JP2634208B2 - 制限断片長多型性分析方法及びその装置 - Google Patents

制限断片長多型性分析方法及びその装置

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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、制限断片長多型性（restriction fragment
length polymorphism;RFLP）分析、ヌクレオチドラベ
ル化及び蛍光検出に係わる。
［従来の技術］ 植物改良に関してバイオテクノロジーが重大な影響を
与えた一つの分野は、個々の植物分離株及び品種の分化
をスクリーニングし同定する新規な方法の開発について
のものである。植物品種改良法においてかかる目的及び
他の目的のためにRFLPを用いる方法はこれまでにも幾つ
か発表されている（Helentjaris他、plant Mol.Biol.5:
109−118（1985））。この方法はRFLP遺伝子連鎖地図を
作成するのに使用された（Helentjaris他、Theor.Appl.
Genet.72:761−769（1986））。また量的形質発現及び
不連続遺伝子効果（discriminate gene effects）に於
ける個々の植物遺伝子の役割を同定し特徴付ける方法に
上記手法を利用することも幾つか発表されている（Nein
huis他、Crop Science,27:797−803（1987））。
現在の典型的なRFLP法はサザンブロット法を利用する
ものである（Southern,E.M.,J.Mol.Biol,98:503−517
（1975））。この方法は一般的には、DNA制限断片試料
をアガロースゲル上で分離し、該ゲル中で変性させ、膜
（例えばナイロン）へ移し、ラベル化プローブDNAとハ
イブリダイズさせ、洗浄して非結合プローブを除去し、
そして最後に、例えば、オートラジオグラフィによって
評価するものである。
［解決すべき課題］ DNAが結合した膜の調製及び通常多数回連続的に繰返
されることの多いラベル化プローブとのその後のハイブ
リダイゼーションは、非常に時間を要するステップであ
り、従って経費がかかり労力を要する困難なものであり
得る。更に、各サザンブロット分析についてたった一つ
の制限酵素断片長多型性クローンしか分析することがで
きず、通常放射活性標識及びオートラジオグラフィを使
用するものである。従って、同じ型の遺伝子型情報をよ
り早くより経済的に得ることができる技術が開発され、
RFLP分析がより多数の試料に用いられるようになれば、
これらの問題はかなり解消され、RFLP法が研究及び産業
の両分野に於いて応用される機会をより多く提供するこ
とができるようになるものと考えられる。
［課題を解決するための手段］ 本発明の特徴の一つは、蛍光発光団をヌクレオチドラ
ベルとして使用することである。この蛍光発色団ラベル
は機種類かの分析応用技術として、最も最近では自動DN
Aシークエンサーで用いられている（Connell他、「自動
DNA配列分析」、Bio−Techniques 5:342−348（198
7））。この方法に於いては、発色団の蛍光をレーザー
を用いて誘起するためにフェムトモル（10-15）からア
ナモル（10-18）の範囲という微量の検出が可能であ
る。本発明者等は、この技術を自動化し得るRFLP分析操
作に用い、従来のRFLP法の持つ時間的、労力的、及び経
済的欠点を除去することに成功した。
上記方法の一つの改良は、検出されるゲノム多型性の
コピー数を増幅させることである。RFLPプローブによっ
て検出される披験植物DNA領域に対応する該領域を増強
させることのできるプライマーが作成される。コピー数
を数オーダー増幅させることによって、単一塩基レベル
までのDNA配列の分析が可能になる。
本発明方法では、従来のRFLP分析におけると同様にし
て、被験植物DNAを調製し、選択した制限酵素で切断
し、一本鎖DNAに変性させる。平均約1,000ヌクレオチド
長を有する現存の多型性プローブの各５′及び３′末端
の配列を決定する。該プローブの各末端からの塩基対プ
ライマー配列を従来のDNA合成手法によって構築し、以
下の延長ステップで用いる。発色団を選び、各塩基対プ
ライマーに付着させる。次いでこれらのプライマーを好
ましくはシーケナーゼ（Sequenase）である化学修飾さ
れたファージT7DNAポリメラーゼ（高度に連続移動的（P
rocessive）であって、３′から５′へのエキソヌクレ
アーゼ活性はない）を用いて延長することによって減衰
（pause）部位に於ける終結又は二次構造障害（impedim
ents）によるバックグランドが実質的になくなる結果を
もたらす。
Tabor及びRichardson,“DNA sequence analysis with
a modified bacteriophage T7 DNA polymerase,"Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 84:4767−4771（1987）．参照。
こうして延長されたプライマーは、元の一本鎖制限切
断試験植物ゲノムDNAと共に変性ゲル上で泳動させる。
ハイブリダイゼーションは、レーザー及び適当な検出器
を用いてゲルを観察することで決定する。サザンブロッ
トは不要である。何故ならば、発色団は種種の異なる放
出光スペクトルを与えるような蛍光を発するため、様々
な発色団が付着した多数のRFLPプローブを同時に単一ゲ
ル上で泳動させ、同様に同時に検出することができるか
らである。
本発明方法は或る種の技術要素と結合されて自動RFLP
分析系を構成する。例えば、広帯域レーザービームで、
モノクロメーターを用いて選択した波長を利用しつつ、
コンピュータ調節のステップモーターによってその動き
が調節されるゲルプレートを走査する。該ゲルを通過す
る放出スペクトルを、受けた光をデジタル信号に変換す
る高感度リニアフォトダイオードアレイ検出器と結合さ
せた放出スペクトログラフによって検出する。このデジ
タル出力はデータ収集及び解析用コンピューターに転送
される。このコンピューターからの出力はスペクトルデ
ータ及びバンド同定等の如何なる数の型をとることが可
能で、チャートレコーダ、プリンタ又はコンピューター
スクリーン上にそのデータを表わすことができる。
本発明のRFLP分析改良における一変形として単一塩基
レベルにおける配列変化を検出するためのアッセイ感度
を増加させる目的で、二重鎖被験植物DNA/プライマーDN
Aが増強（enhancement）される。この変形方法によれば
単一塩基レベルにおける多型性に基づくサイズ変化の検
出を可能にするのみならず、RFLPプローブに相補的なプ
ライマー対応するゲノムDNA領域の配列決定をも可能に
するものである。本質的には、DNA配向が逆である点を
除いて前記の場合と同様な方法でプライマーを選択し作
成した。前記の場合、プライマーは外側（outward）へ
の伸長、即ち、被験植物制限断片末端方向への伸長に用
いられる。この変形方法においては、プライマーは内側
（inward）へ配向し、DNAポリメラーゼによる伸長はプ
ライマー間の領域において生起する。被験植物DNAとハ
イブリダイズした伸長プライマーのコピー数は数オーダ
ーまで増幅される。増強によって使用ラベルの信号強度
が単に増大されるだけでなく、配列決定に用いられるDN
A量の増加がもたらされる。こうした増強操作を可能に
するプライマーを用いることによって、幾つかの又は単
一の塩基のRFLPの検出及びRFLPの実際の配列検出のため
の操作が可能になる。このような検出法は自動分析を容
易にもすることができる。
A.迅速RFLP分析 RFLPは制限エンドヌクレアーゼ消化DNAの断片長に於
ける遺伝子型間に観察される差異である。RFLPは染色体
位置の側面に位置する制限酵素認識部位に於ける塩基対
又は一の変化の結果発生するもので、該染色体断片部分
と相同な配列を含むラベル化DNAプローブとのハイブリ
ダイゼーションによって検出し得るものである。非反復
（unique）クローン化配列とのハイブリダイゼーション
によって特異的染色体領域（遺伝子座）の同定が可能と
なる。
この方法は、DNA配列レベルに於ける個体間の差異を
検出するためにクローン化DNA断片を用いるものであ
る。遺伝的に区別される二つの個体からのゲノムDNAを
