JPH08505529A

JPH08505529A - 植物に病気抵抗性をブリーディングする方法

Info

Publication number: JPH08505529A
Application number: JP6516237A
Authority: JP
Inventors: エー．リアルス，ジョン; ジェイ．ウクネス，スコット; パトリックデラニー，テレンス; アール．ワード，エリック
Original assignee: チバ−ガイギーアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1993-01-08
Filing date: 1994-01-06
Publication date: 1996-06-18
Also published as: AU689767B2; US5792904A; EP0677108A1; CA2152173A1; AU6084594A; WO1994016077A1

Abstract

(57)【要約】病気抵抗性をもつ親植物を選択するための及び品種改良計画においてこれらの植物を使用するための方法を提供する。本発明の１つの態様においては、病変疑似突然変異体を、問題の病原体に対する抵抗性又は全身（浸透）性獲得抵抗性（SAR）遺伝子の発現のいずれかについてスクリーンする。所望の特性をもち又は所望の遺伝子を発現するこのような突然変異体を次に品種改良計画において使用する。親植物を、SAR遺伝子の構成的な発現に基づいて選択することもできる。

Description

【発明の詳細な説明】植物に病気抵抗性をブリーディングする方法本発明は、植物における病気抵抗性に、特に植物における病気抵抗性を同定し、そしてそれをブリーディング（品種改良breeding）することに関する。病気は、特に、特定の原因から生じ、そして特定の徴候を特徴とする破壊的過程である。普通には、病気は、その宿主生物、その地域集団、又はその種の全体に損傷を引き起こす。一般的には、これらの徴候は、特定の原因、普通には病原生物に関係付けられることができる。植物においては、様々な病原生物が多種多様な病気又は病的徴候を引き起こす。その破壊的過程の重度は、その病原の激しさ及びその宿主の応答に依存する。多くの品種改良計画の１つの目的は、病気に対するその植物の抵抗性を増大させることである。多くの植物種においては、壊死性病原体による最初の接種がその後の感染に対してその植物を免疫感作することができる。この獲得された病気抵抗性は、1901年に最初に文書に記載され、そして自然における植物の保存において重要な役割を演じていると考えられている。植物免疫の特によく特徴付けられた例は、タバコにおける（全身）浸透性獲得抵抗性（systemic acquired resist ance（SAR））の現象及びキュウリにおける誘導抵抗性である。これらの系においては、壊死性病原体による接種がその病原体並びに多数の他の農業上重要なバクテリア、菌及びウイルス病原体によるその後の感染に対して全体性の保護をもたらす。免疫感作化合物は、植物において免疫応答を誘導する化学物質である。このような化合物は、天然起源を有することができ、例えば、サリチル酸、又は合成化学物質、例えば、2,6-ジクロロイソニコチン酸であることができる。病原体又は免疫感作化合物による処理は、タバコ、最も特徴付けされた種における少なくとも９セットの遺伝子の発現を誘導する。様々な数及びタイプの遺伝子が他の植物において発現されることができる。免疫感作化合物により誘導されたSAR-関連遺伝子についての誘導のレベルは、背景を10,000- 倍上回る程度の高さである。 SARに関連する遺伝子をクローン化するためのいくつかの努力がなされてきた。これらの遺伝子は、次に病原体に対する免疫性について植物を遺伝子操作するために使用されるとができるであろう。植物遺伝子操作における利点を超える剌激があるにもかかわらず、植物改良のためのこれらの技術の一般的な使用のための見込みが、問題の植物の特性に対応する非常に少ない遺伝子が同定され又はクローン化されたということの実現により軽減される。さらに、問題の特性はしばしば多-遺伝子ファミリーを含む。病原体又は病気抵抗性遺伝子を担持する植物についての選択はこれ故に骨の折れるものであり、そして時間がかかるものである。それ故に、植物品種改良計画における使用のために有用な抵抗性遺伝子を担持する植物を同定するための方法が必要とされている。本発明は、植物の集団から病原体に抵抗性である植物を選択する方法であって：（a）病変疑似表現型（a lesion mimic phenotype）をもつ植物におけるSARの発現又は病原体に対する抵抗性を評価し、そして（b）病原体に抵抗性である植物を選択する、を含んで成る方法に向けられている。従って、本発明は、植物に病気抵抗性又は病原体に対する抵抗性をブリーディングする方法に向けられている。病変又は病気疑似突然変異体は、所望の特性をもつ植物を同定するために使用されている。本方法は、問題の病原体に対する抵抗性又は浸透性獲得抵抗性（SAR）遺伝子の発現のいずれかに基づき病気病変疑似突然変異体を選択することを含む。所望の特性をもち又は所望の遺伝子を発現するこのような突然変異体は次に品種改良計画において使用される。あるいは、品種改良計画における使用のための植物は、SAR遺伝子の構成的発現に基づき選択されることができる。すなわち、SAR遺伝子を構成的に発現する可視性表現型の正常植物を使用することができる。子孫を問題の病原体に対する抵抗性又は浸透性獲得抵抗性遺伝子の発現のいずれかについてスクリーンする。本発明は、さらに、病原体により誘導されるときでさえ、浸透性獲得抵抗性遺伝子を発現しない植物突然変異体の選択及び利用に向けられている。このような突然変異体は病気及び病因テスト並びに殺菌剤スクリーニング計画における用途をもつ。植物に病気抵抗性をブリーディングする方法を提供する。特に、１つの態様において、その病変疑似表現型を品種改良計画のために問題の遺伝子をもつ植物を同定するための道具として使用する。病変疑似突然変異体は植物において広く知られている。このような病変疑似突然変異体は突然変異誘発から又は自発的突然変異により得られることができる。実際、明確な葉の病変形成を引き起こす優性及び劣性突然変異体の自発的及び突然変に誘導ケースの両方が、コーン、トマト、小麦、大麦、タバコ、ヒマワリ、キュウリ、等を含む多数の植物において報告されている。例えば、Neuffer and Calvert（1975）The Journal of Heredity 66:265-270；Cameron J.W.（１964） Maize Genet．Coop．News Letter 38:32-33；Gardner C.0.（1971）Maize Genet ．Coop．News Letter 45:150; Hornbrook and Gardner（1970）Rad．Botany 10: 113-117；Simmonds N.W．（1950） Maize Genet．Coop．News Letter 24:26-27；及びWalbot et al.（1983）in Gen etic Engineering of Plants， Kosuge et al．（eds.）Plenum Publishing Corp oration，1983を参照のこと。本発明は、病変疑似表現型がSAR及び病因関連タンパク質の発現に関連し、そしてSARの発現がその病因表現型から分離されることができるということを最初に認識することにある。これらの遺伝子の発現は、付加された抵抗性因子として品種改良計画において実質的な重要性を有することができるであろう。それ故、本発明の１つの態様は、植物に病原体に対する抵抗性をブリーディングする方法であって：（a）浸透性獲得抵抗性遺伝子を発現し又は病原体に対して抵抗性である病変疑似表現型突然変異体を選択し；（b）品種改良計画において上記病変疑似表現型突然変異体を使用し；そして（c）所望の表現型特性（phenotypic traits）をもつ病原体抵抗性子孫を選択する、を含んで成る方法を表す。