DK175469B1 - Fremgangsmåde til multiplikation og påvisning af nukleinsyresekvenser - Google Patents

Description

DK 175469 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår enkeltstrengede oligonukleotider, der tillader multiplikation af eksisterende nukleinsyresekvenser, hvis disse er til stede i en testprøve, og påvisning af dem, hvis de er til stede, under anvendelse af en probe. Nærmere bestemt tillader oligonukleotiderne frembringelsen af en hvilken som helst bestemt nu-5 kleinsyresekvens ud fra en given sekvens af DNA eller RNA i mængder, som er store sammenlignet med den oprindeligt tilstedeværende mængde, således at påvisning af sekvenserne lettes. DNA'et og RNA'et kan være enkeltstrenget eller dobbeltstrenget og kan enten foreligge i relativt ren form eller som en komponent af en blanding af nukleinsyrer. Oligonukleotiderne ifølge opfindelsen udnytter en gentagen omsætning 10 til udførelse af multiplikationen af den ønskede nukleinsyresekvens.

Navnlig til diagnostiske anvendelser kan mål-nukleinsyresekvensen være blot en lille del af det pågældende DNA eller RNA, således at det kan være vanskeligt at påvise dets tilstedeværelse under anvendelse af ikke-isotopisk mærkede eller ende-mærkede 15 oligonukleotidprober. Der bruges mange kræfter på at forøge sensitiviteten af probe-detektionssystemerne, men der er ikke udført megen forskning på at multiplicere mål-sekvensen, således at den er til stede i mængder, der er tilstrækkelig til let at kunne ' påvises under anvendelse af de metoder, der for tiden er til rådighed.

20 Flere metoder er blevet beskrevet i litteraturen vedrørende de novo syntese af nukleinsyrer eller syntese af nukleinsyrer ud fra en eksisterende sekvens. Disse metoder er i stand til at frembringe store mængder af en given nukleinsyre med fuldstændig specificeret sekvens.

25 Én kendt metode til de novo syntetisering af nukleinsyrer omfatter organisk syntese af en nukleinsyre ud fra nukleosidderivater. Denne syntese kan udføres i opløsning eller på et fast bæremateriale. Én type af organisk syntese er phosphotriestermetoden, som er blevet anvendt til fremstilling af genfragmenter eller korte gener. 1 phosphotriestermetoden fremstilles oligonukleotider, som derefter kan sammenføjes til dan-30 nelse af lange nukleinsyrer. For en beskrivelse af denne metode se Narang, S.A. et al.,

Meth. Enzymol.. 68. 90 (1979) og US patent nr. 4.356.270. I patentet beskrives syntesen og kloningen af somatostatingenet.

P

En anden type af organisk syntese er phosphodiestermetoden, som er blevet anvendt 35 til fremstilling af et tRNA-gen. Se Brown, E.L. et al-, Meth. Enzvmol.. 68. 109 (1979) for en beskrivelse af denne metode. Som i phosphotriestermetoden omfatter phosphodiestermetoden syntese af oligonukleotider, som efterfølgende sammenføjes til dannelse af den ønskede nukleinsyre. 1

Skønt ovennævnte fremgangsmåder for de novo syntese kan anvendes til syntese af lange strenge af nukleinsyre, er de ikke særligt praktiske at anvende til syntese af store mængder af en nukleinsyre. Begge fremgangsmåder er arbejdskrævende og

DK 175469 B1 I

tidsrøvende, kræver dyrt udstyr og dyre reagenser og har en lav samlet effektivitet. I

Den lave samlede effektivitet kan skyldes ineffektiviteter i syntesen af oligonukleoti- I

derne og i sammenføjningsreaktionerne. I syntesen af en lang nukleinsyre eller endog I

i syntesen af en stor mængde af en kort nukleinsyre vil det være nødvendigt at synte- I

5 tisere mange oligonukleotider, og der vil være behov for mange sammenføjningsreak- I

tioner. Som følge heraf vil disse metoder ikke være praktiske til syntese af store I

mængder af en hvilken som helst ønsket nukleinsyre. I

Der eksisterer også fremgangsmåder til fremstilling af nukleinsyrer i store mængder I

10 ud fra små mængder af den oprindeligt foreliggende nukleinsyre. Disse fremgangsmå- I

der omfatter kloning af en nukleinsyre i et passende værtssystem, hvor den ønskede I

nukleinsyre indsættes i en passende vektor, som anvendes til transformering af vær- I

ten. Nar værten dyrkes, replikeres vektoren, og således frembringes flere kopier af I

den ønskede nukleinsyre. For en kort beskrivelse af subkloning af nukleinsyrefrag- I

15 menter se Maniatis T. et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring I

Harbor Laboratory, s. 390-401 (1982). Se også teknikkerne beskrevet i US patent nr. I

4.416.988 og nr. 4.403.036. I

En tredie fremgangsmåde til syntetisering af nukleinsyrer, som er beskrevet i US pa- I

20 tent nr. 4.293.652, er en hybrid mellem den ovenfor beskrevne organiske syntese og I

metoder til molekylær kloning. ] denne fremgangsmåde bliver et passende antal

oligonukleotider til dannelse af den ønskede nukleinsyresekvens syntetiseret organisk I

og indsat sekventielt i en vektor, som multipliceres ved vækst forud for hver efterføl- I

gende indsætning. I

25 I

Den foreliggende opfindelse bærer nogen lighed med metoden til molekylær kloning, I

men den omfatter imidlertid ikke formering af nogen organisme og undgår derved de I

mulige farer eller upraktiske forhold, som dette medfører. Den foreliggende opfindelse I

kræver heller ikke syntese af nukleinsyresekvenser, som er ubeslægtede med den øn- I

30 skede sekvens, og derved undgår man med den foreliggende opfindelse behovet for I

omfattende oprensning af produktet ud fra en kompliceret biologisk blanding. I

I J. Mol. Biol.. 56. s. 341-361 (1971) diskuterer Kleppe et al. primerforlængelsesreak- " I

tioner under anvendelse af templates, der svarer til dele af et tRNA-gen, i hvilke reak- I

35 tioner de anvendte primere er komplementære til væsentlige dele af tilsvarende tem- I

plates og forlænges langs med disse for at frembringe duplex-DNA’er. Disse template- I

kopireaktioner, som involverer simpel primerforlængelse, benævnes "repair replica- I

tion’’ af forfatterne. I det sidste afsnit af artiklen fremsættes der teorier om, at hvis I

duplex-DNA-denaturering påvirkes af tilstedeværelsen af egnede primere, ville der I

40 kunne frembringes to strukturer bestående af templatestrenge med fuld længde i I

kompleks med en primer efter afkøling og "repair replikation” opnået ved tilsætning af I

DNA-polymerase. Det foreslås i det pågældende afsnit, at fremgangsmåden ville I

3 DK 175469 B1 kunne gentages. Imidlertid er der ingen detaljeret forklaring af nøjagtigt hvilke teknikker, der kan anvendes, eller nogen diskussion af hvilke primere, der er "egnede”, og muligheden for at der opstår et problem med template-renaturering (gendannelse af en duplex) diskuteres med forslaget om, om nødvendigt, at separation af strenge 5 nødvendigvis må omgøres med efterfølgende "repair replication".

Den foreliggende opfindelse angår enkelt-strengede oligonukleotider, der tillader multiplikation af en eller flere specifikke nukleinsyresekvenser tilstede i en nukleinsyre eller blanding deraf under anvendelse af midler til polymerisering og derefter påvis-10 ning af den multiplicerede sekvens. Forlængelsesproduktet af én oligonukleotid (primer) bliver, når den hybridiseres til den anden, en template for produktionen af den ønskede specifikke nukleinsyresekvens og vice versa, og fremgangsmåden kan gentages så ofte som nødvendigt for at producere den ønskede mængde af sekvensen.

Denne fremgangsmåde, der udføres under anvendelse af oligonukleotiderne i den 15 foreliggende opfindelse, forventes at være mere effektiv end de ovenfor beskrevne metoder til dannelse af store mængder nukleinsyre ud fra en mål-sekvens og til produktion af sådanne nukleinsyrer på en ved sammenligning kort tid. Fremgangsmåde, der udføres under anvendelse af oligonukleotiderne i den foreliggende opfindelse, er navnlig nyttig til multiplicering af sjældne nukleinsyrer, der er til stede i en blanding af 20 nukleinsyrer, til effektiv påvisning af sådanne sjældne nukleinsyrer.

Nærmere bestemt tilvejebringer den foreliggende opfindelse et første og andet enkelt-strenget oligonukleotid, der tillader multiplikation af en specifik template-nukleinsyre-sekvens indeholdt i en enkelt- eller dobbeltstrenget nukleinsyre eller i en blanding af 25 sådanne nukleinsyrer, hvor (a) det ene oligonukleotid indeholder en del, som er i det væsentlige komplementær til template-nukleinsyresekvensen i den enkeltstrengede nukleinsyre eller i en streng i den dobbeltstrengede nukleinsyre; 30 (b) det andet oligonukleotid indeholder en del, som er i det væsentlige komplementær til et komplement af template-nukleinsyresekvensen i den enkeltstrengede nukleinsyre eller i strengen i den dobbeltstrengede nukleinsyre; (c) nævnte oligonukleotid-dele (a) og (b) yderligere indeholder en sekvens i 5'-en-den, som er ikke-komplementær til template-nukleinsyresekvensen, hvilken sekvens 35 indeholder et restriktionssted; og hvor (d) de under (a) og (b) beskrevne oligonukleotid-dele, der er i det væsentlige komplementære, er indbyrdes forskellige og afgrænser enderne af den specifikke template-nukleinsyresekvens, der skal multipliceres. 1

Foretrukne udførelsesformer af opfindelsen fremgår af kravene 2 til 11.

DK 175469 B1 I

Den verserende europæiske patentansøgning nr. 201184 beskriver fremgangsmåder I

til multiplikation af nukleinsyresekvenser, og denne ansøgning er afdelt fra den euro- I

pæiske patentansøgning nr. 86 302298.4. I

5 Fig.l viser en 94 basepar lang sekvens af human β-globin, der ønskes multipliceret. I

Enkeltbasepar-ændringen, som følger med seglcelleanæmi, er angivet under 94-me* I

ren. ' I

Fig. 2 viser et fotografi af en ethidiumbromidfarvet polyacrylamidgel demonstrerende

10 multiplikation af 94-meren, der indeholdes i human vildtype-DNA og i et plasmid, der I

indeholder et 1,9 kb BamHl fragment af det normale β-giobingen (betegnet I

pBR328:HbA). I

Fig. 3 viser et fotografi af en ethidiumbromidfarvet polyacrylamidgel demonstrerende I

15 multiplikation af enhver af de specifikke 94-mere målsekvenser, der er til stede i I

pBR328:HbA, et plasmid, der indeholder et 1,9 kb BamHI-fraoment af seglcelleallelen I

af β-globin (betegnet pBR328:HbS), pBR328:HbA, hvor sekvensen, der skal multipli- I

ceres, er spaltet med Mstll, og pBR328:HbS, hvor sekvensen, der skal multipliceres, I

er blevet behandlet med, men ikke spaltet med Mstll. I

20 I

Fig.4 viser i detaljer trinnene og produkterne af polymerasekædereaktionen til multi- I

plicering af den ønskede 94-mere sekvens af human β-globin i 3 cyklusser under an- I

vendelse af to oligonukleotidprimere. I

25 Fig. 5 viser et fotografi af en ethidiumbromidfarvet polyacrylamidgel demonstrerende I

multiplikation efter 4 cyklusser af en 240-mer sekvens i pBR328:HbA, hvor alikvoterne I

er fordøjet med Ncol (bane 3), Mstll (bane 4) eller Hinfl (bane 5). Bane 1 er molekyl- I

vægtsstandarden, og bane 2 indeholder det intakte 240 bp lange produkt. I

30 Fig. 6 viser sekvensen af de normale (βΑ) og seglcelle (ps) β-globingener i Ddel og I

Hinfl restriktionsstedområdet, hvor de enkelte linier for βΑ markerer positionen af I

Ddel-stedet (CTGAG) og dobbeltstregerne for βΑ og ps markerer positionen for I

Hinfl-stedet (GACTC). I

35 Fig. 7 viser resultaterne af sekventiel fordøjelse af normal β-globin under anvendelse I

af en 40-mer probe og Ddel-restriktionsenzymet efterfulgt af Hinfl-restriktionsenzy- I

met. I

Fig. 8 viser resultaterne af sekventiel fordøjelse af seglcelle β-globin under anvendelse I

40 af den samme 40-mere probe som i fig. 7 og Ddel-restriktionsenzymet efterfulgt af I

Hinfl-restriktionsenzymet. I

5 DK 175469 B1

Fig. 9 viser et fotografi af en ethidiumbromidfarvet polyacrylamidgel demonstrerende anvendelsen af den samme 40-mere probe som i fig. 7 til specifik karakterisering af tilstedeværende beta*globinalleler i prøven af hel human DNA, som er blevet udsat for multiplikation, hybridisering med proben og sekventiel fordøjelse med Ddel og Hinfl.

5

Fig. 10 viser et fotografi af en 6% NuSieve agarosegel visualiseret ved anvendelse af ethidiumbromid og UV-lys. Dette fotografi demonstrerer multiplikationen af et sub-fragment af et 110-bp multiplikationsprodukt, hvilket sub-fragment er en indre beliggende del af 110-bp fragmentet.

10

Udtrykket "oligonukleotid" som her anvendt under henvisning til primere, prober, olig-omerfragmenter, der skal påvises, oligomerkontroller og umærkede blokerende olig-omerer, er defineret som et molekyle, der består af 2 eller flere deoxyribonukleotider eller ribonukleotider, fortrinsvis mere end tre. Dets eksakte størrelse vil afhænge af 15 mange faktorer, som på sin side anhænger af den ultimative funktion eller anvendelse af oligonukleotidet.

Udtrykket "primer” og "oligonukleotidprimer” som her anvendt refererer til et oligonukleotid ifølge opfindelsen, hvad enten dette forekommer naturligt, som i en opren-20 set restriktionsfordøjelse, eller er produceret syntetisk, hvilken oligonukleotid er i stand til at virke som et initieringspunkt for syntese, når den placeres under betingelser, i hvilke syntese af et primerforlængelsesprodukt, som er komplementært til en nukleinsyrestreng, er induceret, dvs. under tilstedeværelse af nukleotider og et middel for polymerisering, såsom DNA-polymerase, og ved en egnet temperatur og pH. Pri-25 meren er for maximal effektivitet ved multiplikation fortrinsvis enkeltstrenget, men kan alternativt være dobbeltstrenget. Hvis den er dobbeltstrenget, behandles prime-ren først til separering af dets strenge, før den anvendes til dannelse af forlængelsesprodukter. Primeren er fortrinsvis et oligodeoxyribonukleotid. Primeren må være tilstrækkelig lang til at prime syntesen af forlængelsesprodukterne under tilstedevæ-30 relse af polymerisationsmidlet. De eksakte længder af primerne vil afhænge af mange faktorer, inklusiv temperatur og primerkilden. Afhængig af kompleksiteten af målsekvensen indeholder oligonukleotidprimeren f.eks. typisk 15-25 eller flere nukleotider, omend den kan indeholde færre nukleotider. Korte primermolekyler kræver generelt set lavere temperaturer for at danne tilstrækkeligt stabile hybridkomplekser med 35 templaten.

De her omtalte primere udvælges til at være "i alt væsentligt" komplementære til de forskellige strenge af hver specifik sekvens, der skal multipliceres. Dette betyder, at primerne må være tilstrækkeligt komplementære til at hybridisere med deres respek-40 tive strenge. Primersekvensen behøver derfor ikke at reflektere den eksakte sekvens af templaten. F.eks. kan et ikke-komplementært nukleotidfragment være tilhæftet til 5'-enden af primeren, medens resten af primersekvensen er komplementær til stren-

DK 175469 B1 I

gen. Alternativt kan ikke-komplementære baser eller længere sekvenser være anbragt I

spredt i primeren, forudsat at primersekvensen har tilstrækkelig komplementaritet I

med sekvensen af den streng, der skal multipliceres til at hybridisere dermed og der- I

ved danne en template for syntese af forlængelsesproduktet af den anden primer. I

Som anvendt her betegner "restriktionsendonukleaser" og "restriktionsenzymer" bak-

terieenzymer, der hver skærer dobbeltstrenget DNA ved eller nær en specifik nukleo- I

tidsekvens. I

10 Som anvendt her betegner "DNA-polymorfisme" det forhold, i hvilket to eller flere for- I

skellige nukleotidsekvenser kan forekomme på et bestemt sted i DNA’et. I

Betegnelsen "restriktionsfragmentlængdepolymorfi" ("RFLP”) betegner forskellene hos I

forskellige individer i længderne af restriktionsfragmenter, der dannes ved fordøjelse j I

15 med en speciel restriktionsendonuklease.

