CN103616511A - 乙型肝炎核心抗体测定试剂盒以及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种乙型肝炎核心抗体测定试剂盒，包括试剂M、试剂R1、试剂R2以及对照品，所述试剂M中组分包括亲和素包被磁微粒，所述亲和素包被磁微粒经诊断试剂防腐剂处理；所述试剂R1中的组分包括生物素化HBcAg、Tris缓冲液以及诊断试剂防腐剂；所述试剂R2中的组分包括吖啶酯标记的抗-HBc、Tris缓冲液以及诊断试剂防腐剂；所述对照组包括人源性乙肝核心抗体、新生牛血清以及诊断试剂防腐剂；所述生物素化HBcAg和吖啶酯标记的抗-HBc形成双标记模式，所述双标记模式在试剂盒的测定中的免疫过程中保持液相。本发明提供一种灵敏度高、误差小、安全快速检测的乙型肝炎核心抗体测定试剂盒及检测方法。

Description

乙型肝炎核心抗体测定试剂盒以及检测方法
技术领域
本发明涉及乙型肝炎诊断试剂盒，具有设计基于竞争抑制法化学发光原理的乙型肝炎核心抗体测定试剂盒及检测方法。
背景技术
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的一种传染性疾病。HBV可以通过血液和体液直接传播，常见的传播方式包括输血、注射、伤口接触、母婴传播等；常见的临床症状有不适、发热、黄疸、无症状肝炎、暴发性肝炎以及慢性肝炎等，慢性感染易发展成为肝癌，因此，检测乙型肝炎的工作至关重要。
目前，常用的检测方法是免疫学检测，免疫学检测时基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质，激素等微量生物活性物质。免疫学检测经理了放射免疫检测、酶联免疫检测以及光生物学标记免疫检测技术三个阶段，使免疫学检测向着敏感性、准确性以及操作简捷性的方向发展。
化学发光免疫分析是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并借助其发光强度直接测定免疫结合。该方法灵敏度高、检测范围宽，是免疫学检测重要的发展方向。
发明内容
本发明解决了现有技术中的不足，提供一种灵敏度高、误差小、安全快速检测的乙型肝炎核心抗体测定试剂盒及检测方法。
本发明的技术方案为：一种乙型肝炎核心抗体测定试剂盒，包括试剂M、试剂R1、试剂R2以及对照品，所述试剂M中组分包括亲和素包被磁微粒，所述亲和素包被磁微粒经诊断试剂防腐剂处理；所述试剂R1中的组分包括生物素化HBcAg、Tris缓冲液以及诊断试剂防腐剂；所述试剂R2中的组分包括吖啶酯标记的抗-HBc、Tris缓冲液以及诊断试剂防腐剂；所述对照组包括人源性乙肝核心抗体、新生牛血清以及诊断试剂防腐剂；所述生物素化HBcAg和吖啶酯标记的抗-HBc形成双标记模式，所述双标记模式在试剂盒的测定中的免疫过程中保持液相。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述亲和素包被磁微粒的亲和素为链霉亲和素、中性亲和素或类亲和素，所述亲和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三铁为内核表面包裹活性基团的聚合物，所述磁微粒的直径为1.5um。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，试剂R1和试剂R2中所述Tris缓冲液的浓度均为0.05M，pH值为7.5。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述诊断试剂防腐剂为0.1%的Proclin300防腐剂。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述试剂R1的量为12ml，所述试剂R2的量为12ml，所述试剂M的量为3ml。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述对照品包括对照品1和对照品2两组，所述对照品1的量为0.5ml，近似浓度为0.0IU/ml，所述对照品2的量为0.5ml，近似浓度为2.0IU/ml。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，一种使用该乙型肝炎核心抗体测定试剂盒的检测方法，包括以下几步：
（1）在将待测样品和含有生物素化的基因表达的核心抗原（HBcAg）的试剂R1进行反应，形成含有抗体-抗原复合体的反应液1；
（2）在反应液1中加入含有吖啶酯标记的Anti-HBc的试剂R2进行反应，由于待测样品中Anti-HBc的结合抑制作用，形成生物素化HBcAg-吖啶酯标记抗体复合体的数量减少，得到反应液2；
（3）在反应液2中加入含有亲和素包被磁微粒的试剂M，反应液2中的复合体在生物素和亲和素的相互作用下形成固相，得到了反应液3；
（4）将反应液4置于化学发光测定仪上进行检测，在磁场中磁微粒将被吸附，通过洗涤液洗涤，将未结合物冲洗除去；然后，注入化学发光激发液1及化学发光激发液2，检测其化学发光光子强度；产生的光强度与样本内Anti-HBc浓度成反比。
