JP3419850B2 - 核酸分別方法 - Google Patents
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- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
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- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44743—Introducing samples
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
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- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、DNAまたはRNAからなる
核酸の分別方法及びその塩基配列の解析方法に関する。
核酸の分別方法及びその塩基配列の解析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】種々DNAが混合した状態にあるとき、た
とえば長いDNAを酵素切断しときの生成物などでは、直
ちにDNAの塩基配列を決定することは不可能である。こ
れらDNAの解析法としては従来２つの方法が知られてい
る。第１の方法はゲル電気泳動などによりDNA断片の各
成分を分離し、それぞれの成分についてDNA解析を行う
方法である。第２の方法はこれらDNAを適当なベクタ−
中に挿入し（クロ−ニング）、これを大腸菌中に注入し
て寒天培地で培養し、生成したコロニ−毎に菌を再培養
して増殖し、この増殖した菌からDNAを抽出してDNA解析
する方法である。
とえば長いDNAを酵素切断しときの生成物などでは、直
ちにDNAの塩基配列を決定することは不可能である。こ
れらDNAの解析法としては従来２つの方法が知られてい
る。第１の方法はゲル電気泳動などによりDNA断片の各
成分を分離し、それぞれの成分についてDNA解析を行う
方法である。第２の方法はこれらDNAを適当なベクタ−
中に挿入し（クロ−ニング）、これを大腸菌中に注入し
て寒天培地で培養し、生成したコロニ−毎に菌を再培養
して増殖し、この増殖した菌からDNAを抽出してDNA解析
する方法である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】DNAの分離に用いるゲ
ル電気泳動にはアガロ−スゲルあるいはポリアクリルア
ミドゲルが用いられる。鎖長が400b以下のDNAでは一塩
基の違いを識別でき、300b以下なら分離して分取できる
が、鎖長が長くなるにつれ、ゲルによる分離能は低下す
る。このためDNA断片群中の各成分を常に分離し、単一
成分を分取できるとは限らない難点が第１の方法にはあ
る。
ル電気泳動にはアガロ−スゲルあるいはポリアクリルア
ミドゲルが用いられる。鎖長が400b以下のDNAでは一塩
基の違いを識別でき、300b以下なら分離して分取できる
が、鎖長が長くなるにつれ、ゲルによる分離能は低下す
る。このためDNA断片群中の各成分を常に分離し、単一
成分を分取できるとは限らない難点が第１の方法にはあ
る。
【０００４】一方、クロ−ニングによる方法は手間がか
かる上、DNA断片の長さが短すぎるとクロ−ニング出来
ないこともあったり、すべての断片に相当するクロ−ン
を取ろうとすると抜け落ちを防ぐため非常に多くのクロ
−ンを取り解析しなければならない難点があった。ま
た、種々DNA塩基配列を持ったDNAオリゴマ−を固体表面
に固定し、目的とするDNA断片群とハイブリダイズさせ
ることにより分離、分取する手法がある。しかし、この
場合、目的とするDNA断片群の配列が概知であることが
必要で、未知配列を持つDNA断片群には適用出来ない。
かる上、DNA断片の長さが短すぎるとクロ−ニング出来
ないこともあったり、すべての断片に相当するクロ−ン
を取ろうとすると抜け落ちを防ぐため非常に多くのクロ
−ンを取り解析しなければならない難点があった。ま
た、種々DNA塩基配列を持ったDNAオリゴマ−を固体表面
に固定し、目的とするDNA断片群とハイブリダイズさせ
ることにより分離、分取する手法がある。しかし、この
場合、目的とするDNA断片群の配列が概知であることが
必要で、未知配列を持つDNA断片群には適用出来ない。
【０００５】本発明はこれら難点を解決し、簡便に核酸
を分離し、塩基配列の決定などを可能にする手法を提供
するものである。
を分離し、塩基配列の決定などを可能にする手法を提供
するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明はその
末端に配列既知のDNAオリゴマーを結合した核酸断片の
混合物を、前記DNAオリゴマーと相補な特定塩基配列に
続き１〜６個の任意配列を３'末端にもつ種々のDNAプロ
−ブを固体表面に固定したプロ−ブチップあるいはプロ
−ブチップ群で処理し、少なくともハイブリダイゼ−シ
ョンおよび相補鎖合成のプロセスを経て混合核酸断片を
分別あるいは分画することを特徴とする核酸断片の分別
方法である。なお、前記分別方法において、分別あるい
は分画した核酸断片はこれをさらに必要により分離し採
取することができる。
末端に配列既知のDNAオリゴマーを結合した核酸断片の
混合物を、前記DNAオリゴマーと相補な特定塩基配列に
続き１〜６個の任意配列を３'末端にもつ種々のDNAプロ
−ブを固体表面に固定したプロ−ブチップあるいはプロ
−ブチップ群で処理し、少なくともハイブリダイゼ−シ
ョンおよび相補鎖合成のプロセスを経て混合核酸断片を
分別あるいは分画することを特徴とする核酸断片の分別
方法である。なお、前記分別方法において、分別あるい
は分画した核酸断片はこれをさらに必要により分離し採
取することができる。
【０００７】上記プロ−ブチップとしては、それぞれ分
別可能な細棒、ワイヤ−、短冊状のシート、リボンなど
の上にDNAプロ−ブを固定したもの、あるいは固体表面
上に区画を設けこれにDNAプロ−ブを種類別に固定した
ものなどがあげられる。また、上記方法において、DNA
