CN101769933B

CN101769933B - 促甲状腺激素检测微粒、其制备及应用

Info

Publication number: CN101769933B
Application number: CN200810205000.XA
Authority: CN
Inventors: 张伟; 王海蛟; 赵卫国
Original assignee: Boyang Biotechnology (Shanghai) Co Ltd
Current assignee: Kemei Boyang diagnostic technology (Shanghai) Co.,Ltd.
Priority date: 2008-12-30
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2028-12-30
Also published as: CN101769933A

Abstract

本发明涉及甲状腺疾病的辅助诊断试剂，公开了一种促甲状腺激素检测微粒，为抗促甲状腺激素抗体包被的发光微粒。本发明还公开了上述促甲状腺激素检测微粒的制备及应用。此外，本发明又进一步公开了一种测定样品中促甲状腺激素的体外诊断试剂盒，同时公开了该试剂盒的使用方法。本发明的试剂盒可以与其它血清和临床信息联合用于甲状腺疾病的辅助诊断及相关病人治疗效果的监测。

Description

促甲状腺激素检测微粒、其制备及应用

技术领域

本发明涉及促甲状腺激素的诊断试剂，具体涉及基于光激化学发光原理的促甲状腺激素检测微粒、其制备及应用。

背景技术

甲状腺疾病是一组较常见的内分泌疾病，包括缺碘性甲状腺肿、其他原因引起的甲状腺肿、甲亢、甲状腺瘤、甲状腺炎、甲状腺功能减退等。甲状腺病的发生率比较高。

甲亢也就是甲状腺功能亢进症，它是一种临床上十分常见的内分泌疾病。是指由各种原因导致甲状腺功能增强，甲状腺激素分泌过多或因甲腺原氨酸(TSH)在血液中水平增高所导致的机体神经系统、循环系统、消化系统心血管系统等多系统的一系列高代谢症候群以及高兴奋症状和眼部症状。

甲状腺机能减退症系甲状腺激素TSH合成与分泌不足，或甲状腺激素生理效应不好、生物效应不足而致的全身性疾病。临床上可分为呆小病、幼年甲低、成人甲低。若功能减退始于胎儿或新生儿期，称为克汀病；始于性发育前儿童称幼年型甲减；始于成人称成年型甲减。

甲状腺瘤是临床常见病，其中绝大多数为良性病变，少数为癌，肉瘤、恶性淋巴瘤等。该病女性发病率明显高于男性，男女发病比例约1∶2～3。

甲状腺炎是以炎症为主要表现的甲状腺疾病，包括感染性和非感染性。不少见。临床权威上所说的急性、亚急性及已经慢性甲状腺炎，只表明青年疾病过程的长短，它们之间无内在联系，也不互相转变，每种具有发表不同的病因、有着临床特点、病理过程及固有的结局。

促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone，缩写为TSH)，由垂体前叶分泌，促使甲状腺产生并释放T4和T3。它是一种分子量约为28000道尔顿的糖蛋白，由两种不同的亚单位α、β组成。虽然人血中的TSH水平极低，但对保证正常的甲状腺机能是至关重要的，TSH的释放受下丘脑分泌的TSH释放激素(TRH)所调节。TSH和TRH与甲状腺激素的水平成反比。当血中有高水平的甲状腺素时，下丘脑释及TRH减少，因此垂体释放TSH减少，如血中甲状腺激素下降，则产生相反的结果。这种过程称为负反馈，由此保持这些激素在血中的正常水平。TSH和垂体糖蛋白、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)具有相同的α链，而β链则不同，具有特有的氨基序列。检测血清TSH对于甲状腺功能亢进、甲状腺功能减低及甲状腺肿瘤的诊断或鉴别诊断，对甲状腺功能相关疾病的发展过程、疗效及预后评估中具有十分重要的意义。

免疫学检测是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质，激素等微量生物活性物质。

我国免疫学检测基本经历了放射免疫检测(兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院)；酶联免疫检测(兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用)；以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术(20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期)三个阶段。这一衍变过程主要是基于对检测方法的敏感性、准确性、以及操作简捷性的需求的不断提高而决定的。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并籍助其发光强度直接测定免疫结合。由于其高灵敏度，检测范围宽等优点，已成为放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者，是免疫学检测重要的发展方向。

但目前国内自行研制的化学发光检测试剂，大多为非均相反应，采用化学底物直接标记，通过化学反应激发。其分析过程与传统酶标检测类似，需反复清洗与分离，检测耗时长，自动化程度不高。国外厂家检测试剂随发光基质与检测形式而各不相同。以Abbott，Bayer与Chiron等公司为代表的化学激发，即以化学发光底物直接标记抗原或抗体进行免疫测定。最常用的为吖啶酯，在碱性环境中可被过氧化氢氧化而发光。BD则以AKP，金钢脘为基质采用酶促化学发光。Roche则采用电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)，发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。因反应过程中牵涉到分离清洗，自动化设计复杂，仪器相当昂贵。此外，发光基质的稳定性也是一大问题。

