JPH09140400A - 塩基配列決定方法 - Google Patents
塩基配列決定方法Info
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- JPH09140400A JPH09140400A JP8242929A JP24292996A JPH09140400A JP H09140400 A JPH09140400 A JP H09140400A JP 8242929 A JP8242929 A JP 8242929A JP 24292996 A JP24292996 A JP 24292996A JP H09140400 A JPH09140400 A JP H09140400A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＤＮＡ断片とＤＮＡ断片に隣接する部位との
塩基配列の決定方法を提供する。 【解決手段】 ＤＮＡ断片３を鋳型として蛍光標識プラ
イマー３１を用い相補鎖合成し、伸長ＤＮＡ鎖３２を得
る。伸長ＤＮＡ鎖をプライマーとし、試料ＤＮＡ１を鋳
型としてシーケンス反応を実行し、ＤＮＡ伸長鎖３３を
得る。伸長ＤＮＡ鎖３３を電気泳動分離して、ＤＮＡ断
片の塩基配列と、ＤＮＡ断片に隣接する試料ＤＮＡ１の
の少なくとも一部の塩基配列とを同時に決定する。 【効果】 試料ＤＮＡから得る複数ＤＮＡ断片の塩基配
列を重複して解析せず、試料ＤＮＡの塩基配列を決定で
きる。
塩基配列の決定方法を提供する。 【解決手段】 ＤＮＡ断片３を鋳型として蛍光標識プラ
イマー３１を用い相補鎖合成し、伸長ＤＮＡ鎖３２を得
る。伸長ＤＮＡ鎖をプライマーとし、試料ＤＮＡ１を鋳
型としてシーケンス反応を実行し、ＤＮＡ伸長鎖３３を
得る。伸長ＤＮＡ鎖３３を電気泳動分離して、ＤＮＡ断
片の塩基配列と、ＤＮＡ断片に隣接する試料ＤＮＡ１の
の少なくとも一部の塩基配列とを同時に決定する。 【効果】 試料ＤＮＡから得る複数ＤＮＡ断片の塩基配
列を重複して解析せず、試料ＤＮＡの塩基配列を決定で
きる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡの効率の良
い塩基配列決定方法に関し、特に蛍光を用いたＤＮＡの
塩基配列決定方法に関する。
い塩基配列決定方法に関し、特に蛍光を用いたＤＮＡの
塩基配列決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡの塩基配列決定は、遺伝子に含ま
れるＤＮＡを１０ｋ塩基から１００ｋ塩基の長さのクロ
ーンにして全てのＤＮＡを網羅するＤＮＡライブラリー
を作成することから始まる。実際の塩基配列決定では、
各クローンをさらに切断しＤＮＡシーケンサにより、分
析が可能な長さのサブクローンをつくり塩基配列決定を
行なう。最後に塩基配列決定したＤＮＡ断片を再構成し
てもとの完全なＤＮＡの塩基配列を得る。上記方法は操
作が単純なため広く用いられている。
れるＤＮＡを１０ｋ塩基から１００ｋ塩基の長さのクロ
ーンにして全てのＤＮＡを網羅するＤＮＡライブラリー
を作成することから始まる。実際の塩基配列決定では、
各クローンをさらに切断しＤＮＡシーケンサにより、分
析が可能な長さのサブクローンをつくり塩基配列決定を
行なう。最後に塩基配列決定したＤＮＡ断片を再構成し
てもとの完全なＤＮＡの塩基配列を得る。上記方法は操
作が単純なため広く用いられている。
【０００３】しかし、昨今のヒトゲノム計画に見られる
ように、大規模な塩基配列決定方法としてはスループッ
トの点や自動化の点で必ずしも最良の方法とは言えない
（数理科学 Ｎｏ．３５９、Ｍａｙ、（１９９３）ｐｐ
７４−８１）。特に、ＤＮＡシーケンサによる計測に先
立って行われるサブクローンの作成が煩雑で問題となっ
ている。従来、サブクローンは巨大ＤＮＡを超音波によ
りランダムに切断して調製していた（「モレキュラー・
クローニング」第２版、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレス、（１９８９年）第１３．２
１頁から１３．２３頁（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ」ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、 Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９）ｐｐ１３．２１−１３．２
３）。サブクローンを大腸菌に挿入し培養して得られた
コロニーを分別して断片化した目的ＤＮＡを分取してい
た。
ように、大規模な塩基配列決定方法としてはスループッ
トの点や自動化の点で必ずしも最良の方法とは言えない
（数理科学 Ｎｏ．３５９、Ｍａｙ、（１９９３）ｐｐ
７４−８１）。特に、ＤＮＡシーケンサによる計測に先
立って行われるサブクローンの作成が煩雑で問題となっ
ている。従来、サブクローンは巨大ＤＮＡを超音波によ
りランダムに切断して調製していた（「モレキュラー・
クローニング」第２版、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー・プレス、（１９８９年）第１３．２
１頁から１３．２３頁（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ」ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、 Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９）ｐｐ１３．２１−１３．２
３）。サブクローンを大腸菌に挿入し培養して得られた
コロニーを分別して断片化した目的ＤＮＡを分取してい
た。
【０００４】次いで、分取したＤＮＡ断片を含むプラス
ミドを用いてＤＮＡ塩基配列決定をコロニー毎に行なっ
ていた。通常、１回の塩基配列操作で決定できるＤＮＡ
塩基長は３００塩基から５００塩基であるため多数のサ
ブクローンを解析する必要があった。
ミドを用いてＤＮＡ塩基配列決定をコロニー毎に行なっ
ていた。通常、１回の塩基配列操作で決定できるＤＮＡ
塩基長は３００塩基から５００塩基であるため多数のサ
ブクローンを解析する必要があった。
【０００５】また、コロニーを取ってきても同じＤＮＡ
断片部分を含むコロニーが多数あるため、同じＤＮＡ塩
基配列部分を重複して塩基配列決定せざるを得ず、実際
に塩基配列決定したい部分の１０倍から２０倍の塩基長
を分析する必要があった。実際には１０ｋ塩基長のＤＮ
Ａを塩基配列決定するのに４００以上のプラスミド（サ
ブクローン）を解析する必要があるが、塩基配列情報が
重複しないようにサブクローンを選択できない。また、
サブクローンの作成は、大腸菌の宿種・ベクター系を利
用するため、操作が繁雑であり自動化に向かない。
断片部分を含むコロニーが多数あるため、同じＤＮＡ塩
基配列部分を重複して塩基配列決定せざるを得ず、実際
に塩基配列決定したい部分の１０倍から２０倍の塩基長
を分析する必要があった。実際には１０ｋ塩基長のＤＮ
Ａを塩基配列決定するのに４００以上のプラスミド（サ
ブクローン）を解析する必要があるが、塩基配列情報が
重複しないようにサブクローンを選択できない。また、
サブクローンの作成は、大腸菌の宿種・ベクター系を利
用するため、操作が繁雑であり自動化に向かない。
【０００６】同じ塩基配列を何度も重複して塩基配列決
定する必要がない方法にプライマーウォーキング法（サ
イエンス、２５８（１９９２年）第１７８７頁から１７
９１頁（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８（１９９２）ｐｐ１７
８７−１７９１））がある。プライマーウォーキング法
では、巨大ＤＮＡをそのまま試料ＤＮＡとして用いる。
まず試料ＤＮＡの一部分の塩基配列を決定する。次に、
決定したＤＮＡ塩基配列を基に、塩基配列決定した部分
に特異的にハイブリダイズするプライマーを合成して次
の部分のＤＮＡ塩基配列を決定する。プライマーウォー
キング法では、重複して塩基配列決定する部分を最小に
できるが、塩基配列決定毎にプライマー合成をする必要
がある。また、塩基配列決定操作がシーケンシャルとな
るので必ずしも大規模シーケンシングに適しているとは
限らない。
定する必要がない方法にプライマーウォーキング法（サ
イエンス、２５８（１９９２年）第１７８７頁から１７
９１頁（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８（１９９２）ｐｐ１７
８７−１７９１））がある。プライマーウォーキング法
では、巨大ＤＮＡをそのまま試料ＤＮＡとして用いる。
まず試料ＤＮＡの一部分の塩基配列を決定する。次に、
決定したＤＮＡ塩基配列を基に、塩基配列決定した部分
に特異的にハイブリダイズするプライマーを合成して次
の部分のＤＮＡ塩基配列を決定する。プライマーウォー
キング法では、重複して塩基配列決定する部分を最小に
できるが、塩基配列決定毎にプライマー合成をする必要
がある。また、塩基配列決定操作がシーケンシャルとな
るので必ずしも大規模シーケンシングに適しているとは
限らない。
【０００７】クローニングやプライマーウォーキングの
繁雑性を解決するため各種の方法が試みられている。特
に有望な、試料ＤＮＡの制限酵素によるＤＮＡ断片を混
合物の状態から直接塩基配列決定する方法（ＤＮＡリサ
ーチ、１（１９９４年）第２３１頁から２３７頁（ＤＮ
Ａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １ ｐｐ２３１−２３７））に
ついて以下に説明する。ＤＮＡ制限酵素により切断され
た各ＤＮＡ断片を認識するために、既知塩基配列をもつ
オリゴマーをＤＮＡ制限酵素によるＤＮＡ断片の末端に
ライゲーション反応により導入する。次に、制限酵素に
よる切断部と、この切断部に続く１塩基から４塩基の未
知塩基配列を選別できるプライマーセットを用いてシー
ケンシング反応を行なう。プライマーセットは、例え
ば、未知塩基配列部分が２塩基の場合、１６通りの全て
の塩基の塩基配列の組み合わせからなる。２本鎖ＤＮＡ
断片が３種類（ＤＮＡ末端として６種類）程度の場合、
混合物から直接各ＤＮＡ断片の塩基配列を上記プライマ
ーセットを用いて決定できる。各ＤＮＡ断片の塩基配列
を決定した後に、各ＤＮＡ断片の塩基配列を繋ぎ合わせ
て全体塩基配列を得る。全体塩基配列を得るために、各
ＤＮＡ断片の３’末端近傍の塩基配列と同じ塩基配列の
プライマーを合成し、切断前のＤＮＡを鋳型として塩基
配列決定反応を行ない、ＤＮＡ断片とＤＮＡ断片の間の
塩基配列を決定してＤＮＡ断片間の繋がりを知る。又
は、別の制限酵素により切断したＤＮＡ断片の塩基配列
を決定し、塩基配列の重列を手掛かりにＤＮＡ断片の相
互の繋がりを決定していく。
繁雑性を解決するため各種の方法が試みられている。特
に有望な、試料ＤＮＡの制限酵素によるＤＮＡ断片を混
合物の状態から直接塩基配列決定する方法（ＤＮＡリサ
ーチ、１（１９９４年）第２３１頁から２３７頁（ＤＮ
Ａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １ ｐｐ２３１−２３７））に
ついて以下に説明する。ＤＮＡ制限酵素により切断され
た各ＤＮＡ断片を認識するために、既知塩基配列をもつ
オリゴマーをＤＮＡ制限酵素によるＤＮＡ断片の末端に
ライゲーション反応により導入する。次に、制限酵素に
よる切断部と、この切断部に続く１塩基から４塩基の未
知塩基配列を選別できるプライマーセットを用いてシー
ケンシング反応を行なう。プライマーセットは、例え
ば、未知塩基配列部分が２塩基の場合、１６通りの全て
の塩基の塩基配列の組み合わせからなる。２本鎖ＤＮＡ
断片が３種類（ＤＮＡ末端として６種類）程度の場合、
混合物から直接各ＤＮＡ断片の塩基配列を上記プライマ
ーセットを用いて決定できる。各ＤＮＡ断片の塩基配列
を決定した後に、各ＤＮＡ断片の塩基配列を繋ぎ合わせ
て全体塩基配列を得る。全体塩基配列を得るために、各
ＤＮＡ断片の３’末端近傍の塩基配列と同じ塩基配列の
プライマーを合成し、切断前のＤＮＡを鋳型として塩基
配列決定反応を行ない、ＤＮＡ断片とＤＮＡ断片の間の
塩基配列を決定してＤＮＡ断片間の繋がりを知る。又
は、別の制限酵素により切断したＤＮＡ断片の塩基配列
を決定し、塩基配列の重列を手掛かりにＤＮＡ断片の相
互の繋がりを決定していく。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、長いＤ
ＮＡの塩基配列決定は、従来非常に手間と時間のかかる
プロセスによってなされていた。サブクローンを用いる
方法は、複数のＤＮＡ断片（サブクローン）の塩基配列
決定を並行してできるため広く使用されているが、同じ
塩基配列部分を重複して読む必要があり、塩基配列決定
の規模が大きくなると、手間と時間が膨大にかかるとい
う問題がある。また、効率を上げるため重複を少なくす
ると、塩基配列決定した各ＤＮＡ断片の繋ぎ合わせが困
難となり、元の長いＤＮＡ塩基配列を再構成できないと
いう問題がある。
ＮＡの塩基配列決定は、従来非常に手間と時間のかかる
プロセスによってなされていた。サブクローンを用いる
方法は、複数のＤＮＡ断片（サブクローン）の塩基配列
決定を並行してできるため広く使用されているが、同じ
塩基配列部分を重複して読む必要があり、塩基配列決定
の規模が大きくなると、手間と時間が膨大にかかるとい
う問題がある。また、効率を上げるため重複を少なくす
ると、塩基配列決定した各ＤＮＡ断片の繋ぎ合わせが困
難となり、元の長いＤＮＡ塩基配列を再構成できないと
いう問題がある。
【０００９】プライマーウォーキング法では、常に塩基
配列決定した部分から次のプライマーを合成して用いる
ために、塩基配列決定した部分の繋がりは明確である利
点がある。しかし、塩基配列決定は基本的に１本のＤＮ
Ａ鎖を片方の端から順次、数百塩基毎に行なう必要があ
るため処理能力に限界があること、さらに、塩基配列決
定した部分を基に合成したプライマーがうまく機能せず
に、全塩基配列決定が困難となることに問題があった。
制限酵素によるＤＮＡ断片の塩基配列を決定していく方
法では、ＤＮＡ断片間の繋がりを知るために多大な労力
が必要途なるという問題がある。
配列決定した部分から次のプライマーを合成して用いる
ために、塩基配列決定した部分の繋がりは明確である利
点がある。しかし、塩基配列決定は基本的に１本のＤＮ
Ａ鎖を片方の端から順次、数百塩基毎に行なう必要があ
るため処理能力に限界があること、さらに、塩基配列決
定した部分を基に合成したプライマーがうまく機能せず
に、全塩基配列決定が困難となることに問題があった。
制限酵素によるＤＮＡ断片の塩基配列を決定していく方
法では、ＤＮＡ断片間の繋がりを知るために多大な労力
が必要途なるという問題がある。
【００１０】上記問題を解決するため、本発明の目的
は、試料ＤＮＡの塩基配列決定時に、目的とするＤＮＡ
断片の塩基配列を決定すると同時に、目的とするＤＮＡ
断片に隣接する試料ＤＮＡの塩基配列の少なくとも一部
分が同時に決定できる塩基配列決定方法を提供すること
にある。
は、試料ＤＮＡの塩基配列決定時に、目的とするＤＮＡ
断片の塩基配列を決定すると同時に、目的とするＤＮＡ
断片に隣接する試料ＤＮＡの塩基配列の少なくとも一部
分が同時に決定できる塩基配列決定方法を提供すること
にある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の構成（Ａ）の塩
基配列決定方法では、 （Ａ１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断してＤＮＡ断
片を得る工程と、 （Ａ２）上記ＤＮＡ断片の３’末端に所定の塩基配列を
もつオリゴマー（例えば、単一の塩基種からなるオリゴ
マー）を付加する工程と、 （Ａ３）上記オリゴマーが付加された上記ＤＮＡ断片の
１本鎖を鋳型とし、上記オリゴマーの塩基配列の少なく
とも一部と相補的な第１の塩基配列部分と、上記制限酵
素により認識される塩基配列と相補的な第２の塩基配列
部分と、１塩基から４塩基の範囲の塩基の可能な組み合
わせからなる第３の塩基配列部分とからなり、標識（例
えば、蛍光標識）された標識プライマーを用いて、相補
鎖合成伸長反応を行ない、上記ＤＮＡ断片の１本鎖に相
補的な塩基配列をもつ標識伸長プライマーを得る工程
と、 （Ａ４）（ａ）上記オリゴマーが付加された上記ＤＮＡ
断片の１本鎖を鋳型とし上記標識プライマーを使用して
シーケンス反応を行なう工程と、（ｂ）上記ＤＮＡ断片
の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とをもつ
上記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は上記試料ＤＮＡの
１本鎖を鋳型とし、上記標識伸長プライマーを使用して