Den foreliggende opfindelse er rettet mod et første og andet enkeltstrenget oligo- nukleotid, der tillader multiplikation af enhver af en eller flere ønskede specifikke nu- ;

kleinsyresekvenser, der formodes at være tilstede i en nukleinsyre. Fordi store I I

20 mængder af en specifik sekvens kan produceres ved denne fremgangsmåde, kan den I

foreliggende opfindelse anvendes til forbedring af effektiviteten af DNA- eller mRNA- I

kloning og til multiplikation af en målsekvens for at lette påvisningen heraf. I

Generelt set omfatter fremgangsmåden, der kan udføres under anvendelse af oligo- I

25 nukleotiderne ifølge den foreliggende opfindelse, en kædereaktion for i eksponentielle I

mængder i forhold til antallet af de involverede omsætningstrin at producere mindst I

én specifik nukleinsyresekvens under forsætning af, at (a) enderne af den krævede

sekvens er kendt i tilstrækkelige detaljer til at oligonukleotider, som vil hybridisere I

med dem, kan syntetiseres og (b) at en lille mængde af sekvensen er tilgængelige til I

30 initiering af kædereaktionen. Produktet fra kædereaktionen vil være en adskilt nukle- I

insyreduplex med ender, der svarer til enderne af de anvendte specifikke primere. I

Enhver kilde af nukleinsyre kan i oprenset eller ikke-oprenset form anvendes som ud- I

gangsnukleinsyre eller -syrer, forudsat at den formodes at indeholde den ønskede, 35 specifikke nukleinsyresekvens. Fremgangsmåden kan f.eks. således anvende DNA el-

ler RNA, inklusiv mRNA, hvilket DNA eiier RNA kan være enkeltstrenget elier dobbelt- I

strenget. Desuden kan en DNA-RNA-hybrid, som indeholder en streng af hver, anven- I

des. En blanding af enhver af disse nukleinsyrer kan også anvendes, eller nukleinsy- I

rerne, der er produceret ud fra en heri tidligere anvendt multiplikationsreaktion, under I

40 anvendelse af den samme eller forskellige primere, kan anvendes således. Den speci-

fikke nukleinsyresekvens, der skal multipliceres, kan være blot en fraktion af et større I

molekyle eller kan være initielt til stede som et særskilt molekyle, således at den spe- I

7 DK 175469 B1 cifikke sekvens udgør hele nukleinsyren. Det er ikke nødvendigt, at sekvensen, der skal multipliceres, i begyndelsen er til stede i ren form; det kan være en mindre fraktion af en kompleks blanding, såsom en del af β-globingenet, der findes i hel human DNA, eller en del af en nukleinsyresekvens på grund af en speciel mikroorganisme, 5 hvilken organisme blot kan udgøre en meget lille del af en speciel biologisk prøve. Ud-gangsnukleinsyren kan indeholde mere end én ønsket specifik nukleinsyresekvens, som kan være den samme eller forskellig. Den foreliggende fremgangsmåde er derfor ikke blot anvendelig til produktion af store mængder af en specifik nukleinsyresekvens, men også til samtidig multiplicering af mere end én forskellig, specifik nuklein-10 syresekvens, der er lokaliseret på samme eller forskellige nukleinsyremolekyler.

Nukleinsyren eller -syrerne kan være opnået fra enhver kilde, f.eks. fra plasmider såsom pBR322, fra klonet DNA eller RNA, eller fra naturlig DNA eller RNA fra en hvilken som helst kilde, inklusiv bakterier, gær, vira eller højere organismer, såsom planter 15 eller dyr. DNA eller RNA kan være ekstraheret fra blod, vævsmateriale, såsom cho-rion-villi eller amniumceller ved forskellige metoder, såsom den, der beskrives af Maniatis et al., Molecular Cloning. (1982), 280-281.

En hvilket som helst specifik nukleinsyresekvens kan produceres under anvendelse af 20 de foreliggende oligonukleotider. Det er kun nødvendigt, at et tilstrækkeligt antal baser ved begge ender af sekvensen er kendt i tilstrækkelige detaljer, således at der kan fremstilles to oligonukleotidprimere, som vil hybridisere til forskellige strenge af den ønskede sekvens og på relative positioner langs sekvensen, således at et forlængelsesprodukt, der er syntetiseret fra en primer, kan tjene som template, når den er se-25 pareret fra dens template (komplement), for forlængelse af den anden primer i en nukleinsyre af defineret længde. Jo større viden man har om baserne ved begge ender af sekvensen, jo mere specifik kan primeren for målnukleinsyresekvensen gøres og jo mere effektiv kan fremgangsmåden derfor være. Det vil forstås, at betegnelsen "primer", som anvendt her, henviser til mere end én primer, navnlig i det tilfælde, hvor 30 der er nogen tvetydighed i informationen vedrørende endesekvenserne af fragmentet, der skal multipliceres. I tilfældet, hvor en nukleinsyresekvens f.eks. er udledt fra pro-teinsekvensinformation, vil en samling af primere, der indeholder sekvenser, som repræsenterer alle mulige codonvariationer baseret på degenereringen af den genetiske kode, anvendes for hver streng. Én primer fra denne samling vil være homolog med 35 enden af den ønskede sekvens, der skal multipliceres.

Oligonukleotidprimerne kan fremstilles under anvendelse af en hvilken som helst egnet fremgangsmåde, såsom f.eks. de ovenfor beskrevne phosphotriester- og phos-phodiestermetoder, eller automatiserede udførelsesformer deraf. I én således auto-40 matiseret udførelsesform er diethylphosphoramiditer anvendt som udgangsmateriale

og kan syntetiseres som beskrevet af Beaucage et al., Tetrahedron Let- ters (1981), I

22: 1859-1862. Én fremgangsmåde til syntetisering af oligonukleotider på et modifi- !

DK 175469 B1 I

ceret, fast baeremateriale er beskrevet i US patent nr. 4.458.066. Det er også muligt I

at anvende en primer, som er blevet isoleret fra en biologisk kilde (såsom ved en re- I

striktionsendonukleasefordøjelse). I

5 Den specifikke nukleinsyresekvens produceres ved anvendelse af nukleinsyren, der I

indeholder denne sekvens som en template. Hvis nukleinsyren indeholder to strenge, I

er det nødvendigt at separere strengene af nukleinsyren, før den kan anvendes som I

template, enten ved et separat trin eller samtidigt med syntese af primerforlængel- sesprodukterne. Denne strenge-separation kan udføres ved en hvilken som helst eg- 10 net denatureringsmetode, inklusiv fysiske, kemiske eller enzymatiske metoder. Én fy-

sisk metode til separering af strengene af nukleinsyren involverer opvarmning af nu- I

kleinsyren, til den er fuldstændig (>99%) denatureret. Typisk varmedenaturering kan I

omfatte temperaturer i området på fra 80 til 105°C i tidsperioder på fra ca. 1 til 10 I

minutter. Strenge-separation kan også induceres med et enzym fra den klasse af en- I

15 zymer, der kendes som helicaser, eller enzymet RecA, som har helicaseaktivitet, og I

som ved tilstedeværelse af riboATP vides at denaturere DNA. De egnede omsætnings- I

betingelser for separering af nukleinsyrestrengene ved hjælp af helicaser er beskrevet I

af Kuhn Hoffmann-Berling, CSH-Ouantitative Bioloav. 43: 63 (1978) og der gives en I

oversigt over metoderne ved anvendelse af RecA i C.Radding, Ann.Rev.Genetics.. 16: I

20 405-37 (1982). I

Hvis den oprindelige nukleinsyre, der indeholder sekvensen, der skal multipliceres, er I

enkeltstrenget, syntetiseres dens komplementære streng ved at tilføre en eller to I

oligonukleotidprimerne dertil. Hvis en passende enkelt-primer tilsættes, syntetiseres I

25 et primerforlængelsesprodukt under tilstedeværelse af primeren, et polymeriserings- I

middel og de 4 nedenfor beskrevne nukleotider. Produktet vil være delvis komple- I

mentært til den enkeltstrengede nukleinsyre og vil hybridisere med nukleinsyrestren- I

gen til dannelse af en duplex af strenge med ulige længde, som derefter kan separe- I

res til enkeltstrenge, som beskrevet ovenfor til dannelse af to enkelte, separerede

30 komplementære strenge. Alternativt kan to passende primere tilsættes til den enkelt- I

strengede nukleinsyre, og omsætningen udføres.

Hvis den oprindelige nukleinsyre udgør sekvensen, der skal multipliceres, vil det pro- I

ducerede primerforlængelsesprodukt (de producerede primerforlængelsesprodukter) I

35 være fuldstændig komplementært til strengene af den oprindelige nukleinsyre og vil I

hybridisere dermed til dannelse af en duplex af strenge med samme længde, som kan I

separeres til enkeltstrengede molekyler. I

Når de komplementære strenge af nukleinsyren eller -syrerne er separeret - hvad I

40 enten nukleinsyren oprindelig var dobbeltstrenget eller enkeltstrenget - er strengene I

parate til at blive anvendt som en template for syntesen af yderligere nukleinsyre- I

strenge. Denne syntese kan udføres ved at anvende en hvilken som helst egnet me- I

DK 175469 B1 9 tode. Generelt set foregår det i en puffret vandig opløsning, fortrinsvis ved et pH på 7-9, mest fortrinsvis ca. 8. Det foretrækkes, at et molært overskud (for klonet nukleinsyre almindeligvis 1000:1 primer: template, og for genomisk nukleinsyre almindeligvis ca. 106:1 primer: template) af de to oligonukleotidprimere tilsættes til 5 pufferen, der indeholder de separerede templatestrenge. Det skal imidlertid forstås, at mængden af komplementær streng ikke nødvendigvis, hvis den her angivne fremgangsmåde anvendes til diagnostiske anvendelser, således at mængden af primer i forhold til mængden af komplementær streng ikke kan bestemmes med sikkerhed. Af praktiske grunde vil mængden af tilsat primer imidlertid generelt set være i molært 10 overskud i forhold til mængden af komplementær streng (template), når sekvensen, der skal multipliceres, findes i en blanding af komplicerede, langkædede nukleinsyrestrenge. Et stort molært overskud foretrækkes til forbedring af fremgangsmådens effektivitet.

15 Deoxyribonukleosidtriphosphaterne dATP, dCTP, dGTP og TTP tilsættes også til synteseblandingen i tilstrækkelige mængder, og den resulterende opløsning opvarmes til ca. 90-100°C i fra ca. 1 til 10 minutter, fortrinsvis fra 1 til 4 minutter. Efter denne op- . . ,o .... , . ,, - ... °C, hvilket er foretrukket for varmningsperiode far opløsningen lov at afkøle til 20-40 ' primerhybridisering. Til den afkølede blanding tilsættes et polymeriseringsmiddel, og 20 omsætningen får lov at foregå under betingelser, som er kendte inden for fagområdet.

Denne synteseomsætning kan foregå ved fra stuetemperatur op til en temperatur over hvilken polymeriseringsmidlet ikke længere fungerer effektivt. Hvis DNA-poly-merasen således f.eks. anvendes som polymeriseringsmiddel, er temperaturen generelt det ikke højere end ca. 45°C. En mængde dimethylsulfoxid (DMSO) er fortrinsvis 25 til stede, hvilket er effektivt til påvisning af signalet, eller temperaturen er 35-40°C.

Mest foretrukken er tilstedeværelse af 5-10 volumenprocent DMSO, og temperaturen er 35-40°C. Til visse anvendelser, hvor sekvenserne, der skal multipliceres, er over 110 basepar lange fragmenter, såsom HLA DQ-α- eller -β-gener, tilsættes en effektiv mængde (f.eks. 10 volumenprocent) DMSO til multiplikationsblandingen, og omsæt-30 ningen udføres ved 35-40°C for at opnå påviselige resultater eller for at muliggøre kloning.

Polymeriseringsmidlet kan være en hvilket som helst forbindelse eller system., som vil fungere til udførelse af syntese af primerforlængelsesprodukter, inklusiv enzymer. Eg-35 nede enzymer til dette formål indbefatter f.eks. E.coli DNA polymerase I, Klenow fragment af E.coli DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, andre tilgængelige DNA-polymeraser, revers transkriptase og andre enzymer, inklusiv varmestabile enzymer, som vil lette kombinationen af nukleotiderne på en korrekt måde til dannelse af primerforlængelsesprodukter, som er komplementære til hver nuklein-40 syrestreng. Generelt set vil syntesen blive initieret ved 3'-enden af hver primer og forløbe i 5‘-retningen langs templatestrengen, indtil syntesen ender, frembringende molekyler af forskellige længder. Der kan imidlertid være midler, som initierer

DK 175469 B1 I

syntesen ved 5'-enden og forløber i den anden retning under anvendelse af den samme fremgangsmåde som ovenfor beskrevet.

Den nysyntetiserede streng og dens komplementære nukleinsyrestreng danner et H

5 dobbeltstrenget molekyle, som anvendes i de efterfølgende trin af fremgangsmåden. I I

det næste trin separeres strengene af det dobbeltstrengede molekyle under anven- I

delse af et hvilket som helst af de ovenfor beskrevne procedurer til dannelse af en- H

keltstrengede molekyler. I

10 Ny nukleinsyre syntetiseres på de enkeitstrengede molekyler. Yderligere inducerende I

middel, nukleotider og primere kan tilsættes, hvis det er nødvendigt, for at processen I

kan forløbe under de ovenfor foreskrevne betingelser. Syntesen vil igen blive initieret I

ved én ende af oligonukleotidprimerne og vil forløbe langs templatens enkelte streng

til frembringelse af yderligere nukleinsyre. Efter dette trin vil halvdelen af forlænget- I

15 sesproduktet bestå af den specifikke nukleinsyresekvens afgrænset af de to primere. I

Trinnene vedrørende strengeseparation og forlængelsesproduktsyntese kan gentages I

så ofte, som det behøves til frembringelse af en ønsket mængde af den specifikke I

nukleinsyresekvens. Som det vil blive beskevet i yderligere detaljer nedenfor, vil I

20 mængden af den producerede specifikke nukleinsyresekvens akkumulere på ekspon- I

entiel måde. I

Nar det ønskes at producere mere end én specifik nukleinsyresekvens ud fra den før- I

ste nukleinsyre eller blanding af nukleinsyrer, anvendes et passende antal af forskel- I

25 lige oligonukleotidprimere. Hvis f.eks. to forskellige specifikke nukleinsyresekvenser I

skal produceres, anvendes 4 primere. To af primerne er specifikke for én af de speci- I

fikke nukleinsyresekvenser, og de to andre primere er specifikke for den anden speci- I

fikke nukleinsyresekvens. På denne måde kan hver af de to forskellige specifikke se- I

kvenser produceres eksponentielt ved den foreliggende fremgangsmåde.