光激化学发光法通过引入激光技术与纳米微球技术，成功地解决了上述不足。因反应在均相中进行，既加快了反应速度，又避免了反复分离与清洗步骤，能有效降低检测背景值，减少反应时间，并可实现自动化操作。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于定量检测血清中促甲状腺激素的检测微粒，其制备、检测条件及应用。

本发明的技术原理：

本发明的促甲状腺激素检测试剂及试剂盒与光激化学发光检测技术相关，光激化学发光免疫技术是一种利用化学发光物质发射的光波进行免疫测定的方法。该技术主要整合了高分子微粒技术，有机合成，蛋白质化学与临床检测相关领域的研究。

本发明之所以能检测血清中的促甲状腺激素的水平，是由于在均相条件下，将内部带有染料的感光微粒(纳米级)以及包被有抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)并且内部带有发光化合物的发光微粒(纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。此时纳米感光微粒和包被有表面抗体的纳米发光微粒可迅速有效地捕捉促甲状腺激素(TSH)，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后，纳米感光微粒中的染料被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微粒俘获，从而传递能量以激活所述发光微粒中的发光化合物。数微秒后，发光微粒中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地反映了目标分子的浓度。而当样本不含促甲状腺激素(TSH)时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活性氧离子也无法传递至发光微粒表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无高能级红光产生。具体原理参见图1及图2。

基于上述原理，本发明第一方面提供了一种用于检测促甲状腺激素(TSH)的检测微粒，为抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)包被的发光微粒。

本发明第二方面提供了一种促甲状腺激素(TSH)的检测试剂盒，包括上述抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)包被的发光微粒。试剂盒中还可包括生物素标记的抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)和/或亲和素包被的感光微粒。

在试剂盒中，上述抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)包被的发光微粒、生物素标记的抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)和亲和素包被的感光微粒分别独立包装，且均为混悬液。上述含有抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)包被的发光微粒、生物素标记的抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)或亲和素包被的感光微粒的溶液的溶剂可以是常规的适合抗原抗体反应的溶剂体系，如HEPES缓冲体系、Tris缓冲体系。抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)包被的发光微粒的溶剂优选pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液，生物素标记的抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)的溶剂优选pH8.0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的Tris缓冲液，亲和素包被的感光微粒的溶剂优选HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液，上述各种溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质如BSA以及防止微粒聚集的稳定试剂如Tween20，出于对试剂防腐以及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，防腐剂优选100U/ml庆大霉素和质量百分比为万分之五的Proclin 300作为防腐剂。

试剂盒中还可包括阳性对照、阴性对照以及参考样品。参考样品为含有促甲状腺激素的溶液，其促甲状腺激素的浓度为促甲状腺激素临床cutoff点对应的浓度。

在用于定量检测促甲状腺激素(TSH)时，试剂盒中可包括含有多种已知促甲状腺激素(TSH)浓度的溶液。上述不同促甲状腺激素(TSH)浓度的溶液分别独立包装。

上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微粒。发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)₃/TOPO或Eu(TTA)₃/Phen等，该微粒可由市场上购得。

研究发现，由于最终的检测反应是均相反应，发光微粒的粒径(微粒的平均直径)太大(＞400nm)会自然沉降，影响检测效果，微粒的粒径太小(＜100nm)，会使制备过程中的清洗工作比较困难，对抗体连接工作不利，因此发光微粒的粒径范围应在100-400nm之间，较好为150-300nm之间，优选250nm。

发光微粒的表面官能团可以是任何能联接蛋白质的基团，但最常用的主要有羧基和醛基表面官能团的微粒。使用不同的微粒表面官能团，连接抗体的反应方式和条件也不相同。

鉴于获得更好的抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)的连接效率，试剂稳定性和连接重复性，在采用之后记载的改进方法作为抗体的连接方法时优选羧基表面官能团的微粒。

发光微粒的发光量会直接影响最终检测的发光效果。市场提供的发光微粒发光量一般会在150,000——350,000光子数/100μg发光微粒范围内，优选中等强度偏上的水平(≥250,000光子数/100ug)发光微粒。

