KR101739953B1 - 항 에이치비씨의 정량적인 검출 방법 및 만성 비형 간염 환자의 질병 진행의 모니터링 및 억제 및 치료 효과의 예측에 있어서 그의 용도 - Google Patents
항 에이치비씨의 정량적인 검출 방법 및 만성 비형 간염 환자의 질병 진행의 모니터링 및 억제 및 치료 효과의 예측에 있어서 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 B형 간염 코어 단백질에 대한 항체(항-HBc) 정량적인 검출 방법 및 만성 B형 간염 환자의 질병 진행의 모니터링 및 억제 및 치료 효과의 예측에서 상기 방법의 용도를 개시한다. 항-HBc를 정량적으로 검출하며, 따라서 만성 B형 간염 환자의 질병 진행을 모니터하고 억제하며, 항-B형 간염 바이러스(HBv) 치료 중인(특히 인터페론을 기본으로 하는 치료 중인, 및 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 기본으로 하는 항-HBV 약물을 통해 치료 중인) 만성 B형 간염 환자에 대한 치료 효과가 유효하게 예측되어, 이에 의해 환자가 약물을 합리적으로 선택할 수 있게 안내한다.
Description
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)의 검출 및 바이러스성 B형 간염의 임상적인 진단에 관한 것이며, 보다 구체적으로 환자에게서 만성 B형 간염의 질병 진행을 모니터하고, B형 간염 바이러스에 대한 치료(특히 인터페론을 기본으로 하는 치료 및 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드 유사체 항-HBV 약물을 기본으로 하는 치료)을 받는 만성 B형 간염 환자에서 치료 효과를 유효하게 예측하고, 따라서 상기 환자에게 약물을 합리적으로 선택할 수 있게 안내하기 위한, B형 간염 코어 단백질에 대한 항체(항-HBc)의 정량적인 검출을 사용하는 방법에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스의 감염, 특히 B형 간염 바이러스의 만성적인 감염은 세계적으로 가장 중요한 공중 보건 문제 중 하나이다. 현재, 세계에서 만성 B형 간염 바이러스에 감염된 환자는 3억 5천만 명이 넘는다. B형 간염 바이러스의 만성적인 감염 결과 간 질병, 예를 들어 만성 B형 간염(CHB), 간 경변증(LC) 및 원발성 간세포 암종(HCC)이 발생할 수 있으며, 매년 100만 명이 넘는 사람들이 B형 간염 바이러스의 만성적인 감염 및 이에 의해 유발된 관련 질병들로 인해 사망하였다[1].
현재, B형 간염 바이러스의 만성 감염의 치료를 위한 약물들은 주로 2 개의 그룹, 즉 인터페론(IFN)과 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드 유사체(NA)로 나뉜다. 전자는 보통 인터페론(IFN), 및 주로 환자의 면역능력을 종합적으로 증대시킴으로써 HBV를 억제하고 CHB를 치료하는 효과를 일으키는 peg인터페론(Peg-IFN, 또한 지속-작용성 인터페론이라 칭한다)을 포함하는 반면에; 후자는 주로 5 개의 약물, 즉 라미뷰딘(LMV), 아데포비어 디피복실(ADV), 엔테카비어(ETV), 텔비뷰딘(LdT) 및 테노포비어를 포함하며, 이들은 HBV의 폴리머라제 활성을 직접 억제함으로써 HBV 복제를 억제한다. B형 간염 바이러스의 만성 감염에 대해서, 만성 B형 간염의 치료를 위해 상기 약물을 사용하는 최종 목적은 환자에게서 B형 간염 표면 항원(HBsAg)에 대한 혈청학적 음성 또는 혈청전환(HBsAg 상실 또는 HBsAg 혈청전환)을 획득하는 것이다. 그러나, 상기 기존의 약물들은 HBsAg 상실 또는 HBsAg 혈청전환을 성취하기에는 제한된 효능을 가지며, 대개 수년간 지속적인 치료가 요구된다. 더욱이, B형 간염 바이러스 E 항원 혈청전환(HBeAg 혈청전환)이 B형 간염 바이러스의 만성 감염 과정 중의 또 다른 중요한 사건인데, 이는 대개 임상적인 간염의 경감 및 양호한 예후를 동반하며, 따라서 임상의 및 연구자들은 치료가 유효한지 아닌지를 결정하기 위한 주요 지표로서 "HBeAg 혈청전환이 치료 후 환자에게서 발생하는지"를 통상적으로 이용한다. HBeAg 혈청전환 외에, 지속되는 바이러스 반응(SVR)이 또한 B형 간염의 임상 치료에 대한 치료 효과를 측정하기 위한 2차 지표로서 사용된다[2,3].
만성적인 B형 간염이 있는 환자가 HBeAg 혈청전환을 성취하는 치료의 종점에 비추어, IFN과 NA 간의 치료 효과 및 약물 순응성에 관하여 현저한 차이가 존재한다. IFN(주로 Peg-IFN 또는 지속-작용성 인터페론을 지칭한다)은 NA보다 우수한 치료 효과를 가지며, HBeAg 양성 환자의 30 내지 50%는 전자에 의해 1년(52 주) 치료 후 HBeAg 혈청전환을 성취할 수 있는 반면, 후자의 치료에 의해서는 HBeAg 양성 환자의 단지 10 내지 30%만이 HBeAg 혈청전환을 성취할 수 있었다. 그러나, IFN 치료의 부작용은 대개 NA의 경우보다 더 크며, 상기 환자들은 대개 발열, 두통, 허약, 탈모, 백혈구 감소증과 같은 부작용을 동반하고, 일부 환자들은 이러한 부작용을 견딜 수 없었다. 대조적으로, NA의 경구 약물은 부작용이 덜하고, 양호한 순응성을 갖는다. 가격면에서, IFN(주로 Peg-IFN 또는 지속-작용성 인터페론을 지칭한다)에 의한 1년 치료에 대한 약물 비용은 약 15,000 RMB인 반면, NA에 의한 치료에 대한 약물 비용은 대개 10,000 RMB 미만이다. 상기 두 약물 그룹의 차이에 비추어, 근본적으로 중요한 것은 환자의 치료 전에 유효한 평가 및 예측을 수행하고 이어서 만성 B형 간염의 치료에 최적인 약물을 선택하는 것이다.
환자에게서 HBeAg 혈청전환의 성취는 주로 상기 환자 자체가 HBV에 대해 충분한 특정한 면역능력을 갖는지의 여부, 또는 상기 환자가 약물 요법을 통해 HBV에 대해 충분한 특정한 면역능력을 획득할 수 있는지의 여부에 따른다. 따라서, 만성 B형 간염 환자의 HBV에 대한 특정한 면역능력의 정량적인 분석을 사용하여, 치료하고자 하는 만성 B형 간염 환자에서 발생할 HBeAg 혈청전환 확률을 예측할 수 있었다. 오랫동안, 만성 B형 간염 환자의 혈청 ALT 수준이 HBV에 대한 숙주 면역능력의 평가를 위한 간접적인 대리 마커로서 사용되고 있다. 이는 만성 B형 간염 환자의 혈청 ALT 수준이 상기 환자의 간 세포의 염증/괴사 수준을 반영하는 반면, HBV는 항-HBV T 세포에 의해 매개되는 면역학적 반응으로 인해 간 염증 또는 간 세포의 괴사를 유발하는 면역 원인 바이러스이며, 따라서 혈청 ALT 수준과 숙주 항-HBV 면역능력 간에는 특정한 상관성이 존재하기 때문이다. 일반적으로, 정상 상한치(ULN)보다 2배까지 더 큰 혈청 ALT 수준을 갖는 환자는 대개 간염 반응이 없는 환자들, 즉 혈청 ALT 수준이 상기 정상 상한치보다 작은 만성 B형 간염 환자보다 항-HBV 치료에서 더 양호한 치료 효과(치료에 의해 성취되는 HBeAg 혈청전환의 확률을 지칭함)를 갖는 반면, 혈청 ALT 수준이 상기 정상 상한치(ULN)보다 5 배까지 큰 환자는 대개, 간염 반응을 갖지만 비교적 낮은 ALT 수준을 갖는 환자들보다 항-HBV 치료에 더 양호한 치료 효과를 갖는다. 그럼에도 불구하고, 상기 혈청 ALT 수준은 주로 간 염증의 정도를 나타내며, ALT 수준은 HBV 특이 지수가 아니고 다른 인자들(예를 들어 동반되는 자가면역 간염, 알콜성 간 질병, HCV 또는 다른 간염 바이러스의 감염)에 의해 쉽게 영향을 받을 수 있으며, 그의 반감기가 짧고, 따라서 만성 B형 간염의 치료에서 치료 효과를 예측하는데 ALT 수준을 사용하는 것은 그다지 신뢰성이 없다. 혈청 ALT 외에, HBV 특이적 T 세포 면역학적 반응에 대한 분석(예를 들어 시험관내 자극 사이토킨 방출 시험)을 또한 만성 B형 간염 치료에서의 치료 효과의 예측에 사용할 수 있지만, 그의 실행이 비교적 복잡하며, 그의 임상실습 및 판매촉진이 매우 어렵고, 시험 샘플에 대한 높은 필요조건(신선한 전혈 샘플이 요구된다)을 수반하며, 따라서 그의 적용 전망이 매우 제한적이다. 요약하면, 당해 분야에서 치료 전 치료 효과에 대한 유효한 평가 방법이 아직 없다.
B형 간염 코어 단백질(항-HBc)에 대한 항체는 HBV 감염에 대한 가장 전형적인 혈청학적 지표 중 하나이며, 항-HBc의 정량적인 검출(항-HBc가 양성인지의 여부를 결정하는)은 B형 간염 바이러스 감염의 임상적 진단에 있어서 35년이 넘게 사용되어 왔다. 혈청 항-HBc 양성 결과는 환자가 HBV로 감염되었었거나 또는 감염되어 있는 중이고, 상기 항체가 대개는 HBV 감염된 사람의 혈청 중에 평생 계속해서 존재함을 암시한다. 현재, 항-HBc 항체의 검출을 위해 개발된 방법들은 주로 경쟁적이거나 억제성인 면역검출의 기전을 기본으로 하며, 이러한 방법들은 항-HBc의 정량적인 검출에 유효하게 사용될 수 있다. 그러나, 기술적 기전에 의한 제한으로 인해, 그의 검출 동적 직선 범위가 대개 좁으며(일반적으로 한 자릿수의 범위 이내), 그의 검출 안정성이 불량하고, 항-HBc의 정량적인 검출에 만족스럽게 적용될 수 없다. 상기 관련된 개관에 따르면, 본 발명의 공개 이전에 항-HBc의 정량적인 검출에 유효한 방법 및 시약은 존재하지 않으며; 항-HBc의 정량적인 검출의 임상치 및 상응하는 용도는 지금까지 공지되어 있지 않다.
B형 간염 바이러스 코어 단백질은 매우 강한 면역원성을 가지므로, 그의 혈청 항체 수준은 숙주 개인에서 HBV에 대한 특이적인 체액 면역 반응(B 세포 면역 반응) 능력을 가리키며, HBV에 대한 숙주의 전체 면역 적격성을 반영한다. 이 때문에, 본 발명의 발명자들은 만성 B형 간염 환자의 혈청 항-HBc 수준의 정확한 검출이 환자에서 HBV에 대한 특정한 면역 반응의 능력을 가리킬 수 있고 상기 환자에 의해 수용되는 약물(인터페론 약물, 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드 유사체 포함)에 의한 치료의 최종적인 치료 효과를 예측할 수 있는 것으로 여겼다. 본 발명은 B형 간염 바이러스 감염 환자의 혈청/혈장 중 항-HBc의 항체 수준을 정확하게 정량 검출하는 방법, 및 환자의 만성 B형 간염의 진행을 모니터링할 뿐만 아니라 만성 B형 간염 환자의 치료 효과를 예측함에 있어서 항-HBc의 정량적인 검출의 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 혈청 항-HBc의 정확한 정량 검출을 위한 면역학적 검출 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 효소-결합된 면역흡수 분석 또는 화학발광 검출 방법에 의해 충족될 수 있다.