制限酵素で消化し、電気泳動にかけ、ラベル化DNAクロ
ーンでプローブ化すると、個体間の配列の差異に帰因す
るところのハイブリダイゼーションパターンに於ける多
型性が見られることがある。「RFLP」という用語はこの
変異を記述するための用語である。
例えばアガロースゲル電気泳動によって解明される断
片長における差異はそのRFLPの対立因子（alleles）と
して機能する。つまり、RFLPは従来の多型性又はアイソ
ザイムマーカーと類似の様式で遺伝マーカーとして用い
ることができる。しかしながら他の多くの遺伝マーカー
と異なり、RFLPは転写及び翻訳産物ではない。更に、RF
LPには従来使用されてきた遺伝マーカーに較べて或る種
の付加的利点がみられる。第一にRFLPは遺伝的に区別さ
れる個体間の現存する差異を反映するものだという点で
ある。従って、全ての実用目的を達成するためのRFLPの
可能な数は無限であり、いずれかの高等真核生物のゲノ
ムDNAを６塩素認識酵素で消化した場合でも百万個以上
の断片が生じ、その多くは多型性であり得る。更には、
現在100種以上の異なる制限酵素が得られており、その
各々は新規で互いに異なっている断片セットを生成する
ことのできるものである。アイソザイムマーカー又は多
型性マーカーを研究上利用するにあたっては、遺伝子座
の不充分な利用可能性又は染色体上の不充分な分布によ
って、又は対象となるライン系の情報の欠如によってし
ばしば制限を受けることがある。
従来の表現型又はアイソザイムマーカーシステムと比
較しての本発明のRFLPの有する多数の潜在性用途及び理
論的利点がこれまでにも記載されている（Helentjaris
他、Plant Mol.Biol.,上掲）植物研究におけるRFLPマー
カーの使用に関する出願においてこれらのマーカーに基
づく遺伝子連鎖地図が構築されている（Helentjaris
他、Theor.Appl.Genet.,上掲）。例えば、トウモロコシ
において300種以上に及ぶRFLPが連鎖群に分類されてい
る。トウモロコシのRFLP遺伝子座の位置（location）
が、種々の染色体について一染色体性のトウモロコシラ
インにおけるRFLPの遺伝パターンを分析することによっ
て（Helentjaris他、Proc.Natl.Acad.sci.USA 83:6035
−6039（1986）），またアイソザイムマーカー、クロー
ン化遺伝子、及び染色体上の位置がすでに固定されてい
る多型性マーカーとの連鎖関係を確立することによって
（Wright他、MNL 61:89−90（1987））、そしてＢ−Ａ
転座ストックに於ける遺伝パターンを分析することによ
り、従来得られているトウモロコシの遺伝子地図と相関
付けられている。RFLPを用いて多遺伝子形質をそれらの
個々の遺伝成分に分断することについても記載がある。
RFLPで飽和したゲノム若しくはその一部又は選択RFLPマ
ーカーでプローブされたゲノム若しくはその一部分によ
って、強力な環境影響下においてさえも複合遺伝形質を
個々の遺伝子座に分割（分断）するのに必要な解決が得
られることが判明した。この方法は優性及び劣性形質の
いずれについても同等に適用し得、所望遺伝子の商業上
許容し得る栽培品種内への移入（introgression）を促
進するために用いることができる（Nienhuis他、上
掲）。
従って、植物研究に於いてRFLP分析の多数の有用性が
あるために、出来るだけ効率良く、早く且つ経済的な方
法でこの技術を利用することがより一層望ましい状態に
なっていることが理解されよう。本明細書では、特異的
な方法で蛍光一発色団を利用するRFLP分析に関する新規
方法が開示されている。この方法では、RFLPに付着され
た発色団の蛍光を誘発するためにレーザーを用いるた
め、経費、労力及び時間がサザンブロット及び放射活性
ラベル化に較べて著しく低減される。更に様々な放出周
波数を有する複数の発色団を使用することによって、複
数の目標化合物の存在を同時に検出することが可能であ
る。即ち、例えば32Pのような同一種の放射活性化合物
ですべてラベル化された種々のプローブでサザンブロッ
トを繰返してハイブリダイズしなければならない代り
に、夫々が種々の異なる発色団を担持する多数のプロー
ブを同時に用いてブロットをハイブリダイズすることが
可能である。
こうした基本的方策（戦略）は、ニトロセルロース又
はナイロン膜のようなサザンブロット固体マトリックス
上に不動態化された目標物にハイブリダイズされた発色
団を検出するために用いることができるが、このような
発色団を溶液中又はゲル上で検出する場合に較べると数
オーダーの量だけ感度が落ちることが予想される。この
感度の損失は、ヒト又はトウモロコシのような高等真核
生物に於ける単一コピーDNA配列の実際的な検出が出来
なくなる程に大きいものであり得る。更にすでに記した
ように、ゲル中の制限DNA断片を膜に移し、RFLPをその
膜にハイブリダイズさせ、そして非結合プローブを除去
する段階を依然として実施しなければならないであろ
う。
以下に示す別の方法によって固体マトリックス上での
検出に伴なう潜在的問題が回避される。この別法は更
に、ゲルからゲノムDNA断片を移行させる操作を不要に
するといった追加の利点を有するものである。検出はゲ
ル中で行なわれるため、全操作中の操作段階数を著しく
少なくでき、単一試料について複数プローブを同時にア
ッセイすることが可能になる。
この方法においては、約15〜約20ヌクレオチド、又は
DNAプライマーとして機能するに充分な長さを有する二
つの一本鎖DNAプライマーを従来のサザンブロット分析
によって多型性を解明し得るものとして知られているク
ローン化プローブからの配列情報を用いて構築する。該
クローン化プローブの各末端からの短かい距離の配列を
決定することによって、５′から３′方向にプローブ末
端から外側に伸長する各末端に於ける配列を推論するこ
とができる。制限酵素消化によって得られるゲノム断片
の多型性領域をプローブは実際に含有していないかもし
れないが、該領域は有益な（informative）断片の両末
端間に位置する。もしも、二つのプライマーがクローン
化末端からゲノムDNA断片の残部方向に伸長したら、そ
の二つのプライマーは多型性ゲノム断片の末端で最終的
に停止するであろう。これら二つの伸長鎖のうちの少な
くとも一つは該多型性領域を必らず含むものであり、実
際には、この両者ともにかかる情報を備えていることが
証明されている。
このようなプライマーを各プローブについて作成した
後、以下に記すように、発色団を該プライマーに付着さ
せる。当然のことながら、発色団の付着によって該プラ
イマーの相補配列DNAへのハイブリダイゼーション及びD
NAポリメラーゼによる３′末端からの該プライマーの伸
長が妨害されるようなことがあってはならない。
被験ゲノムDNA試料を適当な制限酵素で消化して多型
性ないし情報を与え得る断片を作成する。全消化物を発
色団付着プライマーと混合し約３〜５分間加熱すること
によって一本鎖に変性させ、そして直ちに37℃浴に移し
そこで短期間維持する。この期間は変性DNA混合物を37
℃まで冷却させるに充分な期間である必要があるが、全
ての高等真核生物のゲノム中に存在する多数コピー配列
の多くが再結合できる程に長いものであってはならな
い。約数分間の期間で充分であろう一本鎖DNAの二重鎖D
NAへの再結合は時間及び含有配列の濃度に依存するた
め、そして、非反復配列のゲノム中に於ける濃度は極め
て低いため、数分間という時間内ではこれら配列の殆ん
どは再結合できないであろう。一方、相補的プライマー
は非常に高濃度、例えば、数ナノグラムで添加すること
ができるため、プライマーは相補的ゲノムDNA配列に対
して数千倍過剰になる。従って、このためにプライマー
はそれらの相補的ゲノム配列とほぼ瞬間的にアニールす
ることになり短かい二重鎖領域を形成する。
次の段階においてポリメラーゼ、好ましくは修飾T7DN
Aポリメラーゼ（シーケナーゼ）を四種類の個々の塩基d
ATP、dCTP、dGTP及びdTTPの全て及び適当な緩衝液とと
もに添加する。この酵素は、小さいプライマーを使用し
て非常に大きな一本鎖DNAを素早く複製する能力を有し
ている。多の研究では、種々の小さいゲノム配列（100
−200塩基の範囲）を増幅し検出するためにDNAポリメラ
ーゼの大フラグメント（Klenow）を用いてきたが、この
方法では、ヒト及び植物のRFLP分析にとって必要な大フ