上述生物素标记的抗体(TSHAb)中，生物素与抗体的分子比例较佳为(20-40)∶1，优选30∶1。

上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激发下，可以产生单线态氧离子，当其与发光微粒距离足够近的情况下，单线氧离子传递到发光微粒，与发光微粒中的发光化合物反应，产生紫外光，紫外光再进一步激发镧系元素化合物，产生520-620nm波长光子。感光化合物可以是酞菁染料等，该微粒也可由市场上购得。

上述亲和素包被的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例无特殊限制，较佳为1∶(3-10)，优选1∶5。

市售感光微粒均适用于本发明，微粒粒径较佳为180-260nm，优选220nm。

抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)包被的发光微粒采用NaBH₃CN的还原胺化反应法制备，反应步骤如下：

1)混合：将发光微粒与抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)按质量比例为10∶(1-3)混合于缓冲液中；

2)反应：加入缓冲液配制的NaBH₃CN溶液混合并反应；

3)封闭：加入缓冲液配制的Gly及NaBH₃CN溶液，混匀反应后，再加入BSA溶液封闭；

4)清洗产物，获得抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)包被的发光微粒。

其中，混合步骤中，发光微粒与抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)的质量比例为10∶(1-3)，优选10∶2。反应缓冲液可为MES缓冲液、磷酸缓冲液，优选MES缓冲液，浓度优选0.05M，反应步骤中，反应溶液中发光微粒的浓度可为10-40mg/ml，优选20mg/ml。

改进的，抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)包被的发光微粒可采用下述方法制得：

1)混合：将发光微粒与抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)混合于缓冲液中。较佳的，缓冲液为MES缓冲液，发光微粒与抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)的质量比例为(8-15)∶1，优选12.5∶1。

2)反应：加入缓冲液配制的EDAC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)溶液混合并反应。较佳的，缓冲液为MES缓冲液，混合溶液中，发光微粒与EDAC的质量比为(15-40)∶1混合，优选质量比为25∶1。反应条件为37℃旋转反应。一般约48小时反应充分。

3)往步骤2获得的反应液中加入缓冲液配制的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，缩写为BSA)溶液混匀并反应。较佳的，缓冲液为MES缓冲液。BSA溶液与步骤2获得的反应液体积比较佳为1∶1-1∶2。反应条件为37℃旋转反应。一般约16小时反应充分。

清洗的方式可以为离心法清洗或透析法清洗。

透析法清洗步骤：采用反应缓冲液透析，每次4-5小时，更换缓冲液4次。透析清洗操作时间较长，且微粒损失较多，造成收率降低。

离心法清洗步骤包括离心去上清，加入反应缓冲液洗涤，超声处理打开沉淀，如此反复3-5次。离心法清洗时离心力会使发光微粒暂时聚集在一起，但经过超声处理可以很容易再次分散打开，此法操作时间短，且收率较高。因此优选采用此种清洗方式。

上述改进的制备方法与NaBH₃CN的还原胺化反应法的主要差别在于主要反应试剂NaBH₃CN替换成了EDAC，该试剂的替换，不仅使得反应时间与NaBH₃CN的还原胺化反应法相比缩短了4个多小时，而且发光微粒与抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)的交联效率获得了提高，节省了抗体用量，此外，试验表明，该方法制得的检测微粒与NaBH₃CN的还原胺化反应法制得的检测微粒相比，在相同条件下反应信号更强，灵敏度更高，检测范围也更广。

亲和素包被的感光微粒可采用NaBH₃CN的还原胺化反应法制备。

本发明第三方面，公开了上述试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

将待测样品与试剂盒中用于检测促甲状腺激素(TSH)的检测微粒、生物素标记的抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)和亲和素包被的感光微粒混合反应，而后用激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。

上述激发光光源波长范围为600-700nm，优选640-680nm；反应孔发光的发射光光源波长范围为600-680nm，优选610-620nm；发射光延迟时间范围为100ms-1000ms；激发光光源的功率范围为5-100mw，优选40-60w。

较佳的，上述试剂盒的使用方法具体为：

1)在反应孔中加入样品、试剂盒中用于检测促甲状腺激素(TSH)的检测微粒和生物素标记的抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)，获得初始反应溶液，混合反应；

2)再加入亲和素包被的感光微粒获得最终反应溶液进行反应；

3)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。

上述步骤1的反应条件为37℃温育10-30分钟，优选20分钟，步骤2的反应条件也为37℃温育10-30分钟，优选15分钟。

步骤1中，抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)包被的发光微粒为试剂混悬液，抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)包被的发光微粒在混悬液试剂中的浓度无特殊限制，可以为30-90μg/ml，优选50μg/ml。

步骤1中，生物素标记的抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)也为试剂混悬液，生物素标记的抗促甲状腺激素抗体(TSHAb)在混悬液试剂中的浓度无特殊限制，可以为1-5μg/ml，优选4μg/ml。