상기 방법은 단일 검출의 직선 동적 범위가 1.5 자릿수 이상, 즉 단일 검출에 대한 정확한 정량분석의 상한이 정확한 정량분석의 하한보다 32 배 이상 더 높다는 이점을 갖는다. 상기 특징은 혈청 항-HBc 수준의 정확한 정량 검출을 위한 토대이며 본 발명 이전의 종래 기술에서의 항-HBc의 검출 방법들은 이러한 특징을 갖지 못했다.
B형 간염 바이러스의 다양한 단계의 만성 감염 환자들의 샘플 및 환자의 질병 과정의 자연적인 진행의 일련의 샘플들에 상기 방법을 적용함으로써 획득한 결과는, 정량적 수준의 혈청 항-HBc가 환자의 간염 활동 및 숙주 면역 상태와 고도로 상관되며 항-HBc의 정량적으로 측정된 값을 사용하여 환자가 면역 활성화 단계인지 또는 간염 활동 단계인지를 유효하게 식별할 수 있음을 보였다. 이는 본 발명에 의해 개시된 바와 같은 항-HBc의 정량 검출 방법 또는 그의 동등한 방법의 임상적 사용이 만성 B형 간염 환자의 질병 진행을 모니터링하고 측정하는데 도움이 됨을 암시한다.
상기 방법을 아데포비어 디피복실 및 지속-작용성 인터페론의 치료를 받은 만성 간염 환자의 코호트 샘플에 적용함으로써 획득된 결과는 기본적인 항-HBc 수준이 치료 응답률과 양으로 상관됨을 보였다. 이는 본 발명에 의해 개시된 바와 같은 항-HBc의 정량 검출 방법 또는 그의 동등한 방법의 임상적 사용이, 만성 B형 간염 환자가 아데포비어 디피복실, 지속-작용성 인터페론 또는 유사한 기전을 갖는 것들과 같은 약물의 치료를 받기 전에 치료 효과를 평가하고 예측할 수 있으며, 치료 약물 및 치료 시간의 선택을 안내하고, 이에 의해 치료 효율을 개선시키는데 도움이 됨을 암시한다.
다른 한편으로, 본 발명은 만성 B형 간염 환자의 질병 진행을 모니터하고/하거나 만성 B형 간염 환자가 B형 간염 바이러스에 대한 치료를 받기 전에 치료 효과를 유효하게 예측하기 위한 진단제의 제조에 있어서 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체의 수준을 정량적으로 검출하기 위한 시약의 용도에 관한 것이다.
하나의 특정한 실시태양에서, B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체의 정량 검출을 하기의 방법들 중 하나 이상에 의해 수행한다: 효소-결합된 면역흡수 분석, 화학발광 면역검출법, 시간-분해 형광 검출법, 면역비탁분석법, 면역크로마토그래피법, 면역-삼출법.
하나의 특정한 실시태양에서, B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체 수준의 단일 검출은 1.5 자릿수 이상의 직선 동적 범위를 갖는다, 즉 단일 검출에 대한 정확한 정량의 상한이 정확한 정량의 하한보다 32 배 이상 더 높다.
하나의 특정한 실시태양에서, B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체의 정량 검출은 하기의 단계들을 포함한다:
a) B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 B형 간염 바이러스 단백질을 제공하고, 상기 단백질은 B형 간염 바이러스 코어 단백질의 완전 길이의 아미노산 서열(첫 번째 아미노산에서부터 183번째 아미노산까지)을 포함하거나, 또는 오직 B형 간염 바이러스 코어 단백질의 1차 면역-우세 대역의 아미노산 서열(예를 들어 첫 번째 아미노산에서부터 149 번째 아미노산까지)만을 포함할 수 있으며, 상기 단백질은 고체 지지체 상에 고정화되고, 고상 항원으로서 작용하며, 혈청 샘플 중에 존재하는 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체를 포획하는데 사용되고;
b) 상기 고상 항원 상에 포획된 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 표지된 항원을 제공하며, 상기 표지된 항원은 B형 간염 바이러스 코어 단백질의 완전 길이의 아미노산 서열(첫 번째 아미노산에서부터 183번째 아미노산까지)을 포함하거나, 또는 오직 B형 간염 바이러스 코어 단백질의 1차 면역-우세 대역의 아미노산 서열(예를 들어 첫 번째 아미노산에서부터 149 번째 아미노산까지)만을 포함할 수 있으며, 상기 표지된 항원 상의 신호 발생 물질은 양고추냉이 페록시다제, 알칼리성 포스파타제, 또는 아크리디늄 에스터일 수 있고;
c) 정량분석 표준 곡선을 작성하기 위해 기지의 농도들을 갖는 정량분석 표준 샘플(대개는 상이한 농도로 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체를 함유하는 3 내지 6 개의 샘플로 이루어진다)을 제공한다. 상기 농도의 단위는 IU/㎖, PEIU/㎖, 또는 출처를 추적할 수 있는 다른 농도 또는 역가의 단위일 수 있다;
d) 상기 샘플(시험하고자 하는 샘플 또는 정량분석 표준 샘플)을, 상기 샘플 중의 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체(존재하는 경우)가 포획되어 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 고상 항원-항체의 복합체를 형성하도록 상기 고상 항원과 접촉시키고;
e) 상기 표지된 항원을, B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 고상 항원-항체-표지된 항원의 복합체를 형성하도록, 상기 단계 d)의 생성물, 즉 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 고상 항원-항체의 복합체와 접촉시키고;
f) 신호 발생을 활성화시킬 수 있는 기질 또는 용액을, 측정가능한 신호를 발생시키도록 상기 단계 e)에서 형성된 바와 같은 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 고상 항원-항체-표지된 항원의 복합체와 접촉시키고, 상기 발생된 신호의 강도를 상응하는 측정 장비로 측정하며;
g) 상기 측정된 정량분석 표준 샘플(대개 3 내지 6 개의 샘플) 신호와 상기 샘플의 상응하는 농도와의 선형 회귀 정합을 수행하여 측정 신호로부터 샘플 농도를 계산하기 위한 수학식을 획득하고;
h) 상기 시험하고자 하는 샘플의 측정된 신호를 상기 단계 g)의 식에 도입하고, 상기 시험하고자 하는 샘플 중의 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체의 농도를 계산하고;
i) 상기 단계 h)에서 계산된 바와 같은 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체의 농도가 상기 검출 방법의 정확한 정량분석 상한보다 큰 경우, 상기 시험하고자 하는 샘플을 희석하고, 상기 측정된 농도가 상기 상응하는 검출 방법의 정확한 정량분석 상한과 하한 사이의 범위에 있을 때까지 상기 단계 a) 내지 h)를 반복한다. 상기 시험하고자 하는 샘플 중에 함유된 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체의 농도를 상기 희석 후 측정된 값에 희석비를 곱하여 계산하여 획득한다.
하나의 특정한 실시태양에서, 본 발명의 진단제를 상이한 치료 약물들을 수용하는 만성 B형 간염 환자에 사용하며, 상기 약물은 지속-작용성 인터페론(peg화된 인터페론, Peg인터페론), 보통 인터페론(인터페론), 라미뷰딘(LMV), 아데포피어 디피복실(ADV), 엔테카비어(ETV), 텔비뷰딘(LdT), 테노포비어, 또는 만성 B형 간염의 치료에 유용한 다른 약물들을 포함한다.
하나의 특정한 실시태양에서, 치료 전 환자에게서 상기 치료의 치료 효과를 예측하기 위한 통상적인 기준은 하기와 같다: 치료 전 환자의 혈청 중에 보다 높은 수준의 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체를 갖는 환자에서 획득된 치료 효과(반응률)가 상기 치료 전 환자의 혈청 중에 보다 낮은 수준의 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체를 갖는 환자의 경우보다 우수하고; 치료 효과의 기준이 B형 간염 바이러스 E 항원 혈청전환(즉 치료를 받는 만성 B형 간염 환자에서 HBeAg(+)/항-HBe(-)에서 HBeAg(-)/항-HBe(+)로의 전환)이거나, 또는 바이러스학 반응(즉 만성 B형 간염 환자에서 혈청 HBV DNA 부하가 1000 사본수/㎖ 이하로 떨어진다), 또는 질병 상태의 경감 또는 양호한 예후를 가리킬 수 있는 다른 임상 지표일 수 있다.
하나의 특정한 실시태양에서, 만성 B형 간염 환자의 질병 진행의 모니터링에 대한 통상적인 기준은: 환자의 간 염증의 발생 및 B형 간염 바이러스에 대한 특이적인 숙주 면역 반응의 활성화를 암시하는 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체 수준의 비정상적인 증가이다.
하나의 특정한 실시태양에서, 본 발명은 아데포비어 디피복실 및 peg화된 인터페론의 치료를 받는 만성 B형 간염 환자의 반응을 평가하기 위한 키트의 제조에 있어서 항-HBc의 용도에 관한 것이다.
하나의 특정한 실시태양에서, 본 발명은 만성 B형 간염 환자의 질병 진행을 모니터링하기 위한 키트의 제조에 있어서 항-HBc의 용도에 관한 것이다.
하나의 특정한 실시태양에서, 본 발명은 B형 간염 환자의 질병 단계를 예측하기 위한 키트의 제조에 있어서 항-HBc의 용도에 관한 것이다.
도 1은 항-HBc ELISA 정량분석 방법의 동적인 직선 범위를 도시한다.
도 2는 항-HBc ELISA 정량분석 방법의 실험내(A) 및 실험간(B) 정확성을 도시한다.
도 3은 104 개 샘플의 항-HBc ELISA 정량 검출 결과의 일관성을 도시한다.
도 4는 항-HBc CLEIA 정량분석 방법의 동적인 직선 범위를 도시한다.
도 5는 항-HBc CLIA 정량분석 방법의 동적인 직선 범위를 도시한다.
도 6은 상이한 단계의 HBV로 감염된 환자의 혈청 항-HBc 수준의 분포를 도시한다:
(A) 상이한 단계의 HBV로 감염된 환자의 혈청 항-HBc 수준 및 ALT 수준;
(B) 상이한 단계의 HBV로 감염된 환자의 혈청 HBV DNA 수준 및 HBsAg 수준;
(C) 혈청 항-HBc 수준에 근거한 환자의 면역 활성화 상태를 측정하기 위한 ROC 곡선 분석;
(D) 상이한 ALT 분류된 환자의 평균 항-HBc 수준;
(E) 혈청 항-HBc 수준 및 ALT 수준의 상관성 분석.
약어의 표시: PBI, 감염 전의 환자; IT, 면역 관용 단계의 환자; IC, 면역 제거 단계의 환자; LR, 낮은 증식 단계의 환자; ENH, HBeAg 음성 간염; LC, 간 경변증 환자; HCC, 원발성 간암 환자.
도 7은 만성 B형 간염 바이러스 보균자의 자연적인 진행 중 혈청 항-HBc, ALT, HBV DNA 및 HBsAg 수준의 동적인 변화들을 도시한다.
도 8은 치료 전 만성 B형 간염 환자의 혈청 항-HBc 수준으로 예측된 바와 같은 치료-후 HBeAg 혈청전환율을 도시한다:
(A) 아데포비어 디피복실의 치료를 받은 후 만성 B형 간염 환자의 HBeAg 혈청전환을 예측하기 위해 치료 전 항-HBc 수준 사용;
(B) Peg화된 인터페론의 치료를 받은 후 만성 B형 간염 환자의 HBeAg 혈청전환을 예측하기 위해 치료 전 항-HBc 수준 사용;
(C) 아데포비어 디피복실의 치료를 받은 후 환자의 HBeAg 혈청전환 발생률을 예측하기 위해 혈청 항-HBc 수준 사용;
(D) peg화된 인터페론의 치료를 받은 후 환자의 HBeAg 혈청전환 발생률을 예측하기 위해 혈청 항-HBc 수준 사용;
(E) 상이한 기준선 ALT 수준의 분류된 환자의 HBeAg 혈청전환률을 예측하기 위해 치료전 항-HBc 수준 사용.