本発明の好ましい態様においては、病変疑似表現型突然変異をであって構成的にSAR遺伝子を発現するものを選択する。病因関連タンパク質（PRタンパク質）は、病原体による感染後に誘導される植物タンパク質である。これらのタンパク質の中のいくつかは、植物に浸透性獲得抵抗性を提供することにおいて役割をもつ。これらの植物タンパク質は、ウイルス、バクテリア及び菌を含む様々な病原体による感染に応答して多量に誘導される。病因関連（Pathogenesis-related（PR））タンパク質は、タバコ・モザイク・ウイルス（TMV）による感染に対して過敏に反応するタバコ植物（Nicotiana t abacum ）において最初に発見された。その後、PRタンパク質は、多くの植物種において発見された（Redolfi et al．（1983）Neth J Plant Pathol 89:245-254；Van Loon（1985）Plant Mol．Viol.4:111-116；及びUknes et al．（１992）Plant Cell 4:645-656を参照のこと。）このようなタンパク質は、病原体による感染に対する植物の共通の防御的浸透（全身）性応答であると信じられている。病因関連タンパク質は、非限定的にSAR8.2a及びSAR8.2bタンパク質、タバコPR -1a、PR-1b及びPR-1c、，PR-1'、PR-2、PR-2'、PR-2''、PR-N、PR-O、PR-O'、PR -4、PR-P、PR-Q、PR-S、並びにPR-R主要タンパク質の酸性及び塩基性形態、キュウリ・ペルオキシダーゼ、塩基性キュウリ・ペルオキシダーゼ、PR-P又はPR-Qの塩基性の相手であるキチナーゼ（chitinase）、並びにベータ-1,3-グルカナーゼ（グルカンエンド-1,3-ベータ-グルコシダーゼ、EC 3.2.1.39）であってPR-2、P R-N又はPR-Oの塩基性の相手であるもの、並びにキュウリからの病原体誘導性キチナーゼ、を含む。例えば、Uknes et al．（1992）The Plant Cell 4:645-656 及び本明細書中に引用する文献、並びに欧州特許出願公開番号第0392225号（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。 SAR又はSAR-様遺伝子は、浸透性獲得抵抗性を示すすべての植物種において発現される。このような遺伝子の発現は、公知のSAR DNA遺伝子によりプロービングすることにより決定されることができる。例えば、Lawton et al．（1992）Pr oceedings of the Second European Federation of Plant Pathology（1983）， In：Mechnismsof Defense Responses in Plants，B．Fritig and M．Legrand（e ds），Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，pp．410-420；Uknes et al．（1992）The Plant Cell 4:645-656；及びWard et al．（1991）The Plant Cell 3:1085-1094を参照のこと。ハイブリダイゼーション及びクローニングのための方法は、本分野においてよく知られている。例えば、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2ndEdition，Vol ．1-3，Sambrook et al.（eds.）Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989 ）及び本明細書中に引用する文献を参照のこと。あるいは、このようなSAR又はSAR-様遺伝子を他の方法、例えば、タンパク質スクリーニング、±スクリーニング、等により見つけることができる。例えば、欧州特許出願公開番号第0392225号；Liang and Pardee（1992）Science257:967- 971；及びSt．John and Davis（1979）Cell 16:443を参照のこと；本明細書中引用により取り込む。本発明は、SAR遺伝子が植物における幾つかの病変疑似突然変異体において構成的に発現されるということを認める。さらに、この病変疑似表現型は、そのSA R遺伝子の発現から分離されることができる。それ故、SAR遺伝子を発現する病変疑似突然変異体は、品種改良計画において利用されることができる。子孫は、そのSAR遺伝子の発現又は病原体に対する抵抗性及び所望の表現型に基づいて選択されることができる。本法は、品種改良計画における使用のための病原体に対する抵抗性の追加の源を提供する。本発明は、さらに、SAR遺伝子がいずれの病変形成又は壊死を示さない植物において構成的に発現されることができる。すなわち、これらの植物は、正常な表現型を表す。このような植物も、品種改良計画において使用されることができる。SAR遺伝子を構成的に発現する表現型として正常な植物を同定し且つ選択するために、ノーザン分析を行ってSAR遺伝子の発現を検出する。公知のSAR DNA配列を、Uknes et al．（1992）The Plant Cell 4:645-656中に記載されたように交差ハイブリダイゼーション実験において利用することができる。核酸配列のハイブリダイゼーション及びクローニングのための方法は本分野においてよく知られている（Molecular Clonlng，A Laborat ory Manual，2nd Edition，Vol．1-3，Sambrook et al．（eds.）Cold Spring H arbor Laboratory Press（1989）及び本明細書中に引用する文献を参照のこと。）。一旦、SAR遺伝子を構成的に発現する植物が選択されると、それらは、そのSAR 遺伝子の構成的発現及び植物系への病原体に対する抵抗性を取り込むために品種改良計画において使用されることができる。さらなる交配のための子孫は、その SAR遺伝子の発現及び病気抵抗性に基づいて並びに生産及び品質のために重要な他の特徴について選択される。本発明に係る病原体は、非限定的に、ウイルス又はウイロイド、例えば、タバコ又はキュウリ・モザイク・ウイルス、輪紋病（ringspot）ウイルス又は壊死ウイルス、ペラルゴニューム属の葉曲がりウイルス（pelargonium leaf curl viru s）、レッド・クローバー斑点ウイスル、タバコ矮化（bushy stunt）ウイスル、等のウイルス；菌、例えば、フィトフトーラ・パラシティカ（Phytophthora par asitica）、ペロノスポーラ・タバシナ（Peronospora tabacina）、等；バクテリア、例えば、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・タバシ（Pseudomonas tabaci）、等；昆虫、例えば、アブラムシ（sphi ds）、例えば、ミザス・ペルシカエ（Myzus persicae）；線虫（nematodes）、例えば、マレイドジン・インコグニータ（Meloidogyne incognita）；鱗翅目（l epidoptera）、ヘリオタス・エスピーピー（Heliothus spp.）、等を含む。本発明の方法は、メイズの多数の病気生物であって非限定的に、べと病菌（downy mi ldews）、例えば、スクレロプトーラ・マクロスポラ（Scleropthora macrospora ）、スクレオプトーラ・レイシアエ（Scleropthora rayssiae）、スクレロスポーラ・グラミニコラ（Sclerospora graminicola）、ペロノスクレロスポーラ・ソルギ（Peronosclerospora sorghi）、ペレノスクレロスポーラ・フイリピネンシス（Peronosclerospora philippinensis）、ペレノスクレロスポーラ・サッカリ（Peronosclerospora sacchari）、ペレノスクレロスポーラ・メイディス（Peronosclerospora maydis）；サビ菌（rusts）、例えば、プシニア・ソルフィ（Puccinia sorphi）、プシニア・ポリソラ（Puccinia po lysora）、フィソペラ・ゼアエ（Physopella zeae）；他の菌、例えば、セルコスポラ・ゼアエーメイデイス（Cercospora zeae-maydis）、コレトトリカム・グラミニコラ（Colletotrichum graminicola）、フザリウム・モノリフオルメ（Fu sarium monoliforme）、エクセロヒラム・ターシカム（Exserohilum turcicum）、ビポラリス・メイディス（Bipolaris maydis）；及びバクテリア、例えば、アーウィニア・スチュワーティ（Erwinia stewartii）を含むものに対して有用である。