步骤2中，亲和素包被的感光微粒为试剂混悬液，亲和素包被的感光微粒在混悬液试剂中的浓度一般控制在30-50μg/ml，优选40ug/ml。

上述方法中，初始反应溶液的体积无特殊限制，可以为30-75μl，优选75ul；最终反应溶液的体积也无特殊限制，可以为100-250μl，优选250ul。

上述样品包括血清、血浆和全血。

当本发明的检测微粒及检测试剂盒用于定量检测促甲状腺激素(TSH)时，还需根据标准曲线计算待测样品TSH的含量。

本发明是采用光激化学发光检测技术，定量测定人血清样品中促甲状腺激素(TSH)的体外诊断试剂盒，可以与其它血清和临床信息联合用于甲状腺疾病的辅助诊断及病人治疗效果的监测。

本发明与检测对象相近的促甲状腺激素(TSH)酶免法试剂盒在方法学上比较，酶免法以OD值体现样本检测值，OD值可检测范围窄，仅可做定性检测，且灵敏度低。本发明的试剂盒采用光激化学发光法测定标本中的TSH，具有灵敏度高、检测范围宽等特点，在方法学上较酶免法能达到更高的灵敏度和更优的检测范围。

附图说明

图1：光激化学发光免疫技术原理图：微粒结合形成二聚体，产生光子信号

图2：光激化学发光免疫技术原理图：未结合微粒，无光子信号产生

图3：单线态氧随微粒间距离衰减，在大概600nm的距离，基本没有单线氧的存在，因此也不发光

FG BEAD：发光微粒，内含发光分子；

GG BEAD：感光微粒，内含感光分子；

Singlet Oxygen：单线态氧，活性氧离子；

A/B：两者可直接或间接特异结合的活性分子。如在双抗夹心检测中，A，B为针对靶分子C不同的表位的单克隆抗体

图4：比较试验测试结果示意图

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实验中仪器原料来源及试剂配方：

原料及试剂厂家

Biotin-X-X-NHS Sigma TLC≥95％

BSA Equitech /protease free

Gly Sigma≥95％

HEPES 经科宏达

Tris 国药

NaBH₃CN Acros

Avidin Pierce

EDAC Sigma

抗-TSH抗体 Medix

感光微粒美国PentaTek公司

发光微粒美国PentaTek公司

仪器型号厂家

光激化学发光分析仪 HT 上海博阳医疗仪器公司

紫外分光光度计 752P 上海光谱公司

高速冷冻离心机 CR21G HITACHI

分析天平 ALC-2100.2 ACCULAB

分析天平 AG285 METTLER

PH计 DELTA320 METTLER

粒径仪 Model370 Nicomp

酶标仪 MultiSKAN MK3 labsystem

超声波清洗器 KQ5200E 昆山超声仪器公司

漩涡混合器 QL-901 其林贝尔

磁力搅拌器 (79-1)2003-03 国华

实施例1TSHAb包被的发光微粒的制备

抗体与发光微粒制备方法：

1)发光微粒混悬液处理：吸取一定量的羧基发光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声破碎至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节发光微粒浓度至100mg/ml。

2)抗体处理：TSH抗体于0.05M pH6.0的MES缓冲液(以下简称MES缓冲液)透析，透析完成后测定浓度，并调节浓度至8mg/ml。

3)MES缓冲液、100mg/ml的发光微粒混悬液(MES缓冲液)和8mg/ml的抗-TSH(MES缓冲液)以及，以1∶1∶1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

4)用MES缓冲液配制40mg/ml的EDAC溶液，按照与发光微粒100mg/100uL EDAC的比加入，迅速混匀，37℃旋转反应48小时。

5)加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5∶8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

6)用MES缓冲液离心清洗四次，最后用发光试剂缓冲液进行悬浮，测定粒径和固含量，调节浓度至10mg/ml。

将上述方法与采用NaBH₃CN的还原胺化反应法制得的检测微粒进行比较。

NaBH₃CN还原胺化反应法的制备方法：

1)发光微粒混悬液处理：吸取一定量的发光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量Mes缓冲液，超声破碎至微粒重新悬浮，加入磷酸缓冲液调节发光微粒浓度至100mg/ml。

2)抗体处理：TSH抗体于0.02M pH7.0的Mes缓冲液透析，透析完成后测定浓度，并调节浓度至8mg/ml。

3)Mes缓冲液、100mg/ml的发光微粒混悬液(Mes缓冲液)和8mg/ml的TSH抗体(Mes缓冲液)以及，以1∶2∶5的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

4)用Mes缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与反应液1∶25的体积比加入，迅速混匀，37℃旋转反应48小时。