ラグメント（2,000−12,000塩基もの範囲になり得る）
にとっては実用的ではない。クレノーフラグメント（kl
enow fragment）のコピー速度は遅すぎるため、繰返し
配列が存在するために、コピー操作が完全に終了する前
に変性鎖が再びアニールしてしまうことがありうる。一
方修飾T7ポリメラーゼは非常に早い複製速度及び非常に
高い連続移動性を有しており、この結果、数分間で10,0
00塩基の鋳型を複製することができる。本発明方法にお
いては、比較的短時間で修飾T7DNAポリメラーゼはプラ
イマーの３′末端をゲノム断片の末端までずうっと伸長
させる。この酵素はすでに形成された他の如何なるアニ
ール配列をも伸長することができる。発色団付着プライ
マーを伸長させたものだけが本発明方法において検出さ
れる。
反応生成物の二つの検出方法は以下のとおりである。
第一に、残存する一本鎖DNAをS1ヌクレアーゼで消化
し、また該酵素は伸長断片の反対側一本鎖DNA末端を除
去してこれを完全な二重鎖にしてしまう。この酵素は、
典型的には非常に過剰に加えられたプライマーの未使用
部分を全て破壊するようにも機能する。二重鎖DNAに複
製されたDNA鎖だけが次の単離段階で回収される。この
単離段階は、エタノール沈澱又はミニカラムクロマトグ
ラフィ等の従来公知の多数の技術のうちのいずれを用い
ても達成することができる。単離された断片は次いで標
準中性アガロースゲル上に移され電気泳動によりその大
きさに従って分離される。
もう一つの別の方法では、修飾T7DNAポリメラーゼに
よる処理に続いて、全反応生成物を一本鎖に変性し、変
性アガロースゲルシステムにおける電気泳動によって分
析する。前者の方法のほうが好ましい。何故ならば、ゲ
ルを汚す結果最終分析を複雑なものにしかねない未使用
の発色団を除去しているからである。
上記二方法のいずれに於いても、電気泳動後に、レー
ザーでゲルを走査して発色団を励起させ蛍光を発生さ
せ、これをリニアフォトダイオードアレイ検出器で検出
することができる。各発色団に特有の放出スペクトルに
関するデータを検討することによって、試験DNAの多型
性領域が検出される。更に充分量のプライマー、例えば
100アッセイ分のプライマーがいったん調製されたなら
ば、残りの段階、即ち、消化、変性、伸長、電気泳動、
及び検出が極めて短時間で完了させることができる。一
例として全操作を約20プローブ及び多数のゲノム試験試
料につき１作業日で実施することができる。従来のサザ
ンブロット法を用いて同量の作業を完成させようとすれ
ば、理想的な条件下でさえも、数ケ月かかる場合もあ
る。要約すれば、節約された時間及び費用はこのような
RFLP分析を利用する上で非常に重要なものであることが
判明するであろう。
レーザー誘起蛍光検出及び蛍光発色団を付着するよう
に化学修飾したDNA断片は現在市販されている（Prober
他、Science 238:338−341（1987））。DNA配列決定に
使われた技術は32Pオートラジオグラフィにとって代る
だけの感度を有しているが、選択された蛍光放出光の波
長でのみ検出し得るものである。つまり、上記Proberの
文献が示すように互いにその放出最大波長が近接してい
る４種の蛍光発色団までしか使われていない。
前述したように、蛍光フォトダイオードアレイ検出
系、例えば、Gluckman他、Anal.chem.57:1546−1552（1
985）、及び放出スペクトルが特異的な種々の蛍光発色
団でラベルしたRFLP断片のレーザー励起を組み合わせる
ことによって、分離ゲル媒体中で低濃度（10-16〜10-18
mole）のDNA断片を検出できるのみならず、コンピュー
ターの助けをかりてスペクトルを比較することによって
一つの蛍光発色団を他のそれと識別できるものである。
このことによって、単一の制限酵素によって生じたDNA
断片群を複数DNAプローブを用いて単独ゲルレーン中で
同時に分析することが可能になる。
本発明方法で使用する光学系は上掲のGluckman他のも
のを変更したものである。泳動後のゲルを水晶板（20×
20cm）上に載置する。該板をＸ−Ｙ座標に沿って移動さ
せ、単色光レーザービームで特異的蛍光発色団（DNAプ
ローブ）を含むDNA断片を示すバンドを励起する。高感
度リニアフォトダイオードアレイ（LPDA）検出器と組合
せた放出スペクトルグラフを用いて水晶板を通過する全
放出スペクトルを検出する。高感度LPDAからの出力を検
出器コントローラ／インターフェィスによってデジタル
信号に変換し、これをコンピュータに転送する。デジタ
ル信号の転送が早いため同一バンドを複数回走査するこ
とが可能で、これによってバックグランドノイズレベル
を低下させシグナルレベルを高めることができる。引き
続いて、コンピューターによる標準蛍光発色団のスペク
トルライブラリーによって対応DNAプローブに対して各
バンドの相関を求める。即ち、RFLP断片はその蛍光プロ
ーブ型及びゲル板のＸ−Ｙ座標によって同定される。蛍
光光度フォトダイオードアレイ検出器、スペクトル集積
（収集）及び比較のためのコンピュータプログラミン
グ、及びゲル走査駆動装置といった技術は存在している
が、これまでにRFLP分析用の複数DNAプローブを検出す
るためにこれらの技術が組み合されて使用されたことは
なかった。
以下に、プライマーの製造、発色団の選択、プライマ
ーラベリング、ゲノムDNAの消化、鋳型及びプライマー
の変性及びアニーリング（再結合）伸長反応、及びS1ヌ
クレアーゼ処理について詳説する。これ以外の方法及び
手段についても、同じ結果を奏効し得る限り、本発明で
使用することが可能である。
従来のサザンブロット分析において多型性を解明した
クローン化プローブを用いてプライマーを作成するのが
現在のところ好ましい。このようなRFLPプローブは、典
型的にはサザンブロット分析で検出する断片よりも小さ
いが、このことは必要条件でも必須条件でもない。ラン
ダムに又はその他の方法で選択されたPFLPプローブは、
複数のクローニング部位（MCS）を有し、MC Ｓ末端に相補的なプライマーを用いて挿入物の末端に至
るDNA配列を決定することが可能なプラスミド、例えばp
UC18内でクローニングすることができる。この系によっ
て、一回の操作によって容易に各末端から数百塩基の配
列を決定することができる。こうして得られた配列情報
は次に二種のプライマーを製造する際に用いることがで
きる。この二種のプライマーはゲノムDNA上で伸長され
て、元のクローン化プローブによって検出された多型性
領域のいずれをもカバーする伸長生成物を生ずることと
なる。例えば、いずれかの20塩基配列を一つのプライマ
ーとして使用して、これを鋳型の末端への一方向で伸長
することができる。もしも相補配列を第二のプライマー
として次に用いたとすれば、それは鋳型のもう一方の末
端に向って伸長されるであろう。従って、二つの有用な
プライマーを短かい塩基配列を決定する作業だけで選択
することが可能である。もしもその配列がゲノム中の他
の位置で見出された場合には、この選択されたプライマ
ーは有効でなくなる可能性がある。しかしながらこの分
析で用いられるプローブはそれらの相対的な非反復性
（uniqueness）に基づいて選択されているために、前記
のようなことは起りそうにないと思われる。当然のこと
ながら、もしも選択したプライマーがその後の分析に於
いて二つ以上の配列を明らかにしたような場合には、ク
ローン化プローブのもう一つの領域からもう一つのプラ
イマーを調製することが可能である。
固相ホスホラミダイト化学において知られている方法
によりオリゴマー（20マー）デオキシリボヌクレオチド
を合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチド製造の
後、これ等の合成ヌクレオチドを、第１級アルキルアミ
ン基、Ｎ−モノメトキシトリチル−メトキシ−N,N−ジ
イソプロピルアミノホスフィニル−３−アミノ−１−プ
ロパノールを同様に公知方法により５−末端に結合する
ことにより化学的に改変した。改変したオリゴデオキシ
リボヌクレオチドを単離し、精製し、市販のアミン選択
性螢光染料を結合することにより標識した。螢光標識オ
リゴデオキシリボヌクレオチドをHPLCにより精製し、異
なる制限酵素フラグメントクローンのプライマーとして
使用した。
改変オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成は、B.A.