도 9는 아데포비어 디피복실 및 peg화된 인터페론의 치료를 받은 후 상이한 기준선 항-HBc 수준의 분류된 환자에서 HBeAg 혈청전환 발생률을 도시한다.
도 10은 아데포비어 디피복실의 치료 중 및 치료 후 환자에서 혈청 마커의 정량분석된 수준의 동적인 변화를 도시한다.
도 2는 항-HBc ELISA 정량분석 방법의 실험내(A) 및 실험간(B) 정확성을 도시한다.
도 3은 104 개 샘플의 항-HBc ELISA 정량 검출 결과의 일관성을 도시한다.
도 4는 항-HBc CLEIA 정량분석 방법의 동적인 직선 범위를 도시한다.
도 5는 항-HBc CLIA 정량분석 방법의 동적인 직선 범위를 도시한다.
도 6은 상이한 단계의 HBV로 감염된 환자의 혈청 항-HBc 수준의 분포를 도시한다:
(A) 상이한 단계의 HBV로 감염된 환자의 혈청 항-HBc 수준 및 ALT 수준;
(B) 상이한 단계의 HBV로 감염된 환자의 혈청 HBV DNA 수준 및 HBsAg 수준;
(C) 혈청 항-HBc 수준에 근거한 환자의 면역 활성화 상태를 측정하기 위한 ROC 곡선 분석;
(D) 상이한 ALT 분류된 환자의 평균 항-HBc 수준;
(E) 혈청 항-HBc 수준 및 ALT 수준의 상관성 분석.
약어의 표시: PBI, 감염 전의 환자; IT, 면역 관용 단계의 환자; IC, 면역 제거 단계의 환자; LR, 낮은 증식 단계의 환자; ENH, HBeAg 음성 간염; LC, 간 경변증 환자; HCC, 원발성 간암 환자.
도 7은 만성 B형 간염 바이러스 보균자의 자연적인 진행 중 혈청 항-HBc, ALT, HBV DNA 및 HBsAg 수준의 동적인 변화들을 도시한다.
도 8은 치료 전 만성 B형 간염 환자의 혈청 항-HBc 수준으로 예측된 바와 같은 치료-후 HBeAg 혈청전환율을 도시한다:
(A) 아데포비어 디피복실의 치료를 받은 후 만성 B형 간염 환자의 HBeAg 혈청전환을 예측하기 위해 치료 전 항-HBc 수준 사용;
(B) Peg화된 인터페론의 치료를 받은 후 만성 B형 간염 환자의 HBeAg 혈청전환을 예측하기 위해 치료 전 항-HBc 수준 사용;
(C) 아데포비어 디피복실의 치료를 받은 후 환자의 HBeAg 혈청전환 발생률을 예측하기 위해 혈청 항-HBc 수준 사용;
(D) peg화된 인터페론의 치료를 받은 후 환자의 HBeAg 혈청전환 발생률을 예측하기 위해 혈청 항-HBc 수준 사용;
(E) 상이한 기준선 ALT 수준의 분류된 환자의 HBeAg 혈청전환률을 예측하기 위해 치료전 항-HBc 수준 사용.
도 9는 아데포비어 디피복실 및 peg화된 인터페론의 치료를 받은 후 상이한 기준선 항-HBc 수준의 분류된 환자에서 HBeAg 혈청전환 발생률을 도시한다.
도 10은 아데포비어 디피복실의 치료 중 및 치료 후 환자에서 혈청 마커의 정량분석된 수준의 동적인 변화를 도시한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 문에 사용된 모든 기술과학 용어들은 본 발명과 관련하여 당해 분야의 숙련가들에 의해 공지된 통상적인 의미를 갖는다.
본 발명의 실시예 1에서, 항-HBc ELISA(효소-결합된 면역흡수 분석, 미세웰 플레이트법) 정량 검출 방법이 확립되었으며, 상기 방법은 혈청 샘플 중 항-HBc의 함량을 정확하게 측정할 수 있었고, 단일 검출의 정확한 정량분석을 위한 직선 동적 범위는 1.8 자릿수 이하(0.04 내지 2.5 IU/㎖)였으며, 상기와 같은 특징은 항-HBc의 검출에 대해 공지된 방법이 갖지 못했다[4,5].
실시예 2에서, 항-HBc CLEIA(화학발광 효소-결합된 면역 분석, 미세웰 플레이트법) 정량 검출 방법이 확립되었으며, 상기 방법은 혈청 샘플 중 항-HBc의 함량을 정확하게 측정할 수 있었고, 단일 검출의 정확한 정량분석을 위한 직선 동적 범위는 2.7 자릿수 이하(0.04 내지 20 IU/㎖)였다. 상기 방법의 직선 동적 범위는 실시예 1에 개시된 바와 같은 항-HBc ELISA 정량 검출 방법의 경우보다 더 넓으며, 따라서 높은 항-HBc를 갖는 샘플의 검출에 필요한 희석수가 현저하게 감소하였고, 효율이 개선되었다.
실시예 3에서, 항-HBc CLIA(직접 화학발광 면역 분석, 미세입자법) 정량 검출 방법이 확립되었으며, 상기 방법은 혈청 샘플 중 항-HBc의 함량을 정확하게 측정할 수 있었고, 단일 검출의 정확한 정량분석을 위한 직선 동적 범위는 3.02 자릿수 이하(0.02 내지 20.8 IU/㎖)였다. 상기 방법은 실시예 1에 개시된 바와 같은 항-HBc ELISA 정량 검출 방법에 비해 단일 검출을 위한 직선 동적 범위를 현저하게 확장시켰으며, 따라서 높은 항-HBc를 갖는 샘플의 검출에 필요한 희석수가 현저하게 감소하였고, 효율이 개선되었다. 상기 방법은, 단일 검출 튜브가 사용되고, 완전 자동화 장비가 적재되었을 때 임상에서 어느 때라도 픽업 검출에 사용될 수 있다는 점에서, 실시예 2에 개시된 바와 같은 항-HBc CLEIA 정량 검출 방법과 다르다.
실시예 4에서, 상기 항-HBc 정량 검출 방법을 상이한 단계의 HBV 감염된 사람의 혈청 항-HBc 수준 분포의 평가에 적용하였다. 상기 평가 결과는 만성 B형 간염 바이러스 감염된 사람에서, 혈청 항-HBc 수준이 상기 감염된 사람의 간염 활동 및 숙주 면역 상태와 관련됨을 보였다. 따라서, 항-HBc 수준을 만성 B형 간염 바이러스 감염된 사람이 면역 활성화 상태에 있는지 또는 간염 활동 상태에 있는지를 측정하는데 사용할 수 있었으며, 진단 정밀도(AUROC)는 0.918(95% CI: 0.888 - 0.948)이었고, 측정 한계치는 7400 IU/㎖이었다. 이러한 결과는 본 발명에 개시된 항-HBc 정량 검출 방법에 의해 획득된 검출 결과가, 의사에게 환자의 질병 단계를 측정하는데 도움을 줄 수 있음을 보였다.
실시예 5에서, 상기 항-HBc 정량 검출 방법을 만성 B형 간염 바이러스 감염된 사람의 자연적인 진행 중 항-HBc 수준의 동적인 변화 및 다른 지수들과의 관련성을 평가하기 위해 적용하였다. 상기 평가 결과는 만성 B형 간염 바이러스 감염된 사람이 간 염증 활성을 갖는 경우, 항-HBc 및 ALT가 거의 동시에 증가하고, 항-HBc 피크값은 대개 ALT 피크값보다 3 내지 8 주 늦게 나타나지만, 때때로 ALT 피크의 출현 전 또는 출현과 동시에 나타날 수 있으며; 간염의 회복 단계 동안, ALT는 신속히 정상으로 복귀하는 반면, 항-HBc는 12 내지 20 주 늦게 기준선 수준으로 복귀함을 보였다. 상기 결과는 또한 본 발명의 정량 검출 방법에 의해 측정된 바와 같이 만성 B형 간염 바이러스 감염된 사람의 항-HBc 수준을 ALT 측정을 위한 보완 지수로서 사용할 수 있었고, 이는 환자가 간염 활성 단계에 있는지 또는 최근 3 내지 4 개월 이내에 간염 활동이 있었는지를 측정하는데 의사에게 도움을 줄 수 있음을 암시한다.
실시예 6에서, 상기 항-HBc 정량 검출 방법을 아데포비어 디피복실 및 peg화된 인터페론의 치료를 받는 만성 B형 간염 환자의 반응을 평가하기 위해 적용하였다. 상기 결과는 상기 만성 B형 간염 환자에서 상기 치료 전의 항-HBc 수준이 상기 치료 후 HBeAg 혈청전환율과 양으로 상관됨을 보였다, 즉 치료 전 높은 항-HBc 수준(실시예에서 ≥29000 IU/㎖)을 갖는 환자는, 저렴하고 부작용은 적지만 불충분한 치료 효과를 갖는 아데포비어 디피복실의 경우에조차 목적하는 효과를 성취할 수 있었던 반면; 치료 전에 중간 수준(실시예에서 9000 내지 29000 IU/㎖) 또는 보다 낮은 수준(실시예에서 <9000 IU/㎖)의 항-HBc를 갖는 환자의 경우, 아데포비어 디피복실의 치료 효과는, 값비싸고 높은 부작용을 갖지만 보다 더 효능이 있는 지속-작용성 인터페론보다 현저하게 열등하였다. 치료 전에 높은 항-HBc 수준(실시예에서 ≥29000 IU/㎖)을 갖는 환자에서, 바이러스 복제에 대한 아데포비어 디피복실의 억제 효과는 치료 전에 낮은 항-HBc 수준(<29000 IU/㎖)을 갖는 환자의 경우보다 현저하게 우수하였다. 상기 결과는 치료 받기 전의 만성 B형 간염 바이러스 감염된 사람들의 항-HBc 수준을 측정하기 위해 본 발명의 정량 검출 방법을 사용하면 상기 사람들이 아데포비어 디피복실, 지속-작용성 인터페론 또는 유사한 기전을 갖는 다른 약물들의 치료를 받은 후 기대되는 치료 효과를 예측할 수 있음을 암시하였으며, 이는 치료 약물 및 치료 시간의 선택을 안내하는데 도움을 주어, 치료 효율을 개선시킨다.
하기의 실시예들은 본 발명을 추가로 개시하고 예시한다. 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하며, 실시예들에서 모든 시약, 화학물질 또는 생물 활성 물질 농도, 사용된 환자 및 다른 변수들은 본 발명의 범위를 제한하기 위함이기 보다는 단지 본 발명의 적용을 예시하기 위한 것이다.
실시예
1. 이중 항원 샌드위치 분석 항-HBc 정량적인 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA) 방법
1.1 고정화된 항원 및 표지된 항원의 제조
상기 방법에서, 사용된 바와 같은 고정화된 항원 및 표지된 항원은 샘플 중의 항-HBc 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 B형 간염 바이러스 코어 항원(HBcAg)이었으며, 상기 항원은 HBcAg의 완전 길이 아미노산 서열(Cp183)을 포함하거나 또는 단지 HBcAg의 1차 면역-우세 대역의 아미노산 서열(Cp149)만을 포함할 수 있었다. 본 발명에 사용된 HBcAg는 이 콜라이에 의한 재조합 발현 및 정제에 의해 수득되었다. Cp149 재조합 항원에 대한 발현 및 정제 방법에 관하여, 아담 즐로트닉(Adam Zlotnick) 등[6]에 의해 개시된 방법을 참조할 수 있는 반면, Cp183 재조합 항원에 대한 발현 및 정제 방법에 관해서는 안 리(An Li) 등[5]에 의해 개시된 방법을 참조할 수 있다. 본 발명에서, Cp149 재조합 항원은 대개 고정화된 항원으로서 사용된 반면, Cp183 재조합 항원은 표지된 항원으로서 사용되었다.