本発明は、使用可能な抵抗性遺伝子を同定するために一般的に必要な世界コレクション及び関連種を含む多量の材料のスクリーニングを回避する。その代わりに、抵抗性遺伝子を潜在的に発現する植物を同定するために病変疑似表現型を使用する。従って、問題の植物の病変疑似突然変異体を、問題の病原体に対する抵抗性について又はあるいはSAR遺伝子の構成的発現について選択し、そしてテストする。このような突然変異体を次に品種改良計画において使用して品種改良系にその抵抗特性を導入する。すなわち、SAR遺伝子の構成的発現を植物に導入する。このようなSAR遺伝子の構成的発現は、病原体に対する免疫性に関連する。品種改良計画においてSAR遺伝子を構成的に発現する選択された病変突然変異体又は植物の使用の後に、その抵抗特性を、生産及び品質にとって重要な他の特徴との組み合わせにおける品種改良を通して植物系に導入する。品種改良のアプローチ及び技術は本分野において公知である。例えば、Welsh J．R.，Fundamentals of Plant Genetics an d Breeding ，John Wiley & Sons，NY（1981）；Crop Breeding，Wood D．R．（E d.）American Society of Agronomy Madison，Wisconsin（1983）；Mayo O.，Th e Theory of Plant Breeding， Second Edition，Clarendon Press，Oxford（198 7）；Singh，D.P.，Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests， Springer-Verlag，NY（1986）；及びWricke and Weber，Quantitative Genetics and Selection in Plant Breeding， Walter de Gruyter andCo.，Berlin（1986 ）を参照のこと。病変は、病原体の感染部位の直近の組織の局所的壊死並びにその病原体のその後の局在化により特徴付けられ、これは、その病原体がその植物じゅうに広がるような過敏反応と対照的である。病変疑似突然変異体は、病原体とのいかなる接触をもたずにその過敏反応を示す。病気病変疑似は、メイズ、トマト、小麦、アラビドプシス（arabidopsis）、オーツ、タバコ、ヒマワリ、キュウリ、等を非限定的に含む様々な植物において報告されている。従って、本発明は、病変疑似突然変異体が突然変異誘発を通じて発見され又は導入されることができるいずれかの植物を品種改良することにおいて使用されることができる。突然変異誘発及び選択のための方法は本分野において公知である。病変疑似突然変異体又はSAR遺伝子を発現する表現型的に正常な植物が同定された後、さらなる分析であって品種改良計画において有用である情報をもたらすものを行うことができる。例えば、SAR遺伝子の発現及び抵抗性に関連した制限断片長多形態（RFLP）を同定することができる。一旦、この病気抵抗性に関連する少なくとも１のRFLPが決定されれば、このRFLPを次にその抵抗性表現型の存在についてスクリーンするために使用することができる。RFLPsは、結合した遺伝子マーカーの同定を通してその植物ゲノムに対して農業的特性を及ぼす遺伝子を同定するために植物の品種改良者にとって貴重である。DNA多形態と農業的な重要性をもつ特徴との間の遺伝子的関連の分析は、農業的に重要な遺伝子を同定し、それらの遺伝子に従って同系（inbreds）及びハイブリッド（hybrids）及び品種改良集団を分類し、そしてその後これらの遺伝子を改良された同系及びハイブリッドにより効率的に導入するために有用である。病気抵抗性に関連したRFLPsは、品種改良者にとって大きな価値を有するであろう。それ故、本発明は、その病変疑似表現型及びSAR遺伝子の発現に関連したD NA多形態を同定するために染色体を分析することを包含する。本発明を行うために、病変突然変異体表現型を最初に、病気抵抗性に関連した表現型として使用する。次にRFLPsであって、その病変表現型及び病気抵抗性と関連するものが見つけられることができる。次にそのRFLPをその品種改良計画において使用することができる。特異的なプローブと農業的に重要な特性の遺伝子成分との間の同定された遺伝子結合を、メンデル遺伝学に基く”クラッシクな” 植物品種改良において植物及び集団を選択することにおける助けとして使用する。 RFLPsを測定するための方法及び特定の特性に関連する多形態の同定は本分野において公知である。例えば、Burr et al．（1983）The application of restr iction fragment length polymorphism to plant breeding．In Genetic engine ering principles and methods ，Vol．5（eds J．D．Selow＆A．Hollaender）pp ．45-59．NewYork，Plenum Press；Helentjaris T．（1987）Trends in Genetic s3:217-221；Helentjaris et al．（1985）Plant Mol．Biol．5:109 -118；国際出願WO 89/07647;欧州特許出願公開第0317239号；及び欧州特許出願公開第0306139号を参照のこと。本発明に従って多形態を同定するための典型的な方法においては、DNAは、その植物細胞から抽出され、そして所定の制限エンドヌクレアーゼにより消化される。その消化物が得られ、そしてその消化されたDNAが標準的な技術、例えば、アガロース・ゲル電気泳動により分離された後、その分離されたバンドを、その RFLP配列をコーディングしているDNA配列によりプローブする。プローブは、それがその所望の特性への結合をテストするために有用である場合に、多形態を検出することが見つけられなければならない。その多形態は、特性に影響を及ぼす遺伝子又は研究中の他の有用なマーカーに結合されること、又は前-現存マーカーに直に隣接することが見つけられなければならない。特定のプローブは、それが関連DNA領域又は座内の多形態を同定することができる限りいずれかの望ましい配列を有することができる。特定の特性のためにその遺伝子にも結合した追加の新たなDNA断片を生成するための方法を以下に記す。第一の方法は、そのゲノム・マップの適当な領域にマップするランダムに選ばれたDNA断片をテストすることである。このようなマッピングは、中期染色体スプレッドへのインサイチュー・ハイブリダイゼーションにより又はその領域に既にマップされたいずれかのマーカーへの遺伝子結合により達成されることができる。追加のDNAプローブは、中期染色体から単離されたDNAからライブラリーを構築することにより得ることができる。このような染色体を例えば、蛍光活性化ソーター上でソートすることができる。最終的に、新たなDNAプローブを、ゲノム・ライブラリーからのDNAの隣接重複片を”釣り上げる（fish out）”するための領域に既にマップされたいずれかのプローブを使用すること（染色体歩行）による農業的に重要な遺伝子を含む染色体の領域から得ることができる。病気抵抗性遺伝子に結合したマーカーの同定のための他の方法は、本分野において公知であり、そして本発明において使用することができる。