5)Mes缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与反应液2∶1∶10的体积比加入上述溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(Mes缓冲液)，其与反应液体积比为5∶8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

6)用PB缓冲液离心清洗四次，最后用发光试剂缓冲液进行悬浮，测定粒径和固含量，调节浓度至10mg/ml。

两者制备结果的比较：

1.节省了制备时间

	原有制备工艺	新制备工艺
			制备100mg交联抗体的发光微粒	72h	68h

2.提高了抗体交联效率，节省了抗体用量

	原有制备工艺	新制备工艺
			1mg抗体交联微粒	5mg	12.5mg

3.增强了反应信号

	原有制备工艺定标品6信号值	新制备工艺定标品6信号值
			50ug/mlTSH抗体的发光微粒与4ug/ml的生物素化TSH抗体反应	550000	720000

4.提高了灵敏度

	原有制备工艺定标品2信号值/定标品1信号值	新制备工艺定标品2信号值/定标品1信号值
			50ug/mlTSH抗体的发光微粒与4ug/ml的生物素化TSH抗体反应	2820/1000＝2.82	3850/1000＝3.85

5.扩大了检测范围

	原有制备工艺检测范围	新制备工艺检测范围
			50ug/mlTSH抗体的发光微粒与4ug/ml的生物素化TSH抗体反应	0-80uIU/ml	0-100uIU/ml

参照上述的制备方法制备TSHAb包被的发光微粒，并通过各项性能测试比较从以下几方面进行了具体工艺条件的选择研究。

本实施例中涉及的各个参数的检测方法如下：

1.光信号检测方法：

在反应孔中分别加入25μl样品，再依次加入25μl发光试剂(50μg/ml)和25μl生物素化抗体试剂(1μg/ml)。然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育20分钟，再自动加入175μl亲和素包被的感光微粒试剂(40μl/ml)后37℃温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。

检测TSH浓度分别为1.0uIU/ml和9.0uIU/ml的质控品光信号，每个浓度做10孔重复测定，代入公式，计算CV值。低浓度的精密性测定表示为QC L，高浓度的精密性测定表示为QC H。

2.灵敏度检测方法：

检测10孔定标品10uIU/ml，计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD)，以AVE+2SD反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度，经检测两个批号的试剂，其分析灵敏度分别为0.002uIU/ml、0.003uIU/ml，均不高于0.01uIU/ml。

3.工艺条件选择：

1)发光试剂缓冲液的选择：

根据相应的文献资料，并结合本发明的特点，选择pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液，并在其中添加起封闭和蛋白保护作用的BSA以及防止微粒聚集稳定试剂的Tween20后作为发光试剂的缓冲液。

2)发光试剂防腐剂的考察：

出于对试剂防腐以及长期储存的考虑，我们选择万分之五Proclin 300作为防腐剂进行考察。

分别使用未添加防腐剂及添加万分之五Proclin 300作为防腐剂的发光试剂缓冲液配制发光试剂对企业内控品进行检测，分别考察灵敏度、特异性、准确性、精密度等指标。结果见下表：

对上述结果进行分析比较，发现添加Proclin 300作为防腐剂对我们的试剂体系没有明显的影响，所以我们选择浓度万分之五Proclin 300作为发光试剂缓冲液的防腐剂。

3)发光微粒与TSHAb的反应比例：

发光微粒：抗TSH抗体分别按下表中的比例包被，比较选取最佳的包被反应比例。检测其灵敏度、精密性等。其它反应条件：0.05M pH6.0的MES buffer作为反应缓冲液，20mg/ml的发光微粒反应浓度，离心法清洗。检测结果如下表：

发光微粒与抗TSH反应比例的比较

抗体加入量与发光微粒上包被的抗体量基本呈正比关系，但抗体继续增加时包被上的抗体达到饱和。综合考虑QC结果及成本问题，选择发光微粒与抗-TSH抗体的质量比例为12.5∶1作为反应条件。

4)清洗方式的选择

透析法清洗步骤：100倍体积透析，每次4-5小时，更换缓冲液2次。透析清洗操作时间较长，且清洗不彻底。

离心法清洗步骤：12000rpm离心30分钟，清洗3次，沉淀以超声法重悬。这种方法清洗所用时间较短，效果好。

综合考虑选用离心法清洗。

最终选择250nm的粒径，发光量为≥250,000光子数/100ug的发光微粒，1％BSA的0.01M pH 7.4PBS作为稀释液，万分之五Proclin 300作为防腐剂，10∶2的发光微粒与TSHAb的比例，离心法清洗作为最优制备条件。

