JP2721671B2 - Ｈｔｌｖウイルス及びｈｔｌｖ▲ｉｉ▼ウイルスの検出方法 - Google Patents
Ｈｔｌｖウイルス及びｈｔｌｖ▲ｉｉ▼ウイルスの検出方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−タイプＩ及
びII（HTLV I及びHTLV II）の保存された核酸配列の存
在又は不存在の検出のための方法に関する。この発明は
また、このような検出のための、プライマー及びラベル
されたハイブリダイゼーションプローブを有するキット
に関する。 〔従来の技術〕 ヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV）として知られてい
るＴ細胞熱帯レトロウイルスの一群は幾つかのＴ細胞性
異性腫瘍の発病に関与することが知られている。最近３
種類のタイプのHTLVが知られている。第一のタイプＩ
（HTLV I）は、日本、カリブ地方及びアフリカにおいて
見出されたヒト成人Ｔ−細胞白血病−リンパ腫（ATLL）
に関連する発癌ウイルスである。第二のタイプII（HTLV
II）は、ハーリー（hairy）細胞白血病のＴ−細胞変異
体を有する２人の患者から単離された発癌ウイルスであ
る。M.Popovic等、Science，224:497−500（1984）、及
びRosenblatt,J.D.等、New Eng.J.of Med.,1986年８月
を参照のこと。第３のタイプIII（HTLV III）はレンチ
ウイルスであり、そしてしばしば致命的な日和見感染を
もたらす細胞性免疫系の伝染性疾患である後天性免疫不
全症候群（AIDS）の病因体である。 AIDSのごときHTLV−関連ウイルスに対する抗体を含む
血清を同定するための最近の免疫診断試験（Gallo等の
米国特許No.4,520,113を参照のこと）が潜在的に感染性
の血液を除去するために血夜銀行において使用されてい
る。HTLV群のレトロウイルスを検出するためのモノクロ
ーナル抗体を製造するために有用なレトロウイルスポリ
ペプチドについては1986年３月27日に公開されたWO 86/
01834（カリホルニア大学）をも参照のこと。これらの
ウイルスは有意な量のウイルス粒子を生産することなく
DNAコピーとして存在することができるため、HTLV I及
びII−関連ウイルスを検出するための直接的な免疫的ア
プローチは、持続的に感染している無症状の個体の多く
においては好結果をもたらさない。感染された組織及び
血液中のウイルス粒子の数は少ないため（ウイルス休止
のため）、感染細胞を受容Ｔ細胞系と共に同時培養しな
い限り、ウイルス粒子又はRNA/DNAを直接検出すること
は不可能ではないにしても困難である。 1987年７月28日発行のK.Mullisの米国特許No.4,683,2
02は、ラベル化RNA又はDNAハイブリダイゼーションプロ
ーブを用いることによる、核酸配列の検出を容易にする
ためにそれを増幅する方法を記載している。この方法に
おいては、プライマーを用いてプライマー延長生成物を
得、この生成物を鋳型として用いてヌクレオチドの存在
下で追加の相補鎖を合成する。上記の特許出願はまた次
の様な技法を記載している。すなわち、この方法におい
ては、プローブが目的の配列にハイブリダイズした後制
限酵素の添加によりハイブリドが目的の配列内の部位に
おいて開裂され、そして次に制限消化物がラベル化断片
について分析される。1987年７月28日発行の米国特許N
o.4,683,194、及びH.Erlich等及びSaiki等、Biotechnol
ogy，３:1008−1012（1985）は後者の技法を非常に詳細
に記載している。両特許出願は鎌形赤血球貧血及びβ−
サラセミアのごとき遺伝的疾患の検出のためのこの方法
の使用を例示している。これらの方法、及び核酸配列を
増殖するための方法はまた、Saiki等、Science,230,135
0−1354（1985）にも記載されている。 Landry等、Clin.Lab.Med.（1985）５,513−529による
総説論文は、ウイルスの検出に使用される酸ハイブリダ
イゼーションの分野を記載している。1986年３月13日に
公開されたWO 86/01535、及び1986年３月５日に公開さ
れたEP 173,529はHTLV IIIの分子クローニング、及びAI
DSを検出するためのプローブとしての該クローンの使用
を記載している。1986年３月５日に公開されたヨーロッ
パ特許出願No.173,339は、外来微生物による感染を検出
するためにDNAプローブを用いる遺伝子分析を開示して
いる。1986年６月25日に公開されたEP 185,444は、細胞
溶解物中のHTLV IIIウイルスの検出のためのプローブと
して使用するための組換ペプチドを開示している。Onco
r社は1986年９月に、AIDSウイルスを検出するための放
射性血液試験を開発した旨発表した。 〔発明が解決しようとする問題点〕 発癌ウイルスHTLV I及びIIを検出するためのハイブリ
ダイゼーションプローブの使用は、持続的に感染してい
るがしかしウイルスを生産しない個体又は抗体陰性であ
るが培養陽性である固体の同定、並びに感染された細胞
の検出を、ウイルスの培養を必要としないで可能にする
であろう。増幅によるウイルスのウイルス核核酸コピー
数の増加は感染された個体におけるウイルス核酸の同定
を促進するであろう。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、HTLV I核酸もしくはHTLV II核酸、又はHTL
V I核酸及びHTLV II核酸の両者の単離物の間で実質的に
保存されており、そしてHTLV IもしくはHTLV II、又はH
TLV I及びHTLV IIの両者の単離体中の核酸に特異的な核
酸配列の、サンプル中での存在又は不存在を検出又は監
視するための方法であって、 （ａ）前記サンプルを、一緒に又は別々に、前記核酸配
列の核鎖のためのオリゴヌクレオチドプライマー、４種
類の異るヌクレオシドトリホスフェート及び重合用試薬
によりハイブリダイゼーション条件下で処理し、該核酸
配列の各鎖について、検出又は監視されるべき核酸配列
の各鎖に対して実質的に相補的である各プライマーのの
延長生成物が合成され、一方のプライマーから合成され
た延長生成物がその相補体から分離された場合に他方の
プライマーの延長生成物のための鋳型として機能するよ
うにし； （ｂ）前記サンプルを変性条件下で処理して、検出され
るべき配列が存在する場合にはプライマー延長生成物を
それらの鋳型から分離せしめ； （ｃ）段階（ｂ）の生成物をオリゴヌクレオチドプライ
マーを処理することにより、段段（ｂ）において生成し
た単鎖のそれぞれを鋳型として用いてプライマー延長生
成物を合成して、検出されるべき配列が存在すればそれ
を増幅し；そして （ｄ）検出されるべき配列が存在するとすればそれを検
出する； ことを含んで成る方法に関する。 生成物を検出するための１つの方法は、段階（ｃ）の
生成物に、増幅された核酸配列とハイブリダイズするこ
とができるラベルされたプローブを添加し；そして該プ
ローブが核酸サンプル中の増幅された配列にハイブリダ
イズしたか否かを決定することによる。１つの態様にお
いて、この決定は、 （１）前記プローブ中の配列内の部位を認識する制限酵
素により前記ハイブリダイズした混合物を消化し；そし
て （２）この制限消化物がHTLV I又はHTLV II配列の存在
と関連する制限断片を含有するか否かを決定すること； により行うことができる。 段階（ａ）の前に、患者のサンプル中の核酸を抽出
し、抽出された核酸の混合物をサンプルとして実階に処
理することができる。さらに、段階（ａ）において処理
するサンプル中のウイルスをあらかじめ培養する必要は
ない。 他の態様において、この発明は、HTLV I核酸もしくは
HTLV II核酸、又はHTLV I核酸及びHTLV II核酸の両者の
単離体の間で実質的に保存されており、HTLV Iもしくは
HTLV II、又はHTLV I及びHTLV IIの両者の単離体中の核
酸に特異的な核酸配列のサンプル中での存在又は不存在
を検出又は監視するためのキットであって、 （ａ）検出されるべき核酸配列の各鎖のためのオリゴヌ
クレオチドプライマー（この１又は複数のプライマーは
各特定の核酸配列の各鎖に対して実質的に相補的であっ
て、一方のプライマーから合成された延長生成物がその
相補体から分離された場合、他方のプライマーの延長生
成物の合成のための鋳型として機能することができ
る）；及び （ｂ）前記核酸配列とハイブリダイズすることができる
ラベル化プローブ； を含んで成るキットに関する。 好ましくは、このキットはさらに、重合用試薬４種類
の異るヌクレオチド、及びプローブと配列とのハイブリ
ドを検出するための手段を含む。 この発明の試験キットは研究試験、臨床試験、及び他
の診断的用途に用いることができる。さらに、このキッ
トはウイルスを培養することなく、感染された細胞をモ
ニターするために使用することができ、これは感染を解
消するために種々の療法剤により治療された患者をモニ
ターするのに有用な特徴である。 ここの発明は、HTLV I及びHTLV IIウイルスのいずれ
か又は両者に関連する核酸配列を含有することが疑がわ
れるサンプル中の該核酸配列を検出し又はモーターする
ための方法及びキットに関する。HTLV I及びHTLV IIウ
イルスの単離体は配列決定されている。増幅されるべき
配列はHTLV I及び／又はIIウイルスに特異的でなければ
ならない。すなわち、HTLV IIIウイルス又は非−HTLV I
もしくは非−HTLV IIウイルスと反応してはならない。 〔具体的な説明〕 HTLV Iウイルスの全ゲノムはSeiki等、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 80:3618−3622（1983）により与えられてい
る。HTLV IIウイルスの全ゲノムはShimotohno等、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,82:3101−3105（1985）により与え
られている。 検出されるべき配列について適用される。“実質的に
保存されている”という語は、配列が、検出されるべき
ウイルス中の核酸に対して、重合用試薬及び４種類のヌ
クレオシドトリホスフェートの存在下で重合を開始する
のに十分に相補的でなければならないことを意味する。 用いられるプライマーは、HTLV I及び／又はIIウイル
ス中の有意な数の核酸上での重合の特異的な開始を提供
するための任意の長さ及び配列のオリゴヌクレオチドで
ある。具体的には、この明細書において使用する“プラ
イマー”なる語は、２個以上の、さらに好ましくは３個
より多くの、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレ
オチドから成る分子であって、核酸鎖に対して実質的に
相補的であるプライマー延長生成物の合成が誘導される
条件下に置かれた場合に、すなわちヌクレオシドトリホ
スフェート及び重合用試薬、例えばDNAポリメラーゼ、
の存在下、適当な温度及びpHにおいて、合成の開始点と
して機能することができるものである。プライマーは好
ましくは、増幅の最大効率のために単鎖であるが、しか
し二本鎖であってもよい。二本鎖であれば、プライマー
をまず処理してその鎖に分離し、次にこれを用いて延長
生成物を調製する。好ましくは、プライマーはオリゴデ
オキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合用
誘導剤の存在下で延長生成物の合成を開始するために十
分な長さを有しなければならない。プライマーの正確な
長さは、温度、緩衝液、ヌクレオチド組成及びプライマ
ーの由来等、多くの因子に依存するであろう。この発明
の目的のため、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的
には15〜25又はこれより多くのヌクレオチドを含有す
る。但しさらに少数のヌクレオチドを含有することもで
きる。 この発明においてプライマーは、増幅されるべき特定
の配列の各鎖に対して“実質的に”相補的である様に選
択される。このことは、重合用試薬が機能する条件下で
プライマーがそれらの対応する鎖とハイブリダイズする
ために十分に相補的でなければならないこと、すなわ
ち、プライマーが増幅されるべき鎖の配列との十分な相
補性を有することによりそれとハイブリダイズし、これ
によって他の鋳の延長生成物の合成のための鋳型を構成
することを意味する。プライマーは鎖との間に若干のミ
スマッチを含有することができる。 HTLV I及びHTLV IIウイルスの間で実質的に保存され
ている領域中から増幅されるべき配列を選択することが
できる。従って、任意の適当な手段でプライマー及びプ
ローブを同定しそして選択することができる。これは、
HTLV I及びHTLV IIウイルスゲノムの公表されている核
酸配列の領域を比較することにより手仕事で行うことが
できる。HTLV I及びHTLV IIウイルスのＸ領域間の相同
性がShimotohno等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6657
−6601（1984）により公表されている。他の方法はコン
ピュータープログラムを用いて配列を比較することであ
る。この目的のため、National Biomedical Research F
oundationにより提供される、ドットマトリクスを用い
る基本コンピューターアルゴリズムの市販プログラムを
用いるのが便利である。このプログラムは、HTLV I及び
HTLV IIウイルスの核酸配列をインプットし、そして塩
基対相同性についてウインドウサイズを決定することを
含む。このプログラムはグラフィックを用いて異る軸上
の配列を比較し、そして少なくとも実質的な相同性が存
在する場合にドットが現われる。好ましくは、ウインド
ウサイズは６塩基より大である。 ゲノムのＸ領域は、２種類のウイルス中のコード領域
間で最も保存されている。これがコード領域間で最も保
存されているので、配列を検出するための、これがプロ
ーブ及びプライマーを選択するための好ましい領域であ
る。蛋白質をコードしていないウイルスゲノムの領域を
用いて、使用するべきプライマーの配列を決定すること
もできる。この発明の目的のため、感度及び特異性を最
大にするために、検出されるべき配列は、関連ウイルス
間で、特にプローブ及び制限酵素が使用される場合には
制限酵素開裂部位において実質的に保存されている、特
異的プライミングを可能にするのに十分な長さを有する
配列と相同なものである。 増幅しそしてその後で生成物を検出するために使用さ
れる技法は米国特許No.4,683,201及びNo.4,683,194（前
記）;Saiki等、Biotechnology（前掲）；及びSaiki等Sc
ience（前掲）に詳細に記載されている。一般に、増幅
工程は特定の核酸配列を調製するための酵素的連鎖反応
を含み、用いられた反応段階の数に対して指数的量で核
酸配列が調製される。但し、要求される配列の末端が十
分に詳細に知られており、それとハイブリダイズするオ