Conolly（Nucleic Acids Reserch Vol.15（７）:3131,1
987）をいくらか改変したものに従って行なった。Appli
ed Biosystem DNA合成機を使用してオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドを生成した。３つのアミン選択性螢光物
質、ダンシルクロライド（dansylchloride,Aldrich C
o.）、FITC（フルオロセイン−５−イソチオシアネー
ト）及びNBD−フルオライド（４−フルオロ−７−ニト
ロベンズ−２−アザ−1,3−ジアゾール）（Molecular P
robes）を改変オリゴデオキシリボヌクレオチドを標識
するために選択した。
上記の螢光物質の１つを合成オリゴデオキシリボヌク
レオチドプライマーの５′末端に結合に使用するための
Ｎ−モノメトキシトリチル−Ｏ−メトキシ−N,N−ジイ
ソプロピルアミノホスフィニル−３−アミノ−１−プロ
パノールは以下のようにして製造した。Ｐ−アニシルジ
フェニルクロロメタン（7.72g,25mmol）及び３−アミノ
−１−プロパノール（7.5ml,100mmol）を乾燥CH2Cl
2（モレキュラーシーブ＃3A及び無水Na2SO4で過した
もの）50ml及び25mlにそれぞれ溶解した。Ｐ−アニシル
ジフェニルクロロメタン溶液を、機械的に攪拌されてい
る３−アミノ−１−プロパノールの氷冷溶液に一時時間
かけて滴下した。混合物を0.5時間室温に放置し、その
後５％NaHCO3（50ml）で２回洗浄し同容量の飽和ブライ
ンで洗浄した。洗浄したCH2Cl2溶液をNa2SO4（無水）で
乾燥し、真空下に濃縮した。濃縮混合物をEt20:ヘキサ
ン中に溶解し、液体窒素で冷却してＮ−モノメトキシト
リチル−３−アミノ−１−プロパノールを結晶化した。
結晶を回収し、黄色が全て消失するまで冷却ヘキサンで
洗浄した。Ｎ−モノメトキシトリチル−３−アミノ−１
−プロパノールの白色結晶を冷却Et20中で再結晶化さ
せ、真空中Si−ゲルで乾燥させた。4.5g以上の結晶が得
られた。生成物をTLC,1H−NMR及びFAB−MSで分析し、文
献値と比較した。
所望の中間体６−モノメトキシトリチル−３−アミノ
−１−プロパノールの合成の完了後、Si−TLCプレート
をCH2Cl2:CH3OH:ET3N（97:2:1,v:v:v）で１度展開し、
バニリンH2SO4により可視化した。出発化合物Ｐ−アニ
シルクロロジフェニルメタン及び最終生成物Ｎ−モノメ
トキシトリチル−３−アミノ−１−プロパノールはそれ
ぞれ0.9及び0.58のRf値を有している。生成物をFAB
（＋）MS及び1H−NMR（200MHz,CDC13,TMS）により特性
化した。FAB（＋）MSスペクトルは、m/z273（C2H170）
＋の大フラグメントイオンピークに沿ったM/z348の準安
定イオン（Ｍ＋Ｈ）＋を示し、これはC23H2502Nの分子
式を示している。Ｎ−モノメトキシトリチル−３−アミ
ノ−１−プロパノールの1H−NMRスペクトルは7.45−7.1
5（m,14H）,6.81（d,2H）,3.89（t,2H）,3.78（s,3H）,
2.34（t,2H）,1.69（ddd,2H）を示した。これ等の値は
文献値と非常によく一致する。実験値と文献値における
若干のRf値の差異は、TLC条件の多少の違いによるもの
であろう。これ等のスペクトルデータは、反応混合物
（65％収率）が所望中間体Ｎ−モノメトキシトリチル−
３−アミノ−１−プロパノールであることを明確に支持
するものであった。
N,N−ジイソプロピルエチルアミン（1.9ml,10mmol）
を、Ｎ−モノメトキシトリチル−３−アミノ−１−プロ
パノールのCH2Cl2溶液（10mlの乾燥CH2Cl2中1.73g,5mmo
l）に加え、混合物を氷上で冷却した。攪拌を続けなが
ら、N,N−ジイソプロピルメチルホスホラミディックク
ロライド（0.97ml,5mmol）を５分間で加えた。反応混合
物を氷浴中に10分間放置した。10分間の後、CH3OH（1.0
ml）を加え、さらに10分間室温に放置した。さらにCH2C
l2（25ml）を加え、５％NaHCO3（50ml）で２回、飽和ブ
ライン（50ml）で１回洗浄した。このCH2Cl2溶液をNa2C
O4（無水）で乾燥し、真空下に濃縮した。シリカゲルフ
ラッシュカラムクロマトグラフィーにより反応混合物か
らＮ−モノメトキシトリチル−Ｏ−メトキシ−N,N−ジ
イソプロピルアミノホスフィニル−３−アミノ−１−プ
ロパノールを精製した。適当なカラム分画の真空下にお
ける濃縮により1.67gの透明無色油が得られた。化合物
をTLC,31P−NMR及びFAB（＋）MSで分析した。
上記の反応の完了をTLCで再度確認した。TLCプレート
（Si）をヘキサン:Et3N（9:1,v/v）で一度展開し、U.V.
