CN101769929A - 乙型肝炎病毒表面抗体检测微粒、其制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乙肝的诊断试剂，公开了一种乙型肝炎表面抗体的检测微粒，为乙型肝炎表面抗原包被的发光微粒。本发明还公开了上述乙型肝炎表面抗体检测微粒的制备及应用。此外，本发明又进一步公开了一种测定样品中乙型肝炎表面抗体的体外诊断试剂盒，同时公开了该试剂盒的使用方法。本发明的试剂盒，可以与其它血清和临床信息联合用于诊断个体发生急性或慢性乙型肝炎感染的情况，也可用于对围产期女性乙型肝炎的筛选，以判断新生儿感染乙型肝炎的危险性。

Description

乙型肝炎病毒表面抗体检测微粒、其制备及应用

技术领域

本发明涉及乙肝的诊断试剂，具体涉及基于光激化学发光原理的乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)检测颗粒、其制备及应用。

背景技术

免疫学检测是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质，激素等微量生物活性物质。

我国免疫学检测基本经历了放射免疫检测(兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院)；酶联免疫检测(兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用)；以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术(20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期)三个阶段。这一衍变过程主要是基于对检测方法的敏感性、准确性、以及操作简捷性的需求的不断提高而决定的。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并籍助其发光强度直接测定免疫结合。由于其高灵敏度，检测范围宽等优点，已成为放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者，是免疫学检测重要的发展方向。

但目前国内自行研制的化学发光检测试剂，大多为非均相反应，采用化学底物直接标记，通过化学反应激发。其分析过程与传统酶标检测类似，需反复清洗与分离，检测耗时长，自动化程度不高。国外厂家检测试剂随发光基质与检测形式而各不相同。以Abbott，Bayer与Chiron等公司为代表的化学激发，即以化学发光底物直接标记抗原或抗体进行免疫测定。最常用的为吖啶酯，在碱性环境中可被过氧化氢氧化而发光。BD则以AKP，金钢脘为基质采用酶促化学发光。Roche则采用电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)，发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。因反应过程中牵涉到分离清洗，自动化设计复杂，仪器相当昂贵。此外，发光基质的稳定性也是一大问题。

光激化学发光法通过引入激光技术与纳米微球技术，成功地解决了上述不足。因反应在均相中进行，既加快了反应速度，又避免了反复分离与清洗步骤，能有效降低检测背景值，减少反应时间，并可实现自动化操作。目前，PE公司推出了针对生物研究用的光激化学发光试剂Alpha-Screen。但在临床检测领域，还没有面世的光激化学发光检测试剂，尤其是用于肿瘤标志物与肝炎检测项目。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于定性或定量检测乙型肝炎表面抗体(HBsAb)的检测微粒，其制备、检测条件及应用。

本发明的技术原理：

本发明的乙型肝炎表面抗体(HBsAb)检测试剂及试剂盒与光激化学发光检测技术相关，光激化学发光免疫技术是一种利用化学发光物质发射的光波进行免疫测定的方法。该技术主要整合了高分子微粒技术，有机合成，蛋白质化学与临床检测相关领域的研究。

本发明之所以能检测乙型肝炎表面抗体(HBsAb)，是由于在均相条件下，将内部带有染料的感光微粒(纳米级)以及包被有表面抗原(HBsAg)并且内部带有发光化合物的发光微粒(纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。此时纳米感光微粒和包被有表面抗原(HBsAg)的纳米发光微粒可迅速有效地捕捉HBsAb，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后，纳米感光微粒中的染料被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微粒俘获，从而传递能量以激活所述发光微粒中的发光化合物。数微秒后，发光微粒中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地反映了目标分子的浓度。而当样本不含HBsAb时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活性氧离子也无法传递至发光微粒表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无高能级红光产生。具体原理参见图1及图2。

基于上述原理，本发明第一方面提供了一种用于检测乙型肝炎表面抗体(HBsAb)的检测微粒，为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒。

本发明第二方面提供了一种乙型肝炎表面抗体(HBsAb)的检测试剂盒，包括上述表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒，试剂盒中，还可包括生物素标记的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和/或亲和素包被的感光微粒。

在试剂盒中，上述表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒、生物素标记的表面抗原(HBsAg)和亲和素包被的感光微粒分别独立包装，且均为混悬液。上述含有表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒、生物素标记的表面抗原(HBsAg)或亲和素包被的感光微粒的溶液的溶剂可以是常规的适合抗原抗体反应的溶剂体系，如HEPES缓冲体系、Tris缓冲体系。表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒的溶剂优选pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液，生物素标记的表面抗原(HBsAg)的溶剂优选pH8.0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的Tris缓冲液，亲和素包被的感光微粒的溶剂优选HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液，上述各种溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质如BSA以及防止微粒聚集的稳定试剂如Tween20，出于对试剂防腐以及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，防腐剂优选100U/ml庆大霉素和质量百分比为万分之五的Proclin 300作为防腐剂。

试剂盒中还可包括阳性对照、阴性对照以及参考样品。参考样品为含有乙型肝炎表面抗体的溶液，其乙型肝炎表面抗体的浓度为乙型肝炎表面抗体临床cutoff点对应的浓度。

在用于定量检测乙型肝炎表面抗体时，上述试剂盒中还可包括定标品，即含有多种确定浓度乙型肝炎表面抗体的溶液。上述不同乙型肝炎表面抗体浓度的溶液分别独立包装。

上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微粒。发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)₃/TOPO或Eu(TTA)₃/Phen等，该微粒可由市场上购得。

