CN102707060B - 一种检测mgmt活性的化学发光检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）活性的化学发光检测试剂盒，它包含有：链霉亲和素磁珠，生物素化的O⁶-苄基鸟嘌呤，O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶特异性抗体anti-MGMT的酶标记物，O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品溶液，发光底物液，浓缩洗涤液。本发明还公开了一种应用上述试剂盒用于MGMT的检测方法，它包括步骤：首先进行样品总蛋白质提取，然后采用试剂盒检测，最后分析检测结果。本发明提供了一种检测人组织或细胞中的MGMT活性的化学发光检测试剂盒及检测方法，具有操作简便、快速，检测结果灵敏度高、特异性强等诸多优点，在MGMT活性临床检测方面具有广阔的应用前景。

Description

一种检测MGMT活性的化学发光检测试剂盒及检测方法

（一）技术领域

本发明检测O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的化学发光检测试剂盒及其检测方法。

（二）背景技术

O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O⁶-MethylguanineDNA-Methyltransferase，MGMT）是一种高效的DNA修复酶，能够修复化疗中烷化剂药物对肿瘤细胞DNA所造成的损伤，如果肿瘤细胞中的MGMT活性达到一定水平则可能会导致耐药性，因此，MGMT活性的高低为耐药与否提供直接信息，MGMT活性检测对评估化疗效果以及减少药物毒副作用有着重要的意义。不幸的是，目前还没有一种简易可靠、可应用于常规临床检验的方法来测定具有重要肿瘤学价值的MGMT活性。已有大量文献描述MGMT基因启动子甲基化以及MGMT蛋白表达的免疫测定并试图建立这些分子生物学和血清学指标与肿瘤耐药性、生存率以及个体化治疗方案的相关性，但这些烦琐而且不稳定的检测方法不适合在临床上常规使用，也因为它们不直接测定MGMT的酶学活性而可能引入各种与肿瘤耐药机制无关的干扰因素。基于同位素标记底物的MGMT活性测定法只适用于实验室研究而难以被用于常规临床检验中；此外，这种方法所用的蛋白沉淀步骤容易引入诸如黑色素（Melanin）等蛋白的非特异结合，引起假阳性。虽然有人用非同位素标记的底物和酶联免疫分析方法来测定MGMT活性，但这个方法需要多步而费时的固相分离和反应。从临床应用和检测效率（灵敏度）的角度来看，这是个明显的缺点。

很明显，无论在肿瘤生物学的基础研究中还是在肿瘤治疗的临床实践中，都急需发展一种简单可靠的方法来特异、灵敏地测定各种肿瘤组织和细胞中的MGMT活性。

（三）发明内容

本目的是提供一种简便、特异、灵敏的MGMT活性的化学发光检测试剂盒及其检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种检测O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的化学发光检测试剂盒，主要包括：

试剂1：链霉亲和素磁珠浓度为1~5mg/mL的分散液，溶剂为含有0.5%（w/w）牛血清白蛋白、1%（w/w）酪蛋白的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；所述链霉亲和素磁珠为表面修饰链霉亲和素的磁性微球，粒径为1~3μm，内核为四氧化三铁（Fe₃O₄）、表面带有链霉亲和素生物分子，可通过戊二醛两步法在表面带有羧基或氨基等活性基团的磁性微球以化学共价结合方式引入链霉亲和素，并以含有0.5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、1%酪蛋白的pH为7.2，0.02mol/L的磷酸缓冲液进行封闭完成

试剂2：生物素标记的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的底物，即生物素标记的O⁶-苄基鸟嘌呤溶液，使用时以含有叠氮钠0.2g/L、BSA1.0g/L的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为5μg/mL；

试剂3：辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗人MGMT特异性单克隆抗体，使用时以含有0.05%（w/w）甘油和0.2g/L的硫柳汞的防腐剂溶液稀释至浓度为2μg/mL；酶标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液，当标记酶为过氧辣根化物酶，标记方法优选为过氧碘酸钠法；当标记酶为碱性磷酸酶，标记方法优选为戊二醛法；

试剂4：O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品溶液，溶剂为含有0.5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；使用时配制为6个梯度浓度，分别为600、150、50、25、10、0fmol/mL；