リゴヌクレオチドプライマーを合成することができるこ
と、及び連鎖反応を開始するために少量の配列が入手可
能であることが条件となる。一方のプライマーは負
（−）鎖に対して相補であり、そして他方は正（＋）鎖
に対して相補的である。変性された核酸へのプライマー
のアニーリング、並びにこれに続く、DNAポリメラーゼ
Ｉの大断片（Klenow）のごとき酵素及びヌクレオチドを
用いる延長が標的配列を含有する新しく合成された＋及
び−鎖をもたらす。これらの新しく合成された配列はさ
らにプライマーのための鋳型となるから、変性、プライ
マーアニーリング及び延長の反復サイクルが、プライマ
ーにより規定される領域の指数的蓄積をもたらす。連鎖
反応の生成物は、使用された特定のプライマーの末端に
対応する末端を有する別個の核酸デュプレックスであ
る。 次に増幅工程を模式的に示すが、ここでは相補的な鎖
〔S+〕及び〔S-〕を含んで成る所望の配列〔Ｓ〕を含有
する２本鎖DNAが核酸として使用される。第１の及びこ
れに続く各反応サイクルの間、もとの鋳型上での各オリ
ゴヌクレオチドプライマーの延長が、プライマーの１つ
のみにより停止する無限長の新しいssDNA分子生成物を
生成する。今後“長生成物”と称するこれらの生成物は
直線的に蓄積するであろう。すなわち、ある数のサイク
ルの後に存在する量がサイクル数に比例するであろう。 こうして生成された長生成物は、その後のサイクルの
間一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型
として機能し、そして所望の配列〔S+〕又は〔S-〕の分
子を生成するであろう。これらの分子もまた、一方又は
他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型として機能
してさらに〔S+〕及び〔S-〕を生成し、そしてそれ故
に、サイクル数に対して指数的速度での〔Ｓ〕の蓄積を
もたらすであろう鎖反応が継続され得る。 意図されるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ン以外のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに
より生成される副産物は自己触媒的ではなく、そしてそ
れ故に直線的速度で蓄積する。 増幅されるべき特異的配列〔Ｓ〕を次の様に模式的に
表すことができる。 〔S+〕 ５′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3′ 〔S-〕 ３′TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′ 対応するオリゴヌクレオチドプライマーは次の通りであ
ろう。 プライマー1:3′GGGGGGGGGG 5′ プライマー2:5′AAAAAAAAAA 3′ 従って、〔Ｓ〕を含有するDNA:が単鎖に分離され、そしてその単鎖がプライマー１及び
２とハイブリダイズし、４種類のデオキシリボヌクレオ
シドトリホスフェートの存在下、DNAポリメラーゼの存
在下で次の延長反応が触媒され得る。 生成した２つのデュプレックスの変性の後、次の生成
物が生ずる。 次のサイクルにおいて、これら４つの鎖をプライマー
１及び２とハイブリダイズせしめれば、重合用試薬は次
の反応を触媒するであろう。 上記４種類のデュプレックスが分離されれば次の鎖が
生ずる。 １つのプライマーのオリゴヌクレオチド配列で停止す
る各鎖及び他方の相補鎖は生成することが所望される特
定の核酸鎖〔Ｓ〕であることがわかる。 この工程の段階は無限に反復することができ、プライ
マー１及び２、誘導剤及び存在するヌクレオチドによっ
てのみ限定される。もとのヌクレオチドは複製されない
ので、その量は全工程を通じて一定に維持される。長生
成物はもとの核酸からのみ生成されるのでその量は直線
的に増加する。特異的配列の量は指数的に増加する。す
なわち、特異的配列は支配的な種となる。これは次の表
に示される。この表は、各サイクルの効率を100％とし
て、ｎサイクル後に存在する種の相対量を示す。 鋳型として単鎖ヌクレオチドが使用される場合、サイ
クル当り１個のみの長生成物が生成する。 この明細書において使用する場合、“制限エンドヌク
レアーゼ”及び“制限酵素”なる語は、特定のヌクレオ
チド配列において又はその近傍において２本鎖DNAを切
断する細菌酵素に関する。 この発明のプライマーは次の規準により選択する。こ
れは考慮すべき要素であるが、これらのみではなく、又
は絶対的なものではない。第一に、プライマーはHTLV I
及びHTLV IIゲノムの保存された領域から選択される。
Ｘ領域がコード領域の内の最も保存されている領域であ
り、そしてそれ故に最初の研究のためにＸ領域を選択し
た。 第二に、プライマーは、試験を傷つけると予想される
ウイルスゲノムのあらゆる配列、例えばStarcich等、Sc
ience，227:538−540（1985）により公表されているHTL
V IIIの配列との相同性を欠くものである。 第三に、プライマーは好ましくは増幅される核酸中に
二次構造を形成しないものであり、この二次構造は増幅
酵素、例えばE.コリDNAポリメラーゼ、好ましくはKleno
w断片と称されるDNAポリメラーゼの部分による延長を妨
害するであろう。これは、約15重量％までの、好ましく
は５〜15重量％のジメチルスルホキシド（DMSO）を増幅
媒体中に用いることにより、そして／又は増幅温度を30
〜40℃に、好ましくは35〜40℃に上昇せしめることによ
り達成することができる。 第四に、プライマーは好ましくは、約50％のグアニン
及びシトシンを含有し、そしてプライマーの３′に多数
の連続するアデニン及びチミジン残基を含有しないもの
である。これは不安定なハイブリドをもたらす。最後
に、増幅された生成物が制限酵素を用いて検出される場
合、プローブは内部の（非−末端）制限部位を有さなけ
ればならない。 オリゴヌクレオチドは、例えば、前記のホスホトリエ
ステル法及びホスホジエステル法、又はこれらの自動化
された方法を用いて調製することができる。１つのこの
様な自動化された方法においては、Beaucage等、Tetrah
edron Letters（1981）、22:1859−1862により記載され
ているように、ジエチルホスホラミダイトが出発物質と
して使用され、そして合成される。修飾された固体支持
体上でオリゴヌクレオチドを合成するための１つの方法
は米国特許No.4,458,066に記載されている。生物源から
単離されたプライマー（例えば、制限エンドヌクレアー
ゼ消化物）を使用することもできる。 HTLV I及び／又はHTLV IIと関連する特定の核酸配列
を含有しているか、又は含有していることが疑われるも
のである限り、精製された形又は精製されていない形の
あらゆる核酸源を出発核酸として使用することができ
る。すなわち、この方法においては、DNA又はメッセン
ジャーRNAのごときRNAを使用することができ、このDNA
又はRNAは一本鎖でも二本鎖でもよい。RNAが鋳型として
使用される場合、そのRNAをDNAに逆転写するために最適
な酵素及び／又は条件が使用される。さらに、それぞれ
の鎖を１本ずつ含むDNA−RNAハイブリドを用いることも
できる。これらの核酸の任意の混合物、あるいは同一の
又は異るプライマーを使用する予備増幅反応から生成し
た核酸を使用することもできる。 増幅されるべき特定の核酸配列は大きな分子の一部分
であることができ、あるいは個別の分子として存在し、
特定の配列が核酸全体を構成していてもよい。増幅され
るべき配列が最初に純粋な形で存在する必要はなく、例
えば複雑な混合物の小部分、例えば全体ヒトDNA中に含
有されるウイルス−コード配列の一部分であってもよ
い。出発核酸は、同一の又は異る１個より多くの特定の
核酸配列を含有することができる。従って、この発明の
方法は、１つの特定の核酸配列を多量に調製するための
みならず、同一の又は異る核酸分子上に位置する１個よ
り多くの特定の核酸配列を同時に増幅するためにも有用
である。 核酸配列は、任意の入手源、例えば動物のごとき高等
生物からの天然DNA又はRNAから得ることができる。DNA
又はRNAは体サンプル、例えば血液、組織材料、例えば
絨毛、又は羊膜細胞から種々の技法により、例えばMani
atis等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual（ニ
ューヨーク：コール・ドスプリング・ハーバー・ラボラ
トリー、1982）280−281、により記載されている技法に
より抽出することができる。 サンプルが不純な、例えば血漿又は血液である場合、
増幅の前にそれを、サンプルの細胞、液体、組織、ウイ
ルスカプセル又は動物細胞膜を開き、そして核酸の鎖を
露出しそして／又は分離するために有効な一定量の試薬
により処理することができる。鎖を露出しそして分離す
るためのこの細胞溶解及び核酸変性段階は、さらに容易
に増幅が起こることを可能にするであろう。さらに、サ
ンプルを増幅試薬により処理する前に、サンプル中のHT
LV I及びHTLV IIウイルスを培養する必要がない。サン
プルを遠心分離してバフィーコートを得、次にこれをカ
ラムに通して白血球を得ることができる。次に、白血球
を処理してそれから核酸を抽出し、増幅用サンプルとし
て使用することができる。 この発明の方法により、任意の特定の核酸配列を調製
することができる。必要なことは、配列の両端の十分な
数の塩基が十分に詳細に知られており、所望の配列の異
る鎖と、その配列にそう一定の相対位置においてハイブ
リダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーであ
って、それがその鋳型（相補体）から分離された場合に
規定された長さの核酸への他のプライマーの延長のため
の鋳型として機能することができるもの、が調製され得
ることである。配列の両端における塩基についての知識
が多くなるに従って、標的核酸配列のためのプライマー
の特異性も大きくなることができ、そしてそれ故に工程
の効率が高くなる。今後使用する場合、プライマーなる
語は、特に、増幅されるべき断片の末端配列に関する情
報がいく分不明瞭な場合、複数のプライマーを意味する
ことができると理解すべきである。例えば、核酸配列が
蛋白質配列情報から得られる場合、遺伝子コードの縮重
に基くすべての可能性あるコドン変化を代表する配列を
含有するプライマーの集合が各鎖について用いられるで
あろう。この集合からの１つのプライマーが、増幅され
るべき目的の配列の末端と共に実質的に保存されるであ
ろう。 特定の核酸配列が、鋳型としてその配列を含有する核
酸を用いることにより調製される。サンプルの標的核酸
配列が２つの鎖を含有する場合、それを鋳型として使用
する前に、別個の段階として、又はプライマー延長生成
物の合成と同時に、核酸の鎖を分離する必要がある。こ
の鎖分離は、ある適当な変性条件、例えば物理的、化学
的又は酵素的手段を用いて達成することができ、この発
明において使用する。“変性”なる語はこの様な手段の
すべてを包含する。核酸の鎖を分離するための１つの物
理的方法は、核酸をそれが変性するまで加熱することで
ある。典型的な加熱変性は、約１〜10分間にわたる約80
〜105℃の温度を用いる。鎖の分離はまた、ヘリカーゼ
と称される酵素類、又はヘリカーゼ活性を有しそしてリ
ボATPの存在下でDNAを変性せしめることが知られている
酵素RecAからの１つの酵素により誘導することもでき
る。ヘリカーゼを用いて核酸の鎖を分離するために適当
な反応条件は、Kuhn Hoffmann−Berling,CSH-Quantitat
ive Biology，43:63（1978）により記載されており、そ
してRecAを使用するための技法はC.Radding,Ann.Rev.Ge
netics，16:405−37（1982）に総説されている。 増幅されるべき配列を含むもとの核酸配列が単鎖であ
る場合、その相補体が１又は２個のオリゴヌクレオチド
プライマーを用いることにより合成される。適切な１つ
のプライマーが添加される場合、そのプライマー、重合
用試薬及び下記の４種類のヌクレオシドトリホスフェー
トの存在下でプライマー延長生成物が合成される。この
生成物は単鎖核酸と部分的に相補的であり、そして核酸
鎖とハイブリダイズして異る長さのデュプレックスを形
成し、このデュプレックスが次に前記のようにして単鎖
に分離されて、鎖に相補的な２つの分離された単鎖を生
成するであろう。あるいは、２つの適切なプライマーを
単鎖核酸に加え、そして反応を行うことができる。 オリゴヌクレオチドが増幅されるべき配列を構成する
場合、生成するプライマー延長生成物はもとの核酸の鎖
と完全に又は実質的に完全に相補的であり、そしてそれ
とハイブリダイズして同じ長さの鎖のデュプレックスを
形成し、これが単鎖分子に分離されるであろう。 核酸がもともと二本鎖であろうと単鎖であろうと、核
酸の相補的な２つの鎖が分離された場合、それらの鎖は
追加の核酸鎖の合成のための鋳型として使用され得る状
態となる。この合成は、鋳型へのプライマーのハイブリ
ダイゼーションが起ることを許容する条件下で行われ
る。一般にこれは、緩衝化水溶液中で、好ましくは７〜
９のpHにおいて、最も好ましくはおよそpH8において起
こる。好ましくは、一定モル過剰の（ゲノム核酸の場合
には通常、プライマー：鋳型が108:1）２種類のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを、分離された鋳型鎖を含有す
る緩衝液に加える。しかしながら、この発明の方法が診
断用に用いられる場合には相補的鎖の量は知られず、従
って相補鎖の量に対するプライマーの量は正確には決定
され得ないと理解される。しかしながら実際には、増幅
されるべき配列が複雑な長い核酸鎖の混合物中に含まれ
る場合、添加されるプライマーの量は相補鎖（鋳型）の
量に比べてモル過剰であろう。工程の効率を改良するた
めには大モル過剰が好ましい。 デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートdATP,dCT
P,dGTP及びTTPもまた、プライマーとは別個に又はこれ
と一緒に、適当な量で合成混合物中に添加され、そして
得られた溶液が約90〜100℃にて、約１〜10分間、好ま
しくは１〜４分間加熱される。この加熱期間の後、溶液
を室温に放冷する。この温度はプライマーハイブリダイ
ゼーションのために好ましい。この冷却された混合物
に、プライマー延長反応を行うための適当な試薬（この
明細書において重合用試薬と称する）を添加し、そして
当業界において知られている条件下で反応を行う。重合
用試薬は、もしそれが熱安定性であれば、他の試薬と一
緒に添加することもできる。この合成反応は室温から、
重合用試薬がそれ以上では機能しなくなる温度までにお
いて起こることができる。すなわち、例えば、DNAポリ
メラーゼが試薬として使用される場合、温度は一般に約
40℃より高くはない。最も便利には、反応は室温にて行
う。 重合用試薬はプライマー延長生成物の合成を達成する
ために機能する任意の化合物又は系であることができ、