シーケンス反応を行なう工程とを、個別又は同時に進行
させる工程と、 （Ａ５）上記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、
上記ＤＮＡ断片の塩基配列と、上記ＤＮＡ断片の塩基配
列に隣接する上記試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配
列とを決定し、上記ＤＮＡ断片の長さより長い部分の上
記試料ＤＮＡの塩基配列を決定する工程とを有すること
に特徴があり、さらに上記工程（Ａ３）、（Ａ４）にお
いて、耐熱性ポリメラーゼを使用して、上記工程（Ａ
３）、（Ａ４）をそれぞれ、温度条件を変更して複数回
繰り返し、十分な数の、上記標識伸長プライマー及び上
記シーケンス反応生成物を得ることに特徴がある。
基配列決定方法では、 （Ａ１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断してＤＮＡ断
片を得る工程と、 （Ａ２）上記ＤＮＡ断片の３’末端に所定の塩基配列を
もつオリゴマー（例えば、単一の塩基種からなるオリゴ
マー）を付加する工程と、 （Ａ３）上記オリゴマーが付加された上記ＤＮＡ断片の
１本鎖を鋳型とし、上記オリゴマーの塩基配列の少なく
とも一部と相補的な第１の塩基配列部分と、上記制限酵
素により認識される塩基配列と相補的な第２の塩基配列
部分と、１塩基から４塩基の範囲の塩基の可能な組み合
わせからなる第３の塩基配列部分とからなり、標識（例
えば、蛍光標識）された標識プライマーを用いて、相補
鎖合成伸長反応を行ない、上記ＤＮＡ断片の１本鎖に相
補的な塩基配列をもつ標識伸長プライマーを得る工程
と、 （Ａ４）（ａ）上記オリゴマーが付加された上記ＤＮＡ
断片の１本鎖を鋳型とし上記標識プライマーを使用して
シーケンス反応を行なう工程と、（ｂ）上記ＤＮＡ断片
の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とをもつ
上記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は上記試料ＤＮＡの
１本鎖を鋳型とし、上記標識伸長プライマーを使用して
シーケンス反応を行なう工程とを、個別又は同時に進行
させる工程と、 （Ａ５）上記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、
上記ＤＮＡ断片の塩基配列と、上記ＤＮＡ断片の塩基配
列に隣接する上記試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配
列とを決定し、上記ＤＮＡ断片の長さより長い部分の上
記試料ＤＮＡの塩基配列を決定する工程とを有すること
に特徴があり、さらに上記工程（Ａ３）、（Ａ４）にお
いて、耐熱性ポリメラーゼを使用して、上記工程（Ａ
３）、（Ａ４）をそれぞれ、温度条件を変更して複数回
繰り返し、十分な数の、上記標識伸長プライマー及び上
記シーケンス反応生成物を得ることに特徴がある。
【００１２】本発明の構成（Ｂ）の塩基配列決定方法で
は、（Ｂ１）試料ＤＮＡを第１の制限酵素により切断し
てＤＮＡ断片を得る工程と、（Ｂ２）プライマーを用
い、上記ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型として伸長反応を行
なった後、３’末端を蛍光標識ヌクレオチドと置換する
工程と、（Ｂ３）上記（Ｂ２）で生成した相補鎖を上記
第１の制限酵素と異なる第２の制限酵素により切断し
て、３’末端に蛍光標識された蛍光標識プライマーを得
る工程と、（Ｂ４）上記蛍光標識プライマーを用い、上
記ＤＮＡ断片の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基
配列とをもつ上記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は上記
試料ＤＮＡの１本鎖を鋳型として、シーケンス反応を行
なう工程と、（Ｂ５）上記シーケンス反応の生成物を電
気泳動して、上記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接する上記
試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列を決定し、上記
ＤＮＡ断片の長さより長い部分の上記試料ＤＮＡの塩基
配列を決定する工程とを有することに特徴がある。
は、（Ｂ１）試料ＤＮＡを第１の制限酵素により切断し
てＤＮＡ断片を得る工程と、（Ｂ２）プライマーを用
い、上記ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型として伸長反応を行
なった後、３’末端を蛍光標識ヌクレオチドと置換する
工程と、（Ｂ３）上記（Ｂ２）で生成した相補鎖を上記
第１の制限酵素と異なる第２の制限酵素により切断し
て、３’末端に蛍光標識された蛍光標識プライマーを得
る工程と、（Ｂ４）上記蛍光標識プライマーを用い、上
記ＤＮＡ断片の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基
配列とをもつ上記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は上記
試料ＤＮＡの１本鎖を鋳型として、シーケンス反応を行
なう工程と、（Ｂ５）上記シーケンス反応の生成物を電
気泳動して、上記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接する上記
試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列を決定し、上記
ＤＮＡ断片の長さより長い部分の上記試料ＤＮＡの塩基
配列を決定する工程とを有することに特徴がある。
【００１３】本発明の構成（Ｃ）の塩基配列決定方法で
は、（Ｃ１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断してＤＮ
Ａ断片を得る工程と、（Ｃ２）プライマーを用い、上記
ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型として相補鎖合成を行ない、
上記ＤＮＡ断片の１本鎖に相補的な塩基配列をもつプラ
イマーを得る工程と、（Ｃ３）上記プライマーを用い、
上記ＤＮＡ断片の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩
基配列とをもつ上記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は上
記試料ＤＮＡの１本鎖を鋳型として、伸長鎖の末端に蛍
光標識を導入するシーケンス反応を行なう工程と、（Ｃ
４）上記シーケンス反応の生成物を上記制限酵素により
切断する工程と、（Ｃ５）上記制限酵素により切断され
た上記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、上記Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列に隣接する上記試料ＤＮＡの少なく
とも一部の塩基配列を決定し、上記ＤＮＡ断片の長さよ
り長い部分の上記試料ＤＮＡの塩基配列を決定する工程
とを有することに特徴がある。
は、（Ｃ１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断してＤＮ
Ａ断片を得る工程と、（Ｃ２）プライマーを用い、上記
ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型として相補鎖合成を行ない、
上記ＤＮＡ断片の１本鎖に相補的な塩基配列をもつプラ
イマーを得る工程と、（Ｃ３）上記プライマーを用い、
上記ＤＮＡ断片の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩
基配列とをもつ上記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は上
記試料ＤＮＡの１本鎖を鋳型として、伸長鎖の末端に蛍
光標識を導入するシーケンス反応を行なう工程と、（Ｃ
４）上記シーケンス反応の生成物を上記制限酵素により
切断する工程と、（Ｃ５）上記制限酵素により切断され
た上記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、上記Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列に隣接する上記試料ＤＮＡの少なく
とも一部の塩基配列を決定し、上記ＤＮＡ断片の長さよ
り長い部分の上記試料ＤＮＡの塩基配列を決定する工程
とを有することに特徴がある。
【００１４】本発明の構成（Ｄ）の塩基配列決定方法で
は、（Ｄ１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断してＤＮ
Ａ断片を得る工程と、（Ｄ２）蛍光標識プライマーを用
い、上記ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型として相補鎖合成を
行ない、上記ＤＮＡ断片の１本鎖に相補的な塩基配列を
もつプライマーを得る工程と、（Ｄ３）上記ＤＮＡ断片
の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とをもつ
上記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は上記試料ＤＮＡの
１本鎖を鋳型とし、上記プライマーを用いてシーケンス
反応を行なう工程と、（Ｄ４）上記シーケンス反応の生
成物を電気泳動して、上記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接
する上記試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列決定
し、上記ＤＮＡ断片の長さより長い部分の上記試料ＤＮ
Ａの塩基配列を決定する工程とを有することに特徴があ
る。
は、（Ｄ１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断してＤＮ
Ａ断片を得る工程と、（Ｄ２）蛍光標識プライマーを用
い、上記ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型として相補鎖合成を
行ない、上記ＤＮＡ断片の１本鎖に相補的な塩基配列を
もつプライマーを得る工程と、（Ｄ３）上記ＤＮＡ断片
の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とをもつ
上記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は上記試料ＤＮＡの
１本鎖を鋳型とし、上記プライマーを用いてシーケンス
反応を行なう工程と、（Ｄ４）上記シーケンス反応の生
成物を電気泳動して、上記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接
する上記試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列決定
し、上記ＤＮＡ断片の長さより長い部分の上記試料ＤＮ
Ａの塩基配列を決定する工程とを有することに特徴があ
る。
【００１５】本発明の構成（Ｅ）の塩基配列決定方法で
は、（Ｅ１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断してＤＮ
Ａ断片を得る工程と、（Ｅ２）上記ＤＮＡ断片に選択的
に相補鎖結合し蛍光標識された第１のプライマーと、上
記ＤＮＡ断片の１本鎖に相補的な塩基配列をもつ蛍光標
識された第２のプライマーと用いて、上記ＤＮＡ断片の
１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とをもつ上
記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は上記試料ＤＮＡの１
本鎖と、上記ＤＮＡ断片とを混合し鋳型として、シーケ
ンス反応を行なう工程と、（Ｅ３）上記シーケンス反応
の生成物を電気泳動して、上記ＤＮＡ断片の塩基配列
と、上記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接する上記試料ＤＮ
Ａの少なくとも一部の塩基配列とを決定し、上記ＤＮＡ
断片の長さより長い部分の上記試料ＤＮＡの塩基配列を
決定する工程とを有することに特徴がある。
は、（Ｅ１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断してＤＮ
Ａ断片を得る工程と、（Ｅ２）上記ＤＮＡ断片に選択的
に相補鎖結合し蛍光標識された第１のプライマーと、上
記ＤＮＡ断片の１本鎖に相補的な塩基配列をもつ蛍光標
識された第２のプライマーと用いて、上記ＤＮＡ断片の
１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とをもつ上
記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は上記試料ＤＮＡの１
本鎖と、上記ＤＮＡ断片とを混合し鋳型として、シーケ
ンス反応を行なう工程と、（Ｅ３）上記シーケンス反応
の生成物を電気泳動して、上記ＤＮＡ断片の塩基配列
と、上記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接する上記試料ＤＮ
Ａの少なくとも一部の塩基配列とを決定し、上記ＤＮＡ
断片の長さより長い部分の上記試料ＤＮＡの塩基配列を
決定する工程とを有することに特徴がある。
【００１６】本発明の構成（Ｆ）の塩基配列決定方法で
は、（Ｆ１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断してＤＮ
Ａ断片を得る工程と、（Ｆ２）上記ＤＮＡ断片の１本鎖
を鋳型として、プライマーを伸長反応させて、１本鎖Ｄ
ＮＡを得る工程と、（Ｆ３）上記１本鎖ＤＮＡを用い、
上記ＤＮＡ断片の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩
基配列ともつ上記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は上記
試料ＤＮＡの１本鎖を、鋳型とするシーケンス反応を行
なう工程と、（Ｆ４）上記シーケンス反応の生成物を電
気泳動して、上記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接する上記
試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列を決定し、上記
ＤＮＡ断片の長さより長い部分の上記試料ＤＮＡの塩基
配列を決定する工程とを有することに特徴がある。
は、（Ｆ１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断してＤＮ
Ａ断片を得る工程と、（Ｆ２）上記ＤＮＡ断片の１本鎖
を鋳型として、プライマーを伸長反応させて、１本鎖Ｄ
ＮＡを得る工程と、（Ｆ３）上記１本鎖ＤＮＡを用い、
上記ＤＮＡ断片の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩
基配列ともつ上記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は上記
試料ＤＮＡの１本鎖を、鋳型とするシーケンス反応を行
なう工程と、（Ｆ４）上記シーケンス反応の生成物を電
気泳動して、上記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接する上記
試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列を決定し、上記
ＤＮＡ断片の長さより長い部分の上記試料ＤＮＡの塩基
配列を決定する工程とを有することに特徴がある。
【００１７】本発明の構成（Ｇ）の塩基配列決定方法で
は、 （Ｇ１）試料ＤＮＡから得たＤＮＡ断片の１本鎖の塩基
配列の一部と相補的な塩基配列を３’末端に有するプラ
イマーを用いて相補鎖合成伸長反応を行ない、上記ＤＮ
Ａ断片の１本鎖の一部に相補的な塩基配列をもつ伸長プ
ライマーを得る工程と、 （Ｇ２）（ａ）上記ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型とし、上
記プライマーを使用してシーケンス反応を行なう工程
と、（ｂ）上記ＤＮＡ断片の１本鎖の塩基配列とこれに
隣接する塩基配列とをもつ上記試料ＤＮＡの１本鎖の一
部、又は上記試料ＤＮＡの１本鎖を鋳型とし、上記伸長
プライマーを使用してシーケンス反応を行なう工程と