1.2 반응 플레이트의 제조
(1.2.1) Cp149 항원을 50 mM CB 완충액 pH 9.6(NaHCO3/Na2CO3 완충액, 최종 농도는 50 mM이고, pH 값은 9.6이었다)으로 희석하였으며, 최종 농도는 3 ㎍/㎖이었다.
(1.2.2) 100 ㎕의 코팅 용액을 96-웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 가하고, 2 내지 8 ℃에서 16 내지 24 시간 동안 코팅하고, 이어서 37 ℃에서 2 시간 동안 코팅하였다.
(1.2.3) PBST 세척 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20)을 사용하여 세척을 1 회 수행하였다. 이어서, 200 ㎕의 차단 용액(pH 7.4, 20%의 소 태아 혈청 및 1%의 카제인을 함유하는 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 완충액)을 각 웰에 가하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 차단시키고; 상기 차단 용액을 버렸다. 건조 후에, 상기 플레이트를 알루미늄 호일 주머니에 넣고 대기 사용을 위해 2 내지 8 ℃에서 보관하였다.
1.3 Cp183 항원의 HRP 표지화
개선된 나트륨 퍼요오데이트 방법을 사용하였다. 10 ㎎ Cp183 재조합 항원의 표지화 실시예는 하기와 같았다.
(1.3.1) 2 ㎎/ℓ 농도의 Cp183 재조합 항원(5 ㎖)을 투석 주머니에 로딩하고, 4 ℃에서 4 시간 동안 50 mM CB 완충액으로 투석시키고, 투석 완충액을 상기 투석 동안 2 시간당 1 회 교환하였다.
(1.3.2) 40 ㎎의 HRP를 정확하게 칭량하고, 2 ㎖의 ddH2O에 용해시키고, 용해 후에 2 ㎖의 20 ㎎/㎖ NaIO4 용액을 가하고, 실온에서 30 분 동안 반응시키고; 이어서 40 ul의 에틸렌 글리콜을 가하고, 4 ℃에서 30 분간 반응시켜 HRP 활성화 용액(10 ㎎/㎖, 4 ㎖)을 수득하였다.
(1.3.3) 단계 1.3.2에서 수득한 HRP 활성화 용액을 Cp183 재조합 항원이 로딩된 투석 주머니에 가하고, 균질하게 혼합하고, 이어서 4 ℃에서 암실 조건 하에 6 내지 8 시간 동안 50 mM CB 완충액으로 투석시키고, 투석 완충액을 상기 투석 동안 2 시간당 1 회 교환하였다.
(1.3.4) 0.4 ㎖의 NaBH4 용액(5 ㎎/㎖)을 제조하고, 단계 1.3.3에서 수득한 표지 반응 용액에 가하고, 균질하게 혼합하고, 암실 조건 하에 4 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다.
(1.3.5) 단계 1.3.4를 완료한 후에, 상기 표지 반응 용액을 새로운 투석 주머니에 로딩하고, 4 ℃에서 4 시간 동안 PBS 완충액으로 투석시켰다.
(1.3.6) 단계 1.3.5를 완료한 후에, Cp183-HRP 표지를 분리시키기 위해서, GE 캄파니에 의해 생산된 바와 같은 세파크릴(Sephacryl) S-300 HR 크로마토그래피 컬럼으로 정제를 수행하였다.
(1.3.7) 단계 1.3.6에서 분리되고 정제된 바와 같은 Cp183-HRP 표지를 2 ㎎/㎖로 농축시키고, 이어서 글리세롤을 1:1의 부피비로 가하고, 균질하게 혼합하고 대기 사용을 위해서 -20 ℃에서 보관하였다.
(1.3.8) 단계 1.3.7에서 수득한 Cp183-HRP 표지를 1/4000의 부피비로 효소 표지 희석 완충액(pH 7.4, 20%의 소 태아 혈청, 1%의 카제인, 10%의 슈크로스, 0.05%의 아미노피린을 함유하는 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 완충액)으로 희석하여 효소 표지 반응 용액을 수득하고, 이를 균질하게 혼합하고 대기 사용을 위해 2 내지 8 ℃에서 보관하였다.
1.4 정량적인 표준 샘플
항-HBc 정량 검출용의 정량적인 표준 샘플은 일련의 상이한 농도의 B형 간염 바이러스 코어 단백질 항체의 샘플들로 이루어졌다. 상기 농도의 단위는 IU/㎖, PEIU/㎖이거나, 또는 출처를 추적할 수 있는 농도 또는 역가의 임의의 다른 단위일 수 있다. 본 발명에서, 통상적인 국제 단위(IU/㎖)를 항-HBc 정량분석용 단위로서 사용하였으며, NIBSC[7]에 의해 개시된 항-HBc WHO 표준 샘플(코드: 95/522, 50IU/앰풀)을 40 IU/㎖, 20 IU/㎖, 10 IU/㎖, 5 IU/㎖, 2.5 IU/㎖, 1.25 IU/㎖, 0.625 IU/㎖, 0.3125 IU/㎖, 0.156 IU/㎖, 0.078 IU/㎖, 0.039 IU/㎖, 0.02 IU/㎖, 0.01 IU/㎖, 즉 총 13 개의 상이한 농도에 도달하도록 연속적으로 희석하였다. 상기 표준 샘플의 희석에 사용된 기질 용액은 항-HBc 음성의 건강한 혈액 제공자로부터의 혈장 또는 혈청이거나, 또는 20%의 소 태아 혈청을 함유하는 PBS 용액일 수 있었다.
1.5 항-HBc의 ELISA 정량 검출
만성 B형 간염 환자의 하나의 혈청 샘플(번호: P1)을 제공하였으며, 항-HBc 정량 검출을 하기의 단계들에 따라 수행하였다. 만성 B형 간염 환자가 대개는 비교적 높은 수준의 항-HBc를 갖는다는 사실에 비추어, 상기 샘플을 20%의 소 태아 혈청을 함유하는 PBS 용액으로 4 개의 희석 비율, 즉 1:500, 1:2500, 1:12500, 1:62500에 도달하도록 희석하였고, 이어서 이를 정량적인 ELISA 검출에 사용하였다.
(1.5.1) 샘플 반응: 하나의 코팅된 ELISA 플레이트를 제공하고, 90 ㎕의 샘플 희석 용액을 각 웰에 가하고, 10 ㎕의 샘플 또는 표준 샘플을 또한 각 웰에 가하고, 진탕하고 혼합하고, 이어서 배양하고 37 ℃에서 30 분 동안 반응시켰다.
(1.5.2) 효소 표지 반응: 단계 1.5.1을 완료한 후에, 상기 ELISA 플레이트를 PBST 세척 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20)으로 5 회 세척하고, 각 웰에 단계 1.3.8에서 수득한 바와 같은 효소 표지 반응 용액 100 ㎕를 가하고, 배양하고 37 ℃에서 30 분간 반응시켰다.
(1.5.3) 발색 반응: 단계 1.5.2를 완료한 후에, 상기 ELISA 플레이트를 PBST 세척 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20)으로 5 회 세척하고, 각 웰에 50 ㎕의 TMB 발색제(베이징 완타이 바이올로지컬 파마시 캄파니 리미티드(Beijing Wantai Biological Pharmacy Co., Ltd.))를 가하고, 배양하고 37 ℃에서 15 분간 반응시켰다.
(1.5.4) 정지 반응 및 판독값: 단계 1.5.3을 완료한 후에, 상기 ELISA 플레이트의 각 웰에 50 ㎕의 정지 용액(베이징 완타이 바이올로지컬 파마시 캄파니 리미티드)을 가하고, 각 웰의 OD450/630 값을 플레이트 판독기로 검출하였다.
(1.5.5) 정량적인 표준 곡선의 작성: 단계 1.5.4를 완료한 후에, 13 개의 정량적인 표준 샘플의 측정된 값 및 그의 상응하는 농도에 대해 선형 회귀분석을 수행하고, 도 1의 정량적인 표준 곡선을 작성하였다. 도 1에 따라, 항-HBc ELISA 방법은 정확한 정량분석을 위해 2.5 IU/㎖의 상한 및 0.04 IU/㎖의 하한을 가졌으며, 그의 직선 동적 범위는 1.8 자릿수였다. 측정된 OD450/630 값으로부터의 항-HBc 농도를 계산하기 위한 식은 Conc.항-HBc(IU/㎖) = 1.2104 x OD450/630 - 0.011이었다.
(1.5.6) 시험하고자 하는 샘플의 항-HBc 농도의 획득: P1 혈청의 연속 희석된 샘플들에 단계 1.5.1 내지 1.5.5를 수행하였으며, 이어서 1:500의 희석비율에 대해 측정된 OD450/630 값은 3.899이었고; 1:2500의 희석비율에 대해 측정된 OD450/630 값은 3.801이었으며; 1:12500의 희석비율에 대해 측정된 OD450/630 값은 2.988이었고, 1:62500의 희석비율에 대해 측정된 OD450/630 값은 0.301이었으며; 상기 측정된 값들을 단계 1.5.5에서 획득된 바와 같은 항-HBc 농도 계산을 위한 식에 도입시켰고, 1:500의 희석비율에 대해 측정된 농도 값은 4.71 IU/㎖이었고, 1:2500의 희석비율에 대해 측정된 농도 값은 4.59 IU/㎖이었으며, 1:12500의 희석비율에 대해 측정된 농도 값은 3.61 IU/㎖이었고, 1:62500의 희석비율에 대해 측정된 농도 값은 0.35 IU/㎖이었다. 1:62500의 희석비율에 대해 측정된 농도 값은 ELISA 방법의 정확한 정량분석을 위해 상기 직선 동적 범위(0.04 내지 2.5 IU/㎖) 이내였다. 따라서, 상기 샘플의 원래 항-HBc 농도는 0.35 x 62500 = 22083 IU/㎖이었다.
(1.5.7) 상기 검출 방법의 분석내 정확성의 평가: 기지의 농도를 갖는 6 개의 샘플(5 IU/㎖, 2.5 IU/㎖, 1.25 IU/㎖, 0.625 IU/㎖, 0.3125 IU/㎖, 0.156 IU/㎖의 항-HBc 정량화된 값을 가졌다)을 제공하였으며, 동일한 시험에서, 상기 샘플들을 각각 단계 1.5.1 내지 1.5.4에 따라 16 웰에서 반복적으로 검출하였고, 각 샘플에 대해 측정된 OD450/630 값의 분석내 가변 계수를 검출 후 별도로 계산하고 이를 도 2A에 나타내었으며, 이는 6 개 샘플의 분석내 가변 계수가 2.8% 내지 10.1%임을 가리켰다.
(1.5.8) 상기 검출 방법의 분석간 정확성의 평가: 기지의 농도를 갖는 6 개의 샘플(5 IU/㎖, 2.5 IU/㎖, 1.25 IU/㎖, 0.625 IU/㎖, 0.3125 IU/㎖, 0.156 IU/㎖의 항-HBc 정량화된 값을 가졌다)을 제공하였다. 상기 6 개의 샘플에 단계 1.5.1 내지 1.5.4에 따른 16 개의 독립적인 검출 시험을 수행하였으며, 모든 시험을 완료한 후에, 각 샘플에 대해 측정된 OD450/630 값의 분석간 가변 계수를 별도로 계산하고 이를 도 2B에 나타내었으며, 이는 6 개 샘플의 분석간 가변 계수가 4.4% 내지 10.5%임을 가리켰다.