これには酵素が包含される。この目的のために適当な酵
素には、例えばE.コリDNAポリメラーゼＩ、E.コリDNAポ
リメラーゼＩのKlenow断片、T4 DNAポリメラーゼ、他の
入手可能なDNAポリメラーゼ、ポリメラーゼミューテイ
ン、逆転写酵素、及び他の酵素、例えば熱安定性酵素
（すなわち、変性を生じさせるために十分に上昇した温
度に暴露した後にプライマー延長を行う酵素）が今ま
れ、これらは適切な態様でのヌクレオチドの結合を促進
し、各核酸鎖に相補的なプライマー延長生成物を生成せ
しめるであろう。一般に、合成は各プライマーの３′末
端から始まりそして鋳型鎖にそって合成が停止するまで
５′方向に進行し、異る長さの分子を生成する。しかし
ながら、上記の同じ方法を用いて、５′末端において合
成を開始しそして他の方向に進行せしめる重合用試薬も
存在し得る。 新たに合成された鎖及びその相補的核酸鎖は、標的配
列が存在すれば前記のハイブリダイゼーション条件下で
二本鎖分子を形成し、そしてこのハイブリドがこの方法
の次の段階において使用される。次の段階において、ハ
イブリダイゼーション条件下で処理されたサンプルを、
前記のいずれかの方法を用いて変性条件にかけ、標的配
列が存在するとすれば単鎖分子を得る。 新しい核酸が単鎖分子上に合成される。前記の条件下
に反応が進行することが必要であれば、追加の重合用試
薬、ヌクレオチド及びプライマーを添加することができ
る。やはり、合成は各オリゴヌクレオチドの一端から開
始されそして鋳型の単鎖にそって進行し、追加の核酸を
生成するであろう。この段階の後、反応生成物の半分は
２つのプライマーにより挾まれた特定の核酸配列から成
るであろう。 検出のために必要な程度に標的核酸配列を増幅するた
めに必要な回数だけ、変性及び延長生成物合成の段階を
反復する。さらに詳細に後記するように、生産された特
定の核酸配列の量が指数的に蓄積するであろう。 最初の核酸又は核酸の混合物から１種類より多くの特
定の核酸配列を調製することが望まれる場合には、適切
な数の異るオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。例
えば、２種類の異る特定の核酸配列が調製されるべき場
合、４種類のプライマーが使用される。２つのプライマ
ーは特定の核酸配列の１つに特異的であり、他の２つの
プライマーは第二の特定の核酸配列に特異的である。こ
のようにして、２種類の異る特定の配列を、この発明の
方法により指数的に調製することができる。 この発明は、各段階の後に新たな試薬を加えながら段
階的に、すべての試薬を最初の段階で加えて同時的に、
あるいは所定数の段階の後に新たな試薬を加えながら半
ば段階的且つ半ば同時的に行うことができる。熱感受性
酵素の場合のように、重合用試薬を不活性化するであろ
う変性方法、例えば熱を用いる場合、各鎖分離段階の後
に試薬を更新する必要がある。鎖分離段階に酵素的手段
を用いる場合、同時的方法を用いることができる。同時
的方法においては、反応混合物は、所望の配列を含有す
る核酸鎖に加えて、鎖分離酵素（例えば、ヘリカー
ゼ）、該鎖分離酵素のための適切なエネルギー源、例え
ばrATP、４種類のヌクレオシドトリホスフェート、モル
過剰のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、重合用試
薬、例えばE.コリDNAポリメラーゼＩのKlenow断片を含
有することができる。 同時的方法において変性のために加熱が使用される場
合、核酸が平衡状態の単鎖及び二本鎖から成る温度であ
る上昇した温度、例えば試薬に依存して50℃〜105℃に
おいて機能するであろう熱安定性試薬、例えば熱安定性
ポリメラーゼが用いられる。長さの短い核酸のためには
約40℃〜50℃の低い温度を用いることができる。上限温
度は、酵素が分解する温度、又はそれより高温ではプラ
イマーハイブリダイゼーションが十分なレベルで起らな
い温度に依存するであろう。この様な熱安定性酵素は例
えばA.S.Kaledin等、Biokhimiya，45,644−651（1980）
により記載されている。この定温反応が継続するために
は、プライマーはお互の６〜８塩基対以内にそれらの
３′末端を有する。この方法の各段階は、すべての試薬
が最初に存在するにもかかわらず逐次的に生ずる。必要
に応じて追加の材料を添加することができる。所望の量
の特定の核酸配列を生じさせるのに適切な時間が経過し
た後、既知の方法で酵素を不活性化することにより、又
は反応成分を分離することにより反応を停止させること
ができる。 温度サイクル反応を用いて増幅を行うこともでき、こ
の場合熱安定性酵素を用いて延長、アニーリング及び変
性を行うために温度を次第に上昇せしめる。 この発明の方法は連続的に行うことができる。自動化
された方法の具体例においては、変性領域、試薬添加領
域、及び反応領域を通して反応を循環することができ
る。他の態様においては、プライマー延長生成物の合成
のために使用される酵素をカラム中に固定化することが
できる。他の反応成分はポンプによりカラム及び加熱コ
イルを直列的に通して連続的に循環せしめ、そして酵素
を不活性化することなく繰り返し変性せしめることがで
きる。 増幅された生成物は、放射性プローブを用いることな
くサザンブロットによってそれを分析することにより、
検出することができる。この様な方法においては、例え
ば、非常に低レベルのHTLV I及び／又はIIを含有する末
梢血リンパ球からのDNAの小サンプルを増幅し、そして
サザンブロット法により分析する。高レベルの増幅され
たシグナルにより非放射性プローブの使用が容易にな
る。 検出のための他の方法は、増幅された核酸配列とハイ
ブリダイズすることができるラベルされたプローブを用
い、そして該プローブがハイブリダイズしたか否かを決
定することを含む。この様なプローブはHTLV I及び／又
はHTLV IIウイルスのゲノムからの実質的に保存された
核酸配列を必然的に含有し、そしてプライマー及び増幅
される配列について前記したようにして選択される。好
ましくはHTLV I及び／又はHTLV IIのＸ領域から選択さ
れる。 １つのこの様なプローブ法は米国特許No.4,683,194
（前掲）に記載されている様なオリゴマー制限酵素技法
を含む、この方法においては、増幅された核酸を変性せ
しめ、そして標的配列（プライマーにより含有される特
定の保存された領域を含む）に特異的にハイブリダイズ
し且つ注目の少なくとも１つの制限部位を含むラベルさ
れたオリゴヌクレオチドに溶液中でハイブリダイズせし
める。標的及びプローブ間に形成されたデュプレックス
が制限部位を再構成し、そして制限酵素、例えばBgl
I、PvuII、又はHinf Iで開裂された場合、ゲル電気泳動
により全長プローブから容易に分離され得るラベルされ
た制限断片を放出する。次に、得られたゲルをオートラ
ジオグラフィーにかける。この方法による増幅された生
成物の分析は迅速である。すなわち数時間で結果が得ら
れる。好ましくは、プローブは30〜45塩基の長さを有
し、そしてラベルされている。また、制限酵素としてBg
l I、PvuII、又はHinf Iが好ましい。 増幅された生成物を分析するために使用することがで
きる他の方法はドットブロット法である。この方法にお
いては、増幅されたサンプルを膜に直接スポットし、そ
してラベル化プローブとハイブリダイズせしめる。この
ラベルは、分光法、光化学法、又は生化学的、免疫化学
的もしくは化学的手段により検出することができる。こ
の例には酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ、放射
性ラベル、例えば32P、蛍光ラベル、又はビオチンが含
まれる。１つの態様においては、このプローブはビオチ
ン化プローブであって、ビオチンが次の式： （式中、ＹはO,NH又はＮ−CHOであり、Ｘは１〜４の
数であり、そしてｙは２〜４の数である）で表わされる
スペーサーアームにより連結されている。このスペーサ
ーアームは、次の式： で表わされるプソラレン成分に連結される。プソラレン
成分は、Courage−Tebbe等、Biochim.Biophys.Acta,697
（1982）１−５により記載されているように、“ギャッ
プを有するサークル”プローブに入り込みそして架橋
し、ここでギャップを有するサークルの単鎖ハイブリダ
イゼーション領域はプライマー間に含まれる領域を含
む。このビオチン化及びドットブロット法の詳細は、米
国特許No.4,582,789及びNo.4,617,261にさらに詳細に記
載されている。ビオチン化プローブは放射性同位元素の
使用の必要性を排除する。 別の方法として、プローブをまず膜に、必要であれば
プレハイブリダイゼーション条件下でスポットし、そし
て次にこの前処理された膜に増幅された生成物を、
“逆”ドットブロット方式で、ハイブリダイゼーション
条件下で加える。 このドットブロット法は前記のオリゴマー制限酵素法
に比べて時間を要する。膜をまずプレハイブリダイズせ
しめ、そして次にプローブとハイブリダイズさせなけれ
ばならないからである。しかしながら、急速に変異する
ウイルスについては限定された塩基のミスマッチを含有
する配列が適切なハイブリダイゼーション条件下でなお
検出されるという利点をドットブロット法は有し、これ
に対してオリゴマー制限酵素法においては、制限部位の
破壊をもたらす変異を有するウイルスはウイルスの可変
性の故に検出されないであろう。 この発明はまた、使用される各プライマー及びプロー
ブの容器を有する包装された多容器ユニットを有するキ
ットに関する。このキットはまた、プライマー延長生成
物を合成するための重合用試薬例えば酵素の容器、４種
類のヌクレオシドトリホスフェートのそれぞれのための
容器、及びラベルを検出する手段（ラベルがビオチンの
場合には、例えばアビジン−酵素複合体）の容器を含有
することができる。さらに、キットはまた、HTLV I及び
／又はHTLV IIウイルスゲノムの配列を有する１又は複
数の核酸を含有する陽性対照の容器、及び／又はこの様
な核酸を含まない陰性対照の容器を有することができ
る。さらに、キットは、標的配列を含有する核酸をプロ
ーブの配列中に含まれる部位において開裂することがで
きる各制限酵素の容器を有することができる。 次に、例によりこの発明の種々の態様を例示するが、
この発明の範囲がこれらに限定されるものではない。こ
の例において、特にことわらない限り、すべての部及び
％は固体については重量により、そして液体については
容量による。温度は℃で示す。 例1. 増幅されるべき目的配列は、Regional Oncology Cent
er,SUNY Upstate Medical Center,シラカス、ニューヨ
ーク13210のBernard Poiesz博士から入手した11個の印
を付されたDNAサンプル、194BK,342,367,361,368H,207,
307,308B,323,326及び340中に含まれていた。プライマ
ー及びプローブは、Shimotohno等、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 81:6657−6661（1984）により同定されたHTLV I
ウイルス及びわずかなミスマッチを伴うHTLV IIウイル
スのＸ領域を用いて選択した。 まず、標識を付されたサンプルはPoeisz博士によりイ
ンターロイキンの存在下で培養された。次に、下記の方
法によりサンプルからDNAを抽出した。 1.1〜２×108個の培養細胞を試薬管中で、20mlのドデシ
ル硫酸ナトリウム細胞溶解緩衝液（１％ SDS,150mM Nac
l,25mM NaZ EDTA）により溶解した。 2.試験管当り5mg/μｌのプロテイナーゼＫ溶液400μｌ
を加え、そして37℃にて一夜インキュベートした。 3.DNAをフェノール、及びCHCl3：イソアミルアルコール
により逐次抽出し、次にエタノールで沈澱せしめた。 4.DNAをガラス棒に巻き取り、そして１×TE緩衝液（10m
M Tris,1mM NaZ EDTA,pH7.5）中に再懸濁し、そして１
×TE緩衝液に対して十分に透析した。 I.プライマーの合成 それぞれSK43及びSK44と称する２種類のオリゴデオキ
シリボヌクレオチドプライマー： ５′−CGGATACCCAGTCTACGTGT−３′ （SK43） ５′−GAGCCGATAACGCGTCCATCG−３′（SK44） を前記の方法により合成した。 A.自動合成法 Beaucage及びCaruthers〔Tetrahedron Letters（198
1）22:1859−1862〕に従って合成されたジエチルホスホ
ラミダイムを次々に、ビオサーチSAM−１を用いて、ヌ
クレオチドで誘導体化された調節された孔のガラス支持
体に縮合せしめた。この方法は、ジクロロメタン中トリ
クロロ酢酸による脱トリチル化、活性化陽子供与体とし
てベンゾトリアゾールを用いる縮合、並びにテトラヒド
ロフラン及びピリジン中無水酢酸及びジメチルアミノピ
リジンを用いるキャッピングを含む。サイクル時間は約
30分であった。各段階の収量は実質的に定量的であり、
そしてトリチル化の間に放出されるジメトキシトリチル
アルコールの収集及び分光測定により決定された。 B.オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱保護及び精製方
法 固体支持体をカラムから取り出し、そして1mlの濃水
酸化アンモニウムに室温にて４時間密閉チューブ中で暴
露した。次に支持体を濾過により除去し、そして部分的
に保護されたオリゴデオキシヌクレオチドを含有する溶
液を５時間55℃にした。アンモニアを除去し、そして残
渣を分取用ポリアクリルアミドゲルに適用した。30V/cm
にて90分間電気泳動を行い、その後で生成物を含有する
バンドを蛍光プレートのUVシャドイングにより同定し
た。バンドを切り出し、そして1mlの蒸留水で４℃にて
一夜溶出した。この溶液をAltech RP18カラムに適用
し、そして１％酢酸アンモニウム（pH6.0）緩衝液中ア
セトニトリルの７〜13％のグラジエントにより溶出し
た。溶出液を260nmでのUV吸収によりモニターし、そし
て該当する画分を集め、一定容量中でのUV吸収により定
量し、そして真空遠心機中室温にて乾燥した。 C.オリゴデオキシリボヌクレオチドの特徴付け 精製されたオリゴヌクレオチドの試験アリコートをポ
リヌクレオチドキナーゼ及びγ−32P−ATPを用いて32P
でラベルした。ラベルされた化合物を、50V/cmにて45分
間の電気泳動の後14〜20％ポリアクリルアミドゲルのオ
ートラジオグラフィーにより試験した。この方法により
分子量が確認される。ヘビ毒ジエステラーゼ及び細菌ア
ルカリ性ホスファターゼの使用によるオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドのヌクレオシドへの消化、並びにこれに
続く、逆相HPLCカラム及び10％アセトニトリル、１％酢
酸アンモニウム移動相を用いる前記ヌクレオシドの分離
及び容量により塩基組成を決定した。 II.増幅反応 Poiesz博士からの11個の標識を付されたDNAサンプル
のそれぞれからのDNA1μｇを、10mM Tris−HCl（pH7.