を、進行させる工程と、 （Ｇ３）上記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、
上記ＤＮＡ断片の塩基配列と、上記ＤＮＡ断片の塩基配
列に隣接する上記試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配
列とを決定、上記ＤＮＡ断片の長さより長い部分の上記
試料ＤＮＡの塩基配列を決定する工程とを有することに
特徴がある。
は、 （Ｇ１）試料ＤＮＡから得たＤＮＡ断片の１本鎖の塩基
配列の一部と相補的な塩基配列を３’末端に有するプラ
イマーを用いて相補鎖合成伸長反応を行ない、上記ＤＮ
Ａ断片の１本鎖の一部に相補的な塩基配列をもつ伸長プ
ライマーを得る工程と、 （Ｇ２）（ａ）上記ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型とし、上
記プライマーを使用してシーケンス反応を行なう工程
と、（ｂ）上記ＤＮＡ断片の１本鎖の塩基配列とこれに
隣接する塩基配列とをもつ上記試料ＤＮＡの１本鎖の一
部、又は上記試料ＤＮＡの１本鎖を鋳型とし、上記伸長
プライマーを使用してシーケンス反応を行なう工程と
を、進行させる工程と、 （Ｇ３）上記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、
上記ＤＮＡ断片の塩基配列と、上記ＤＮＡ断片の塩基配
列に隣接する上記試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配
列とを決定、上記ＤＮＡ断片の長さより長い部分の上記
試料ＤＮＡの塩基配列を決定する工程とを有することに
特徴がある。
【００１８】なお、以上の塩基配列決定方法の構成で
は、試料ＤＮＡを制限酵素により切断してＤＮＡ断片を
得るが、これに限らず超音波等によりランダムに試料Ｄ
ＮＡを切断してＤＮＡ断片を得ることができる。さら
に、その他の方法により試料ＤＮＡからＤＮＡ断片を調
製してもよい。
は、試料ＤＮＡを制限酵素により切断してＤＮＡ断片を
得るが、これに限らず超音波等によりランダムに試料Ｄ
ＮＡを切断してＤＮＡ断片を得ることができる。さら
に、その他の方法により試料ＤＮＡからＤＮＡ断片を調
製してもよい。
【００１９】本発明による塩基配列決定方法（ＤＮＡ断
片の塩基配列を伸長反応により次から次へと繋いでいく
ことができる。以下、本発明の方法をフラグメントウオ
ーキング法という）はより詳細に説明すると、（１）試
料ＤＮＡを制限酵素により断片化する工程、（２）制限
酵素により認識され切断部分に続く末端部の１塩基から
４塩基の塩基の種類とＤＡＮ断片の長さを調べ、シーケ
ンシング反応に用いるプライマーを決定する工程、
（３）制限酵素によるＤＮＡ断片を電気泳動により、長
さにより分別する工程、（４）ＤＮＡ断片の３’末端に
既知オリゴマーを付加する工程、（５）３’末端にＤＮ
Ａ断片を選別するための１塩基から４塩基からなる塩基
配列をもつ蛍光標識プライマーを用いて、選別されたＤ
ＮＡ断片を鋳型として相補鎖合成をする工程、（６）上
記標識プライマーを用い選別されたＤＮＡ断片を鋳型と
するシーケンス反応と、工程（５）による生成相補鎖を
用い、選別されたＤＮＡ断片と同じ塩基配列とこれに隣
接する塩基配列を持つ試料ＤＮＡの一部、又は試料ＤＮ
Ａを鋳型とするシーケンス反応とを、個別又は同時に行
なう工程、（７）工程（６）によるシーケンス反応の生
成物を解析して得られる塩基配列から、選別されたＤＮ
Ａ断片の塩基配列と、選別されたＤＮＡ断片に隣接する
塩基配列を得て試料ＤＮＡでの各ＤＮＡ断片の並びを決
定し、選別されたＤＮＡ断片の長さより長い部分の試料
ＤＮＡの塩基配列を決定する工程からなる。
片の塩基配列を伸長反応により次から次へと繋いでいく
ことができる。以下、本発明の方法をフラグメントウオ
ーキング法という）はより詳細に説明すると、（１）試
料ＤＮＡを制限酵素により断片化する工程、（２）制限
酵素により認識され切断部分に続く末端部の１塩基から
４塩基の塩基の種類とＤＡＮ断片の長さを調べ、シーケ
ンシング反応に用いるプライマーを決定する工程、
（３）制限酵素によるＤＮＡ断片を電気泳動により、長
さにより分別する工程、（４）ＤＮＡ断片の３’末端に
既知オリゴマーを付加する工程、（５）３’末端にＤＮ
Ａ断片を選別するための１塩基から４塩基からなる塩基
配列をもつ蛍光標識プライマーを用いて、選別されたＤ
ＮＡ断片を鋳型として相補鎖合成をする工程、（６）上
記標識プライマーを用い選別されたＤＮＡ断片を鋳型と
するシーケンス反応と、工程（５）による生成相補鎖を
用い、選別されたＤＮＡ断片と同じ塩基配列とこれに隣
接する塩基配列を持つ試料ＤＮＡの一部、又は試料ＤＮ
Ａを鋳型とするシーケンス反応とを、個別又は同時に行
なう工程、（７）工程（６）によるシーケンス反応の生
成物を解析して得られる塩基配列から、選別されたＤＮ
Ａ断片の塩基配列と、選別されたＤＮＡ断片に隣接する
塩基配列を得て試料ＤＮＡでの各ＤＮＡ断片の並びを決
定し、選別されたＤＮＡ断片の長さより長い部分の試料
ＤＮＡの塩基配列を決定する工程からなる。
【００２０】フラグメントウオーキング法では、長いＤ
ＮＡの塩基配列を短時間で効率よくできる。１般に、制
限酵素によるＤＮＡの切断では、多数のＤＮＡ断片を生
じるが、制限酵素切断反応によるＤＮＡ断片から直接に
塩基配列決定でき、決定された塩基配列の重複配列を探
すことにより、長いＤＮＡの全体の塩基配列を、クロー
ニング、又はサブクローニングすることなく、非常に小
さいリダンダンシーで決定できる。
ＮＡの塩基配列を短時間で効率よくできる。１般に、制
限酵素によるＤＮＡの切断では、多数のＤＮＡ断片を生
じるが、制限酵素切断反応によるＤＮＡ断片から直接に
塩基配列決定でき、決定された塩基配列の重複配列を探
すことにより、長いＤＮＡの全体の塩基配列を、クロー
ニング、又はサブクローニングすることなく、非常に小
さいリダンダンシーで決定できる。
【００２１】フラグメントウオーキング法では、予め調
製されている１６種類の少数のプライマーのライブラリ
ーを使用して、試料ＤＮＡの制限酵素切断反応によるＤ
ＮＡ断片の選択的シーケンス反応を行なう。複数のＤＮ
Ａ断片は並行して塩基配列決定され、蛍光標識されたプ
ライマーは、シーケンス反応の生成物を与えるように伸
長されるが、この時同時に、各ＤＮＡ断片に相補的な蛍
光標識された長い伸長されたプライマーが生成される。
この蛍光標識された長い伸長されたプライマーは、制限
酵素切断反応を受けていない試料ＤＮＡを鋳型とするプ
ライマーとして作用する。試料ＤＮＡの制限酵素切断反
応による各ＤＮＡ断片の選択的シーケンス反応液に、制
限酵素切断反応を受けていない試料ＤＮＡを鋳型として
添加することにより、各ＤＮＡ断片の塩基配列ととも
に、このＤＮＡ断片に隣接する試料ＤＮＡの塩基配列
が、試料ＤＮＡを鋳型とする上記蛍光標識された長い伸
長されたプライマーのシーケンス反応の生成物によっ
て、決定される。
製されている１６種類の少数のプライマーのライブラリ
ーを使用して、試料ＤＮＡの制限酵素切断反応によるＤ
ＮＡ断片の選択的シーケンス反応を行なう。複数のＤＮ
Ａ断片は並行して塩基配列決定され、蛍光標識されたプ
ライマーは、シーケンス反応の生成物を与えるように伸
長されるが、この時同時に、各ＤＮＡ断片に相補的な蛍
光標識された長い伸長されたプライマーが生成される。
この蛍光標識された長い伸長されたプライマーは、制限
酵素切断反応を受けていない試料ＤＮＡを鋳型とするプ
ライマーとして作用する。試料ＤＮＡの制限酵素切断反
応による各ＤＮＡ断片の選択的シーケンス反応液に、制
限酵素切断反応を受けていない試料ＤＮＡを鋳型として
添加することにより、各ＤＮＡ断片の塩基配列ととも
に、このＤＮＡ断片に隣接する試料ＤＮＡの塩基配列
が、試料ＤＮＡを鋳型とする上記蛍光標識された長い伸
長されたプライマーのシーケンス反応の生成物によっ
て、決定される。
【００２２】各ＤＮＡ断片の塩基配列とともに、制限酵
素の切断部位を越えた、このＤＮＡ断片に隣接する試料
ＤＮＡの塩基配列を決定できるので、決定されたこれら
塩基配列を基にして、重複する塩基配列を探すことによ
り、１つのＤＮＡ断片からこのＤＮＡ断片に隣接するＤ
ＮＡ断片へと歩き渡るようにして、試料ＤＮＡの全体の
塩基配列を決定できる。この方法では、読み取り可能な
ＤＮＡの長さは、ＤＮＡ断片の長さではなく、制限酵素
切断反応を受けていない試料ＤＮＡを鋳型とするシケン
ス反応により決定される。従って、全体の塩基配列は、
非常にリダンダンシーが小さい状態で、決定できる。
素の切断部位を越えた、このＤＮＡ断片に隣接する試料
ＤＮＡの塩基配列を決定できるので、決定されたこれら
塩基配列を基にして、重複する塩基配列を探すことによ
り、１つのＤＮＡ断片からこのＤＮＡ断片に隣接するＤ
ＮＡ断片へと歩き渡るようにして、試料ＤＮＡの全体の
塩基配列を決定できる。この方法では、読み取り可能な
ＤＮＡの長さは、ＤＮＡ断片の長さではなく、制限酵素
切断反応を受けていない試料ＤＮＡを鋳型とするシケン
ス反応により決定される。従って、全体の塩基配列は、
非常にリダンダンシーが小さい状態で、決定できる。
【００２３】
【発明の実施の形態】以下、実施例を図を参照して詳細
に説明する。
に説明する。
【００２４】（第１の実施例）図１は、本発明の第１の
実施例における処理の手順を示すフローである。第１の
実施例は、上記の工程（５）と工程（６）を連続して行
ない、選別されたＤＮＡ断片の塩基配列と、この選別さ
れたＤＮＡ断片の塩基配列に続く試料ＤＮＡの塩基配列
を同時に決定する。なお、工程（５）と工程（６）を同
時に行なうことも可能である。試料としてｐＵＣ１９を
用いた。
実施例における処理の手順を示すフローである。第１の
実施例は、上記の工程（５）と工程（６）を連続して行
ない、選別されたＤＮＡ断片の塩基配列と、この選別さ
れたＤＮＡ断片の塩基配列に続く試料ＤＮＡの塩基配列
を同時に決定する。なお、工程（５）と工程（６）を同
時に行なうことも可能である。試料としてｐＵＣ１９を
用いた。
【００２５】〈試料ＤＮＡの増幅〉試料ＤＮＡが少ない
時には、以下の手順によりＰＣＲを用いて試料ＤＮＡを
増幅する。まず、環状のｐＵＣ１９を直鎖状とするた
め、１０ｐｍｏｌのｐＵＣ１９を１００ユニットのＰｓ
ｔ１で３７℃１時間かけて切断する。常法に従いエタノ
ール沈殿を行ない、直鎖状のｐＵＣ１９を得る。次に、
１ｍＭのＡＴＰと１２ユニットのターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼを用いて、切断したｐ
ＵＣ１９の両方の３’末端にポリＡを導入して、ＰＣＲ
用のプライマーがハイブリダイズする領域とする。
時には、以下の手順によりＰＣＲを用いて試料ＤＮＡを
増幅する。まず、環状のｐＵＣ１９を直鎖状とするた
め、１０ｐｍｏｌのｐＵＣ１９を１００ユニットのＰｓ
ｔ１で３７℃１時間かけて切断する。常法に従いエタノ
ール沈殿を行ない、直鎖状のｐＵＣ１９を得る。次に、
１ｍＭのＡＴＰと１２ユニットのターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼを用いて、切断したｐ
ＵＣ１９の両方の３’末端にポリＡを導入して、ＰＣＲ
用のプライマーがハイブリダイズする領域とする。
【００２６】プライマーとして、塩基配列 ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＧＣ（配列番号１） 、及び ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＧＴ（配列番号２） をもつ２種類のプライマーを用いた。９６ｐｍｏｌの２
種類の各プライマーと、５ｆｍｏｌのポリＡを導入した
ｐＵＣ１９のＰｓｔ１切断物と、各３０ｎｍｏｌのｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰと、１５ユニット
のＴａｑポリメラーゼとを用いてＰＣＲを実行した。各
反応液量は４８００マイクロリットルとした。各反応液
を９６等分してサーマルサイクル反応を実行した。サー
マルサイクル反応は、９４℃で３０秒間、４７℃３０秒
間、７２℃５分間のサイクルを２回実行した後、９４℃
で３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃５分間のサイクル
を３５回実行した。
種類の各プライマーと、５ｆｍｏｌのポリＡを導入した
ｐＵＣ１９のＰｓｔ１切断物と、各３０ｎｍｏｌのｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰと、１５ユニット
のＴａｑポリメラーゼとを用いてＰＣＲを実行した。各
反応液量は４８００マイクロリットルとした。各反応液
を９６等分してサーマルサイクル反応を実行した。サー
マルサイクル反応は、９４℃で３０秒間、４７℃３０秒
間、７２℃５分間のサイクルを２回実行した後、９４℃
で３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃５分間のサイクル
を３５回実行した。
【００２７】未反応のプライマーとｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを除去するため、０．７％のア
ガロースゲル電気泳動で分離分取し、電気泳動的に２．
７ｋ塩基長の１つのバンドからなる高純度のＰＣＲ産物
として、約１５ｐｍｏｌの鎖状ｐＵＣ１９を得た。以下
では、この鎖状ｐＵＣ１９をＰＣＲ産物と呼び、試料Ｄ
ＮＡ１とする。
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを除去するため、０．７％のア
ガロースゲル電気泳動で分離分取し、電気泳動的に２．
７ｋ塩基長の１つのバンドからなる高純度のＰＣＲ産物
として、約１５ｐｍｏｌの鎖状ｐＵＣ１９を得た。以下
では、この鎖状ｐＵＣ１９をＰＣＲ産物と呼び、試料Ｄ
ＮＡ１とする。
【００２８】＜試料ＤＮＡの断片化＞制限酵素を用いて
ｐＵＣ１９ＰＣＲ産物を切断したＤＮＡ断片を作製す
る。本実施例では、制限酵素としてＨｈａ１を用いた
が、試料ＤＮＡ１（ｐＵＣ１９ＰＣＲ産物）を切断する
制限酵素は酵素Ｈｈａ１に限定されない。図１におい
て、１２、１３、１４は試料ＤＮＡの制限酵素により生
じる断片部分を示す。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐ
Ｈ７．５）、ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（５０
ｍＭ）、ジチオスレイトール（１ｍＭ）の溶液中で、
５．５ｐｍｏｌのｐＵＣ１９ＰＣＲ産物に、８４ユニッ
トのＨｈａ１を作用させた。反応は３７℃で１時間実行
した。反応後、反応液の一部を使用して、後述するＤＮ
Ａ断片の３’末端へのオリゴマーの付加方法に従い、Ｄ
ＮＡ断片の３’末端に既知の塩基配列を導入する。
ｐＵＣ１９ＰＣＲ産物を切断したＤＮＡ断片を作製す
る。本実施例では、制限酵素としてＨｈａ１を用いた
が、試料ＤＮＡ１（ｐＵＣ１９ＰＣＲ産物）を切断する
制限酵素は酵素Ｈｈａ１に限定されない。図１におい
て、１２、１３、１４は試料ＤＮＡの制限酵素により生
じる断片部分を示す。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐ
Ｈ７．５）、ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（５０
ｍＭ）、ジチオスレイトール（１ｍＭ）の溶液中で、
５．５ｐｍｏｌのｐＵＣ１９ＰＣＲ産物に、８４ユニッ
トのＨｈａ１を作用させた。反応は３７℃で１時間実行
した。反応後、反応液の一部を使用して、後述するＤＮ
Ａ断片の３’末端へのオリゴマーの付加方法に従い、Ｄ
ＮＡ断片の３’末端に既知の塩基配列を導入する。
【００２９】次に、１６種類のプライマー（配列番号
３）を用いて伸長反応を行なう。伸長反応生成物を１６
種類のプライマー毎に電気泳動により分析する。図２に
分析結果を示す。なお、図２、図４において、３９は塩
基長、３８はプライマーの泳動ピーク、３７はプライマ
ー伸長により生じたＤＮＡ断片の泳動パターン、４０は
プライマーがもつ２塩基配列を示す。図２の結果を基に
して、電気泳動分離により、各プライマーの伸長産物を
極力１種類となるように分取する。
３）を用いて伸長反応を行なう。伸長反応生成物を１６
種類のプライマー毎に電気泳動により分析する。図２に
分析結果を示す。なお、図２、図４において、３９は塩
基長、３８はプライマーの泳動ピーク、３７はプライマ
ー伸長により生じたＤＮＡ断片の泳動パターン、４０は
プライマーがもつ２塩基配列を示す。図２の結果を基に
して、電気泳動分離により、各プライマーの伸長産物を
極力１種類となるように分取する。
【００３０】分取に関しては、ＨｈａＩ切断反応液を直
ちに２％アガロースゲル電気泳動により分離し、第１か