このような方法は、非限定的に、マーカーを素早く同定するための方法としての分離（segregan t）分析（Michelmore et al．（1991）proc．Matl．Acad．Sci．USA 88:9828-98 32、引用により本明細書中に取り込む。）、及びWilliams et al．（1990）Nucl eic Acids Res．18:6531-6535（引用により本明細書中に取り込む。）により記載されているようなPAPD（ランダム増幅多形態DNA）の使用を含む。 DNAを標識付けするための、及びハイブリダイゼーションのための方法は、本分やにおいて公知である。例えば、Sambrook et al.，前記を参照のこと。本発明は、さらに、それらが浸透性獲得抵抗性に関連した遺伝子を発現しないような病原体感染へのそれらの正常な応答において欠陥をもつ突然変異体に関する。これらの突然変異体は、（非-誘導性免疫（non-inducible immunity）のために）nim突然変異体といわれ、そしてそれらが、その宿主植物の病原体の多くの株及び病因型に感受性であり、そしてまたその宿主植物に正常には感染しないが他の宿主には感染する病原体に感受性であるために、”全病気感受性（univer sal disease susceptible（UDS））”として有用である。それらは、突然変異誘発剤により種又は他の生物学的材料を処理し、そして次に浸透性獲得応答の公知の化学的誘導物質（例えば、INA）により子孫植物を処理することによるそのUDS 表現型について子孫植物を選択し、そして次に公知の病原体によりその植物を感染させることにより、選択されることができる。非-誘導性突然変異体は、これらの環境下で重度の病気徴候を顕出し、一方、非-突然変異体は、その化学的化合物により浸透性獲得抵抗性に誘導される。nim突然変異体は、化学的及び放射突然変異誘発により生成された突然変異体集団から、並びにT-DNA挿入及びトランスポゾン-誘導突然変異誘発により生成された集団から等しく選択されることができる。突然変異体植物系を生成する技術は、本分野においてよく知られている。 nim突然変異体は、いわゆる野性型（すなわち、非-突然変異体）植物の自然の抵抗性表現型が変化することができる畑病因テストにおける病気圧の評価の有用な指標を提供し、そしてそれ故、感受性の信頼できる標準を提供しない。さらに、nim植物は、候補病気抵抗性トランスジーンのテストのための追加の用途をもつ。トランスジーンのための受容体としてnim保存系を使用して、病気抵抗性に対するトランスジーンの貢献を感受性の基準レベルを上回って直接的に評価することができる。さらに、このnim植物は、植物-病原体の相互作用の理解における道具として有用である。nim宿主植物は、病原体攻撃に対する浸透性応答を高めず、そしてその病原体の減っていない発展は、その宿主とのその生物学的相互作用を研究するための理想系である。 nim宿主植物は、それらが正常に降下するその宿主-レンジの外側の病原体に感受性であることもできるので、これらの植物も、宿主-病原体相互作用の分子、遺伝子、及び生物学的研究において重要な用途をもつ。さらにまたnim植物のUDS 表現型は、それらに殺菌剤スクリーニングのための用途を与える。特定の宿主において選択されたnim突然変異体は、その宿主及びその宿主の病原体を使用する殺菌剤のスクリーニングのためのかなりの用途をもつ。利点は様々な病原体及び病因型に異なって感受性であり又はさらに幾つかの病原体又は病因型に抵抗性である宿主により遭遇する問題を回避する突然変異体のUDS表現型にある。 nim突然変異体は、異種宿主、すなわち、特定の病原体の宿主種レンジ内に正常にはあることができない宿主を使用して病原体及び病因型のレンジに対して殺菌剤をスクリーニングするためのさらなる用途をもつ。従って、他の種（例えば、穀物植物種）の病原体に対する（容易に操作可能な種であり、そして限定された空間要求をもつ）アラビドプシス（Arabidopsis）のnim突然変異体の感受性は、穀物植物の重要な病因に対する化合物についての効き目のある殺菌剤のスクリーニング手順を容易にするであろう。以下の実施例を、説明のために、そして限定のためではなく、提供する。実施例アラビドプシス病気疑似（Arabidopsis lesion mimic）病気疑似を、（全身）浸透性獲得抵抗性（SAR）といわれる誘導された抵抗性現象に関連する一連の遺伝子の変更された発現をもつアラビドプシスの突然変異体についてスクリーンの間に単離された。特に、我々は、M2、個々にマークされた容器内のエチル・メタン・スルホネート（EMS）処理植物を育てた。この植物が３週齢にあったとき、１〜２の葉をそれぞれの植物から収穫した。RNAをその葉サンプルから単離し、そして病因関連PR-1及びPR-2cDNAs（SAR遺伝子）によりプローブされたRNAゲル・ブロットを使用して分析した。種を、これらの２つのR NAsの高いレベルの発現を示す植物から単離した。プローブとしてアラビドプシスPR-1遺伝子を使用して、27の中から１の植物（79#）が、PR-1の高いレベルの発現を示した。さらに、興味深い形態学的な表現型のいずれをも記録した。１つの植物が、より古い葉の中央脈の内側に広がった葉の周辺上に病気-様徴候を示した。これらの病変は、その植物が９時間昼間の下で成長したとき約３週齢であるとき最初に観察可能である。その表現型を与えるように突然変異された特性を付与する遺伝子がcim1（ cim=構成的免疫性）といわれた。この元の植物からの子孫が成長するとき、約半分がその病変-疑似表現型及び高いレベルのSAR遺伝子発現をもつ。その植物の残りは、表現型として正常に見え、そしてSAR遺伝子発現の低い-背景レベルをもつ。これらの結果は、その突然変異体ciml遺伝子が、その病変疑似表現型及び変更された遺伝子発現の両方を引き起こす優性な効果をもち、そしてその元のcim1植物が、ヘテロ接合体であるということと矛盾しない。このcim1突然変異体を、シュードモナス（Pseudomonas）及びペロノスポラ（P eronospora ）による感染に対する感受性／抵抗性についてテストした。バクテリア病原体シュードモナスについて、in plantaバクテリア成長を、Debener et al ．（1991）Plant J 1:289-30２により記載された手順を使用して10⁵コロニー形成単位/mlの注射による接種の後５日間にわたりモニターした。典型的には、そのcim1突然変異体系は、野性型と比べて１オーダーの大きさ程成長における減少をもたらした。これは、そのcim1系がシュードモナスによる感染に対する強化された抵抗性をもつことを示していた。その菌の病原体ペロノスポラ・パラシティカ（Peronospora parasitica）に対する感受性／抵抗性を評価するために、４週齢の植物を、水中の新たな分生子の2mlの懸濁液（10⁵胞子/ml）を使用して葉接種するか又は空気植物表面の全体（10⁶胞子/ml）に対してスプレーするかのいずれかを行った。この胞子懸濁液をDangl et al．（1993）Int Rev Cytol 144:53- 83により記載されたように調製した。野性型との比較について、cim1植物は、より少ない菌糸成長及び分生子生産を示した。その葉の表面は、肉眼観察により野性型植物よりもペロノスポラ菌糸がより透明であり、そしてそれ故その植物は、その菌に対する高められた抵抗性を示した。以下の表Ｉはデータの要約を示す。変更された菌形態学及び抵抗性表現型は、SAR-誘導性化学的INAにより前処理されたアラビドプシス植物において示されたもの（Uknes et al．（1992）Plant Cell4:645-656）と類似していた。上記病気疑似（cim1）に加えて、構成的SAR遺伝子発現の高いレベルをもつ他の突然変異体を発見した。これらの突然変異体（cim2及び他のもの）の幾つかは、明らかでない表現型をもつ非常に高いレベルをもつ。これらのcim突然変異体は３つの異なるクラス：cimI cimII、cimIIIに分類される（表II）。cimI突然変異体は、病変、高く構成的なサリチル酸レベル（SARのための内因性シグナル）、及びSAR遺伝子発現の高く構成的なレベルをもつことを特徴とする。