5）、50mM塩化ナトリウム及び10mM塩化マグネシウムか
ら成る緩衝液であって100pmoleのプライマーSK43、100p
moleのプライマーSK44並びに150nmずつのdATP,dCTP,dGT
P及びTTPを含有するもの100μｌに加えた。 得られた溶液を10分間100℃に加熱し、そして２分間
室温に冷却し、次にE.コリDNAポリメラーゼのKlenow断
片１ユニットを含有する２μｌを加えた。反応を室温に
て２分間進行せしめ、次に95℃にて２分間加熱すること
により酵素を不活性化した。段階当り２分間ずつの変
性、プライマーのアニーリング、及びKlenowにより延
長、並びにポリメラーゼの添加を19回反復した。 III.オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの合成及
びリン酸化 次の配列： ５′−*ACGCCCTACTGGCCACCTGTCCAGAGCATCAGATCACCTG−
３′(*はラベルを表わす）を有するラベル化DNAプロー
ブSK45を、I.において記載した方法に従って合成した。
10pmoleのプローブを４ユニットのT4ポリヌクレオチド
キナーゼ及び10pmoleのγ−32P−ATP（約7200Ci/mmol
e）と、70mM Tris（pH7.6）、10mM MgCl2、1.5mMスペル
ミン及び2.5mMジチオスレイトールを含有する40μｌの
反応容量中で37℃にて90分間接触せしめることによりラ
ベルした。次に、全容量を25mM EDTAにより100μｌに調
整し、そしてアリコートを採り、ATC沈澱により比活性
を決定した。ラベルされたプローブをSpeed−vacを用い
て濃縮し、そしてTris−硼酸−EDTA（TBE）緩衝液（89m
M Tris,89mM硼酸、2.5mM EDTA,pH8.3）中18％ポリアク
リルアミドゲル（アクリルアミド:BIS＝19.1）上での電
気泳動により500vhrで精製した。オートラジオグラフィ
ーにより位置を決定した後、ラベル化プローブを含有す
るゲルの部分を切り出し、砕破し、そして0.2mlのTE緩
衝液に４℃にて一夜溶出した。反応生成物のTCA沈澱
は、比活性が2Ci/mmoleでありそして最終濃度が20pmole
/mlであることを示した。 IV.増幅されたゲノムDNAのプローブとのハイブリダイゼ
ーション及びBgl Iによる消化 A.溶液中での検出 10μｌの増幅されたDNA（71ngのゲノムDNAの増幅同等
物を含有する）を1.5mlのマイクロフュージチューブに
分配し、そして10μｌのTE緩衝液により30μｌの最終容
量とした。サンプルを95℃にて10分間変性した。0.02pm
oleのSK45プローブを含有する0.6M Nacl 10μｌをチュ
ーブに加え、ゆっくり混合し、そして鉱油を重層し、そ
してすぐに56℃のヒートブロックに移して１時間置い
た。10μｌの50mM MgCl2及び１μｌのBgl I（８ユニッ
ト）を加え、そして再アニールしたDNAを56℃にて30分
間消化した。４μｌの75mM EDTA及び６μｌの追跡色素
を加えて最終容量60μｌとした。鉱油を0.2mlのクロロ
ホルムで抽出し、そして13μｌの反応混合物（〜15ngの
ゲノムDNA）をHoeffer SE 200装置中の30％ポリアクリ
ルアミドミニ−ゲル（19:1）上に負荷した。ゲルを約30
0Vにて１時間、ブロムフェノールブルー色素が原点から
3.0cm泳動するまで電気泳動した。ゲルの先端1.5cmを除
去し、そして残りのゲルを少なくとも一夜、２個の強化
スクリーンを用いて−70℃にて暴露した。 B.ドットブロットによる検出 増幅されたDNAをNaOHとNaZ EDTAとの緩衝液に加え
て、最終濃度を400mM NaOH及び25mM NaZ EDTAとし、そ
して最終容量を200μｌとした。 イオン性の膜を水中で湿し、そしてBio−Radイムノブ
ロット真空装置に入れた。次に真空を引き、装置を平衡
にし、そして前記のDNAサンプルを膜に負荷した。膜を2
0×SSPEで洗浄した。SSPEはNaCl、リン酸ナトリウム、E
DTA及びNaOHから成る標準緩衝液である。次に、膜を取
り出し、そして20×SSPEに入れて２〜５分間攪拌した。
次に、膜を乾燥し、UV光に６分間暴露してDNAを膜に架
橋せしめた。 次に、膜を5mlのフレハイブリダイゼーション溶液
〔３×SSPE、５×デンハート溶液、0.5％ドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）、30％ホルムアミド、ガラス蒸留水
により10mlにする〕に入れ42℃にて30分間攪拌した。次
に、プレハイブリダイゼーション溶液を絞り取り、そし
て5mlのハイブリダイゼーション溶液（プレハイブリダ
イゼーション溶液に0.5pmoleのSK45を添加したもの）を
加えた。42℃にて１時間、攪拌しながらインキュベーシ
ョンを行った。 ハイブリダイゼーションの後、２×SSPE、0.1％SDS中
で15分間ずつ２回、室温にて攪拌しながら洗浄した。次
に、これを0.2×SSPE、0.1％SDSにより50℃にて５分
間、攪拌しながら洗浄した。膜を乾燥し、そしてフィル
ムに暴露した。 V.結果の検討 溶液中及び膜上での両方の検出のオートラジオグラフ
は、サンプル342（HTLV I）、367（HTLV I）、361（HTL
V I）、307（HTLV I）、308B（HTLV I）、323（HTLV I
I）及び326（HTLV I）中にのみHTLV I及びII DNA配列が
存在することを示した。これらのサンプルのすべてがHT
LV I又はHTLV II陽性DNAであることが後で見出された。
他の４個のサンプルは、194BK＝白血病患者（ウイルス
単離されない）からのDNA、207＝攻撃的白血病患者（皮
膚包含）からのDNA、340＝攻撃的白血病患者（207とは
異る）からのもの、及び368H＝HTLV IIIであった。 従って、使用したプライマーはDNAを増幅することが
可能であり、プローブが配列を実際に検出することを可
能にした。 37℃にて10％DMSOの存在下での増幅（二次構造の形成
を最小にする）もまたHTLV I及びIIサンプルを陽性サン
プルとして示した。 例2.HTLV I pol領域3365−3483を増幅するHTLV I−特異的プライ
マーを用いて、例１の増幅／ハイブリダイゼーション／
消化実験を行た。これらのプライマーは次の２種類であ
った。 ５′−CTTCACAGTCTCTACTGTGC−３′（SK54） ５′−CGGCAGTTCTGTGACAGGG−３′（SK55） 下記のプローブSK56を制限酵素Pvu IIと共に使用し
た。 ５′−CCGCAGCTGCACTAATGATTGAACTTGAGAAGGAT−３′（S
K56） オートラジオグラフは、HTLV I DNA配列が、後でHTLV
I陽性DNAとして同定されたサンプル中にのみ存在する
ことを示した。HTLV II pol領域4198−4300を増幅するHTLV II−特異的プライ
マーを用いて、例１の増幅／ハイブリダイゼーション／
消化実験を行った。次のプローブを使用した。 ５′−ATCTACCTCCACCATGTCCG−３′（SK58） ５′−TCAGGGGAACAAGGGGAGCT−３′（SK59） 下記のプローブSK60を制限酵素Hinf Iと共に使用し
た。 ５−TAAGGGAGTCTGTGTATTCATTGAAGGTGGAAATTGGGTC−３′
（SK60） オートラジオグラフは、HTLV II DNA配列が後でHTLV
II陽性DNAとして同定されたサンプル323中にのみ存在す
ることを示した。
びII（HTLV I及びHTLV II）の保存された核酸配列の存
在又は不存在の検出のための方法に関する。この発明は
また、このような検出のための、プライマー及びラベル
されたハイブリダイゼーションプローブを有するキット
に関する。 〔従来の技術〕 ヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV）として知られてい
るＴ細胞熱帯レトロウイルスの一群は幾つかのＴ細胞性
異性腫瘍の発病に関与することが知られている。最近３
種類のタイプのHTLVが知られている。第一のタイプＩ
（HTLV I）は、日本、カリブ地方及びアフリカにおいて
見出されたヒト成人Ｔ−細胞白血病−リンパ腫（ATLL）
に関連する発癌ウイルスである。第二のタイプII（HTLV
II）は、ハーリー（hairy）細胞白血病のＴ−細胞変異
体を有する２人の患者から単離された発癌ウイルスであ
る。M.Popovic等、Science，224:497−500（1984）、及
びRosenblatt,J.D.等、New Eng.J.of Med.,1986年８月
を参照のこと。第３のタイプIII（HTLV III）はレンチ
ウイルスであり、そしてしばしば致命的な日和見感染を
もたらす細胞性免疫系の伝染性疾患である後天性免疫不
全症候群（AIDS）の病因体である。 AIDSのごときHTLV−関連ウイルスに対する抗体を含む
血清を同定するための最近の免疫診断試験（Gallo等の
米国特許No.4,520,113を参照のこと）が潜在的に感染性
の血液を除去するために血夜銀行において使用されてい
る。HTLV群のレトロウイルスを検出するためのモノクロ
ーナル抗体を製造するために有用なレトロウイルスポリ
ペプチドについては1986年３月27日に公開されたWO 86/
01834（カリホルニア大学）をも参照のこと。これらの
ウイルスは有意な量のウイルス粒子を生産することなく
DNAコピーとして存在することができるため、HTLV I及
びII−関連ウイルスを検出するための直接的な免疫的ア
プローチは、持続的に感染している無症状の個体の多く
においては好結果をもたらさない。感染された組織及び
血液中のウイルス粒子の数は少ないため（ウイルス休止
のため）、感染細胞を受容Ｔ細胞系と共に同時培養しな
い限り、ウイルス粒子又はRNA/DNAを直接検出すること
は不可能ではないにしても困難である。 1987年７月28日発行のK.Mullisの米国特許No.4,683,2
02は、ラベル化RNA又はDNAハイブリダイゼーションプロ
ーブを用いることによる、核酸配列の検出を容易にする
ためにそれを増幅する方法を記載している。この方法に
おいては、プライマーを用いてプライマー延長生成物を
得、この生成物を鋳型として用いてヌクレオチドの存在
下で追加の相補鎖を合成する。上記の特許出願はまた次
の様な技法を記載している。すなわち、この方法におい
ては、プローブが目的の配列にハイブリダイズした後制
限酵素の添加によりハイブリドが目的の配列内の部位に
おいて開裂され、そして次に制限消化物がラベル化断片
について分析される。1987年７月28日発行の米国特許N
o.4,683,194、及びH.Erlich等及びSaiki等、Biotechnol
ogy，３:1008−1012（1985）は後者の技法を非常に詳細
に記載している。両特許出願は鎌形赤血球貧血及びβ−
サラセミアのごとき遺伝的疾患の検出のためのこの方法
の使用を例示している。これらの方法、及び核酸配列を
増殖するための方法はまた、Saiki等、Science,230,135
0−1354（1985）にも記載されている。 Landry等、Clin.Lab.Med.（1985）５,513−529による
総説論文は、ウイルスの検出に使用される酸ハイブリダ
イゼーションの分野を記載している。1986年３月13日に
公開されたWO 86/01535、及び1986年３月５日に公開さ
れたEP 173,529はHTLV IIIの分子クローニング、及びAI
DSを検出するためのプローブとしての該クローンの使用
を記載している。1986年３月５日に公開されたヨーロッ
パ特許出願No.173,339は、外来微生物による感染を検出
するためにDNAプローブを用いる遺伝子分析を開示して
いる。1986年６月25日に公開されたEP 185,444は、細胞
溶解物中のHTLV IIIウイルスの検出のためのプローブと
して使用するための組換ペプチドを開示している。Onco
r社は1986年９月に、AIDSウイルスを検出するための放
射性血液試験を開発した旨発表した。 〔発明が解決しようとする問題点〕 発癌ウイルスHTLV I及びIIを検出するためのハイブリ
ダイゼーションプローブの使用は、持続的に感染してい
るがしかしウイルスを生産しない個体又は抗体陰性であ
るが培養陽性である固体の同定、並びに感染された細胞
の検出を、ウイルスの培養を必要としないで可能にする
であろう。増幅によるウイルスのウイルス核核酸コピー
数の増加は感染された個体におけるウイルス核酸の同定
を促進するであろう。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、HTLV I核酸もしくはHTLV II核酸、又はHTL
V I核酸及びHTLV II核酸の両者の単離物の間で実質的に
保存されており、そしてHTLV IもしくはHTLV II、又はH
TLV I及びHTLV IIの両者の単離体中の核酸に特異的な核
酸配列の、サンプル中での存在又は不存在を検出又は監
視するための方法であって、 （ａ）前記サンプルを、一緒に又は別々に、前記核酸配
列の核鎖のためのオリゴヌクレオチドプライマー、４種
類の異るヌクレオシドトリホスフェート及び重合用試薬
によりハイブリダイゼーション条件下で処理し、該核酸
配列の各鎖について、検出又は監視されるべき核酸配列
の各鎖に対して実質的に相補的である各プライマーのの
延長生成物が合成され、一方のプライマーから合成され
た延長生成物がその相補体から分離された場合に他方の
プライマーの延長生成物のための鋳型として機能するよ
うにし； （ｂ）前記サンプルを変性条件下で処理して、検出され
るべき配列が存在する場合にはプライマー延長生成物を
それらの鋳型から分離せしめ； （ｃ）段階（ｂ）の生成物をオリゴヌクレオチドプライ
マーを処理することにより、段段（ｂ）において生成し
た単鎖のそれぞれを鋳型として用いてプライマー延長生
成物を合成して、検出されるべき配列が存在すればそれ
を増幅し；そして （ｄ）検出されるべき配列が存在するとすればそれを検
出する； ことを含んで成る方法に関する。 生成物を検出するための１つの方法は、段階（ｃ）の
生成物に、増幅された核酸配列とハイブリダイズするこ
とができるラベルされたプローブを添加し；そして該プ
ローブが核酸サンプル中の増幅された配列にハイブリダ
イズしたか否かを決定することによる。１つの態様にお
いて、この決定は、 （１）前記プローブ中の配列内の部位を認識する制限酵
素により前記ハイブリダイズした混合物を消化し；そし
て （２）この制限消化物がHTLV I又はHTLV II配列の存在
と関連する制限断片を含有するか否かを決定すること； により行うことができる。 段階（ａ）の前に、患者のサンプル中の核酸を抽出
し、抽出された核酸の混合物をサンプルとして実階に処
理することができる。さらに、段階（ａ）において処理
するサンプル中のウイルスをあらかじめ培養する必要は
ない。 他の態様において、この発明は、HTLV I核酸もしくは
HTLV II核酸、又はHTLV I核酸及びHTLV II核酸の両者の
単離体の間で実質的に保存されており、HTLV Iもしくは
HTLV II、又はHTLV I及びHTLV IIの両者の単離体中の核
酸に特異的な核酸配列のサンプル中での存在又は不存在
を検出又は監視するためのキットであって、 （ａ）検出されるべき核酸配列の各鎖のためのオリゴヌ
クレオチドプライマー（この１又は複数のプライマーは
各特定の核酸配列の各鎖に対して実質的に相補的であっ
て、一方のプライマーから合成された延長生成物がその
相補体から分離された場合、他方のプライマーの延長生
成物の合成のための鋳型として機能することができ
る）；及び （ｂ）前記核酸配列とハイブリダイズすることができる
ラベル化プローブ； を含んで成るキットに関する。 好ましくは、このキットはさらに、重合用試薬４種類
の異るヌクレオチド、及びプローブと配列とのハイブリ
ドを検出するための手段を含む。 この発明の試験キットは研究試験、臨床試験、及び他
の診断的用途に用いることができる。さらに、このキッ
トはウイルスを培養することなく、感染された細胞をモ
ニターするために使用することができ、これは感染を解
消するために種々の療法剤により治療された患者をモニ
ターするのに有用な特徴である。 ここの発明は、HTLV I及びHTLV IIウイルスのいずれ
か又は両者に関連する核酸配列を含有することが疑がわ
れるサンプル中の該核酸配列を検出し又はモーターする
ための方法及びキットに関する。HTLV I及びHTLV IIウ
イルスの単離体は配列決定されている。増幅されるべき
配列はHTLV I及び／又はIIウイルスに特異的でなければ
ならない。すなわち、HTLV IIIウイルス又は非−HTLV I
もしくは非−HTLV IIウイルスと反応してはならない。 〔具体的な説明〕 HTLV Iウイルスの全ゲノムはSeiki等、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 80:3618−3622（1983）により与えられてい
る。HTLV IIウイルスの全ゲノムはShimotohno等、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,82:3101−3105（1985）により与え
られている。 検出されるべき配列について適用される。“実質的に
保存されている”という語は、配列が、検出されるべき
ウイルス中の核酸に対して、重合用試薬及び４種類のヌ
クレオシドトリホスフェートの存在下で重合を開始する