プロ−ブを保持した１つあるいは複数のプロ−ブチップ
を核酸断片群を含む溶液中に同時にいれ、相補鎖合成し
て二本鎖となったDNAを１種ずつあるいは複数種同時に
分別あるいは分画することができる。
別可能な細棒、ワイヤ−、短冊状のシート、リボンなど
の上にDNAプロ−ブを固定したもの、あるいは固体表面
上に区画を設けこれにDNAプロ−ブを種類別に固定した
ものなどがあげられる。また、上記方法において、DNA
プロ−ブを保持した１つあるいは複数のプロ−ブチップ
を核酸断片群を含む溶液中に同時にいれ、相補鎖合成し
て二本鎖となったDNAを１種ずつあるいは複数種同時に
分別あるいは分画することができる。
【０００８】上記方法において、相補鎖合成プロセス
と、該相補鎖合成プロセスにより得られる相補鎖合成混
合物を昇温せしめることにより相補鎖合成したDNAプロ
−ブは核酸試料と結合したままとし、一方相補鎖合成し
なかったDNAプロ−ブと核酸試料を解離せしめる解離プ
ロセスとを少なくとも１回以上繰り返しておこなわれ
る。
と、該相補鎖合成プロセスにより得られる相補鎖合成混
合物を昇温せしめることにより相補鎖合成したDNAプロ
−ブは核酸試料と結合したままとし、一方相補鎖合成し
なかったDNAプロ−ブと核酸試料を解離せしめる解離プ
ロセスとを少なくとも１回以上繰り返しておこなわれ
る。
【０００９】上記方法において、DNAオリゴマーを種類
毎に別々の固体表面あるいは同一固体表面の区画された
位置に固定したオリゴDNAチップと遊離DNAオリゴマーを
用いたDNA相補鎖合成に当たり、反応温度を上下するこ
とによりDNAを効率的に選別することができる。そし
て、前記固体表面に固定されたDNAオリゴマーの構成配
列は共通配列と3'末端側に任意配列を含むものである。
毎に別々の固体表面あるいは同一固体表面の区画された
位置に固定したオリゴDNAチップと遊離DNAオリゴマーを
用いたDNA相補鎖合成に当たり、反応温度を上下するこ
とによりDNAを効率的に選別することができる。そし
て、前記固体表面に固定されたDNAオリゴマーの構成配
列は共通配列と3'末端側に任意配列を含むものである。
【００１０】さらに、本発明は上記核酸断片の分別方法
により得られた核酸断片をそのままあるいは分離、採取
してその塩基配列を決定する核酸塩基配列の解析方法で
ある。以下、本発明の該略を図１及び図２により説明す
る。まず２本鎖DNAの末端に概知配列を持つDNAオリゴマ
−をライゲ−ション反応等により結合させたり、１本鎖
RNAの末端にタ−ミナルトランスフェラ−ゼによりポリA
を結合させるなどして、末端に概知配列を導入する。図
１にて２本鎖DNAの末端に概知配列オリゴマ−を導入し
た試料を例に説明する。先端に上記概知配列13を含み、
３'末端側数塩基が任意の配列14を持つすべてのDNAオリ
ゴマ−12を一種ずつ持つ細管あるいは細棒11を用意す
る。
により得られた核酸断片をそのままあるいは分離、採取
してその塩基配列を決定する核酸塩基配列の解析方法で
ある。以下、本発明の該略を図１及び図２により説明す
る。まず２本鎖DNAの末端に概知配列を持つDNAオリゴマ
−をライゲ−ション反応等により結合させたり、１本鎖
RNAの末端にタ−ミナルトランスフェラ−ゼによりポリA
を結合させるなどして、末端に概知配列を導入する。図
１にて２本鎖DNAの末端に概知配列オリゴマ−を導入し
た試料を例に説明する。先端に上記概知配列13を含み、
３'末端側数塩基が任意の配列14を持つすべてのDNAオリ
ゴマ−12を一種ずつ持つ細管あるいは細棒11を用意す
る。
【００１１】上記細棒11を試料溶液中に浸し、目的DNA
断片41,42 とハイブリダイズせしめた後、DNAの相補鎖
合成反応を行う。次いで70〜85℃に昇温し、相補鎖伸長
が行われなかったミスマッチ結合したDNA断片を脱離さ
せ、再び降温してハイブリダイズせしめて相補鎖合成反
応を行う。この操作を繰り返した後、昇温下で細棒を引
き上げミスマッチDNAを溶液中に残し、相補鎖合成され
たペアだけを取り出した後、各棒の先端をバッファ液を
満たした異なるボトルに移し再度昇温して先端にハイブ
リダイズしているDNAを分離する。細棒は図２のように
たばねて一度に複数本を反応処理することが可能であ
る。細管先端はバッファ−液に浸され、昇温することに
より、その細棒に固定されたDNAオリゴマ−と３'末数塩
基の配列が一致するDNA断片だけを分取する。このよう
にして得られたDNA断片を用いてDNA塩基配列決定をす
る。
断片41,42 とハイブリダイズせしめた後、DNAの相補鎖
合成反応を行う。次いで70〜85℃に昇温し、相補鎖伸長
が行われなかったミスマッチ結合したDNA断片を脱離さ
せ、再び降温してハイブリダイズせしめて相補鎖合成反
応を行う。この操作を繰り返した後、昇温下で細棒を引
き上げミスマッチDNAを溶液中に残し、相補鎖合成され
たペアだけを取り出した後、各棒の先端をバッファ液を
満たした異なるボトルに移し再度昇温して先端にハイブ
リダイズしているDNAを分離する。細棒は図２のように
たばねて一度に複数本を反応処理することが可能であ
る。細管先端はバッファ−液に浸され、昇温することに
より、その細棒に固定されたDNAオリゴマ−と３'末数塩
基の配列が一致するDNA断片だけを分取する。このよう
にして得られたDNA断片を用いてDNA塩基配列決定をす
る。
【００１２】なお、本発明における塩基配列の決定法
は、前記のとおりDNA断片を分取した後その断片につい
て塩基配列決定を行う方法の他、DNA断片を分別あるい
は分画した後これを分取することなくそのままその塩基
配列の決定を行うこともできる。
は、前記のとおりDNA断片を分取した後その断片につい
て塩基配列決定を行う方法の他、DNA断片を分別あるい
は分画した後これを分取することなくそのままその塩基
配列の決定を行うこともできる。
【００１３】
【作用】DNA断片1末端に既知DNAオリゴマ−2を付けてる
ことにより、DNAをDNAオリゴマ−にハイブリダイズ可能
な形にする。選別用オリゴマ−の３'末端に付加された
数塩基の任意配列は目的DNA断片を選別するためのもの
である。３'末端の数塩基の配列はすべての組み合わせ
を用意し、それぞれを細棒先端に結合させる。DNAオリ
ゴマ−の３'末端部配列が完全に一致した場合には相補