ら第４までの四つのフラクションを得た。図３に示すよ
うに、第１から第４のフラクションから４種類の分離バ
ンドをもつ泳動パターン９１、９２、９３、９４がそれ
ぞれ得られた。ＤＮＡサイズマーカ９０の各バンドは、
下から１００塩基長、２００塩基長、３００塩基長、
…、と１００塩基長おきになっている。
ちに２％アガロースゲル電気泳動により分離し、第１か
ら第４までの四つのフラクションを得た。図３に示すよ
うに、第１から第４のフラクションから４種類の分離バ
ンドをもつ泳動パターン９１、９２、９３、９４がそれ
ぞれ得られた。ＤＮＡサイズマーカ９０の各バンドは、
下から１００塩基長、２００塩基長、３００塩基長、
…、と１００塩基長おきになっている。
【００３１】＜ＤＮＡ断片の３’末端へのオリゴマーの
付加＞ＤＮＡ断片の３’末端に既知の塩基配列をもつオ
リゴマーを結合する方法には２通りある。第１の方法
は、既知の塩基配列をもつオリゴマーをＤＮＡ断片にラ
イゲーションにより結合させる方法であり、ＤＮＡ断片
の３’末端だけにオリゴマーが付加される。ライゲーシ
ョン用の２本鎖オリゴマーのうち、ＤＮＡ断片の５’末
端に接する側のライゲーション用の２本鎖オリゴマーの
３’末端をダイデオキシヌクレオチドの形にする。又
は、ＤＮＡ断片の５’リン酸を除去しておく。ＤＮＡ断
片の５’末端側に余分のオリゴマーが結合すると工程
（５）で生成するＤＮＡ相補鎖に元のＤＮＡ鎖にない塩
基配列が入り、工程（６）が動作しなくなるからであ
る。第２の方法は、ターミナルデオキシヌクレチオチジ
ルトランスフェラーゼ（以下、ターミナルトランスフェ
ラーゼと呼ぶ）を用いて、ＤＮＡ断片の３’末端にｄＡ
ＴＰ（２’−デオキシアデノシン ５’−トリフォスフ
ェート）、又はｄＴＴＰ（２’−デオキシチミジントリ
フォスフェート）を順次付加していく方法である。第２
の方法が第１の方法に比べて簡単で効率も高いので、本
実施例では第２の方法を用いた。
付加＞ＤＮＡ断片の３’末端に既知の塩基配列をもつオ
リゴマーを結合する方法には２通りある。第１の方法
は、既知の塩基配列をもつオリゴマーをＤＮＡ断片にラ
イゲーションにより結合させる方法であり、ＤＮＡ断片
の３’末端だけにオリゴマーが付加される。ライゲーシ
ョン用の２本鎖オリゴマーのうち、ＤＮＡ断片の５’末
端に接する側のライゲーション用の２本鎖オリゴマーの
３’末端をダイデオキシヌクレオチドの形にする。又
は、ＤＮＡ断片の５’リン酸を除去しておく。ＤＮＡ断
片の５’末端側に余分のオリゴマーが結合すると工程
（５）で生成するＤＮＡ相補鎖に元のＤＮＡ鎖にない塩
基配列が入り、工程（６）が動作しなくなるからであ
る。第２の方法は、ターミナルデオキシヌクレチオチジ
ルトランスフェラーゼ（以下、ターミナルトランスフェ
ラーゼと呼ぶ）を用いて、ＤＮＡ断片の３’末端にｄＡ
ＴＰ（２’−デオキシアデノシン ５’−トリフォスフ
ェート）、又はｄＴＴＰ（２’−デオキシチミジントリ
フォスフェート）を順次付加していく方法である。第２
の方法が第１の方法に比べて簡単で効率も高いので、本
実施例では第２の方法を用いた。
【００３２】蛍光標識プライマーがハイブリダイズでき
る部位を確保するために、各ＤＮＡ断片の３’末端にポ
リＡを導入する。ポリＡ導入には、ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いた。反応条件
を次ぎに示す。約４ｐｍｏｌの各フラクションに、ｄＡ
ＴＰ（１ｍＭ）、ＣｏＣｌ2（５ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（５
ｍＭ）、メルカプエオエタノール（０．５ｍＭ）、カコ
ジル酸（５０ｍＭ、ｐＨ７．２））を加えて、１２．５
ユニットのターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フェラーゼを３７℃で１時間反応させた。
る部位を確保するために、各ＤＮＡ断片の３’末端にポ
リＡを導入する。ポリＡ導入には、ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いた。反応条件
を次ぎに示す。約４ｐｍｏｌの各フラクションに、ｄＡ
ＴＰ（１ｍＭ）、ＣｏＣｌ2（５ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（５
ｍＭ）、メルカプエオエタノール（０．５ｍＭ）、カコ
ジル酸（５０ｍＭ、ｐＨ７．２））を加えて、１２．５
ユニットのターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フェラーゼを３７℃で１時間反応させた。
【００３３】＜選別相補鎖合成＞図１に示すように、得
られたＤＮＡ断片２、３は、３’末端側に導入したポリ
Ａ部分２１、制限酵素認識部分２３、及び選択される塩
基配列部分２２をもつ。選択される塩基配列部分２２は
蛍光標識プライマー３１により選択される２塩基の部分
である。
られたＤＮＡ断片２、３は、３’末端側に導入したポリ
Ａ部分２１、制限酵素認識部分２３、及び選択される塩
基配列部分２２をもつ。選択される塩基配列部分２２は
蛍光標識プライマー３１により選択される２塩基の部分
である。
【００３４】試料から制限酵素により得るＤＮＡ断片
は、複数種類のＤＮＡ断片の混合物である。目的とする
ＤＮＡ断片３のみを選択的に塩基配列決定するために、
蛍光標識プライマー３１を用いる。蛍光標識プライマー
３１の任意の塩基配列部分２０１は、任意の２塩基種の
組み合わせからなり、全部で１６通りある。蛍光標識プ
ライマー３１のポリＴ部分２０３とＤＮＡ断片３のポリ
Ａ部分２１、及び蛍光標識プライマー３１の制限酵素認
識部分２０２とＤＮＡ断片３の制限酵素認識部分２３
は、それぞれ完全にハイブリダイズできる。
は、複数種類のＤＮＡ断片の混合物である。目的とする
ＤＮＡ断片３のみを選択的に塩基配列決定するために、
蛍光標識プライマー３１を用いる。蛍光標識プライマー
３１の任意の塩基配列部分２０１は、任意の２塩基種の
組み合わせからなり、全部で１６通りある。蛍光標識プ
ライマー３１のポリＴ部分２０３とＤＮＡ断片３のポリ
Ａ部分２１、及び蛍光標識プライマー３１の制限酵素認
識部分２０２とＤＮＡ断片３の制限酵素認識部分２３
は、それぞれ完全にハイブリダイズできる。
【００３５】完全ハイブリッド体５１のように、蛍光標
識プライマー３１の任意の塩基配列部分２０１は、任意
の塩基配列部分２０１と相補的な塩基配列２２を持つＤ
ＮＡ断片３のみとハイブリダイズできる。しかし、不完
全ハイブリッド体５２では、任意の塩基配列部分２０１
はＤＮＡ断片２とは末端部がハイブリダイズしないの
で、１６種類の蛍光標識プライマーをＤＮＡ断片に反応
させて、目的とするＤＮＡ断片３を選別できる。
識プライマー３１の任意の塩基配列部分２０１は、任意
の塩基配列部分２０１と相補的な塩基配列２２を持つＤ
ＮＡ断片３のみとハイブリダイズできる。しかし、不完
全ハイブリッド体５２では、任意の塩基配列部分２０１
はＤＮＡ断片２とは末端部がハイブリダイズしないの
で、１６種類の蛍光標識プライマーをＤＮＡ断片に反応
させて、目的とするＤＮＡ断片３を選別できる。
【００３６】実際には以下の方法で、予め塩基配列決定
に利用できる蛍光標識プライマーのみを選別して、塩基
配列決定反応を行なう。まず、約２００ｆｍｏｌのＤＮ
Ａ断片を含むＤＮＡ混合物の各フラクションに、ｄＡＴ
Ｐ（０．１ｍＭ）、ｄＣＴＰ（０．１ｍＭ）、ｄＧＴＰ
（０．１ｍＭ）、ｄＴＴＰ（０．１ｍＭ）の混合溶液
（１６マイクロリットル）、ＭｇＣｌ2（７５ｍＭ）を
含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５０ｍＭ、ｐＨ９．５）緩衝
液（８マイクロリットル）を添加し、全体を４８マイク
ロリットルとする。３マイクロリットルずつ１６本の容
器に分注し、各容器に各蛍光標識プライマー（０．００
１ｍＭ、０．５マイクロリットル）と２ユニット／マイ
クロリットルの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（０．５マイ
クロリットル）を添加する。使用する耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼは、通常広く使用されているＴａｑポリメラー
ゼよりは、伸長特性や基質特異性がより改善されたΔＴ
ａｑ、又はサーモシーケネース（いずれもアマシャムイ
ンタナショナル社製品）がより有効である。この理由
は、通常のＴａｑポリメラーゼでは、特定の塩基配列部
分で伸長反応が停止してしまう場合が多いためである。
９４℃で３０秒間→６６℃で３０秒間→７２℃で６０秒
間保持するサーマルサイクルを、５回繰り返し、反応物
を電気泳動で分析した。
に利用できる蛍光標識プライマーのみを選別して、塩基
配列決定反応を行なう。まず、約２００ｆｍｏｌのＤＮ
Ａ断片を含むＤＮＡ混合物の各フラクションに、ｄＡＴ
Ｐ（０．１ｍＭ）、ｄＣＴＰ（０．１ｍＭ）、ｄＧＴＰ
（０．１ｍＭ）、ｄＴＴＰ（０．１ｍＭ）の混合溶液
（１６マイクロリットル）、ＭｇＣｌ2（７５ｍＭ）を
含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５０ｍＭ、ｐＨ９．５）緩衝
液（８マイクロリットル）を添加し、全体を４８マイク
ロリットルとする。３マイクロリットルずつ１６本の容
器に分注し、各容器に各蛍光標識プライマー（０．００
１ｍＭ、０．５マイクロリットル）と２ユニット／マイ
クロリットルの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（０．５マイ
クロリットル）を添加する。使用する耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼは、通常広く使用されているＴａｑポリメラー
ゼよりは、伸長特性や基質特異性がより改善されたΔＴ
ａｑ、又はサーモシーケネース（いずれもアマシャムイ
ンタナショナル社製品）がより有効である。この理由
は、通常のＴａｑポリメラーゼでは、特定の塩基配列部
分で伸長反応が停止してしまう場合が多いためである。
９４℃で３０秒間→６６℃で３０秒間→７２℃で６０秒
間保持するサーマルサイクルを、５回繰り返し、反応物
を電気泳動で分析した。
【００３７】図２に分取前の分析結果を、図４に分取後
のフラクション４（図３の泳動パターン９４を与えたフ
ラクション）の分析（電気泳動）結果を示す。使用した
プライマーの任意の塩基配列部分２０１の２塩基配列４
０をもつ各泳動パターンを示す。
のフラクション４（図３の泳動パターン９４を与えたフ
ラクション）の分析（電気泳動）結果を示す。使用した
プライマーの任意の塩基配列部分２０１の２塩基配列４
０をもつ各泳動パターンを示す。
【００３８】図４に示す、２塩基配列ＸＹ（ＸＹは任意
の２塩基の組み合わせを示す）をもつプライマーにより
選択されたＤＮＡ断片の泳動パターンにおいて、プライ
マーの泳動ピーク３８以外に、全く泳動ピークが出現し
ていない場合は、プライマーと反応するＤＮＡ断片が存
在しないことを示している。図４において、２塩基配列
ＡＡをもつプライマーにより選択されたＤＮＡ断片の泳
動パターンでは泳動ピークが１本のみ検出されており、
プライマーは１種類のみのＤＮＡ断片にハイブリッドし
たことを示し、以下で説明する塩基配列決定が可能とな
る。
の２塩基の組み合わせを示す）をもつプライマーにより
選択されたＤＮＡ断片の泳動パターンにおいて、プライ
マーの泳動ピーク３８以外に、全く泳動ピークが出現し
ていない場合は、プライマーと反応するＤＮＡ断片が存
在しないことを示している。図４において、２塩基配列
ＡＡをもつプライマーにより選択されたＤＮＡ断片の泳
動パターンでは泳動ピークが１本のみ検出されており、
プライマーは１種類のみのＤＮＡ断片にハイブリッドし
たことを示し、以下で説明する塩基配列決定が可能とな
る。
【００３９】図２、及び図４において、泳動ピークが２
本以上出現している泳動パターン（例えば、図４に示す
２塩基配列ＧＧをもつプライマーにより選択されたＤＮ
Ａ断片の泳動パターン）は、使用した蛍光標識プライマ
ーが複数のＤＮＡ断片にハイブリダイズしたことを示
す。図４に示す２塩基配列ＧＧをもつプライマーにより
選択されたＤＮＡ断片の泳動パターンは、任意の塩基配
列部分２０１としてＧＧをもつ蛍光標識プライマーが、
２種類のＤＮＡ断片に対し蛍光標識プライマーとして働
いたことを示しており、特定の塩基配列をもつ１種類の
ＤＮＡ断片のみを塩基配列決定する場合には、任意の塩
基配列部分２０１としてＧＧをもつ蛍光標識プライマー
は、使用できない。
本以上出現している泳動パターン（例えば、図４に示す
２塩基配列ＧＧをもつプライマーにより選択されたＤＮ
Ａ断片の泳動パターン）は、使用した蛍光標識プライマ
ーが複数のＤＮＡ断片にハイブリダイズしたことを示
す。図４に示す２塩基配列ＧＧをもつプライマーにより
選択されたＤＮＡ断片の泳動パターンは、任意の塩基配
列部分２０１としてＧＧをもつ蛍光標識プライマーが、
２種類のＤＮＡ断片に対し蛍光標識プライマーとして働
いたことを示しており、特定の塩基配列をもつ１種類の
ＤＮＡ断片のみを塩基配列決定する場合には、任意の塩
基配列部分２０１としてＧＧをもつ蛍光標識プライマー
は、使用できない。
【００４０】しかし、図４において、２塩基配列ＧＧを
もつプライマーにより選択されたＤＮＡ断片の泳動パタ
ーンの２つ接近した泳動ピークの内の左側の泳動ピーク
と、２塩基配列ＣＡをもつプライマーにより選択された
ＤＮＡ断片の泳動パターンの泳動ピークとは等しい塩基
長にピークをもち、２塩基配列ＧＧをもつプライマーに
より選択されたＤＮＡ断片の泳動パターンの２つ接近し
た泳動ピークの内の右側の泳動ピークと、２塩基配列Ａ
Ａをもつプライマーにより選択されたＤＮＡ断片の泳動
パターンの泳動ピークとは等しい塩基長にピークをも
ち、同じ塩基長（泳動時間）を与えるＤＮＡ断片は２本
鎖の裏表（＋鎖、−鎖）の関係にある。従って、ＤＮＡ
断片の制限酵素認識部分に隣接する、２塩基配列ＣＡと
ＧＧ、又は２塩基配列ＡＡとＧＧをもつプライマーを用
いてＰＣＲにより、２塩基配列ＧＧをもつプライマーに
より選択された２種類のＤＮＡ断片を分離できる。
もつプライマーにより選択されたＤＮＡ断片の泳動パタ
ーンの２つ接近した泳動ピークの内の左側の泳動ピーク
と、２塩基配列ＣＡをもつプライマーにより選択された
ＤＮＡ断片の泳動パターンの泳動ピークとは等しい塩基
長にピークをもち、２塩基配列ＧＧをもつプライマーに
より選択されたＤＮＡ断片の泳動パターンの２つ接近し
た泳動ピークの内の右側の泳動ピークと、２塩基配列Ａ
Ａをもつプライマーにより選択されたＤＮＡ断片の泳動
パターンの泳動ピークとは等しい塩基長にピークをも
ち、同じ塩基長（泳動時間）を与えるＤＮＡ断片は２本
鎖の裏表（＋鎖、−鎖）の関係にある。従って、ＤＮＡ
断片の制限酵素認識部分に隣接する、２塩基配列ＣＡと
ＧＧ、又は２塩基配列ＡＡとＧＧをもつプライマーを用
いてＰＣＲにより、２塩基配列ＧＧをもつプライマーに
より選択された２種類のＤＮＡ断片を分離できる。
【００４１】以上の説明では、２塩基ＸＹ（ＸＹは任意
の２塩基の組み合わせを示す）からなる任意の塩基配列
をもつプライマーを用いてＤＮＡ断片を分離する場合を
例にとり説明したが、３塩基ＸＹＺ（ＸＹＺは任意の３
塩基の組み合わせを示す）、又は４塩基ＷＸＹＺ（ＷＸ
ＹＺは任意の４塩基の組み合わせを示す）からなる任意
の塩基配列をもつプライマーを用いてＤＮＡ断片を分離
してもよい。以上のように塩基配列決定に用いる蛍光標
識プライマーを予め容易に選別できる。
の２塩基の組み合わせを示す）からなる任意の塩基配列
をもつプライマーを用いてＤＮＡ断片を分離する場合を
例にとり説明したが、３塩基ＸＹＺ（ＸＹＺは任意の３
塩基の組み合わせを示す）、又は４塩基ＷＸＹＺ（ＷＸ
ＹＺは任意の４塩基の組み合わせを示す）からなる任意
の塩基配列をもつプライマーを用いてＤＮＡ断片を分離
してもよい。以上のように塩基配列決定に用いる蛍光標
識プライマーを予め容易に選別できる。
【００４２】＜相補鎖合成、及び塩基配列決定＞次に、
選択した蛍光標識プライマーを用いて塩基配列決定を行
なう。ここでは図３に示す泳動パターン９１（フラクシ
ョン１）と９４（フラクション４）を示したフラクショ
ンを、ＤＮＡ断片として用いた例を示す。分取後のフラ
クションの分析（電気泳動）結果から、フラクション
１、及びフラクション４では、任意の塩基配列部分２０
１がＡＡである蛍光標識プライマーは１種類のＤＮＡ断
片とハイブリダイズすることが判明したので、以下、任
意の塩基配列部分２０１がＡＡの蛍光標識プライマー３
１を用いて、蛍光プライマー３１がハイブリダイズする
ＤＮＡ断片の塩基配列決定を行なう。
選択した蛍光標識プライマーを用いて塩基配列決定を行
なう。ここでは図３に示す泳動パターン９１（フラクシ
ョン１）と９４（フラクション４）を示したフラクショ