254nmランプの下で観察した。出発中間化合物Ｎ−モノ
メトキシトリチル−３−アミノ−１−プロパノール及び
最終生成物Ｎ−モノメトキシトリチル−Ｏ−メトキシ−
N,N−ジイソプロピルアミノホスフィニル−３−アミノ
−１−プロパノールはそれぞれ0.05及び0.63のRf値を有
する。この最終生成物をフラッシュカラム（Si）クロマ
トグラフィーで精製し、FAB（＋）MS及び31P−NMR（CDC
13/Eb3N,9:1,81.3MHz,H3PO4）により分析した。該最終
生成物のFAB（＋）MSスペクトルは、m/z509の準安定イ
オン（Ｍ＋Ｈ）＋を示し、C30H4103N2Pの分子式を示し
ている。最終生成物の31P−NMPスペクトルはH3PO4から
のダウンフィールドの147.73ppmで単一ピークを示し
た。この値は文献値148.29ppmとほぼ一致する。これ等
のスペクトルデータにより最終反応生成物がＮ−モノメ
トキシトリチル−Ｏ−メトキシ−N,N−ジイソプロピル
アミノホスフィニル−３−アミノ−１−プロパノールで
あることが同定された。
フラッシュカラムクロマトグラフィーは下記のように
して行なった。シリカゲル（40μｍ）をフラッシュカラ
ム中に湿潤充填した（CH2Cl2,15cm×3cm）。充填カラム
をヘキサン（200ml）で２回、ヘキサン−Et3N（3:1,200
ml）で１回洗浄した。反応混合物を少容量の溶出溶媒
（ヘキサン−Et3N,8:1）に溶解した。約10ml容量のフラ
クションを回収した。
Ｎ−モノメトキシトリチル−Ｏ−メトキシ−N,N−ジ
イソプロピルアミノホスフィニル−３−アミノ−１−プ
ロパノールで５′末端を改変したデオキシリボヌクレオ
シドの合成は以下の方法により行なった。オリゴデオキ
シリボヌクレオチド（20マー）は、当初結合ヌクレオチ
ドの約１μｍのスケールで通常の固相ホスホラミダイト
法により製造した。所望の配列合成が終了した後、Ｎ−
モノメトキシトリチル−Ｏ−メトキシ−N,N−ジイソプ
ロピルアミノホスフィニル−３−アミノ−１−プロパノ
ール（アセトニトリル中12.7mg,25μｍ）及びテトラゾ
ール60μｍを使用してさらに一巡の合成を行なった。こ
の結果の後、12/H2O/THFによるホスファイトトリエステ
ルの酸化、チオフェノールによる脱メチル化及びNH3に
よる塩基保護基の解裂と脱ブロック化を、新しく導入し
たNH2基を脱保護することなく行なった。粗製モノメト
キシトリチル保護オリゴヌクレオチドを逆相HPLCにより
精製した。精製オリゴヌクレオチドを80％HOAcの2mlに
２時間で溶解し、アミン基を脱保護した。２時間の後、
HOAcを蒸発により除去し、プロピルアミン基を有するオ
リゴマーを小容量の水に溶解した。
改変オリゴヌクレオチドを螢光物質に結合するため
に、改変オリゴヌクレオチドの水性溶液（100〜500μ
中0.01〜0.25μｍ）を等容量の５％NaHCO3/Na2CO3バッ
ファー（pH10）と混合した。NBD−フルオライド及びFIT
Cをジメチルホルムアミド（100μg/ml）で溶解し、ダン
シルクロライドをアセトニトリル中に溶解した（オリゴ
マーに対し100当量、１〜25μｍ）。これ等の螢光物質
溶液を改変オリゴヌクレオチド溶液に加え、３時間イン
キュベートした。螢光物質標識オリゴヌクレオチドを逆
相HPLCにより精製し、以下のRFLP分析に使用した。
B.試験植物DNA/延長プライマーDNAの増強 試験植物DNAの量を増強する方法は、アッセイの感受
性を増加させること及び単一塩基レベルでの配列変化を
検知することの両方に使用し得る。そのような改変を使
用することにより、微小な大きさの変化が検出できるば
かりでなく、DNA配列における変化自体を特性化するこ
とができる。植物の間では、変異の大部分は単一塩基対
レベルでの変化を構成するものであることから、上記の
ことは有意義である。このような変化の結果としてのゲ
ノムDNAフラグメント間の差異は、サザンブロッティン
グあるいはゲル電気泳動により実用的に検出するには大
きさが小さすぎる。また変異は塩基対の置換であること
があり、これは検出可能な大きさの変化を伴なわず、ま
た最もストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下以外ではプローブ（あるいはプライマー）の結合を阻
止することができない。さらに、上記例で使用するT7DN
Aポリメラーゼによるプライマーの延長においては、T7
を使用して延長された配列の部分におけるDNA配列のわ
ずかな変化は検出できない。プライマーDNAが試験植物D
NA結合する頻度はかなり低く、これはプライマーが由来
するプローブが、該植物のゲノム中のそれ等の低コピー
数に基づいて選択されるからである。従って、本発明の
改変の目的は、延長プライマーに結合した試験植物DNA
の量を選択的に増加させることである。
単一塩基レベルでの変異を検出し、同時に本発明の分
析をより自動化し易いものとするためには、プライマー
が結合した試験植物DNAを約100万倍まで増強する方法が
好ましい。試験植物DNAの量のこのような増加は、例え
ば、増強セグメントの直接の配列化を可能として単一塩
基対変化の検出及び特性化を可能とし、延長プライマー
／試験植物DNAの増強により信号（例えばプライマーに
結合した螢光物質標識からの螢光）の増幅を可能として
非常に低い当初濃度でも検出することを可能にする。さ
らに信号の増加により、より低感度の検出装置でよいこ
とになる。
ポリメラーゼ鎖反応すなわち「PCR（polymerase chai
n reaction）」は、延長プライマーDNA/試験植物DNAハ
イブリッドの選択的増幅に使用し得る方法の１つであ
る。PCRは米国特許4683195号及び4683202号に記載され
ており、これらは参考文献として本明細書の一部とす
る。この方法を使用することにより二本鎖延長プライマ
ー／試験植物DNAのみが増幅され、非結合一本鎖DNAは取
り込まれず変化しないまま残る。
本発明の所望のDNAフラグメントを増幅するためにPCR
法を使用するには、所望のフラグメントが正確に増幅さ
れるために充分短いものであることが必要であるが、殆
んどの場合PCRは約1kd未満のセグメントの増幅に限られ
ている。多形態性を示す試験植物ゲノムフラグメントは
その全体で1kbを超えていることが多く、従って多形態
性自体が、我々が使用した約1kbRFLPプローブの末端を
超えて存するものである。
この問題を解決するために、分析の焦点をRFLP自体
（即ち植物DNAにおける制限フラグメント長の差異）か
ら、試験した植物間におけるDNAの配列の変異に移し
た。この考えは、配列変異はRFLPに現われるが、RFLP分
析のみでは通常配列変異の性質そのままは示されないと
いうことに関連する。いい換えれば、分析は制限フラグ
メントの長さの変化に限定されるものではなく、長さに
おける変化を生起する配列変化についても行なうという
ことである。また、配列長の変化を起さないことがあり
得る塩基置換のような配列変化も含まれ、また実際上検
出できない長さの変化を生起するわずかな配列の付加及
び削除も含む。
プライマーが結合した試験植物DNAを増強するために
上記と同じ基本的方法を使用した。しかし、試験植物制
限フラグメントの末端に向ってそれぞれ外側に延長され
得る２つのプライマーを製造する代りに、内側に向って
延長され得るプライマー、即ち、それぞれが他方に向っ
て延長され従って試験植物の中間領域に向って延長され
得るプライマーを製造した。この方法においては、増幅
される二本鎖領域はプライマーが由来するプローブの大
きさに制限される。典型的にはプローブは1kb未満から
なるので、PCRを用いた増幅が可能である。
増幅の後、さもなければ非常に低いコピー数であるは
ずのゲノムDNA制限フラグメントの数100万に至るコピー
が生成され、配列化に充分なDNAが供給される。DNAポリ
メラーゼにより充填されたプライマー間の領域は、単離
物あるいは変異体間により異なることがあるので、実際
の配列における差異が特性化できる。
また、標識オリゴマーを使用した二本鎖延長プライマ
ー／試験植物DNAのプライマー間の領域の増幅により、