鎖合成が起こり、ハイブリダイゼ−ションの安定度が格
段に増加するので末端配列が不一致のものと区別でき
る。選別プライマ−の３'末端数塩基を除いた配列は全
て共通なため、単にハイブリダイズした段階では末端が
一致しない、いわゆるミスマッチの対も多数存在する。
そこで、一度昇温し、マッチしており相補鎖伸長が起き
た対はそのままで、伸長反応が起こらなかった対は解離
させて再度ハイブリダイズさせる。これをくりかえすこ
とにより末端が完全に一致した対を増やすことが出来
る。
ことにより、DNAをDNAオリゴマ−にハイブリダイズ可能
な形にする。選別用オリゴマ−の３'末端に付加された
数塩基の任意配列は目的DNA断片を選別するためのもの
である。３'末端の数塩基の配列はすべての組み合わせ
を用意し、それぞれを細棒先端に結合させる。DNAオリ
ゴマ−の３'末端部配列が完全に一致した場合には相補
鎖合成が起こり、ハイブリダイゼ−ションの安定度が格
段に増加するので末端配列が不一致のものと区別でき
る。選別プライマ−の３'末端数塩基を除いた配列は全
て共通なため、単にハイブリダイズした段階では末端が
一致しない、いわゆるミスマッチの対も多数存在する。
そこで、一度昇温し、マッチしており相補鎖伸長が起き
た対はそのままで、伸長反応が起こらなかった対は解離
させて再度ハイブリダイズさせる。これをくりかえすこ
とにより末端が完全に一致した対を増やすことが出来
る。
【００１４】このようにして完全にハイブリダズしたも
のだけを分取するが、図２のような細棒はまとめて反応
させても、それぞれを分離できるので各断片を分離・分
取することができる。
のだけを分取するが、図２のような細棒はまとめて反応
させても、それぞれを分離できるので各断片を分離・分
取することができる。
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定
されるものではない。
る。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定
されるものではない。
【００１５】〔実施例１〕試料としてλファ−ジDNAのH
indIII断片を用いた。切断片群に蛍光（スルフォロ−ダ
ミン101）標識したDNAオリゴマ−をライゲ−ション反応
で結合させる。一方、先端径が0.2mmのガラス棒の先端
５mmの所までを表面処理し、アミノ基を５'末端にもつD
NAオリゴマ−を結合させ、DNAプロ−ブを先端に保持し
たガラス棒を多種作成する。
indIII断片を用いた。切断片群に蛍光（スルフォロ−ダ
ミン101）標識したDNAオリゴマ−をライゲ−ション反応
で結合させる。一方、先端径が0.2mmのガラス棒の先端
５mmの所までを表面処理し、アミノ基を５'末端にもつD
NAオリゴマ−を結合させ、DNAプロ−ブを先端に保持し
たガラス棒を多種作成する。
【００１６】固定法にはシランカプリング反応を用いて
ガラス表面に種々の活性残基を導入して用いる。たとえ
ば、ガラス表面を３−グリシドキシプロピルトリメトキ
シシランの希酢酸水溶液で処理した後、90〜105℃でベ
−クしてガラス表面にエポキシ基を導入する。５'−末
端アミノ化DNAオリゴマ−をPH９で反応させてガラス表
面にDNAプロ−ブを保持したガラス棒を得ることが出来
る。他には、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、
３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシ
シラン等を用いてガラス表面にアミノ基を導入し、無水
コハク酸で処理してアミノ基にカルボキシル基を導入す
る。続いて水溶性カルボジイミドの存在下、５'−末端
アミノ化DNAオリゴマ−を反応させることで、DNAプロ−
ブを保持したガラス棒を得ることが出来る。
ガラス表面に種々の活性残基を導入して用いる。たとえ
ば、ガラス表面を３−グリシドキシプロピルトリメトキ
シシランの希酢酸水溶液で処理した後、90〜105℃でベ
−クしてガラス表面にエポキシ基を導入する。５'−末
端アミノ化DNAオリゴマ−をPH９で反応させてガラス表
面にDNAプロ−ブを保持したガラス棒を得ることが出来
る。他には、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、
３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシ
シラン等を用いてガラス表面にアミノ基を導入し、無水
コハク酸で処理してアミノ基にカルボキシル基を導入す
る。続いて水溶性カルボジイミドの存在下、５'−末端
アミノ化DNAオリゴマ−を反応させることで、DNAプロ−
ブを保持したガラス棒を得ることが出来る。
【００１７】DNAプロ−ブの塩基配列は共通部分として
ライゲ−ションに用いた蛍光標識オリゴマ−のうちDNA
断片の３末端側につく配列に相補的（５'末端側に付く
ものと同じ）なものをもち、その３'末端側２塩基に任
意配列を持つものである。末端２塩基の組み合わせの数
は16種あるので16種のDNAオリゴマ−（DNAプロ−ブ）を
別々に保持した細棒を16種作る。３'末端の任意配列は
３〜４塩基でも良いが３塩基のときは64種、４塩基のと
きは256種のDNAオリゴマ−を用意する。末端の任意配列
の長さが長くなると完全にマッチしなくても相補鎖合成
が進行することがある。これを防止するには末端−塩基
のミスマッチで末端部のハイブリダイゼーション力が大
きく減ずるようにすればよい。共通配列のうち３'末端
側の任意配列に続く部分の塩基を１〜２ケだけイノシン
に変えたり、ミスマッチさせた配列にしておくと末端近
傍のハイブリダイゼーション安定性は任意配列のマッチ
ングに大きく依存するこになり、一塩基でもミスマッチ
塩基があると相補鎖合成がうまくゆかなくなるように調
節できる。任意配列の長さはこの部分単独では安定なハ
イブリッドを形成しない６mer以下が良く相補鎖合成が
より敏感に一致度に左右される１〜３merが望ましい。
ライゲ−ションに用いた蛍光標識オリゴマ−のうちDNA
断片の３末端側につく配列に相補的（５'末端側に付く
ものと同じ）なものをもち、その３'末端側２塩基に任
意配列を持つものである。末端２塩基の組み合わせの数