ンを、ＤＮＡ断片として用いた例を示す。分取後のフラ
クションの分析（電気泳動）結果から、フラクション
１、及びフラクション４では、任意の塩基配列部分２０
１がＡＡである蛍光標識プライマーは１種類のＤＮＡ断
片とハイブリダイズすることが判明したので、以下、任
意の塩基配列部分２０１がＡＡの蛍光標識プライマー３
１を用いて、蛍光プライマー３１がハイブリダイズする
ＤＮＡ断片の塩基配列決定を行なう。
【００４３】ＤＮＡ断片３に隣接する部分１４の塩基配
列も同時に読むため、Ｈｈａ１で切断していないＰＣＲ
産物（試料ＤＮＡ１）を添加して、塩基配列決定反応
（シーケンス反応）を実行した。蛍光標識プライマー３
１は、ポリＡが付加したＤＮＡ断片３には完全にハイブ
リダイズするが、試料ＤＮＡ１にはハイブリダイズしな
い。ＤＮＡ断片３を鋳型として相補鎖合成した伸長ＤＮ
Ａ鎖３２は試料ＤＮＡ１にハイブリダイズし、シーケン
ス反応によりＤＮＡ伸長鎖３３が形成される。ＤＮＡ塩
基配列決定では、塩基長が長くなるとＤＮＡ断片数が減
少するので信号強度が減少する。
列も同時に読むため、Ｈｈａ１で切断していないＰＣＲ
産物（試料ＤＮＡ１）を添加して、塩基配列決定反応
（シーケンス反応）を実行した。蛍光標識プライマー３
１は、ポリＡが付加したＤＮＡ断片３には完全にハイブ
リダイズするが、試料ＤＮＡ１にはハイブリダイズしな
い。ＤＮＡ断片３を鋳型として相補鎖合成した伸長ＤＮ
Ａ鎖３２は試料ＤＮＡ１にハイブリダイズし、シーケン
ス反応によりＤＮＡ伸長鎖３３が形成される。ＤＮＡ塩
基配列決定では、塩基長が長くなるとＤＮＡ断片数が減
少するので信号強度が減少する。
【００４４】伸長ＤＮＡ鎖３２が伸長して得られるＤＮ
Ａ伸長鎖３３からの信号強度を十分とるために、予め、
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、とｄＴＴＰ
の混合物）のみで、ＤＮＡ断片３の５’末端まで蛍光プ
ライマー３１を伸長し、伸長ＤＮＡ鎖３２を多量に作成
した後に、伸長ＤＮＡ鎖３２を用い試料ＤＮＡ１を鋳型
としてシーケンス反応を行ない、ＤＮＡ伸長鎖３３を得
るのが有効である。即ち、未切断の試料ＤＮＡ１に対し
プライマーとして働く伸長ＤＮＡ鎖３２を多量に作った
後に、ダイデオキシヌクレオチドを添加して塩基配列決
定反応を実行した。
Ａ伸長鎖３３からの信号強度を十分とるために、予め、
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、とｄＴＴＰ
の混合物）のみで、ＤＮＡ断片３の５’末端まで蛍光プ
ライマー３１を伸長し、伸長ＤＮＡ鎖３２を多量に作成
した後に、伸長ＤＮＡ鎖３２を用い試料ＤＮＡ１を鋳型
としてシーケンス反応を行ない、ＤＮＡ伸長鎖３３を得
るのが有効である。即ち、未切断の試料ＤＮＡ１に対し
プライマーとして働く伸長ＤＮＡ鎖３２を多量に作った
後に、ダイデオキシヌクレオチドを添加して塩基配列決
定反応を実行した。
【００４５】反応の詳細を以下に示す。約１００ｆｍｏ
ｌの各ＤＮＡ断片を含むフラクション１、又はフラクシ
ョン４に、蛍光標識プライマー３１（１ｐｍｏｌ／マイ
クロリットル）を２マイクロリットル、ｄＮＴＰを４マ
イクロリットル、７５ｍＭのＭｇＣｌ2を含むＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（２５０ｍＭ、ｐＨ９．５）緩衝液を２マイク
ロリットル、それぞれ添加し全体を１４マイクロリット
ルとし、次ぎに３．５マイクロリットルずつ４本の容器
に分注し、分注した４本の容器の各々に２ユニット／マ
イクロリットルのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ΔＴａｑ
ポリメラーゼ（アマシャム社）０．５マイクロリット
ル）を添加する。９４℃で３０秒間→６４℃で３０秒間
→７２℃で６０秒間保持するサーマルサイクルを５回繰
り返し、蛍光プライマー３１がＤＮＡＤＮＡ断片３の
５’末端まで伸長した伸長ＤＮＡ鎖３２を多量に作成し
た。
ｌの各ＤＮＡ断片を含むフラクション１、又はフラクシ
ョン４に、蛍光標識プライマー３１（１ｐｍｏｌ／マイ
クロリットル）を２マイクロリットル、ｄＮＴＰを４マ
イクロリットル、７５ｍＭのＭｇＣｌ2を含むＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（２５０ｍＭ、ｐＨ９．５）緩衝液を２マイク
ロリットル、それぞれ添加し全体を１４マイクロリット
ルとし、次ぎに３．５マイクロリットルずつ４本の容器
に分注し、分注した４本の容器の各々に２ユニット／マ
イクロリットルのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ΔＴａｑ
ポリメラーゼ（アマシャム社）０．５マイクロリット
ル）を添加する。９４℃で３０秒間→６４℃で３０秒間
→７２℃で６０秒間保持するサーマルサイクルを５回繰
り返し、蛍光プライマー３１がＤＮＡＤＮＡ断片３の
５’末端まで伸長した伸長ＤＮＡ鎖３２を多量に作成し
た。
【００４６】次に、この伸長ＤＮＡＤＮＡ断片３２を多
量に含む反応液に、１２．５ｆｍｏｌのＰＣＲ産物（試
料ＤＮＡ１）、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴ
Ｐ）、及びデオキシヌクレオチドの混合液（４．５マイ
クロリットル）をそれぞれ添加した。ジデオキシヌクレ
オチドとデオキシヌクレオチドの組成は、Ａ反応用とし
てｄＮＴＰを０．０２０ｍＭ、ｄｄＡＴＰを１．０ｍ
Ｍ、Ｃ反応用としてｄＮＴＰを０．０２０ｍＭ、ｄｄＣ
ＴＰを０．５０ｍＭ、Ｇ反応用としてｄＮＴＰを０．０
２０ｍＭ、ｄｄＧＴＰを０．１０ｍＭ、Ｔ反応用として
ｄＮＴＰを０．０２０ｍＭ、ｄｄＴＴＰを１．０ｍＭと
した。混合液に対して、９４℃で３０秒間→６４℃で３
０秒間→７２℃で６０秒間保持するサーマルサイクルを
３０回繰り返した。エタノール沈殿を行ない反応生成物
を回収し、蛍光式ＤＮＡシーケンサで反応生成物を電気
泳動分離して塩基配列決定を実行した。
量に含む反応液に、１２．５ｆｍｏｌのＰＣＲ産物（試
料ＤＮＡ１）、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴ
Ｐ）、及びデオキシヌクレオチドの混合液（４．５マイ
クロリットル）をそれぞれ添加した。ジデオキシヌクレ
オチドとデオキシヌクレオチドの組成は、Ａ反応用とし
てｄＮＴＰを０．０２０ｍＭ、ｄｄＡＴＰを１．０ｍ
Ｍ、Ｃ反応用としてｄＮＴＰを０．０２０ｍＭ、ｄｄＣ
ＴＰを０．５０ｍＭ、Ｇ反応用としてｄＮＴＰを０．０
２０ｍＭ、ｄｄＧＴＰを０．１０ｍＭ、Ｔ反応用として
ｄＮＴＰを０．０２０ｍＭ、ｄｄＴＴＰを１．０ｍＭと
した。混合液に対して、９４℃で３０秒間→６４℃で３
０秒間→７２℃で６０秒間保持するサーマルサイクルを
３０回繰り返した。エタノール沈殿を行ない反応生成物
を回収し、蛍光式ＤＮＡシーケンサで反応生成物を電気
泳動分離して塩基配列決定を実行した。
【００４７】電気泳動の結果、フラクション１、フラク
ション４の混合ＤＮＡ試料からそれぞれ、図５（ａ）〜
図５（ｅ）、図６（ａ）〜図６（ｅ）に示すように明瞭
な電気泳動パターンを得た。図５（ａ）、図６（ａ）は
それぞれ、蛍光プライマー３１が伸長して３’末端塩基
が、Ａで終端するＡ断片群、図５（ｂ）、図６（ｂ）は
それぞれ、Ｃで終端するＣ断片群、図５（ｃ）、図６
（ｃ）はそれぞれ、Ｇで終端するＧ断片群、図５
（ｄ）、図６（ｄ）はそれぞれ、Ｔで終端するＴ断片
群、の各泳動パターンを示す。図５（ｅ）、図６（ｅ）
はそれぞれ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの各ＤＮＡ断片群の泳動パ
ターンを重ねた図である。泳動パターン４１、４２、４
３はそれぞれ、ＤＮＡ断片３を鋳型とするシーケンス反
応により生じたＤＮＡ断片（図１に示すＤＮＡ伸長鎖３
４）、蛍光プライマー３１がＤＮＡ断片３の５’末端ま
で伸長して反応が停止して生じたＤＮＡ断片（図１に示
す伸長ＤＮＡ鎖３２）、伸長ＤＮＡ鎖３２（図１）がＤ
ＮＡに結合してさらに伸長したＤＮＡ伸長鎖３３によ
る。
ション４の混合ＤＮＡ試料からそれぞれ、図５（ａ）〜
図５（ｅ）、図６（ａ）〜図６（ｅ）に示すように明瞭
な電気泳動パターンを得た。図５（ａ）、図６（ａ）は
それぞれ、蛍光プライマー３１が伸長して３’末端塩基
が、Ａで終端するＡ断片群、図５（ｂ）、図６（ｂ）は
それぞれ、Ｃで終端するＣ断片群、図５（ｃ）、図６
（ｃ）はそれぞれ、Ｇで終端するＧ断片群、図５
（ｄ）、図６（ｄ）はそれぞれ、Ｔで終端するＴ断片
群、の各泳動パターンを示す。図５（ｅ）、図６（ｅ）
はそれぞれ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの各ＤＮＡ断片群の泳動パ
ターンを重ねた図である。泳動パターン４１、４２、４
３はそれぞれ、ＤＮＡ断片３を鋳型とするシーケンス反
応により生じたＤＮＡ断片（図１に示すＤＮＡ伸長鎖３
４）、蛍光プライマー３１がＤＮＡ断片３の５’末端ま
で伸長して反応が停止して生じたＤＮＡ断片（図１に示
す伸長ＤＮＡ鎖３２）、伸長ＤＮＡ鎖３２（図１）がＤ
ＮＡに結合してさらに伸長したＤＮＡ伸長鎖３３によ
る。
【００４８】従来の塩基配列決定方法では、泳動パター
ン４１、４２しか得られなかったが、本実施例では、Ｄ
ＮＡ断片３の塩基配列を決定すると同時に、ＤＮＡ断片
３に続く試料ＤＮＡの塩基配列を決定できた。本実施例
では長い試料ＤＮＡが４塩基認識酵素により完全に切断
されると仮定したが、４塩基認識酵素により完全に切断
されない場合でも、長い試料ＤＮＡ分子の総数のうち、
例えば２０％〜３０％が、４塩基認識酵素により完全に
切断されていれば、何ら問題なく塩基配列決定ができ、
さらに、制限酵素により理想的に切断された部分を越え
て、制限酵素による隣の切断されたＤＮＡ断片の少なく
とも一部の塩基配列をも決定できる。
ン４１、４２しか得られなかったが、本実施例では、Ｄ
ＮＡ断片３の塩基配列を決定すると同時に、ＤＮＡ断片
３に続く試料ＤＮＡの塩基配列を決定できた。本実施例
では長い試料ＤＮＡが４塩基認識酵素により完全に切断
されると仮定したが、４塩基認識酵素により完全に切断
されない場合でも、長い試料ＤＮＡ分子の総数のうち、
例えば２０％〜３０％が、４塩基認識酵素により完全に
切断されていれば、何ら問題なく塩基配列決定ができ、
さらに、制限酵素により理想的に切断された部分を越え
て、制限酵素による隣の切断されたＤＮＡ断片の少なく
とも一部の塩基配列をも決定できる。
【００４９】本実施例では、試料ＤＮＡ１を制限酵素に
より切断したＤＮＡ断片中から、蛍光標識プライマー３
１の３’末端側の任意の塩基配列部分２０１と、制限酵
素認識部分２３に隣接し選択される塩基配列部分２２と
が相補な関係にあるＤＮＡ断片が、蛍光標識プライマー
３１により選択でき、選択的にシーケンス反応ができ
る。相補鎖形成時のプライマーのアニール温度を、６０
℃以上、好ましくは６２℃から６８℃の範囲に設定し
て、より選択性を向上できる。
より切断したＤＮＡ断片中から、蛍光標識プライマー３
１の３’末端側の任意の塩基配列部分２０１と、制限酵
素認識部分２３に隣接し選択される塩基配列部分２２と
が相補な関係にあるＤＮＡ断片が、蛍光標識プライマー
３１により選択でき、選択的にシーケンス反応ができ
る。相補鎖形成時のプライマーのアニール温度を、６０
℃以上、好ましくは６２℃から６８℃の範囲に設定し
て、より選択性を向上できる。
【００５０】相補鎖合成は、蛍光標識プライマー３１が
ハイブリダイズしたＤＮＡ断片３の３’末端側から５’
末端方向に進行する。通常のＤＮＡ塩基配列決定反応で
は、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴのいずれかの特定の１塩基種と
してダイデオキシヌクレオチドを添加するために、ダイ
デオキシヌクレオチドが導入された部位で伸長反応が停
止する。伸長ＤＮＡ鎖３２はＤＮＡ断片３の５’末端ま
で到達したＤＮＡ鎖である。ダイデオキシヌクレオチド
を添加しない場合には、伸長ＤＮＡ鎖３２はＤＮＡ断片
３の５’末端まで到達する。試料ＤＮＡ１を鋳型とし、
ＤＮＡ断片伸長ＤＮＡ鎖３２をプライマーとするシーケ
ンス反応は、制限酵素による切断部を超えたＤＮＡ鎖部
分１４にも達するので、ＤＮＡ鎖部分１４の塩基配列を
も決定できる。一旦、相補鎖合成により生成した伸長Ｄ
ＮＡ鎖３２を、試料ＤＮＡ１のプライマーとして働かせ
るには、熱変性により鋳型のＤＮＡ断片３から有離させ
１本鎖にする必要があるが、遊離は熱サイクルシーケン
シングにより行なう。
ハイブリダイズしたＤＮＡ断片３の３’末端側から５’
末端方向に進行する。通常のＤＮＡ塩基配列決定反応で
は、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴのいずれかの特定の１塩基種と
してダイデオキシヌクレオチドを添加するために、ダイ
デオキシヌクレオチドが導入された部位で伸長反応が停
止する。伸長ＤＮＡ鎖３２はＤＮＡ断片３の５’末端ま
で到達したＤＮＡ鎖である。ダイデオキシヌクレオチド
を添加しない場合には、伸長ＤＮＡ鎖３２はＤＮＡ断片
３の５’末端まで到達する。試料ＤＮＡ１を鋳型とし、
ＤＮＡ断片伸長ＤＮＡ鎖３２をプライマーとするシーケ
ンス反応は、制限酵素による切断部を超えたＤＮＡ鎖部
分１４にも達するので、ＤＮＡ鎖部分１４の塩基配列を
も決定できる。一旦、相補鎖合成により生成した伸長Ｄ
ＮＡ鎖３２を、試料ＤＮＡ１のプライマーとして働かせ
るには、熱変性により鋳型のＤＮＡ断片３から有離させ
１本鎖にする必要があるが、遊離は熱サイクルシーケン
シングにより行なう。
【００５１】鋳型ＤＮＡ（ＤＮＡ断片３、及び試料ＤＮ
Ａ１）に対するプライマー（蛍光プライマー３１、及び
伸長ＤＮＡ鎖３２）のハイブリダイゼーション（例え
ば、６４℃で３０秒間）、相補鎖伸長反応（例えば、７
２℃で６０秒間）、伸長したプライマーを鋳型ＤＮＡか
ら熱変性によ遊離させる各工程からなるサイクルシーケ
ンシングを、例えば、３０回繰り返す。このサイクルシ
ーケンシングにより、ＤＡＮ断片３を鋳型としてＤＮＡ
断片３の途中まで伸長したＤＮＡ断片３４と、試料ＤＮ
Ａ１を鋳型として伸長ＤＮＡ鎖３２が伸長したＤＮＡ伸
長鎖３３とを同時に得る。この結果、ＤＮＡ断片３の塩
基配列とＤＮＡ断片３の３’末端に隣接する部位の試料
ＤＮＡの塩基配列の少なくとも一部を決定できる。他の
ＤＮＡ断片についても、同様にして、各ＤＮＡ断片の塩
基配列と各ＤＮＡ断片の３’末端に隣接する部位の試料
ＤＮＡの塩基配列の少なくとも一部を決定できる。
Ａ１）に対するプライマー（蛍光プライマー３１、及び
伸長ＤＮＡ鎖３２）のハイブリダイゼーション（例え
ば、６４℃で３０秒間）、相補鎖伸長反応（例えば、７
２℃で６０秒間）、伸長したプライマーを鋳型ＤＮＡか
ら熱変性によ遊離させる各工程からなるサイクルシーケ
ンシングを、例えば、３０回繰り返す。このサイクルシ
ーケンシングにより、ＤＡＮ断片３を鋳型としてＤＮＡ
断片３の途中まで伸長したＤＮＡ断片３４と、試料ＤＮ
Ａ１を鋳型として伸長ＤＮＡ鎖３２が伸長したＤＮＡ伸
長鎖３３とを同時に得る。この結果、ＤＮＡ断片３の塩
基配列とＤＮＡ断片３の３’末端に隣接する部位の試料
ＤＮＡの塩基配列の少なくとも一部を決定できる。他の
ＤＮＡ断片についても、同様にして、各ＤＮＡ断片の塩
基配列と各ＤＮＡ断片の３’末端に隣接する部位の試料
ＤＮＡの塩基配列の少なくとも一部を決定できる。
【００５２】制限酵素による各ＤＮＡ断片の塩基配列
と、各ＤＮＡ断片の３’末端に隣接する試料ＤＮＡの塩
基配列部位は、他のＤＮＡ断片の５’末端近傍の塩基配
列に重なるので、容易に各ＤＮＡ断片の塩基配列の繋ぎ
あわせができる。また、ＤＮＡ断片３の末端までの相補
鎖合成反応により生じたプライマー伸長体３２の電気泳
動ピークが強く観測されるので、試料ＤＮＡにおける制
限酵素切断部位を、容易に判別できる。実際に、ｐＵＣ
１９のＨｈａＩによるＤＮＡ断片のいくつかを、本実施
例の方法により塩基配列決定して、各ＤＮＡ断片の塩基
配列の繋がりを調べ、ｐＵＣ１９の全長の塩基配列がク
ローニングなしで決定できる。
と、各ＤＮＡ断片の３’末端に隣接する試料ＤＮＡの塩
基配列部位は、他のＤＮＡ断片の５’末端近傍の塩基配
列に重なるので、容易に各ＤＮＡ断片の塩基配列の繋ぎ
あわせができる。また、ＤＮＡ断片３の末端までの相補
鎖合成反応により生じたプライマー伸長体３２の電気泳
動ピークが強く観測されるので、試料ＤＮＡにおける制
限酵素切断部位を、容易に判別できる。実際に、ｐＵＣ
１９のＨｈａＩによるＤＮＡ断片のいくつかを、本実施
例の方法により塩基配列決定して、各ＤＮＡ断片の塩基
配列の繋がりを調べ、ｐＵＣ１９の全長の塩基配列がク
ローニングなしで決定できる。
【００５３】図７は、第１の実施例における、ｐＵＣ１
９（全塩基長２．７Ｋｂｐ）の塩基配列決定を説明する
