CN109811035A

CN109811035A - 一种肠道脱落细胞目标基因启动子甲基化检测的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN109811035A
Application number: CN201910288598.1A
Authority: CN
Inventors: 杨国栋; 杨薛康; 卢晓昭; 韦梦影; 周雪莹; 赵联璧
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2019-05-28

Abstract

本发明提供了一种肠道脱落细胞目标基因启动子甲基化检测的方法及试剂盒，属于基因甲基化检测技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将粪便样品裂解后进行固液分离；2)超声处理断裂包括肠道脱落细胞基因组DNA的料液；3)将包括断裂DNA的料液、生物素标记的目标基因探针、PBS溶液混合，孵育后，降温获得包括基因‑探针复合物的料液；4)用C1链亲和素磁珠从所述的包括基因‑探针复合物的料液中分离基因‑探针复合物；5)对磁珠‑基因‑探针复合物进行重亚硫酸盐处理获得处理后的DNA样品；6)对所述的处理后的DNA样品进行甲基化特异性PCR和测序，获得目标基因甲基化程度。所述方法捕获效率高，特异性好。

Description

一种肠道脱落细胞目标基因启动子甲基化检测的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于基因甲基化检测技术领域，尤其涉及一种肠道脱落细胞目标基因启动子甲基化检测的方法及试剂盒。

背景技术

肠道脱落细胞一般从粪便中收集，但是粪便大部分是食物和细菌DNA，干扰人肠道脱落细胞基因组DNA的检测，而甲基化检测对DNA的浓度和纯度要求较高，目前尚没有一种能够从粪便样品中精准捕获人肠道脱落细胞中目标基因，并对其启动子进行甲基化检测的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够从粪便中快速靶向捕获目标基因并对所述目标基因启动子进行甲基化检测的方法及试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种非疾病诊断目的的肠道脱落细胞目标基因启动子甲基化检测的方法，包括以下步骤：

1)将粪便样品置于裂解液中进行细胞裂解，对裂解后的料液进行固液分离，收集液相组分获得包括肠道脱落细胞基因组DNA的料液；

2)超声处理断裂步骤1)中所述的包括肠道脱落细胞基因组DNA的料液获得包括断裂DNA的料液；

3)将步骤2)中所述的包括断裂DNA的料液、生物素标记的目标基因探针、PBS溶液混合获得混合料液，将所述混合料液置于95～100℃孵育4～6min后，降温至20～24℃获得包括基因-探针复合物的料液；

4)用C1链亲和素磁珠从步骤3)中所述的包括基因-探针复合物的料液中分离基因-探针复合物获得磁珠-基因-探针复合物；

5)对步骤4)中所述的磁珠-基因-探针复合物进行重亚硫酸盐处理获得处理后的DNA样品；

6)对步骤5)中所述的处理后的DNA样品进行甲基化特异性PCR和测序，获得目标基因甲基化程度；所述目标基因甲基化程度＝甲基化引物扩增产物的测序丰度/非甲基化引物扩增产物的测序丰度。

优选的，所述裂解液以水为溶剂，包括以下组分：50mmol/L Tris，150mmol/LNaCl，1wt％Triton X-100，1wt％脱氧胆酸钠和0.1wt％十二烷基硫酸钠；所述50mmol/LTris的pH值为7.4。

优选的，步骤1)中所述粪便样品与裂解液的质量体积比为(150～250)mg:(150～250)μL。

优选的，步骤2)中所述的超声处理为间歇性超声处理；所述超声处理的功率为110～130W；所述间歇性超声处理为2s处理，5s间歇；所述间歇性超声处理的总时间为3min。

优选的，步骤3)所述生物素标记的目标基因探针的长度为22～24nt；所述生物素标记的目标基因探针的退火温度为58～75℃。

优选的，步骤3)所述生物素标记的目标基因探针在所述混合料液中的浓度为8～12nmol/L。

优选的，所述目标基因为QKI基因。

优选的，所述目标基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了一种肠道脱落细胞目标基因启动子甲基化检测的试剂盒，包括所述裂解液、生物素标记的目标基因探针、PBS溶液、C1链亲和素磁珠。

优选的，所述C1链亲和素磁珠为Dynabeads^TM MyOne^TM Streptavidin C1链亲和素磁珠。

本发明的有益效果：本发明提供的肠道脱落细胞目标基因启动子甲基化检测的方法，通过裂解、超声处理以及生物素标记的目标基因探针的靶向性捕获能够快速准确的从粪便样品中富集目标基因，捕获效率高，特异性强，样品用量少。