(1.5.9) 항-HBc 정량 검출의 반복성의 평가: 만성 B형 간염 환자의 104 개 혈청 샘플(항-HBc 수준은 2.23 log10 IU/㎖ 내지 5.37 log10 IU/㎖이었다)을 랜덤하게 선택하고, 단계 1.5.1 내지 1.5.6에 따른 항-HBc 정량 검출을 수행하였으며, 상기 검출을 2 회 독립적으로 반복하고, 상기 두 검출 시험의 결과에 회귀 분석을 수행하고 이를 도 3에 나타내었으며, 이는 상기 두 검출 시험의 결과가 고도로 일치함, 즉 R2 = 0.988임을 가리켰다.
2. 이중 항원 샌드위치 분석 항-HBc 정량적인 화학발광 효소-결합된 면역분석(CLEIA) 방법
2.1 고정화된 항원 및 표지된 항원의 제조
본 발명의 실시예 1의 섹션 1.1의 방법을 사용하여 상기 제조를 수행하였다.
2.2 화학발광 반응 플레이트의 제조
본 발명의 실시예 1의 섹션 1.2의 방법을, 화학발광 반응 플레이트를 상기 항원에 대한 고체 지지체로서 사용함을 제외하고, 사용하였다.
2.3 Cp183 항원의 HRP 표지화
본 발명의 실시예 1의 섹션 1.3의 방법 및 단계를 사용하였다.
2.4 정량분석 표준 샘플
상기 정량적인 표준 샘플은 본 발명의 실시예 1의 섹션 1.4의 경우와 동일하였다.
2.5 항-HBc의 CLEIA 정량적인 검출
만성 B형 간염 환자의 하나의 혈청 샘플(번호: P1)을 제공하고, 항-HBc 정량적인 검출을 하기의 단계들에 따라 수행하였다. 만성 B형 간염 환자가 대개는 비교적 높은 수준의 항-HBc를 갖는다는 사실에 비추어, 상기 샘플을 20%의 소 태아 혈청을 함유하는 PBS 용액으로 3 개의 희석 비율, 즉 1:500, 1:2500, 1:12500에 도달하도록 희석하고, 이어서 이를 정량적인 CLEIA 검출에 사용하였다.
(2.5.1) 샘플 반응: 하나의 코팅된 화학발광 반응 플레이트를 제공하고, 90 ㎕의 샘플 희석 용액을 각 웰에 가하고, 이어서 10 ㎕의 샘플 또는 표준 샘플을 각 웰에 가하고, 진탕하고 균질하게 혼합하고, 이어서 배양하고 37 ℃에서 30 분 동안 반응시켰다.
(2.5.2) 효소 표지 반응: 단계 2.5.1을 완료한 후에, 상기 화학발광 반응 플레이트를 PBST 세척 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20)으로 5 회 세척하고, 각 웰에 단계 1.3.8에서 제조한 바와 같은 효소 표지 반응 용액 100 ㎕를 가하고, 배양하고 37 ℃에서 30 분간 반응시켰다.
(2.5.3) 발광 반응 및 측정: 단계 2.5.2를 완료한 후에, 상기 화학발광 반응 플레이트를 PBST 세척 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20)으로 5 회 세척하고, 각 웰에 피어스 캄파니(Pierce Company)에 의해 제조된 바와 같은 100 ㎕의 PICO 화학발광 기질을 가하고, 각 반응 웰의 발광 값(RLU)을 오린(Orin) II 화학발광 검출기로 즉시 판독하였다.
(2.5.4) 정량적인 표준 곡선의 작성: 단계 2.5.3을 완료한 후에, 13 개의 정량적인 표준 샘플의 측정된 값 및 그의 상응하는 농도에 대해 선형 회귀분석을 수행하고, 도 4의 정량적인 표준 곡선을 작성하였다. 도 4에 따라, 항-HBc CLEIA 방법은 정확한 정량분석을 위해 20 IU/㎖의 상한 및 0.04 IU/㎖의 하한을 가졌으며, 그의 직선 동적 범위는 2.7 자릿수였다. 측정된 RLU 값으로부터의 항-HBc 농도를 계산하기 위한 식은 Conc.항-HBc(IU/㎖) = 10(Log10(RLU) x 0.9337 - 5.3006)이었다.
(2.5.5) 시험하고자 하는 샘플의 항-HBc 농도의 획득: P1 혈청의 연속 희석된 샘플들에 단계 2.5.1 내지 2.5.4의 측정을 수행하였으며, 1:500의 희석비율에 대해 측정된 RLU 값은 12115100이었고; 1:2500의 희석비율에 대해 측정된 RLU 값은 5067890이었으며; 1:12500의 희석비율에 대해 측정된 RLU 값은 889610이었고; 상기 측정된 값들을 단계 2.5.4에서 획득된 바와 같은 항-HBc 농도 계산을 위한 식에 도입시켰고, 1:500의 희석비율에 대해 측정된 농도 값은 20.56 IU/㎖이었고, 1:2500의 희석비율에 대해 측정된 농도 값은 9.114 IU/㎖이었으며, 1:12500의 희석비율에 대해 측정된 농도 값은 1.795 IU/㎖이었고, 여기에서 1:2500 및 1:12500의 희석비율에 대해 측정된 값들은 본 발명의 CLEIA 방법의 정확한 정량분석을 위해 상기 직선 동적 범위(0.04 내지 20 IU/㎖) 이내였다. 따라서, 상기 1:2500의 희석비율에 대해 측정된 값을 계산에 사용한 경우, 상기 샘플의 원래 항-HBc 농도는 9.114 x 2500 = 22784 IU/㎖인 반면; 상기 1:12500의 희석비율에 대해 측정된 값을 계산에 사용한 경우, 상기 샘플의 원래 항-HBc 농도는 1.795 x 12500 = 22442 IU/㎖이었다. 상기 2 개의 측정된 값들의 평균 농도는 22613 IU/㎖이고, 상기 농도 값 및 상기 샘플에 대해 ELISA 방법에 의해 측정된 바와 같은 22083 IU/㎖의 농도 값은 2.4%의 오차를 가졌으며, 이는 정상 변동 범위 중에 있었다.
3. 이중 항원 샌드위치 분석 항-HBc 정량적인 관상 미세입자 화학발광 면역분석(CLIA) 방법
3.1 고정화된 항원 및 표지된 항원의 제조
본 발명의 실시예 1의 섹션 1.1의 방법을 사용하여 상기 제조를 수행하였다.
3.2 화학발광 반응 플레이트의 제조
(3.2.1) 1 ㎎의 자기 비드를 제공하고, 1 ㎖의 활성화 완충제 시스템(50 mM MES 5.0)으로 2 회 세척하고, 상등액을 버렸다. 1 ㎎ EDC 및 1 ㎎ NHS 작용제(각각 10 ㎎/㎖에 도달하도록 50 mM MES 5.0으로 제조하였다)를 가하고, 균질하게 혼합하고, 실온에서 진탕하고 20 분간 활성화시켰다.
(3.2.2) 상기 활성화된 자기 비드를 1 ㎖의 활성화 완충제 시스템(50 mM MES 5.0)으로 2 회 세척하고, 상등액을 버렸다. 25 ㎍의 Cp149 항원을 가하고, 균질하게 혼합하고, 실온에서 진탕하고 3 시간 동안 반응시켰다.
(3.2.3) PBST 세척 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20)을 사용하여 세척을 3 회 수행하였다. 이어서 각 웰에 2500 ㎕의 보존 용액(20 mM PB7.4, 0.1% BSA, 100 mM Gly, 0.05% TW-20, 0.1% 프로클린(Proclin))을 가하고 2 내지 8 ℃에서 대기 사용을 위해 보관하였다.
3.3 Cp183 항원의 아크리디늄 에스터 표지화
(3.3.1) 50 ㎍의 단백질 Cp183을 제공하고, 300 ㎕의 표지 완충제 시스템(50 mM 포스페이트 완충제, pH 8.0)을 가하고, 8 ㎕의 아크리디늄 에스터(5 mM NHS-SAE)를 가하고, 암실 조건 하에 실온에서 30 분간 반응시켰다.
(3.3.2) 100 ㎕의 정지 완충액(100 mM 글리신을 함유하는 포스페이트 완충제, pH 8.0)을 단계 (3.3.1)에서 반응된 혼합물에 가하고, 암실 조건 하에 실온에서 30 분간 반응시켰다.
(3.3.3) 단계 (3.3.2)에서 수득한 표지된 단백질을 투석 주머니에 로딩하고, 투석 완충액(20 mM 포스페이트 완충액, pH 7.4)으로 암실 조건 하에 4 ℃에서 6 내지 8 시간 동안 투석시켰으며, 여기에서 투석 완충액을 2 시간당 1 회 교환하였다.
(3.3.4) 단계 (3.3.3)에서 수득한 표지된 단백질을 보존 튜브로 옮기고, 2% BSA 및 50% 글리세롤을 가하고, -20 ℃에서 대기 사용을 위해 보관하였다.
(3.3.5) 단계 3.3.4에서 수득한 Cp183-SAE 표지를 아크리디늄 에스터 표지 희석 완충액(20%의 소 태아 혈청, 1%의 카제인, 10%의 슈크로스, 0.05%의 아미노피린을 함유하는 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 완충액, pH 7.4)으로 1/500의 부피비로 희석하여 발광 표지 반응 용액을 형성시키고, 이를 균질하게 혼합하고 2 내지 8 ℃에서 대기 사용을 위해 보관하였다.
3.4 정량적인 표준 샘플
기지 농도의 항-HBc(항-HBc = 22083 IU/㎖)를 갖는 샘플 P1을 제공하고, 일련의 방식으로 20%의 소 태아 혈청을 함유하는 PBS 용액으로 희석하고, CLIA 방법의 정량적인 표준 샘플로서 4000 IU/㎖, 1333 IU/㎖, 333 IU/㎖, 83.3 IU/㎖, 20.8 IU/㎖, 5.21 IU/㎖, 1.30 IU/㎖, 0.33 IU/㎖, 0.08 IU/㎖, 0.02 IU/㎖, 0.005 IU/㎖에 도달하도록 별도로 희석하였다.
3.5 항-HBc의 CLIA 정량 검출
만성 B형 간염 환자의 하나의 혈청 샘플(번호: P2)을 제공하고, 항-HBc 정량 검출을 하기의 단계들에 따라 수행하였다. 만성 B형 간염 환자가 대개는 비교적 높은 수준의 항-HBc를 갖는다는 사실에 비추어, 상기 샘플을 20%의 소 태아 혈청을 함유하는 PBS 용액으로 2 개의 희석비율: 1:500, 1:2500에 도달하도록 희석하고, 이어서 정량적인 CLIA 검출에 사용하였다. 상기 P2 샘플에 대해 실시예 1의 항-HBc ELISA 정량 검출 방법을 수행하고 그의 항-HBc 농도를 8069 IU/㎖로서 측정하였다.
(3.5.1) 샘플 반응: 50 ㎕의 자기 비드를 제공하고 반응 튜브에 가하고, 이어서 각 웰에 10 ㎕의 샘플 또는 표준 샘플을 가하고, 진탕하고 균질하게 혼합하고, 배양하고 37 ℃에서 15 분 동안 반응시켰다.
(3.5.2) 발광 표지 반응: 단계 3.5.1을 완료한 후에, 상기 화학발광 반응 플레이트를 PBST 세척 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20)으로 5 회 세척하고, 각 웰에 단계 3.3.5에서 제조한 바와 같은 발광 표지 반응 용액 50 ㎕를 가하고, 배양하고 37 ℃에서 10 분간 반응시켰다.
(3.5.3) 발광 반응 및 측정: 단계 3.5.2를 완료한 후에, 상기 화학발광 반응 플레이트를 PBST 세척 용액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20)으로 5 회 세척하고, 시리우스(Sirius)-L 단일 튜브 화학발광 검출기를 사용하여 여기 용액을 원 위치에서 주입하고, 광 강도를 동시에 검출하였다.