实施例2生物素标记抗体的制备

制备方法：

1)抗体处理：将抗-TSH抗体透析于0.1M NaHCO₃溶液，测定抗体浓度并调节至1mg/ml。

2)用DMSO配制16.17mg/ml的Biotin溶液。

3)标记：取处理好的1mg/ml抗-AFP抗体标记抗体与配制好的Biotin溶液，二者按照72∶10000的体积比进行混合，迅速混匀。4℃静置反应12～16小时。

4)透析：将反应好的生物素标记抗体透析于生物素标记透析缓冲液(pH8.0)。

5)将透析好的生物素化抗体吸出转移至干净离心管中，取样测定抗体浓度。将质检合格的生物素标记抗体浓度调节至0.5mg/ml。

将抗体与Biotin按照不同比例进行反应并进行检测：

本实施例中涉及的各个参数的检测方法如下：

1、生物素与抗TSH抗体比例的选择：

将Biotin-X-X-NHS∶抗体按照20∶1、30∶1、40∶1的不同比例进行标记，比较选取最佳的标记比例。检测其灵敏度、精密性等。检测结果如下表：

抗体与生物素的标记比例比较

从灵敏度、Hook effect、成本等方面进行考虑，最终选择30∶1的比例。

2、生物素标记抗TSH抗体的缓冲液的选取：

本实施例中，选择pH8.0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的Tris缓冲液，并在其中添加起封闭和蛋白保护作用的BSA以及防止微粒聚集稳定试剂的Tween20后作为生物素化抗体的缓冲液。

3、生物素化抗体缓冲液中防腐剂的选择：

出于对试剂防腐以及长期储存的考虑，选择万分之五Proclin 300作为防腐剂进行考察。

分别使用未添加防腐剂及添加万分之五Proclin 300作为防腐剂的生物素化抗体缓冲液配制生物素化抗体对企业内控品进行检测，分别考察灵敏度、精密度等指标。结果见下表：

对上述结果进行分析比较，发现添加Proclin 300作为防腐剂对试剂体系没有明显的影响，因此选择万分之五Proclin 300作为生物素化抗体缓冲液的防腐剂。

4、发光微粒试剂与生物素化抗体浓度的选择：

1)发光试剂和生物素化抗体浓度的初筛：

分别配制浓度为30ug/ml、60ug/ml、90ug/ml的发光试剂以及浓度为1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml的生物素化抗体交叉配对进行检测，结果分别如下：

30ug/ml发光试剂

60ug/ml发光试剂

90ug/ml发光试剂

对上述结果进行分析比较，发光试剂的浓度在30ug/ml-60ug/ml之间，生物素化抗体的浓度在3ug/ml-5ug/ml之间结果较为理想。

2)发光试剂和生物素化抗体浓度的精筛：

根据初筛的结果分别配制浓度为30ug/ml、50ug/ml、60ug/ml的发光试剂以及浓度为3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml的生物素化抗体交叉配对进行检测，结果分别如下：

30ug/ml发光试剂

50ug/ml发光试剂

60ug/ml发光试剂

对上述结果进行分析比较，发光试剂的浓度在50ug/ml，生物素化抗体的浓度在4ug/ml时结果最为理想，故选择以上浓度为工作浓度。

实施例3亲和素包被的感光微粒的制备

感光微粒：采用粒径为220±40nm的感光微粒(美国PentaTek公司)

制备方法：

a、感光微粒混悬液处理：吸取一定量的感光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节感光微粒浓度至100mg/ml。

b、亲和素溶液配制：称量一定量Avidin，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。

c、混合：将处理好的感光微粒混悬液、8mg/ml的Avidin以及MES缓冲液，以2∶5∶1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

d、反应：MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液1∶25的体积比加入，迅速混匀。37℃旋转反应48小时。

e、封闭：MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液2∶1∶10的体积比加入上述溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5∶8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

f、清洗：向反应好的溶液中加入MES缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃上清，加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次，最后用少量的感光试剂缓冲液进行悬浮，测定固含量，用感光试剂缓冲液调节浓度至10mg/ml。

实施例4促甲状腺激素定量检测

首先向反应孔中分别加入样品，再依次加入发光试剂(抗体包被的发光微粒)和生物素标记抗体。然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育。再自动加入亲和素包被的感光微粒后37℃再次温育。温育结束后仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。