研究发现，由于最终的检测反应是均相反应，发光微粒的粒径(微粒的平均直径)太大(＞400nm)会自然沉降，影响检测效果，微粒的粒径太小(＜50nm)，会使制备过程中的清洗工作比较困难，对抗体连接工作不利，因此发光微粒的粒径范围应在50-400nm之间，较好为100-300nm之间，优选250nm。

发光微粒的表面官能团可以是任何能联接蛋白质的基团，但最常用的主要有羧基和醛基表面官能团的微粒。使用不同的微粒表面官能团，连接抗体的反应方式和条件也不相同。

鉴于获得更好的表面抗原(HBsAg)连接效率，试剂稳定性和连接重复性，在采用之后记载的改进方法作为抗体的连接方法时优选羧基表面官能团的微粒。

发光微粒的发光量会直接影响最终检测的发光效果。市场提供的发光微粒发光量一般会在50,000-10,000,000光子数/100μg发光微粒范围内，优选150,000-350,000光子数/100μg)发光微粒。

上述生物素标记的表面抗原(HBsAg)中，生物素与抗原的分子比例较佳为(10-20)∶1，优选15∶1。

上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激发下，可以产生单线态氧离子，当其与发光微粒距离足够近的情况下，单线氧离子传递到发光微粒，与发光微粒中的发光化合物反应，产生紫外光，紫外光再进一步激发镧系元素化合物，产生520-620nm波长光子。感光化合物可以是酞菁染料等，该微粒也可由市场上购得。

上述亲和素包被的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例无特殊限制，较佳为1∶(3-10)，优选1∶5。

市售感光微粒均适用于本发明，微粒粒径较佳为180-260nm，优选220nm。

表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒采用NaBH₃CN的还原胺化反应法制备，NaBH₃CN的还原胺化反应步骤如下：

1)混合：将发光微粒与表面抗原(HBsAg)按质量比例为10∶(1-3)混合于缓冲液中；

2)反应：加入缓冲液配制的NaBH₃CN溶液混合并反应；

3)封闭：加入缓冲液配制的Gly及NaBH₃CN溶液，混匀反应后，再加入BSA溶液封闭；

4)清洗产物，获得表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒。

其中，混合步骤中，发光微粒与表面抗原(HBsAg)的质量比例为10∶(1-3)，优选10∶2。反应缓冲液可为MES缓冲液、磷酸缓冲液，优选MES缓冲液，浓度优选0.05M，反应步骤中，反应溶液中发光微粒的浓度可为10-40mg/ml，优选20mg/ml。

改进的，表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒可采用下述方法制得：

1)混合：将发光微粒与表面抗原(HBsAg)混合于缓冲液中。较佳的，缓冲液为MES缓冲液，发光微粒与表面抗原(HBsAg)的质量比例为(8-15)∶1，优选12.5∶1。

2)反应：加入缓冲液配制的EDAC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)溶液混合并反应。较佳的，缓冲液为MES缓冲液，混合溶液中，发光微粒与EDAC的质量比为(15-40)∶1混合，优选质量比为25∶1。反应条件为37℃旋转反应。一般约48小时反应充分。

3)往步骤2获得的反应液中加入缓冲液配制的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，缩写为BSA)BSA溶液混匀并反应。较佳的，缓冲液为MES缓冲液。BSA溶液与步骤2获得的反应液体积比较佳为1∶1-1∶2。反应条件为37℃旋转反应。一般约16小时反应充分。

4)清洗产物，获得表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒。

清洗的方式可以为离心法清洗或透析法清洗。

透析法清洗步骤：采用反应缓冲液透析，每次4-5小时，更换缓冲液4次。透析清洗操作时间较长，且微粒损失较多，造成收率降低。

离心法清洗步骤包括离心去上清，加入反应缓冲液洗涤，超声处理打开沉淀，如此反复3-5次。离心法清洗时离心力会使发光微粒暂时聚集在一起，但经过超声处理可以很容易再次分散打开，此法操作时间短，且收率较高。因此优选采用此种清洗方式。

上述改进的制备方法与NaBH₃CN的还原胺化反应法的主要差别在于主要反应试剂NaBH₃CN替换成了EDAC，该试剂的替换，不仅使得反应时间与NaBH₃CN的还原胺化反应法相比缩短了4个多小时，而且发光微粒与表面抗原(HBsAg)的交联效率获得了提高，节省了表面抗原(HBsAg)用量，此外，试验表明，该方法制得的检测微粒与NaBH₃CN的还原胺化反应法制得的检测微粒相比，在相同条件下反应信号更强，灵敏度更高，检测范围也更广。

亲和素包被的感光微粒可采用NaBH₃CN的还原胺化反应法制备。

本发明第三方面，公开了上述试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

将待测样品与试剂盒中用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒、生物素标记的表面抗原(HBsAg)和亲和素包被的感光微粒混合反应，而后用激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。