试剂5：发光底物液，为过氧化氢-鲁米诺发光液或者AMPPD溶液；所述酶标记物的标记酶为过氧辣根化物酶时，发光底物液由A液和B液构成，发光底物液A液为过氧化氢溶液，发光底物液B液为鲁米诺溶液，使用时等体积混合；所述酶标记物的标记酶为碱性磷酸酶时，发光底物液为3-（2’-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3’-羟基）苯-1,2-二氧杂环丁烷磷酸钠（4-methoxy-4-（3-phosphatephenyl）-spiro-（1,2-dioxetane-3,2’-admantane），AMPPD）溶液，溶剂为0.5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。

试剂6：浓缩洗涤液，为含有0.1%~0.5%（w/w）吐温-20、0.1%（w/w）叠氮化钠的磷酸盐缓冲溶液，pH 7.4。

本发明提出了使用链亲和素（Streptavidin，SA）修饰磁性微球捕获MGMT，结合酶促化学发光反应来检测MGMT的活性的方法。检测原理图如图1所示：（a）待测的MGMT与Biotin标记MGMT底物：生物素化O⁶-苄基鸟嘌呤（Biotin-BG）反应，在苄基转移到酶蛋白后形成生物素标记的MGMT即Biotin-MGMT；（b）加入过量链霉亲和素修饰的磁性微球P(St-GMA-SA)/Fe₃O₄俘获Biotin-MGMT，并在外加磁场作用下进行分离；（c）最后加入O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶特异性抗体的酶标记物（ALP-anti-MGMT或HRP-anti-MGMT)；（d）使用酶促化学发光底物来检测MGMT的活性相关指标。由于MGMT能催化Biotin-BG上的苯甲基转移到自身的巯基上，使MGMT标记上了Biotin，从而形成Biotin-MGMT，可被带有SA配基的P(St-GMA-SA)/Fe₃O₄捕获。MGMT的活性越高，催化能力就越强，被Biotin标记的量就越高，从而被P(St-GMA-SA)/Fe₃O₄捕获的量就越多，因此MGMT的活性与被P(St-GMA-SA)/Fe₃O₄捕获数量直接相关，通过酶促化学发光反应即可获得MGMT的活性信息，最终被检测样品的发光强度度值越高，即被捕获的MGMT数量越多，MGMT的活性就越高。即本发明采用高特异性的anti-MGMT和Biotin-BG两种探针，与MGMT形成免疫夹心复合物，结合磁性微球固相分离和酶促化学发光检测技术，从而达到快速、灵敏检测MGMT活性的目的。

本发明还涉及一种利用所述的试剂盒对O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性进行检测的方法，所述方法包括：

（1）按本领域常规方法提取待测样品的总蛋白质；

（2）向试管中加入25μL上述处理后的样品蛋白质，再加入50μL试剂2（稀释后的），37℃恒温振荡反应30min，加入50μL试剂1，37℃恒温振荡反应5min后，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上层清夜；往试管中加入500μL试剂6（稀释后的），充分洗涤2~3次后，置于磁分离器上分离5min，除去上清液，再加入50μL试剂3（稀释后的），37℃恒温振荡反应5min后，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上层清夜，加入500μL试剂6（稀释后的），充分洗涤2~3次后，置于磁分离器上分离5min，除去上清，加入300μL试剂5，充分混匀后，暗处放置2min后置于磁分离器，待所有磁性微球富集于试管底部后，置于化学发光仪测定，获得其发光值；

（3）取梯度浓度的试剂4，按照步骤（2）的方法分别测定其发光值，以所获得的每个浓度标准溶液的平均值（RLU）减去浓度为0的标准品溶液的发光值（RLU₀），再取对数值作为纵坐标，以标准品溶液浓度的自然对数值为横坐标，绘制标准曲线；

（4）根据样品溶液的发光值，按照步骤（3）计算方法取对数值，对照标准曲线，即获得样品中的MGMT含量。

所述待测样品可为临床组织样品或临床细胞株样品。

待测样品为肿瘤细胞株样品时，总蛋白提取步骤如下：

1.裂解液制备：每500uL冷的缓冲溶液（20mM DTT，2mM EDTA，20%（v/v）丙三醇，溶剂为100mM Tris-HCl，pH 7.6，）A中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物（10μg/mL抑肽酶，10μM抑氨肽酶素b，10μM亮抑酶肽，1μM胰肽素，0.1mM苯甲基磺酰氟），混匀后置冰上备用；