図である。図７において、↓は制限酵素酵素Ｈｈａ１に
よる切断部位を、←─→の近傍に示す数値（例えば、２
７０、３９３等）は制限酵素酵素のよる切断部位間の長
さ（塩基数）を、横軸は塩基長さを、─→及び←─はそ
れぞれ本実施例での塩基配列決定部位を、─→及び←─
と平行に示される──は、塩基配列決定の対象としたＨ
ｈａ１により切断されたＤＮＡ断片に隣接する塩基配列
部位（各ＤＮＡ断片の塩基配列の繋がり情報を与える塩
基配列部分）を、それぞれ表わす。さらに、図７におい
て、塩基配列決定部位７７０は、図６に示す電気泳動パ
ターンから決定された部位であり、ＤＮＡ断片７７０−
１の塩基配列部分と、ＤＮＡ断片７７０−１に隣接する
ＤＮＡ断片の一部の塩基配列部分７７０−２とからなっ
ている。図７に示すように、各ＤＮＡ断片の塩基配列の
繋がり情報を与える塩基配列部分──の情報を有効に利
用することにより、全塩基長２．７ＫｂｐをもつｐＵＣ
１９の前塩基配列が決定できた。
９（全塩基長２．７Ｋｂｐ）の塩基配列決定を説明する
図である。図７において、↓は制限酵素酵素Ｈｈａ１に
よる切断部位を、←─→の近傍に示す数値（例えば、２
７０、３９３等）は制限酵素酵素のよる切断部位間の長
さ（塩基数）を、横軸は塩基長さを、─→及び←─はそ
れぞれ本実施例での塩基配列決定部位を、─→及び←─
と平行に示される──は、塩基配列決定の対象としたＨ
ｈａ１により切断されたＤＮＡ断片に隣接する塩基配列
部位（各ＤＮＡ断片の塩基配列の繋がり情報を与える塩
基配列部分）を、それぞれ表わす。さらに、図７におい
て、塩基配列決定部位７７０は、図６に示す電気泳動パ
ターンから決定された部位であり、ＤＮＡ断片７７０−
１の塩基配列部分と、ＤＮＡ断片７７０−１に隣接する
ＤＮＡ断片の一部の塩基配列部分７７０−２とからなっ
ている。図７に示すように、各ＤＮＡ断片の塩基配列の
繋がり情報を与える塩基配列部分──の情報を有効に利
用することにより、全塩基長２．７ＫｂｐをもつｐＵＣ
１９の前塩基配列が決定できた。
【００５４】（第２の実施例）本実施例では、クローニ
ングして長い試料ＤＮＡが得られる場合に、クローニン
グする時に用いた制限酵素により、試料ＤＮＡを切断し
て得られる長いＤＮＡ断片を試料ＤＮＡ１として用い
る。本発明の方法を、ラムダＤＮＡに応用した例につい
て説明する。塩基配列を決定するには、予め１６種類
（ＤＮＡ断片を選択するための任意の塩基配列部位が２
塩基の場合）のプライマーを使用し、相補鎖合成を行な
い、どのような長さのＤＮＡ断片が何種類存在し、どの
ようなＤＮＡ断片の分取を行なえばよいかを的確に判断
するのが成功する鍵となる。
ングして長い試料ＤＮＡが得られる場合に、クローニン
グする時に用いた制限酵素により、試料ＤＮＡを切断し
て得られる長いＤＮＡ断片を試料ＤＮＡ１として用い
る。本発明の方法を、ラムダＤＮＡに応用した例につい
て説明する。塩基配列を決定するには、予め１６種類
（ＤＮＡ断片を選択するための任意の塩基配列部位が２
塩基の場合）のプライマーを使用し、相補鎖合成を行な
い、どのような長さのＤＮＡ断片が何種類存在し、どの
ようなＤＮＡ断片の分取を行なえばよいかを的確に判断
するのが成功する鍵となる。
【００５５】図８に、ラムダＤＮＡ（４７．７Ｋ塩基
長）を、ＨｈａＩにより切断したＤＮＡ断片を鋳型と
し、蛍光標識プライマーを用いて伸長反応を行ない得た
反応物の電気泳動パターンを示す。図に示すような、反
応物のままではＤＮＡ断片の数が多すぎて、ＤＮＡ断片
の分取が困難となる。ラムダＤＮＡのように巨大な試料
ＤＮＡでは、予め、例えば、６塩基認識酵素により切断
した後、電気泳動により制限酵素によるＤＮＡ断片を分
離して、分取し、分取した各ＤＮＡ断片を、さらに４塩
基認識酵素により切断して、第１の実施例におけるｐＵ
Ｃ１９の場合と同様にして、塩基配列を決定できる。例
えば、６塩基認識酵素としてＰｓｔＩ、４塩基認識酵素
としてＨｈａＩを使用する。
長）を、ＨｈａＩにより切断したＤＮＡ断片を鋳型と
し、蛍光標識プライマーを用いて伸長反応を行ない得た
反応物の電気泳動パターンを示す。図に示すような、反
応物のままではＤＮＡ断片の数が多すぎて、ＤＮＡ断片
の分取が困難となる。ラムダＤＮＡのように巨大な試料
ＤＮＡでは、予め、例えば、６塩基認識酵素により切断
した後、電気泳動により制限酵素によるＤＮＡ断片を分
離して、分取し、分取した各ＤＮＡ断片を、さらに４塩
基認識酵素により切断して、第１の実施例におけるｐＵ
Ｃ１９の場合と同様にして、塩基配列を決定できる。例
えば、６塩基認識酵素としてＰｓｔＩ、４塩基認識酵素
としてＨｈａＩを使用する。
【００５６】（第３の実施例）通常、多くの研究室では
クローニングして得られた長いＤＮＡがＤＮＡライブラ
リーの形として保存されている。又は、塩基配列決定を
行なうＤＮＡの領域のクローニングは既に終了している
場合が多い。本発明では、クローニングが既に終了して
いる場合にも、サブクローニングなしで効率良く塩基配
列の決定ができる。例えば、モデルとしてｐＵＣ１９を
制限酵素Ｐｓｔ１により切断した直鎖状のＤＮＡを試料
ＤＮＡ１とする。本実施例は、試料ＤＮＡ１としてＰｓ
ｔ１により切断した直鎖状ｐＵＣ１９を用いる点で、第
１の実施例と異なる。以下、図１において用いた符号と
同じ符号を用いて説明する。１０ｐｍｏｌのｐＵＣ１９
を１００ユニットのＰｓｔ１により、３７℃１時間かけ
て切断する。常法に従い、エタノール沈殿を行なう。Ｐ
ｓｔ１はｐＵＣ１９を１ケ所で切断するので、直線状に
なったｐＵＣ１９が得られる。
クローニングして得られた長いＤＮＡがＤＮＡライブラ
リーの形として保存されている。又は、塩基配列決定を
行なうＤＮＡの領域のクローニングは既に終了している
場合が多い。本発明では、クローニングが既に終了して
いる場合にも、サブクローニングなしで効率良く塩基配
列の決定ができる。例えば、モデルとしてｐＵＣ１９を
制限酵素Ｐｓｔ１により切断した直鎖状のＤＮＡを試料
ＤＮＡ１とする。本実施例は、試料ＤＮＡ１としてＰｓ
ｔ１により切断した直鎖状ｐＵＣ１９を用いる点で、第
１の実施例と異なる。以下、図１において用いた符号と
同じ符号を用いて説明する。１０ｐｍｏｌのｐＵＣ１９
を１００ユニットのＰｓｔ１により、３７℃１時間かけ
て切断する。常法に従い、エタノール沈殿を行なう。Ｐ
ｓｔ１はｐＵＣ１９を１ケ所で切断するので、直線状に
なったｐＵＣ１９が得られる。
【００５７】以下、第１の実施例と同様にして塩基配列
を決定する。直線状になったｐＵＣ１９を、制限酵素Ｈ
ｈａ１を用いて切断化してＤＮＡ断片を調製し、アガロ
ース電気泳動により、３種類のフラクションに分離し、
１６種類の蛍光標識プライマーから、シーケンス反応に
使用する蛍光プライマー３１を選別した。蛍光プライマ
ー３１を用いて、伸長反応により伸長ＤＮＡ鎖３２を得
た。次に、ｐＵＣ１９を鋳型として、伸長ＤＮＡ鎖３２
を伸長してＤＮＡ伸長鎖３３を得て、第１の実施例と同
様にして塩基配列を決定した。この結果、特定のＤＮＡ
断片３の塩基配列と、ＤＮＡ断片３の３’末端に隣接し
て繋がる試料ＤＮＡ１（ｐＵＣ１９）の塩基配列が決定
できた。
を決定する。直線状になったｐＵＣ１９を、制限酵素Ｈ
ｈａ１を用いて切断化してＤＮＡ断片を調製し、アガロ
ース電気泳動により、３種類のフラクションに分離し、
１６種類の蛍光標識プライマーから、シーケンス反応に
使用する蛍光プライマー３１を選別した。蛍光プライマ
ー３１を用いて、伸長反応により伸長ＤＮＡ鎖３２を得
た。次に、ｐＵＣ１９を鋳型として、伸長ＤＮＡ鎖３２
を伸長してＤＮＡ伸長鎖３３を得て、第１の実施例と同
様にして塩基配列を決定した。この結果、特定のＤＮＡ
断片３の塩基配列と、ＤＮＡ断片３の３’末端に隣接し
て繋がる試料ＤＮＡ１（ｐＵＣ１９）の塩基配列が決定
できた。
【００５８】（第４の実施例）ＤＮＡ断片の長さが４０
０塩基から５００塩基以上になると十分な数のＤＮＡ断
片を得ることが困難となり、ゲル電気泳動において、Ｄ
ＮＡ断片からの信号強度が弱くなるのに加えて、ＤＮＡ
鎖長の分離能も低下するという問題がある。この問題に
対処する方法の手順の１例を、図９を用いて以下に説明
する。
０塩基から５００塩基以上になると十分な数のＤＮＡ断
片を得ることが困難となり、ゲル電気泳動において、Ｄ
ＮＡ断片からの信号強度が弱くなるのに加えて、ＤＮＡ
鎖長の分離能も低下するという問題がある。この問題に
対処する方法の手順の１例を、図９を用いて以下に説明
する。
【００５９】試料ＤＮＡ５００を第１の制限酵素により
切断して得られるＤＮＡ断片５０１の３’末端に、第１
の実施例と同様の方法によりポリＡを付加する。ＤＮＡ
断片５０１を鋳型として、制限酵素認識部分、及び制限
酵素認識部分に連なる未知塩基配列部分にハイブリダイ
ズする蛍光標識プライマー５０２（第１プライマーと呼
ぶ）を用いてシーケンス反応を行ない、合成した種々の
長さのＤＮＡ断片５５０を、蛍光式ＤＮＡシーケンサに
より電気泳動分離して、ＤＡＮ断片５０１の塩基配列を
決定する。次いで、第１プライマーをビオチンで標識し
たビオチン化プライマー５０４を用意する。
切断して得られるＤＮＡ断片５０１の３’末端に、第１
の実施例と同様の方法によりポリＡを付加する。ＤＮＡ
断片５０１を鋳型として、制限酵素認識部分、及び制限
酵素認識部分に連なる未知塩基配列部分にハイブリダイ
ズする蛍光標識プライマー５０２（第１プライマーと呼
ぶ）を用いてシーケンス反応を行ない、合成した種々の
長さのＤＮＡ断片５５０を、蛍光式ＤＮＡシーケンサに
より電気泳動分離して、ＤＡＮ断片５０１の塩基配列を
決定する。次いで、第１プライマーをビオチンで標識し
たビオチン化プライマー５０４を用意する。
【００６０】ポリＡが付加したＤＮＡ断片５０１を鋳型
として相補鎖合成して、相補鎖合成ＤＡＮ断片５３０を
得る。相補鎖合成ＤＡＮ断片５３０を、アビジンを保持
したビーズ５１０にトラップして反応液から取り出す。
次いで、蛍光標識ｄＮＴＰ５１１、及び３’エキソヌク
レアーゼ活性をもつ酵素ＤＮＡポリメラーゼにより、相
補鎖合成ＤＮＡ断片５３０の３’末端を分解（３’→
５’エキソヌクレアーゼ反応）し、新たに蛍光標識ｄＮ
ＴＰ５１１を添加して、３’末端に蛍光標識をもつ蛍光
標識ＤＮＡ鎖５１２を得る（３’末端認識反応）。
として相補鎖合成して、相補鎖合成ＤＡＮ断片５３０を
得る。相補鎖合成ＤＡＮ断片５３０を、アビジンを保持
したビーズ５１０にトラップして反応液から取り出す。
次いで、蛍光標識ｄＮＴＰ５１１、及び３’エキソヌク
レアーゼ活性をもつ酵素ＤＮＡポリメラーゼにより、相
補鎖合成ＤＮＡ断片５３０の３’末端を分解（３’→
５’エキソヌクレアーゼ反応）し、新たに蛍光標識ｄＮ
ＴＰ５１１を添加して、３’末端に蛍光標識をもつ蛍光
標識ＤＮＡ鎖５１２を得る（３’末端認識反応）。
【００６１】ここで、先に塩基配列を決定したＤＮＡ断
片５０１の塩基配列を基に、ＤＮＡ断片５０１の３’末
端近傍の２本鎖ＤＮＡを切断する第２の制限酵素を決め
る。第２の制限酵素により蛍光標識ＤＮＡ鎖５１２を切
断し、短い蛍光標識プライマーとなる第２プライマー５
１３を得る。試料ＤＮＡ５００を鋳型としてシーケンシ
ング反応５０３により、第２プライマー５１３を伸長し
て、第１の実施例と同様にして、塩基配列を決定する。
もちろん、試料ＤＮＡ５００を鋳型としてシーケンシン
グ反応により、３’末端に蛍光標識をもつ蛍光標識ＤＮ
Ａ鎖５１２を伸長した後で、第２の制限酵素により第２
プライマー５１３の伸長体を切断してもよい。第２プラ
イマー５１３は、試料ＤＮＡ５００の一部と相補的であ
り、シーケンシング反応により生成する第２プライマー
５１３の伸長体は、第２の制限酵素により切断された分
だけ短くなり、シーケンシング反応による生成物はより
長いＤＮＡ断片長さまで、蛍光式ＤＮＡシーケンサによ
り高感度で検出でき、塩基配列がより正確に決定でき
る。
片５０１の塩基配列を基に、ＤＮＡ断片５０１の３’末
端近傍の２本鎖ＤＮＡを切断する第２の制限酵素を決め
る。第２の制限酵素により蛍光標識ＤＮＡ鎖５１２を切
断し、短い蛍光標識プライマーとなる第２プライマー５
１３を得る。試料ＤＮＡ５００を鋳型としてシーケンシ
ング反応５０３により、第２プライマー５１３を伸長し
て、第１の実施例と同様にして、塩基配列を決定する。
もちろん、試料ＤＮＡ５００を鋳型としてシーケンシン
グ反応により、３’末端に蛍光標識をもつ蛍光標識ＤＮ
Ａ鎖５１２を伸長した後で、第２の制限酵素により第２
プライマー５１３の伸長体を切断してもよい。第２プラ
イマー５１３は、試料ＤＮＡ５００の一部と相補的であ
り、シーケンシング反応により生成する第２プライマー
５１３の伸長体は、第２の制限酵素により切断された分
だけ短くなり、シーケンシング反応による生成物はより
長いＤＮＡ断片長さまで、蛍光式ＤＮＡシーケンサによ
り高感度で検出でき、塩基配列がより正確に決定でき
る。
【００６２】（第５の実施例）第４の実施例では、ＤＮ
Ａ断片を生成するのに用いた第１の制限酵素と異なる第
２の制限酵素を用いて、端蛍光標識ＤＮＡ鎖５１２を切
断したが、本実施例では、蛍光標識ターミネータを用い
伸長したＤＮＡ鎖を、ＤＮＡ断片の作成に用いた制限酵
素を用いて切断して、ＤＮＡ断片に隣接する塩基配列を
決定する。図１０に、本実施例の処理の手順を示す。
Ａ断片を生成するのに用いた第１の制限酵素と異なる第
２の制限酵素を用いて、端蛍光標識ＤＮＡ鎖５１２を切
断したが、本実施例では、蛍光標識ターミネータを用い
伸長したＤＮＡ鎖を、ＤＮＡ断片の作成に用いた制限酵
素を用いて切断して、ＤＮＡ断片に隣接する塩基配列を
決定する。図１０に、本実施例の処理の手順を示す。
【００６３】試料ＤＮＡ７００を例えば、制限酵素Ｈｈ
ａ１により切断し、ＤＮＡ断片７０１、７０２、７０
３、７０４を得る。次いで、３’末端に選別塩基配列を
持つ第１プライマー７１０を用いて、目的とするＤＮＡ
断片７０２の相補鎖を作る。第１プライマー７１０の
５’側はビオチン７１１で標識しておく。表面にアビジ
ンを固定したアビジン固定ビーズ７１２を用いて、相補
鎖伸長した第１プライマー７５０をつりだして、鋳型の
ＤＮＡ断片７０２を除去して、第１プライマー７１０が
伸長した１本鎖を、シーケンシング反応のプライマー
（第２プライマー７５０と呼ぶ）として用いる。
ａ１により切断し、ＤＮＡ断片７０１、７０２、７０
３、７０４を得る。次いで、３’末端に選別塩基配列を
持つ第１プライマー７１０を用いて、目的とするＤＮＡ
断片７０２の相補鎖を作る。第１プライマー７１０の
５’側はビオチン７１１で標識しておく。表面にアビジ
ンを固定したアビジン固定ビーズ７１２を用いて、相補
鎖伸長した第１プライマー７５０をつりだして、鋳型の
ＤＮＡ断片７０２を除去して、第１プライマー７１０が
伸長した１本鎖を、シーケンシング反応のプライマー
（第２プライマー７５０と呼ぶ）として用いる。
【００６４】アビジン固定ビーズ７１２の代りに、磁気
ビーズを用いて第２プライマーをつりだしてもよい。第
２プライマー７５０と試料ＤＮＡ７００を混合し、シー
ケンシング反応液を加えてシーケンス反応を行ない、
３’末端に蛍光標識をもつＤＮＡ断片７２０を得る。次
いで、制限酵素Ｈｈａ１により切断し、第２プライマー
７５０を除去して、ＤＮＡ断片７２１を得て、ＤＡＮ断
片７２１を蛍光式ＤＮＡシーケンサにより電気泳動し
て、塩基配列決定する。本実施例により、第１プライマ
ー７１０がハイブリットするＤＮＡ断片７０２の３’末
端に隣接する試料ＤＮＡ７００の塩基配列が決定できる
（即ち、ＤＮＡ断片７０３の塩基配列が決定できる）。
ビーズを用いて第２プライマーをつりだしてもよい。第
２プライマー７５０と試料ＤＮＡ７００を混合し、シー
ケンシング反応液を加えてシーケンス反応を行ない、
３’末端に蛍光標識をもつＤＮＡ断片７２０を得る。次
いで、制限酵素Ｈｈａ１により切断し、第２プライマー
７５０を除去して、ＤＮＡ断片７２１を得て、ＤＡＮ断
片７２１を蛍光式ＤＮＡシーケンサにより電気泳動し
て、塩基配列決定する。本実施例により、第１プライマ
ー７１０がハイブリットするＤＮＡ断片７０２の３’末
端に隣接する試料ＤＮＡ７００の塩基配列が決定できる
（即ち、ＤＮＡ断片７０３の塩基配列が決定できる）。
【００６５】（第６の実施例）第２の実施例に示したよ
うに、数十Ｋ塩基からなる長い試料ＤＮＡの塩基配列決
定では、まず試料ＤＮＡを６塩基認識酵素により切断し
た後、電気泳動により分離、分取して、分取した各ＤＮ
Ａ断片を更に４塩基認識酵素により切断して、上記の各
実施例で説明した方法を適用して、全体の塩基配列決定
ができる。上記の分離と塩基配列決定は、計算機の制御
の下で自動的に実行でき、上記の分離と塩基配列決定を
行なう全体システムは、分離装置と、シーケンス反応を
行なう装置（ロボット）、キャピラリーアレー電気泳動
装置のような高スループットなＤＮＡシーケンサから構
成され、熟練を特に要することなく操作が可能である。
うに、数十Ｋ塩基からなる長い試料ＤＮＡの塩基配列決
定では、まず試料ＤＮＡを６塩基認識酵素により切断し