上述激发光光源波长范围为600-700nm，优选640-680nm；反应孔发光的发射光光源波长范围为600-680nm，优选610-620nm；发射光延迟时间范围为100ms-1000ms；激发光光源的功率范围为5-100mw，优选40-60w。

较佳的，上述试剂盒的使用方法具体为：

1)在反应孔中加入样品、试剂盒中用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒和生物素标记的表面抗原(HBsAg)，获得初始反应溶液，混合反应；

2)再加入亲和素包被的感光微粒获得最终反应溶液进行反应；

3)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。

上述步骤1)的反应条件为37℃温育10-30分钟，优选20分钟，步骤2的反应条件也为37℃温育10-30分钟，优选15分钟。

步骤1中，表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒为混悬液，表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒在混悬液中的浓度无特殊限制，可以为200ug/ml-300ug/ml，优选250mg/ml。

步骤1中，生物素标记的表面抗原(HBsAg)为混悬液，生物素标记的表面抗原(HBsAg)在混悬液中的浓度无特殊限制，可以为6ug/ml-8ug/ml，优选7ug/ml。

步骤1中，亲和素包被的感光微粒为混悬液，亲和素包被的感光微粒在混悬液中的浓度一般控制在30-100μg/ml，可以为30-50μg/ml，优选40μg/ml。

上述方法中，初始反应溶液的体积无特殊限制，可以为30-75μl，优选75μl；最终反应溶液的体积也无特殊限制，可以为100-250μl，优选250μl。

上述样品包括血清、血浆、全血、前述参考样品或定标品。

上述乙型肝炎表面抗体(HBsAb)的检测试剂盒的使用方法，在定量检测乙型肝炎表面抗体时，还包括：根据标准曲线计算待测样品HBsAb含量。

本发明是采用光激化学发光检测技术，测定人血清样品中乙型肝炎表面抗体(HBsAb)的定量及定性体外诊断试剂盒，可以与其它血清和临床信息联合用于诊断个体发生急性或慢性乙型肝炎感染的情况，也可用于对围产期女性乙型肝炎的筛选，以判断新生儿感染乙型肝炎的危险性。

本发明与检测对象相近的乙型肝炎表面抗体(HBsAb)酶免法试剂盒在方法学上比较，酶免法以OD值体现样本检测值，OD值可检测范围窄，仅可做定性检测，且灵敏度低。本发明的试剂盒采用光激化学发光法测定标本中的HBsAb，具有灵敏度高、检测范围宽等特点，在方法学上较酶免法能达到更高的灵敏度和更优的检测范围。

附图说明

图1：光激化学发光免疫技术原理图：微粒结合形成二聚体，产生光子信号

图2：光激化学发光免疫技术原理图：未结合微粒，无光子信号产生

图3：单线态氧随微粒间距离衰减，在大概600nm的距离，基本没有单线氧的存在，因此也不发光

FG BEAD：发光微粒，内含发光分子；

GG BEAD：感光微粒，内含感光分子；

Singlet Oxygen：单线态氧，活性氧离子；

A/B：两者可直接或间接特异结合的活性分子。如在双抗夹心检测中，A，B为针对靶分子C不同的表位的单克隆抗体

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实验中仪器原料来源及试剂配方：

原料及试剂                        厂家

Biotin-X-X-NHS                    Sigma TLC≥95％

BSA                               Equitech/protease free

Gly                               Sigma≥95％

HEPES                             华美

Tris                              Sigma

NaBH₃CN                           Acros

Avidin                            Pierce

EDAC                              Sigma

HBsAg                             厦门波生生物有限责任公司

感光微粒                          美国PentaTek公司

发光微粒                          美国PentaTek公司

仪器                     型号                    厂家

粒径仪                   Model 370               Nicomp

酶标仪                   MultiSKAN MK3           labsystem

紫外可见分光光度计       752P                    上海光谱有限公司

荧光分光光度计           F95                     上海棱光技术有限公司

光激化学发光分析系统                             博阳生物/上海北滨光子

实施例1表面抗原包被的发光微粒的制备

抗原与发光微粒制备方法：

1)发光微粒混悬液处理：吸取一定量的羧基发光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声破碎至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节发光微粒浓度至100mg/ml。

2)抗体处理：HBsAg抗原于0.05M pH6.0的MES缓冲液(以下简称MES缓冲液)透析，透析完成后测定浓度，并调节浓度至8mg/ml。

3)MES缓冲液、100mg/ml的发光微粒混悬液(MES缓冲液)和8mg/ml的HBsAg抗原(MES缓冲液)以及，以1∶1∶1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

4)用MES缓冲液配制40mg/ml的EDAC溶液，按照与发光微粒100mg/100uL EDAC的比加入，迅速混匀，37℃旋转反应48小时。

5)加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5∶8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

6)用MES缓冲液离心清洗四次，最后用发光试剂缓冲液进行悬浮，测定粒径和固含量，调节浓度至10mg/ml。

将上述方法与采用NaBH₃CN的还原胺化反应法制得的检测微粒进行比较。

NaBH₃CN还原胺化反应法的制备方法：

1)发光微粒混悬液处理：吸取一定量的发光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量Mes缓冲液，超声破碎至微粒重新悬浮，加入磷酸缓冲液调节发光微粒浓度至100mg/ml。