附图说明

图1为肿瘤患者和正常人粪便样本甲基化程度检测结果及差异；

图2为组织样品和粪便样本甲基化程度检测结果的相关性。

具体实施方式

本发明提供了一种非疾病诊断目的的肠道脱落细胞目标基因启动子甲基化检测的方法，包括以下步骤：1)将粪便样品置于裂解液中进行细胞裂解，对裂解后的料液进行固液分离，收集液相组分获得包括肠道脱落细胞基因组DNA的料液；2)超声处理断裂步骤1)中所述的包括肠道脱落细胞基因组DNA的料液获得包括断裂DNA的料液；3)将步骤2)中所述的包括断裂DNA的料液、生物素标记的目标基因探针、PBS溶液混合获得混合料液，将所述混合料液置于95～100℃孵育4～6min后，降温至20～24℃获得包括基因-探针复合物的料液；4)用C1链亲和素磁珠从步骤3)中所述的包括基因-探针复合物的料液中分离基因-探针复合物获得磁珠-基因-探针复合物；5)对步骤4)中所述的磁珠-基因-探针复合物进行重亚硫酸盐处理获得处理后的DNA样品；6)对步骤5)中所述的处理后的DNA样品进行甲基化特异性PCR和测序，获得目标基因甲基化程度；所述目标基因甲基化程度＝甲基化引物扩增产物的测序丰度/非甲基化引物扩增产物的测序丰度。

本发明将粪便样品置于裂解液中进行细胞裂解；在本发明中，所述裂解液所述裂解液以水为溶剂，包括以下组分：50mmol/L Tris，150mmol/L NaCl，1wt％Triton X-100，1wt％脱氧胆酸钠和0.1wt％十二烷基硫酸钠；所述50mmol/L Tris的pH值为7.4。在本发明中，所述粪便样品与裂解液的质量体积比优选为(150～250)mg:(150～250)μL，更优选为200mg:200μL。本发明中，所述粪便样品用量少；本发明中，所述细胞裂解的时间优选为25～35min，更优选为30min；本发明对所述细胞裂解的温度没有特殊要求，所述细胞裂解期间优选的伴随震荡以促进细胞裂解。本发明采用所述裂解液进行细胞裂解为温和的细胞裂解，主要裂解真核细胞，而不裂解植物和厚壁细菌细胞，以避免粪便样品中的食物以及细菌DNA对人肠道脱落细胞基因组DNA的干扰。

本发明在所述细胞裂解后，对裂解后的料液进行固液分离，收集液相组分获得包括肠道脱落细胞基因组DNA的料液。在本发明中，所述固液分离的方法优选为离心，所述离心的离心力优选为800～1200g，更优选为1000g；所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min；本发明中所述离心的目的是去除细菌和粪便残渣，收集肠道脱落细胞基因组DNA。

本发明在获得所述包括肠道脱落细胞基因组DNA的料液后，超声处理断裂所述的包括肠道脱落细胞基因组DNA的料液获得包括断裂DNA的料液。在本发明中，所述超声处理优选为间歇性超声处理；所述超声处理的功率优选为110～130W，更优选为120W；所述间歇性超声处理具体优选为2s处理，5s间歇；所述间歇性超声处理的总时间优选为3min。

本发明在获得所述包括断裂DNA的料液后，将所述的包括断裂DNA的料液、生物素标记的目标基因探针、PBS溶液混合获得混合料液，将所述混合料液置于95～100℃孵育4～6min后，降温至20～24℃获得包括基因-探针复合物的料液。在本发明中，所述PBS溶液的体积优选为所述包括断裂DNA的料液体积的2倍；所述所述生物素标记的目标基因探针在所述混合料液中的浓度优选为8～12nmol/L，更优选为10nmol/L。在本发明中，所述生物素标记的目标基因探针的序列是根据目标基因的序列设计获得的，为目标基因的同向序列或反向互补序列。本发明对所述的目标基因的种类没有特殊限定，任何基因均可以作为目标基因；在本发明具体实施过程中，以QKI基因为例。在本发明中，所述生物素标记的目标基因探针的长度优选为22～24nt，更优选为23nt；所述生物素标记的目标基因探针的退火温度优选为58～75℃，更优选为62～72℃，最优选的为70℃。本发明对所述生物素标记的目标基因探针的制备方法没有特殊限定，优选的委托生物科技公司进行人工合成。在本发明中，当所述目标基因为QKI基因时，所述目标基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明中，所述混合料液置于95～100℃孵育4～6min的目的在于对DNA进行变性，利用目标基因探针与目的基因的结合。本发明中，所述孵育的温度优选为96～99℃，所述孵育的时间优选为5min。本发明中，所述降温优选为自然降温，所述自然降温更有利于目标基因探针与目的基因的结合。