30 I

Den foreliggende opfindelse kan udføres på trinvis måde, hvor nye reagenser tilsættes I

efter hvert trin, eller samtidigt, hvor alle reagenser tilsættes i begyndelsestrinnet, el- I

ler delvist trinvis og delvis samtidigt, hvor frisk reagens tilsættes efter et givent antal I

trin. Hvis der anvendes en fremgangsmåde til strengeseparation der, som f.eks. var- I

35 me, vil inaktivere polymeriseringsmidlet, hvilket er tilfældet med et varmelabilt en- I

zym, er det nødvendigt at tilføre polymeriseringsmidlet igen efter hvert strenge-se- I

parationstrin. Den samtidige metode kan anvendes, når et antal oprensede kompo- I

nenter, inklusiv et enzymatisk middel såsom helicase, anvendes til strengeseparati- I

onstrinnet. I den samtidige fremgangsmåde kan reaktionsblandingen ud over nuklein- I

40 syrestrengen (-strengene), der indeholder den ønskede sekvens, også indeholde det I

strengeseparerende enzym (f.eks. helicase), en passende energikilde for det strenge- I

separerende enzym, såsom rATP, de fire nukleotider, oligonukleotidprimerne i molært I

n DK 175469 B1 overskud og det inducerende middel, f.eks. Klenow-fragment af E.coli DNA polymerase I. Hvis varme anvendes til denaturering i en samtidig proces kan der anvendes et varmestabilt, inducerende middel, såsom en termostabil polymerase, som vil fungere ved hævede temperaturer, fortrinsvis 65-90°C, afhængig af det inducerende middel, 5 ved hvilken temperatur nukleinsyrer vil består af enkelt- og dobbeltstrenge i ligevægt.

For mindre længder af nukleinsyre kan lavere temperaturer på ca. 50°C anvendes.

Den øvre temperatur vil afhænge af temperaturen, ved hvilken enzymet vil nedbrydes, eller den temperatur, over hvilken primerhybridisering vil ske i utilstrækkeligt omfang. Et sådant varmestabilt enzym er beskrevet, f.eks. af A.S.Kaledin et al., 10 Biokhimiva. 45. 644-651 (1980). Hvert trin af processen vil foregå sekventielt uanset den initielle tilstedeværelse af alle reagenserne. Yderligere materialer kan tilsættes om nødvendigt. Efter at en passende tid er forløbet til dannelse af den ønskede mængde af den specifikke nukleinsyresekvens, kan reaktionen standses ved inaktivering af enzymerne på en hvilken som helst kendt måde eller ved separering af komponenterne i 15 reaktionen.

Fremgangsmåden, der kan udfører under anvendelse af oligonukleotiderne ifølge den foreliggende opfindelse, kan udføres kontinuerligt. I én udførelsesform af en automatiseret proces kan reaktionen føres i cyklus gennem et denaturerende område, et rea-20 genstilsætningsområde og et omsætningsområde. 1 en anden udførelsesform kan enzymet, der anvendes til syntese af primerforlængelsesprodukterne, immobiliseres i en søjle. De andre omsætningskomponenter kan ved hjælp af en pumpe cirkuleres kontinuerligt gennem søjlen og en varmespiral i serie, og de producerede nukleinsyrer kan således blive denatureret gentagne gange uden inaktivering af enzymet.

25

Den foreliggende opfindelse demonstreres skematisk nedenfor, hvor dobbeltstrenget DNA, der indeholder den ønskede sekvens [S] bestående af komplementære strenge [S+]og [S'], anvendes som nukleinsyren. Under den første og hver efterfølgende omsætningscyklus vil forlængelse af hver oligonukleotidprimer på den oprindelige tem-30 plate producere ét nyt ssDNA-molekyleprodukt af ikke nærmere bestemt længde, som terminerer med kun en af primerne. Disse produkter, der herefter henvises til som "lange produkter", vil akkumulere på liniær måde, dvs. at mængden, der er til stede efter et vilkårligt antal cyklusser, vil være proportional med antallet af cyklusser. 1 2 3 4 5 6

De lange produkter, der således er produceret, vil virke som templater for den ene 2 eller den anden af oligonukleotidprimerne i efterfølgende cyklusser og vil producere 3 molekyler af den ønskede sekvens [S4] eller [S']. Disse molekyler vil også fungere 4 som templater for den ene eller den anden af oligonukleotidprimerne, frembringende 5 yderligere [S+] og [S‘], og en kædereaktion kan således vedligeholdes, som vil resul- 6 tere i akkumuleringen af [S] med en eksponentiel hastighed i forhold til antallet af cyklusser.

I DK 175469 B1 I

I 12 I

I Biprodukter dannet ved andre oligonukleotidhybridiseringer end de tilsigtede er ikke I

I selv-katalytiske (undtagen i sjældne tilfælde) og akkumulerer således med liniær ha- I

I stighed. I

I 5 Den specifikke sekvens, der skal multipliceres, (S) kan angives skematisk som: I

I [S+] 5’ AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3' I

I [S'] 3' ΠΊΊ rrriTlYYYYYVYYYYGGGGGGGGGG 5' I

I 10 De passende oligonukleotidprimere ville være: I

I Primer 1: GGGGGGGGGG I

I Primer 2: AAAAAAAAAA I

I 15 således at hvis DNA, der indeholder [S] I

I .. .ZZZZZZZZZZZZZZZZAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCZZZZZ2ZZZZ2ZZZ22... I

I ...ζζζζζζζζζζζζζζζζΙΊΊ 11111 ΠYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz... I

I 20 separeres i enkeltstrenge og dets enkeltstrenge hybridiseres til primere 1 og 2, kan de I

I efterfølgende forlængelsesreaktioner katalyseres ved DNA-polymerase under tilstede- I

I værelse af de fire deoxyribonukleosidtriphosphater: I

I 3' 5' I

I 25 forlængelse <-GGGGGGGGGG primer 1 I

I ....zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXX CCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz.... I

I + I

oprindelig template-streng

I oprindelig template-streng I

I 30 I

I ....zzzzzzzzzzzzzzzzi 111111 li j yYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzzz.... I

I primer 2 AAAAAAAAAA-> forlængelse I

I 5' 3' I

I 35 Efter denaturering af de to dannede duplexer er produkterne: I

I 3' 5' I

I ....zzzzzzzzzzzzzzzzrrrm 11 π yyyyyyyyyygggggggggg I

I nylig syntetiseret langt produkt 1 I

5’ DK 175469 B1 13 —ZZZZZZZZZZZZZZZZAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCZZZZZZZZZZZZZZZZ....

oprindelig templatestreng* 5 3* ....ZZZZZZZZZZZZZZZZl I iTl I I I I I VYYYYYYYYYGGGGGGGGGGZZZZZZZZZZZZZZZZ.... oprindelig templatestreng* 5’ 3' 10 AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCZZZZZZZZZZZZZZZZ....

nylig syntetiseret langt produkt 2

Hvis disse 4 strenge får lov at rehybridisere med primere 1 og 2 i den næste cyklus, vil polymeriseringsmidlet katalysere de følgende reaktioner: 15

Primer 2 5' AAAAAAAAAA-» forlængelse hertil 3'....ZZZZZZZZZZZZZZZZl ΓΙ'ΠΙΙΙ I lYYYYYYYYYY6GGGGG6GGG 5' nyligt syntetiseret langt produkt 1 20 forlængelse < ....... - —GGGGGGGGGG 5’ primer 1 5'... .ZZZZZZZZZZZZZZZZAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCZZZZZZZZZ... .3' oprindelig templatestreng*

Primer 2 5' AAAAAAAAAA---—» forlængelse 25 3'...ZZZZZZZZZZZZZZZZl ITI I I II I I YYYYYYYYYYGGGGGGGGGGZZZZZZZ....5' oprindelig templatestreng forlængelse hertil <-GGGGGGGGGG 5’ primer 1 5* AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzz....3’ 30 nyligt syntetiseret langt produkt 2

Hvis strengene af de fire duplexer ovenfor separeres, findes følgende strenge: 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3' 35 nyligt syntetiseret [S+] 3’ ... .zzzzzzzzzzzzzzzzTTl l'llil ITYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5’ første-cyklus-synthetiseret langt produkt 1 40 3’ .... zzzzzzzzzzzzzzzzTTl ΓΙ Μ I I TYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5’

I DK 175469 B1 I

I I

I nyligt syntetiseret langt produkt 1 I

I 5‘ ... .zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzz....3' I

I I

oprindelig templatestreng I

Is I

I 5’ AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....3‘ I

I nyligt syntetiseret langt produkt 2 I

I 3'....ζζζζζζζζζζζζζζζζΤΤΓΓΙ 111 11YYYVYYYYYYGGGGGGGGGGZZZZZZZZZZZZZZ....5' I

I 10 oprindelig templatestreng I

I 3’ ΤΙΤΓΠΤΙ 11YYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5’ I

I nyligt syntetiseret [S'] I

I 15 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCZZZZZZZZZZZZZZZZ....3’ I

I første-cyklus-syntetiseret langt produkt 2 I

Det ses, at hver streng, som ender med oligonukleotidsekvensen af én primer og den I

I komplementære sekvens af den anden, er den specifikke nukleinsyresekvens [S], som I

I 20 det ønskes at producere. I

I Trinnene i denne fremgangsmåde kan gentages uendeligt, og er kun begrænset af I

I mængden af primere 1 og 2, polymeriseringsmidlet og tilstedeværende nukleotider. I

I Antallet af cyklusser anvendt til påvisning er de, der kræves til frembringelse af et på- I

I 25 viselig signal, en mængde, som f.eks. vil afhænge af prøvens natur. Hvis f.eks. prøven I

er ren eller fortyndet, kan færre cyklusser være krævet, end hvis den er en kompleks I

I blanding. Hvis prøven er human genomisk DNA er antallet af cyklusser fortrinsvis fra I

I ca. 10 til 30. I

I 30 Mængden af oprindelig nukleinsyre forbliver konstant i hele fremgangsmåden, fordi I

I den ikke replikeres. Mængden af de lange produkter forøges liniært, fordi de kun pro- I

I duceres ud fra den oprindelige nukleinsyre. Mængden af den specifikke sekvens for- I

I øges eksponentielt. Den specifikke sekvens vil således blive den dominerende. Dette I

vises i den følgende tabel, som indicerer de relative mængder af de teoretiske typer, I

I 35 der er til stede efter n cyklusser, idet 100% effektivitet antages for hver cyklus: I

DK 175469 B1 15

Antal af dobbeltstreng efter 0 til n cykler

Specifik

Cyklus antal Template Lange produkter sekvens (S) 5 0 1 1 1 1 0 2 12 1 3 1 3.4 5 1 5 26 10 10 1 10 1013 15 1 15 32.752 20 1 20 1.048.555 η 1 n (2n-n-l) 15 Nar en enkeltstrenget nukleinsyre anvendes som templaten dannes kun l langt produkt pr. cyklus.

Oligonukleotiderne heri kan anvendes til kloning af en speciel nukleinsyresekvens for indføjelse i en egnet ekspressionsvektor. Vektoren kan derefter anvendes til transfor-20 mering af en passende værtsorganisme til dannelse af genproduktet af sekvensen ved standardmetoder af rekombinant DNA teknologi.

Normalt vil sådan kloning enten involvere direkte ligering i en vektor eller tilsætningen af oligonukleotidlinkere efterfulgt af restriktionsenzymspaltning. Begge disse metoder 25 involverer imidlertid den ineffektive stump-endede ligeringsreaktion. Ingen af teknikkerne vil desuden styre orienteringen eller multipliceringen af indføjelsen af det multiplicerede produkt i kloningsvektoren.

Multiplikationsprocessen, der kan udføres under anvendelse af oligonukleotiderne heri, 30 kan give en blanding af nukleinsyrer, hidrørende fra den oprindelige template-nuklein-syre, de forventede målmultiplikationsprodukter og forskellige ikke-mål-baggrunds-produkter. Det multiplicerede produkt kan også være en blanding, hvis den oprindelige template-DNA indeholder multiple målsekvenser, såsom i et heterozygotisk diploidgenom, eller når der er en familie af beslægtede gener.

35

De heri beskrevne primere kan være modificeret til at hjælpe til hurtig og specifik kloning af blandingen af DNA, der produceres ved multiplikationsreaktion. I en sådan modifikation er den samme eller forskellige restriktionssteder inkorporeret ved 5’-en-derne af primerne, hvilket resulterer i restriktionssteder ved de to ender af det multi-40 plicerede produkt. Når det udskæres med de passende enzymer, kan det multiplicerede produkt derefter let indsættes i plasmid- eller virusvektorer og klones. Denne I DK 175469 B1

I 16 I

I kloning tillader analyse eller ekspression af individuelle multiplicerede produkter, ikke I

en blanding. I

I Skønt det samme restriktionssted kan anvendes for begge primere, tillader anvendel* I

I 5 sen af forskellige restriktionssteder indsætning af produktet i vektoren med en specifik I

I orientering og undertrykker multiple indsætninger såvel som indsætninger, der stam- I

I mer fra multiplikationer, der kun er baseret på en af de to primere. Den specifikke I

I orientering er nyttig, når der klones i enkeltstrengsekventerende vektorer, når enkelt- I

I strenghybridiseringsprober anvendes eller når det klonede produkt udtrykkes. I

I 10 I

Én metode til fremstilling af primerne er at vælge en primersekvens, som adskiller sig I

I minimalt fra målsekvensen. Områder, i hvilke hver af primerne skal placeres, bliver I

screenet for homologi til restriktionssteder, der er passende for den ønskede vektor. I

I Målsekvensen "CAGTATCCGA..." adskiller sig f.eks. med kun en base fra en, der inde- I

I 15 holder et BamHI-sted. En primersekvens udvælges til at passe målet præcist ved dets I

3’ ende og at indeholde den ændrede sekvens og restriktionssted nær dets 5’-ende I

(f.eks. "CAGgATCCGA...", hvor det lille bogstav symboliserer en enhed, der ikke pas- I

I ser med målsekvensen). Denne minimalt ændrede sekvens vil ikke interferere med I

primerens evne til at hybridisere til den originale målsekvens og til initiering af poly- I

I 20 meriseringen. Efter den første multiplikationscyklus kopieres primeren, bliver selv I

I målet og parrer eksakt med nye primere. Efter multiplikationsprocessen spaltes pro- I

I dukterne med passende restriktionsenzymer, der eventuelt er separeret fra ligations- I

I inhibitorer, såsom nukleotidtriphosphater og salte ved passage over en afsaltende I

I søjle eller molekylvægtkromatografisøjle og indsættes ved ligering i en klonende vek- I

25 tor, såsom bakteriofag M13. Genet kan derefter sekventeres og/eller udtrykkes under I

I anvendelse af kendte metoder. I

I Den anden metode til fremstilling af primerne involverer at tage 3'-enden af primerne I

fra målsekvensen og tilsætte det ønskede restriktionssted (-steder) til 5'-enden af I

30 primeren. For det ovenfor anførte eksempel kunne et Hindlll-sted tilsættes til dan- I

nelse af sekvensen "cgaagcttCAGTATCCGA...", hvor små bogstaver er som beskrevet I

ovenfor. De tilsatte baser ville ikke bidrage til hybridiseringen i den første multiplikati- I

onscyklus, men ville passe i efterfølgende cyklusser. De endelige multiplicerede pro- I

I dukter udskæres derefter med restriktionsenzym (-enzymer), klones og udtrykkes I

I 35 som beskrevet ovenfor. Genet, der multipliceres, kan f.eks. være human β-hæmoglo- I

I bin eller human HLA DQ, DR eller DP-α og -β-gener. I

I Oligonukleotiderne heri kan desuden anvendes til in vitro mutagenisering. Oligode- I

I oxyribonucleotidprimerne behøver ikke at være præcis komplementære til DNA-se- I

40 kvensen, som skal multipliceres. Det er blot nødvendigt, at de er i stand til at hybridi- I

I sere tilstrækkeligt godt til sekvensen til at blive forlænget af polymeraseenzymet eller I

I ved et hvilket som helst andet anvendt inducerende middel. Produktet af en polyme- I

I / I

DK 175469 B1 17 rasekædereaktion, hvor de anvendte primere ikke er præcis komplementære til den oprindelige template vil indeholde sekvensen af primeren snarere end sekvensen af templaten, og derved indføre en in vitro mutation. I yderligere cyklusser vil denne mutation blive multipliceret med en ubegrænset effektivitet, fordi ingen yderligere 5 ikke-parrede primerreaktioner kræves. Den således fremstillede mutant kan indsættes i en passende vektor ved molekylærbiologiske standardteknikker og kan eventuelt overføre mutantegenskaber til denne vektor, såsom produktionspotentialet af et ændret protein.