2)抗体处理：HBsAg于0.02M pH7.0的Mes缓冲液透析，透析完成后测定浓度，并调节浓度至8mg/ml。

3)Mes缓冲液、100mg/ml的发光微粒混悬液(Mes缓冲液)和8mg/ml的HBsAg(Mes缓冲液)以及，以1∶2∶5的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

4)用Mes缓冲液配制25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液1∶25的体积比加入，迅速混匀，37℃旋转反应48小时。

5)Mes缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液2∶1∶10的体积比加入上述溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(Mes缓冲液)，其与反应液体积比为5∶8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

6)用Mes缓冲液离心清洗四次，最后用发光试剂缓冲液进行悬浮，测定粒径和固含量，调节浓度至10mg/ml。

两者制备结果的比较：

1.节省了制备时间

	NaBH3CN还原胺化反应法	改进的制备工艺
			制备100mg交联抗原的发光微粒	72h	68h

2.提高了抗体交联效率，节省了抗体用量

	原有制备工艺	新制备工艺
			1mg抗原交联微粒	5mg	12.5mg

3.增强了反应信号

	原有制备工艺定标品6信号值	新制备工艺定标品6信号值
			250ug/mlHBsAg的发光微粒与7ug/ml的生物素化HBsAg反应	600000	700000

4.提高了灵敏度

	原有制备工艺定标品2信号值/定标品1信号值	新制备工艺定标品2信号值/定标品1信号值
			250ug/mlHBsAg的发光微粒与7ug/ml的生物素化HBsAg反应	1540/1000＝1.54	2092/1000＝2.092

5.扩大了检测范围

	原有制备工艺检测范围	新制备工艺检测范围
			250ug/mlHBsAg的发光微粒与7ug/ml的生物素化HBsAg反应	0-750mIU/ml	0-1000mIU/ml

参照前述1)的制备方法制备表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒，并通过各项性能测试比较从以下几方面进行了具体工艺条件的选择研究：

研究中涉及的各个参数的检测方法如下：

1.光信号检测方法：

在反应孔中分别加入25μl样品，再依次加入25μl发光试剂和25μl生物素化抗原试剂。然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育20分钟，再自动加入175μl亲和素包被的感光微粒试剂后37℃温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。

2.灵敏度检测方法：

检测灵敏度参考品(编号L1-1～3、L2-1～3、L3-1～3)光信号，均需检出所要求的灵敏度参考品(需检出L1-2；L2-2；L3-2)。

L1-1～3、L2-1～3、L3-1～3配方：选取了3份不同来源的血清标本，经检测HCV、HIV均为阴性，HBsAb经ABBOTT公司试剂盒检测确认为阳性，分别按照比例稀释后得到3个标本系列：

编号	1∶64	1∶128	1∶256	1∶512	1∶1024
						1#(S/CO值)	31.2	15.4	7.4	3.7	1.8

编号	1∶64	1∶128	1∶256	1∶512	1∶1024
						2#(S/CO值)	32.4	16.1	8.3	4.1	2.1

编号	1∶64	1∶128	1∶256	1∶512	1∶1024
						3#(S/CO值)	53.1	26.5	13	6.9	3.4

结果表明按上述比例稀释后组成的3个标本系列为弱阳性标本，可用于试剂盒灵敏度的考核。按比例配制1#标本的1∶256-1∶1024、2#标本的1∶256-1∶1024、3#标本的1∶512-1∶2048组成的3个系列作为灵敏度参考品(编号L1-1～3、L2-1～3、L3-1～3)。

3.特异性检测方法：

检测20份特异性参考品光信号，不得检出假阳性，无假阳性则记为20/20。

特异性参考品配方：从收集的HBsAb阴性标本中选取20份，组成特异性参考品，编号N-01～N-20。标本选择时既包括了健康人标本，也包括了的较易引起假阳性的特殊人群标本。其具体组成如下：

标本类型	份数
		正常献血员标本	6份

标本类型	份数
		甲肝阳性标本	3份
丙肝阳性标本	1份
		类风湿关节炎病人标本	4份
高血脂等其他病人标本	6份

4.Hook检测：检测HBsAb浓度分别为8000mIU/ml、10000mIU/ml、12000mIU/ml、14000mIU/ml的样本光信号，结果应大于1000mIU/ml。

5.精密性检测方法：

检测HBsAb浓度分别为15mIU/ml和600mIU/ml的质控品光信号，每个浓度做10孔重复测定，代入公式，计算CV值。低浓度的精密性测定表示为QC L，高浓度的精密性测定表示为QC H。

6.线性检测方法：

对除0值外其他5点定标品(实施例6制备)做线性分析，计算线性相关系数r(r应大于0.99)