標識の信号も同時に増幅され得る。これにより検出方法
の複雑さを有意に減じることができる。
増幅の後は、種々の配列変異検出法が使用可能であ
る。下記の４つの検出法は例として記載するものであ
り、他の検出法は当業者に明らかであろう。
増幅領域における再配列により生起したサイズ多形態
性は、増幅領域上の標識を検出手段として使用してゲル
あるいはカラム上で直接分析することができる。この方
法によれば信号の強さは増加されるが、単一塩基対変化
は検出されそうにない。
もし、配列変化が増幅領域内に新しい制限部位を生成
すれば、増幅の前の試験DNA（内側に延長したプライマ
ーに係合した）の予備消化により増幅が阻止されるであ
ろう。試験植物間の増幅における差異は配列の変化の性
質を示すことになる。この「＋／−」タイプのアッセイ
は自動化を容易にする一方、制限部位の偶然の創生ある
いは破壊について信頼性がある。
試験植物ゲノムDNAが、延長プライマーに由来する配
列に対応する配列を有するか否かを同定するもう一つの
方法は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件
を使用することである。当業者には公知の、このような
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下におい
ては、非対応オリゴマー間のハイブリダイゼーションに
対して識別される。非標識オリゴマーと増幅させ、熱変
性させ、その後種々の配列変異体の全てに適合する標識
内部オリゴマーとストリンジェント条件下でハイブリダ
イゼーションさせることができた。この「＋／−」アッ
セイにおいては、特定の植物ゲノムフラグメントが、特
定の配列を含んでいるか否かを確認することができる。
非常に厳格なストリンジェントハイブリダイゼーショ
ン条件を使用して増強プロセスにおけるアニーリング段
階を行なうことによっても、試験DNAフラグメントが単
一の塩基対変化を含んでいるかさえ検出できる実用的な
アッセイが得られる。本質的に、異なるプライマーを使
用し、１つは増幅が要求されるものの末端に固定された
ものであり、別の２つはそれぞれの末端（３′末端）が
異なる塩基であるものである。この二つの可変プライマ
ーのそれぞれ、異なる標識により標識される。例えば、
１つを赤色螢光発色団で標識し、他方を緑色螢光発色団
で標識することができる。固定されたプライマーは、前
記標識プライマー（可変３′末端において）と、固定プ
ライマー自身の間の領域を充填することによって生成さ
れた完全オリゴヌクレオチドの逆の末端として作用す
る。この「固定」プライマーはストリンジェントハイブ
リダイゼーション条件下で、それぞれがその末端に異な
る塩基対配列を有し、異なる標識を有する種々のオリゴ
ヌクレオチドと共に試験植物DNAとアニーリングする。
次に、後述するように結合「固定」プライマー並びに
任意の結合可変プライマーを、例えばTaqポリメラーゼ
のような任意のDNAポリメラーゼを使用して互いに向っ
て延長する。次に試験植物／延長プライマー二重鎖DNA
を、オリジナルプライマーの標識の全てのコピーへの取
込みが可能な条件下で増幅させる。３′末端が不適合な
プライマーは極端な不充分な延長しか起さないので、試
験DNAにうまく適合する３′末端を有するオリゴマーの
みが増幅され得る。増幅生成物を分析して、例えば赤色
発色団、緑色発色団あるいはその両方といったようなど
のような標識が存在するかを確認することができた。検
出された異なる標識は、例えば、試験植物が同種接合体
親あるいは異種接合体遺伝子型かを示し得た。
最後に記載した検出方法をさらに改変して、選択した
固定プライマー及び標識可変プライマーとの間の距離に
基づいて増幅領域のサイズを変化させた。いくつかの異
なる遺伝子座間のこの距離を変化させ、それら全てを同
時に増幅させ（１つの容器で行なうことができる）、混
合物をゲル上に流し、分析することができた。種々のプ
ライマーの３′末端の変異を有する遺伝子座のそれぞれ
を、異なる発色団あるいは使用した他の標識を検出する
ことによりゲル上で異なる分子量の点で検出した。この
ようにして、ただ２つだけの標識を使用して単一のゲル
レーン中で多数の遺伝子座をスクリーニングできた。
以下に増幅及びゲノムDNAの配列化の手順をより詳細
に記載する。これ等のプロトコールと同じ結果を得るた
めの他の手段も可能であり、それらも有用であると考え
られる。
トウモロコシ（Maize）栽培変種植物からの遺伝子座288
及び451の直接配列化のための増強 以下は２つの異なるプライマーが結合したトウモロコ
シゲノムDNAのポリメラーゼ鎖反応増幅に使用したプロ
トコールである。試験したトウモロコシ系を以下に慣用
的な名称により示す。全てのトウモロコシ系は公共的あ
るいは商業的供給源より入手可能である。
使用したプライマーはHelentjaris,Trends in Geneti
cs ３:217（1987）に示されたようにトウモロコシ遺伝
子座からRFLPプローブを使用して従来の方法により製造
した。使用したプライマーのDNA配列は第２図から第10
図に示した。第２図〜第６図はトウモロコシ遺伝子座28
8の核酸配列を示す。プライマーとして使用した遺伝子
座の部分に下線を付し、特異的なプライマーを示した。
第９図及び第10図はトウモロコシ遺伝子座451のDNA配列
を示しており、やはり特異的プライマーを示した。プラ
イマーは従来の技術により、それ等の方向が使用したプ
ライマー間のPCRにより延長が可能となるように製造し
た。
下記のゲノムDNA/プライマー混合物を使用した。
１つの試験植物ゲノムDNA当り２つの対向するプライ
マーを使用した。
PCR増幅のプロトコールはPerkin Elmer Cetus（Norwa
lk,CT）により製造されたTaqポリメラーゼを使用して行
なった。製品のパンフレットに記載された手順をたどっ
たが、この手順は参考文献として本明細書の一部とす
る。またDNA配列の増幅について記載したLi et al.,Nat
ure 325:414（1988）も参照されたい。
非精製ゲノムDNA中のRNAは下記のものを10μを加え
ることにより消化した。
Rx（24X） dH2O 1248 μ 10X PCR 216 DMSO 240 ゼラチン 48 RNアーゼ 4.8 混合物を５分間室温、その後95℃で５分間でインキュ
ベートした。
前出の増幅キットの中のものとして提供されるTaqポ
リメラーゼを使用したポリメラーゼ鎖反応混合物は下記
のものである。
Rx（23X） dH2O 13.8 2.5mM dXTPs 184 10X PCR 23 酵素 9.2 ポリメラーゼ鎖反応は、93℃で２分間、55℃で２分間
及び72℃で４分間のそれぞれ30サイクルと最後の10分間
の延長サイクルに亘って行なった。上記のサイクルで、
ゲノムDNAの相補鎖の有意な再アニーリングなしに十分
なプライマーの結合が得られることが判明した。
各増幅生成物の10μをアガロースゲル上に流し、従
来のように調製し、臭化エチジウムで染色した。このゲ
ルは第11図に示した。このゲルは、288プライマーが試
験したラインの小部分にあることを示している。451プ
ライマーは約300bpのバンドを示している。ラインB14
は、288Aプライマー及び288EOLIプライマーを含有する
他の系よりも大きいフラグメントを示した。
サンプルの残りは配列化のために用意した（後記参
照）。23μの５×PCR停止混合物を加え、サンプルを5
0℃で60分間インキュベートした。サンプルをフェノー
ル及びクロロホルムでそれぞれ１回抽出し、Centricon
（Amicon Corp.,Lexington,Mass.）で３回透析した。そ
の後サンプルを酢酸アンモニウムで沈殿させ、10μの
バッファー中に再懸濁させた。
多数の栽培変種植物及び増幅器を使用したPCR増幅 ここでは、種々の栽培変種植物を種々のプライマーと
共に試験した。さらに、種々の量の試験植物DNAを使用
した。
上記と同じプロトコールをPCR増幅に使用し、10μ
を取りアガロースゲル上に流した（第12図）。このゲル