按上述方法检测各个定标品的发光光子量，将测得的光信号值与相应的定标品浓度采用cubic spline拟和作图即得，标准曲线呈线性。

在定量测定中，根据标准曲线，按样本实测光信号值计算每一个样本的TSH含量，单位是uIU/ml。

检测条件的优化试验：

1、温育时间的确定：

试验材料：采用抗体包被的50μg/ml的发光微粒试剂和4μg/ml的生物素标记抗体试剂，及40μg/ml的亲和素包被的感光微粒试剂。

检验样本：灵敏度参考品和质控品QcL，QcH。

初始反应条件：加样量为样品25μl，发光微粒试剂25μl，生物素标记抗体试剂25μl，亲和素包被的感光微粒试剂为175μl，两步温浴。

1.1第一步温育时间的确定

第一步分别实验温育时间分别为10min、15min、20min、30min，第二步温育时间为15min，比较选取最适温育时间。

以四种不同温育时间检测其灵敏度、精密度、线性。检测结果如下表：

第一步温育时间的比较

根据以上实验结果可知，在其余条件相同的情况下，第一步温育时间为20min结果已经趋于稳定，延长第一步温育时间已经没有实际意义，故将第一步温育时间确定为20min。

1.2第二步温育时间的确定

第一步温育时间为20min，第二步分别实验温育时间分别为10min、15min、20min、30min，比较选取最适温育时间。

第二步温育时间的比较

根据以上实验结果可知，在其余条件相同的情况下，第二步温育时间为15min结果已经趋于稳定，延长第二步温育时间已经没有实际意义，故将第二步温育时间确定为15min。

2、加样模式的考察

试验材料：采用抗体包被的50μg/ml的发光微粒试剂(下简称发光抗体试剂)4μg/ml的生物素标记抗体试剂，及40μg/ml的亲和素包被的感光微粒试剂。

检验样本：灵敏度参考品和质控品QcL，QcH。

初始反应条件：依次添加样品、发光微粒试剂、生物素标记抗体试剂、亲和素包被的感光微粒，两步温浴，其中第一温浴时间为20min，第二温浴时间为15min。

根据关于抗原-抗体反应时间的文献资料，并结合本方法的特点设计了三种加样模式进行考察。

模式1：10ul样品+10ul发光试剂+10ul生物素化抗体+70ul亲和素包被的感光微粒试剂；

模式2：15ul样品+15ul发光试剂+15ul生物素化抗体+105ul亲和素包被的感光微粒试剂；

模式3：25ul样品+25ul发光试剂+25ul生物素化抗体+175ul亲和素包被的感光微粒试剂。

按照以上三种加样模式对企业内控品进行检测，分别考察灵敏度、准确性、精密度等指标。结果见下表：

对上述结果进行分析比较，在其余条件相同的情况下，并考虑到手工加样样品量过小会造成不便于操作的影响以及更容易产生误差，所以选择模式3为加样模式。

3、亲和素包被的感光微粒的浓度的筛选：

发光抗体浓度选用150μg/ml，生物素化抗体的浓度选用0.15μg/ml，亲和素包被的感光微粒浓度分别配制为30μg/ml，40μg/ml，50μg/ml，在初始反应条件下，结果如下：

根据灵敏度比较，Qc L和Qc H的测定浓度，亲和素包被的感光微粒浓度在40μg/ml时结果最为理想。

实施例5定标品的配制

用称重法将中国药品生物制品检定所的TSH国家定标品以新生牛血清为稀释液将其配制为0uIU/ml、0.05uIU/ml、0.4uIU/ml、4uIU/ml、30uIU/ml、l00uIU/ml的定标品系列。

实施例6评价试验

试剂：采用发光抗体试剂(50μg/ml)、生物素标记抗体试剂(4μg/ml)及亲和素包被的感光微粒试剂(40μg/ml)。

检测方法：在反应孔中分别加入25μl样品，再依次加入25μl发光试剂和25μl生物素化抗体试剂。然后放入仪器，由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育20分钟，再自动加入亲和素包被的感光微粒试剂175μl后37℃温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量，根据标准曲线可以推算样品TSH浓度，单位是uIU/ml，最后打印试验报告。

1、检测范围

本试剂盒线性检测范围为0.01-100uIU/ml，对其用双对数模型拟合，剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值不低于0.9900。如要准确的测定样品中TSH浓度值，样品中TSH浓度值应不超出0.01-100uIU/ml定标品曲线的浓度范围，超出此范围的测定结果是通过曲线外延得出的计算结果。经本试剂盒对大量的临床样本的检验结果可知道，大部分样本结果小于100uIU/ml，因此，本试剂盒设定的检测范围为0.01-100uIU/ml完全可满足临床应用要求。

2、分析灵敏度的检测：

检测10孔定标品10uIU/ml，计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD)，以AVE+2SD反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度，经检测两个批号的试剂，其分析灵敏度分别为0.002uIU/ml、0.003uIU/ml，均不高于0.01u IU/ml。