(3.5.4) 정량적인 표준 곡선의 작성: 단계 3.5.3을 완료한 후에, 11 개의 정량적인 표준 샘플의 측정된 값 및 그의 상응하는 농도에 대해 선형 회귀분석을 수행하고, 도 5의 정량적인 표준 곡선을 작성하였다. 도 5에 따라, 항-HBc 미세입자 화학발광 검출(CLISA) 방법은 정확한 정량분석을 위해 20.8 IU/㎖의 상한 및 0.02 IU/㎖의 하한을 가졌으며, 그의 직선 동적 범위는 3.02 자릿수였다. 측정된 RLU 값으로부터의 항-HBc 농도를 계산하기 위한 식은 Conc.항-HBc(IU/㎖) = 10(Log10(RLU) x 1.1409-5.861)이었다.
(3.5.5) 시험하고자 하는 샘플의 항-HBc 농도의 획득: P2 혈청의 연속 희석된 샘플들에 단계 3.5.1 내지 3.5.4의 측정을 수행하였으며, 1:500의 희석비율에 대해 측정된 RLU 값은 1571400이었고; 1:2500의 희석비율에 대해 측정된 RLU 값은 380560이었으며; 상기 측정된 값들을 단계 3.5.4에서 획득된 바와 같은 항-HBc 농도 계산을 위한 식에 도입시켰고, 1:500의 희석비율에 대해 측정된 농도 값은 16.16 IU/㎖이었고, 1:2500의 희석비율에 대해 측정된 농도 값은 3.204 IU/㎖이었으며, 상기 두 값들은 모두 상기 CLIA 방법의 정확한 정량분석을 위해 상기 직선 동적 범위(0.02 내지 20.8 IU/㎖) 이내였다. 따라서, 상기 1:500의 희석비율에 대해 측정된 값을 계산에 사용한 경우, 상기 샘플의 원래 항-HBc 농도는 16.16 x 500 = 8078 IU/㎖인 반면; 상기 1:2500의 희석비율에 대해 측정된 값을 계산에 사용한 경우, 상기 샘플의 원래 항-HBc 농도는 3.204 x 2500 = 8010 IU/㎖이었다. 상기 2 개의 측정된 값들의 평균 농도는 8044 IU/㎖이고, 상기 농도 값 및 상기 샘플에 대해 ELISA 방법에 의해 측정된 바와 같은 8069 IU/㎖의 농도 값은 3.1%의 오차를 가졌으며, 이는 정상 변동 범위 중에 있었다.
4. 상이한 단계의 HBV 감염된 사람의 혈청 항-HBc 수준의 분포
4.1 단면적인 환자 혈청 샘플의 선택
본 발명에서, 상이한 단계의 HBV 감염된 사람들의 혈청 항-HBc 수준의 분포를 연구하기 위해서, 과거에 HBV 감염되었고 치유된 건강한 사람의 350 개 혈청 샘플 및 만성 B형 간염 환자의 488 개 혈청 샘플을 모으고, 모든 혈청 샘플들을 혈청 분리 후 -80 ℃에서 보관하였다. 488 명의 환자 중에서, 109 명의 환자는 원발성 간암 환자였고, 63 명의 환자는 간 경변증 환자였으며, 나머지 316 명의 환자는 단순한 만성 B형 간염 환자였고, 모든 환자들은 C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), D형 간염 바이러스(HDV), E형 간염 바이러스(HEV)에 동반 감염될 가능성이 배제되고 동반되는 자가면역 또는 대사성 간 질병의 임상적인 의학적 증거가 없도록 선택되었다.
유럽 간 연구 협회의 만성 B형 간염 임상 관리를 위한 지침(2009)에 따라, 상기 316 명의 단순한 만성 B형 간염 환자를 상이한 감염 단계들로 나누었고, 여기에서 52 명의 환자는 면역 관용 단계(IT)에 있었으며, 35 세 미만의 연령, HBeAg 양성, 5 x 107 사본수/㎖ 초과의 혈청 HBV DNA 부하, 과거 12 개월 동안 측정된 바와 같은, 항상 정상의 상한(ULN, 즉 본 발명에서 40 U/L) 미만인 ALT 수준을 특징으로 하였고; 104 명의 환자는 면역 제거 단계(IC)에 있었으며, HBeAg 양성, 1 x 104 사본수/㎖ 초과의 혈청 HBV DNA 부하, ULN 2 배 초과의 ALT 수준을 특징으로 하였고; 75 명의 환자는 낮은-증식 단계(LR)에 있었으며, HBeAg 음성, 1 x 104 사본수/㎖ 미만의 혈청 HBV DNA 부하, 과거 12 개월 동안 측정된 바와 같은, 항상 ULN 미만의 ALT 수준을 특징으로 하였고; 85 명의 환자는 HBeAg 음성 간염 단계에 있었으며, HBeAg 음성, 2 x 104 사본수/㎖ 초과의 혈청 HBV DNA 부하, 및 ULN 2 배 초과의 ALT 수준을 특징으로 하였다.
4.2 임상 검사 방법
환자들의 혈청 ALT 수준 및 다른 간 기능 생화학적 지수들을 샘플 수집 후 24 시간째에 측정하였으며; 혈청 HBV DNA 부하 및 HBV 유전자형 검출을 종래 기술 문헌에 보고된 바와 같은 방법을 사용하여 수행하였고; HBsAg 정량분석을 베이징 완타이 바이오로지컬 파마시 캄파니 리미티드의 HBsAg 화학발광 정량분석 키트를 사용하여 수행하였으며; HBeAg 및 항-HBe를 애보트 레보라토리즈(Abbott Laboratories)(미국 소재)의 아키텍트(Architect) 화학발광 자동 검출 시스템으로 측정하였다.
4.3 환자들의 혈청 샘플의 항-HBc 정량분석
상기 분석을 본 발명의 실시예 1, 실시예 2 또는 실시예 3의 방법들을 사용하여 수행하였다.
4.4 통계학적 방법
그룹들 간의 연속적인 변수들의 비교를 독립적인(unpaired) t-시험, 또는 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) ANOVA를 사용하여 수행하였으며; 그룹들 간의 분류된 변수들의 비교는 맨텔-헨젤(Mantel-Haenszel) X2 시험 또는 피셔(Fisher) 정확 추론을 사용하여 수행하였고; 피어슨(Pearson) 시험을 상관 분석에 사용하였다. 진단 정확도 분석을 수용자 반응 특성(ROC)을 사용하여 수행하였고, 진단 효율을 계산하였다(ROC 곡선 아래의 면적, AUROC). 0.05 미만의 P 값은 유의수준의 통계 차이를 갖는 것으로 보였다.
4.4 환자 코호트의 기본적인 특징
섹션 4.1에 개시된 바와 같은 과거에 HBV 감염된 사람들 및 만성 HBV 보균자의 인구 통계학, 임상 바이러스학 및 혈액 생화학에 대한 배경 데이터를 표 1에 나타낸다.
[표 1]
4.5 상이한 단계의 HBV 감염된 사람들의 혈청 항-HBc 수준
도 6A/B는 상이한 질병 단계의 단면적인 환자의 혈청 항-HBc 수준, ALT 수준, HBsAg 수준 및 HBV DNA 부하의 분포 상황을 도시하였다. 과거에 감염된 사람은 만성 HBV 보균자의 경우보다 현저하게 더 낮은 혈청 항-HBc 수준을 가졌으며(중간값: 0.4 대 4.1 log10 IU/㎖, p<0.001, 1000 배 미만); 상이한 감염 단계의 단순한 만성 B형 간염 환자들 중에서, 혈청 항-HBc 수준은 현저하게 상이하였다. 면역 관용 단계 환자의 혈청 항-HBc 수준의 중간값은 3.4 log10 IU/㎖이었고, 면역 제거 단계 환자의 혈청 항-HBc 수준의 중간값은 4.4 log10 IU/㎖이었으며, 낮은-증식 단계 환자의 혈청 항-HBc 수준의 중간값은 3.3 log10 IU/㎖이었고, HBeAg 음성 간염 단계 환자의 혈청 항-HBc 수준의 중간값은 4.4 log10 IU/㎖이었다. 상기 데이터의 분석은 면역 제거 단계 및 HBeAg 음성 간염 단계 환자들의 혈청 항-HBc 수준이 면역 관용 단계 및 낮은-증식 단계 환자들의 경우보다 현저하 더 높고(p<0.001); 상기 면역 제거 단계 및 HBeAg 음성 간염 단계 환자들의 혈청 항-HBc 수준간에는 통계학적 차이가 없으며(p>0.05); 면역 관용 단계 및 낮은-증식 단계 환자들의 혈청 항-HBc 수준 간에 통계학적 차이가 없다(p>0.05). 상기 결과는 만성 B형 간염 환자의 혈청 항-HBc 수준이 숙주 면역 상태와 매우 상관이 있음을 보인다. 항-HBc의 높은 수준은, 환자가 항-HBc 수준을 환자 개인이 면역 활성 상태(면역 제거 단계 또는 HBeAg 음성 간염 단계)인지의 여부를 결정하는데 사용할 때, 항-HBV의 면역 활성 상태를 가짐을 가리키며, 진단 효율(AUROC, 곡선 아래 면적)은 ROC 곡선 분석을 통해 0.918(95% 신뢰도 구간: 0.888 - 0.948)이다(도 6C 참조). ROC 곡선을 사용하여 계산된 바와 같은 7400 IU/㎖의 최적화된 컷오프값이 한계값으로 사용될 때, 진단 감도는 87.3%이고, 진단 특이성은 83.5%이다.
B형 간염 간경변 환자 및 B형 간염 원발성 간암 환자의 혈청 항-HBc 수준을 분석하고 결과를 도 6A/B에 나타낸다. B형 간염 간경변 환자들 중에서, ALT≥ULN(LC-b 그룹)을 갖는 39 명 환자의 혈청 항-HBc 수준은 ALT<ULN(LC-a 그룹)을 갖는 24 명 환자의 경우보다 현저하게 더 높았던 반면(중간값은 4.2 log10 대 3.8 log10 IU/㎖, p = 0.016이었다); B형 간염 원발성 간암 환자들 중에서, ALT≥ULN(HCC-b 그룹)을 갖는 80 명 환자의 혈청 항-HBc 수준은 ALT<ULN(HCC-a 그룹)을 갖는 29 명 환자의 경우보다 현저하게 더 높았다(중간값은 4.1 log10 대 3.8 log10 IU/㎖, p = 0.006이었다). 상기 결과는 만성 간염 바이러스 감염된 사람들의 혈청 항-HBc 수준이 ALT 수준 및 숙주 면역 상태와 유의수준으로 상관됨을 추가로 입증한다.