クラスII突然変異体は、その病変疑似表現型をもたないクラスＩと同じものである。クラスIII突然変異体は、SAの増加されたレベル又はその病変疑似表現型をもたないSAR遺伝子発現の増加されたレベルをもつ。上記EMS処理は、以下のように行われた：アラビドプシス・サリアナ（Arabido psis thaliana）の生態型Columbia種を12-24時間EMSの溶液中に入れ、その種を次に洗浄し、そして植え付けた。その植物が成熟したとき、1000植物の群を収穫し、そしてその種を別々に番号付けしたロットにおいて維持した。これらの種は、植え付けられたM2種であった。EMS-処理種をLehle種，Tucson，AZから購入することができる。タバコ病変疑似病因関連タンパク質Ｑにより形質転換された1791C-18-2と名付けれた１つのトランスジェニック・タバコ系は、病変疑似表現型を示した。十分に増加されたレベは、多くの、11-20ミリメーターの壊死領域をもっていた。これらの病変は、典型的には、その中心において明るい茶色であり、暗くなった組織により取り囲まれていた。その植物が約５週齢であったとき、それらは、土壌中適用によりフィトフトーラ・パラシティカ（Phytophtora parasitica）により感染され、そしてフィトフトーラ・パラシティカ（Phytophtora parasitica）に対する抵抗性が観察された。しかしながら、PR-Qについてトランスジェニックであるがその病変疑似表現型をもたない他の植物系は、フィトフトーラ・パラシティカ（Phytophtora parasitica）に対して抵抗性ではなかった。これは、その観察された抵抗性がその植物の変更された表現型（病変疑似）及びそのトランスジーンの非存在により引き起こされる。PR-Qを構成的に発現するトランスジェニック系1791C-18-2の構築及び特徴１.精製PR-Qの調製（一般的な方法については、欧州特許出願公開第0392225号（引用により本明細書中に取り込む）を参照のこと。） Nicotiana tabacum cv．Xanthi.ncの植物を温室内で栽培し、そして、カルボランダム（carborundum）を含む10mMリン酸ナトリウム（pH 7.0）の溶液中0.5マイクログラム/mlの濃度におけるタバコ・モザイク・ウイルスの一般株（U1）の懸濁液によりその葉を擦ることにより８週齢時に感染させた。葉を７日後に収穫した。この細胞間-液画分を、Parent andAsselin，（1984）Can．J．Bot．62:56 4-569の真空浸潤方法によりその葉から調製した。タンパク質PR-P及びPR-Qを、U ltragel AcA54カラム、DEAE-Sephacelカラム、及び逆相HPLCフェニル・カラムを通しての順番に精製することによりその画分中に存在する他のタンパク質から分離し、そしてそおれらの回収を、Giannina zzi and Kassanis，（1974）J．Gen．Vir．23:1-9により記載されたように10％非変性ゲル上の精製画分と粗細胞間-液のサンプルとを比較することによりモニターした。純粋なPR-Qを、10-250mM酢酸アンモニウム（pH 7.0）のグラジエントを使用して、Brownlee Labs AX-300 HPLCイオン- 交換カラム上のクロマトグラフィーによりPR-Q及びPR-Pの混合物から得た。２.PR-Qのアミノ酸配列臭化シアノゲン及びトリプシン作用のペプチドを本分野においてよく知られた方法により調製し、そして精製し、そして自動エドマン分解及び分析に供した。３.PR-Q cDNAの単離及びクローニングタバコの葉を、先に記載したように感染させ、そして５日後に収穫した。RNA をLagrimini et al．（1987）PNAS 84:7542-7546の方法により調製し、cDNAをGu bler and Hoffman，（1983）Gene 25:263-269の方法によりそれから調製し、そしてのcDNAをStratageneから入手可能なラムダOngCファージ・ベクターのEco RI 部位にクローン化した。そのライブラリーをプレートし、そして２連フィルター・レプリカを行った。このフィルターを以下の条件：50℃における125mM NaCl/1 ％SDS/ 40 mMリン酸ナトリウム，pH 7.2/1mM EDTA、の下でタバコ塩基性キチナーゼShinshi et al．（1987）PNAS 84:89-93をエンコードしているDNAによりプローブし；洗浄を同一の条件下で行った。陽性プラークを同定し、そして単離した。その単離されたファージを再びプレートし、そして新たな２連のフィルターを行った。そのタバコ塩基性キチナーゼを再びプローブとして使用したが、このとき、そのハイブリダイゼーシヨン及び洗浄を、65℃において先に記載した溶液中で行った。50℃においてそのプローブにハイブリダイズしたが65℃において弱くハイブリダイズするか又は全くしないプラークを精製した。DNAをその精製したファージから単離し、そしてそのcDNA をEco RIによる消化により取り出した。このcDNAを提示するEco RI断片をプラスミド・ベクターBluescript内にサブクローンし、そしてその配列を２本鎖鋳型のための手順を使用してジデオキシ配列決定により測定した。PR-Qとしてのそのクローンの同定をそのcDNAから得られた予言アミノ酸配列とその精製タンパク質から測定したアミノ酸配列とを比較することにより行った。４.植物発現/形質転換ベクター内へのPR-Q DNAの遺伝子操作完全長のPR-Q cDNAを、カリフラワー・モザイク・ウイルスから誘導された２連35S RNAプロモーターとその同一ウイルスのtml遺伝子の3'非コーディング領域によりエンコードされた転写終止シグナルとの間に位置するプラスミドpCGN1761 のEco RI部位内に挿入した。組換えプラスミドを制限消化により分析し、そして翻訳可能なPR-Q-エンコーディング・メッセージの生産に適当な方向においてそのPR-Q cDNAを含むもの、PCIB 1022をさらなる構築のために選んだ。２つのCaMVプロモーター、PR-Q cDNA、及びtml 3'領域を含むDNA断片を、それをXbaIにより消化することによりpCIB1022から切除した。それをプラスミドpCGN 1540のXbaI内に挿入した。その２連伝達ベクターpCGN1540は、E．coli及びアグロバアクテリウム・チュームファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の両方における選択についてのゲンタマイシン抵抗性遺伝子、PBR322及びPRiHRI複製起点を含む。そのXbaI部位内への挿入は、マンノピン・シンターゼ（mannopine synthase）プロモーターの制御下で且つそのマンノピン・シンターゼ遺伝子の3' 非-コーディング領域により結合されたTn5 ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現のためのカセットに沿ってアグロバクテリウムT-DNAの右と左のボーダーに対応するDNA配列と、色生産のためのE．coli lacZ遺伝子との間に、そのPR-Q発現カセットを置く。新たなプラスミド、pCGN1791Cの構造は、そのmasプロモータ及びその２つのCaMVプロモーターがそのDNA鋳型上の同一方向において転写を開始するであろうものであることを制限分析により示された。５.タバコの形質転換プラスミドpCGN11791CをA．tumefaciens株LBA4404内に形質転換した。Nicotia na tabacum cv．Xanthi.ncの形質転換は、標準的な方法による葉ディスクにと共に同時培養することによるものであった。形質転換された植物組織をカナマイシンに対する抵抗性により選択し、そして標準的な方法により無傷の植物（T1植物）に再生した。約20の植物が、独立形質転換事件から生じた組織から出発して、再生した。６.ホモ接合体植物の生産及び生物化学的特徴付け葉組織の小さなサンプルをそのT1植物のそれぞれから採取し、そして全葉組織からの変性抽出物をSDSゲル及びウェスタン・ブロットによりPR-Qタンパク質の対して生じた抗血清を使用して分析した。