2.取5~10×10⁶个细胞，在4℃，1000rpm条件下离心5~10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞；

3.用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清；

4.每5×10⁶个细胞中加入500uL冷的裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡15~20分钟；

5.在4℃，14000rpm条件下离心15分钟；

6.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。

待测样品为临床组织样品时，总蛋白提取步骤如下：

1.裂解液制备：每500uL冷的缓冲溶液A中加入2uL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用；

2.取100mg组织样本剪碎，加入上述裂解液中，并用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体；

3.将组织匀浆吸入另一预冷的干净离心管中，在4℃，10000rpm条件下离心5分钟；

4.将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明使用磁性微球代替一般的孔板作为ELISA的固相反应载体，由于其高的比表面积和低的传质阻力，亲和反应可迅速发生，并且在外加磁场的作用下，可以快速、高效地捕获MGMT，达到快速检测的目的；

(2)本发明与常规只是用抗体一种结合探针的ELISA检验不同是的是，使用Biotin-BG和anti-MGMT两种特异探针，通过酶学催化和抗原-抗体双重特异反应来保证最终检测信号的高特异性。

(3)本发明试剂盒成分简单，携带方便，检测步骤与常规的ELISA类似，适用于大批量样品的定量和定性分析检测。

（四）附图说明

图1为本发明原理图；

图2为本发明制备获得的链霉亲和素磁珠的透射电镜照片。

图3为本发明实施例1获得的标准曲线。

图4为本发明实施例2获得的标准曲线。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：人脑胶质瘤细胞MGR-1样品中MGMT活性检测

检测人脑胶质瘤细胞MGR-1样品中MGMT活性的化学发光酶联免疫试剂盒包括：

(1)链霉亲和素磁珠：粒径为1~3μm、使用浓度为10mg/mL，10mL/瓶，1瓶；

(2)生物素化的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的底物：浓度为5μg/mL，5mL/瓶，1瓶；使用时用稀释液稀释1000倍后使用，稀释液为含有1%BSA和0.2g/L的叠氮钠防腐剂溶液。

(3)O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶特异性抗体的酶标记物：标记酶为碱性磷酸酶，浓度为5μg/mL，5mL/瓶，1瓶；使用时用稀释液稀释2000倍后使用，稀释液为含有0.05%甘油和0.2g/L的硫柳汞防腐剂溶液。

(4)O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品溶液：浓度分别为600、150、50、25、10、0fmol/mL，0.5mL/瓶，6瓶，溶剂为含有0.5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；

(5)发光底物液：AMPPD溶液，溶剂为0.5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，AMPPD浓度0.5μg/mL，5mL/瓶，1瓶；

(6)浓缩洗涤液：pH 7.4，含有0.2%吐温-20，0.1%叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲溶液。25mL/瓶，1瓶。使用时用蒸馏水稀释20倍；

其中链霉亲和素磁珠、生物素化的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的底物以及O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶特异性单克隆抗体的碱性磷酸酶标记物的制备方法如下：

1、链霉亲和素磁珠的制备：

a）表面含有氨基基团的磁性微球的制备：在50mL Fe₃O₄磁流体中加入90mL无水乙醇，0.4g聚乙烯吡咯烷酮，超声10min混合均匀后转移到250mL三颈瓶中，依次加入4mL苯乙烯、1mL甲基丙烯酸缩水甘油酯、0.09g偶氮二异丁腈，机械搅拌，通入氮气45min后升温到75℃，反应24h。将反应后的混合液进行磁分离，分别用乙醇和二次水各洗涤三次，真空干燥，得到棕色的粉末。将上述5g粉末中加入50mL水和50mL己二胺，超声10min混合均匀后转移到250mL三颈瓶中，机械搅拌，在80℃时反应12h。将反应后的混合液进行磁分离后，用纯水洗涤多次除去多余己二胺，得到表面含有氨基基团的磁性微球。

b）将50mg表面含有氨基基团的磁性微球放入灭菌水中浸泡，用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）清洗3次后，再加入2.5mL磷酸盐缓冲液，超声分散10min后待用；取上述2.5mL磁性微球分散液，加入2mL的戊二醛室温震荡反应6h，进行磁分离，多次用大量纯水清洗多余的戊二醛后，将磁性微球重新悬浮在2.5mL磷酸盐缓冲液中，然后再加入到装有200μL的浓度1.0mg/mL的链霉亲和素溶液的EP管中，室温震荡培养6h；用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）多次清洗所得磁性微球，最后将其分散在含有0.5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、1%酪蛋白的pH为7.2、0.02mol/L的磷酸缓冲液中（浓度为10mg/mL），4℃保存待用。制得的链霉亲和素磁珠的透射电镜照片见图2。