7.工艺条件选择：

a.缓冲液及反应pH值选择

其它反应条件：20mg/ml的发光微粒反应浓度，12.5∶1的发光微粒与HBsAg质量比，离心法清洗。

对比实验结果，发现无论是抗原连接率(％)、抗HOOK能力，还是精密度，0.05M pH6.0的MES缓冲液都好于0.02M pH7.0的PB缓冲液，因此选择0.05M pH6.0的MES缓冲液。

b.发光微粒与抗原的反应比例

其它反应条件：0.05M pH6.0的MES buffer作为反应缓冲液，离心法清洗。

抗原加入量与发光微粒上包被的抗原量基本呈正比关系，但抗原继续增加时包被上的抗原达到饱和。综合考虑QC结果及成本问题，选择发光微粒与HBsAg的比例为12.5∶1作为反应条件。

c.清洗方式

其它反应条件：0.05M pH6.0的MES buffer作为反应缓冲液，20mg/ml的发光微粒反应浓度，12.5∶1的发光微粒与HBsAg比例。

透析法清洗步骤：采用反应缓冲液透析，每次4-5小时，更换缓冲液4次。透析清洗操作时间较长，且微粒损失较多，造成收率降低。

离心法清洗步骤包括离心去上清，加入反应缓冲液洗涤，超声处理打开沉淀，如此反复3-5次。离心法清洗时离心力会使发光微粒暂时聚集在一起，但经过超声处理可以很容易再次分散打开，此法操作时间短，且收率较高。因此优选采用此种清洗方式。

最终选择250nm的粒径，发光量为≥250,000光子数/100μg的发光微粒，0.05M pH6.0的MES buffer作为反应缓冲液，12.5∶1的发光微粒与HBsAg比例，离心法清洗作为最优制备条件。

实施例2生物素标记抗原的制备

制备方法：

1)抗原处理：将HBsAg透析于0.1M NaHCO₃溶液，测定抗原浓度并调节至1mg/ml。

2)用DMSO配制16.17mg/ml的Biotin溶液。

3)标记：取处理好的1mg/ml HBsAg标记抗原与配制好的Biotin溶液，二者按照72∶10000的体积比进行混合，迅速混匀。4℃静置反应12～16小时。

4)透析：将反应好的生物素标记抗原透析于生物素标记透析缓冲液(pH8.0)。

5)将透析好的生物素化抗原吸出转移至干净离心管中，取样测定抗原浓度。将质检合格的生物素标记抗原浓度调节至0.5mg/ml。

将抗原与Biotin按照不同比例进行反应并进行检测：

光信号检测方法：

在反应孔中分别加入25μl样品，再依次加入25μl发光试剂和25μl生物素化抗原试剂。然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育15分钟，再自动加入175μl亲和素包被的感光微粒试剂后37℃温育15分钟。仪器自动产

生激光照射微孔计算每孔发光光子量。

标记比例越高，与实际测定比例之间的偏差越大。从灵敏度及Hook effect等方面进行考虑，最终选择15∶1的比例。

实施例3亲和素包被的感光微粒的制备

感光微粒：采用粒径为220±40nm的感光微粒(美国PentaTek公司)

制备方法：

a、感光微粒混悬液处理：吸取一定量的感光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节感光微粒浓度至100mg/ml。

b、亲和素溶液配制：称量一定量Avidin，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。

c、混合：将处理好的感光微粒混悬液、8mg/ml的Avidin以及MES缓冲液，以2∶5∶1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

d、反应：MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液1∶25的体积比加入，迅速混匀。37℃旋转反应48小时。

e、封闭：MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液2∶1∶10的体积比加入上述溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5∶8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

f、清洗：向反应好的溶液中加入MES缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃上清，加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次，最后用少量的感光试剂缓冲液进行悬浮，测定固含量，用感光试剂缓冲液调节浓度至10mg/ml。

实施例4临床cutoff点确定

试剂配制：

1.发光抗原缓冲液：pH8.0成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液，添加BSA及100U/ml庆大霉素和质量百分比为万分之五Proclin 300。

2.生物素标记抗原缓冲液：pH8.0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的Tris缓冲液，添加BSA及100U/ml庆大霉素和质量百分比为万分之五Proclin 300。

3.表面抗原(HBsAg)包被的发光微粒试剂：采用实施例1的方法，选择250nm的粒径，发光量为≥250,000光子数/100μg的发光微粒，0.05M pH6.0的MES buffer作为反应缓冲液，20mg/ml的发光微粒反应浓度，10∶0.75的发光微粒与HBsAg比例，离心法清洗制得表面抗原包被的发光微粒。将抗原包被的发光微粒用发光抗原缓冲液调节浓度至10mg/ml。4.生物素标记抗原试剂：采用实施例2的方法，生物素与抗原按照10∶1的比例制得生物素标记抗原。将生物素标记抗原用生物素标记抗原缓冲液调节浓度至0.5mg/ml。

5.亲和素包被的感光微粒试剂：由实施例3的方法制得亲和素包被的感光微粒，将亲和素包被的感光微粒用感光试剂缓冲液调节浓度至10mg/ml。

光信号检测方法：

在反应孔中分别加入25μl样品，再依次加入25μl发光试剂和25μl生物素化抗原试剂。然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育20分钟，再自动加入175μl亲和素包被的感光微粒试剂后37℃温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。

根据我们之前对1158个正常非乙型肝炎患者的样品进行检测的结果，99％的样品HBsAb水平小于10mIU/ml，所以我们可以认为10mIU/ml是本试剂的临床cutoff点，所以我们配制浓度为10mIU/ml的样品作为我们的HBsAb参考样品并使用赋值后的定标品对HBsAb参考样品进行三次重复标定，最终测定均值必须在9.5-10.5mIU/ml。