本发明在获得所述包括基因-探针复合物的料液后，用C1链亲和素磁珠从所述包括基因-探针复合物的料液中分离基因-探针复合物获得磁珠-基因-探针复合物。在本发明中，所述C1链亲和素磁珠优选为Dynabeads^TM MyOne^TM Streptavidin C1链亲和素磁珠；所述C1链亲和素磁珠能够与生物素标记的目标基因探针结合，从而靶向捕获目标基因。在本发明具体实施过程中，优选的将所述C1链亲和素磁珠与包括基因-探针复合物的料液混合后进行分离；所述分离优选的为离心分离或磁铁分离；所述离心分离的离心力优选为800～1200g，更优选为1000g；所述离心的时间优选为5～10min，更优选为8min。本发明对所述磁铁分离没有特殊限定，采用本领域常规的磁铁分离装置进行即可。本发明在所述分离后优选的进行洗涤；所述洗涤用的溶液为PBS溶液，所述洗涤的次数优选为1～3次，更优选为2次。

本发明在分离获得所述磁珠-基因-探针复合物后，对所述磁珠-基因-探针复合物进行重亚硫酸盐处理获得处理后的DNA样品。本发明对所述重亚硫酸盐处理的方法和步骤没有特殊限定，采用本领域常规的重亚硫酸盐测序文库构建过程的重亚硫酸盐处理即可。

本发明在所述中亚硫酸盐处理结束后，将所述的处理后的DNA样品进行甲基化特异性PCR和测序，获得目标基因甲基化程度；所述目标基因甲基化程度＝甲基化引物扩增产物的测序丰度/非甲基化引物扩增产物的测序丰度。本发明中，所述甲基化特异性PCR优选为巢式PCR；本发明中，所述巢式PCR分为外围引物PCR和内部引物PCR两个步骤；所述外围引物PCR的反应体系以25μL计，优选的如下：

所述外围引物PCR的反应程序优选的如下：

95℃30s，55℃30s，72℃30s，25～35个循环；72℃延伸7min。

本发明在所述外围引物PCR反应结束后，优选的取外围引物PCR反应的产物1μL为模板，然后采用内部引物进行内部引物PCR，所述内部引物PCR的反应体系以25μL计，优选的如下：

所述内部引物PCR的反应程序优选的如下：

95℃30s，58℃30s，72℃30s，25～35个循环；72℃延伸7min。

在本发明中，所述内部引物优选的包括甲基化内部PCR引物对和非甲基化内部引物对；采用两个不同的引物对，对所述外围引物PCR反应的产物进行PCR扩增，然后测序获得所述目标基因甲基化程度；所述目标基因甲基化程度＝甲基化引物扩增产物的测序丰度/非甲基化引物扩增产物的测序丰度。

在本发明中，所述测序优选的包括以下步骤：①将内部引物PCR扩增获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离并回收目的条带；②将所述目的条带与载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞后进行培养；③挑选阳性克隆进行测序。本发明中，所述分离并回收目的条带优选的采用试剂盒进行；本发明对所述步骤②和③的操作没有特殊限定，采用本领域常规的转化和测序方法即可。本发明中所述测序优选的委托生物技术公司进行。

本发明提供了一种肠道脱落细胞目标基因启动子甲基化检测的试剂盒，包括所述裂解液、生物素标记的目标基因探针、PBS溶液、C1链亲和素磁珠。所述C1链亲和素磁珠优选的为Dynabeads^TM MyOne^TM Streptavidin C1链亲和素磁珠。在本发明中，所述试剂盒还包括基因启动子甲基化检测所需要的其他试剂；例如目标基因巢式PCR扩增的引物对，PCR反应缓冲液，琼脂糖凝胶电泳试剂，PCR产物回收和纯化试剂盒等。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

收集结肠癌患者3例，取其粪便，同时收集正常对照的粪便3例。

1)粪便裂解

裂解液具体配方：50mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，1wt％Triton X-100，1wt％sodium deoxycholate，0.1wt％ SDS；采用较温和的裂解液，这样裂解主要为真核细胞，而不裂解植物和厚壁细菌。

称取粪便200mg，加入200μL裂解液，裂解30min(期间震荡)，获得肠道脱落细胞的基因组DNA。

2)将裂解后的料液1000g离心10min，去除细菌、粪便残渣；超声【120w，2s on，5soff，时间3min】断裂DNA后富集断裂DNA。

超声破碎DNA后，加入2倍体积的1XPBS，然后加入含靶基因QKI基因靶区域外围的单链DNA探针，使其终浓度为10nmol/L(biotin修饰过的两条核酸链，核苷酸序列分别为：GGCGGGTGGGTGTGGGCTGC(SEQ ID No.1)和GGCGGCGCTGCCAGCGGCGG(SEQ ID No.2)；然后在沸水(95℃以上)中孵育5min，随后自然降温至室温(22℃)；然后加入Dynabeads^TM MyOne^TMStreptavidin C1链亲和素磁珠，1000g离心5min得到磁珠-基因-探针复合物；然后PBS洗涤2次，每次2min。