2、生物素化的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的底物的制备：将O⁶-苄基鸟嘌呤用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）或0.5mol/L硼酸缓冲液（pH 8.6）稀释到1mg/mL，用1mL DMSO溶解N-羟基琥珀酰亚胺生物素（NHSB）1mg；向1mL O⁶-苄基鸟嘌呤溶液加入120μL NHSB溶液（即含NHSB 120μg）；在室温下持续搅拌，保温2～4小时；加入9.6μL1mol/L NH₄Cl（每25μg NHSB加1μL）和200μL浓度为1mg/mL EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）溶液，在室温下搅拌10分钟；在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素；将样品上1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管，蛋白质在1～3mL之间洗下；最后，样品加入叠氮钠（终浓度0.2g/L）及1.0g/L BSA，浓度为5μg/mL。将结合产物置4℃，避光保存。

3、O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶特异性单克隆抗体的碱性磷酸酶标记物的制备：将碱性磷酸酶20mg溶于1.5%（v/v）的戊二醛溶液中，室温静置过夜，将上述酶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱，流速控制1.2mL/min，并收集棕色流出物；取O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶特异性单克隆抗体anti-MGMT 2.5mg，以0.1mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释至5mL，搅拌下逐滴加入酶溶液中；然后加入0.2mol/L赖氨酸0.2mL，混匀，置室温2~3h；反应液装入透析袋，以0.1mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液透析24h后，以含有0.05%甘油、0.2g/L的硫柳汞防腐溶液1∶2000稀释，分装，4℃保存待用。

利用该试剂盒检测人脑胶质瘤细胞MGR-1样品中MGMT活性的方法如下：

(1)样品前处理

a.裂解液制备：每500uL冷的缓冲溶液A中（100mM Tris-HCl，pH7.6，20mM DTT，2mM EDTA，20%丙三醇）加入2ul蛋白酶抑制剂混合物（10μg/mL抑肽酶，10μM抑氨肽酶素b，10μM亮抑酶肽，1μM胰肽素，0.1mM苯甲基磺酰氟），混匀后置冰上备用；

b.取5~10×10⁶个MGR-1细胞，在4℃，1000rpm条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞；

c.用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清；

d.每5×10⁶个细胞中加入500uL冷的裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡15~20分钟；

e.在4℃，14000rpm条件下离心15分钟；

f.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。

(2)检测方法：

向试管中加入25μL上述处理后的MGR-1样品或同体积的系列标准品溶液，再加入生物素化的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的底物50μL，37℃恒温振荡反应30min。加入50μL链霉亲和素修饰的磁性微球，37℃恒温振荡反应5min后，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上层清夜；加入洗涤液500μL，充分洗涤2~3次后，置于磁分离器上分离5min，除去上清，再加入50μL碱性磷酸酶标记的an-MGMT，37℃恒温振荡反应5min后，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上层清夜，加入洗涤液500μL，充分洗涤2~3次后，置于磁分离器上分离5min，除去上清，加入AMPPD发光底物液300μL，充分混匀后，暗处放置2min后置于磁分离器，待所有磁性微球富集于试管底部后，置于化学发光仪测定。

(3)结果分析：

发光计数-剂量反应曲线以双对数曲线表示，即所获得的每个浓度标准溶液或样本发光值的平均值（RLU）减去第一个零标准点的发光值（RLU₀），再取对数，即

纵轴（Y轴）=log（RLU-RLU₀）=logΔRLU

以MGMT浓度的自然对数值为横轴（X轴），绘制标准曲线，如图3所示。相应每个样品中MGMT浓度可从标准曲线上读出，计算出样品溶液中MGMT的浓度。按照上述方法采用本发明试剂盒对待测样品进行检测，其浓度检测线性范围可达到0~1000fmol/mg蛋白质之间，可以避免高MGMT浓度样品的稀释，使用本试剂盒的整个检测过程约1~1.5h，最低检测限为2.0fmol/mg蛋白质。