た後、電気泳動により分離、分取して、分取した各ＤＮ
Ａ断片を更に４塩基認識酵素により切断して、上記の各
実施例で説明した方法を適用して、全体の塩基配列決定
ができる。上記の分離と塩基配列決定は、計算機の制御
の下で自動的に実行でき、上記の分離と塩基配列決定を
行なう全体システムは、分離装置と、シーケンス反応を
行なう装置（ロボット）、キャピラリーアレー電気泳動
装置のような高スループットなＤＮＡシーケンサから構
成され、熟練を特に要することなく操作が可能である。
【００６６】図１１に、分離と塩基配列決定の１連の操
作を行なうシステムの構成例を示す。図１１に示すシス
テムは、酵素反応装置９００、断片分析装置９０１、分
取用電気泳動装置９０２、ＤＮＡシーケンサ９０３、こ
れら装置の間で試料、反応生成物等を搬送するための複
数のピペット９０４を保持して、ピペット９０４の移動
させるためのＸＹＺステージ装置９０５、各装置の動作
を予め設定されたプログラムの下で制御する計算機９０
６から構成される。
作を行なうシステムの構成例を示す。図１１に示すシス
テムは、酵素反応装置９００、断片分析装置９０１、分
取用電気泳動装置９０２、ＤＮＡシーケンサ９０３、こ
れら装置の間で試料、反応生成物等を搬送するための複
数のピペット９０４を保持して、ピペット９０４の移動
させるためのＸＹＺステージ装置９０５、各装置の動作
を予め設定されたプログラムの下で制御する計算機９０
６から構成される。
【００６７】酵素反応装置９００は、１６種類のプライ
マーセットを保持する少なくとも１６区画をもつプライ
マーセット保持部９１０、酵素、バッファー等の反応試
薬を保持する反応試薬保持部９１１、制限酵素による試
料ＤＮＡの切断反応を行なう酵素切断反応部９１２、酵
素切断反応部での反応生成物を回収するＤＮＡ回収部９
１３、伸長反応を行なう少なくとも１６区画をもつ伸長
反応部９１４、シーケンス反応を行なうシーケンス反応
部９１８、ピペット洗浄部９１５、試料ＤＮＡを保持す
る試料保持部９１７より構成される。酵素反応装置９０
０を構成する各部は、計算機９０６の下で独立して温度
制御装置（図示せず）により制御され、これら各部の間
での試料液、反応試薬、反応生成物を含む液の搬送は、
ピペット９０４により行なわれ、ピペット９０４の位置
の移動制御はＸＹＺステージ装置９０５によりなされ、
ピペットへの液の吸引、排出の制御は、移動制御ととも
に計算機９０６からの制御信号により実行される。
マーセットを保持する少なくとも１６区画をもつプライ
マーセット保持部９１０、酵素、バッファー等の反応試
薬を保持する反応試薬保持部９１１、制限酵素による試
料ＤＮＡの切断反応を行なう酵素切断反応部９１２、酵
素切断反応部での反応生成物を回収するＤＮＡ回収部９
１３、伸長反応を行なう少なくとも１６区画をもつ伸長
反応部９１４、シーケンス反応を行なうシーケンス反応
部９１８、ピペット洗浄部９１５、試料ＤＮＡを保持す
る試料保持部９１７より構成される。酵素反応装置９０
０を構成する各部は、計算機９０６の下で独立して温度
制御装置（図示せず）により制御され、これら各部の間
での試料液、反応試薬、反応生成物を含む液の搬送は、
ピペット９０４により行なわれ、ピペット９０４の位置
の移動制御はＸＹＺステージ装置９０５によりなされ、
ピペットへの液の吸引、排出の制御は、移動制御ととも
に計算機９０６からの制御信号により実行される。
【００６８】試料保持部９１７から試料ＤＮＡを酵素切
断反応部９１２にピペットでとり、反応試薬保持部９１
１から制限酵素等を分液して酵素切断反応部９１２に加
えて、３７°Ｃで１時間保持して反応を行なう。反応終
了後、反応液をＤＮＡ回収部９１３にピペットで移し、
制限酵素により切断されたＤＮＡを回収する。ＤＮＡ回
収部９１３は、シリカビーズフイルターとポンプから構
成され、ＤＮＡの回収は、まずＤＮＡをシリカビーズフ
イルターに補足し、洗浄を行なった後に水で溶出して行
なう。回収した切断されたＤＮＡの一部は１６分割し
て、伸長反応部９１４にて１６種類のプライマーセット
による伸長反応を行なう。反応生成物はピペットにより
断片分析装置９０１に添加され、反応したプライマーと
その断片長が計測され、計測結果は計算機９０６で解析
され、各プライマーが１種類の断片伸長に利用できるよ
うにＤＮＡ断片混合物の分取範囲を決定する。ＤＮＡ回
収部９１３に残っているＤＮＡ断片混合物を、分取用電
気泳動装置９０２に添加してＤＮＡ断片混合物を２〜５
のフラクションに分注する。
断反応部９１２にピペットでとり、反応試薬保持部９１
１から制限酵素等を分液して酵素切断反応部９１２に加
えて、３７°Ｃで１時間保持して反応を行なう。反応終
了後、反応液をＤＮＡ回収部９１３にピペットで移し、
制限酵素により切断されたＤＮＡを回収する。ＤＮＡ回
収部９１３は、シリカビーズフイルターとポンプから構
成され、ＤＮＡの回収は、まずＤＮＡをシリカビーズフ
イルターに補足し、洗浄を行なった後に水で溶出して行
なう。回収した切断されたＤＮＡの一部は１６分割し
て、伸長反応部９１４にて１６種類のプライマーセット
による伸長反応を行なう。反応生成物はピペットにより
断片分析装置９０１に添加され、反応したプライマーと
その断片長が計測され、計測結果は計算機９０６で解析
され、各プライマーが１種類の断片伸長に利用できるよ
うにＤＮＡ断片混合物の分取範囲を決定する。ＤＮＡ回
収部９１３に残っているＤＮＡ断片混合物を、分取用電
気泳動装置９０２に添加してＤＮＡ断片混合物を２〜５
のフラクションに分注する。
【００６９】各フラクションをシーケンス反応部９１８
に搬送してシーケンス反応を行なう。シーケンス反応に
必要な試薬は反応試薬保持部９１１からピペットでシー
ケンス反応部に供給される。シーケンス反応部９１８で
得られるシーケンス反応生成物は、ＤＮＡシーケンサ９
０３に搬送されて電気泳動され、塩基配列決定に必要な
電気泳動分析結果が得られる。各フラクションに関する
電気泳動分析結果をもとにして、試料ＤＮＡの塩基配列
が決定される。試料ＤＮＡの塩基配列が決定は、計算機
９０６、又はＤＮＡシーケンサ９０３が単独でもつ計算
機により行なわれる。なお、計算機９０６は表示装置９
１６を有し、各種の制御の実行状況、塩基配列情報等の
表示を行なう。
に搬送してシーケンス反応を行なう。シーケンス反応に
必要な試薬は反応試薬保持部９１１からピペットでシー
ケンス反応部に供給される。シーケンス反応部９１８で
得られるシーケンス反応生成物は、ＤＮＡシーケンサ９
０３に搬送されて電気泳動され、塩基配列決定に必要な
電気泳動分析結果が得られる。各フラクションに関する
電気泳動分析結果をもとにして、試料ＤＮＡの塩基配列
が決定される。試料ＤＮＡの塩基配列が決定は、計算機
９０６、又はＤＮＡシーケンサ９０３が単独でもつ計算
機により行なわれる。なお、計算機９０６は表示装置９
１６を有し、各種の制御の実行状況、塩基配列情報等の
表示を行なう。
【００７０】
【発明の効果】本発明によれば、試料ＤＮＡを制限酵素
により切断して得る、ＤＮＡ断片の混合物に切断前の試
料ＤＮＡ又は塩基配列を決定使用とする目的ＤＮＡ断片
の３’末端側の塩基配列を含む大きなＤＮＡ断片を添加
した状態で、塩基配列決定反応を行ない、目的ＤＮＡ断
片と目的ＤＮＡ断片の３’末端側に隣接するＤＮＡ断片
の部分の塩基配列を同時に決定できる。本発明の方法に
よれば、制限酵素により得られた各ＤＮＡ断片の塩基配
列を決定すると同時に、各ＤＮＡ断片に隣接するＤＮＡ
断片の部分の塩基配列を同時に決定でき、各ＤＮＡ断片
間での塩基配列の繋がりを決定できる。
により切断して得る、ＤＮＡ断片の混合物に切断前の試
料ＤＮＡ又は塩基配列を決定使用とする目的ＤＮＡ断片
の３’末端側の塩基配列を含む大きなＤＮＡ断片を添加
した状態で、塩基配列決定反応を行ない、目的ＤＮＡ断
片と目的ＤＮＡ断片の３’末端側に隣接するＤＮＡ断片
の部分の塩基配列を同時に決定できる。本発明の方法に
よれば、制限酵素により得られた各ＤＮＡ断片の塩基配
列を決定すると同時に、各ＤＮＡ断片に隣接するＤＮＡ
断片の部分の塩基配列を同時に決定でき、各ＤＮＡ断片
間での塩基配列の繋がりを決定できる。
【００７１】従って、複数の制限酵素を用いて各ＤＮＡ
断片の塩基配列のオーバーラップを決定する必要がな
く、効率的に塩基配列が決定できる。また、サブクロー
ニングを用いることなく、全て試験管内のみの反応によ
り、長い試料ＤＮＡの塩基配列が決定できる。さらに、
プライマーウォーキングのように、塩基配列決定毎にプ
ライマー合成を行なうことなく、各ＤＮＡ断片の塩基配
列決定を行ない、各ＤＮＡ断片間の塩基配列の繋がりを
決定できる。
断片の塩基配列のオーバーラップを決定する必要がな
く、効率的に塩基配列が決定できる。また、サブクロー
ニングを用いることなく、全て試験管内のみの反応によ
り、長い試料ＤＮＡの塩基配列が決定できる。さらに、
プライマーウォーキングのように、塩基配列決定毎にプ
ライマー合成を行なうことなく、各ＤＮＡ断片の塩基配
列決定を行ない、各ＤＮＡ断片間の塩基配列の繋がりを
決定できる。
【００７２】（配列表） 配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＧＣ 配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＧＴ 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：Ｘ、Ｙ；任意のＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴ 配列 ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＸＹ
【図１】本発明の第１の実施例での処理の手順を示すフ
ロー図。
ロー図。
【図２】本発明の第１の実施例での、蛍光標識プライマ
ーを用いてｐＵＣ１９のＨｈａＩ切断によるＤＮＡ断片
を鋳型とした伸長反応生成物の電気泳動パターン。
ーを用いてｐＵＣ１９のＨｈａＩ切断によるＤＮＡ断片
を鋳型とした伸長反応生成物の電気泳動パターン。
【図３】本発明の第１の実施例での、ｐＵＣ１９のＰＣ
Ｒ生成物の制限酵素Ｈｈａ１による切断生成物のアガロ
ースゲル電気泳動により分離したフラクションの電気泳
動パターン。
Ｒ生成物の制限酵素Ｈｈａ１による切断生成物のアガロ
ースゲル電気泳動により分離したフラクションの電気泳
動パターン。
【図４】本発明の第１の実施例での、蛍光標識プライマ
ーを用いてフラクション４のＤＮＡ断片を鋳型とした伸
長反応生成物の電気泳動パターン。
ーを用いてフラクション４のＤＮＡ断片を鋳型とした伸
長反応生成物の電気泳動パターン。
【図５】本発明の第１の実施例での、フラクション１か
ら得られた塩基配列決定反応生成物の、（ａ）Ａ断片
群、（ｂ）Ｃ断片群、（ｃ）Ｇ断片群、（ｄ）Ｔ断片
群、（ｅ）全断片群の、各電気泳動パターン。
ら得られた塩基配列決定反応生成物の、（ａ）Ａ断片
群、（ｂ）Ｃ断片群、（ｃ）Ｇ断片群、（ｄ）Ｔ断片
群、（ｅ）全断片群の、各電気泳動パターン。
【図６】本発明の第１の実施例での、フラクション４か
ら得られた塩基配列決定反応生成物の、（ａ）Ａ断片
群、（ｂ）Ｃ断片群、（ｃ）Ｇ断片群、（ｄ）Ｔ断片
群、（ｅ）全断片群の、各電気泳動パターン。
ら得られた塩基配列決定反応生成物の、（ａ）Ａ断片
群、（ｂ）Ｃ断片群、（ｃ）Ｇ断片群、（ｄ）Ｔ断片
群、（ｅ）全断片群の、各電気泳動パターン。
【図７】本発明の第１の実施例での、ｐＵＣ１９の塩基
配列決定を説明する図。
配列決定を説明する図。
【図８】本発明の第２の実施例での、蛍光標識プライマ
ーを用いてラムダＤＮＡのＨｈａＩ切断によるＤＮＡ断
片を鋳型とした伸長反応生成物の電気泳動パターン。
ーを用いてラムダＤＮＡのＨｈａＩ切断によるＤＮＡ断
片を鋳型とした伸長反応生成物の電気泳動パターン。
【図９】本発明の第４の実施例での処理の手順を示すフ
ロー図。
ロー図。
【図１０】本発明の第５の実施例での処理の手順を示す
フロー図。
フロー図。
【図１１】本発明の第５の実施例での分離と塩基配列決
定の１連の操作を行なうシステムの構成例を示す図。
定の１連の操作を行なうシステムの構成例を示す図。
１、５００、７００…試料ＤＮＡ、２、３…ＤＮＡ断
片、１２、１３、１４…試料ＤＮＡの制限酵素による断
片、２１…ポリＡ部分、２２…選択される塩基配列部
分、２３…制限酵素認識部分、３１…蛍光標識プライマ
ー、３２…伸長ＤＮＡ鎖、３３、３４…ＤＮＡ伸長鎖、
３７…プライマーが伸長したＤＮＡ断片による泳動パタ
ーン、３８…プライマーの泳動ピーク、３９…塩基長、
４０…プライマーがもつ２塩基配列、４１、４２、４３
…泳動パターン、５１…完全ハイブリッド体、５２…不
完全ハイブリッブ体、９０…ＤＮＡサイズマーカ、９
１、９２、９３、９４…泳動パターン、２００…サイク
ルシーケンシング反応、２０１…任意の塩基配列部分、
２０２…制限酵素認識部分、２０３…ポリＴ部分、５０
１…ＤＮＡ断片、５０２…蛍光標識プライマー、５０３
…シーケンシング反応、５０４…ビオチン化プライマ
ー、５１０、７１２…アビジン固定ビーズ、５１１…蛍
光標識ｄＮＴＰ、５１２…３’末端蛍光標識ＤＮＡ鎖、
５１３…第２プライマー、５３０…相補鎖合成、５５０
…ＤＮＡ断片、７０１、７０２、７０３、７０４…ＤＮ
Ａ断片、７１０…第１プライマー、７１１…ビオチン、
７１２…アビジン固定ビーズ、７２０…ＤＮＡ断片、７
２１…ＤＮＡ断片、７５０…第２プライマー、７７０…
塩基配列決定部位、７７０−１…ＤＮＡ断片、７７０−
２…ＤＮＡ断片７７０−１に隣接するＤＮＡ断片の一部
の塩基配列部分、９００…酵素反応装置、９０１…断片
分析装置、９０２…分取用電気泳動装置、９０３…ＤＮ
Ａシーケンサ、９０４…ピペット、９０５…ＸＹＺステ
ージ装置、９０６…計算機、９１０…プライマーセット
保持部、９１１…反応試薬保持部、９１２…酵素切断反
応部、９１３…ＤＮＡ回収部、９１４…伸長反応部、９
１５…ピペット洗浄部、９１６…表示装置、９１７…試
料保持部、９１８…シーケンス反応部。
片、１２、１３、１４…試料ＤＮＡの制限酵素による断
片、２１…ポリＡ部分、２２…選択される塩基配列部
分、２３…制限酵素認識部分、３１…蛍光標識プライマ
ー、３２…伸長ＤＮＡ鎖、３３、３４…ＤＮＡ伸長鎖、
３７…プライマーが伸長したＤＮＡ断片による泳動パタ
ーン、３８…プライマーの泳動ピーク、３９…塩基長、
４０…プライマーがもつ２塩基配列、４１、４２、４３
…泳動パターン、５１…完全ハイブリッド体、５２…不
完全ハイブリッブ体、９０…ＤＮＡサイズマーカ、９
１、９２、９３、９４…泳動パターン、２００…サイク
ルシーケンシング反応、２０１…任意の塩基配列部分、
２０２…制限酵素認識部分、２０３…ポリＴ部分、５０
１…ＤＮＡ断片、５０２…蛍光標識プライマー、５０３
…シーケンシング反応、５０４…ビオチン化プライマ
ー、５１０、７１２…アビジン固定ビーズ、５１１…蛍
光標識ｄＮＴＰ、５１２…３’末端蛍光標識ＤＮＡ鎖、
５１３…第２プライマー、５３０…相補鎖合成、５５０
…ＤＮＡ断片、７０１、７０２、７０３、７０４…ＤＮ
Ａ断片、７１０…第１プライマー、７１１…ビオチン、
７１２…アビジン固定ビーズ、７２０…ＤＮＡ断片、７
２１…ＤＮＡ断片、７５０…第２プライマー、７７０…
塩基配列決定部位、７７０−１…ＤＮＡ断片、７７０−
２…ＤＮＡ断片７７０−１に隣接するＤＮＡ断片の一部
の塩基配列部分、９００…酵素反応装置、９０１…断片
分析装置、９０２…分取用電気泳動装置、９０３…ＤＮ
Ａシーケンサ、９０４…ピペット、９０５…ＸＹＺステ
ージ装置、９０６…計算機、９１０…プライマーセット
保持部、９１１…反応試薬保持部、９１２…酵素切断反
応部、９１３…ＤＮＡ回収部、９１４…伸長反応部、９
１５…ピペット洗浄部、９１６…表示装置、９１７…試
料保持部、９１８…シーケンス反応部。
Claims (17)
- 【請求項１】（１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断し
てＤＮＡ断片を得る工程と、 （２）前記ＤＮＡ断片の３’末端に所定の塩基配列をも
つオリゴマーを付加する工程と、 （３）前記オリゴマーが付加された前記ＤＮＡ断片の１
本鎖を鋳型とし、前記オリゴマーの塩基配列の少なくと
も一部と相補的な第１の塩基配列部分と、前記制限酵素
により認識される塩基配列と相補的な第２の塩基配列部
分と、１塩基から４塩基の範囲の塩基の可能な組み合わ
せからなる第３の塩基配列部分とからなる、標識された
標識プライマーを用いて、相補鎖合成伸長反応を行な
い、前記ＤＮＡ断片の１本鎖に相補的な塩基配列をもつ
標識伸長プライマーを得る工程と、 （４）（ａ）前記オリゴマーが付加された前記ＤＮＡ断
片の１本鎖を鋳型とし、前記標識プライマーを使用して
シーケンス反応を行なう工程と、（ｂ）前記ＤＮＡ断片
の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とをもつ