4.6 만성 B형 간염 바이러스 보균자에서 항-HBc 수준 및 ALT 수준의 상관성
488 명의 만성 B형 간염 바이러스 보균자 모두(단순한 만성 B형 간염 환자, B형 간염 간경변 환자 및 B형 간염 원발성 간암 환자 포함, n=488) 중에서 상이한 ALT 분류된 환자들의 혈청 항-HBc 수준을 분석하였으며, 결과를 도 6D에 나타낸다. ALT≤5xULN을 갖는 환자들 중에서, 환자들의 평균 항-HBc 수준이 ALT 수준의 증가에 따라 증가한 반면(p 추세 < 0.001); ALT가 5xULN에 도달했을 때, 상기 혈청 항-HBc 수준은 최고값에 도달하였고 추가로 증가하지 않았다(p 추세 = 0.63). 상기 상관성 분석은 ALT≤5xULN(n = 328)을 갖는 환자에서, 평균 혈청 항-HBc 수준이 ALT 수준과 양으로 상관되었지만(단일 인자 분석: r = 0.52, p < 0.001; 다수-인자 분석: R = 0.53, p < 0.001), HBV DNA 수준(p = 0.25) 또는 HBsAg 수준(p = 0.33)과는 상관되지 않음을 보인다(도 6E). ALT≤5xULN을 갖는 환자에서, 항-HBc 수준과 ALT 수준간의 정량적인 상관성은 남성 환자(r = 0.53, p < 0.001) 또는 여성 환자(r = 0.43, p < 0.001)에서; HBV 유전자형 B로 감염된 환자(r = 0.49, p < 0.001) 또는 HBV 유전자형 C로 감염된 환자(r = 0.53, p < 0.001)에서; HBeAg 양성 환자(r = 0.57, p < 0.001) 또는 HBeAg 음성 환자(r = 0.50, p < 0.001)에서 항상 존재한다. ALT>5xULN(n = 160)인 경우, 항-HBc 수준은 ALT 수준과 통계학적 유의수준으로 상관되지 않으며(p = 0.43), HBV DNA 수준(p = 0.63) 또는 HBsAg 수준(p = 0.43)과 상관성이 없다.
5. 만성 B형 간염 바이러스 보균자의 자연적인 진행 동안 혈청 항-HBc 수준의 동적인 변화 및 다른 지표들과 그의 관계
5.1 환자 코호트
본 실시예에서, 항-HBV 치료를 받지 않은 총 9 명의 환자로부터 자연적인 진행의 수직 관찰을 위한 일련의 혈청 샘플들을 연구하였으며, 평균 관찰 기간은 103±38 주(57 내지 168 주)이었고, 추적 방문을 5 내지 17 회 수행하였으며, 77 개의 혈청 샘플을 사용하였다.
5.2 임상적인 검출 방법
상기 방법을 실시예 4의 섹션 4.2에 개시된 방법에 따라 수행하였다.
5.3 환자의 혈청 샘플의 항-HBc 정량분석
상기 분석을 실시예 4의 섹션 4.3에 개시된 방법에 따라 수행하였다.
5.4 통계학적 방법
수직 데이터 분석을 일반화 추정 방정식(GEE)을 사용하여 수행하고, 다른 통계학적 방법을 실시예 4에 개시된 바에 따라 수행하였다.
5.5 만성 B형 간염 바이러스 보균자의 자연적인 진행 동안 혈청 마커들의 동적인 변화 및 이들 간의 관계
추적 관찰 기간 동안 9 명의 환자(A 내지 G)의 항-HBc 수준, ALT 수준, HBsAg 수준 및 혈청 HBV DNA 부하의 동적인 변화를 도 7에 도시한다. 환자 A는 추적 관찰 기간 동안 면역 관용 단계를 가졌으며, 그의 혈청 HBV DNA 및 HBsAg는 항상 매우 높은 수준인 반면, ALT 수준 및 항-HBc 수준은 항상 매우 낮은 수준이었다. 환자 A를 제외하고, 다른 환자들(B 내지 G) 모두에게 1 회 이상의 간염 활성화가 가해졌다. 이들 환자를 관찰함으로써, 항-HBc 수준의 증가는 항상 ALT 수준의 증가를 동반함, 즉 간염의 발생을 동반하는 것으로 밝혀졌다. 대부분의 상황에서, 급성 간염 공격이 발생했을 때, 상기 환자들의 혈청 항-HBc 수준은 ALT 수준보다 대개 3 내지 8 주 늦게 피크값에 도달하였으며(도 7, 예를 들어 환자 C의 상황, 환자 D의 첫 번째 기간, 환자 F, 및 환자 G 및 I의 첫 번째 기간); 일부의 경우에, 상기 환자들의 혈청 항-HBc 수준은 ALT 수준에 비해 더 일찍 또는 동시에 피크값에 도달한다(도 7, 예를 들어 환자 B, 환자 D의 상황, 환자 F 및 환자 H, 환자 E의 두 번째 기간). 간염의 회복 단계 동안, 항-HBc의 감소는 ALT보다 느렸고, 항-HBc는 ALT가 정상으로 복원된 후 대개 12 내지 20 주째에 기준선으로 복원되었다.
일반적으로, 다수-인자 수직 데이터 분석은, 혈청 항-HBc 수준이 ALT 수준과 독립적으로 상관되나(β = 0.65, p < 0.001), 혈청 HBV DNA 부하(β = -0.006, p = 0.98) 및 HBsAg 수준(β = -0.034, p = 0.45)과는 통계학적 유의수준의 상관성이 없음을 보인다.
6. 항-HBc 수준은 만성 B형 간염 환자에서 항바이러스 요법의 치료 효과를 예측하기 위해 사용될 수 있다.
6.1 환자 코호트
환자 코호트 A: 49 명의 HBeAg 양성 환자, 모든 환자들은 총 96 주 동안 아데포비어 디피복실(10 ㎎/일) 치료를 받았고, 치료 정지 후 12 주 동안 추적 방문을 받았다.
환자 코호트 B: 48 명의 HBeAg 양성 환자, 모든 환자들은 총 24 주 동안 peg인터페론 알파-2a(지속-작용성 인터페론 α-2a, 180 ㎍/주) 치료를 받았고, 치료 정지 후 24 주 동안 추적 방문을 받았다.
상기 환자들은 모두 치료 전에 APASL의 만성 B형 간염의 임상 관리 지침에 의해 권장되는 바와 같은 치료에 허용 가능한 질병 기준을 충족하였다, 즉 HBsAg는 연속적으로 1 년 이상 양성이었고, HBeAg는 양성이고 항-HBe는 음성이었으며, 혈청 ALT 수준은 ULN의 2 배 초과였고; 상기 환자들은 C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), D형 간염 바이러스(HDV), E형 간염 바이러스(HEV)에 동반 감염될 가능성이 배제되고 동반되는 자가면역 또는 대사성 간 질병의 임상적인 의학적 증거가 없도록 선택되었다.
6.2 임상적인 검출 방법
상기 방법을 실시예 4의 섹션 4.2에 개시된 방법에 따라 수행하였다.
6.3 환자의 혈청 샘플의 항-HBc 정량분석
상기 분석을 실시예 4의 섹션 4.3에 개시된 방법에 따라 수행하였다.
6.4 치료 끝의 한정
주 치료의 끝을 HBeAG 혈청전환이 추적 방문의 끝에서 발생했을 때로 한정하였다.
6.5 통계학적 방법
모든 통계학적 방법들을 실시예 4에 개시된 바에 따라 수행하였다.
6.6 환자 코호트의 기본적인 특징
표 2에 나타낸 바와 같다.
[표 2]
6.7 기준선 항-HBc 수준은 치료 후 HBeAg 혈청전환의 발생률과 상관있다.
치료 및 추적 관찰 후에, 코호트 A(아데포비어 디피복실에 의한 치료를 받은)의 49 명 환자 중 9 명이 추적 방문의 끝에서 HBeAg 혈청전환이 발생하였고, 치료 유효율은 18.4%(95% CI: 8.8 내지 32.0%)인 반면; 코호트 B(지속-작용성 인터페론에 의한 치료를 받은)의 48 명 환자 중 23 명이 추적 방문의 끝에서 HBeAg 혈청전환이 발생하였고, 치료 유효율은 47.9%(95% CI: 33.3 내지 62.8%)였다.
상기 치료를 받기 전 2 개의 코호트에서 상기 치료가 유효한 환자 및 상기 치료가 유효하지 않은 환자의 임상적인 지표들을 분석하였으며, 결과를 표 3에 나타내었다. 아데포비어 디피복실로 치료된 환자 또는 지속-작용성 인터페론으로 치료된 환자에 대해서, 연령, 성비, ALT 수준, 혈청 HBV DNA 부하, HBsAg 수준 및 항-HBc-IgM 수준에 따른 상기 치료가 유효한 환자와 상기 치료가 유효하지 않은 환자 간의 통계학적 유의수준 차이는 없었다. 그러나, 상기 치료가 유효한 환자의 기준선 항-HBc 수준은 유효하였으며 상기 치료가 유효하지 않은 환자의 경우보다 현저하게 더 높았다, 즉 코호트 A에서, 4.58±0.28 대 4.15±0.42 log10 IU/㎖, p=0.005; 코호트 B에서, 4.32±0.66 대 3.81±0.68 log10 IU/㎖, p=0.011. 이러한 결과는 상기 치료 전 항-HBc 수준이 환자의 예상되는 치료 효과를 예측할 수 있었음을 암시한다. ROC 분석은 기준선 항-HBc 수준을 사용하여 추적 방문의 끝에서 HBeAg 혈청전환의 예측을 위한 AUROC 값이 코호트 A에서 0.810이고(95%, CI: 0.675-0.948, p =0.004, 도 8A 참조), 최상의 컷오프 값은 29000 IU/㎖이며, 상기 진단 감도가 77.8%이고, 진단 특이성은 77.5%이며; 코호트 B에서의 상기 AUROC 값은 0.710이고(95% CI: 0.564-0.855, p=0.013, 도 8B 참조), 최상의 컷오프 값은 9000 IU/㎖이며, 상기 진단 감도가 69.6%이고, 진단 특이성은 60.0%임을 보인다.
[표 3]
6.8 기준선 항-HBc 수준을 사용하는 치료 후 HBeAg 혈청전환의 발생률의 예측
섹션 6.7에서 계산된 바와 같은 컷오프 값을 치료 전에 사용하여 환자가 치료를 받은 후의 HBeAg 혈청전환의 발생률을 예측할 수 있었다. 코호트 A에서, 도 8C에 나타낸 바와 같이, 29000 IU/㎖ 초과의 기준선 항-HBc 수준을 갖는 16 명의 환자 중 7 명이 추적 방문의 끝에서 HBeAg 혈청전환이 발생한 반면(유효율: 43.8%); 29000 IU/㎖ 미만의 기준선 항-HBc 수준을 갖는 33 명의 환자 중 단지 2 명만이 추적 방문의 끝에서 HBeAg 혈청전환이 발생했고(유효율: 6.1%), 높고 낮은 항-HBc 그룹들 간의 HBeAg 혈청전환의 발생률의 비(위험비, RR)는 7.22였다(95% CI: 1.69-30.9, p=0.006). 코호트 B에서, 도 8D에 나타낸 바와 같이, 9000 IU/㎖ 초과의 기준선 항-HBc 수준을 갖는 25 명의 환자 중 16 명이 추적 방문의 끝에서 HBeAg 혈청전환이 발생한 반면(유효율: 64.0%); 9000 IU/㎖ 미만의 기준선 항-HBc 수준을 갖는 23 명의 환자 중 단지 7 명만이 추적 방문의 끝에서 HBeAg 혈청전환이 발생했고(유효율: 30.4%), 높고 낮은 항-HBc 그룹들 간의 HBeAg 혈청전환의 발생률의 비(위험비, RR)는 2.10이었다(95% CI: 1.06-4.17, p=0.006).