この抗体と反応したトランスジェニック植物からの材料をTMV-処理した非形質転換タバコから生じたものと、非処理非形質転換タバコからの材料と、そしてその同一ブロット上で精製されたPR-Qタンパク質と、比較した。その正確な分子量である免疫反応性材料の有意な量を含まないトランスジェニック植物を廃棄した。本テストにおいて陽性であった植物を開花段階まで温室内で栽培し、そしてその後それらを、自家受粉だけが生じることを確保するために個々に袋をかぶせた。得られた種（T2世代）を収穫し、そして各T1植物からの100を、抗生物質含有培地上でそれを発芽させることによりカナマイシンに対する抵抗性について等級付けした。約3:1のカナマイシン抵抗性対感受性を示す種を与えた植物をT-DNA挿入の単一座を含むと判断され、そしてこれらの植物のそれぞれからの8-10子孫をその開花段階まで栽培し、そして袋をかぶせた。これらの植物の成長の間に、葉サンプルを採取し、そして先に記載したように構成的なPR-Q発現について分析した。これらの分析に基づいて、１つの独立形質転換対からの系統をその最大量のPR-Q（1791C-18）を蓄積するものとして選んだ。この系統の個々のT2植物からの種を収穫し、そして100をカナマイシン抵抗性について等級付けした。本検定におけるカナマイシン感受性の完全な非存在は、その種がそのトランスジーンのついてホモ接合である親から生じたことを示した。種ロットl791C-18-2はこの基準によりホモ接合体であり、そして病原体に対してテストするために使用された。７.セルコスポラ・ニコチアナ（Cercospora nicotianae）に対する抵抗性についてのテスト C．nicotianae（ATCC株18366）からの接種を、２週間18℃において暗光下で滅菌濾紙によりカバーされたCDV8プレート上の分生子懸濁液を培養することにより行った。これらの胞子を蒸留水中でその濾紙をブラッシングすることにより集め、そしてその胞子濃度を1ml当たり100,000-150,000胞子に調整した。この懸濁液を、８週齢のタバコ植物の葉の上表面上にスプレーし、これを次に、高い湿度を維持するためにプラスチック・シートにより5-6日間カバーし続けた。その後、植物を自己系により周期的にスプレーすることにより湿度を維持した。これらの徴候は、8-10日後に現れ、そして病気等級をその菌により感染された葉の領域のパーセンテージを記録することにより得た。この病変疑似植物、1791C-18-2は、非形質転換 Xanthi.nc植物よりも有意に少なく感染された。非-誘導性免疫（nim）突然変異体Ａ.病気テストにおけるnim突然変異体の使用アラビドプシスnim突然変異体を、多数の病原体により挑戦させ、そして野性型植物よりもより速くより大きな病変に発展することが見つかった。この表現型は、UDS（すなわち、全病気感受性）といわれ、そして病原体に対してのその植物の防御を行使するためのSAR遺伝子を発現することに陥った突然変異の結果である。nim突然変異体のUDS表現型は、いわゆる野性型系の天然の抵抗性表現型が（すなわち、異なる病原体及びその同一の病原体の異なる病因型に）変化することができる畑病因テストにおける実験的な系における病気徴候の評価のための対照植物として、それに有用性を与える。従って、病原体による天然の感染が実験系の抵抗性を評価するために頼られている畑環境において、適当な穀物植物種の nim突然変異体系の実験への取り込みが、非実験系の使用において固有の変化を伴わずに、病原体圧のその真のレベル及びそのスペクトルの評価を可能にするであろう。畑環境における植物における病気抵抗性及び感受性を評価するためのこのような方法は、上記環境におけるその植物のnim突然変異系を計画し、そして病原体圧のレベルを測定することを含んで成る。Ｂ.病気抵抗性の目的のためのトランスジーンの用途の評価 nim突然変異体を病気抵抗性における使用のためにそれらの評価を容易にするためにトランスジーンの形質転換のための宿主植物として使用した。そのUDS表現型と特徴とするアラビドプシスnim突然変異系を、病気抵抗性のために候補遺伝子によりその後に形質転換して、それ故、そのUDS nim突然変異体植物の基準レベルに対する抵抗性へのその個々の遺伝子の寄与の評価を可能にするために、使用する。Ｃ.植物- 病原体相互作用の理解における道具としてのnim突然変異体 nim突然変異体は、植物病原体相互作用の理解のために、そして特に植物細胞の侵入のためのその病原体により利用される過程の理解のために有用である。これは、nim突然変異体が病原体攻撃への全身性応答を生じさせず、そしてその病原体の減っていない発展がその宿主との生物学的相互作用の研究のための理想的なシナリオであるからである。さらに重要なことは、宿主nim突然変異体がその特定の宿主とは正常には関連しないがその代わり異なる宿主と関連する病原体に感受性であることができるという観察である。アラビドプシスnim突然変異体は、そのUDS表現型を特徴とする。これらの植物は、タバコだけを正常には感染させる多数の病原体により挑戦され、そして感受性であることが見つかった。従って、このUDS表現型を引き起こすnim突然変異体は、病原体-レンジ感受性の修飾を導き、そしてこれは、宿主- 病原体相互関係の分子的、遺伝的及び生物化学的分析において重要な用途をもつ。Ｄ.殺菌剤スクリーニングにおける使用のためのnim突然変異体 nim突然変異体は、殺菌剤活性についての新たな化学的化合物のスクリーニングにおいて特に有用である。特定の宿主において選択されたnim突然変異体は、その宿主及びその宿主の病原体を使用して殺菌剤のスクリーニングのために重要な用途をもつ。この利点は、その宿主が様々な病原体及び病因型に異なって感受性であり、又はさらに幾つかの病原体又は病因型に抵抗性であるということにより遭遇する問題を回避する突然変異体のUDS表現型内にある。実施例により、小麦におけるnim突然変異体は、小麦病原体及び病因型の広いレンジに対する殺菌剤についてスクリーンするために有効に使用されることができるであろう。なぜなら、それらの突然変異体は、その導入された病原体に対する抵抗性応答を生じさせず、そして他の方法で多数の小麦系であってそれぞれが特定のテスト病原体に適切に感受性であるものの使用を要求することができるであろう異なる病因型に対する異なる抵抗性を示さないからである。特に問題の小麦病原体は、（非限定的に）エリシフェ・グラミニス（Erisyphegraminis）（粉状ウドンコ病（powdery mildew）の原因剤である）、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctoni a solani）（鋭い眼点（sharp eyespot）の原因剤）、シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイド（Pseudocercosporella herpotrichoides）（眼点の原因剤）、プシニア（Puccinia）種（サビ病の原因剤）、及びセプトリア・ノドラム（ Septoria nodorum）を含む。同様に、コーンのnim突然変異体は、コーン病原体に高く感受性であり、そしてそれ故にコーンの病気に対する活性をもつ殺菌剤についてのスクリーニングにおいて有用である。 nim突然変異体は、さらに、ヘテロ接合体宿主において、すなわち、特定の病原体の宿主種レンジ内に正常にはあることができないが（例えば、アラビドプシス）を特に容易に増幅することができる宿主において広いレンジの病原体及び病因型をスクリーニングするためのさらなる用途をもつ。そのUDS表現型により、そのヘテロ接合体宿主は、経済学的に重要な穀物植物種を含む他の植物種の病原体に感受性である。従って、実施例により、上記と同一のアラビドプシスnim突然変異体は、小麦病原体、例えば、エリシフェ・グラミニス（Erisyphe gramini ｓ）（粉状ウドンコ病（powdery mildew）の原因剤である）又はコーン病原体ヘルミンソポリウム・メイディス（Helminthosporium maydis）により感染されることができるであろうし、そして殺菌剤候補の効力をテストするために使用されることができるであろう。