前記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は前記試料ＤＮＡの
１本鎖を鋳型とし、前記標識伸長プライマーを使用して
シーケンス反応を行なう工程とを、進行させる工程と、 （５）前記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、前
記ＤＮＡ断片の塩基配列と、前記ＤＮＡ断片の塩基配列
に隣接する前記試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列
とを決定する工程と、を有することを特徴とする塩基配
列決定方法。 - 【請求項２】請求項１に記載の塩基配列決定方法におい
て、前記標識が蛍光標識であることを特徴とする塩基配
列決定方法。 - 【請求項３】請求項１に記載の塩基配列決定方法におい
て、前記工程（３）を、温度条件を変更して複数回繰り
返すことを特徴とする塩基配列決定方法。 - 【請求項４】請求項１に記載の塩基配列決定方法におい
て、前記工程（４）を、温度条件を変更して、前記相補
鎖合成伸長反応、及び前記標識伸長プライマーを前記Ｄ
ＮＡ断片から遊離させることを複数回繰り返すことを特
徴とする塩基配列決定方法。 - 【請求項５】請求項１に記載の塩基配列決定方法におい
て、前記工程（３）、前記工程（４）において耐熱性ポ
リメラーゼを使用することを特徴とする塩基配列決定方
法。 - 【請求項６】請求項１に記載の塩基配列決定方法におい
て、前記オリゴマーは、単一の塩基種からなることを特
徴とする塩基配列決定方法。 - 【請求項７】（１）試料ＤＮＡを第１の制限酵素により
切断してＤＮＡ断片を得る工程と、（２）プライマーを
用い、前記ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型として伸長反応を
行なった後、３’末端を蛍光標識ヌクレオチドと置換す
る工程と、（３）前記（２）で生成した相補鎖を前記第
１の制限酵素と異なる第２の制限酵素により切断して、
３’末端に蛍光標識された蛍光標識プライマーを得る工
程と、（４）前記蛍光標識プライマーを用い、前記ＤＮ
Ａ断片の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列と
をもつ前記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は前記試料Ｄ
ＮＡの１本鎖を鋳型として、シーケンス反応を行なう工
程と、（５）前記シーケンス反応の生成物を電気泳動し
て、前記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接する前記試料ＤＮ
Ａの少なくとも一部の塩基配列を決定する工程と、を有
することを特徴とする塩基配列決定方法。 - 【請求項８】（１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断し
てＤＮＡ断片を得る工程と、（２）プライマーを用い、
前記ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型として相補鎖合成を行な
い、前記ＤＮＡ断片の１本鎖に相補的な塩基配列をもつ
プライマーを得る工程と、（３）前記プライマーを用
い、前記ＤＮＡ断片の１本鎖の塩基配列とこれに隣接す
る塩基配列とをもつ前記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又
は前記試料ＤＮＡの１本鎖を鋳型として、伸長鎖の末端
に蛍光標識を導入するシーケンス反応を行なう工程と、
（４）前記シーケンス反応の生成物を前記制限酵素によ
り切断する工程と、（５）前記制限酵素により切断され
た前記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、前記Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列に隣接する前記試料ＤＮＡの少なく
とも一部の塩基配列を決定する工程と、を有することを
特徴とする塩基配列決定方法。 - 【請求項９】（１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断し
てＤＮＡ断片を得る工程と、 （２）前記ＤＮＡ断片の３’末端に所定の塩基配列をも
つオリゴマーを付加する工程と、 （３）前記オリゴマーが付加された前記ＤＮＡ断片の１
本鎖を鋳型とし、前記オリゴマーの塩基配列の少なくと
も一部と相補的な第１の塩基配列部分と、前記制限酵素
により認識される塩基配列と相補的な第２の塩基配列部
分と、１塩基から４塩基の範囲の塩基の可能な組み合わ
せからなる第３の塩基配列部分とからなる、標識された
標識プライマーを用いて、相補鎖合成伸長反応を行な
い、前記ＤＮＡ断片の１本鎖に相補的な塩基配列をもつ
標識伸長プライマーを得る工程と、 （４）（ａ）前記オリゴマーが付加された前記ＤＮＡ断
片の１本鎖を鋳型とし、前記標識プライマーを使用して
シーケンス反応を行なう工程と、（ｂ）前記ＤＮＡ断片
の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とをもつ
前記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は前記試料ＤＮＡの
１本鎖を鋳型とし、前記蛍光標識伸長プライマーを使用
してシーケンス反応を行なう工程とを、進行させる工程
と、 （５）前記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、前
記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接する前記試料ＤＮＡの少
なくとも一部の塩基配列を決定する工程と、を有するこ
とを特徴とする塩基配列決定方法。 - 【請求項１０】（１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断
してＤＮＡ断片を得る工程と、（２）蛍光標識プライマ
ーを用い、前記ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型として相補鎖
合成を行ない、前記ＤＮＡ断片の１本鎖に相補的な塩基
配列をもつプライマーを得る工程と、（３）前記ＤＮＡ
断片の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とを
もつ前記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は前記試料ＤＮ
Ａの１本鎖を鋳型とし、前記プライマーを用いてシーケ
ンス反応を行なう工程と、（４）前記シーケンス反応の
生成物を電気泳動して、前記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣
接する前記試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列決定
する工程と、を有することを特徴とする塩基配列決定方
法。 - 【請求項１１】（１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断
してＤＮＡ断片を得る工程と、（２）前記ＤＮＡ断片に
選択的に相補鎖結合し蛍光標識された第１のプライマー
と、前記ＤＮＡ断片の１本鎖に相補的な塩基配列をもつ
蛍光標識された第２のプライマーと用いて、前記ＤＮＡ
断片の１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とを
もつ前記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は前記試料ＤＮ
Ａの１本鎖と、前記ＤＮＡ断片とを混合し鋳型として、
シーケンス反応を行なう工程と、（３）前記シーケンス
反応の生成物を電気泳動して、前記ＤＮＡ断片の塩基配
列と、前記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接する前記試料Ｄ
ＮＡの少なくとも一部の塩基配列とを決定する工程と、
を有することを特徴とする塩基配列決定方法。 - 【請求項１２】（１）試料ＤＮＡを制限酵素によりによ
り切断してＤＮＡ断片を得る工程と、 （２）前記ＤＮＡ断片の３’末端に既知塩基配列をもつ
オリゴマーを付加する工程と、 （３）前記ＤＮＡ断片の前記制限酵素により認識され切
断部分に続く末端部の１塩基から４塩基の数の塩基の種
類を識別して伸長反応を行なうことにより、前記ＤＮＡ
断片の長さを計測するとともに、シーケンシング反応に
用いるプライマーを決定する工程と、 （４）前記制限酵素による前記ＤＮＡ断片を電気泳動に
より長さにより分離して、分取する工程と、 （５）３’末端に前記ＤＮＡ断片を選別するための１塩
基から４塩基からなる塩基配列をもつ蛍光標識プライマ
ーを用いて前記ＤＮＡ断片を選別し、選別された前記Ｄ
ＮＡ断片を鋳型として相補鎖を合成をする工程、 （６）（ａ）前記標識プライマーを用いて、選別された
前記ＤＮＡ断片を鋳型とするシーケンス反応と、（ｂ）
前記工程（５）により生成した前記相補鎖を用いて、選
別された前記ＤＮＡ断片の塩基配列とこれに隣接する塩
基配列とをもつ前記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は前
記試料ＤＮＡの１本鎖を鋳型とするシーケンス反応と
を、行なう工程と、 （７）前記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、選
別された前記ＤＮＡ断片の塩基配列と、選別された前記
ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接する前記試料ＤＮＡの少な
くとも一部の塩基配列を決定する工程と、を有すること
を特徴とする塩基配列決定方法。 - 【請求項１３】（１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断
してＤＮＡ断片を得る工程と、（２）前記ＤＮＡ断片の
１本鎖を鋳型として、プライマーを伸長反応させて、１
本鎖ＤＮＡを得る工程と、（３）前記１本鎖ＤＮＡを用
い、前記ＤＮＡ断片の１本鎖の塩基配列とこれに隣接す
る塩基配列とをもつ前記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又
は前記試料ＤＮＡの１本鎖を、鋳型とするシーケンス反
応を行なう工程と、（４）前記シーケンス反応の生成物
を電気泳動して、前記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接する
前記試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列を決定する
工程と、を有することを特徴とする塩基配列決定方法。 - 【請求項１４】（１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断
してＤＮＡ断片を得る工程と、（２）前記ＤＮＡ断片の
１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とをもつ前
記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は前記試料ＤＮＡの１
本鎖と、前記ＤＮＡ断片とをそれぞれ鋳型とし、前記試
料ＤＮＡの１本鎖又は前記試料ＤＮＡの１本鎖の一部に
選択的に相補鎖結合するプライマーと、前記ＤＮＡ断片
に選択的に相補鎖結合するプライマーとを用いて、シー
ケンス反応を行なう工程と、（３）前記シーケンス反応
の生成物を電気泳動して、前記ＤＮＡ断片の塩基配列の
長さよりも長い部分の、前記試料ＤＮＡの塩基配列を決
定する工程と、を有することを特徴とする塩基配列決定
方法。 - 【請求項１５】（１）試料ＤＮＡを第１の制限酵素によ
り切断してＤＮＡ断片を得る工程と、（２）プライマー
を用い、前記ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型として伸長反応
を行なった後、３’末端を蛍光標識ヌクレオチドと置換
する工程と、（３）前記相補鎖を前記第１の制限酵素と
異なる第２の制限酵素により切断して、３’末端に蛍光
標識された蛍光標識プライマーを得る工程と、（４）前
記蛍光標識プライマーをを用い、前記ＤＮＡ断片の１本
鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とをもつ前記試
料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は前記試料ＤＮＡの１本鎖
を鋳型として、シーケンス反応を行なう工程と、（５）
前記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、前記ＤＮ
Ａ断片の塩基配列の長さよりも長い部分の、前記試料Ｄ
ＮＡの塩基配列を決定する工程と、を有することを特徴
とする塩基配列決定方法。 - 【請求項１６】（１）試料ＤＮＡを制限酵素により切断
してＤＮＡ断片を得る工程と、（２）前記ＤＮＡ断片の
１本鎖の塩基配列とこれに隣接する塩基配列とをもつ前
記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、又は前記試料ＤＮＡの１
本鎖と、前記ＤＮＡ断片の１本鎖とをそれぞれ鋳型とし
て、前記試料ＤＮＡの１本鎖又は前記試料ＤＮＡの１本
鎖の一部に選択的に相補鎖結合するプライマーと、前記
ＤＮＡ断片に選択的に相補鎖結合するプライマーとを用
いて、シーケンス反応を同時に行なう工程と、（３）前
記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、前記ＤＮＡ
断片の塩基配列と、前記ＤＮＡ断片の塩基配列に隣接す
る前記試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列とを同時
に決定する工程と、を有することを特徴とする塩基配列
決定方法。 - 【請求項１７】（１）試料ＤＮＡから得たＤＮＡ断片の
１本鎖の塩基配列の一部と相補的な塩基配列を３’末端
に有するプライマーを用いて相補鎖合成伸長反応を行な
い、前記ＤＮＡ断片の１本鎖の一部に相補的な塩基配列
をもつ伸長プライマーを得る工程と、 （２）（ａ）前記ＤＮＡ断片の１本鎖を鋳型とし、前記
プライマーを使用してシーケンス反応を行なう工程と、
（ｂ）前記ＤＮＡ断片の１本鎖の塩基配列とこれに隣接
する塩基配列とをもつ前記試料ＤＮＡの１本鎖の一部、
又は前記試料ＤＮＡの１本鎖を鋳型とし、前記伸長プラ
イマーを使用してシーケンス反応を行なう工程とを、進
行させる工程と、 （３）前記シーケンス反応の生成物を電気泳動して、前
記ＤＮＡ断片の塩基配列と、前記ＤＮＡ断片の塩基配列
に隣接する前記試料ＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列
とを決定する工程と、を有することを特徴とする塩基配
列決定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8242929A JPH09140400A (ja) | 1995-09-18 | 1996-09-13 | 塩基配列決定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-238141 | 1995-09-18 | ||
| JP23814195 | 1995-09-18 | ||
| JP8242929A JPH09140400A (ja) | 1995-09-18 | 1996-09-13 | 塩基配列決定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09140400A true JPH09140400A (ja) | 1997-06-03 |
Family
ID=26533550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8242929A Pending JPH09140400A (ja) | 1995-09-18 | 1996-09-13 | 塩基配列決定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09140400A (ja) |
-
1996
- 1996-09-13 JP JP8242929A patent/JPH09140400A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050308 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050705 |