提取DNA的时候，通过生物素-链亲和素磁珠系统，只富集探针结合的DNA

2)直接对磁珠复合物，进行重亚硫酸盐处理，具体如下：

试剂配方：①2.3mol/L重亚硫酸钠溶液(4mL)：1.76g重亚硫酸钠溶解于3mL蒸馏水中，加入340μL 3mol/L的NaOH。此溶液需即用即配，不可久置。②20mmol/L氢醌：称取微量氢醌，根据实际的质量，溶解于相应的蒸馏水中，搅拌混匀。此溶液需即用即配，不可久置。③3mol/L NaOH(10mL)：溶解1.2g NaOH于8mL蒸馏水中，搅拌溶解后定容至10mL。④8mol/LNH4Ac(10mL)：溶解6.16g NH4Ac于50mL蒸馏水中，搅拌至大部分溶解后，缓慢加蒸馏水至10mL。

实验步骤：①取等量(不同处理组的样本)，定容至90μL，加入10μL上述配制好的3mol/L的NaOH，37℃作用20min；②加入1040μL的2.3mol/L的重亚硫酸钠，30μL的20mmol/L的氢醌，20μL的ddH₂O，轻柔混匀；③55℃水浴16h，后通过胶回收试剂盒的吸附柱(可以适当加点溶胶试剂，不加也可)回收DNA，去除重亚硫酸钠，90μLTE洗脱；④加入10μL的3mol/L的NaOH，37℃孵育15min；⑤加入70μL的NH4AC(8mol/L)，中和上述反应；⑥加入20μg的糖原或者10mmol/L的tRNA，混匀，随后加入3倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃静置1h；⑦12,000rpm离心10min，弃上清，70％的乙醇洗涤，离心弃上清，晾干，用10μL的H2O溶解、备用。然后对处理后的DNA样本进行甲基化特异性PCR和测序，采用巢式PCR进行启动子甲基化检测，引物如表1所示。

表1巢式PCR所用引物序列

外围引物PCR反应体系如下：

表2外围引物PCR扩增体系

外围引物PCR循环参数如下：

95℃30s；55℃30s，72℃30s；30个循环；72℃延伸7min。

取外围引物产物1μL，然后采用内部引物继续PCR，退火温度升高3度，PCR其它条件相同。

通过T-A克隆与测序，明确甲基化效果，步骤:

①PCR产物，琼脂糖凝胶电泳，分离目的条带；

②胶回收目的条带(采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209)，按照说明书进行)；

③目的条带6μL+pMD18-T载体(来源Takara)1μL+1μL T4 DNA Ligase+1μL Ligasebuffer；4℃连接过夜；

④转化感受态细菌DH5α，涂板、细菌孵箱培养；

⑤挑选15个克隆，提取质粒，电泳和酶切鉴定；随机挑选鉴定正确的5个克隆送公司测序。

最后分别比较MSP internal 1和MSP internal 2扩增产物的丰度，通过MSP1/MSP2的丰度推算甲基化程度。

结果发现，结肠癌患者中脱落细胞QKI启动子甲基化程度显著高于正常人(图1)。此外，本发明所述方法检测的结肠癌患者脱落细胞QKI启动子甲基化程度与直接检测肿瘤样本中甲基化程度具有很好的一致性(图2)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 一种肠道脱落细胞目标基因启动子甲基化检测的方法及试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcgggtggg tgtgggctgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcggcgctg ccagcggcgg 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatttagttt ttgygtttag gtt 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaatctctc taaactaatc cc 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgttaacggt cgttttgcgc ggtt 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgccgcgctc cgactacgct cctc 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggaggtag ggaggagggg g 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaattcacct caattcaaac 20

Claims

1.一种非疾病诊断目的的肠道脱落细胞目标基因启动子甲基化检测的方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液以水为溶剂，包括以下组分：50mmol/L Tris，150mmol/L NaCl，1wt％Triton X-100，1wt％脱氧胆酸钠和0.1wt％十二烷基硫酸钠；所述50mmol/L Tris的pH值为7.4。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述粪便样品与裂解液的质量体积比为(150～250)mg:(150～250)μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的超声处理为间歇性超声处理；所述超声处理的功率为110～130W；所述间歇性超声处理为2s处理，5s间歇；所述间歇性超声处理的总时间为3min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述生物素标记的目标基因探针的长度为22～24nt；所述生物素标记的目标基因探针的退火温度为58～75℃。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，步骤3)所述生物素标记的目标基因探针在所述混合料液中的浓度为8～12nmol/L。

7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述目标基因为QKI基因。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述目标基因探针的核苷酸序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。

9.一种肠道脱落细胞目标基因启动子甲基化检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述裂解液、生物素标记的目标基因探针、PBS溶液、C1链亲和素磁珠。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述C1链亲和素磁珠为Dynabeads^TMMyOne^TMStreptavidin C1链亲和素磁珠。