10 Fremgangsmåden til fremstilling af en ændret DNA-sekvens som beskrevet ovenfor kan gentages på det ændrede DNA under anvendelse af forskellige primere for således at inducere yderligere sekvensændringer. På denne måde kan en serie af muterede sekvenser gradvis produceres, hvori hver ny tilføjelse til serierne kan adskille sig fra den forrige i ringe grad, men fra den oprindelige DNA-kildes sekvens i stadig større 15 grad. På denne måde kan der i sidste ende laves ændringer, som ikke er mulige i et enkelt trin på grund af den manglende funktionsevne hos en meget alvorlig fejlparrende primer.

Primeren kan desuden som en del af dens sekvens indeholde en ikke-komplementær 20 sekvens, forudsat at en tilstrækkelig mængde af primeren indeholder en sekvens, som er komplementær til strengen, som skal multipliceres. En nukleotidsekvens, som ikke er komplementær til templatesekvensen (såsom f.eks. en promotor, linker, kodende sekvens osv) kan f.eks. blive tilføjet til 5'-enden af en eller begge primerne og derved tilhæftet til produktet fra multiplikationsprocessen. Efter at forlængelsesprimeren er 25 tilsat gennemføres tilstrækkeligt mange cyklusser til opnåelse af den ønskede mængde af ny template, der indeholder den ikke-komplementære nukleotidindføjelse. Dette tillader produktion af store mængder af de kombinerede fragmenter på relativ kort tid (f.eks. to timer eller mindre) under anvendelse afen simpel teknik.

30 Oligonukleotiderne heri kan desuden anvendes til at syntetisere et nukleinsyrefrag-ment ud fra et eksisterende nukleinsyrefragment, som er kortere end dets produkt (kaldet kernesegmentet) under anvendelse af visse primere, hvis 3'-ender er komplementære til eller i alt væsentligt komplementære til 3’-enderne af enkeltstrengene, som er frembragt ved at separere strengene af de oprindelige, kortere nukleinsyre-35 fragmenter, og hvor 5'-enderne af primerne indeholder sekvensinformation, som skal tilføjes til kernesegmentet. Fremgangsmåden omfatter: (a) behandling af strengene af det eksisterende fragment med 2 oligonukleotid-primere under sådanne betingelser, hvor der syntetiseres et forlængelsesprodukt af 40 hver primer, som er komplementær til hver nukleinsyrestreng, og hvor primerne udvælges således, at de i alt væsentligt er komplementære til 3’-enden af hver streng af det eksisterende fragment, således at forlængelsesproduktet, der er syntetiseret fra I DK 175469 B1 I 18

en primer, når det er adskilt fra dets komplement, kan tjene som en template for I

syntese af forlængelsesproduktet af den anden primer, og hvor hver primer i dets I

5'-ende indeholder en sekvens af nukleotider, som ikke er komplementære til det I

eksisterende fragment, og som svarer til de to ender af nukleinsyrefragmentet, som I

H 5 skal syntetiseres; I

H (b) adskillelse af primerforlængelsesprodukterne fra templaterne, på hvilke de blev I

syntetiseret, til frembringelse af enkeltstrengede molekyler; og I

10 (c) behandling af de enkeltstrengede molekyler, der frembragtes i trin (b), med I

primerne fra trin (a) under sådanne betingelser, at et primerforlængelsesprodukt I

syntetiseres under anvendelse af hver af enkeltstrengene, der er frembragt i trin (b), I

som en template, for således at frembringe to intermediære, dobbeltstrengede nukle- I

I insyremolekyler, hvori der i hver er blevet inkorporeret nukleotidsekvensen, der er til I

I 15 stede i 5’-enden af en af oligonukleotidprimerne, og to dobbeltstrengede nukleinsyre- I

molekyler af fuld længde, hvor der i hver af disse er blevet inkorporeret nukleotidse- I

I kvensen, der er til stede i 5'-enderne af begge oligonukleotidprimerne; I

(d) gentagelse af trinnene (b) og (c) et tilstrækkeligt antal gange til frembringelse I

I 20 af de dobbeltstrengede molekyler af fuld længde i en effektiv mængde; I

I (e) behandling af strengene af produktet ifølge trin (d) med to primere for således I

at forlænge produktet fra trin (d) i begge ender; og I

I 25 (f) gentagelse af trinnene (a)-(d) under anvendelse af produktet fra trin (d) som I

I kernefragmentet og to oligonukleotidprimere, som er komplementære eller i alt vae- I

sentligt komplementære til 3’-enderne af enkeltstrengene, som er produceret ved at I

I separere strengene af produktet fra trin (d). I

I 30 Trinnene (b) og (c) gentages så ofte som nødvendigt, almindeligvis mindst 5 gange, til I

frembringelse af den krævede mængde af det dobbeltstrengede produkt af fuld I

I længde til syntetisering af slutproduktet (dvs. den effektive mængde). Kernesegmen- I

tet kan yderligere opnås som produktet af en tidligere multiplikationscyklus. Produktet I

I frembragt i trin (d) kan oprenses før en ny forlængelses- og multiplikationscyklus eller I

I 35 kan anvendes direkte ved at anvende reaktionsblandingen, der indeholder produktet. I

Hvis 3’-enderne af primerne ikke er præcis komplementære til 3'-enderne af de en- I

kelte strenge af den oprindelige, kortere nukleinsyre, vil kernefragmentet af produktet I

I ikke være præcis det samme som sekvensinformationen, der er nedlagt i den oprinde- I

I 40 lige, kortere nukleinsyre. Mutanter af den oprindelige nukleinsyre kan derfor laves ved I

I at anvende primere, som i alt væsentligt er komplementære ved deres 3’-ender til I

I 3'-enderne af enkeltstrengene af den oprindelige, kortere nukleinsyre. I

DK 175469 B1 19

Hvis restriktionsstedlinkere inkorporeres i primerne, kan de multiplicerede, dobbelt- j strengede produkter fordøjes med de passende restriktionsenzymer og ligeres direkte i en M13-vektor til hurtig kloning og sekventering. M13-plaques, der indeholder de 5 specifikke multiplicerede målsekvenser, kan identificeres ved at hybridisere plaque-løftefiltrere med en probe, som er specifik for målsekvensen.

Oligonukleotiderne heri kan også anvendes til at muliggøre påvisning og/eller karakterisering af specifikke nukleinsyresekvenser, der er associeret med infektiøse syg-10 domme, genetiske lidelser eller cellulære sygdomme, såsom kræft, f.eks. oncogener.

Multiplicering er nyttig, når den mængde nukleinsyre, der er tilgængelig for analyser, er meget lille, som f.eks. ved prænatal diagnose af seglcelleanæmi under anvendelse af DNA opnået fra føtale celler. Multiplikation er navnlig nyttig, hvis en sådan analyse skal udføres på et lille prøvemateriale under anvendelse af ikke-radioaktive påvis-15 ningsmetoder, som måske er iboende insensitiv, eller hvor radioaktive metoder anvendes, men hvor hurtig påvisning er ønskelig.

For denne opfindelses formål kan genetiske sygdomme omfatte specifikke deletioner og/eller mutationer i genomisk DNA fra enhver organisme, såsom f.eks. seglcelle-20 anæmi, cystisk fibrose, a-thalasssemi, β-thalassæmi og lignende. Seglcelleanæmi kan let påvises ved oligomerrestriktionsanafyse eller en RFLP-lignende analyse efter multiplikation af den passende DNA-sekvens ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. α-Thalassæmi kan påvises ved fravær af en sekvens, og β-thalassæmi kan påvises ved tilstedeværelse af et polymorft restriktionssted tæt koblet til en mutation, som 25 forårsager sygdommen.

Alle disse genetiske sygdomme kan påvises ved multiplicering af den passende sekvens og analyse af det ved Southern blot teknik uden anvendelse af radioaktive prober. I en sådan fremgangsmåde kan f.eks. en lille prøve af DNA fra f.eks. amnionvæ-30 ske indeholdende et meget lavt niveau af den ønskede sekvens multipliceres, skæres med et restriktionsenzym og analyseres med Southern blotting teknik. Anvendelsen af ikke-radioaktive prober lettes ved det høje niveau af det multiplicerede signal.

I en anden udførelsesform kan en lille prøve af DNA multipliceres til et passende ni-35 veau, og derefter kan der udføres en yderligere cyklus af forlængelsesreaktioner, hvor nukleotidderivater, som er let påviselige (såsom 32P-mærkede eller biotinmærkede nukleosidtriphosphater) inkorporeres direkte i slut-DNA-produktet, som kan analyseres ved restriktionsanalyse og elektroforetisk separation eller en hvilken som helst anden passende metode. Et eksempel på denne teknik i et modelsystem demonstreres 40 på figur 5.

I DK 175469 B1 I 20

Η I endnu en udførelsesform, der er demonstreret i et modelsystem i figur 3, kan nu- I

kleinsyren udsættes for en særlig restriktionsendonuklease forud for multipliceringen. I

H Eftersom en sekvens, som er blevet skåret op, ikke kan multipliceres, medfører fore- I

komsten af et multipliceret fragment fraværet af et sted for endonukleasen i den mul- I

5 tiplicerede sekvens, på trods af forudgående restriktion af DNA-prøven. Tilstedeværel- sen eller fraværet af en multipliceret sekvens kan påvises ved en passende metode.

En praktisk anvendelse af denne teknik kan illustreres ved dets anvendelse til at lette påvisningen af seglcelleanæmi ved hjælp af den her og i Saiki et al., Biotechnology 10 2:1008-1012 (1985) beskrevne ofigomerrestriktionsteknik. Seglcelleanæmi er en hæmoglobinsygdom, som er forårsaget af en ændring af et enkelt basepar i den 6. codon af β-globingenet. Figur 6 viser sekvenserne af normale β-globingener og seglcelle-p-globingener i området for deres polymorfisme, hvor de enkelte streger markerer placeringen af et Ddel-sted. der kun er til stede i det normale gen, og hvor 15 dobbeltstregen markerer placeringen af et Hinfl-sted. som er ikke-polymorft og således er til stede i både normale alleler og seglcellealleler. Figur 7 viser otigomer- restriktionsprocessen for normal β-globin DNA under anvendelse af en probe, der spænder over begge restriktionssteder, og som er mærket, hvor der er angivet en stjerne. (Proben er fortrinsvis mærket i den ende, som er færre basepar fra restrik- 20 tionsstedet end i den anden ende af proben). DNA'et, der er multipliceret som anvist heri, denatureres og anneales til den mærkede probe. Multiplikationen kan udføres ved hævede temperaturer (35-40°C) under tilstedeværelse af dimethylsulfoxid til minimisering af dannelsen af sekundær struktur. Enzymet Ddel spalter DNA’et ved det H gendannede Ddel-sted og danner en mærket octamer. Under de betingelser, som er I 25 anvendt i prøven, er octameren kort nok til at dissociere fra duplexen. En efterføl- I gende tilsætning af enzymet Hinfl har ingen virkning på den nu enkeltstrengede I octamer. Figur 8 viser den samme proces anvendt på seglcelleallelet af β-globin DNA.

I Enzymet Ddel kan ikke spalte duplexen, der er dannet af det multiplicerede DNA og I den mærkede probe, fordi A-A baseparret fejlparrer. Enzymet Hinfl begrænser imid- I 30 lertid hybriden, og der produceres en mærket trimer. 1 praksis kan metoden diag- I nosticere DNA’et hos et individ som enten homozytisk for vildtypen, homozygotisk for I seglcelletypen eller heterozygotisk bærer af seglcelleanlægget, eftersom et specifikt I signal er forbundet med tilstedeværelsen af hvert allel. Anvendelse af den ovenfor I beskrevne metode til multiplicering af den relevante sekvens tillader hurtig analyse af 35 et gen i enkelt kopi under anvendelse af en probe med kun et enkelt 32P-mærke.

I Forskellige infektiøse sygdomme kan diagnosticeres ved tilstedeværelsen i kliniske I prøver af specifikke DNA-sekvenser, der er karakteristiske for mikroorganismen, der I forårsager infektionen. Disse inkluderer bakterier, såsom Salmonella, Chlamydia, 40 Neisseria, virus, såsom hepatitisvirus, og parasitter, såsom Plasmodium, der forårsager malaria. US patent nr. 4.358.535 udstedt til Falkow beskriver anvendelsen af specifikke DNA-hybridiseringsprober til diagnose af infektiøse sygdomme. Et iboende DK 175469 B1 21 problem i Falkow-proceduren er, at et relativt lille antal pathogene organismer kan være til stede i en klinisk prøve fra en inficeret patient, og at DNA'et, der ekstraheres fra disse, kan udgøre en kun meget lille fraktion af det totale DNA i prøven. Specifik multiplicering af mistænkte sekvenser forud for immobiliserings- og hybridiseringspå-5 visning af DNA-prøverne kunne i bøj grad forøge følsomheden og specificiteten af disse procedurer.

Kliniske rutineanvendelser af DNA-prober til diagnose af infektiøse sygdomme ville blive betragteligt simplificeret, hvis ikke-radioaktivt mærkede prober kunne anvendes 10 som beskrevet i EP 63.879 til Ward. I denne fremgangsmåde påvises biotin-indeholdende DNA-prober med chromogene enzymer, der er koblet til avidin eller biotinspecifikke antistoffer. Denne påvisningstype er bekvem, men relativ ufølsom. Kombinationen af specifik DNA-multiplicering ved den foreliggende fremgangsmåde og anvendelse af stabilt mærkede prober kunne tilvejebringe den nemhed og følsomhed, som 15 kræves for at gøre Falkow- og Ward-fremgangsmåderne nyttige i klinisk rutinearbejde.

Desuden kan proben være en biotinyleret probe, hvori biotinet er påhæftet til en afstandsarm med formlen: 20

H

-y-(ch2)2-o-[ (CH2)xo^-ch2ch2-n-25 hvor Y er 0, NH eller N-CHO, x er en tal fra 1 til 4, og y er et tal fra 2 til 4. Afstandsarmen er selv påhæftet til en psoralenenhed med formlen: CH3 CH2- 30 / J J '1 3 0— CH3 35 Psoralenenheden interkalerer ind i og krydsforbinder en probe med "hullet cirkel" som beskrevet af Courage-Tebbe et al., Biochem. Biophvs. Acta (1982) 697, 1-5, hvori det enkeltstrengede hybridiseringsområde af den hullede cirkel spænder over området, der er indeholdt i primerne. 1

Oligonukleotiderne heri kan også anvendes til fremstilling af tilstrækkelige mængder af DNA ud fra et humant gen i enkelt kopi, således at påvisning af en simpel ikke-spe- I DK 175469 B1 I 22

I cifik DNA-farvning, såsom ethidiumbromid, kan udføres for således at udføre en DNA- I

I diagnose på direkt måde. I

Ud over at påvise infektiøse sygdomme og sygelige abnormaliteter i genomet hos or- H 5 ganismer, kan oligonukleotiderne som beskrevet her også anvendes til påvisning af I DNA-polymorfisme, som ikke behøver at være forbundet med nogen sygelig tilstand.

I De efterfølgende eksempler gives til illustration af opfindelsen og har ikke til hensigt I at begrænse denne på nogen måde. I disse eksempler er alle procenter vægtprocen- 10 ter, hvad angår faste stoffer, og volumenprocenter, hvad angår væsker, og alle tem- peraturer er i grader Celsius med mindre andet angives.

Eksempel 1

En 25-baseparsekvens med nukletidsekvensen 15 I 5' CCTCGGCACCGTCACCCTGG ATGCT 3’ 3’ GGAGCCGTGGCAGTGGGACCTACGA 5’ I indeholdt på et 47 basepar Fokl-restriktionsfragment af pBR322, som var opnået fra 20 ATCC, blev fremstillet som følger. En Fokl-fordøjelse af pBR322 indeholdende det I 47 bp lange fragment blev fremstillet ved at fordøje pBR322 med Fokl i overensstem- I melse med betingelserne, som er foreslået af leverandøren, New England Biolabs Inc.

I Primerne, som blev anvendt, var 5’ d(CCTCGGCACCG) 3' og 5' d(AGCATCAGGGTG) 3' ] og blev fremstillet under anvendelse af traditionelle metoder. De efterfølgende

I 25 ingredienser tilsattes til 33 μΙ puffer, som bestod af 25 mM kaliumphosphat, 10 mM

I magnesiumchlorid og 100 mM natriumchlorid ved pH 7,5: 2433 pmol af hver af de I ovenfor beskrevne primere, 2,4 pmol af det Fokl-fordøjede pBR322, 12 nmol dATP, I 22 mmol dCTP, 19 nmol dGTP og 10 nmol TTP.