は臭化エチジウム染色により検出されるように近親交配
系の均一な増幅を示している。さらに、５μｇのDNAは
最適な増幅を促進するが、10μｇを使用したときは増幅
の減少が認められるようである。第11図に示したB14Aに
おける多形態性がやはり検出された。
試験植物DNAの量の増加、増幅サイクル数の変化及び試
験植物DNAの精製の増強の程度に対する影響 標準的な方法でトウモロコシ近親交配MTからのゲノム
DNAを単離し、全てのサンプルに使用した。プライマー2
88BOL1及び288EOL1の両方を各サンプルに使用した。下
記の「汚染」DNAは、タンパクあるいはその他の外来の
物質の除去のための予備処理をしていないMTゲノムDNA
を示す。「精製」DNAは、RNアーゼ処理したゲノムDNAサ
ンプルをフェノール及びクロロホルムで１回ずつ抽出し
たものである。PCR増幅の後、サンプルをさらに４回Cen
triconで透析し、酢酸アンモニウムで沈殿させた。DNA
沈殿物を80％エタノールで１回洗浄した。
PCRサイクル数も変化させ、サンプルを30回または35
回のサイクルにかけた。
使用したサンプルは以下の通りである。
1. １μｇの汚染DNA−35サイクルのPCR 2. ５μｇの汚染DNA−35サイクルのPCR 5. １μｇの汚染DNA−30サイクルのPCR 6. ５μｇの汚染DNA−30サイクルのPCR 8. １μｇの汚染DNA−30サイクルのPCR 15サイクルで酵素を付加 9. １μｇの精製DNA−30サイクルのPCR 10. ５μｇの精製DNA−30サイクルのPCR 15. ８と同じCentriconカラムサンプルを再使用 使用したPCR増幅は前記のものである。
サンプルのゲル電気泳動分析は、試験DNAの５μｇの
使用が、試験DNA1μｇを使用したときに得られるものよ
りも増幅DNAの量を増加させることを示している。PCR前
の精製はわずかに増幅の増加を示したが、有意なもので
はなかった。増幅においては、サンプルに35サイクルの
PCRを行なった場合でも30サイクルで検出されるものと
差異は認められなかった。
増幅反応物の直接配列化 増幅生成物の配列化の好ましい方法を示す。ここで使
用したサンプルは、上記の「多数の栽培変種植物及び増
幅器を使用したPCR増幅」の項で記載したように調製し
たサンプル８〜14である。
サンプル８〜14を25:24:1のフェノール:CHCl3:イソア
ミルアルコールで１回抽出し、次に24:1のCHCl3:イソア
ミルアルコールで１回抽出した。サンプルを30kDa Cent
rion限外過膜で４回過した。各過において2mlの
水で連続的に希釈した。最終的に得られた保持物を回収
し、最終濃度2MまでNH4OAcを加えた。２容量の冷エタノ
ールを加え、混合物を一晩−20℃に冷却した。
DNAの配列化を、Sequenase（商標）キット（U.S.Bioc
hemical Corp,Cleveland,OH）を使用し、製造者による
説明書に従い行なった。この説明書は参考文献として本
明細書の一部とする。PCR鋳型DNAを沈降させ、70％冷エ
タノールで洗浄した後、10μのバッファー中に溶解し
た。１μを電気泳動サンプルとして取ったが、これは
殆んどのサンプルにおいて約150〜300ngの回収に相当す
る。
残りの９μを沸騰水浴中で５分間加熱し、37℃に加
温した以下のプライマー／バッファー混合物の３μを
加えた。混合物は10μ５×sequenaseバッファー＋８
μ１μM288EOL1である。得られた混合物を短時間回転
させて液体を単一容量に回収し、室温で15分間DNAをア
ニーリングさせ、その後以下の混合物を5.5μを各管
に加えた。
X1 X8 1 8 1M DTT 0.4 3.2 非希釈 標識混合物 0.5 4 ［a35S］dATP 0.25 2 非希釈 Sequenase（商標） 3.35 27 水 末端溶液G,A,T及びＣの2.5μを含む管に各反応物の
3.5μを導入したときに、上記のように反応物を５分
間室温で標識した。
室温での５〜６分後に４μの反応停止溶液を各管に
加え、その後管を−20℃で凍結した。
種々のトウモロコシ栽培変異植物についてのトウモロ
コシ遺伝子座288及び451の配列を第13図及び第14図に示
す。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明方法の概略を示す図、第２図〜第10図は
本発明の実施に使用したプライマーのDNA配列を示す
図、第11図及び第12図は本発明によるPCR増幅を示すた
めのアガロースゲル上での分析の生物の形態を示す写
真、第13図及び第14図は種々のトウモロコシ栽培変異植
物の遺伝子座288及び451のDNA配列を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エス・マーク・リー アメリカ合衆国、ユタ・84124、ソル ト・レイク・シテイ、イースト・オーロ ーラ・サークル・3676 (72)発明者 ドナ・マリー・シヤタツク−エイデンス アメリカ合衆国、ユタ・84108、ソル ト・レイク・シテイ、バークリー・スト リート・1936 (56)参考文献 特開 昭62−281（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−249049（ＪＰ，Ａ) 欧州公開237362（ＥＰ，Ａ２)

Claims (32)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ） 制限断片長多型性プローブの一部
    分に充分相補的であり、蛍光分子でラベルされている少
    なくとも一つのオリゴデオキシリボヌクレオチドをプラ
    イマーとして用いてこれをオリゴデオキシリボヌクレオ
    チド延長酵素の存在下に制限目標DNA試料とハイブリダ
    イズさせ； （ｂ） （ａ）段階のハイブリダイゼーション混合物を
    ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ； （ｃ） 前記電気泳動後のハイブリダイゼーション混合
    物中に存在する全ての蛍光分子を光励起し； （ｄ） 前記光励起された蛍光分子の存在及び位置を同
    定する； 各段階から成る迅速な制限断片長多型性分析方法。
  2. 【請求項２】夫々が異なる制限断片長多型性プローブに
    対するプライマーとして有用であり、且つ夫々が異なる
    波長の蛍光を発する蛍光分子でラベルされている、二つ
    以上の前記オリゴデオキシリボヌクレオチドを段階
    （ａ）のハイブリダイゼーション混合物の調製に使用す
    ることを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】前記オリゴデオキシリボヌクレオチド延長
    酵素がDNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項
    １記載の方法。
  4. 【請求項４】前記DNAポリメラーゼがシーケナーゼであ
    ることを特徴とする請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】段階（ｃ）の光励起がレーザービームで行
    なわれることを特徴とする請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】前記レーザービームが広帯域レーザーから
    発生されることを特徴とする請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】前記光励起及び検出段階（ｃ）及び（ｄ）
    に先立って、電気泳動後のハイブリダイゼーション混合
    物を膜に移すことを更に含む請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】電磁波放出源； 一つ以上の蛍光発色団ラベル化制限断片多型性プローブ
    プライマーと制限DNA試料とのハイブリダイゼーション
    から得られた電気泳動ゲルパターンであって、前記放出
    源がその放出を前記電気泳動ゲルパターンに向けるよう