のに十分に相補的でなければならないことを意味する。 用いられるプライマーは、HTLV I及び／又はIIウイル
ス中の有意な数の核酸上での重合の特異的な開始を提供
するための任意の長さ及び配列のオリゴヌクレオチドで
ある。具体的には、この明細書において使用する“プラ
イマー”なる語は、２個以上の、さらに好ましくは３個
より多くの、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレ
オチドから成る分子であって、核酸鎖に対して実質的に
相補的であるプライマー延長生成物の合成が誘導される
条件下に置かれた場合に、すなわちヌクレオシドトリホ
スフェート及び重合用試薬、例えばDNAポリメラーゼ、
の存在下、適当な温度及びpHにおいて、合成の開始点と
して機能することができるものである。プライマーは好
ましくは、増幅の最大効率のために単鎖であるが、しか
し二本鎖であってもよい。二本鎖であれば、プライマー
をまず処理してその鎖に分離し、次にこれを用いて延長
生成物を調製する。好ましくは、プライマーはオリゴデ
オキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合用
誘導剤の存在下で延長生成物の合成を開始するために十
分な長さを有しなければならない。プライマーの正確な
長さは、温度、緩衝液、ヌクレオチド組成及びプライマ
ーの由来等、多くの因子に依存するであろう。この発明
の目的のため、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的
には15〜25又はこれより多くのヌクレオチドを含有す
る。但しさらに少数のヌクレオチドを含有することもで
きる。 この発明においてプライマーは、増幅されるべき特定
の配列の各鎖に対して“実質的に”相補的である様に選
択される。このことは、重合用試薬が機能する条件下で
プライマーがそれらの対応する鎖とハイブリダイズする
ために十分に相補的でなければならないこと、すなわ
ち、プライマーが増幅されるべき鎖の配列との十分な相
補性を有することによりそれとハイブリダイズし、これ
によって他の鋳の延長生成物の合成のための鋳型を構成
することを意味する。プライマーは鎖との間に若干のミ
スマッチを含有することができる。 HTLV I及びHTLV IIウイルスの間で実質的に保存され
ている領域中から増幅されるべき配列を選択することが
できる。従って、任意の適当な手段でプライマー及びプ
ローブを同定しそして選択することができる。これは、
HTLV I及びHTLV IIウイルスゲノムの公表されている核
酸配列の領域を比較することにより手仕事で行うことが
できる。HTLV I及びHTLV IIウイルスのＸ領域間の相同
性がShimotohno等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6657
−6601（1984）により公表されている。他の方法はコン
ピュータープログラムを用いて配列を比較することであ
る。この目的のため、National Biomedical Research F
oundationにより提供される、ドットマトリクスを用い
る基本コンピューターアルゴリズムの市販プログラムを
用いるのが便利である。このプログラムは、HTLV I及び
HTLV IIウイルスの核酸配列をインプットし、そして塩
基対相同性についてウインドウサイズを決定することを
含む。このプログラムはグラフィックを用いて異る軸上
の配列を比較し、そして少なくとも実質的な相同性が存
在する場合にドットが現われる。好ましくは、ウインド
ウサイズは６塩基より大である。 ゲノムのＸ領域は、２種類のウイルス中のコード領域
間で最も保存されている。これがコード領域間で最も保
存されているので、配列を検出するための、これがプロ
ーブ及びプライマーを選択するための好ましい領域であ
る。蛋白質をコードしていないウイルスゲノムの領域を
用いて、使用するべきプライマーの配列を決定すること
もできる。この発明の目的のため、感度及び特異性を最
大にするために、検出されるべき配列は、関連ウイルス
間で、特にプローブ及び制限酵素が使用される場合には
制限酵素開裂部位において実質的に保存されている、特
異的プライミングを可能にするのに十分な長さを有する
配列と相同なものである。 増幅しそしてその後で生成物を検出するために使用さ
れる技法は米国特許No.4,683,201及びNo.4,683,194（前
記）;Saiki等、Biotechnology（前掲）；及びSaiki等Sc
ience（前掲）に詳細に記載されている。一般に、増幅
工程は特定の核酸配列を調製するための酵素的連鎖反応
を含み、用いられた反応段階の数に対して指数的量で核
酸配列が調製される。但し、要求される配列の末端が十
分に詳細に知られており、それとハイブリダイズするオ
リゴヌクレオチドプライマーを合成することができるこ
と、及び連鎖反応を開始するために少量の配列が入手可
能であることが条件となる。一方のプライマーは負
（−）鎖に対して相補であり、そして他方は正（＋）鎖
に対して相補的である。変性された核酸へのプライマー
のアニーリング、並びにこれに続く、DNAポリメラーゼ
Ｉの大断片（Klenow）のごとき酵素及びヌクレオチドを
用いる延長が標的配列を含有する新しく合成された＋及
び−鎖をもたらす。これらの新しく合成された配列はさ
らにプライマーのための鋳型となるから、変性、プライ
マーアニーリング及び延長の反復サイクルが、プライマ
ーにより規定される領域の指数的蓄積をもたらす。連鎖
反応の生成物は、使用された特定のプライマーの末端に
対応する末端を有する別個の核酸デュプレックスであ
る。 次に増幅工程を模式的に示すが、ここでは相補的な鎖
〔S+〕及び〔S-〕を含んで成る所望の配列〔Ｓ〕を含有
する２本鎖DNAが核酸として使用される。第１の及びこ
れに続く各反応サイクルの間、もとの鋳型上での各オリ
ゴヌクレオチドプライマーの延長が、プライマーの１つ
のみにより停止する無限長の新しいssDNA分子生成物を
生成する。今後“長生成物”と称するこれらの生成物は
直線的に蓄積するであろう。すなわち、ある数のサイク
ルの後に存在する量がサイクル数に比例するであろう。 こうして生成された長生成物は、その後のサイクルの
間一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型
として機能し、そして所望の配列〔S+〕又は〔S-〕の分
子を生成するであろう。これらの分子もまた、一方又は
他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型として機能
してさらに〔S+〕及び〔S-〕を生成し、そしてそれ故
に、サイクル数に対して指数的速度での〔Ｓ〕の蓄積を
もたらすであろう鎖反応が継続され得る。 意図されるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ン以外のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに
より生成される副産物は自己触媒的ではなく、そしてそ
れ故に直線的速度で蓄積する。 増幅されるべき特異的配列〔Ｓ〕を次の様に模式的に
表すことができる。 〔S+〕 ５′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3′ 〔S-〕 ３′TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′ 対応するオリゴヌクレオチドプライマーは次の通りであ
ろう。 プライマー1:3′GGGGGGGGGG 5′ プライマー2:5′AAAAAAAAAA 3′ 従って、〔Ｓ〕を含有するDNA:が単鎖に分離され、そしてその単鎖がプライマー１及び
２とハイブリダイズし、４種類のデオキシリボヌクレオ
シドトリホスフェートの存在下、DNAポリメラーゼの存
在下で次の延長反応が触媒され得る。 生成した２つのデュプレックスの変性の後、次の生成
物が生ずる。 次のサイクルにおいて、これら４つの鎖をプライマー
１及び２とハイブリダイズせしめれば、重合用試薬は次
の反応を触媒するであろう。 上記４種類のデュプレックスが分離されれば次の鎖が
生ずる。 １つのプライマーのオリゴヌクレオチド配列で停止す
る各鎖及び他方の相補鎖は生成することが所望される特
定の核酸鎖〔Ｓ〕であることがわかる。 この工程の段階は無限に反復することができ、プライ
マー１及び２、誘導剤及び存在するヌクレオチドによっ
てのみ限定される。もとのヌクレオチドは複製されない
ので、その量は全工程を通じて一定に維持される。長生
成物はもとの核酸からのみ生成されるのでその量は直線
的に増加する。特異的配列の量は指数的に増加する。す
なわち、特異的配列は支配的な種となる。これは次の表
に示される。この表は、各サイクルの効率を100％とし
て、ｎサイクル後に存在する種の相対量を示す。 鋳型として単鎖ヌクレオチドが使用される場合、サイ
クル当り１個のみの長生成物が生成する。 この明細書において使用する場合、“制限エンドヌク
レアーゼ”及び“制限酵素”なる語は、特定のヌクレオ
チド配列において又はその近傍において２本鎖DNAを切
断する細菌酵素に関する。 この発明のプライマーは次の規準により選択する。こ
れは考慮すべき要素であるが、これらのみではなく、又
は絶対的なものではない。第一に、プライマーはHTLV I
及びHTLV IIゲノムの保存された領域から選択される。
Ｘ領域がコード領域の内の最も保存されている領域であ
り、そしてそれ故に最初の研究のためにＸ領域を選択し
た。 第二に、プライマーは、試験を傷つけると予想される
ウイルスゲノムのあらゆる配列、例えばStarcich等、Sc
ience，227:538−540（1985）により公表されているHTL
V IIIの配列との相同性を欠くものである。 第三に、プライマーは好ましくは増幅される核酸中に
二次構造を形成しないものであり、この二次構造は増幅
酵素、例えばE.コリDNAポリメラーゼ、好ましくはKleno
w断片と称されるDNAポリメラーゼの部分による延長を妨
害するであろう。これは、約15重量％までの、好ましく
は５〜15重量％のジメチルスルホキシド（DMSO）を増幅
媒体中に用いることにより、そして／又は増幅温度を30
〜40℃に、好ましくは35〜40℃に上昇せしめることによ
り達成することができる。 第四に、プライマーは好ましくは、約50％のグアニン
及びシトシンを含有し、そしてプライマーの３′に多数
の連続するアデニン及びチミジン残基を含有しないもの
である。これは不安定なハイブリドをもたらす。最後
に、増幅された生成物が制限酵素を用いて検出される場
合、プローブは内部の（非−末端）制限部位を有さなけ
ればならない。 オリゴヌクレオチドは、例えば、前記のホスホトリエ
ステル法及びホスホジエステル法、又はこれらの自動化
された方法を用いて調製することができる。１つのこの
様な自動化された方法においては、Beaucage等、Tetrah
edron Letters（1981）、22:1859−1862により記載され
ているように、ジエチルホスホラミダイトが出発物質と
して使用され、そして合成される。修飾された固体支持
体上でオリゴヌクレオチドを合成するための１つの方法
は米国特許No.4,458,066に記載されている。生物源から
単離されたプライマー（例えば、制限エンドヌクレアー
ゼ消化物）を使用することもできる。 HTLV I及び／又はHTLV IIと関連する特定の核酸配列
を含有しているか、又は含有していることが疑われるも
のである限り、精製された形又は精製されていない形の
あらゆる核酸源を出発核酸として使用することができ
る。すなわち、この方法においては、DNA又はメッセン
ジャーRNAのごときRNAを使用することができ、このDNA
又はRNAは一本鎖でも二本鎖でもよい。RNAが鋳型として
使用される場合、そのRNAをDNAに逆転写するために最適
な酵素及び／又は条件が使用される。さらに、それぞれ
の鎖を１本ずつ含むDNA−RNAハイブリドを用いることも
できる。これらの核酸の任意の混合物、あるいは同一の
又は異るプライマーを使用する予備増幅反応から生成し
た核酸を使用することもできる。 増幅されるべき特定の核酸配列は大きな分子の一部分
であることができ、あるいは個別の分子として存在し、
特定の配列が核酸全体を構成していてもよい。増幅され
るべき配列が最初に純粋な形で存在する必要はなく、例
えば複雑な混合物の小部分、例えば全体ヒトDNA中に含
有されるウイルス−コード配列の一部分であってもよ
い。出発核酸は、同一の又は異る１個より多くの特定の
核酸配列を含有することができる。従って、この発明の
方法は、１つの特定の核酸配列を多量に調製するための
みならず、同一の又は異る核酸分子上に位置する１個よ
り多くの特定の核酸配列を同時に増幅するためにも有用
である。 核酸配列は、任意の入手源、例えば動物のごとき高等
生物からの天然DNA又はRNAから得ることができる。DNA
又はRNAは体サンプル、例えば血液、組織材料、例えば
絨毛、又は羊膜細胞から種々の技法により、例えばMani
atis等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual（ニ
ューヨーク：コール・ドスプリング・ハーバー・ラボラ
トリー、1982）280−281、により記載されている技法に
より抽出することができる。 サンプルが不純な、例えば血漿又は血液である場合、
増幅の前にそれを、サンプルの細胞、液体、組織、ウイ
ルスカプセル又は動物細胞膜を開き、そして核酸の鎖を
露出しそして／又は分離するために有効な一定量の試薬
により処理することができる。鎖を露出しそして分離す
るためのこの細胞溶解及び核酸変性段階は、さらに容易
に増幅が起こることを可能にするであろう。さらに、サ
ンプルを増幅試薬により処理する前に、サンプル中のHT
LV I及びHTLV IIウイルスを培養する必要がない。サン
プルを遠心分離してバフィーコートを得、次にこれをカ
ラムに通して白血球を得ることができる。次に、白血球
を処理してそれから核酸を抽出し、増幅用サンプルとし
て使用することができる。 この発明の方法により、任意の特定の核酸配列を調製
することができる。必要なことは、配列の両端の十分な
数の塩基が十分に詳細に知られており、所望の配列の異
る鎖と、その配列にそう一定の相対位置においてハイブ
リダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーであ
って、それがその鋳型（相補体）から分離された場合に
規定された長さの核酸への他のプライマーの延長のため
の鋳型として機能することができるもの、が調製され得
ることである。配列の両端における塩基についての知識
が多くなるに従って、標的核酸配列のためのプライマー
の特異性も大きくなることができ、そしてそれ故に工程
の効率が高くなる。今後使用する場合、プライマーなる
語は、特に、増幅されるべき断片の末端配列に関する情
報がいく分不明瞭な場合、複数のプライマーを意味する
ことができると理解すべきである。例えば、核酸配列が
蛋白質配列情報から得られる場合、遺伝子コードの縮重
に基くすべての可能性あるコドン変化を代表する配列を
含有するプライマーの集合が各鎖について用いられるで
あろう。この集合からの１つのプライマーが、増幅され
るべき目的の配列の末端と共に実質的に保存されるであ
ろう。 特定の核酸配列が、鋳型としてその配列を含有する核
酸を用いることにより調製される。サンプルの標的核酸
配列が２つの鎖を含有する場合、それを鋳型として使用
する前に、別個の段階として、又はプライマー延長生成
物の合成と同時に、核酸の鎖を分離する必要がある。こ
の鎖分離は、ある適当な変性条件、例えば物理的、化学
的又は酵素的手段を用いて達成することができ、この発
明において使用する。“変性”なる語はこの様な手段の
すべてを包含する。核酸の鎖を分離するための１つの物
理的方法は、核酸をそれが変性するまで加熱することで
ある。典型的な加熱変性は、約１〜10分間にわたる約80
〜105℃の温度を用いる。鎖の分離はまた、ヘリカーゼ
と称される酵素類、又はヘリカーゼ活性を有しそしてリ
ボATPの存在下でDNAを変性せしめることが知られている
酵素RecAからの１つの酵素により誘導することもでき
る。ヘリカーゼを用いて核酸の鎖を分離するために適当
な反応条件は、Kuhn Hoffmann−Berling,CSH-Quantitat
ive Biology，43:63（1978）により記載されており、そ
してRecAを使用するための技法はC.Radding,Ann.Rev.Ge
netics，16:405−37（1982）に総説されている。 増幅されるべき配列を含むもとの核酸配列が単鎖であ
る場合、その相補体が１又は２個のオリゴヌクレオチド
プライマーを用いることにより合成される。適切な１つ
のプライマーが添加される場合、そのプライマー、重合
用試薬及び下記の４種類のヌクレオシドトリホスフェー
トの存在下でプライマー延長生成物が合成される。この
生成物は単鎖核酸と部分的に相補的であり、そして核酸
鎖とハイブリダイズして異る長さのデュプレックスを形
成し、このデュプレックスが次に前記のようにして単鎖
に分離されて、鎖に相補的な２つの分離された単鎖を生
成するであろう。あるいは、２つの適切なプライマーを
単鎖核酸に加え、そして反応を行うことができる。 オリゴヌクレオチドが増幅されるべき配列を構成する
場合、生成するプライマー延長生成物はもとの核酸の鎖
と完全に又は実質的に完全に相補的であり、そしてそれ