3、功能灵敏度检测：

以0.1uIU/ml TSH定标品倍比稀释成0.05、0.025、0.0125、0.00625、0uIU/ml，每个点作10孔加样检测，共60孔，以TSH定标品系列检测其浓度值，并以CV为Y轴，浓度值为X轴，计算CV为20％时相对应的浓度值，经检测两个批号的试剂，本试剂盒功能灵敏度分别为0.006uIU/ml、0.006uIU/ml。

4、精密度检测：

分别采用2个批号的TSH试剂盒对质控品QC L、QC H进行1次检测，每次复测10孔，每份样品共检测20次。得到如下结果：

由上述结果可知，本产品其批内精密性小于10％、批间精密性小于15％。

5、线性检测：

对除0值外其他5点定标品用双对数或其他数学模型拟合，剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值应不低于0.9900。经检测两个批号的试剂盒，其线性r值分别为0.9963、0.998。

6、Hook实验：

由上述结果可知，本试剂盒的HOOK效应在1000uIU/ml未见。

7、干扰性实验：

在已知浓度的临床标本1#、2#、3#中加入250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三酯、10mg/dL胆红素，以本试剂盒进行检测，结果如下表：

表1试剂盒批号：20060809 (单位：uIU/ml)

表2试剂盒批号：20060811 (单位：uIU/ml)

由上述结果可知，500mg/dL甘油三酯和10mg/dL胆红素对本产品无明显干拢，但250mg/dL血红蛋白对本产品检测结果产生影响，因此尽量避免样本严重溶血。

实施例7比较试验

以西门子公司的TSH试剂盒为参照进行了质量水平比较，所用标本为实施例5中的灵敏度参考品，结果如图4所示。

由图4所示的结果可知，本发明的试剂盒检测结果与西门子结果相关性r＝0.990，且该试剂盒成本底、灵敏度高、精密性好、检测范围宽、操作简便、省时，适合于向临床推广

实施例8试剂盒的组配

将实施例1-3中按照各种方法制备的的三种试剂分别独立包装，组配后获得基本试剂盒。可用于定量检测样品中TSH的浓度。

Claims

1.一种促甲状腺激素的检测试剂盒，包括用于检测促甲状腺激素的检测微粒，还包括生物素标记的抗促甲状腺激素抗体以及亲和素包被的感光微粒；所述检测微粒为抗促甲状腺激素抗体包被的发光微粒；所述发光微粒的表面官能团为羧基；所述检测微粒经如下工艺制得：

a)混合：将发光微粒与抗促甲状腺激素抗体混合于缓冲液中，所述发光微粒与抗促甲状腺激素抗体的质量比例为（8-15）：1；

b)反应：加入缓冲液配制的EDAC溶液混合并反应；发光微粒与EDAC的质量比为（15-40）：1混合；

c)往步骤b获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA溶液混匀并反应，所述缓冲液为MES缓冲液；

d)清洗产物，获得抗促甲状腺激素抗体包被的发光微粒。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光微粒的粒径范围为100-400nm。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光微粒的发光量为150,000-350,000光子数/100μg发光微粒。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光微粒与抗促甲状腺激素抗体的质量比例为12.5：1。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤d的清洗的方式为离心法清洗。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的抗促甲状腺激素抗体中，生物素与抗体的分子比例为（20-40）：1。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和素包被的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例为1：（3-10）。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测促甲状腺激素的检测微粒、生物素标记的抗促甲状腺激素抗体以及亲和素包被的感光微粒分别独立包装，且均为混悬

液。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述混悬液的溶剂选自HEPES缓冲体系或Tris缓冲体系。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测促甲状腺激素的检测微粒混悬液的溶剂为pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液。

11.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的抗促甲状腺激素抗体混悬液的溶剂为pH8.0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的Tris缓冲液。

12.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和素包被的感光微粒混悬液的溶剂为成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液。

13.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述混悬液中还包括蛋白保护剂、防止微粒聚集的稳定试剂或防腐剂中的一种或多种。

14.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测促甲状腺激素的检测微粒为混悬液，用于检测促甲状腺激素的检测微粒在混悬液中的浓度为30-90μg/ml；所述生物素标记的抗促甲状腺激素抗体为混悬液，生物素标记的抗促甲状腺激素抗体在混悬液中的浓度为1-5μg/ml；所述亲和素包被的感光微粒为混悬液，亲和素包被的感光微粒在混悬液中的浓度为30-50μg/ml。

15.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测促甲状腺激素的检测微粒在混悬液中的浓度为50μg/ml；所述生物素标记的抗促甲状腺激素抗体在混悬液中的浓度为4μg/ml；所述亲和素包被的感光微粒在混悬液中的浓度为40ug/ml。