上記化合物により病原体により感染したnim突然変異体を処理し、そしてその化合物の殺菌剤活性を評価することを含んで成る殺菌剤活性について化合物をスクリーニングするためのこのような方法は、様々な穀物植物栽培変種に対して異なって有害であることができる様々な病原体及び病因型により異なる穀物植物種及び異なる栽培変種の種をスクリーニングするための最近使用される手順についての効率におけるかなりの改良をもつ。さらに、アラビドプシスの使用は、その小さなサイズ及びそれによる空間の限定された資源によるより良好なテストを引き受ける可能性のために、有利である。遺伝子クローニング様々なcim型突然変異及びnim突然変異体表現型におけるSAR遺伝子発現の及び病変疑似特性の原因である遺伝子をクローン化し、そしてその対応のcDNAsをその植物の表現型を修飾するためにセンス又はアンチセンスのいずれかの方向においてトランスジェニック植物内に導入することができる。 cim及びnim突然変異遺伝子のクローニングは、本分野においてよく知られた技術を使用して企てられることができる。問題の突然変異に近い位置にあるマーカーをRFPL及びRAPD技術を使用して同定することができる。典型的には、これは、分離集団、例えば、ホモ接合体突然変異体とホモ接合体同質遺伝子型の非突然変異植物との間の交配から生じたF2世代において行われるが、あるいは、それは、ヘテロ接合体個体から生じた他の培養２倍体系において行われることができる。一旦、所望の表現型と同時分離するマーカーが同定されれば、その隣接DNAが、その所望の目的へのその後の”ゲノム歩行（genome walking）”と組み合わされたゲノム・ライブラリー・スクリーンにおけるプローブとしてそのマーカーを使用して直接的にクローン化されることができる。この段階は、伝統的なラムダ・ファージ又はコスミド・クローニング技術を使用して可能であるよりもより大きなゲノム断片のサブクローニングを可能にするYACクローニング技術を使用して容易にされることができる。この標的配列は、宿主植物内へのこのようなサブクローンからのその再導入から正確に同定され；その突然変異体の表現型が優性であるか又は陰性であるか否かに依存して、その再導入検定は、一次形質転換体、又は以降の分離世代における野性型において完成されることができる。その突然変異体遺伝子を首尾よくクローン化した場合、その野性型遺伝子は、ライブラリー・スクリーンにおけるプローブとしてその突然変異体遺伝子を使用して容易にクローン化できる。本分野において公知であるような、”マップ- ベースのクローニング技術”は、十分に当業者の能力内にあり、そして例えば、Arondel et al.（Science 258:1353-1358（1992））及びMartin et al.（Science 262:1432-1436（1993））中に記載されている。本発明者らは、本明細書中に記載した病変疑似及びnim突然変異の存在及び用途を確立したので、その同一タイプの突然変異が挿入突然変異誘発技術を使用して再び行われることができ、これがそれ故に問題の標的遺伝子のその後のクローニングを容易にするということは、当業者にとって明らかであろう。植物からの遺伝子のクローニングの文脈において特に有用である挿入突然変異誘発技術の例は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）からのT-DNAがそのゲノム内にランダムに挿入されるようなT-DNA挿入技術、及び天然又は導入されたトランスポゾンがそのゲノムを通じて新たな位置に動くように導入される場合における、トランスポゾン挿入突然変異誘発を含む。それぞれの場合において、その新たに挿入されたDNAは、遺伝子機能を破壊することができ、そしてこれは、表現型として検定可能であることができる。本発明の文脈において、検定された表現型は、病変疑似/SAR遺伝子発現であろう。SAR遺伝子発現に基づく検定の代替として、新たな突然変異体を生成する保存系として、リポーター遺伝子、例えば、SAR遺伝子プロモーター、例えば、PR- 1a プロモーターの調節下のルシフェラーゼにより形質転換された系を使用することができ；cim突然変異体は、予言可能な状態でルシフェラーゼを構成的に発現する。T-DNA及びトランスポゾン挿入突然変異体コレクションの生成は、上記文献中によく記載されている技術であり、そして十分にその日常的勤務者の通常の技術内にある（例えば、Feldman et al．Science 243:1351-1354（1989）；Ma rks and Feldman Plant Cell 1:1053-1050（1989）；Honma et al．Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 90:6242-6246（1993）及びAarts et al．Nature 363:715-717 （1993））。 T-DNA挿入によりタグを付けられた遺伝子のために、その野性型の非中断遺伝子を、そのT-DNAタグ遺伝子を最初にクローニングし、そして次にその野性型遺伝子のクローニングにおけるプローブとしてそのT-DNA配列に隣接する宿主ゲノム内の配列を使用することにより、クローン化することができる。これらの技術は、Feldman etal．（1989；Science 243:1351-1354）Marks and Feldman（1989 ；Plant Cell 1:1053-1050）及びHayashi et al．（Science 258:1350-1352）により記載されている。トランポゾンによりタグを付けられた遺伝子のために、その野性型の非中断遺伝子を同様の技術を使用してクローン化することができ、これらは、Honma et al.（1993；Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:6242-6246）及びAarts et al．（1993；Nature 363:715-717）により記載されている。挿入突然変異によりタグを付けられた遺伝子のクローニングへの他のアプローチは、その突然変異以外の全てについて同質遺伝子をもつ系から得られたゲノム DNA又はcDNAが相同配列を取り出すために繰り返しハイブリダイズされるような引き算技術の使用である。これは、その後サブクローン化され、そして特徴付けされる２つの集団の間で異なる配列についての増加を引き起こす。この技術及びその多数の変法は、上記文献中に広く記載されている。Lamar andPalmer Cell 3 7: 171-?（1984）；Kunkel et al．Proc．Natl．Acad.Sci．USA 82: 4778-?（19 85）；Nussbaum et al．Proc．Natl．Acad.Sci．USA 84: 6521-?（1987）；Lisi tsyn et al.：Science 259: 946-951（1993）を参照のこと。その突然変異体表現型が生じるところの野性型遺伝子をクローン化した場合、この野性型遺伝子に対応するcDNAは、当業者によく知られているハイブリダイゼーション技術を使用して容易に単離されることができる。一旦、単離されれば、このcDNAは、（その遺伝子の過剰発現を達成するために）センス方向又は（その内因性遺伝子を停止するための）アンチセンス方向においてトランスジェニック植物系内で発現されることができる。トランスジェニック植物における発現は、センス又はアンチセンス方向における好適なプロモーターの後ろに、先に記載したように同定され、そしてクローン化されたcDNAを融合することにより達成される。このcDNAは、トランスジェニック植物において高いレベルにおいて発現されたプロモーターの後ろの、そして植物において作用することが知られている転写ターミネーターの上流の、植物発現カセット内にクローン化される。好ましいプロモーターは、CaMV35Sプロモーターであり、そして好ましいターミネーターは、ノパリン（nopaline）シンターゼ・ターミネーターである。