	测定均值(mIU/ml)	SD	CV(％)
				HBsAb参考样品	10.07	0.29	2.91

实施例5阴性、阳性对照、参考样及定标品的制备

1.HBsAb阴性对照：经过之前试验验证新生牛血清的光信号水平与临床阴性血清相当，故使用新生牛血清作为HBsAb阴性对照。

2.HBsAb阳性对照：使用中国生物制品检定所出品的乙型肝炎表面抗体定量参考品以新生牛血清为稀释液配制浓度为60mIU/ml的溶液作为阳性对照。

3.根据对临床cutoff点的研究，使用中国生物制品检定所出品的乙型肝炎表面抗体定量参考品以新生牛血清为稀释液配制浓度为10mIU/ml的样品作为参考样。

4.使用经中国药品生物制品检定所出品的乙型肝炎表面抗体定量参考品赋值的鼠单克隆抗-HBs，以新生牛血清为稀释液，按照浓度0mIU/ml，10mIU/ml，50mIU/ml，100mIU/ml，500mIU/ml，1000mIU/ml配制6个定标品。

实施例6乙型肝炎表面抗体定性及定量检测

首先向反应孔中分别加入样品，再依次加入发光试剂(抗原包被的发光微粒)和生物素标记抗原。然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育。再自动加入亲和素包被的感光微粒后37℃再次温育。温育结束后仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。

按上述方法检测各个定标品的发光光子量，将测得的光信号值与相应的定标品浓度采用cubic spline拟和作图即得，标准曲线呈线性。

在定量测定中，根据标准曲线，按样本实测光信号值计算每一个样本的HBsAb含量，单位是mIU/ml。

定性检测：

在定性测定中，检测参考样品的光信号值计，计算每一个样本的S/CO(即待测样品光信号值与HBsAb参考样品光信号的比值)，当S/CO≥1时待测样品被判定为阳性，当S/CO＜1时待测样品被判定为阴性。检测阴阳对照的光信号，如检测结果出错，则检测无效，需重新检测。

检测条件的优化试验：

1.1温育时间的确定：

试验材料：采用抗原包被的250μg/ml的发光微粒试剂(下简称发光抗原试剂)和7μg/ml的生物素标记抗原试剂，及40μg/ml的亲和素包被的感光微粒试剂

检验样本：灵敏度参考品和质控品QcL，QcH。

初始反应条件：加样量为样品25μl，发光微粒试剂25μl，生物素标记抗原试剂25μl，亲和素包被的感光微粒试剂为175μl，两步温浴。

1.1.1第一步温育时间的确定

第一步温育时间分别为10min、15min、20min、30min，第二步温育时间为20min对检验样本进行检测，分别考察灵敏度、特异性、准确性、精密度等指标。结果见下表：

对上述结果进行分析比较，在其余条件相同的情况下，第一步温育时间为20min结果已经趋于稳定，延长第一步温育时间已经没有实际意义，所以我们将第一步温育时间确定为20min。

1.1.2第二步温育时间的确定

第一步温育时间为20min，第二步温育时间分别为10min、15min、20min、30min对检验样本进行检测，分别考察灵敏度、特异性、准确性、精密度等指标。结果见下表：

对上述结果进行分析比较，在其余条件相同的情况下，第二步温育时间为15min结果已经趋于稳定，延长第二步温育时间已经没有实际意义，所以我们将第二步温育时间确定为为15min。

1.2加样模式的考察

试验材料：采用抗原包被的250μg/ml的发光微粒试剂(下简称发光抗原试剂)和7μg/ml的生物素标记抗原试剂，及40μg/ml的亲和素包被的感光微粒试剂

检验样本：灵敏度参考品和质控品QcL，QcH。

初始反应条件：依次添加样品、发光微粒试剂、生物素标记抗原试剂、亲和素包被的感光微粒，两步温浴，其中第一温浴时间为20min，第二温浴时间为15min。

设计了三种加样模式进行考察：

模式1：10μl样品+10μl发光抗原试剂+10μl生物素化抗原试剂+70μl亲和素包被的感光微粒试剂；

模式2：15μl样品+15μl发光抗原试剂+15μl生物素化抗原试剂+105μl亲和素包被的感光微粒试剂；

模式3：25μl样品+25μl发光抗原试剂+25μl生物素化抗原试剂+175μl亲和素包被的感光微粒试剂。

对上述结果进行分析比较，在其余条件相同的情况下，并考虑到手工加样样品量过小会造成不便于操作的影响以及更容易产生误差，所以我们选择模式3为我们的加样模式。

1.3发光抗原、生物素化抗原、亲和素包被的感光微粒浓度的筛选

试验材料：采用抗体包被的发光微粒试剂(下简称发光抗原试剂)和生物素标记抗原试剂，及亲和素包被的感光微粒试剂；

检验样本：灵敏度参考品和质控品QcL，QcH。

初始反应条件：依次添加25μl样品、25μl发光微粒试剂、25μl生物素标记抗原试剂、175μl亲和素包被的感光微粒，两步温浴，其中第一温浴时间为20min，第二温浴时间为15min。

1.3.1发光抗原和生物素化抗原浓度的初筛

亲和素包被的感光微粒采用40μg/ml的浓度，分别配制浓度为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml和400μg/ml的发光抗原以及浓度为4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml的生物素化抗原交叉配对进行检测，在初始条件下结果分别如下：