30 Blandingen blev opvarmet til 85eC i 5 minutter og fik lov at afkøle til omgivelsestemperatur. Fem enheder Klenow-fragment af E.coli DNA polymerase I tilsattes, og temperaturen blev holdt i 15 minutter. Efter denne tid blev blandingen igen opvarmet til 85°C i 5 minutter og fik lov at afkøle. Fem enheder Klenow-fragment blev igen tilsat, og reaktionen blev udført i 15 minutter. Opvarmnings-, afkølings- og syntesetrinnene 35 blev gentaget yderligere 11 gange.

Efter den sidste gentagelse blev en 5 μΙ delprøve udtaget fra reaktionsblandingen.

Denne blev opvarmet til 85°C i 3 minutter og fik lov at afkøle til omgivelsestemperatur. 12,5 pmol a-P32-deoxycytidintriphosphat og 5 enheder Klenow-fragment blev til-40 sat, og reaktionen fik lov at forløbe i 15 minutter. De mærkede produkter blev undersøgt ved polyacrylamidgelelektroforese. Fokl-fordøjelsen blev mærket på lignende måde og tjente som kontrol og molekylvægtmarkører. Det eneste stærkt mærkede DK 175469 B1 23 bånd, der var synligt efter de 13 cyklusser, var den tilsigtede 25-basepar lange sekvens.

Eksempel 2 5 Sekvensen, som ønskedes multipliceret, var en 94 basepar lang sekvens, der var indeholdt i det humane p-globingen og spændte over Mstll-stedet, der er involveret i seglcelleanæmi. Sekvensen har den i figur 1 viste nukleotidsekvens.

I. Syntese af primere 10 Følgende to oligodeoxyribonukleotidprimere fremstilledes ved den nedenfor beskrevne metode: 5’ CACAGGGCAGTAACG 3' Primer A og

15 5' TTTGCTTCTGACACA 3' Primer B

Automatiseret synteseprocedure: Diethylphosphoramiditer, der er syntetiseret ifølge Beaucage og Caruthers (Tetrahedron Letters (1981) 22:1859-1862) blev kondenseret sekventielt til et nukleosidderivatiseret styret poreglasbæremateriale under anven-20 delse af en Biosearch SAM-1. Fremgangsmåden inkluderede detritylering med tri-chloreddikesyre i dichlormethan, kondensering under anvendelse af benzotriazol som aktiverende protondonor og afdækning (eng: capping) med eddikesyreanhydrid og di-methylaminopyridin i tetrahyd rof uran og pyridin. Cyklustid var ca. 30 minutter. Udbytte ved hvert trin var i alt væsentligt kvantitativt og blev bestemt ved opsamling og 25 spektroskopisk undersøgelse af dimethoxytritylalkohol frigjort under detritylering.

Oligodeoxyribonukleotid-afbeskyttelses- og -oprensningsprocedurer: Den faste bæremateriale blev fjernet fra søjlen og eksponeret til 1 ml koncentreret ammoniumhydroxid ved stuetemperatur i 4 timer i et lukket rør. Bærematerialet blev derefter fjernet 30 ved filtrering, og opløsningen, der indeholdt det delvis beskyttede oligodeoxynukleo-tid, blev opvarmet til 55°C i 5 timer. Ammoniak blev fjernet, og resten blev påsat en præparativ polyacrylamidgel. Elektroforese blev udført ved 30 volt/cm i 90 minutter, hvorefter båndet, der indeholdt produktet, blev identificeret ved UV-skygning af en fluorescensplade. Båndet blev udskåret og elueret med 1 ml destilleret vand natten 35 over ved 4°C. Denne opløsning blev påført en Altech RP18 søjle og elueret med en 7-13% gradient af acetonitril i 1% ammoniumacetatbuffer ved pH 6,0. Eluatet blev målt ved UV-absorption ved 260 nm, og en passende fraktion opsamledes, kvantificeredes ved UV-absorbans i et fastlagt volumen og inddampedes til tørhed ved stuetemperatur i en vakuumcentrifuge.

Karakterisering af oligodeoxyribonukleotider: Testalikvoter af de oprensede oligo-nukleotider blev mærket med 32P med polynukleotidkinase og γ-32Ρ-ΑΤΡ. De mærkede 40

I DK 175469 B1 I

I 24 I

I forbindelser blev undersøgt ved autoradiografi af 14-20% polyacrylamidgeler efter I

elektroforese i 45 minutter ved 50 volt/cm. Denne fremgangsmåde verificerer mole- I

I kylvægten. Basesammensætningen blev bestemt ved fordøjelse af oligodeoxyribo- I

nukleotidet til nukleosider under anvendelse af gift-diesterase og bakteriel, alkalisk I

I 5 phosphatase og efterfølgende separation og kvantificering af de afledte nukleosider I

I under anvendelse af en HPLC-søjle med omvendt fase og en 10% acetonitril, 1% am- I

I moniumacetat mobil fase. I

I II. DNA-kilde I

I 10 I

I A. Ekstraktion af hel, human vildtvpe-DNA I

Human genomisk DNA, der er homozygotisk for normal β-globin, blev ekstraheret fra I

cellelinien Molt4 (opnået fra Human Genetic Mutant Cell Repository og identificeret I

som GM2219c) under anvendelse af teknikken beskrevet af Stetler et al., Proc.Natl. I

I 15 Acad.Sci. (19821 79:5966-5970. I

B. Konstruktion af klonede olobinaener I

Et 1,9 kb langt BamHI-fragment af det normale β-globingen isoleredes fra cosmidet I

I oFCll og indsattes i BamHI-stedet af pBR328 (Soberon et al.. Gene (1980) 9: I

I 20 287-305). Dette fragment, som omfatter regionen, som hybridiserer til den syntetiske I

I 40-mer probe, inkluderer den første og anden exon, den første intron og de 5'-flanke- I

I rende sekvenser af genet (Lawn et al., Cell (1978), 15:1157-1174). Denne klon be- I

I tegnedes pBR328:HbA og blev deponeret under ATCC nr. 39.698 25.maj 1984. I

25 Det tilsvarende 1,9 kb lange BamHI-fragment af seglcelleallelet af β-globin isoleredes I

fra cosmidet pFC12 og klonedes som ovenfor beskrevet. Denne klon blev betegnet I

I pBR328:HbS og deponeredes under ATCC nr. 39.699 25. maj, 1984. I

I Hver rekombinantplasmid blev transformeret ind i og opformeret i E.coli MM294 I

I 30 (ATCC nr. 39.607).

I C. Fordøjelse af klonede olobinaener med MstH I

I Et total på 100 ug af hver af pBR328:HbA og pBR328:HbS blev individuelt fordøjet I

I met 20 enheder MstH (New England Biolabs) i 16 timer ved 37°C i 200 μ! 150 mM I

35 NaCI, 12 mM Tris HCI (pH 7,5), 12 mM MgCI2, 1 mM dithiothreitol (DTT), og 100 Mg/ml

bovinserumalbumin (BSA). Produkterne blev betegnet pBR328:HbA/MstII henholdsvis I

pBR3 28: HbS/MstI I.

III. Polvmerasekædereaktion 40 Til 100 μΙ buffer bestående af 60 mM natriumacetat, 30 mM Trisacetat og 10 mM magnesiumacetat ved pH 8,0 tilsattes 2 μΙ af en opløsning indeholdende 100 picomol Primer A (med sekvensen d(CACAGGGCACTAACG)), 100 picomol af Primer B (med DK 175469 B1 25 sekvensen d( 111GCTTCTGACACA)) og 1000 picomol af hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP. Desuden tilsattes en af følgende ovenfor beskrevne DNA-kilder: 10 fig hel, human, vildtype DNA (reaktion I) 5 0,1 picomol pBR328:HbA (reaktion II).

0,1 picomol pBR328:HbS (reaktion III).

0,1 picomol pBR328:HbA/Mst!l (reaktion IV).

0,1 picomol pBR328:HbS/MstII (reaktion V).

Intet mål-DNA (reaktion VI) 10

Hver resulterende opløsning opvarmedes til 100°C i 4 minutter og fik lov at afkøle til stuetemperatur i 2 minutter, hvorefter 1 μΙ indeholdende 4 enheder Klenow-fragment af E.coli DNA polymerase tilsattes. Hver reaktion fik lov at forløbe i 10 minutter, hvorefter cyklussen med tilsætning af primere, nukleotider og DNA, opvarmning, afkøling, 15 tilsætning af polymerase og reaktion blev gentaget 19 gange for reaktion 1 og 4 gange for reaktionerne II-VI.

Alikvoter på 4 mikroliter af reaktionerne I og II, der var fjernet før den første cyklus og efter den sidste cyklus af hver reaktion, blev påsat en 12% polyacrylamidgel 0,089 M i Tris-borat-buffer ved pH 8,3 og 2,5 mM i EDTA. Gelen blev elektrofore-20 sebehandlet ved 25 volt/cm i 4 timer, overført til en nylonmembran, der tjente som fast-fase-bæremateriale og probebehandlet med et syntetisk 5'-32P-mærket 40 bp langt fragment, der var fremstillet ved standardteknik, med sekvensen: 5' d(TCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG)3· 25 i 30% formamid, 3 x SSPE, 5 x Denhardt's, 5% natriumdodecylsulfat ved pH 7,4. Figur 2 er et autoradiogram af den probebehandlede nylonmembran for reaktionerne I og II. Bane 1 er 0,1 picomol af en 58 bp langt syntetisk fragmentkontrol, hvor 1 streng er komplementær til den ovennævnte probe. Bane 2 er 4 μΙ af reaktion I forud 30 for den første multiplikationscyklus. Bane 3 er 4 μΙ af reaktion I efter den 20. multiplikationscyklus. Bane 4 er 4 μΙ af reaktion II efter fem multiplikationscyklusser. Bane 5 er en molekylvægtstandard, der består af en Fokl (New England Biolabs) fordøjelse af pBR322 (New England Biolabs) mærket med ot-32P-dNTP'er og polymerase. Bane 3 viser, at efter 20 cyklusser indeholdt reaktionsblanding I en stor mængde af den speci-35 fikke sekvens af den passende molekylvægt og ingen andre påviselige produkter. Reaktionsblanding II efter 5 cyklusser indeholdt også dette produkt, såvel som udgangs-nukleinsyren og andre produkter, som vist ved bane 4.

Til 5,0 μ! alikvoter af reaktionerne II-VI efter den 4. cyklus tilsattes 5 pmol af hver af 40 de ovenfor beskrevne primere. Opløsningerne blev opvarmet til 100°C i 4 minutter og fik lov at ækvilibrere til stuetempeatur. 3 pmol af hver af a-32P-dATP, ct-32P-dCTP, a-32P-dGTP, a-32P-dTTP og 4 enheder Klenow-fragment blev tilsat. Reaktionen fik i et I DK 175469 B1

I 26 I

slutvolumen på 10 μΙ og ved de ovenfor angivne saltkoncentrationer lov at forløbe i I

I 10 minutter. Polymeraseaktiviteten blev afsluttet ved opvarmning i 20 minutter ved I

I 60CC. Alikvoter på 4 μΙ af reaktionerne II-VI blev ladet på en 12% polyacrylamidgel I

I 0,089 M i Tris-borat-buffer ved pH 8,3 og 2,5 mM i EDTA. Gelen blev elektroforese- I

5 behandlet ved 25 volt/cm i 4 timer, hvorefter autoradiografi blev udført. I

Figur 3 er et autoradiogram af elektroforesen. Bane 1 er en molekylvægtstandard, I

bane 2 er reaktion II, bane 3 er reaktion III, bane 4 er reaktion IV og bane 5 er reak- I

tion V. En anden bane for reaktion VI som kontrol og uden tilsat DNA havde ingen I

10 markeringer i nogen af banerne. Det kan ses ud fra tegningen, at de 94 bp lange I

I fragment, som var forudsagt ud fra mål-DNA, kun var til stede, hvor intakt β-globin- I

DNA-sekvenser var tilgængelige for multiplicering, dvs. pBR328:HbA (bane 2), I

I pBR328:HbS (bane 3) og pBR328:HbS/MstII (bane 5). Mstll-fordøjelse skærer I

I pBR328:HbA i den 94-mere sekvens, og gør den derved ude af stand til at blive multi- I

15 pliceret, og det 94-mere bånd viser sig ikke i bane 4. I modsætning hertil udskæres I

den 94-mere sekvens i pBR328:AbS ikke, når plasmidet fordøjes med £jsill, og er så- I

I ledes tilgængelig for multiplicering som vist i bane 5. I

Figur 4 viser kædereaktionen for 3 cyklusser i multiplicering af den 94 bp lange se- I

20 kvens. PC01 og PC02 er primere A og B. Tallene på højre side indicerer cyklusserne, I

hvorimod tallene på venstre side indicerer cyklustallene, i hvilke et specielt molekyle I

blev produceret. I

Eksempel 3 I

I 25 Dette eksempel viser multiplikationen af en 110 bp sekvens spændende over det allele I

Mstll-sted i det humane hæmoglobingen. I

Et total på 1,0 mikrogram hel, human DNA, 100 picomol d(ACACAACTGTGTTCAC- I

I TAGC) og 100 picomol d(CAACTTCATCCACGTTCACC), hvor primerne var blevet frem- I

I 30 stillet ved metoden ifølge eksempel 2, blev opløst i 100 μΙ af en opløsning, som bestod I

I I

I 1,5 mM af hver af de fire deoxyribonukleosidtriphosphater I

I 30 mM Trisacetatbuffer ved pH 7,9 I

I 35 60 mM natriumacetat I

10 mM magnesiumacetat I

I 0,25 mM dithiothreitol. I

I Opløsningen opvarmedes til 100°C i 1 minut og bragtes hurtigt til 25°C i 1 minut, I

I 40 hvorefter der tilsattes 2,5 enheder Klenow-fragment af DNA-polymerase. Polymera- I

I sereaktionen fik lov at forløbe i 2 minutter ved 25°C, hvorefter cyklussen bestående af I

DK 175469 B1 27 opvarmning, afkøling, tilsætning af Klenow-fragment og reaktion blev gentaget si ofte som ønsket.

Men en 70% effektivitet ved hver cyklus resulterede 15 cyklusser i syntese af 1,4 5 femtomol af det ønskede 110 bp fragment af β-globingenet.

Eksempel 4

Dette eksempel viser multiplikationen af en 240 bp sekvens, der spænder over det allele Mstll-sted i det humane hæmoglobingen. Denne sekvens indeholder Ncol, Hinf] 10 og Mstll restriktionsstederne.

Til 100 μΙ af en blanding af 60 mM natriumacetat, 30 mM Tris-acetat og 10 mM magnesiumacetat ved pH 8,0 indeholdende 0,1 pmol pBR328:HbA tilsattes 2 μΙ opløsning A, der indeholdt: 15 100 picomol d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) primer.

100 picomol d(TAACCTTGATACCAACCTGCCC) primer 1000 pmol af hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP.

20 De to primere blev fremstillet ved metoden beskrevet i eksempel 2. Opløsningen blev opvarmet til 100°C i 4 minutter og fik lov at afkøle i omgivelsesluft i 2 minutter, hvorefter der tilsattes 1 μΙ indeholdende fire enheder Klenow fragment af E.coli DNA polymerase. Reaktionen fik lov at forløbe i 10 minutter, hvorefter cyklussen bestående af tilsætning af opløsning A, opvarmning, afkøling, tilsætning af polymerase og reaktion 25 blev gentaget 3 gange. Til en delmængde på 5,0 μΙ af reaktionerne tilsattes 5 picomol af hver af ovennævnte oligonukleotidprimere. Opløsningen blev opvarmet til 100°C i 4 minutter og fik lov at indstille sig til omgivelsestemperatur, hvorefter 3 picomol af hver af de a-32P-mærkede deoxyribonukleosidtriphosphater og 4 enheder Klenow-fragment tilsattes. Reaktionen fik i et slutvolumen på 10 μΙ og ved de ovenfor givne 30 saltkoncentrationer lov at forløbe i 10 minutter. Polymeraseaktiviteten blev afsluttet ved opvarmning i 20 minutter ved 60°C. 2 μΙ alikvoter blev fordøjet med NcoIf MstI eller Hinfl og sat på en 12% poiyacrylamidgel 0,089 M i Tris-Borat-buffer ved pH 8,3 og 2,5 mM i EDTA. Gelen blev elektroforesebehandlet ved 25 volt/cm i 4 timer, og autoradiografi blev udført. Figur 5 viser autoradiogrammet af elektroforesen, hvor 35 bane 1 er den molekylvaegtstandard, bane 2 er uden fordøjelse med enzym (240 bp intakt), bane 3 er fordøjelse med Ncol (131 og 109 bp), bane 4 er fordøjelse med Mstll (149 og 91 bp) og bane 5 er fordøjelse med Hinfl (144 og 96 bp). Autoradiogrammet er i overensstemmelse med multiplikationen af den 240 bp lange sekvens.