は16種あるので16種のDNAオリゴマ−（DNAプロ−ブ）を
別々に保持した細棒を16種作る。３'末端の任意配列は
３〜４塩基でも良いが３塩基のときは64種、４塩基のと
きは256種のDNAオリゴマ−を用意する。末端の任意配列
の長さが長くなると完全にマッチしなくても相補鎖合成
が進行することがある。これを防止するには末端−塩基
のミスマッチで末端部のハイブリダイゼーション力が大
きく減ずるようにすればよい。共通配列のうち３'末端
側の任意配列に続く部分の塩基を１〜２ケだけイノシン
に変えたり、ミスマッチさせた配列にしておくと末端近
傍のハイブリダイゼーション安定性は任意配列のマッチ
ングに大きく依存するこになり、一塩基でもミスマッチ
塩基があると相補鎖合成がうまくゆかなくなるように調
節できる。任意配列の長さはこの部分単独では安定なハ
イブリッドを形成しない６mer以下が良く相補鎖合成が
より敏感に一致度に左右される１〜３merが望ましい。
【００１８】さて、ライゲ−ションにより蛍光標識した
断片群の１部を分取し、ゲル電気泳動分離パタ−ンを得
る。このパタ−ンから断片数が５〜６（１本鎖にすると
その倍）以上の場合にはDNA断片試料をゲル電気泳動に
より分離・分取する。この結果、１つの分画に含まれるD
NA断片種の数を１本鎖換算で10本以下とする。これは、
以降でDNAの分取に用いるDNAプロ−ブの種類は16種であ
り、各プロ−ブで分画できる断片種の重複を避けるため
である。
断片群の１部を分取し、ゲル電気泳動分離パタ−ンを得
る。このパタ−ンから断片数が５〜６（１本鎖にすると
その倍）以上の場合にはDNA断片試料をゲル電気泳動に
より分離・分取する。この結果、１つの分画に含まれるD
NA断片種の数を１本鎖換算で10本以下とする。これは、
以降でDNAの分取に用いるDNAプロ−ブの種類は16種であ
り、各プロ−ブで分画できる断片種の重複を避けるため
である。
【００１９】λファ−ジの場合、断片数は14本であるが
分画せずに扱った。DNA断片群をバッファ−液に溶か
し、16種のDNAプロ−ブ付細棒をこれに浸してハイブリ
ダイズさせる。バイブリダイズを容易にするため２本鎖
のDNAを熱変性させたり、２本鎖状の５'末端を削り取る
エクソヌクレア−ゼを作用させ、３'末端を１本鎖状と
して行う。次いで相補鎖合成の基質であるオリゴヌクレ
オチド（dNTP）とDNAポリメラ−ゼを加え相補鎖合成を
行う。DNA断片にハイブリダイズしたDNAのうち３'末端
が完全にマッチしたのもは相補鎖合成が起こるのでDNA
プロ−ブとDNA断片の結合力は増加する。一方、一部が
不一致のものは相補鎖合成が起こらないので結合は弱
い。
分画せずに扱った。DNA断片群をバッファ−液に溶か
し、16種のDNAプロ−ブ付細棒をこれに浸してハイブリ
ダイズさせる。バイブリダイズを容易にするため２本鎖
のDNAを熱変性させたり、２本鎖状の５'末端を削り取る
エクソヌクレア−ゼを作用させ、３'末端を１本鎖状と
して行う。次いで相補鎖合成の基質であるオリゴヌクレ
オチド（dNTP）とDNAポリメラ−ゼを加え相補鎖合成を
行う。DNA断片にハイブリダイズしたDNAのうち３'末端
が完全にマッチしたのもは相補鎖合成が起こるのでDNA
プロ−ブとDNA断片の結合力は増加する。一方、一部が
不一致のものは相補鎖合成が起こらないので結合は弱
い。
【００２０】16種のDNAプロ−ブを同時にDNA断片を含む
溶液に浸し、ハイブリダイズさせると、完全マッチ率は
約1/16である。そこで相補鎖合成後、図１に示すように
熱変性サイクルすなわち、70〜85℃に昇温し、鎖長伸長
のプロ−ブにはハイブリダイズしたままだが、鎖長伸長
のないプロ−ブからDNAが脱離させ、降温して再度ハイ
ブリダイズさせて相補鎖伸長反応を行う。これを繰り返
すことにより完全マッチしたDNAの対を増やすことが出
来る。DNAプロ−ブの種類数よりも多い回数このサイク
ルを繰り返せばほぼ目的DNA断片を完全マッチDNAプロ−
ブにより捕獲し、分画できる。同時にハイブリダイズさ
せるDNAプロ−ブの種類数は少ない方が繰返し操作数は
少なくてすむ。そこでDNAプロ−ブを１本づつ用いた
り、４〜５本を１つのグル−プにして用いたり、あるい
はDNA断片の共通配列に続く２塩基の配列を調べ、必要
なものだけを用いるなどの方法が実用的である。
溶液に浸し、ハイブリダイズさせると、完全マッチ率は
約1/16である。そこで相補鎖合成後、図１に示すように
熱変性サイクルすなわち、70〜85℃に昇温し、鎖長伸長
のプロ−ブにはハイブリダイズしたままだが、鎖長伸長
のないプロ−ブからDNAが脱離させ、降温して再度ハイ
ブリダイズさせて相補鎖伸長反応を行う。これを繰り返
すことにより完全マッチしたDNAの対を増やすことが出
来る。DNAプロ−ブの種類数よりも多い回数このサイク
ルを繰り返せばほぼ目的DNA断片を完全マッチDNAプロ−
ブにより捕獲し、分画できる。同時にハイブリダイズさ
せるDNAプロ−ブの種類数は少ない方が繰返し操作数は
少なくてすむ。そこでDNAプロ−ブを１本づつ用いた
り、４〜５本を１つのグル−プにして用いたり、あるい
はDNA断片の共通配列に続く２塩基の配列を調べ、必要
なものだけを用いるなどの方法が実用的である。
【００２１】プロ−ブ部位の共通配列に続く２塩基の配
列を知るには、共通配列に続く塩基がA,C,G,およびTのD
NAプライマ−を固定したガラス棒を用いて図３の手続き
で行なう。A,C,G,T各４本、計16本を一組として試料混
合液と反応させる。洗浄しハイブリダイズしなかった物
を洗い流した後、A,C,G,Tのセットとして４分割する。
蛍光標識タ−ミネ−タ−112を加えてDNAポリメラ−ゼで
共通配列に続く等２塩基目のヌクレオチド（ddNTP*）を
結合させる。ガラス棒表面の蛍光の有無を図４の方法で
測定することで、共通配列に続く２塩基までの配列情報
が得られる。図４の方法では、レ−ザ−121の光をビ−
ムエキスパンダで広げ、集光レンズ124で集光し、光カ
プラ−127を介してガラス棒11に導入する。ガラス棒に
導入されたレ−ザ光はガラス先端に達する。上記反応で
ガラス表面のDNAプライマ−に蛍光体が結合していれ
ば、蛍光を発する。蛍光は、ガラス棒11、光カプラ−12