とハイブリダイズして同じ長さの鎖のデュプレックスを
形成し、これが単鎖分子に分離されるであろう。 核酸がもともと二本鎖であろうと単鎖であろうと、核
酸の相補的な２つの鎖が分離された場合、それらの鎖は
追加の核酸鎖の合成のための鋳型として使用され得る状
態となる。この合成は、鋳型へのプライマーのハイブリ
ダイゼーションが起ることを許容する条件下で行われ
る。一般にこれは、緩衝化水溶液中で、好ましくは７〜
９のpHにおいて、最も好ましくはおよそpH8において起
こる。好ましくは、一定モル過剰の（ゲノム核酸の場合
には通常、プライマー：鋳型が108:1）２種類のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを、分離された鋳型鎖を含有す
る緩衝液に加える。しかしながら、この発明の方法が診
断用に用いられる場合には相補的鎖の量は知られず、従
って相補鎖の量に対するプライマーの量は正確には決定
され得ないと理解される。しかしながら実際には、増幅
されるべき配列が複雑な長い核酸鎖の混合物中に含まれ
る場合、添加されるプライマーの量は相補鎖（鋳型）の
量に比べてモル過剰であろう。工程の効率を改良するた
めには大モル過剰が好ましい。 デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートdATP,dCT
P,dGTP及びTTPもまた、プライマーとは別個に又はこれ
と一緒に、適当な量で合成混合物中に添加され、そして
得られた溶液が約90〜100℃にて、約１〜10分間、好ま
しくは１〜４分間加熱される。この加熱期間の後、溶液
を室温に放冷する。この温度はプライマーハイブリダイ
ゼーションのために好ましい。この冷却された混合物
に、プライマー延長反応を行うための適当な試薬（この
明細書において重合用試薬と称する）を添加し、そして
当業界において知られている条件下で反応を行う。重合
用試薬は、もしそれが熱安定性であれば、他の試薬と一
緒に添加することもできる。この合成反応は室温から、
重合用試薬がそれ以上では機能しなくなる温度までにお
いて起こることができる。すなわち、例えば、DNAポリ
メラーゼが試薬として使用される場合、温度は一般に約
40℃より高くはない。最も便利には、反応は室温にて行
う。 重合用試薬はプライマー延長生成物の合成を達成する
ために機能する任意の化合物又は系であることができ、
これには酵素が包含される。この目的のために適当な酵
素には、例えばE.コリDNAポリメラーゼＩ、E.コリDNAポ
リメラーゼＩのKlenow断片、T4 DNAポリメラーゼ、他の
入手可能なDNAポリメラーゼ、ポリメラーゼミューテイ
ン、逆転写酵素、及び他の酵素、例えば熱安定性酵素
（すなわち、変性を生じさせるために十分に上昇した温
度に暴露した後にプライマー延長を行う酵素）が今ま
れ、これらは適切な態様でのヌクレオチドの結合を促進
し、各核酸鎖に相補的なプライマー延長生成物を生成せ
しめるであろう。一般に、合成は各プライマーの３′末
端から始まりそして鋳型鎖にそって合成が停止するまで
５′方向に進行し、異る長さの分子を生成する。しかし
ながら、上記の同じ方法を用いて、５′末端において合
成を開始しそして他の方向に進行せしめる重合用試薬も
存在し得る。 新たに合成された鎖及びその相補的核酸鎖は、標的配
列が存在すれば前記のハイブリダイゼーション条件下で
二本鎖分子を形成し、そしてこのハイブリドがこの方法
の次の段階において使用される。次の段階において、ハ
イブリダイゼーション条件下で処理されたサンプルを、
前記のいずれかの方法を用いて変性条件にかけ、標的配
列が存在するとすれば単鎖分子を得る。 新しい核酸が単鎖分子上に合成される。前記の条件下
に反応が進行することが必要であれば、追加の重合用試
薬、ヌクレオチド及びプライマーを添加することができ
る。やはり、合成は各オリゴヌクレオチドの一端から開
始されそして鋳型の単鎖にそって進行し、追加の核酸を
生成するであろう。この段階の後、反応生成物の半分は
２つのプライマーにより挾まれた特定の核酸配列から成
るであろう。 検出のために必要な程度に標的核酸配列を増幅するた
めに必要な回数だけ、変性及び延長生成物合成の段階を
反復する。さらに詳細に後記するように、生産された特
定の核酸配列の量が指数的に蓄積するであろう。 最初の核酸又は核酸の混合物から１種類より多くの特
定の核酸配列を調製することが望まれる場合には、適切
な数の異るオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。例
えば、２種類の異る特定の核酸配列が調製されるべき場
合、４種類のプライマーが使用される。２つのプライマ
ーは特定の核酸配列の１つに特異的であり、他の２つの
プライマーは第二の特定の核酸配列に特異的である。こ
のようにして、２種類の異る特定の配列を、この発明の
方法により指数的に調製することができる。 この発明は、各段階の後に新たな試薬を加えながら段
階的に、すべての試薬を最初の段階で加えて同時的に、
あるいは所定数の段階の後に新たな試薬を加えながら半
ば段階的且つ半ば同時的に行うことができる。熱感受性
酵素の場合のように、重合用試薬を不活性化するであろ
う変性方法、例えば熱を用いる場合、各鎖分離段階の後
に試薬を更新する必要がある。鎖分離段階に酵素的手段
を用いる場合、同時的方法を用いることができる。同時
的方法においては、反応混合物は、所望の配列を含有す
る核酸鎖に加えて、鎖分離酵素（例えば、ヘリカー
ゼ）、該鎖分離酵素のための適切なエネルギー源、例え
ばrATP、４種類のヌクレオシドトリホスフェート、モル
過剰のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、重合用試
薬、例えばE.コリDNAポリメラーゼＩのKlenow断片を含
有することができる。 同時的方法において変性のために加熱が使用される場
合、核酸が平衡状態の単鎖及び二本鎖から成る温度であ
る上昇した温度、例えば試薬に依存して50℃〜105℃に
おいて機能するであろう熱安定性試薬、例えば熱安定性
ポリメラーゼが用いられる。長さの短い核酸のためには
約40℃〜50℃の低い温度を用いることができる。上限温
度は、酵素が分解する温度、又はそれより高温ではプラ
イマーハイブリダイゼーションが十分なレベルで起らな
い温度に依存するであろう。この様な熱安定性酵素は例
えばA.S.Kaledin等、Biokhimiya，45,644−651（1980）
により記載されている。この定温反応が継続するために
は、プライマーはお互の６〜８塩基対以内にそれらの
３′末端を有する。この方法の各段階は、すべての試薬
が最初に存在するにもかかわらず逐次的に生ずる。必要
に応じて追加の材料を添加することができる。所望の量
の特定の核酸配列を生じさせるのに適切な時間が経過し
た後、既知の方法で酵素を不活性化することにより、又
は反応成分を分離することにより反応を停止させること
ができる。 温度サイクル反応を用いて増幅を行うこともでき、こ
の場合熱安定性酵素を用いて延長、アニーリング及び変
性を行うために温度を次第に上昇せしめる。 この発明の方法は連続的に行うことができる。自動化
された方法の具体例においては、変性領域、試薬添加領
域、及び反応領域を通して反応を循環することができ
る。他の態様においては、プライマー延長生成物の合成
のために使用される酵素をカラム中に固定化することが
できる。他の反応成分はポンプによりカラム及び加熱コ
イルを直列的に通して連続的に循環せしめ、そして酵素
を不活性化することなく繰り返し変性せしめることがで
きる。 増幅された生成物は、放射性プローブを用いることな
くサザンブロットによってそれを分析することにより、
検出することができる。この様な方法においては、例え
ば、非常に低レベルのHTLV I及び／又はIIを含有する末
梢血リンパ球からのDNAの小サンプルを増幅し、そして
サザンブロット法により分析する。高レベルの増幅され
たシグナルにより非放射性プローブの使用が容易にな
る。 検出のための他の方法は、増幅された核酸配列とハイ
ブリダイズすることができるラベルされたプローブを用
い、そして該プローブがハイブリダイズしたか否かを決
定することを含む。この様なプローブはHTLV I及び／又
はHTLV IIウイルスのゲノムからの実質的に保存された
核酸配列を必然的に含有し、そしてプライマー及び増幅
される配列について前記したようにして選択される。好
ましくはHTLV I及び／又はHTLV IIのＸ領域から選択さ
れる。 １つのこの様なプローブ法は米国特許No.4,683,194
（前掲）に記載されている様なオリゴマー制限酵素技法
を含む、この方法においては、増幅された核酸を変性せ
しめ、そして標的配列（プライマーにより含有される特
定の保存された領域を含む）に特異的にハイブリダイズ
し且つ注目の少なくとも１つの制限部位を含むラベルさ
れたオリゴヌクレオチドに溶液中でハイブリダイズせし
める。標的及びプローブ間に形成されたデュプレックス
が制限部位を再構成し、そして制限酵素、例えばBgl
I、PvuII、又はHinf Iで開裂された場合、ゲル電気泳動
により全長プローブから容易に分離され得るラベルされ
た制限断片を放出する。次に、得られたゲルをオートラ
ジオグラフィーにかける。この方法による増幅された生
成物の分析は迅速である。すなわち数時間で結果が得ら
れる。好ましくは、プローブは30〜45塩基の長さを有
し、そしてラベルされている。また、制限酵素としてBg
l I、PvuII、又はHinf Iが好ましい。 増幅された生成物を分析するために使用することがで
きる他の方法はドットブロット法である。この方法にお
いては、増幅されたサンプルを膜に直接スポットし、そ
してラベル化プローブとハイブリダイズせしめる。この
ラベルは、分光法、光化学法、又は生化学的、免疫化学
的もしくは化学的手段により検出することができる。こ
の例には酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ、放射
性ラベル、例えば32P、蛍光ラベル、又はビオチンが含
まれる。１つの態様においては、このプローブはビオチ
ン化プローブであって、ビオチンが次の式： （式中、ＹはO,NH又はＮ−CHOであり、Ｘは１〜４の
数であり、そしてｙは２〜４の数である）で表わされる
スペーサーアームにより連結されている。このスペーサ
ーアームは、次の式： で表わされるプソラレン成分に連結される。プソラレン
成分は、Courage−Tebbe等、Biochim.Biophys.Acta,697
（1982）１−５により記載されているように、“ギャッ
プを有するサークル”プローブに入り込みそして架橋
し、ここでギャップを有するサークルの単鎖ハイブリダ
イゼーション領域はプライマー間に含まれる領域を含
む。このビオチン化及びドットブロット法の詳細は、米
国特許No.4,582,789及びNo.4,617,261にさらに詳細に記
載されている。ビオチン化プローブは放射性同位元素の
使用の必要性を排除する。 別の方法として、プローブをまず膜に、必要であれば
プレハイブリダイゼーション条件下でスポットし、そし
て次にこの前処理された膜に増幅された生成物を、
“逆”ドットブロット方式で、ハイブリダイゼーション
条件下で加える。 このドットブロット法は前記のオリゴマー制限酵素法
に比べて時間を要する。膜をまずプレハイブリダイズせ
しめ、そして次にプローブとハイブリダイズさせなけれ
ばならないからである。しかしながら、急速に変異する
ウイルスについては限定された塩基のミスマッチを含有
する配列が適切なハイブリダイゼーション条件下でなお
検出されるという利点をドットブロット法は有し、これ
に対してオリゴマー制限酵素法においては、制限部位の
破壊をもたらす変異を有するウイルスはウイルスの可変
性の故に検出されないであろう。 この発明はまた、使用される各プライマー及びプロー
ブの容器を有する包装された多容器ユニットを有するキ
ットに関する。このキットはまた、プライマー延長生成
物を合成するための重合用試薬例えば酵素の容器、４種
類のヌクレオシドトリホスフェートのそれぞれのための
容器、及びラベルを検出する手段（ラベルがビオチンの
場合には、例えばアビジン−酵素複合体）の容器を含有
することができる。さらに、キットはまた、HTLV I及び
／又はHTLV IIウイルスゲノムの配列を有する１又は複
数の核酸を含有する陽性対照の容器、及び／又はこの様
な核酸を含まない陰性対照の容器を有することができ
る。さらに、キットは、標的配列を含有する核酸をプロ
ーブの配列中に含まれる部位において開裂することがで
きる各制限酵素の容器を有することができる。 次に、例によりこの発明の種々の態様を例示するが、
この発明の範囲がこれらに限定されるものではない。こ
の例において、特にことわらない限り、すべての部及び
％は固体については重量により、そして液体については
容量による。温度は℃で示す。 例1. 増幅されるべき目的配列は、Regional Oncology Cent
er,SUNY Upstate Medical Center,シラカス、ニューヨ
ーク13210のBernard Poiesz博士から入手した11個の印
を付されたDNAサンプル、194BK,342,367,361,368H,207,
307,308B,323,326及び340中に含まれていた。プライマ
ー及びプローブは、Shimotohno等、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 81:6657−6661（1984）により同定されたHTLV I
ウイルス及びわずかなミスマッチを伴うHTLV IIウイル
スのＸ領域を用いて選択した。 まず、標識を付されたサンプルはPoeisz博士によりイ
ンターロイキンの存在下で培養された。次に、下記の方
法によりサンプルからDNAを抽出した。 1.1〜２×108個の培養細胞を試薬管中で、20mlのドデシ
ル硫酸ナトリウム細胞溶解緩衝液（１％ SDS,150mM Nac
l,25mM NaZ EDTA）により溶解した。 2.試験管当り5mg/μｌのプロテイナーゼＫ溶液400μｌ
を加え、そして37℃にて一夜インキュベートした。 3.DNAをフェノール、及びCHCl3：イソアミルアルコール
により逐次抽出し、次にエタノールで沈澱せしめた。 4.DNAをガラス棒に巻き取り、そして１×TE緩衝液（10m
M Tris,1mM NaZ EDTA,pH7.5）中に再懸濁し、そして１
×TE緩衝液に対して十分に透析した。 I.プライマーの合成 それぞれSK43及びSK44と称する２種類のオリゴデオキ
シリボヌクレオチドプライマー： ５′−CGGATACCCAGTCTACGTGT−３′ （SK43） ５′−GAGCCGATAACGCGTCCATCG−３′（SK44） を前記の方法により合成した。 A.自動合成法 Beaucage及びCaruthers〔Tetrahedron Letters（198
1）22:1859−1862〕に従って合成されたジエチルホスホ
ラミダイムを次々に、ビオサーチSAM−１を用いて、ヌ
クレオチドで誘導体化された調節された孔のガラス支持
体に縮合せしめた。この方法は、ジクロロメタン中トリ
クロロ酢酸による脱トリチル化、活性化陽子供与体とし
てベンゾトリアゾールを用いる縮合、並びにテトラヒド
ロフラン及びピリジン中無水酢酸及びジメチルアミノピ
リジンを用いるキャッピングを含む。サイクル時間は約
30分であった。各段階の収量は実質的に定量的であり、
そしてトリチル化の間に放出されるジメトキシトリチル
アルコールの収集及び分光測定により決定された。 B.オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱保護及び精製方
法 固体支持体をカラムから取り出し、そして1mlの濃水
酸化アンモニウムに室温にて４時間密閉チューブ中で暴
露した。次に支持体を濾過により除去し、そして部分的
に保護されたオリゴデオキシヌクレオチドを含有する溶
液を５時間55℃にした。アンモニアを除去し、そして残
渣を分取用ポリアクリルアミドゲルに適用した。30V/cm
にて90分間電気泳動を行い、その後で生成物を含有する
バンドを蛍光プレートのUVシャドイングにより同定し
た。バンドを切り出し、そして1mlの蒸留水で４℃にて
一夜溶出した。この溶液をAltech RP18カラムに適用
し、そして１％酢酸アンモニウム（pH6.0）緩衝液中ア
セトニトリルの７〜13％のグラジエントにより溶出し
た。溶出液を260nmでのUV吸収によりモニターし、そし
て該当する画分を集め、一定容量中でのUV吸収により定
量し、そして真空遠心機中室温にて乾燥した。 C.オリゴデオキシリボヌクレオチドの特徴付け 精製されたオリゴヌクレオチドの試験アリコートをポ
リヌクレオチドキナーゼ及びγ−32P−ATPを用いて32P
でラベルした。ラベルされた化合物を、50V/cmにて45分
間の電気泳動の後14〜20％ポリアクリルアミドゲルのオ
ートラジオグラフィーにより試験した。この方法により
分子量が確認される。ヘビ毒ジエステラーゼ及び細菌ア
ルカリ性ホスファターゼの使用によるオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドのヌクレオシドへの消化、並びにこれに
続く、逆相HPLCカラム及び10％アセトニトリル、１％酢
酸アンモニウム移動相を用いる前記ヌクレオシドの分離
及び容量により塩基組成を決定した。 II.増幅反応 Poiesz博士からの11個の標識を付されたDNAサンプル
のそれぞれからのDNA1μｇを、10mM Tris−HCl（pH7.