本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述化学发光激发液1中含有过氧化氢，所述化学发光激发液2中含有氢氧化钠，所述洗涤液含有磷酸盐缓冲液。
本发明的解决了现有技术的缺陷，具有以下有益效果：
1.本发明涉及的乙型肝炎核心抗体测定试剂盒，制备简单，使用方便，易于储存，可用于定量测定人体血清（血浆）中的乙型肝炎病毒核心抗体，个体感染乙型肝炎病毒（HBV）后，一般会产生抗-HBc；在HBV感染康复者和HBsAg携带者中，抗-HBc可持续存在，抗-HBc是过去或现在感染HBV的指标，结合其它HBV感染血清学指标，可以判断HBV感染的不同阶段。使用该试剂盒来的检测方法是基于竞争抑制法化学发光原理，该方法灵敏度高、误差小、安全快速。
2.本发明提供的试剂盒中的生物素化HBcAg和吖啶酯标记的抗-HBc形成双标记模式，所述双标记模式在试剂盒的测定中的免疫过程中保持液相，使反应更充分、扩展线性、提高灵敏度、加快反应时间。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明，并使本发明的上述优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明一种乙型肝炎核心抗体测定试剂盒，组要组成成分如下：
试剂R1：每瓶12ml，内含有生物素化HBcAg即生物素标记的基因表达的核心抗原，0.05MpH值7.5Tris缓冲液，0.1%Proclin300诊断试剂防腐剂。
试剂R2：每瓶12ml，内含有吖啶酯标记的抗-HBc，0.05MpH值7.5Tris缓冲液，0.1%Proclin300诊断试剂防腐剂；其中，吖啶酯标记的抗-HBc以吖啶酯通过偶联剂偶联抗-HBc，偶联剂为二甲基亚胺或戊二醛，或者偶联剂可以选用其他业内常用的偶联剂。
试剂M：每瓶3.0ml，内含亲和素包被的磁微粒，经0.1%Proclin300诊断试剂防腐剂防腐处理；其中，亲和素包被磁微粒的亲和素为链霉亲和素、中性亲和素或类亲和素，亲和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三铁为内核表面包裹活性基团的聚合物，磁微粒的直径为1.5um。
对照品（Cal）：本发明实施例中的对照品分为1和2两组，均内含人源性的乙肝核心抗体，新生牛血清，0.1%Proclin300诊断试剂防腐剂；对照品浓度如下：Cal1的近似浓度为0.0IU/ml，Cal2的近似浓度为2.0IU/ml。
试剂盒中的生物素化HBcAg和吖啶酯标记的抗-HBc形成双标记模式，所述双标记模式在试剂盒的测定中的免疫过程中保持液相，使反应更充分、扩展线性、提高灵敏度、加快反应时间。
本发明的乙型肝炎核心抗体测定试剂盒用于测定人血清（血浆）中乙型肝炎核心抗体，个体感染乙型肝炎病毒（HBV）后，一般会产生抗-HBc；在HBV感染康复者和HBsAg携带者中，抗-HBc可持续存在，抗-HBc是过去或现在感染HBV的指标，结合其它HBV感染血清学指标，可以判断HBV感染的不同阶段。
本发明使用该试剂盒的检测原理是采用竞争抑制法化学发光原理，步骤如下：
第一步反应：将样本和生物素标记的基因表达的核心抗原（HBcAg）反应，如果标本中含有Anti-HBc，将形成抗体-抗原复合体。
第二步反应：加入吖啶酯标记的Anti-HBc进行反应，由于标本中Anti-HBc的结合抑制作用，形成生物素化HBcAg-吖啶酯标记抗体复合体的数量减少。
第三步反应：加入亲和素包被的微粒，复合体在生物素和亲和素相互作用下形成固相。
将反应液置于一个磁场内，检测中的磁微粒将被吸附，通过洗涤，将未结合物冲洗除去；然后，注入化学发光激发液1及化学发光激发液2，检测其化学发光光子强度；产生的光强度与样本内Anti-HBc浓度成反比。
实施例1
本发明具体实施例中的具体实验步骤如下：
首先，要获得待测样品，即血清，按照常规应用技术采集全血标本，放置半小时以上使凝集，在3000rpm的转速下离心10分钟以上，使血清分离完全，血清中不含细胞成分；血浆用肝素钠、EDTA-K3、枸橼酸钠或氟化钠/草酸钾抗凝。
然后，对该待测样品使用乙型肝炎核心抗体测定试剂盒进行检测：
（1）在将待测样品和含有生物素化的基因表达的核心抗原（HBcAg）的试剂R1进行反应，形成含有抗体-抗原复合体的反应液1；
（2）在反应液1中加入含有吖啶酯标记的Anti-HBc的试剂R2进行反应，由于待测样品中Anti-HBc的结合抑制作用，形成生物素化HBcAg-吖啶酯标记抗体复合体的数量减少，得到反应液2；
（3）在反应液2中加入含有亲和素包被磁微粒的试剂M，反应液2中的复合体在生物素和亲和素的相互作用下形成固相，得到了反应液3；
（4）将反应液4置于化学发光测定仪上进行检测，在磁场中磁微粒将被吸附，通过洗涤液洗涤，将未结合物冲洗除去；然后，注入化学发光激发液1及化学发光激发液2，检测其化学发光光子强度；产生的光强度与样本内Anti-HBc浓度成反比。
其中，所述化学发光激发液1中含有过氧化氢，所述化学发光激发液2中含有氢氧化钠，所述洗涤液含有磷酸盐缓冲液。
在本发明的实施例中如果待测样品是在24小时之内使用，可于2-8℃下保存，如果需要超过24小时的长期存放应该保存在-20℃以下，并且避免样品反复冻融。