实施例2：人乳腺癌组织样品中MGMT活性检测

检测人乳腺癌组织样品中MGMT活性的化学发光酶联免疫试剂盒包括：

(1)链霉亲和素磁珠：粒径为1~3μm、使用浓度为10mg/mL，10mL/瓶，1瓶；

(2)生物素化的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的底物：浓度为5μg/mL，5mL/瓶，1瓶；使用时用稀释液稀释1000倍后使用，稀释液为含有1%BSA和0.2g/L的叠氮钠防腐剂溶液。

(3)O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶特异性抗体的酶标记物：标记酶为辣根过氧化物酶，浓度为5μg/mL，5mL/瓶，1瓶；使用时用稀释液稀释2000倍后使用，稀释液为含有0.05%甘油和0.2g/L的硫柳汞防腐剂溶液。

(4)O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品溶液：浓度分别为600、150、50、25、10、0fmol/mL，0.5mL/瓶，6瓶；溶剂为含有0.5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；

(5)发光底物液：A液，过氧化氢溶液（20.0μmol/mL），5mL/瓶，1瓶；B液：鲁米诺溶液（1.0μmol/mL），5mL/瓶，1瓶；使用时体积比为1∶1混合。

(6)浓缩洗涤液：pH 7.4，含有0.3%吐温-20，0.1%叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲溶液。25mL/瓶，1瓶。使用时用蒸馏水稀释20倍；

其中链霉亲和素磁珠、生物素化的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的底物以及O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶特异性单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记物的制备方法如下：

1、链霉亲和素磁珠的制备：将50mg表面含有氨基基团的磁性微球放入灭菌水中浸泡，用磷酸盐缓冲液清洗3次后，再加入2.5mL磷酸盐缓冲液（pH 7.4），超声分散10min后待用；取上述2.5mL磁性微球分散液，加入2mL的戊二醛室温震荡反应6h，进行磁分离，多次用大量纯水清洗多余的戊二醛后，将磁性微球重新悬浮在2.5mL磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，然后再加入到装有200μL的浓度1.0mg/mL的链霉亲和素溶液的EP管中，室温震荡培养6h；用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）多次清洗所得磁性微球，最后将其分散在含有0.5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、1%酪蛋白的pH为7.2，0.02mol/L的磷酸缓冲液中（浓度为10mg/mL），4℃保存待用。

2、生物素化的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的底物的制备：将O⁶-苄基鸟嘌呤用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）或0.5mol/L硼酸缓冲液（pH 8.6）稀释到1mg/mL，用1mL DMSO溶解N-羟基琥珀酰亚胺生物素（NHSB）1mg；向1mL O⁶-苄基鸟嘌呤溶液加入120μL NHSB溶液（即含NHSB 120μg）；在室温下持续搅拌，保温2～4小时；加入9.6μL1mol/L NH₄Cl（每25μg NHSB加1μL），在室温下搅拌10分钟；在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素；将样品上1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管，蛋白质在1～3mL之间洗下；最后，样品加入叠氮钠（终浓度0.2g/L）及1.0g/L BSA，浓度为5μg/mL。将结合产物置4℃，避光保存。

3、O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶特异性单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记物的制备：将辣根过氧化物酶10mg溶于1mL纯水中，在搅拌条件下逐滴加入0.2mL NaIO₄溶液0.2mL，室温搅拌30min后，用pH 4.4的浓度为1mmol/L醋酸钠缓冲溶液在4℃下透析过夜后，用0.2mol/L的Na₂CO₃缓冲溶液将pH值调整至9.0~10.0；将1mg的anti-MGMT溶于4mL浓度为0.2mol/L的Na₂CO₃缓冲溶液中并迅速加入上述酶液，搅拌反应3~5小时，再加入新配置的NaBH₄溶液100μL，4℃下反应2小时；将上述反应液装入透析袋中，在0.1mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中透析24h后，以含有0.05%甘油、0.2g/L的硫柳汞防腐溶液1∶2000稀释，分装，4℃保存待用。