この発現カセットは、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換のための（2連ベクター（ pCGN1540-Alexander et al.，PNAS 90:7327-7331（1993）に、そして直接遺伝子伝達のための直接遺伝子伝達ベクター（pCIB3064；Koziel et al.，Biotechnolo gy 11: 194-200）に伝達される。アグロバクテリウムは、双子葉種の形質転換に特に好適であり、そして直接遺伝子伝達は、単子葉種の形質転換に特に好適である。これらの技術は、本分野においてよく知られており、そして２つの先に引用した刊行物中に記載されている。トランスジェニック植物は、ノーザン分析によりセンス又はアンチセンスの発現についてスクリーンされ、そして高いレベルにおいて発現する植物は、さらなる表現型分析のために選択される。あるいは、組織特異的な発現パターンをもち、そしてこのように特定の細胞型にセンス又はアンチセンス発現の効果を局在化するであろうプロモーターが選択されることができる（このようなプロモーターの例については、Edwards and Co ruzzi，Ann．Rev．Genet.24:275-303（1990）を参照のこと。）。さらに、化学的に調節可能であり、そしてそれ故特定の化学物質によるそのトランスジェニック植物の処理の間にそのトランスジーンを発現するように誘導されることができるプロモーターが選択されることができる。このために好適なプロモーターは、タバコからのPR-1aプロモーターである（EP 0 332 104）。適当な宿主遺伝子型背景におけるトランスジェニック植物におけるclm及びnim 遺伝子の発現は、病気抵抗性及び／又は宿主細胞その死の両方を操作するために使用されることができる。（その病変疑似突然変異体の病変において明らかな細胞死に類似して）その宿主細胞死の表現型を引き起こすことができるセンス又はアンチセンスにおけるトランスジーンは、特定の細胞型（例えば、雄不稔性の生産のための花粉又は絨毬細胞）内でのみ、又はあるいは化学的に誘導されたプロモーター（例えば、PR-1aプロモーター）の調節下で発現されることが本分野においてよく知られている植物調節要素の調節下で発現されることができる。本発明の１つの態様においては、細胞死を引き起こすトランスジーン（例えば、アンチセンスにおけるcimI-誘導遺伝子）が、その雌親における雄不稔性を引き起こすために花粉特異的プロモーターの下で発現され、一方、その花粉供給源植物（pollinator）は、その化学的に調節可能なPR-1aプロモーターに融合されている花粉特異的構築物に対するアンチセンス（すなわち、アンチセンス-対-アンチセンス）において構築物を担持する。従って、そのF1ハイブリッド植物集団において、上記PR-1aプロモーターの化学的誘導物質による処理は、その花粉供給源植物-系誘導遺伝子を活性化し、そしてそのF1ハイブリッドの正常な開花を許容する母親-誘導遺伝子の発現を遮断するであろう。類似のやり方で、（めしべ組織だけに発現されるプロモーターを使用することにより）雌不稔性である系を創出することができる。本明細書中に記載するcim及びnim突然変異対の生物学から、病気抵抗性表現型がcim又はnim遺伝子に対するアンチセンスの発現から修飾されることができることは明らかである。cim遺伝子の場合においては、高められた病気抵抗性が予測されるであろし、一方、nim遺伝子については、病気抵抗性における減少が予測されるであろう。本明細書中に掲げた全ての刊行物及び特許明細書は、本発明の属する分野における熟練者の技術水準を示すものである。全ての刊行物及び特許明細書を、あたかも個々の刊行物又は特許明細書が特別に且つ個々に引用により本明細書中に取り込まれることを示されるようなものと同程度に、引用により本明細書中に取り込む。これまで本発明を説明のために及び理解の明確さの目的をもっていくぶん詳細に記載してきたが、特定の変更及び修正が添付クレームの範囲内で行われることができるということが明らかであろう。文献リスト

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者デラニー，テレンスパトリックアメリカ合衆国，ノースカロライナ 27713，ダーハム，グリーンビュードライブ 4900 (72)発明者ワード，エリックアール. アメリカ合衆国，ノースカロライナ 27701，ダーハム，モンマウスアベニュ 313

Claims

【特許請求の範囲】１．植物の集団から病原体に対して抵抗性である植物を選択するための方法であって：（a）病変疑似表現型（a lesion mimic phenotype）をもつ植物において病原体に対する抵抗性についてSAR遺伝子の発現を評価し、そして（b）病原体に抵抗性である植物を選択する、を含んで成る方法。２．植物が、SAR遺伝子の発現に基づいて選択される、請求項１に記載の方法。３．植物が、病原体に対する抵抗性に基づいて選択される、請求項１に記載の方法。４．病原体が、ウイルス、菌、バクテリア、昆虫、及び線虫である、請求項１に記載の方法。５．病原体が、菌である、請求項４に記載の方法。６．植物が、コーン、トマト、小麦、大麦、タバコ、及びヒマワリから選ばれる、請求項１に記載の方法。７．植物が、コーンである、請求項６に記載の方法。８．植物に病原体に対する抵抗性をブリーディングするための方法であって：（a）全身（浸透）性獲得抵抗性遺伝子（ｓystemic acquired resistance gen es）を発現する病変疑似表現型突然変異体を選択し：（b）品種改良計画において上記病変疑似表現型突然変異体を使用し；（c）所望の表現型特性をもつ病原体抵抗性子孫を選択する、を含んで成る方法。９．植物が、コーン、トマト、小麦、大麦、タバコ、及びヒマワリから選ばれる、請求項８に記載の方法。１０．植物が、コーンである、請求項９に記載の方法。１１．病原体が、ウイルス、菌、バクテリア、昆虫、及び線虫である、請求項８に記載の方法。１２．病原体が、菌である、請求項11に記載の方法。１３．植物に病原体に対する抵抗性をブリーディングするための方法であって：（a）病原体に対して抵抗性である病変疑似表現型突然変異体を選択し：（b）品種改良計画において上記病変疑似表現型突然変異体を使用し；（c）所望の表現型特性をもつ病原体抵抗性子孫を選択する、を含んで成る方法。１４．植物が、コーン、トマト、小麦、大麦、タバコ、及びヒマワリから選ばれる、請求項13に記載の方法。１５．植物が、コーンである、請求項14に記載の方法。１６．病原体が、ウイルス、菌、バクテリア、昆虫、及び線虫である、請求項 13に記載の方法。１７．病原体が、菌である、請求項16に記載の方法。１８．植物に病原体に対する抵抗性をブリーディングするための方法であって：（a）SAR遺伝子を構成的に発現する植物を選択し：（b）品種改良計画においてSAR遺伝子を構成的に発現する上記植物を使用し；（c）所望の表現型特性をもつ病原体抵抗性子孫を選択する、を含んで成る方法。１９．植物が、コーン、トマト、小麦、大麦、タバコ、及びヒマワリから選ばれる、請求項18に記載の方法。２０．植物が、コーンである、請求項19に記載の方法。２１．病原体が、ウイルス、菌、バクテリア、昆虫、及び線虫である、請求項 18に記載の方法。２２．病原体が、菌である、請求項21に記載の方法。２３．SAR遺伝子を構成的に発現する植物が、病変疑似表現型を欠いている、請求項18に記載の方法。２４．請求項13に記載の方法により生産されたハイブリッド植物。２５．請求項18に記載の方法により生産されたハイブリッド植物。２６．畑環境において植物における病気抵抗性及び感受性を評価するための方法であって：（a）上記環境において上記植物のnim突然変異系を植え付け；そして（b）病原体圧のレベルを測定する、を含んで成る方法。２７．殺菌剤活性について化合物をスクリーニングするための方法であって：（ａ）上記化合物により、病原体により感染されたnim突然変異体を処理し；そして（b）上記化合物の殺菌剤活性を評価する、を含んで成る方法。