5）、50mM塩化ナトリウム及び10mM塩化マグネシウムか
ら成る緩衝液であって100pmoleのプライマーSK43、100p
moleのプライマーSK44並びに150nmずつのdATP,dCTP,dGT
P及びTTPを含有するもの100μｌに加えた。 得られた溶液を10分間100℃に加熱し、そして２分間
室温に冷却し、次にE.コリDNAポリメラーゼのKlenow断
片１ユニットを含有する２μｌを加えた。反応を室温に
て２分間進行せしめ、次に95℃にて２分間加熱すること
により酵素を不活性化した。段階当り２分間ずつの変
性、プライマーのアニーリング、及びKlenowにより延
長、並びにポリメラーゼの添加を19回反復した。 III.オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの合成及
びリン酸化 次の配列： ５′−*ACGCCCTACTGGCCACCTGTCCAGAGCATCAGATCACCTG−
３′(*はラベルを表わす）を有するラベル化DNAプロー
ブSK45を、I.において記載した方法に従って合成した。
10pmoleのプローブを４ユニットのT4ポリヌクレオチド
キナーゼ及び10pmoleのγ−32P−ATP（約7200Ci/mmol
e）と、70mM Tris（pH7.6）、10mM MgCl2、1.5mMスペル
ミン及び2.5mMジチオスレイトールを含有する40μｌの
反応容量中で37℃にて90分間接触せしめることによりラ
ベルした。次に、全容量を25mM EDTAにより100μｌに調
整し、そしてアリコートを採り、ATC沈澱により比活性
を決定した。ラベルされたプローブをSpeed−vacを用い
て濃縮し、そしてTris−硼酸−EDTA（TBE）緩衝液（89m
M Tris,89mM硼酸、2.5mM EDTA,pH8.3）中18％ポリアク
リルアミドゲル（アクリルアミド:BIS＝19.1）上での電
気泳動により500vhrで精製した。オートラジオグラフィ
ーにより位置を決定した後、ラベル化プローブを含有す
るゲルの部分を切り出し、砕破し、そして0.2mlのTE緩
衝液に４℃にて一夜溶出した。反応生成物のTCA沈澱
は、比活性が2Ci/mmoleでありそして最終濃度が20pmole
/mlであることを示した。 IV.増幅されたゲノムDNAのプローブとのハイブリダイゼ
ーション及びBgl Iによる消化 A.溶液中での検出 10μｌの増幅されたDNA（71ngのゲノムDNAの増幅同等
物を含有する）を1.5mlのマイクロフュージチューブに
分配し、そして10μｌのTE緩衝液により30μｌの最終容
量とした。サンプルを95℃にて10分間変性した。0.02pm
oleのSK45プローブを含有する0.6M Nacl 10μｌをチュ
ーブに加え、ゆっくり混合し、そして鉱油を重層し、そ
してすぐに56℃のヒートブロックに移して１時間置い
た。10μｌの50mM MgCl2及び１μｌのBgl I（８ユニッ
ト）を加え、そして再アニールしたDNAを56℃にて30分
間消化した。４μｌの75mM EDTA及び６μｌの追跡色素
を加えて最終容量60μｌとした。鉱油を0.2mlのクロロ
ホルムで抽出し、そして13μｌの反応混合物（〜15ngの
ゲノムDNA）をHoeffer SE 200装置中の30％ポリアクリ
ルアミドミニ−ゲル（19:1）上に負荷した。ゲルを約30
0Vにて１時間、ブロムフェノールブルー色素が原点から
3.0cm泳動するまで電気泳動した。ゲルの先端1.5cmを除
去し、そして残りのゲルを少なくとも一夜、２個の強化
スクリーンを用いて−70℃にて暴露した。 B.ドットブロットによる検出 増幅されたDNAをNaOHとNaZ EDTAとの緩衝液に加え
て、最終濃度を400mM NaOH及び25mM NaZ EDTAとし、そ
して最終容量を200μｌとした。 イオン性の膜を水中で湿し、そしてBio−Radイムノブ
ロット真空装置に入れた。次に真空を引き、装置を平衡
にし、そして前記のDNAサンプルを膜に負荷した。膜を2
0×SSPEで洗浄した。SSPEはNaCl、リン酸ナトリウム、E
DTA及びNaOHから成る標準緩衝液である。次に、膜を取
り出し、そして20×SSPEに入れて２〜５分間攪拌した。
次に、膜を乾燥し、UV光に６分間暴露してDNAを膜に架
橋せしめた。 次に、膜を5mlのフレハイブリダイゼーション溶液
〔３×SSPE、５×デンハート溶液、0.5％ドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）、30％ホルムアミド、ガラス蒸留水
により10mlにする〕に入れ42℃にて30分間攪拌した。次
に、プレハイブリダイゼーション溶液を絞り取り、そし
て5mlのハイブリダイゼーション溶液（プレハイブリダ
イゼーション溶液に0.5pmoleのSK45を添加したもの）を
加えた。42℃にて１時間、攪拌しながらインキュベーシ
ョンを行った。 ハイブリダイゼーションの後、２×SSPE、0.1％SDS中
で15分間ずつ２回、室温にて攪拌しながら洗浄した。次
に、これを0.2×SSPE、0.1％SDSにより50℃にて５分
間、攪拌しながら洗浄した。膜を乾燥し、そしてフィル
ムに暴露した。 V.結果の検討 溶液中及び膜上での両方の検出のオートラジオグラフ
は、サンプル342（HTLV I）、367（HTLV I）、361（HTL
V I）、307（HTLV I）、308B（HTLV I）、323（HTLV I
I）及び326（HTLV I）中にのみHTLV I及びII DNA配列が
存在することを示した。これらのサンプルのすべてがHT
LV I又はHTLV II陽性DNAであることが後で見出された。
他の４個のサンプルは、194BK＝白血病患者（ウイルス
単離されない）からのDNA、207＝攻撃的白血病患者（皮
膚包含）からのDNA、340＝攻撃的白血病患者（207とは
異る）からのもの、及び368H＝HTLV IIIであった。 従って、使用したプライマーはDNAを増幅することが
可能であり、プローブが配列を実際に検出することを可
能にした。 37℃にて10％DMSOの存在下での増幅（二次構造の形成
を最小にする）もまたHTLV I及びIIサンプルを陽性サン
プルとして示した。 例2.HTLV I pol領域3365−3483を増幅するHTLV I−特異的プライ
マーを用いて、例１の増幅／ハイブリダイゼーション／
消化実験を行た。これらのプライマーは次の２種類であ
った。 ５′−CTTCACAGTCTCTACTGTGC−３′（SK54） ５′−CGGCAGTTCTGTGACAGGG−３′（SK55） 下記のプローブSK56を制限酵素Pvu IIと共に使用し
た。 ５′−CCGCAGCTGCACTAATGATTGAACTTGAGAAGGAT−３′（S
K56） オートラジオグラフは、HTLV I DNA配列が、後でHTLV
I陽性DNAとして同定されたサンプル中にのみ存在する
ことを示した。HTLV II pol領域4198−4300を増幅するHTLV II−特異的プライ
マーを用いて、例１の増幅／ハイブリダイゼーション／
消化実験を行った。次のプローブを使用した。 ５′−ATCTACCTCCACCATGTCCG−３′（SK58） ５′−TCAGGGGAACAAGGGGAGCT−３′（SK59） 下記のプローブSK60を制限酵素Hinf Iと共に使用し
た。 ５−TAAGGGAGTCTGTGTATTCATTGAAGGTGGAAATTGGGTC−３′
（SK60） オートラジオグラフは、HTLV II DNA配列が後でHTLV
II陽性DNAとして同定されたサンプル323中にのみ存在す
ることを示した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ジョン ジョセフ スニンスキ
アメリカ合衆国，カリフォルニア
94803，エル ソブランテ，サンダーヘ
ッド コート4924
(72)発明者 シャーレイ イー ウォク
アメリカ合衆国，カリフォルニア
94563，サン ラモン，ローモンド サ
ークル 611
(72)発明者 ベルナード ポイエス
アメリカ合衆国，ニョーヨーク 13159,
タリー，ロング ロード，ボックス
49，アールティー，３
審査官 竹内 亜希
(56)参考文献 特開 昭61−19500（ＪＰ，Ａ)
欧州公開185444（ＥＰ，Ａ１)
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．81，Ｐ．6657−
6661 （1984)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．HTLV I核酸もしくはHTLV II核酸、又はHTLV I核酸
及びHTLV II核酸の両者の単離物の間で実質的に保存さ
れており、そしてHTLV IもしくはHTLV II、又はHTLV I
及びHTLV IIの両者の単離体中の核酸に特異的な核酸配
列の、サンプル中での存在又は不存在を検出又は監視す
るための方法であって、 （ａ）前記サンプルを、一緒に又は別々に、前記核酸配
列の各鎖のための15ヌクレオチド以上の長さ及び50〜63
％のGC含有を有するオリゴヌクレオチドプライマー、４
種類の異るヌクレオシドトリホスフェート及び重合用試
薬によりハイブリダイゼーション条件下で処理し、該核
酸配列の各鎖について、検出又は監視されるべき核酸配
列の各核酸鎖に対して実質的に相補的である各プライマ
ーの延長生成物が合成され、一方のプライマーから合成
された延長生成物がその相補体から分離された場合に他
方のプライマーの延長生成物のための鋳型として機能す
るようにし； （ｂ）前記サンプルを変性条件下で処理して、検出され
るべき配列が存在する場合にはプライマー延長生成物を
それらの鋳型から分離せしめ； （ｃ）段階（ｂ）の生成物を15ヌクレオチド以上の長さ
及び50〜63％のGC含量を有するオリゴヌクレオチドプラ
イマーで処理することにより、段階（ｂ）において生成
した単鎖のそれぞれを鋳型として用いてプライマー延長
生成物を合成して、検出されるべき配列が存在すればそ
れを増幅し；そして （ｄ）検出されるべき配列が存在するとすればそれを15
ヌクレオチド以上の長さ及び46〜60％のGC含量を有する
プローブにより検出する； ことを含んで成る方法。 ２．段階（ｄ）が、 （１）前記の増幅された核酸配列とハイブリダイズする
ことができるラベル化プローブを段階（ｃ）の生成物に
添加し；そして （２）前記プローブが前記核酸サンプル中の増幅された
配列にハイブリダイズするか否かを決定する段階を含ん
で成る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．段階（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも１回反復し、そ
して前記プライマーがHTLV Iゲノム及びHTLV IIゲノム
のＸ領域から選択されたものである、特許請求の範囲第
１項又は第２項に記載の方法。 ４．重合のための前記試薬がE.コリ DNAポリメラー
ゼ、E.コリ DNAポリメラーゼＩのKlenow断片、逆転写
酵素、又は核酸を変性するのに十分な温度に暴露した後
に、段階（ａ）及び（ｃ）の間に反応温度において前記
延長生成物を生成するためのその酵素活性を維持してい
る酵素から成る群から選ばれた酵素である、特許請求の
範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５．段階（ａ）の前に、前記サンプルを該サンプル中に
含まれる核酸の鎖を露出せしめることができる試薬で処
理し、そして鎖を同時に又は逐次に分離する、特許請求
の範囲第１項〜第４項に記載の方法。 ６．段階（２）が、 （１）段階（ｄ）からのハイブリダイズした混合物を、
前記プローブ中の配列内の部位を認識する制限酵素によ
り消化し；そして （２）制限消化物が、検出されるべきHTLV I及び／又は
HTLV II配列の存在と関連する制限断片を含有するか否
かを検出する； 段階を含んで成る、特許請求の範囲第２項に記載の方
法。 ７．段階（１）及び（２）において、HTLV I及び／又は
HTLV IIウイルスゲノムの配列を有する１又は複数の核
酸を含有する陽性対照、及び／又はHTLV I及び／又はHT
LV IIウイルス間からの配列を有する核酸を含有しない
陰性対照を用いる、特許請求の範囲第６項に記載の方
法。 ８．前記核酸配列が２本鎖である、特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 ９．前記核酸配列が１本鎖である、特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 １０．前記２本鎖核酸配列がDNAである、特許請求の範
囲第８項に記載の方法。 １１．前記１本鎖核酸配列がRNAである、特許請求の範
囲第９項に記載の方法。 １２．HTLV I核酸もしくはHTLV II核酸、又はHTLV I核
酸及びHTLV II核酸の両者の単離体の間で実質的に保存
されており、HTLV IもしくはHTLV II、又はHTLV I及びH
TLV IIの両者の単離体中の核酸に特異的な核酸配列のサ
ンプル中での存在又は不存在を検出又は監視するための
キットであって、 （ａ）検出されるべき核酸配列の各鎖のための15ヌクレ
オチド以上の長さ及び50〜63％のGC含量を有するオリゴ
ヌクレオチドプライマー（この１又は複数のプライマー
は各特定の核酸配列の各鎖に対して実質的に相補的であ
って、一方のプライマーから合成された延長生成物がそ
の相補体から分離された場合、他方のプライマーの延長
生成物の合成のための鋳型として機能することができ
る）；及び （ｂ）前記核酸配列とハイブリダイズすることができる
15ヌクレオチド以上の長さ及び46〜60％のGC含量を有す
るプローブ； を含んで成るキット。 １３．前記プライマーがHTLV I及び／又はHTLV IIゲノ
ムのpol領域又はＸ領域から選択される、特許請求の範
囲第12項に記載のキット。 １４．（ａ）プライマーが： ５′−CGG ATA CCC AGT CTA CGT GT−３′及び ５′−GAG CCG ATA ACG CGT CCA TCG−３′ であり、そしてプローブが： ５′−ACG CCC TAC TGG CCA CCT GTC CAG AGC ATC AGA
TCA CCT G−３′ であるか；あるいは （ｂ）プライマーが： ５′−CTT CAC AGT CTC TAC TGT GC−３′及び ５′−CGG CAG TTC TGT GAC AGG G−３′ であり、そしてプローブが： ５′−CCG CAG CTG CAC TAA TGA TAA TGA TTG AAC TTG
AGA AGG AT−３′ であるか；あるいは （ｃ）プライマーが； ５′−ATC TAC CTC CAC CAT GTC CG−３′及び ５′−TCA GGG GAA CAA GGG GAG CT−３′ であり、そしてプローブが： ５′−TAA GGG AGT CTG TGT ATT CAT TGA AGG TGG AAA
TTG GGT C−３′ である、 ことを特徴とする、特許請求の範囲第12項に記載のキッ
ト。 １５．重合用試薬、４種類のヌクレオシドトリホスフェ
ートのそれぞれ、及び前記プローブと前記配列とのハイ
ブリドを検出するための手段をさらに含んで成る特許請
求の範囲第12項に記載のキット。 １６．HTLV I核酸もしくはHTLV II核酸、又はHTLV I核
酸及びHTLV II核酸の両者の単離物の間で実質的に保存
されており、そしてHTLV IもしくはHTLV II、又はHTLV
I及びHTLV IIの両者の単離体中の核酸に特異的な核酸配
列の、サンプル中での存在又は不存在を検出又は監視す
るための方法であって、 （ａ）前記サンプルを、一緒に又は別々に、前記核酸配
列の各鎖のための15ヌクレオチド以上の長さ及び50〜63
％のGC含量を有するオリゴヌクレオチドプライマー、４
種類の異るヌクレオシドトリホスフェート及び重合用試
薬によりハイブリダイゼーション条件下で処理し、該核
酸配列の各鎖について、検出又は監視されるべき核酸配
列の各核酸鎖に対して実質的に相補的である各プライマ
ーの延長生成物が合成され、一方のプライマーから合成
された延長生成物がその相補体から分離された場合に他
方のプライマーの延長生成物のための鋳型として機能す
るようにし； （ｂ）前記サンプルを変性条件下で処理して、検出され
るべき配列が存在する場合にはプライマー延長生成物を
それらの鋳型から分離せしめ； （ｃ）段階（ｂ）の生成物を15ヌクレオチド以上の長さ
及び50〜63％のGC含量を有するオリゴヌクレオチドプラ
イマーで処理することにより、段階（ｂ）において生成
した単鎖のそれぞれを鋳型として用いてプライマー延長
生成物を合成して、検出されるべき配列が存在すればそ
れを増幅し；そして （ｄ）検出されるべき配列が存在するとすればそれを15
ヌクレオチド以上の長さ及び45〜60％のGC含量を有する
プローブにより検出する； ことを含んで成る方法において使用するためのプライマ
ーであって、 15ヌクレオチド以上の長さ及び50〜63％のGC含量を有す
る核酸配列を含んで成り、そして HTLV I核酸もしくはHTLV II核酸又はHTLV I核酸及びHTL
V II核酸の両方の単離物間で実質的に保存されており、
そしてHTLV I核酸もしくはHTLV II核酸又はHTLV I核酸
及びHTLV II核酸の両方の単離物中の核酸に特異的な配
列を有する、 ことを特徴とするプライマー。 １７．HTLV I及び／又はHTLV IIウイルスのpol領域又は
Ｘ領域から選択される核酸に対して特異的な、特許請求
の範囲第16項に記載のプライマー。 １８．次の配列： ５′−CGG ATA CCC AGT CTA CGT GT−３′； ５′−GAG CCG ATA ACG CGT CCA TCG−３′； ５′−CTT CAC AGT CTC TAC TGT GC−３′； ５′−CGG CAG TTC TGT GAC AGG G−３′； ５′−ATC TAC CTC CAC CAT GTC CG−３′；又は ５′−TCA GGG GAA CAA GGG GAG CT−３′； を有する、特許請求の範囲第16項又は第17項に記載のプ
ライマー。 １９．HTLV I核酸もしくはHTLV II核酸、又はHTLV I核
酸及びHTLV II核酸の両者の単離物の間で実質的に保存
されており、そしてHTLV IもしくはHTLV II、又はHTLV
I及びHTLV IIの両者の単離体中の核酸に特異的な核酸配
列の、サンプル中での存在又は不存在を検出又は監視す
るための方法であって、 （ａ）前記サンプルを、一緒に又は別々に、前記核酸配
列の各鎖のための15ヌクレオチド以上の長さ及び50〜63
％のGC含量を有するオリゴヌクレオチドプライマー、４
種類の異るヌクレオシドトリホスフェート及び重合用試
薬によりハイブリダイゼーション条件下で処理し、該核
酸配列の各鎖について、検出又は監視されるべき核酸配