7の順に進行し、ダイクロイックミラ−123で折り曲げら
れる。フィルタ−125を通過後、集光レンズ124により検
出機126に導かれる。各ガラス棒の蛍光の有無を調べる
ことで、蛍光を発しているプライマ−とタ−ミネ−タ−
の種類が同定できる。すなわち、共通配列に続く１塩基
目に、プライマ−の種類で、２塩基目に導入された蛍光
標識タ−ミネ−タ−の種類で２塩基までの塩基配列を決
定できる。
列を知るには、共通配列に続く塩基がA,C,G,およびTのD
NAプライマ−を固定したガラス棒を用いて図３の手続き
で行なう。A,C,G,T各４本、計16本を一組として試料混
合液と反応させる。洗浄しハイブリダイズしなかった物
を洗い流した後、A,C,G,Tのセットとして４分割する。
蛍光標識タ−ミネ−タ−112を加えてDNAポリメラ−ゼで
共通配列に続く等２塩基目のヌクレオチド（ddNTP*）を
結合させる。ガラス棒表面の蛍光の有無を図４の方法で
測定することで、共通配列に続く２塩基までの配列情報
が得られる。図４の方法では、レ−ザ−121の光をビ−
ムエキスパンダで広げ、集光レンズ124で集光し、光カ
プラ−127を介してガラス棒11に導入する。ガラス棒に
導入されたレ−ザ光はガラス先端に達する。上記反応で
ガラス表面のDNAプライマ−に蛍光体が結合していれ
ば、蛍光を発する。蛍光は、ガラス棒11、光カプラ−12
7の順に進行し、ダイクロイックミラ−123で折り曲げら
れる。フィルタ−125を通過後、集光レンズ124により検
出機126に導かれる。各ガラス棒の蛍光の有無を調べる
ことで、蛍光を発しているプライマ−とタ−ミネ−タ−
の種類が同定できる。すなわち、共通配列に続く１塩基
目に、プライマ−の種類で、２塩基目に導入された蛍光
標識タ−ミネ−タ−の種類で２塩基までの塩基配列を決
定できる。
【００２２】もちろん４種の蛍光標識タ−ミネ−タ−dd
ATP*、ddCTP*、ddGTP*、ddTTP*の蛍光体にそれぞれ異な
る波長のものを用いれば、16本のガラス棒の組をACGTの
組で分割することなく１回の反応で行なうことが出来
る。この場合は、蛍光波長の違いで共通配列に続く２塩
基目の塩基種を同定する。プロ−ブ部位の共通配列に続
く２塩基の配列を知る他の方法としては、共通配列に続
く塩基がA,C,GおよびTのDNAプライマ−を用意する。図
５の200〜203のように各プライマ−の長さを変えてお
き、電気泳動で相互に識別できるようにしておく。試料
を分取し、プライマ−を蛍光標識タ−ミネ−タ112を加
えてDNAポリメラ−ゼで共通配列に続く第２塩基目のヌ
クレオチド（ddNTP*）を結合させる。反応生物を電気泳
動分離し、蛍光検出によりスペクトルを測定する。出現
するピ−クから共通配列に続く２塩基までの情報が得ら
れる。この場合、反応はすべて液中で行なうことがで
き、検出は電気泳動で行なえるので特別な検出装置の必
要はなくなる。
ATP*、ddCTP*、ddGTP*、ddTTP*の蛍光体にそれぞれ異な
る波長のものを用いれば、16本のガラス棒の組をACGTの
組で分割することなく１回の反応で行なうことが出来
る。この場合は、蛍光波長の違いで共通配列に続く２塩
基目の塩基種を同定する。プロ−ブ部位の共通配列に続
く２塩基の配列を知る他の方法としては、共通配列に続
く塩基がA,C,GおよびTのDNAプライマ−を用意する。図
５の200〜203のように各プライマ−の長さを変えてお
き、電気泳動で相互に識別できるようにしておく。試料
を分取し、プライマ−を蛍光標識タ−ミネ−タ112を加
えてDNAポリメラ−ゼで共通配列に続く第２塩基目のヌ
クレオチド（ddNTP*）を結合させる。反応生物を電気泳
動分離し、蛍光検出によりスペクトルを測定する。出現
するピ−クから共通配列に続く２塩基までの情報が得ら
れる。この場合、反応はすべて液中で行なうことがで
き、検出は電気泳動で行なえるので特別な検出装置の必
要はなくなる。
【００２３】図３〜図５では説明を簡略化するために試
料DNAに１種類の場合を示したが、本例では複数種DNAの
混合物でも共通配列に続く２塩基までの情報を得ること
ができる。本実施例ではの８種のプロ−ブが完全マッチ
であることがわかった。さて、細棒先端のDNAプロ−ブ
に捕獲されたDNAを種類ごとにマイクロチュ−ブに移
す。DNAプロ−ブからDNA断片を脱離さすには溶液の温度
を95℃にまで高めて熱脱離させる。こうして得たDNA断
片群を鋳型にDNAシ−ケンス反応を行い、配列を読み取
る。図６はその１例でり、その配列は TTCAAACATTAATTT
TTTATGATAAACAATTCCA と決定された。この図６から各塩
基由来のピ−クに１塩基ごとに分離したシングルピ−ク
が得られ、クロ−ニングを行なわなくても混合材料から
直接シ−ケンスできることがわかる。
料DNAに１種類の場合を示したが、本例では複数種DNAの
混合物でも共通配列に続く２塩基までの情報を得ること
ができる。本実施例ではの８種のプロ−ブが完全マッチ
であることがわかった。さて、細棒先端のDNAプロ−ブ
に捕獲されたDNAを種類ごとにマイクロチュ−ブに移
す。DNAプロ−ブからDNA断片を脱離さすには溶液の温度
を95℃にまで高めて熱脱離させる。こうして得たDNA断
片群を鋳型にDNAシ−ケンス反応を行い、配列を読み取
る。図６はその１例でり、その配列は TTCAAACATTAATTT
TTTATGATAAACAATTCCA と決定された。この図６から各塩
基由来のピ−クに１塩基ごとに分離したシングルピ−ク
が得られ、クロ−ニングを行なわなくても混合材料から
直接シ−ケンスできることがわかる。
【００２４】上記の例ではプローブ上に捕獲したDNAを
解析に用いたが、固体表面で伸長したDNAプロ−ブを用
いてもよい。細棒先端に固定されたDNAプロ−ブを相補
鎖合成のプライマ−として相補鎖が全長伸長すると、
３'末端には共通配列が来る（２本鎖にライゲ−ション
でオリゴマ−を結合させているので）ので配列概知のプ
ライマ−を用いて、伸長した鎖の３'末端側から解析で
きる。また、捕獲したDNA鎖が長い場合には分画後、再
度、別の制限酵素で切断し、小断片として上記操作を繰
り返せばよい。
解析に用いたが、固体表面で伸長したDNAプロ−ブを用
いてもよい。細棒先端に固定されたDNAプロ−ブを相補