상이한 ALT 수준을 갖는 환자들에서 치료 후 HBeAg 혈청전환의 예측을 위한 기준선 항-HBc의 효과를 추가로 분석하였으며, 결과를 도 8E에 나타내었다. 2 개의 코호트에서, ≤5xULN 또는 >5xULN의 기준선 ALT 수준을 갖는 환자들의 하위그룹들에 관하여, 보다 높은 항-HBc 수준을 갖는 환자들이 보다 낮은 항-HBc 수준을 갖는 환자들에 비해 치료 후 보다 높은 혈청전환 발생률을 가졌다. 아데포비어 디피복실 및 지속-작용성 인터페론의 치료를 받은 환자들을 분석을 위해 합하였으며, 모든 환자를 3 개의 그룹, 즉 높은 항-HBc 수준(≥29000 IU/㎖), 중간 항-HBc 수준(9000 내지 29000 IU/㎖) 및 낮은 항-HBc 수준(<9000 IU/㎖)으로 나누었고, 치료 후 상기 3 개 그룹 환자의 HBeAg 혈청전환율을 분석하였으며, 결과를 도 9에 나타내었다. ≥29000 IU/㎖의 기준선 항-HBc 수준을 갖는 환자들 가운데, 아데포비어 디피복실의 치료를 받은 16 명의 환자 중 9 명이 치료 후 HBeAg 혈청전환을 가졌고, 반응률이 43.8%인 반면, 지속-작용성 인터페론의 치료를 받은 15 명의 환자에서 상기 비율은 66.7%(10/15)이었고, 이들 간에 통계학적 유의수준 차이는 없었으며(p=0.82); 9000 내지 29000 IU/㎖의 기준선 항-HBc 수준을 갖는 환자에 대해서, 아데포비어 디피복실의 치료를 받은 19 명의 환자 중 단지 2 명만이 치료 후 HBeAg 혈청전환을 가졌고, 반응률이 10.5%인 반면, 지속-작용성 인터페론의 치료를 받은 10 명의 환자에서 상기 비율은 60.0%(6/10)이었고, 이들 간에는 통계학적 유의수준 차이가 있었으며(p=0.018); <9000 IU/㎖의 기준선 항-HBc 수준을 갖는 환자에 대해서, 아데포비어 디피복실의 치료를 받은 16 명의 환자 중 누구도 치료 후 HBeAg 혈청전환을 갖지 않은 반면, 지속-작용성 인터페론의 치료를 받은 23 명의 환자 중 7 명이 HBeAg 혈청전환을 가졌고(30.4%), 이들 간에는 통계학적 유의수준 차이가 있었다(p<0.001).
6.9 아데포비어 디피복실 치료 중 및 치료 후 환자의 항-HBc 수준의 동적인 변화
아데포비어 디피복실의 치료 중 및 치료 후 환자의 항-HBc 수준의 동적인 변화에 따라(도 10A 참조), 전체 치료 및 관찰 기간을 3 개의 단계로 나눌 수 있었다, 즉 (1) 기준선 내지 치료 시작 후 60 주, 이 단계에서 환자의 평균 혈청 항-HBc 수준은 치료의 지속에 따라 직선 감소를 나타내었고(r=0.99, p<0.001), 12 주당 0.20±0.05 log10 IU/㎖이 감소하였으며; (2) 치료 시작 후 60 주 내지 치료의 끝(96 주), 환자의 평균 혈청 항-HBc 수준은 플랫폼에 도달하였고, 치료의 지속에 따라 감소하지 않았으며(p=0.87); (3) 약물 치료 후(108 주), 환자의 평균 혈청 항-HBc 수준은 치료의 끝(96 주)에서와 비교 시 현저한 반동을 나타내었고, 평균 증가는 0.29 log10 IU/㎖이었다(p<0.001). 일반적으로, 상기 항-HBc 수준은 치료 과정 동안 ALT 수준, HBV DNA 수준 및 HBsAg 수준보다 더 느리게 감소하였으며, 전자는 치료 시작 후 60 주째에 플랫폼 단계에 도달한 반면, 나중의 3 개 지표는 치료 시작 후 24 주째에 플랫폼 단계에 도달하였다. 다수-인자 수직 분석은, 항-HBc 수준이 ALT 수준과 독립적으로 상관되지만(β = 0.830, p<0.001), HBV DNA 수준(β = 0.003, p = 0.94) 또는 HBsAg 수준(β = -0.061, p = 0.52)과는 통계학적 유의수준의 상관성이 없었다.
본 실시예의 섹션 6.7에서 측정된 임상적인 컷오프 값에 따라, 아데포비어 디피복실의 치료를 받은 모든 환자를 2 개의 그룹, 즉 ≥29000 IU/㎖(n=16, HBc-높은) 및 <29000 IU/㎖(n=33, HBc-낮은)로 나누었으며, 상기 두 그룹 간의 치료 중 및 치료 후 혈청 항-HBc, HBV DNA, ALT 및 HBsAg 수준의 동적인 변화를 비교하고, 결과를 도 10B에 나타내었다. HBV DNA 수준(7.61±1.15 대 7.50±1.22 log10 사본수/㎖, p=0.77) 및 HBsAg 수준(4.34±0.31 대 4.38±0.69 log10 IU/㎖, p=0.83)에 관하여 HBc-높은 및 HBc-낮은 그룹 간의 통계학적 차이는 없는 반면; HBc-높은 그룹의 기준선 ALT 수준은 HBc-낮은 그룹의 경우보다 더 높았지만, 통계학적 유의수준 차이는 없었다. 치료 중에, 상기 두 그룹의 ALT 수준 및 항-HBc 수준의 감소 곡선은 각 모니터링 점들의 분석 또는 수직 분석에서 유의수준 차이가 없음을 보였으나; 약물 치료 후, 상기 HBc-낮은 그룹의 항-HBc는 HBc-높은 그룹의 경우에 비해 현저한 반동을 가졌고(p=0.039), ALT 수준은 유사한 상황이었지만, 통계학적 유의수준은 없었다(p=0.09). HBV DNA 수준에 관하여, HBc-높은 그룹 환자는 치료 중 또는 치료 후에 HBc-낮은 그룹의 경우보다 현저하게 더 낮은 혈청 HBV DNA 수준을 가졌다(p<0.05)(기준선 제외). 추적의 끝에서, HBc-높은 그룹 환자의 평균 HBV DNA 수준은 치료 전의 경우에 비해 3.48±2.24 log10 사본수/㎖까지 감소한 반면; HBc-낮은 그룹 환자의 평균 HBV DNA 수준은 치료 전의 경우에 비해 1.69±2.05 log10 사본수/㎖(p=0.008)까지 감소하였다. 상기 두 그룹의 HBsAg 수준 변경은 유의수준 차이를 나타내지 않았다.
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Claims (12)
- 만성 B형 간염 환자로부터 얻은 샘플에서 항-HBc의 수준을 정량적으로 검출하는 것을 포함하는 만성 B형 간염 환자가 B형 간염 바이러스에 대한 치료를 받기 전에 치료효과를 유효하게 예측하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 항-HBc 의 정량적인 검출을 하기의 방법들, 즉 효소-결합된 면역흡수 분석, 화학발광 면역검출법, 시간-분해 형광 검출법, 면역비탁분석법, 면역크로마토그래피법, 면역-삼출법 중 하나 이상에 의해 수행하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 항-HBc 수준의 단일 검출이 1.5 자릿수 이상의 직선 동적 범위를 갖는, 즉 단일 검출에 대한 정확한 정량분석 상한이 정확한 정량분석 하한보다 32 배 이상 더 높은 방법. - 제 1 항에 있어서,
항-HBc의 정량적인 검출이
a) B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 B형 간염 바이러스 단백질을 제공하고, 상기 단백질이 B형 간염 바이러스 코어 단백질의 완전 길이의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 오직 B형 간염 바이러스 코어 단백질의 1차 면역-우세 대역의 아미노산 서열만을 포함할 수 있으며, 상기 단백질이 고체 지지체 상에 고정화되고, 고상 항원으로서 작용하며, 혈청 샘플 중에 존재하는 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체를 포획하는데 사용되고;
b) 상기 고상 항원 상에 포획된 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 표지된 항원을 제공하며, 상기 표지된 항원이 B형 간염 바이러스 코어 단백질의 완전 길이의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 오직 B형 간염 바이러스 코어 단백질의 1차 면역-우세 대역의 아미노산 서열만을 포함할 수 있으며, 상기 표지된 항원 상의 신호 발생 물질이 양고추냉이 페록시다제, 알칼리성 포스파타제, 또는 아크리디늄 에스터일 수 있고;
c) 정량분석 표준 곡선을 작성하기 위해 기지의 농도들을 갖는 정량분석 표준 샘플(상이한 농도로 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체를 함유하는 3 내지 6 개의 샘플로 이루어진다)을 제공한다;
d) 상기 시험하고자 하는 샘플 또는 정량분석 표준 샘플을, 상기 샘플 중의 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체(존재하는 경우)가 포획되어 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 고상 항원-항체의 복합체를 형성하도록 상기 고상 항원과 접촉시키고;
e) 상기 표지된 항원을, B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 고상 항원-항체-표지된 항원의 복합체를 형성하도록, 상기 단계 d)의 생성물, 즉 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 고상 항원-항체의 복합체와 접촉시키고;
f) 신호 발생을 활성화시킬 수 있는 기질 또는 용액을, 측정가능한 신호를 발생시키도록 상기 단계 e)에서 형성된 바와 같은 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 고상 항원-항체-표지된 항원의 복합체와 접촉시키고, 상기 발생된 신호의 강도를 상응하는 측정 장비로 측정하며;
g) 상기 측정된 정량분석 표준 샘플 신호와 상기 샘플의 상응하는 농도와의 선형 회귀 정합을 수행하여 측정 신호로부터 샘플 농도를 계산하기 위한 수학식을 획득하고;
h) 상기 시험하고자 하는 샘플의 측정된 신호를 상기 단계 g)의 식에 도입하고, 상기 시험하고자 하는 샘플 중의 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체의 농도를 계산하고;
i) 상기 단계 h)에서 계산된 바와 같은 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체의 농도가 상기 검출 방법의 정확한 정량분석 상한보다 큰 경우, 상기 시험하고자 하는 샘플을 희석하고, 상기 측정된 농도가 상기 상응하는 검출 방법의 정확한 정량분석 상한과 하한 사이의 범위에 있을 때까지 상기 단계 a) 내지 h)를 반복하고, 상기 시험하고자 하는 샘플 중에 함유된 B형 간염 바이러스 코어 단백질에 대한 항체의 농도를 상기 희석 후 측정된 값에 희석비를 곱하여 계산하여 획득하는 단계들을 포함하는 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 치료는 지속-작용성 인터페론(peg화된 인터페론, Peg인터페론), 보통 인터페론(인터페론), 라미뷰딘(LMV), 아데포피어 디피복실(ADV), 엔테카비어(ETV), 텔비뷰딘(LdT), 테노포비어, 및 만성 B형 간염의 치료에 유용한 다른 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치료 약물을 사용하는 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 치료의 치료 효과를 예측하기 위한 통상적인 기준이 다음과 같은 방법:
치료 전 환자의 혈청 중에 보다 높은 수준의 항-HBc를 갖는 환자에서 획득된 치료 효과(반응률)가 상기 치료 전 환자의 혈청 중에 보다 낮은 수준의 항-HBc를 갖는 환자의 경우보다 우수하고; 치료 효과의 기준이 B형 간염 바이러스 E 항원 혈청전환(즉 치료를 받는 만성 B형 간염 환자에서 HBeAg(+)/항-HBe(-)에서 HBeAg(-)/항-HBe(+)로의 전환)이거나, 또는 바이러스학 반응(즉 만성 B형 간염 환자에서 혈청 HBV DNA 부하가 1000 사본수/㎖ 이하로 떨어진다), 또는 질병 상태의 경감 또는 양호한 예후를 가리킬 수 있는 다른 임상 지표일 수 있다. - 삭제
- 아데포비어 디피복실 또는 peg화된 인터페론의 치료를 받기 전에 만성 B형 간염 환자의 반응을 평가하는데에 사용되는 항-HBc.
- 삭제
- 삭제
- 제4항에 있어서,
상기 a)단계에서의 B형 간염 바이러스 단백질은, B형 간염 바이러스 코어 단백질의 첫 번째 아미노산에서부터 183번째 아미노산까지, 또는 첫 번째 아미노산에서부터 149 번째 아미노산까지를 포함하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 b)단계에서의 표지된 항원은, B형 간염 바이러스 코어 단백질의 첫 번째 아미노산에서부터 183번째 아미노산까지, 또는 첫 번째 아미노산에서부터 149 번째 아미노산까지를 포함하는 방법.
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