本发明实施例中的化学发光测定仪是EVERESYSA1800Ⅰ类，在检测时，将试剂装载到化学发光测定仪试剂仓上，并在软件操作系统上确定装载就试剂的名称；试剂在装载前，应轻轻混匀，但禁止上下颠倒已打开的试剂；将检测样本装载在样本仓中，并在软件操作系统上确定样本检测项目；将反应杯装载满，也可以根据实验情况装载相应数量反应杯；每次检测样本量需要50ul，考虑检测系统死体积因素，应确保样本量在200ul以上，同时应考虑样本容器的死腔因素。
结果计算
测定仪自动计算得出Cut-off值，每份标本根据标本的RLU与Cut-off值的比值（S/CO），计算抗-HBc的检测结果。标本的抗-HBc测量S/CO值＞1判断为抗-HBc无反应性；标本的抗-HBc测量S/CO值≤1判断为抗-HBc反应性。
灵敏度
使用上述检测方法，测到抗-HBc试剂盒的灵敏度Cut-off值为≤0.5IU/mL；检测抗-HBc试剂国家盘灵敏度，符合标准；检测抗-HBc试剂国家盘阳性参考品，符合标准。
精密度
精密度依照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）EP5-A方案制定，对5份抗-HBc质控品（其中三份血清，二份为校准品），采用同一批次试剂，每天不同时间各检测一次，每次双孔，共进行20天，实验结果如下表1所示。
表1实验结果
本检测方法分别以血红蛋白（150mg/dL），甘油三酯（1200mg/dL），胆红素（30mg/dL），生物素（30ng/ml）为检测样本进行检测，结果均为无反应性。
本发明的乙型肝炎表面抗体试剂盒的检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据，为达到诊断目的，此检测结果要与临床检查、病史和其它的检查结果结合使用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种乙型肝炎核心抗体测定试剂盒，其特征在于，包括试剂M、试剂R1、试剂R2以及对照品，所述试剂M中组分包括亲和素包被磁微粒，所述亲和素包被磁微粒经诊断试剂防腐剂处理；所述试剂R1中的组分包括生物素化HBcAg、Tris缓冲液以及诊断试剂防腐剂；所述试剂R2中的组分包括吖啶酯标记的抗-HBc、Tris缓冲液以及诊断试剂防腐剂；所述对照组包括人源性乙肝核心抗体、新生牛血清以及诊断试剂防腐剂；所述生物素化HBcAg和吖啶酯标记的抗-HBc形成双标记模式，所述双标记模式在试剂盒的测定中的免疫过程中保持液相。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎核心抗体测定试剂盒，其特征在于，所述亲和素包被磁微粒的亲和素为链霉亲和素、中性亲和素或类亲和素，所述亲和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三铁为内核表面包裹活性基团的聚合物，所述磁微粒的直径为1.5um。
3.根据权利要求1所述的乙型肝炎核心抗体测定试剂盒，其特征在于，试剂R1和试剂R2中所述Tris缓冲液的浓度均为0.05M，pH值为7.5。
4.根据权利要求1所述的乙型肝炎核心抗体测定试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂防腐剂为0.1%的Proclin300防腐剂。
5.根据权利要求1所述的乙型肝炎核心抗体测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的量为12ml，所述试剂R2的量为12ml，所述试剂M的量为3ml。
6.根据权利要求1所述的乙型肝炎核心抗体测定试剂盒，其特征在于，所述对照品包括对照品1和对照品2两组，所述对照品1的量为0.5ml，近似浓度为0.0 IU/ml，所述对照品2的量为0.5ml，近似浓度为2.0 IU/ml。
7.一种使用权利要求1-6所述的乙型肝炎核心抗体测定试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下几步：
（1）在将待测样品和含有生物素化的基因表达的核心抗原（HBcAg）的试剂R1进行反应，形成含有抗体-抗原复合体的反应液1；
（2）在反应液1中加入含有吖啶酯标记的Anti-HBc的试剂R2进行反应，由于待测样品中Anti-HBc的结合抑制作用，形成生物素化HBcAg-吖啶酯标记抗体复合体的数量减少，得到反应液2；
（3）在反应液2中加入含有亲和素包被磁微粒的试剂M，反应液2中的复合体在生物素和亲和素的相互作用下形成固相，得到了反应液3；
（4）将反应液4置于化学发光测定仪上进行检测，在磁场中磁微粒将被吸附，通过洗涤液洗涤，将未结合物冲洗除去；然后，注入化学发光激发液1及化学发光激发液2，检测其化学发光光子强度；产生的光强度与样本内Anti-HBc浓度成反比。
8.根据权利要求7所述的乙型肝炎核心抗体测定试剂盒的检测方法，其特征在于，所述化学发光激发液1中含有过氧化氢，所述化学发光激发液2中含有氢氧化钠，所述洗涤液含有磷酸盐缓冲液。
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