    に配置されているもの；出力信号を発生する、前記電気
    泳動ゲルパターン中の蛍光を検知する手段；及び 前記蛍光に応答する前記検知器によって発生した信号を
    受信する手段から成る、蛍光発色団ラベル化制限断片長
    多型性プローブプライマー及び延長プライマーを検出す
    る装置。
  9. 【請求項９】更に、一つ以上の集束レンズを前記電磁波
    放出源及び前記電気泳動ゲルパターンの間に有すること
    を特徴とする請求項８記載の装置。
  10. 【請求項１０】更に、前記電磁波放出源と前記電気泳動
    ゲルパターンとの間に電磁波を消去するための手段を有
    し、前記電磁波放出源から選択された放出波長のみが前
    記電気泳動ゲルパターンに向けられることを特徴とする
    請求項８に記載の装置。
  11. 【請求項１１】出力信号を発生する、前記電気泳動ゲル
    パターン中の蛍光を検知する前記手段が放出スペクトロ
    グラフ及び高感度リニアフォトダイオードアレイ検出器
    を含むことを特徴とする請求項８に記載の装置。
  12. 【請求項１２】少なくとも二種の核酸試験試料間の核酸
    配列における変化を検出する方法であって、 （ａ） 適当なハイブリダイゼーション条件下で、前記
    核酸試験試料を制限断片長多型性プローブの一部分と充
    分に相補的でありプライマーとして用いる少なくとも一
    つのオリゴヌクレオチドと接触させ； （ｂ） 前記ハイブリダイゼーション混合物を増強さ
    せ；そして （ｃ） 前記ハイブリダイゼーション混合物の増強生成
    物を検出する； ことを含む、前記方法。
  13. 【請求項１３】前記核酸試験試料が真核ゲノムDNAを含
    むことを特徴とする請求項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記核酸試験試料にハイブリダイズした
    ときに、プライマー間の領域において核酸試験試料と相
    補的な核酸鎖を作成するためにTaq DNAポリメラーゼが
    使用できるように配向されている二つの前記プライマー
    を使用することを特徴とする請求項12に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記増強がポリメラーゼ鎖反応法を用い
    て実施されることを特徴とする請求項12に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記ハイブリダイゼーション生成物の増
    強生成物の検出がゲル電気泳動によってなされることを
    特徴とする請求項12に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記ハイブリダイゼーション混合物の増
    強生成物がラベルされていることを特徴とする請求項12
    に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記ハイブリダイゼーション生成物の配
    列決定を更に含むことを特徴とする請求項12に記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】更に、前記ハイブリダイゼーション混合
    物の増強生成物を変性し、そして非相補的配列間の検出
    可能なハイブリダイゼーションは許さないようなハイブ
    リダイゼーション条件下で、既知の配列変化に対応する
    ラベル化オリゴマーを用いて再びハイブリダイズさせ、
    そして前記すでに変性された増強生成物とハイブリダイ
    ズしたラベル化オリゴマーを検出する段階を含むことを
    特徴とする請求項12に記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記核酸試験試料を （ａ） 固定プライマー；及び （ｂ） 少なくとも二つの可変プライマーと接触させ、
    （ｂ）の各プライマーはその３′末端において少なくと
    も１つの塩基が異っており、そして各々が異なるラベル
    でラベル化されており、前記接触が非相補的配列間の検
    出可能なハイブリダイゼーションを許さないハイブリダ
    イゼーション条件下で行なわれ、そして（ｂ）のラベル
    の存在を検出することを特徴とする請求項12に記載の方
    法。
  21. 【請求項２１】前記可変プライマーが前記核酸試験試料
    の異なる遺伝子座に対応することを特徴とする請求項20
    に記載の方法。
  22. 【請求項２２】核酸試験試料の少なくとも二つの領域間
    の核酸配列変化を決定する方法であって、 （ａ） 各々が制限断片長多型性プローブの異なる部分
    に充分相補的である二つの異なるオリゴマーと核酸試験
    試料をハイブリダイゼーションに適当な条件下で接触さ
    せ； （ｂ） 前記ハイブリダイゼーション混合物を増強し； （ｃ） 増強生成物を単離し；そして （ｄ） 増強生成物を配列決定する； ことから成る前記方法。
  23. 【請求項２３】前記増強がポリメラーゼ鎖反応によって
    行なわれることを特徴とする請求項22に記載の方法。
  24. 【請求項２４】核酸配列内の変化を検出する方法であっ
    て、 （Ａ） 試験生物のゲノムの非多型性領域に相補的な第
    １プライマーを合成し、 （Ｂ） 少なくとも第２プライマーおよび第３プライマ
    ーを合成するが、前記第２および第３プライマーの各々
    は前記ゲノムの第１多型性領域の異なる配列変化を識別
    し、かつ前記第１プライマーと同じ前記ゲノムのDNA鎖
    にはハイブリダイズしないものであり、 （Ｃ） 前記第２および第３プライマーをそれぞれ、蛍
    光スペクトルにおいて互いに識別可能な発色団でラベル
    し、 （Ｄ） 前記第１、第２および第３プライマーのすべて
    を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
    で前記試験生物由来のゲノムDNAと接触させて、ハイブ
    リダイゼーション生成物を生成させ、 （Ｅ） ポリメラーゼ鎖反応によって前記ハイブリダイ
    ゼーション生成物を増幅して、増幅産物を生成させ、そ
    の後、 （Ｆ） 前記増幅産物の蛍光スペクトルを分析して、ラ
    ベルの存在および、推定による前記ゲノムの第１多型性
    領域内の変化の存在を決定する、ことを含む前記方法。
  25. 【請求項２５】前記試験生物が真核生物であることを特
    徴とする請求項24に記載の方法。
  26. 【請求項２６】前記試験生物が植物であることを特徴と
    する請求項24に記載の方法。
  27. 【請求項２７】前記プライマーの全てが少なくとも16ヌ
    クレオチドの長さであることを特徴とする請求項24に記
    載の方法。
  28. 【請求項２８】前記ポリメラーゼ鎖反応をTaqポリメラ
    ーゼを用いて行なうことを特徴とする請求項24に記載の
    方法。
  29. 【請求項２９】前記ポリメラーゼ鎖反応をシーケナーゼ
    （ｒ）すなわち改変型T7DNAポリメラーゼを用いて行な
    うことを特徴とする請求項24に記載の方法。
  30. 【請求項３０】前記蛍光スペクトルを、レーザービーム
    による発蛍光団の光励起によって生じさせることを特徴
    とする請求項24に記載の方法。
  31. 【請求項３１】前記レーザービームが広帯域レーザービ
    ームであることを特徴とする請求項30に記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記第１多型性領域がさらに複数の多型
    性領域を含み、少なくとも前記第２および第３プライマ
    ーの各々が前記多型性領域の各々の異なる配列変化を識
    別することを特徴とする請求項24に記載の方法。
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