鎖合成のプライマ−として相補鎖が全長伸長すると、
３'末端には共通配列が来る（２本鎖にライゲ−ション
でオリゴマ−を結合させているので）ので配列概知のプ
ライマ−を用いて、伸長した鎖の３'末端側から解析で
きる。また、捕獲したDNA鎖が長い場合には分画後、再
度、別の制限酵素で切断し、小断片として上記操作を繰
り返せばよい。
【００２５】上記の例では熱サイクル（反応液の温度を
上下する）により、DNAプロ−ブの共通配列に続く２塩
基の配列がマッチするDNAがDNAプロ−ブにハイブリダイ
ズし、相補鎖合成をする率を上げたが、この時、共通配
列を持つ遊離プライマ−を加えておきPCR（Polymerase
Chain Reaction）を同時に遂行してDNAコピ−数を増や
してもよい。
上下する）により、DNAプロ−ブの共通配列に続く２塩
基の配列がマッチするDNAがDNAプロ−ブにハイブリダイ
ズし、相補鎖合成をする率を上げたが、この時、共通配
列を持つ遊離プライマ−を加えておきPCR（Polymerase
Chain Reaction）を同時に遂行してDNAコピ−数を増や
してもよい。
【００２６】このように配列の異なるプローブを区画し
て固定した固体サポートと遊離プライマーを用いたＰＣ
Ｒ増幅は、混合物の分離増幅の新しい手段を与える。固
定プローブとマッチして相補鎖伸長したプローブにハイ
ブリダイズしたDNAは２本鎖を１本鎖に熱解離する95℃
程度の高温下でも相補鎖の固定された区画の比較的近傍
に滞在する。一方、相補鎖合成しなかったDNAはより多
く拡散してマッチするオリゴマー部にも一部が到達す
る。これをくりかえすことにより、DNA鎖の各区画への
選別捕獲と増幅を行うことができる。
て固定した固体サポートと遊離プライマーを用いたＰＣ
Ｒ増幅は、混合物の分離増幅の新しい手段を与える。固
定プローブとマッチして相補鎖伸長したプローブにハイ
ブリダイズしたDNAは２本鎖を１本鎖に熱解離する95℃
程度の高温下でも相補鎖の固定された区画の比較的近傍
に滞在する。一方、相補鎖合成しなかったDNAはより多
く拡散してマッチするオリゴマー部にも一部が到達す
る。これをくりかえすことにより、DNA鎖の各区画への
選別捕獲と増幅を行うことができる。
【００２７】上記実施例では種々DNAプロ−ブを細棒の
ようにそれぞれが分離可能な固体表面に固定して用いた
が、材質はここで用いたガラス棒に限定されるものでは
ない。また、ガラスなどの板状物質の表面に区画を設
け、それぞれのDNAプロ−ブを固定し、分画することも
できる。 〔実施例２〕第２の実施例は分別したDNA断片をそのま
ま塩基配列決定に活用する例である。実施例１と同様に
して短冊状リボンの先端に分別してDNA断片を保持し、
合成相補鎖を作る。合成相補鎖の3'末端にはライゲーシ
ョンで先に付着せしめたオリゴマーと同じ共通配列があ
る。昇温し、２本鎖を熱解離し１本鎖とし、すべての短
冊を一括して塩基配列決定反応液中に浸してシーケンス
反応を行う。プライマーには3'末端の共通配列に相補的
な配列を用いる。ターミネータddNTP（ダイデオキシヌ
クレオチド）を塩基種に応じて異なる蛍光体で標識した
ものを用いると便利である。なお蛍光標識プライマーを
用いる時には短冊リボンに固定されたDNA伸長鎖を４つ
用意し末端塩基種の異なるフラグメントファミリーを合
成する。シーケンス反応終了後にはリボン先端に5'末端
を固定された伸長DNAの3'末端側に共通プライマーを用
いて合成した種々長さの断片が保持される。この短冊リ
ボンをゲル板の上端に載せ、熱を加えてシーケンス反応
により得たDNA断片を遊離し、ゲル泳動分離により断片
長を知り配列を決定する。もちろん短冊リボンは各種類
毎に異なる位置におかれ、そこから遊離するＤＮＡ断片
群は別々の泳動で分離される。
ようにそれぞれが分離可能な固体表面に固定して用いた
が、材質はここで用いたガラス棒に限定されるものでは
ない。また、ガラスなどの板状物質の表面に区画を設
け、それぞれのDNAプロ−ブを固定し、分画することも
できる。 〔実施例２〕第２の実施例は分別したDNA断片をそのま
ま塩基配列決定に活用する例である。実施例１と同様に
して短冊状リボンの先端に分別してDNA断片を保持し、
合成相補鎖を作る。合成相補鎖の3'末端にはライゲーシ
ョンで先に付着せしめたオリゴマーと同じ共通配列があ
る。昇温し、２本鎖を熱解離し１本鎖とし、すべての短
冊を一括して塩基配列決定反応液中に浸してシーケンス
反応を行う。プライマーには3'末端の共通配列に相補的
な配列を用いる。ターミネータddNTP（ダイデオキシヌ
クレオチド）を塩基種に応じて異なる蛍光体で標識した
ものを用いると便利である。なお蛍光標識プライマーを
用いる時には短冊リボンに固定されたDNA伸長鎖を４つ
用意し末端塩基種の異なるフラグメントファミリーを合
成する。シーケンス反応終了後にはリボン先端に5'末端
を固定された伸長DNAの3'末端側に共通プライマーを用
いて合成した種々長さの断片が保持される。この短冊リ
ボンをゲル板の上端に載せ、熱を加えてシーケンス反応
により得たDNA断片を遊離し、ゲル泳動分離により断片
長を知り配列を決定する。もちろん短冊リボンは各種類
毎に異なる位置におかれ、そこから遊離するＤＮＡ断片
群は別々の泳動で分離される。
【００２８】
【発明の効果】本発明によれば、塩基配列が未知のDNA
断片群を末端配列の違いにより分別・分画できる。これ
により従来、非常に手間と時間を必要としたクロ−ニン
グプロセスなしにDNAの解析を可能とする。また、固体
表面にDNA断片の配列と相補的配列を持つ（２本鎖DNA断
片では全体で見ると元のDNA断片群と同じ配列の断片群
になる）DNAを保持したライブラリ−を末端配列ごとに
整理して得ることが出来るので種々の方面に応用可能で
ある。
断片群を末端配列の違いにより分別・分画できる。これ
により従来、非常に手間と時間を必要としたクロ−ニン
グプロセスなしにDNAの解析を可能とする。また、固体
表面にDNA断片の配列と相補的配列を持つ（２本鎖DNA断
片では全体で見ると元のDNA断片群と同じ配列の断片群
になる）DNAを保持したライブラリ−を末端配列ごとに
整理して得ることが出来るので種々の方面に応用可能で
ある。
【図１】本発明のDNA抽出法の概念図。