40 Eksempel 5

Dette eksempel viser anvendelsen af fremgangsmåden beskrevet heri til påvisning af seglcelleanæmi ved sekventiel fordøjelse.

____________

I DK 175469 B1 I

I 28 I

I Syntese oa phosphorvlerina af oliaodeoxvribonukleotider I

I En mærket DNA-probe, RS06, med sekvensen: I

5 5’ *CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG 3‘ I

H hvor * indicerer mærkningen, og en umærket, blokerende oligomer, RS10, med se- I

kvensen: I

I 10 3’ G ACAG AGGT CACCT CTT C AG ACGGCAAT G ACGGG ACACCC 5' I

I som har 3 basepar fejlparrede med RS06, blev syntetiseret ifølge fremgangsmåderne, I

som blev angivet i eksempel 2(1). Proben RS06 blev mærket ved at kontakte 5 pmol I

I heraf med 4 enheder T4 polynukleotidkinase (New England Biolabs) og 50 pmol γ-32Ρ- I

I 15 ATP (New England Nuclear, ca. 7200 Ci/mmol) i et 40 pi reaktionsvolumen indehol- I

I dende 70 mM Tris-buffer (pH 7,5), 10 mM MgCI2, 1,5 mM spermin og 2,5 mM dithi- I

othreitol i 90 minutter ved 37°C. Det totale volumen blev derefter indstillet til 100 μΙ I

I med 25 mM EDTA og oprenset ifølge fremgangsmåden af Maniatis et al., Molecular I

I Cloning (1982), 454-465 over en 1 ml Bio Gel P-4 spindialysesøjle fra BioRad I

I 20 ækvilibreret med Tris-EDTA (TE) buffer (10 mM Tris-buffer, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). I

H Den mærkede probe blev yderligere oprenset ved elektroforese på en 18% polyacryl- I

I amidgel (19:1 acrylamid:B!S, BioRad) i Tris-borsyre-EDTA (TBE) buffer (89 mM Tris, I

I 89 mM borsyre, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) i 500 vhr. Efter lokalisering ved autoradiografi I

I blev den del af gelen, der indeholdt den mærkede probe, udskåret, knust og elueret i I

25 0,2 ml TE puffer natten over ved 4°C. TCA-præcipitation af reaktionsproduktet viste, I

I at den specifikke aktivitet var 4,9 Ci/mmol, og slutkoncentrationen var 20 pmol/ml. I

I Den umærkede RS10 blokerende oligomer blev anvendt ved en koncentration på 200 I

pmol/ml. I

30 I

I Isolering af human oenomisk DNA fra cellelinier I

I Genomisk DNA med høj molekylvægt blev isoleret fra lymfoidcellelinierne Molt4, SC-1 I

I og GM2064 under anvendelse af i alt væsentligt den metode, der beskrives af Stetler I

I et al. i PNAS (1982) 22; 5966-5970 (for Molt4) og Maniatis et al. i Molecular Cloning I

I 35 (1982), 280-281. I

Molt4 (Human Mutant Cell Repository, GM2219C) er en T-cellelinie, der er homozygot I

for normal p-globin, og SC-1, deponeret hos ATCC 19. marts 1985, er en EBV-trans- I

I formeret B-cellelinie, der er homozygot for seglcelleallelet. GM2064 (Human Mutant I

I 40 Cell Repository, GM2064) blev oprindeligt isoleret fra en individuel homozygot med I

arvelig persistens af føtalhæmoglobin (HPFH) og indeholder ingen beta- eller deltaglo- I

29 i i DK 175469 B1 bingensekvenser. Alle cellelinier blev opretholdt i RPM1-1640 med 10% føtal kalveserum.

Isolering af human aenomisk DNA fra kliniske blodprøver : 5 En klinisk blodprøve, betegnet CH12, fra en kendt seglcellebærer (AS) blev opnået fra Dr. Bertram Lubin fra Children's Hospital i Oakland, Californien. Genomisk DNA blev fremstillet ud fra "buffy^coaf-fraktionen, som primært er sammensat af perifer blodlymfocytter, under anvendlese af en modifikation af fremgangsmåden, som er beskrevet af Nunberg et al. i Proc.Nat.Acad.Sci. 75, 5553-5556 (1978).

10

Cellerne blev resuspenderet i 5 ml Tris-EDTA-NaCI (TEN) buffer (10 mM Tris buffer pH 8, 1 mM EDTA, 10 mM NaCI) og indstillet til 0,2 mg/ml proteinase K, 0,5% SDS, og inkuberet natten over ved 37°C. Natriumperchlorat blev derefter tilsat til 0,7 M, og lysatet blev forsigtigt rystet i 1-2 timer ved stuetemperatur. Lysatet blev ekstraheret 15 med 30 ml phenol/chloroform (1:1), derefter med 30 ml chloroform og efterfulgt af ethanolpræcipitering af nukleinsyrerne. Pelleten blev resuspenderet i 2 ml TE-buffer og RNase A blev tilsat til 0,005 mg/ml. Efter fordøjelse i 1 time ved 37°C blev DNA'et ekstraheret en gang med hver af lige volumener phenol, phenol/ chloroform og chloroform og blev ethanolpraecipiteret. DNA'et blev resuspenderet i 0,5 ml TE-puffer, og 20 koncentrationen blev bestemt ved absorbtion ved 260 nm.

Polvmeasekædereaktion til selektiv multiplicerina af β-olobinsekvenser To mikrogram genomisk DNA blev multipliceret i et initielt 100 μΙ reaktionsvolumen indeholdende 10 mM Tris-puffer (pH 7,5), 50 mM NaCI, 10 mM MgCI2, 150 pmol Pri-25 mer A med sekvensen d(CACAGGGCACTAACG) og 150 pmol af Primer B med sekvensen d(CTTTGCTTCTGACACA) og dækket med ca. 100 μΙ mineralolie for at forhindre fordampning.

Hver DNA-prøve undergik 15 multiplikationscyklusser, hvor en cyklus er sammensat af 30 3 trin: 1) denaturering i et varmebloksæt ved 95°C i 2 minutter, 2) umiddelbar overføring til et varmebloksæt ved 30°C i 2 minutter for at tillade pri-35 mere og genomisk DNA at anneale, 3) tilsætning af 2 μΙ af en opløsning indeholdende 5 enheder Klenow-fragment af E.coli DNA-polymerase I (New England Biolabs), 1 nmol af hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP i en puffer, der er sammensat af 10 mM Tris (pH 7,5), 50 mM NaCI, 10 mM MgCI2 og 40 4 mM dithiothreitol. Denne forlængelsesreaktion fik lov at forløbe i 10 minutter ved 30°C.

I DK 175469 B1 I 30

Efter slutcyklussen blev reaktionen afsluttet ved opvarmning ved 95°C i 2 minutter. I

H Mineralolien blev ekstraheret med 0,2 ml chloroform og bortkastet. Slutreaktionsvo- I

lumenet var 130 μΙ. I

5 Hybridisering/fordøjelse af multipliceret, aenomisk DNA med orober I

I og Ddel/Hinfl I

45 ml af det multiplicerede, genomiske DNA blev ethanolpræcipiteret og resuspende- I

ret i samme volumen TE-buffer. 10 μΙ (indeholdende den præ-multiplicerede ækvjva- I

lent til 154 ng af genomisk DNA) blev overført til et 1,5 ml Microfuge-rør og 20 μΙ TE- I

10 buffer til et slutvolumen på 30 μΙ. Prøven blev dækket med mineralsk olie og denatu- I

reret ved 95°C i 10 minutter. 10 μΙ 0,6 M NaCI indeholdende 0,02 pmol mærket I

R206-probe blev tilsat til røret, blandet let og straks overført til en 56°C varm I

varmeblok i 1 time. Fire mikroliter umærket RS10-blokerende oligomer (0,8 pmol) I

blev tilsat, og hybridiseringen fortsattes i yderligere 10 minutter ved samme I

15 temperatur. 5 μΙ 60 mM MgCI2/0,l% BSA og 1 μΙ Ddel (10 enheder, New England I

H Biolabs) tilsattes, og det reannealede DNA blev fordøjet i 30 minutter ved 56°C. 1 μΙ I

Hinfl (10 enheder, New England Biolabs) blev derefter tilsat og inkuberet i yderligere 30 minutter. Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 4 μΐ 75 mM EDTA og 6 μ! sporfarve til et slutvolumen på 61 μΙ.

I 20

Mineralolien blev ekstraheret med 0,2 ml chloroform og 18 μΙ af reaktionsblandingen I (45 ng genomisk DNA) blev sat på en 30% polyacrylamid-minigel (19:1, Bio Rad) i et

Hoeffer SE200 apparat. Gelen blev elektroforesebehandlet ved ca. 300 volt I 1 time, H indtil bromphenolblå-farvefronten var vandret 3,0 cm fra påsætningsstedet. De øver- 25 ste 1,5 cm af gelen fjernedes, og den resterende gel blev eksponeret i 4 dage med en intensiFiceringsskærm ved -70°C.

I Diskussion af fotografi (fio.9^ I Hver bane indeholder 45 ng multipliceret, genomisk DNA. Bane A indeholder Molt4 I 30 DNA; bane B, CH12; bane C, SC-1 og bane D, GM2064. Molt4 repræsenterer genoty- I pen af et normalt individ med 2 kopier af pA-genet pr. celle (AA), CH12 er en klinisk I prøve fra en seglcellebærer med et βΑ- og et ps-gen pr. celle (AS), og SCI repræsen- terer genotypen for et seglcelleindivid med to kopier af ps-genet pr. celle (SS).

I GM2064, som ikke indeholder beta- eller deltaglobinsekvenser, er tilstede som en ne-

I 35 gativ kontrol. I

Som det ses på fotografiet er den Ddel-spaltede. pA-specifikke octamer kun tilstede i I de DNA'er, der indeholder pA-genet (baner A og B) og den Hmfl-spaltede, ps-specifikke I trimer er kun tilstede i de DNA'er, der indeholder ps-genet (banerne B og C). Tilstede- 40 værelsen af både trimer og octamer (bane B) er diagnostisk for en seglcellebærer og I kan skelnes fra et normalt individ (bane A) med octameren alene og fra et seglcelle- plaget individ (bane C) med trimer alene.

DK 175469 B1 31

Gentagelsen af det ovenfor beskrevne forsøg under anvendelse af ikke-multipliceret, genomisk DNA viste til sammenligning at multiplikationen forøgede påvisningsfølsomheden mindst 1000 gange.

5

Eksempel 6

Dette eksempel illustrerer direkte påvisning af et fuldstændigt uoprenset, enkeltkopi-gen i hel, human DNA på geler uden behov for en mærket probe.

10 Under anvendelse af den i eksempel 3 beskrevne metode blev et 110 bp langt fragment fra en sekvens i det første exonområde af betaglobingenet multipliceret ud fra 10 mikrogram hel, human DNA efter 20 cyklusser. Dette 110 bp fragment, der var frembragt efter 20 cyklusser, kunne let ses på geler, der var farvet med ethidiumbro-mid.

15

Sekvensen multipliceredes ikke, når det først var skåret med restriktionsenzymet Ddelr undtagen, som i beta-globin-S-allelen, hvis sekvensen ikke indeholdt restriktionsstedet som enzymet genkender.

20 Eksempel 7 A. Et total på 100 fmol pBR328, der indeholdt et 1,9 kb langt indsat stykke fra det humane beta-globin A altel, 50 nmol af hver af a-32P-dNTP ved 500 Ci/mol og 1 nmol af hver af primerne, der anvendtes i eksempel 3, blev opløst i en opløsning indeholdende 100 μΙ 30 mM Tris-acetat ved pH 7,9, 60 mM natriumacetat, 100 mM dithio-25 threitol og 10 mM magnesiumacetat. Opløsningen bragtes til 100°C i 2 minutter og afkøledes til 25eC i 1 minut. Et total på 1 μΙ indeholdende 4,5 enheder Klenow-frag-ment af E.coli DNA polymerase I og 0,09 enheder uorganisk pyrophosphatase tilsattes for at forhindre den mulige ophobning af pyrophosphat i reaktionsblandingen, og reaktionen fik lov at forløbe i 2 minutter ved 25°C, hvorefter cyklussen med opvarm-30 ning, afkøling, enzymtilsætning og reaktion blev gentaget 9 gange. 10 μΙ delprøver udtoges og tilsattes til 1 μΙ 600 mM EDTA efter hver syntesecyklus. Hver blev analyseret på en 14% polyacrylamidgel i 90 mM Tris-borat og 2,5 mM EDTA ved pH 8,3 og 24 volt/cm i 2,5 timer. Den færdige gel blev opblødet i 20 minutter i den samme puffer med tilsætning af 0,5 μg/ml ethidiumbromid, vasket med det oprindelige puffer og 35 fotograferet i UV-lys under anvendelse af et rødt filter.

Det fremstillede 110 bp lange fragment blev udskåret fra gelen under ultraviolet lys, og det inkorporerede 32P måltes ved Cerenkov-bestråling. Et forsøg på at indpasse resultaterne i ligningen med formen:pmol/10 μΙ = 0,01 [(l+y)N- yN - 1], hvor N angiver 40 antallet af cyklusser og y er fraktionsudbyttet pr. cyklus, var optimal med y = 0,619.

Dette indicerer, at en signifikant multiplicering opnåedes.