列の各核酸鎖に対して実質的に相補的である各プライマ
ーの延長生成物が合成され、一方のプライマーから合成
された延長生成物がその相補体から分離された場合に他
方のプライマーの延長生成物のための鋳型として機能す
るようにし； （ｂ）前記サンプルを変性条件下で処理して、検出され
るべき配列が存在する場合にはプライマー延長生成物を
それらの鋳型から分離せしめ； （ｃ）段階（ｂ）の生成物を15ヌクレオチド以上の長さ
及び50〜63％のGC含量を有するオリゴヌクレオチドプラ
イマーで処理することにより、段階（ｂ）において生成
した単鎖のそれぞれを鋳型として用いてプライマー延長
生成物を合成して、検出されるべき配列が存在すればそ
れを増幅し；そして （ｄ）検出されるべき配列が存在するとすればそれを15
ヌクレオチド以上の長さ及び46〜60％のGC含量を有する
プローブにより検出する； ことを含んで成る方法において使用するためのDNAプロ
ーブであって、 HTLV I及び／又はHTLV IIウイルスのゲノムからの実質
的に保存された核酸配列に対して相補的であり、そして
HTLV I及び／又はHTLV II核酸とハイブリダイズするこ
とができるDNAプローブ。 ２０．長さが15〜40ヌクレオチドである特許請求の範囲
第19項に記載のDNAプローブ。 ２１．次の配列： ５′−ACG CCC TAC TGG CCA CCT GTC CAG AGC ATC AGA
TCA CCT G−３′； ５′−CCG CAG CTG CAC TAA TGA TTG AAC TTG AGA AGG
AT−３′；もしくは ５′−TAA GGG AGT CTG TGT ATT CAT TGA AGG TGG AAA
TTG GGT C−３′、 又はそれに対して相補的な配列、に由来する特許請求の
範囲第19項に記載のDNAプローブ。
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Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU606043B2 (en) * | 1985-03-28 | 1991-01-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Detection of viruses by amplification and hybridization |
| EP0272098A3 (en) * | 1986-12-15 | 1990-06-06 | City Of Hope National Medical Center | Method for amplification and detection of rna sequences |
| US5614366A (en) * | 1986-12-31 | 1997-03-25 | Genelabs Technologies, Inc. | HTLV-I peptide antigens and kit |
| US5643714A (en) * | 1986-12-31 | 1997-07-01 | Genelabs Technologies, Inc. | Method and assay for HTLV |
| US5389512A (en) * | 1988-10-07 | 1995-02-14 | Hoffman-La Roche Inc. | Method for determining the relative amount of a viral nucleic acid segment in a sample by the polymerase chain reaction |
| FR2647810B1 (fr) * | 1989-06-02 | 1994-07-22 | Pasteur Institut | Amorces oligonucleotidiques pour l'amplification du genome des retrovirus du type hiv-2 et siv, et leurs applications au diagnostic in vitro des infections dues a ces virus |
| JP3428012B2 (ja) * | 1989-06-02 | 2003-07-22 | インスティチュート・パスツール | Ｈｉｖ―１、ｈｉｖ―２及びｓｉｖタイプのレトロウイルスのゲノムからのヌクレオチド配列、並びに、特に、これらのレトロウイルスのゲノムの増幅のため及びこれらのウイルスによる感染の「生体外」診断のためのこれらの配列の応用 |
| US7022814B1 (en) | 1992-01-21 | 2006-04-04 | Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Nucleotide sequences derived from the genome of retroviruses of the HIV-1, HIV-2 and SIV type, and their uses in particular for the amplification of the genomes of these retroviruses and for the in vitro diagnosis of the diseases due to these viruses |
| WO1991000868A1 (en) * | 1989-07-07 | 1991-01-24 | National Research Development Corporation | Immobilised polynucleotides |
| US5856088A (en) * | 1989-07-11 | 1999-01-05 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
| US6589734B1 (en) * | 1989-07-11 | 2003-07-08 | Gen-Probe Incorporated | Detection of HIV |
| US5780219A (en) * | 1989-07-11 | 1998-07-14 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification oligonucleotides and probes to human hepatitis B virus |
| WO1991002091A1 (en) * | 1989-08-10 | 1991-02-21 | Northwestern University | Method of identifying herpesviruses and oligonucleotides for use therein |
| FR2677039B1 (fr) * | 1991-05-31 | 1994-09-09 | Cis Bio Int | Oligonucleotides, utilisables comme reactifs pour la detection in vitro des infections a retrovirus de type hiv et procede de detection de retrovirus de type hiv. |
| US5478724A (en) * | 1991-08-16 | 1995-12-26 | The Rockefeller University | Lentivirus-specific nucleotide probes and methods of use |
| US5387510A (en) * | 1991-10-02 | 1995-02-07 | Eastman Kodak Company | Detection of amplified nucleic acid using secondary capture oligonucleotides and test kit |
| DE4140463A1 (de) * | 1991-12-09 | 1993-06-17 | Boehringer Mannheim Gmbh | 2'-desoxy-isoguanosin, dessen isostere analoge sowie anwendung derselben |
| EP0672174A4 (en) * | 1991-12-23 | 1997-07-16 | Chiron Corp | HTLV-1 SAMPLES FOR USE OF SANDWICH HYBRIDIZATION METHODS SOLUTION. |
| US5312527A (en) * | 1992-10-06 | 1994-05-17 | Concordia University | Voltammetric sequence-selective sensor for target polynucleotide sequences |
| KR100325554B1 (ko) | 1993-03-26 | 2002-11-02 | 젠-프로브 인코포레이티드 | 사람의면역결핍 바이러스타입1의검출 |
| US6174668B1 (en) * | 1993-05-14 | 2001-01-16 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of two or more target DNA's using primers having matched melting temperatures |
| US5403707A (en) * | 1993-05-14 | 1995-04-04 | Eastman Kodak Company | Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of retroviral DNA using primers having matched melting temperatures |
| US6709813B1 (en) | 1993-05-14 | 2004-03-23 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of human CMV DNA using primers having matched melting temperatures |
| DE69431510T2 (de) * | 1993-07-08 | 2003-02-27 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Verfahren zur Koamplifikation zweier unterschiedlicher Nukleinsäure-Sequenzen unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion |
| US5514551A (en) * | 1994-10-14 | 1996-05-07 | Gen-Probe Incorporated | Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis |
| US5622827A (en) * | 1995-02-07 | 1997-04-22 | Gen-Probe Incorporated | Amplification primers and nucleic acid probes targeted to coccidioides immitis nucleic acid |
| US5747252A (en) * | 1995-06-07 | 1998-05-05 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes and amplification oligonucleotides for Neisseria species |
| CA2237891C (en) * | 1995-11-15 | 2013-07-30 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes complementary to human papillomavirus nucleic acid and related methods and kits |
| US7244570B2 (en) * | 1998-08-04 | 2007-07-17 | Luminex Molecular Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for modulating “marginally indiscriminant” hybridizations |
| US7820030B2 (en) * | 2003-04-16 | 2010-10-26 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| EP4361607A3 (en) | 2012-02-03 | 2024-07-17 | California Institute of Technology | Signal encoding and decoding in multiplexed biochemical assays |
| US9791372B2 (en) | 2012-08-03 | 2017-10-17 | California Institute Of Technology | Multiplexing and quantification in PCR with reduced hardware and requirements |
| US10066263B2 (en) | 2016-06-17 | 2018-09-04 | California Institute Of Technology | Nucleic acid reactions and related methods and compositions |
| CN107488746A (zh) * | 2017-09-13 | 2017-12-19 | 北京福安华生物科技有限公司 | 一种检测人类嗜t细胞病毒的方法及其专用成套试剂 |
| US12203129B2 (en) | 2018-07-03 | 2025-01-21 | ChromaCode, Inc. | Formulations and signal encoding and decoding methods for massively multiplexed biochemical assays |
| US11634762B2 (en) * | 2020-05-14 | 2023-04-25 | Chemgenes Corporation | RT-qPCR molecular detection and diagnosis |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0062286A1 (en) * | 1981-03-31 | 1982-10-13 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Diagnostic test for hepatitis B virus |
| WO1984003715A1 (en) * | 1983-03-21 | 1984-09-27 | John A Webster Jr | Method for identifying and characterizing organisms |
| GB8423659D0 (en) * | 1984-09-19 | 1984-10-24 | Pasteur Institut | Cloned dna sequences |
| US4520113A (en) * | 1984-04-23 | 1985-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Serological detection of antibodies to HTLV-III in sera of patients with AIDS and pre-AIDS conditions |
| US4683194A (en) * | 1984-05-29 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences |
| IL76082A (en) * | 1984-08-22 | 1991-07-18 | Us Health | Molecular clones of the genome of htlv-iii and a process for the preparation thereof |
| US9328391B1 (en) * | 1984-08-22 | 2016-05-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cloning and expression of HIV-1 DNA |
| US4755458A (en) * | 1984-08-30 | 1988-07-05 | Enzo Biochem, Inc. | Composition and method for the detection of the presence of a polynucleotide sequence of interest |
| EP0187041B1 (en) * | 1984-12-24 | 1996-05-15 | Genentech, Inc. | Fusions of AIDS-related polypeptides |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| DK171161B1 (da) * | 1985-03-28 | 1996-07-08 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve |
| AU606043B2 (en) * | 1985-03-28 | 1991-01-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Detection of viruses by amplification and hybridization |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4806463A (en) * | 1986-05-23 | 1989-02-21 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides |
-
1986
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