【図２】本発明のDNA抽出用細棒集合体の概念図。
【図３】DNA断片末端２塩基の調べ方を示す図。
【図４】DNA断片末端２塩基の決定に用いる検出装置の
概念図。
概念図。
【図５】DNA断片末端２塩基の調べ方の他の方法を示す
図。
図。
【図６】本発明を用いた塩基配列決定結果の一例を示す
図。
図。
１…２本鎖DNAの制限控訴切断，２…概知配列オリゴマ
−，３…概知配列を導入した２本鎖DNA，11…オリゴマ
−を固定する細棒，12…DNAオリゴマ−，13…オリゴマ
−の概知配列部，14…任意配列部，30,31…２本鎖DNAの
５'末端側の未知配列部，41…２本鎖DNAの十鎖，42…２
本鎖DNAの一鎖，51,52…相補鎖合成されたDNA，61…不
実系にハイブリダイズしたDNA，101,110…副数本束ねた
オリゴマ−固定細棒，111…ハイブリダイズしたDNA，11
2…蛍光標識タ−ミネ−タ−，120…オリゴマ−の概知配
列部に続く１塩基目のA,C,G,Tを１組に束ねたオリゴマ
−固定細棒，121,206…レ−ザ−発信機，122…ビ−ムエ
キスパンダ−，123…ダイクロイックミラ−，124…集光
レンズ，125…フィルタ−，126,207…光検出機，127…
光カプラ−，128,211…デ−タ処理装置，200,201,202,2
03…DNAオリゴマ−，204…試料DNA，205…試料DNAに導
入された蛍光標識タ−ミネ−タ−，209…電気泳動用ゲ
ル担体，210…レ−ザ光，220…蛍光標識タ−ミネ−タ−
を導入したオリゴマ−の電気泳動分離バンド，221…未
反応蛍光標識タ−ミネ−タ−の電気泳動分離バンド
−，３…概知配列を導入した２本鎖DNA，11…オリゴマ
−を固定する細棒，12…DNAオリゴマ−，13…オリゴマ
−の概知配列部，14…任意配列部，30,31…２本鎖DNAの
５'末端側の未知配列部，41…２本鎖DNAの十鎖，42…２
本鎖DNAの一鎖，51,52…相補鎖合成されたDNA，61…不
実系にハイブリダイズしたDNA，101,110…副数本束ねた
オリゴマ−固定細棒，111…ハイブリダイズしたDNA，11
2…蛍光標識タ−ミネ−タ−，120…オリゴマ−の概知配
列部に続く１塩基目のA,C,G,Tを１組に束ねたオリゴマ
−固定細棒，121,206…レ−ザ−発信機，122…ビ−ムエ
キスパンダ−，123…ダイクロイックミラ−，124…集光
レンズ，125…フィルタ−，126,207…光検出機，127…
光カプラ−，128,211…デ−タ処理装置，200,201,202,2
03…DNAオリゴマ−，204…試料DNA，205…試料DNAに導
入された蛍光標識タ−ミネ−タ−，209…電気泳動用ゲ
ル担体，210…レ−ザ光，220…蛍光標識タ−ミネ−タ−
を導入したオリゴマ−の電気泳動分離バンド，221…未
反応蛍光標識タ−ミネ−タ−の電気泳動分離バンド
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平２−219600（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/00 - 15/90
Claims (8)
- 【請求項１】 その末端に配列既知のDNAオリゴマーを
結合した核酸断片の混合物を、前記DNAオリゴマーと相
補な特定塩基配列に続き１〜６個の任意配列を３'末端
にもつ種々のDNAプロ−ブを固体表面に固定したプロ−
ブチップあるいはプロ−ブチップ群で処理し、少なくと
もハイブリダイゼ−ションおよび相補鎖合成のプロセス
を経て前記混合核酸断片を分別あるいは分画することを
特徴とする核酸分別方法。 - 【請求項２】 プロ−ブチップがそれぞれ分別可能な細
棒、ワイヤ−、短冊状のシート、リボンなどの上にDNA
プロ−ブを固定したものであることを特徴とする請求項
１記載の核酸分別方法。 - 【請求項３】 プロ−ブチップが、固体表面上に区画を
設けこれにDNAプロ−ブを種類別に固定したものである
ことを特徴とする請求項１記載の核酸分別方法。 - 【請求項４】 請求項１記載の方法において、相補鎖合
成プロセスと、該相補鎖合成プロセスにより得られる相
補鎖合成混合物を昇温せしめることにより該混合物中の
相補鎖合成したDNAプロ−ブは核酸試料と結合した状態
で、一方相補鎖合成しなかったDNAプロ−ブと核酸試料
とを解離せしめる解離プロセスとを少なくとも１回以上
繰り返すことを特徴とする核酸分別方法。 - 【請求項５】 請求項１記載の方法において、DNAプロ
−ブを保持した１つあるいは複数のプロ−ブチップを核
酸断片群を含む溶液中に同時にいれ相補鎖合成し、二本
鎖となったDNAを１種ずつあるいは複数種同時に分別あ
るいは分画することを特徴とする核酸断片の分別方法。 - 【請求項６】 請求項１記載の方法において、DNAオリ
ゴマーを種類毎に別々の固体表面あるいは同一固体表面
の区画された位置に固定したオリゴDNAチップと遊離DNA
オリゴマーを用いたDNA相補鎖合成に当たり、反応温度
を上下することによりDNAを選別することを特徴とする
核酸断片の分別方法。 - 【請求項７】 固体表面に固定されたDNAオリゴマーの
構成配列が共通配列と3'末端側に任意配列を含むもので
あることを特徴とする請求項６記載の核酸断片の分別方
法。 - 【請求項８】 請求項１乃至６のいずれかの項記載の核
酸断片の分別方法により得られた核酸断片をそのままあ
るいは分離、採取してその塩基配列を決定することを特
徴とする核酸塩基配列の解析方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26693693A JP3419850B2 (ja) | 1993-10-26 | 1993-10-26 | 核酸分別方法 |
| EP94116671A EP0649852B1 (en) | 1993-10-26 | 1994-10-21 | Fractionation method for nucleotide fragments |
| DE69422467T DE69422467T2 (de) | 1993-10-26 | 1994-10-21 | Fraktioniermethode für Nukleotidfragmente |
| CN94117583A CN1077140C (zh) | 1993-10-26 | 1994-10-26 | 核苷酸片段的分级分离方法 |