I DK 175469 B1 I

I 32 I

I B. Det ovenfor angivne forsøg gentoges med undtagelse af, at 100 nmol af hver dNTP I

tilsattes til en 100 fil reaktion, ingen radioaktiv mærkning blev anvendt og delprøver I

I blev ikke fjernet ved hver cyklus. Efter 10 cyklusser afsluttedes reaktionen ved kog- I

ning i 2 minutter og rehybridiseringen blev udført ved 57eC i 1 time. Sekvensen af det I

I 5 110 bp lange produkt blev bekræftet ved at udsætte 8 fil delprøver for restriktions- I

analyse ved tilsætning af 1 fil bovinserumalbumin (25 mg/ml) og 1 fil af det passende I

I restriktionsenzym fHinfl, Mnll. MstH. Ncol) og ved omsætning ved 37eC i 15 timer. I

I PAGE blev udført som ovenfor beskrevet. I

I 10 Eksempel 8 I

I Dette eksempel illustrerer anvendelsen af forskellige primere til multiplicering af for- I

I skellige fragmenter af pBR328 og 322. I

I A. Forsøget, der er beskrevet i eksempel 7A, blev gentaget med undtagelse af, at I

15 der anvendtes følgende primere: d(TTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC) og I

I d(GCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACC) til fremstilling af et 130 bp langt fragment I

I af pBR328. I

I B. Forsøget, der er beskrevet i eksempel 7A, blev gentaget med undtagelse af, at I

I 20 der anvendtes følgende primere: d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) og I

I d(TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG) til fremstilling af et 262 bp langt fragment af I

I pBR328. Omsætningstiden var 20 minutter pr. cyklus. I

C- Forsøget, der er beskrevet i eksempel 8A, blev gentaget med undtagelse af, at I

I 25 100 fmol af en Mstll-fordøjelse af pBR328 indeholdende et 1,9 kb langt indskud fra I

I det humane beta-globin S allel blev anvendt som initiel template. Dette plasmid blev I

I spaltet flere gange med MstH. men ikke indeni sekvensen, der skulle multipliceres. I

I Desuden var de anvendte primere følgende: d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) og I

I d(TAACCTTGATACCAACCTGCCC) I

I 30 til dannelse af et 240 bp langt fragment. I

I D. Forsøget, der er beskrevet i eksempel 7B, blev gentaget med undtagelse af, at I

I 100 fmol af en Nrul-fordøjelse af pBR328 blev anvendt som template, 200 nmol af I

hver dNTP blev anvendt i 100 μΙ omsætningen og primerne var: I

I 35 d(TAGGCGT AT CACG AGGCCCT) og d (CTTCCCCAT CGGT GAT GT CG) til dannelse af et I

I 500 bp langt fragment fra pBR328. Omsætningstider var 20 minutter pr. cyklus ved I

I 37°C. Slut-rehybridisering var 15 timer ved 57°C. Elektroforese var på en 4% agaro- I

I segel. I

I 40 Eksempel 9 I

I Dette eksempel illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvorved en in vitro I

I mutation introduceres i det multiplicerede segment. I

DK 175469 B1 33 A. Et total på 100 fmol pBR322 lineariseret med Nrul, 1 nmol af hver af primerne: d(CGCATTAAAGCTTATCGATG) og d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) udformet til frembringelse af et 75 bp langt fragment, 100 nmol af hver af dNTP, i 100 μΙ 40 mM Tris 5 ved pH 8, 20 mM i MgCI2, 5 mM i dithiothreitol og 5 mg/ml bovinserumalbumin blev kombineret. Blandingen blev bragt til 100°C i 1 minut, afkølet i 0,5 minutter i et vandbad ved 23°C, hvorefter 4,5 enheder Klenow-fragment og 0,09 enheder uorganisk pyrophosphatase blev tilsat, og en omsætning fik lov at forløbe i 3 minutter. Cyklussen med opvarmning, afkøling, tilsætning af enzymer og omsætning blev gentaget 10 9 gange. Den 10. omsætningscyklus blev afsluttet ved nedfrysning og en 8 μΙ delprøve af reaktionsblandingen blev sat på en 4% agarosegel visualiseret med ethidiumbro-mid.

B. Forsøget som er beskrevet i eksempel 9A blev gentaget med undtagelse af, at 15 de anvendte oligonukleotidprimere var: d(CGCATTAAAGCTTATCGATG) og d(AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTAT-CACGAGGCCCT)

Disse primere er udformet til at producere et 101 bp langt fragment, hvoraf 26 nucle-20 otider (i den primer, der er angivet som nummer to), ikke er til stede i pBR322. Disse nukleotider repræsenterer sekvensen i T7-promotoren, som blev tilføjet til den 75 bp lange sekvens fra pBR322 ved at anvende primeren med 20 komplementære baser og en 26 base lang 5‘-forlængelse. Proceduren krævede mindre end 2 timer og producerede to picomol af det relativt rene 101 bp lange fragment fra 100 fmol af pBR322.

25 T7-promotoren kan anvendes til at initiere RNA-transkription. T7-polymerase kan tilsættes til det 101 bp lange fragment til frembringelse af enkeltstrenget RNA.

C. Forsøget som er beskrevet i eksempel 8D blev gentaget med undtagelse af, at de 30 anvendte oligonukleotidprimere var som følger: d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) og d(CCAGCAAGACGTAGCCCAGC) til frembringelse af et 1000 bp langt fragment fra pBR322.

D. Forsøget som er beskrevet i eksempel 9C blev gentaget med undtagelse af, at de 35 anvendte oligonukleotidprimere var som følger: d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) og d(AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTAT-CACGAGGCCCT) for således at frembringe et 1026 bp langt fragment, hvoraf 26 nukleotider (i den primer, der er angivet som nummer to) ikke er til stede i pBR322 og repræsenterer den ovenfor beskrevne T7-promotor. Promotoren er blevet indføjet 40 naboliggende til et 1000 bp langt fragment fra pBR322.

I DK 175469 B1 I

I 34 I

I Resultaterne indicerer, at en primer, som ikke er en perfekt parring til templatese- I

I kvensen, som ikke desto mindre er i stand til at hybridisere tilstrækkeligt til at blive I

enzymatisk forlænget, producerer et langt produkt, som indeholder sekvensen af pri- I

I meren snarere end den tilsvarende sekvens af den oprindelige template. Det lange I

I 5 produkt tjener som template for den anden primer til introducering af en in vitro mu- I

tation. Denne mutation multipliceres i yderligere cyklusser med en uformindsket ef- I

I fektivitet, fordi ingen yderligere fejlparrede priminger kræves. I dette tilfælde blev en I

I primer, som bærer en ikke-komplementær forlængelse på dets 5'-ende anvendt til I

I indføjelse af en ny sekvens i produktet, der er naboliggende til templatesekvensen, I

I 10 der kopieres. I

I Eksempel 10 I

I Dette eksempel illustrerer anvendelsen af indskudte sæt af primere for at nedsætte I

I baggrunden i multiplikationen af enkeltkopigener. I

I 15 I

Hel, human DNA, som er homozygotisk for vildtype β-globinallelet, blev udsat for 20 I

I multiplikationscyklusser på følgende måde: Ialt 10 pg DNA, 200 pmol af hver af pri- I

I merne: d(ACACAACTGTGTTCACTAGC) og d(CAACTTCATCCACGTTCACC) og 100 nmol I

I af hver dNTP i 100 μΙ af 30 mM Tris-acetat pH 7,9, 60 mM natriumacetat, 10 mM I

20 dithiothreitol og 10 mM magnesiumacetat blev opvarmet til 100°C i 1 minut, afkølet til I

I 25°C i 1 minut og behandlet med 2 enheder Klenow-fragment i 2 minutter. Cyklussen I

I med opvarmning, afkøling og tilsætning af Klenow-fragment blev gentaget 19 gange. I

I En delprøve på 10 μΙ blev fjernet fra reaktionsblandingen og udsat for yderligere 10 I

I multiplikationscyklusser under anvendelse af hver af primerne: I

I 25 d(CAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTG) og d(CCCCACAGGGCAGTAACGGCA- I

I GACTTCTCC), hvilket multiplicerer et 58 bp langt fragment indeholdt i det ovenfor I

I fremstillede 110 bp lange fragment. Disse sidste 10 multiplikationscyklusser blev ud- I

I ført ved at fortynde 10 μΙ delprøven i 90 μΙ frisk Tris-acetatpuffer beskrevet ovenfor I

I indeholdende 100 nmol af hver dNTP og 200 pmol af hver primer. Reaktionsbetingel- I

I 30 serne var som ovenfor anført. Efter 10 cyklusser blev en 10 μΙ delprøve (svarende til I

I 100 ng af det oprindelige DNA) påsat en 6% NuSieve (FMC Corp.) agarosegel og blev I

I visualiseret under anvendelse af ethidiumbromid. I

I Figur 10 illustrerer denne gel belyst med UV-lys og fotograferet gennem et rødt filter, I

I 35 hvilket er kendt inden for fagområdet. Bane 1 er molekylvægtsmarkører. Bane 2 er en I

I delprøve af den ovenfor beskrevne reaktions. Bane 3 er en delprøve af en reaktion I

I identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at det oprindelige vildtype- I

I DNA blev spaltet med Ddel forud for multiplikationen. Bane 4 er en delprøve af en re- I

I aktion identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at human DNA ho- I

40 mozygot for seglcellebetaglobinallelet blev behandlet med Ddel før multiplikationen I

I (seglcelleallelet indeholder ikke et Ddel-restriktionssted i det fragment, som bliver I

multipliceret her). Bane 5 er en delprøve afen reaktion identisk med den ovenfor be- I

DK 175469 B1 35 skrevne med undtagelse af, at laksesperm-DNA blev anvendt i stedet for human DNA.

Bane 5 er en delprøve af en reaktion identisk med den ovenfor beskrevne med undtagelse af, at delprøven blev behandlet med Pdel efter multiplikation (Ddel skulle omdanne det 58 bp lange vildtypeprodukt til 27 og 31 bp lange fragmenter). Bane 7 er 5 en delprøve af materialet fra bane 4 behandlet med Ddel efter multiplikation (det 58 bp lange seglcelleprodukt indeholder intet Ddgl-restriktionssted).

Påvisning af et 58 bp langt fragment, som er repræsentativt for et enkeltkopigen, fra 1 mikrogram human DNA under anvendelse af udelukkende ethidiumbromidfarvning 10 af en agarosegel kræver en multiplikation på ca. 500.000 gange. Dette blev opnået ved at anvende de to indskudte sæt af oligonukleotidprimere beskrevet her. Det første sæt multiplicerer det 110 bp lange fragment og det i det indre indskudte sæt multiplicerer et subfragment af dette produkt op til et niveau, som er hensigtsmæssigt til påvisning, som vist i figur 10. Denne fremgangsmåde med at anvende primere, som 15 multiplicerer en lille sekvens indeholdt i den sekvens, som er multipliceret i den tidligere multiplikationsproces og som er indeholdt i forlængelsesprodukter af de andre primere, gør det muligt at skelne vildtypen fra seglcelleallelet ved β-globinlocusset uden at ty til hverken radioisotopiske eller ikke-radioisotopiske probehybridiserings-metoder, såsom beskrevet af Conner et al., PNAS (USA), ££):278 (1983) og Leary et 20 al., PNAS (USA), £Q:4045 (1983).

Eksempel 11

Det forventes, at den foreliggende fremgangsmåde er nyttig til i en DNA-prøve fra en patient at påvise en specifik sekvens associeret med en infektiøs sygdom, såsom 25 f.eks. Chlamydia under anvendelse af en biotinyleret hybridiseringsprobe, som spænder over den ønskede multiplicerede sekvens og under anvendelse af den i beskrivelsen til USA 4.358.535, se ovenfor, beskrevne fremgangsmåde. Den biotinylerede hybridiseringsprobe kan fremstilles ved interkalering og bestråling af et delvis dobbeltstrenget DNA med en 4’-methylensubstitueret 4,5'-8-trimethylpsoralen knyttet til bio-30 tin via en afstandsarm med formlen:

H

-Y-(CH2)2-0-(CH2)xOiy-CH2CH2-N- 35 hvor Y er 0, NH eller N-CHO, x er et tal på fra 1 til 4 og y er et tal på fra 2 til 4. Påvisning af biotinylgrupper på proben kan opnås ved at anvende et streptavidin - sur phosphatase - kompleks, som kan opnås kommercielt fra Enzo Biochem Inc., under anvendelse af de påvisningsmetoder, som foreslås af leverandøren i dennes brochure.

40 Den hybridiserede prøve ses som en plet af udfældet farve på grund af bindingen af påvisningskomplekset og den efterfølgende reaktion katalyseret af sur phosphatase, hvilket frembringer en udfældelig farve.

I DK 175469 B1 I

I 36 I

I Eksempel 12 I

I I dette eksempel anvendes stort set den i eksempel 7 beskrevne fremgangsmåde til at I

I multiplicere et 119 basepar langt fragment på det humane β-hæmoglobingen under I

I 5 anvendelse af primerne: I

I 5,-CTrCTGcagCAACTGTGTTCACTAGC-3, (GH18) I

I 5'-CACa AgCTTCAT CCACGTT CACC- 3’ (GH19) . I

I 10 hvor små bogstaver betegner fejlparringer i forhold til vildtypesekvensen for at frem- I

I bringe restriktionsenzymsteder. Det fulde skema vises i tabel I. Tabel I illustrerer et I

I diagram af primerne GH18 og GH19, som anvendes til kloning og sekventering af et I

I 119-basepar langt fragment af det humane β-globingen, og som er udformet til at in- I

I deholde indre restriktionssteder. Startcodonnet ATG er understreget. GH18 er et 26 I

I 15 baser langt oligonukleotid, som er komplementær med den negative streng, og som I

I indeholder et indre Estl-sted. GH19 er et 23 base langt oligonukleotid, som er kom- I

I plementært til plusstrengen, og som indeholder en indre HindUI-aenkendelsesse- I

I kvens. Pile angiver forlængelsesretningen for DNA-polymerase 1. De indrammede se- I

I kvenser angiver restriktionsenzymets genkendelsessekvenser på hver primer. Disse I

I 20 primere blev udvalgt ved først at screene områderne på genet for homologi til PstI og I

I Hjndlll restriktionssteder i bakteriofag M13. Primerne blev derefter fremstillet som I

I beskrevet i tidligere eksempler. I

DK 175469 B1 + ' 37 v-/ '-y

O O O

< E-H < ej ej ej

ro ej ej C H· <C oO H s O O O

H < E^· i-i -2 f~> CJ O ej < E-h < H < E-h o o o o o ej

< H < cj cj ej cj cj cj Η < H

f—· -CC f—· cj cj cj

< E-h <C

o ej o ej ej ej 3 £ ej ej O ej cj ej O ej ej ej M < eJ ej t-> c v ej ej ej ej o ej ej ej f-H < cj ej < t- H < E-h < ej ej ej ej ej ej ej ej E-> < ej ej E-> < o ej

3 S

ej ej < i- ej ej . o ej i-i < H <u

ej ej E

H < -H

h ej ej ej η-* ej ej o.

.-Η 4J| 6~> < Vi <u -o ej ej <u vi jj al < H v ro ej ej c ε

E-h £-h -5; -Η -H

O ej ^H Vi ej ej o.

c E-ι Cl V# ej ej vi οι o ej jj jj f-ι c ΙΛ c ej ej c -»π ej i ej <u <—1 H <c >

Cl h O) ej ej 00 vi ej o —* ->-> <c f- se -a

ej ej λ ej X

*~C E—i ej ej «λ < t- - *- ej ej en x < e- ej 3 S ej - ej ej cj <0 t-H < < ej ej f- cj ej cj ej <c e-h < ej -2 E-< ej < o ej ej H ej ej ej ej E->

< H < ej H

E— <c ί-ι Η· ej o ej ej ej ej

C f-H < f-H C

ej ej ej cj o E—· «i i-« co 00 ej E—♦ «2 E-h '—* <i '—' E-h o ej ej w <2 X < e-h c e-h ej ej ej ej ej ej o 00 E-h <C E-h (0 Ϊ—* ej ej ej ei t— < H < ej < E— <! o 00 ej ej ej e-h < C E-h 00 ej ro ej ej ro E— < E-h e« e-h ej O u ej ej < e-h < e-h ej ej ej ej E-h <c E-h e-h 2 f- ej ej ej in in

I DK 175469 B1 I

I 38 I

I Multiplikation oq kloning I

I Efter 20 multiplikationscyklusser med 1 mikrogram human genomisk DNA isoleret fra I

I cellelinien Molt 4 som beskrevet i eksempel 2 blev 1/14 af reaktionsproduktet hybridi- I

I seret til den mærkede β-globin specifikke, oligonukieotid probe, RS06, med sekvensen I

I 5 5’-CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG-3'under anvendelse af de I

ovenfor beskrevne metoder til oligomer restriktion. Efter opløsningshybridisering blev I

I reaktionsblandingen behandlet med Ddel under restriktionsfordøjelsesbetingelser, I

som beskrevet ovenfor, til frembringelse af et 8-basepar langt oligonukieotid. Mæng- I

I den af dette 8-basepar lange produkt er proportionalt med mængden af frembragt I

I 10 multipliceret produkt. Fordøjelsesprodukteme blev separeret på en 30% polyacryl- I

I amidgel og visualiseret ved autoradiografi. I

I Analyse af autoradiogrammet afslørede, at multiplikationen var sammenlignelig i ef- I

I fektivitet med multiplikationen af primeren PC03 (S'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-S1) og I

I 15 PC04 (5'-CCACrTGCACCTACTTCAAC-3'), som er komplementære med den negative I

I henholdsvis den positive strerig i vildtype β-globin. I

I Det multiplicerede produkt blev ethanolpræcipiteret for at afsalte og koncentrere prø- I

I ven, blev genopløst i en restriktionspuffer af 10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCI2/ 1 mM I

20 DTT, 100 mM NaCI og blev samtidig fordøjet med Pst] og Hindlll. Efter fordøjelsen I

I blev prøven afsaltet med en Centricon 10 koncentrator og ligeret natten over ved 12°C I

ved 0,3 mikrogram af den PstI/ Hindlll-fordøiede vektor M13mpl0w, som er offentlig I

I tilgængelig fra Boehringer-Mannheim. I

I 25 Hele ligeringsblandingen blev transformeret i Exoll stamme JM103, som er offentlig I

I tilgængelige fra BRL i Bethesda, MD. Den fremgangsmåde, som blev fulgt til fremstil- I

I ling af den transformerede stamme, er beskrevet i Messing, J. (1981) Third Cleveland I

Symposium on Macro-molecules: Recombinant DNA. red. A.Walton, Elsevier, I

I Amsterdam, 143-153. I

I 30 I

Transformationsblandingen blev udpladet på x-gal medie til screening ved hjælp af I

I plaquehybridisering med nylonfiltere. Filtrene blev proberet med en β-globinspecifik I

I oligonukleotidprobe RS24 med sekvensen 5’-CCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTC- I

I TCCTCAGGAGTCAG-3’ for at bestemme antallet af β-globinindføjelser. Filtrene blev I

I 35 derefter reproberet med primeren PC04 for at bestemme det totale antal af indføjel- I

I ser. I

Udpladnina oo screening I

I Tabel II opsummerer udpladnings- og plaquehybridiseringsresultater. Filtrene blev I

.40 proberet med primeren PC04 for at bestemme procent indføjelse resulterende fra I

I multiplikationen og kloningen; 1206 klare plaque (90% af det totale antal klare I

I plaque) hybridiserede med primeren. 15 plaque hybridiserede med den β-globinsped- I

DK 175469 B1 39 fikke probe RS24. Procentdelen af β-globinpositive plaques blandt de multiplicerede primer-positive plaques er ca. 1%.