100μg/ml发光抗原

200μg/ml发光抗原

300μg/ml发光抗原

400μg/ml发光抗原

对上述结果进行分析比较，发光抗原的浓度在200ug/ml-300ug/ml之间，生物素化抗原的浓度在6ug/ml-8ug/ml之间结果较为理想。

1.3.2发光抗原和生物素化抗原浓度的精筛

根据初筛的结果分别配制浓度为200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml的发光抗原以及浓度为6ug/ml、7ug/ml、8ug/ml的生物素化抗原交叉配对进行检测，结果分别如下：

200μg/ml发光抗原

250μg/ml发光抗原

300μg/ml发光抗原

对上述结果进行分析比较，发光抗原的浓度在250ug/ml，生物素化抗原的浓度在7ug/ml时结果最为理想，故选择以上浓度为工作浓度。

1.4亲和素包被的感光微粒浓度筛选

发光抗原浓度选用250μg/ml，生物素化抗原的浓度选用7μg/ml，亲和素包被的感光微粒浓度分别配制为30μg/ml，40μg/ml，50μg/ml，在初始反应条件下，结果如下：

根据灵敏度比较，Qc L和Qc H的测定浓度，亲和素包被的感光微粒浓度在40μg/ml时结果最为理想。

实施例7评价试验

试剂：采用发光抗原试剂(250μg/ml)、生物素标记抗原试剂(7μg/ml)及亲和素包被的感光微粒试剂(40μg/ml)。

检测方法：在反应孔中分别加入25μl样品，再依次加入25μl发光试剂和25μl生物素化抗原试剂。然后放入仪器，由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育20分钟，再自动加入亲和素包被的感光微粒试剂175μl后37℃温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量，根据标准曲线可以推算样品HBsAb浓度，单位是mIU/ml，也可以根据S/CO值判断样品的阴阳性，最后打印试验报告。

1.定量模式性能评价

1.1检测范围

在3个临床试验点对1042个正常非乙型肝炎患者的血样进行检测，99％的样品HBsAb水平小于1mIU/ml。而高浓度HBsAb水平的病人样品可导致RLU(相对光子单位)的反常性下降(即高滴度的钩带效应)。在本测定方法中，HBsAb水平高达1000mIU/ml的病人样品的检测结果将大于1000mIU/ml。

因此确定检测范围为1-1000mIU/ml。

1.2灵敏度的检测

对灵敏度参考品(编号L1-1～3、L2-1～3、L3-1～3)，均需检出所要求的灵敏度参考品(要求检出L1-2；L2-2；L3-2)

	1	2	3
				L1(mIU/ml)	7.5	15.4	31.1
L2(mIU/ml)	8.2	16.3	32.2
				L3(mIU/ml)	7.1	12.9	26.7

1.3特异性的检测

检测20份特异性参考品，不得检出假阳性。

编号	测定值	编号	测定值	编号	测定值	编号	测定值
								N-01	1.39	N-06	7.35	N-11	7.41	N-16	5.2
N-02	3.14	N-07	3.52	N-12	6.48	N-17	5.26
								N-03	3.83	N-08	4.84	N-13	5.8	N-18	5.05
N-04	4.83	N-09	4.95	N-14	4.84	N-19	2.39
								N-05	6.49	N-10	4.57	N-15	4.91	N-20	4.29

1.4线性的检测

对除0值外其他5点定标品(实施例6制备)做线性分析，计算线性相关系数r(r应大于0.99)，r＝0.999

1.5精密性的检测

分别采用2个批号的试剂对高、低2个水平的乙肝表面抗原质控品进行检测，重复10次，将结果数值代入公式，计算CV值

1.6Hook试验

检测浓度	8000mIU/ml	10000mIU/ml	12000mIU/ml	14000mIU/ml
					测定值(mIU/ml)	1252.66	1165.54	1098.58	996.08

由上述结果确定：虽然本产品在HBsAb浓度12000mIU/ml时测定结果依然大于1000mIU/ml，但结果已经与1000mIU/ml很接近，在HBsAb浓度10000mIU/ml时检测结果将大于1000mIU/ml。

1.7干扰性试验

在一份已知浓度的临床标本中添加血红蛋白、甘油三酯及胆红素制成250mg/dL血红蛋白的溶血标本、500mg/dL甘油三酯的脂血标本及10mg/dL胆红素的黄疸标本进行检测，测定值与原浓度的偏差不得超过10％。

	测定值	理论值	偏差率(％)
				溶血标本	476.77	511.67	-6.82
脂血标本	542.52	511.67	6.03
				黄疸标本	549.69	511.67	7.43