| US08/748,900 US5817464A (en) | 1993-10-26 | 1996-11-15 | Fractionation method for nucleotide fragments |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26693693A JP3419850B2 (ja) | 1993-10-26 | 1993-10-26 | 核酸分別方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07116000A JPH07116000A (ja) | 1995-05-09 |
| JP3419850B2 true JP3419850B2 (ja) | 2003-06-23 |
Family
ID=17437748
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26693693A Expired - Fee Related JP3419850B2 (ja) | 1993-10-26 | 1993-10-26 | 核酸分別方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5817464A (ja) |
| EP (1) | EP0649852B1 (ja) |
| JP (1) | JP3419850B2 (ja) |
| CN (1) | CN1077140C (ja) |
| DE (1) | DE69422467T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CA2185590A1 (en) * | 1995-09-18 | 1997-03-19 | Kazunori Okano | Dna sequencing method and dna sample preparation method |
| US5780231A (en) * | 1995-11-17 | 1998-07-14 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA extension and analysis with rolling primers |
| US5763175A (en) * | 1995-11-17 | 1998-06-09 | Lynx Therapeutics, Inc. | Simultaneous sequencing of tagged polynucleotides |
| JPH09149799A (ja) * | 1995-11-30 | 1997-06-10 | Hitachi Ltd | 核酸の分析方法又は検査方法、及び核酸の分析装置又は検査装置 |
| US6458530B1 (en) | 1996-04-04 | 2002-10-01 | Affymetrix Inc. | Selecting tag nucleic acids |
| US5905024A (en) * | 1996-12-17 | 1999-05-18 | University Of Chicago | Method for performing site-specific affinity fractionation for use in DNA sequencing |
| IL122147A0 (en) * | 1997-11-10 | 1998-04-05 | Technion Res & Dev Foundation | Method for labeling polynucleotides |
| JP2002501760A (ja) * | 1998-02-02 | 2002-01-22 | アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・アクチボラグ | 核酸解析方法 |
| US6054276A (en) * | 1998-02-23 | 2000-04-25 | Macevicz; Stephen C. | DNA restriction site mapping |
| JP2003135098A (ja) * | 2001-11-06 | 2003-05-13 | Hitachi Ltd | 遺伝子検査方法 |
| US11692221B2 (en) * | 2017-08-01 | 2023-07-04 | Mgi Tech Co., Ltd. | Nucleic acid sequencing method |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US496202A (en) * | 1893-04-25 | Puzzle | ||
| US5171534A (en) * | 1984-01-16 | 1992-12-15 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
| US5221518A (en) * | 1984-12-14 | 1993-06-22 | Mills Randell L | DNA sequencing apparatus |
| US5064754A (en) * | 1984-12-14 | 1991-11-12 | Mills Randell L | Genomic sequencing method |
| CA1323553C (en) * | 1987-11-03 | 1993-10-26 | Timothy George Helentjaris | Method and device for improved restriction fragment length polymorphism analysis |
| US4962020A (en) * | 1988-07-12 | 1990-10-09 | President And Fellows Of Harvard College | DNA sequencing |
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