Tabel II

5 Blå Ingen β-Globin-

Plade nr. plaques indføjelser* Indføjelser** indføjelser 1 28 25 246 1 2 29 18 222 2 10 3 11 26 180 0 4 24 20 192 5 5 22 27 185 5 6 39 21 181 3

Total 158 132 1206 15 15 °/o plaque indeholdende multiplicerede sekvenser, som indeholder β-globinindføjelse = 15/1206 x 100 = 1,24%.

% total plaque, som indeholder β-globinindføjelse = 15/1496 x 100 = ca. 1%.

% total plaque, som indeholder multiplicerede sekvenser = 1206/1496 x 100 = ca.

20 0,8%.

* Klare plaque, som ikke hybridiserer med primer PC04 ** Klare plaque, som hybridiserer med primer PC04.

Restriktionsenzvmanalvse og Southern Blot Analyse 25 DNA fra fag-DNA mi ni præparation af 3 β-globinpositive og 2 β-globinnegative (men PC04 primerpositive) plaques blev analyseret ved restriktionsenzymanalyse. Mstll-fordøjelse af DNA fra M13-kloner indeholdende det multiplicerede β-globinfragment skulle frembringe et karakteristisk 283 bp langt fragment. Efter MstH-fordøielse producerede de tre β-globinpositive kloner alle det forudsagte 283 bp lange fragment, 30 medens de to kloner, som kun var positive med primeren, producerede større fragmenter.

Gelen fra denne analyse blev overført til et MSI-nylonfilter og hybridiseret med en radioaktiv mærket, nick-translateret β-globinprobe fremstillet ved nicktranslationsstan-35 dardmetoder, som beskrevet af Rigby et al., J.Mol.Biol. (1977), 113:237-51. De eneste bånd, som hybridiserede til β-globinproben, var de tre β-globinpositive kloner. De to andre kloner havde indføjelser, som ikke hybridiserede til β-globinproben.

Sekvensanalyse 40 10 β-globinpositive kloner, som ved restriktionsenzymanalyse blev vist at indeholde β-globinindføjelsen, blev sekventeret under anvendelse af M13-dideoxysekventerings-metoden. Ud af de 10 kloner var 9 identiske med β-globinvildtypesekvensen. Den an-

I DK 175469 B1 I

I 40 I

I den klon var identisk med <3-globingenet, som er blevet vist at være multipliceret I

I alene i en lille udstrækning af β-globinprimerne. I

I Som konklusion var de modificerede linkerprimere næsten lige så effektive som de I

I 5 ikke-modificerede primere til at multiplicere β-globinsekvensen. Primerne var i stand I

I til at lette indføjelsen af multipliceret DNA i kloningsvektorer. På grund af multiplice- I

I ringen af andre segmenter af genomet indeholdt kun 1% af klonerne hæmoglobinse- I

I kvenser. I

I 10 9 ud af de 10 kloner blev fundet at være identiske med den publicerede β-globinse- I

I kvens, hvilket viser, at metoden multiplicerer genomisk DNA med stor nøjagtighed. En I

I klon blev fundet at være identisk med den publicerede δ-globinsekvens, hvilket be- I

I kræfter, at primerne er specifikke for β-globingenet på trods af, at de har en signifi- I

I kant sekvenshomologi med δ-globin. I

I 15 I

I Nar kloningen blev udført med et 267 bp langt fragment af β-globin-genet, var klonin- I

I gen kun effektiv, når dimethylsulfoxid var tilstede {10 volumen% ved 37°C) i multipli- I

I kationsproceduren. I

I 20 Restriktionsstedmodificerede primere blev også anvendt til at multiplicere og klone og I

I delvis sekventere det humane N-ras oncogen og til at klone de 240 bp lange segmen- I

I ter af HLA DQ-α og DQ-β generne. Alle disse multiplikationer blev udført i nærværelse I

I af 10 volumenprocent dimethylsulfoxid ved 37°C. Primerne til multiplikation af HLA I

I DQ-α og DQ-β generne var meget mere specifikke for deres beregnede mål end I

I 25 β-globin- og DR-p-primerne, hvilket i stedet for at give adskilte bånd på en ethidium- I

I bromidfarvet agarosegel blot gav et smear. Ydermere frembragte HLA DQ-α primerne I

I op til 20% kloner med multiplicerede indføjelser, som indeholdt det ønskede HLA mål- I

I fragment, hvorimod 1% af β-globinklonerne indeholdt målsekvensen. HLA DQ-α- og I

I DQ-p-genkloningen er kun effektiv, når DMSO var til stede, og temperaturen var hæ- I

I 30 vet. I

I Eksempel 13 I

I Dette eksempel illustrerer anvendelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til at I

I fremstille TNF-genet med 494 basepar startende fra 2 oligonukleotider på hver 74 ba- I

I 35 separ. I

I Primere I

I De anvendte primere blev fremstillet ved den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde I

I og er identificeret neden for som hver værende 74 merer. I

I 40 1 DK 175469 B1 41 (TN10) 5'-CCTCGTCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCGACTATGTGCTCCTCA-CCCACACCGTCAGCC-3' (TNI 1) 5'-GGCAGGGGCTCTTGACGGCAGAGAGGAGGTTGACCTTCTCCTGGTAGGAGATGGCGAAG-5 CGGCTGACGGTGTGG-3' (LL09) 5’-CCTGGCCAAT6GCATGGATCTGAAAGATAACCAGCTGGTGGTGCCAGCAGATGGCCTGT-ACCTCGTCTACTCCC-3' (LL12) 5’-CTCCCTGATAGATGGGCTCATACCAGGGCTTGAGCTCAGCCCCCTCTGGGGTGTCCTTC-10 GGGCAGGGGCTCTTG-3’ (TN08) 5’-TGTAGCAAACCATCAAGTTGAGGAGCAGCTCGAGTGGCTGAGCCAGCGGGCCAATGCCC-TCCTGGCCAATGGCA-3’ (TN13) 5'-GATACTTGGGCAGATTGACCTCAGCGCTGAGTTGGTCACCCTTCTCCAGCTGGAAGACC-CCTCCCTGATAGATG-3' 15 (LL07) 5’-CCTTAAGCTTATGCTCAGATCATCTTCTCAAAACTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATG-TTGTAGCAAACCATC-3’ (TNI4) 5'-GCTCGGATCCTTACAGGGCAATGACTCCAAAGTAGACCTGCCCAGACTCGGCAAAGTCG-AGATACTTGGGCAGA-3' 20

Samlet procedure I. 10 cyklusser af den nedenfor anførte protokol blev udført under anvendelse af pri-25 rnerne TN10 og TNll, som vekselvirker som vist på diagrammet nedenfor, trin (a).

II. Et total på 2 μΙ af reaktionsblandingen fra afsnit I ovenfor blev tilsat til primerne LL09 og LL12. Den nedenfor beskrevne protokol blev udført i 15 cyklusser, således at primerne vekselvirkede med produktet fra afsnit I som vist i diagrammet nedenfor, 30 trin (b).

III. Ialt 2 mikroliter af reaktionsblandingen fra afsnit II ovenfor blev tilsat til primerne TN08 og TN13. Den nedenfor beskrevne protokol blev udført i 15 cyklusser, således at primerne vekselvirkede med produktet fra afsnit II, som vist i diagrammet nedenfor, 35 trin (c).

IV. Ialt 2 mikroliter af reaktionsblandingen fra afsnit III ovenfor blev tilsat til primerne LL07 og LL14. Den nedenfor beskrevne protokol blev udført i 15 cyklusser, således at primerne vekselvirkede med produktet fra afsnit III som vist i diagrammet nedenfor, 40 trin (d).

DK 175469 B1 I

Protokol I

Hver reaktion indeholdt 100 μΙ af: I

2 mM af hver af dATP, dCTP, dGTP og TTP I

5 3 μΜ af hver af primerne anvendt på dette trin I

1 x polymerasepuffer (30 mM Tris-acetat, 60 mM natriumacetat, 10 mM Mg- I

acetat, 2,5 mM dithiothreitol). I

Hver cyklus bestod af: I

10 I

1) 1 minut i kogende vand. I

2) 1 minut afkøling ved stuetemperatur I

3) tilsætning af 1 μΙ (5 enheder) af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I

4) mulighed for at polymeriseringsreaktionen forløb i 2 minutter. I

15 For næste cyklus start igen ved trin 1. I

DK 175469 B1 43

Diagram a) 5' TN10-> --5’ TN 11 5 i -> xxxxxxx produkt fra afsnit 1 xxxxxxxxxxxx «-- b) 5‘ LL09-> 10 xxxxxxxxx «-5'TN11 + 5‘ TN 10-> xxxxxxxx <—--5’ LL12 i 15 5'LL09-»xxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx <-5'TN11 intermediær tilstand + 20 5’ TN10-> xxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxx <-1-5' LL12 4- kun sekvensen mellem 5’ af LL09 og 5’ af LL12 vil være 25 fuld længde. Strengene, som indeholder TN10 og TN11, har ikke voksende 5’-ender.

På denne måde...

30 5' LL09 -—-»xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx<---5' LL12

Dette er produktet fra afsnit II.

I DK 175469 B1 I

I 44 I

I C) 5' TN08-> I

I xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx <-5’ LL12 I

I I

I 5’LL09 χχχχχχχχχχχχχχχχ I

I S <-5' TN13 I

I i samme intermediære skema I

I som (b) I

I 5' TN08 -->χχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχ I

I 10 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx <-5’TN13 I

I Dette er produktet fra afsnit III. I

I d) 5' LL07-> I

I 15 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx <--5’ TIM13 I

I I

I 5’ TN08-»xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx I

I <-5’ TN14 I

I -l samme intermediære skema I

I 20 som (b) og (c) I

I 5' LL07-»xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx I

I xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx«-5' TN 14 I

I (TNF-genet) I

I 25 I

I Deponeringer af materialer I

I Cellelinien SC-1 (CTCC nr. 0082) blev deponeret 19. marts 1985 hos American Type I

I Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA med I

I ATCC deponeringsnummer CRL nr. 8756. Deponeringen af SC-1 var underlagt en I

I 30 kontrakt mellem ATCC og assignatar for den foreliggende ansøgning, Cetus corpora- I

I tion. Kontrakten med ATCC giver offentligheden en permanent mulighed for, at afkom I

I af denne cellelinie er tilgængelig ved udstedelse af det US patent, som beskriver og I

I identificerer deponeringen, eller ved offentliggørelse eller fremlæggelse af en hvilken I

I som helst US eller fremmed patentansøgning, hvad der nu kommer først, og for at I

I 35 afkom af denne cellelinie er tilgængelig for en person, der af US Commissioner of Pa- B

I tents and Trademarks er udpeget til at være berettiget til dette ifølge 35 CFR §122 og I

I Commissioners regler i medfør heraf (inklusiv 37 CFR §1,14 med speciel henvisning til I

I 886 OG 638). Assignatar for den foreliggende ansøgning har accepteret, at hvis celle- I

I linien, der er deponeret, dør eller går tabt eller bliver ødelagt, når den dyrkes under I

I 40 egnede betingelser, vil den straks ved notifikation blive erstattet med en levende kul- I

I tur af den samme cellelinie. I

DK 175469 B1 45

Opsummerende fremgår det, at der med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til påvisning af sekvenser i nukleinsyrer ved først at multiplicere en eller flere specifikke nukleinsyresekvenser under anvendelse af en kædereaktion, hvorved primerforlængelsesprodukter frembringes, som efterfølgende kan fungere 5 som templater for yderligere primerforlængeisesreaktioner. Fremgangsmåden er især anvendelig til påvisning af nukleinsyresekvenser, som i begyndelsen kun er til stede i meget små mængder. Multiplikationsprocessen kan også anvendes til molekylær kloning.

10

Claims (11)

1. Første og andet enkeltstrenget oligonukleotid, der tillader multiplikation af en spe- H cifik template-nukleinsyresekvens indeholdt i en enkelt- eller dobbeltstrenget nuklein- I 15 syre eller i en blanding af sådanne nukleinsyrer, hvor H (a) det ene oligonukleotid indeholder en del, som er i det væsentlige komple- I mentær til template-nukleinsyresekvensen i den enkeltstrengede nukleinsyre eller i en I streng i den dobbeltstrengede nukleinsyre; I 20 (b) det andet oligonukleotid indeholder en del, som er i det væsentlige komple- I mentær til et komplement af template-nukleinsyresekvensen i den enkeltstrengede I nukleinsyre eller i strengen i den dobbeltstrengede nukleinsyre; I (c) nævnte oligonukleotid-dele (a) og (b) yderligere i 5-enden indeholder en H nukleotidsekvens, som er ikke-komplementær til template-nukleinsyresekvensen, og H 25 som indeholder et restriktionssted; og hvor H (d) de under (a) og (b) beskrevne oligonukleotid-dele, der er i det væsentlige H komplementære, er indbyrdes forskellige og afgrænser enderne af den specifikke I template-nukleinsyresekvens, der skal multipliceres. I

2. Oligonukleotider ifølge krav 1, hvor den specifikke template-nukleinsyresekvens er I indeholdt i en større sekvens. I

3. Oligonukleotider ifølge krav 1 eller 2, hvor nukleinsyren er DNA eller RNA, herunder I mRNA, hvilket DNA eller RNA er enkelt- eller dobbeltstrenget eller er en DNA-RNA-hy- 35 brid. I

4. Oligonukleotider ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, hvor nukleinsyren er I genomisk DNA. I 1

5. Oligonukleotider ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, hvor de dele af oligo- I nukleotiderne, som er i det væsentlige komplementære, indeholder fra mindst ca. 15 I til 25 nukleotider. 46 DK 175469 B1

6. Oligonukleotider ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, hvor i det mindste det ene af oligonukleotiderne er et detekterbart oligonukleotid.

7. Anvendelse af oligonukleotiderne ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6 til mul-5 tiplicering af en specifik template-nukleinsyresekvens indeholdt i en enklet- eller dobbeltstrenget nukleinsyre eller i en blanding af sådanne nukleinsyrer.

8. Anvendelse ifølge krav 7 til at muliggøre multiplikation, detektering og/eller karakterisering af specifikke template-nukleinsyresekvenser, der er associeret med infekti- 10 øse sygdomme, genetiske lidelser eller cellulære lidelser.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvor den infektiøse sygdom er forårsaget af bakterier, vira eller protozoparasitter.

10. Anvendelse ifølge krav 8, hvor den genetiske lidelse er forårsaget af specifikke deletioner og/eller mutationer i genomisk DNA.

11. Anvendelse ifølge krav 8, hvor den cellulære lidelse er cancer.