2.定性模式检测

使用灵敏度参考品、特异性参考品以及阴阳性对照对定性模式下的试剂进行检测。

由上述结果确定：本产品在定性模式下灵敏度、特异性、精密性等指标均能达到要求。

实施例8比较试验

试剂：采用发光抗原试剂(250μg/ml)、生物素标记抗原试剂(7μg/ml)及亲和素包被的感光微粒试剂(40μg/ml)。

以美国Abbott公司HBsAb试剂盒(磁性微粒发光系统)为参照进行了质量水平比较，所用标本为前述灵敏度参考品，结果如下：

根据以上结果，本发明试剂盒的最低检出率与特异性已和Abbott公司的产品基本相当。

实施例9试剂盒的组配

将实施例1-3中按照各种方法制备的的三种试剂分别独立包装，组配后获得基本试剂盒。可用于检测待测样本的光激化学反应光信号。

在上述试剂盒中加入分别独立包装的实施例5配制的阴性、阳性对照及参考样后获得定性检测试剂盒。可用于定性检测乙型肝炎表面抗体。

在上述试剂盒中加入独立包装的实施例5配制的定标品后获得定量检测试剂盒。可用于定量检测乙型肝炎表面抗体。

Claims (31)

1.一种用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒，为乙型肝炎表面抗原包被的发光微粒。

2.如权利要求1所述用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒，其特征在于，所述发光微粒的粒径范围为50-400nm。

3.如权利要求1所述用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒，其特征在于，所述发光微粒的表面官能团选自羧基或醛基。

4.如权利要求1所述用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒，其特征在于，所述发光微粒的发光量为150,000-350,000光子数/100μg发光微粒。

5.如权利要求1-4中任一权利要求所述用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒，其特征在于，所述检测微粒经如下工艺制得：

a)混合：将发光微粒与乙型肝炎表面抗原混合于缓冲液中；

b)反应：加入缓冲液配制的EDAC溶液混合并反应；

c)往步骤b获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA溶液混匀并反应；

d)清洗产物，获得乙型肝炎表面抗原包被的发光微粒。

6.如权利要求5所述用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒，其特征在于，所述缓冲液为MES缓冲液。

7.如权利要求5所述用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒，其特征在于，所述步骤a中，发光微粒与乙型肝炎表面抗原的质量比例为(8-15)∶1。

8.如权利要求7所述用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒，其特征在于，所述发光微粒与乙型肝炎表面抗原的质量比例为12.5∶1。

9.如权利要求5所述用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒，其特征在于，所述步骤d的清洗的方式为离心法清洗。

10.一种乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒，包括权利要求1-9中任一权利要求所述乙型肝炎表面抗体的检测微粒。

11.如权利要求10所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒，其特征在于，还包括生物素标记的乙型肝炎表面抗原或亲和素包被的感光微粒中的一种或两种。

12.如权利要求11所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的乙型肝炎表面抗原中，生物素与乙型肝炎表面抗原的分子比例为(10-20)∶1。

13.如权利要求11所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述亲和素包被的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例为1∶(3-10)。

14.如权利要求11所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述乙型肝炎表面抗体的检测微粒、生物素标记的乙型肝炎表面抗原以及亲和素包被的感光微粒分别独立包装，且均为混悬液。

15.如权利要求14所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述混悬液的溶剂选自HEPES缓冲体系或Tris缓冲体系。

16.如权利要求15所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒，其特征在于，乙型肝炎表面抗体的检测微粒混悬液的溶剂为pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液。

17.如权利要求15所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的乙型肝炎表面抗原混悬液的溶剂为pH8.0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的Tris缓冲液。

18.如权利要求15所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述亲和素包被的感光微粒混悬液的溶剂为成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液。

19.如权利要求14所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述混悬液中还包括蛋白保护剂、防止微粒聚集的稳定试剂或防腐剂中的一种或多种。

20.如权利要求10-19中任一权利要求所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照。

21.如权利要求10-19中任一权利要求所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括多种浓度已知的乙型肝炎表面抗体溶液，不同浓度的乙型肝炎表面抗体溶液分别独立包装。

22.如权利要求10-21中任一权利要求所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

1)在反应孔中加入样品、试剂盒中用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒和生物素标记的乙型肝炎表面抗原，获得初始反应溶液，混合反应；

2)再加入亲和素包被的感光微粒获得最终反应溶液进行反应；

3)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。

23.如权利要求22所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤3的激发光光源波长范围为600-700nm。

24.如权利要求22所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述激发光光源的功率范围为5-100mw。

25.如权利要求22所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤1)和2)的反应条件为37℃温育10-30分钟。

26.如权利要求25所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤1)的反应条件为37℃温育20分钟，步骤2)的反应条件为37℃温育15分钟。

27.如权利要求22所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒为混悬液，用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒在混悬液中的浓度为200ug/ml-300ug/ml；所述生物素包被的乙型肝炎表面抗原为混悬液，生物素包被的乙型肝炎表面抗原在混悬液中的浓度为6ug/ml-8ug/ml；亲和素包被的感光微粒为混悬液，亲和素包被的感光微粒在混悬液中的浓度为30-100μg/ml。

28.如权利要求27所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述用于检测乙型肝炎表面抗体的检测微粒在混悬液中的浓度为250mg/ml；所述亲和素包被的感光微粒在混悬液中的浓度为7ug/ml；所述亲和素包被的感光微粒在混悬液中的浓度为40μg/ml。

29.如权利要求22所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述初始反应溶液的体积为30-75μl；最终反应溶液的体积为100-250μl。

30.如权利要求29所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，初始反应溶液的体积为75μl，最终反应溶液的体积为250μl。

31.如权利要求22-30中任一权利要求所述乙型肝炎表面抗体的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，还包括根据标准曲线计算待测样品乙型肝炎表面抗体含量。

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