利用该试剂盒检测人乳腺癌组织样品中MGMT活性的方法如下：

(4)样品前处理

a.裂解液制备：每500uL冷的缓冲溶液A中加入2uL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

b.取100mg组织样本剪碎，加入上述裂解液中，并用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。

c.将组织匀浆吸入另一预冷的干净离心管中，在4℃，10000rpm条件下离心5分钟。

d.将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。

(5)检测方法：

向试管中加入25μL上述处理后的人乳腺癌组织样品总蛋白或同体积的系列标准品溶液，再加入生物素化的O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的底物50μL，37℃恒温振荡反应30min。加入50μL链霉亲和素磁珠，37℃恒温振荡反应5min后，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上层清夜；加入洗涤液500μL，充分洗涤2~3次后，置于磁分离器上分离5min，除去上清，再加入50μL辣根过氧化物酶标记的anti-MGMT，37℃恒温振荡反应5min后，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上层清夜，加入洗涤液500μL，充分洗涤2~3次后，置于磁分离器上分离5min，除去上清，加入发光底物液A液和B液各150μL，充分混匀后，暗处放置2min后置于磁分离器，待所有磁性微球富集于试管底部后，置于化学发光仪测定。

(6)结果分析：

发光计数-剂量反应曲线以双对数曲线表示，即所获得的每个浓度标准溶液或样本发光值的平均值（RLU）减去第一个零标准点的发光值（RLU₀），再取对数，即

纵轴（Y轴）=log（RLU-RLU₀）=logΔRLU

以MGMT浓度的自然对数值为横轴（X轴），绘制标准曲线，如图4所示。相应每个样品中MGMT浓度可从标准曲线上读出，计算出样品溶液中MGMT的浓度。按照上述方法采用本发明试剂盒对待测样品进行检测，其浓度检测线性范围可达到0~1000fmol/mg蛋白质之间，可以避免高MGMT浓度样品的稀释，使用本试剂盒的整个检测过程约1~1.5h，最低检测限为4.5fmol/mg蛋白质。

Claims (3)

1.一种检测O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的化学发光检测试剂盒，主要包括：

试剂1：链霉亲和素磁珠浓度为1～5mg/mL的分散液，溶剂为含有0.5％牛血清白蛋白、1％酪蛋白的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；

试剂2：生物素标记的O⁶-苄基鸟嘌呤溶液，以含有叠氮钠0.2g/L、BSA1.0g/L的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为5μg/mL；

试剂3：辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗人MGMT特异性单克隆抗体，以含有0.05％甘油和0.2g/L的硫柳汞的防腐剂溶液稀释至浓度为2μg/mL；

试剂4：O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品溶液，溶剂为含有0.5％牛血清白蛋白、1％酪蛋白的pH 7.2、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；

试剂5：发光底物液，为过氧化氢-鲁米诺发光液或者AMPPD溶液；

试剂6：浓缩洗涤液，为含有0.1％～0.5％吐温-20、0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲溶液，pH 7.4，使用时蒸馏水稀释20倍。

2.利用如权利要求1所述的试剂盒对O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶进行检测的方法，所述方法包括：

(1)提取待测样品的总蛋白质；

(2)向试管中加入25μL上述处理后的样品蛋白质，再加入50μL试剂2，37℃恒温振荡反应30min，加入50μL试剂1，37℃恒温振荡反应5min后，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上层清液；往试管中加入500μL试剂6，充分洗涤2～3次后，置于磁分离器上分离5min，除去上清液，再加入50μL试剂3，37℃恒温振荡反应5min后，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上层清液，加入500μL试剂6，充分洗涤2～3次后，置于磁分离器上分离5min，除去上清，加入300μL试剂5，充分混匀后，暗处放置2min后置于磁分离器，待所有磁珠富集于试管底部后，置于化学发光仪测定，获得其发光值；

(3)取梯度浓度的试剂4，按照步骤(2)的方法分别测定其发光值，以所获得的每个浓度标准溶液的平均值RLU减去浓度为0的标准品溶液的发光值RLU₀，再取对数值作为纵坐标，以标准品溶液浓度的自然对数值为横坐标，绘制标准曲线；

(4)根据样品溶液的发光值，按照步骤(3)计算方法取对数值，对照标准曲线，即获得样品中的MGMT含量。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述待测样品为临床组织样品或临床细胞株样品。