JPH09300A - Ｄｎａ塩基配列決定法およびその装置 - Google Patents
Ｄｎａ塩基配列決定法およびその装置Info
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- JPH09300A JPH09300A JP7148980A JP14898095A JPH09300A JP H09300 A JPH09300 A JP H09300A JP 7148980 A JP7148980 A JP 7148980A JP 14898095 A JP14898095 A JP 14898095A JP H09300 A JPH09300 A JP H09300A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】長いＤＮＡの塩基配列決定を、あらかじめ準備
された比較的少数のプライマーを用いて、３′末端から
順次決定する効率のよい塩基配列決定方法を提供する。 【構成】鋳型ＤＮＡを１本鎖とし、その３′末端から一
定長さを相補鎖合成により２本鎖とし、２本鎖部分を酵
素で切断し、切断部にオリゴマーを結合させて新たなプ
ライマー結合部を作製して、順次塩基配列を決定して行
く。 【効果】従来の複雑な操作で手間のかかる長いＤＮＡの
塩基配列決定を簡単な操作で効率よく行うことができ
る。
された比較的少数のプライマーを用いて、３′末端から
順次決定する効率のよい塩基配列決定方法を提供する。 【構成】鋳型ＤＮＡを１本鎖とし、その３′末端から一
定長さを相補鎖合成により２本鎖とし、２本鎖部分を酵
素で切断し、切断部にオリゴマーを結合させて新たなプ
ライマー結合部を作製して、順次塩基配列を決定して行
く。 【効果】従来の複雑な操作で手間のかかる長いＤＮＡの
塩基配列決定を簡単な操作で効率よく行うことができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ塩基配列決定法に
係り、特に効率の良い塩基配列決定法およびその装置に
関する。
係り、特に効率の良い塩基配列決定法およびその装置に
関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ＤＮＡの塩基配列決定には、ＤＮ
Ａ断片を放射性標識し、ゲル電気泳動後のパターンを、
オートラジオグラフィーにより読み取っていたが、最近
蛍光標識を用いてゲル電気泳動分離を行いながら、実時
間で塩基配列を決定する装置が開発され普及してきてい
る。この装置を用いると、一度に２０〜３０種のＤＮＡ
断片の塩基配列を４００〜５００塩基長まで決定するこ
とができる。しかし、より長いＤＮＡ断片の塩基配列決
定は容易でなく、（１）ショットガン法、（２）ネステ
ィド・デリーション法、（３）ウォーキング法等、幾つ
かの方法が提案されている。上記（１）ショットガン法
は、ＤＮＡを超音波、その他の手法で小さく切断し（数
百塩基長〜数千塩基長）、プラスミド等のベクターにＤ
ＮＡ断片を埋め込み、大腸菌等に感染させた後、寒天培
養を行いＤＮＡ断片の組み込まれたベクターを持つ大腸
菌を分離、分取してＤＮＡを取り出し塩基配列を決定す
る。このプロセスでは、取り出してくるＤＮＡ断片の配
列および元のＤＮＡにおける部位などは不明であり、元
のＤＮＡ配列を得るには実質５〜１０倍のＤＮＡ配列を
決める必要があるうえ、操作が多く複雑で自動化にも不
向きな難点がある。上記（２）ネスティドデリーション
法は、ベクターに組み込まれたＤＮＡを取り出し、その
長さをあらかじめ計測し、長さ順に並べて、無駄なく長
さ順に解析を行う方法であり、重複して解析する率を３
〜４倍にまで低減することができる。しかし、この方法
は手間が掛かるうえ、クローニングなど自動化が難しい
プロセスが含まれている。上記（３）第３のウォーキン
グ法は、長いＤＮＡの塩基配列を端からまず決定する。
一度に配列が決定できる長さは４００〜５００塩基程度
である。ついで、配列決定開始地点から４００塩基前後
の決定された塩基配列と相補的なＤＮＡオリゴマーを人
工合成し、塩基配列決定のプライマーとして第２回目の
配列決定を行う。このような配列決定を順次行うことに
より、長いＤＮＡの塩基配列を決定するものである。し
かし、この方法は最も効率の良い方法であるが、配列決
定用のプライマーをその都度合成しなければならないと
いう手間が掛かる問題があった。
Ａ断片を放射性標識し、ゲル電気泳動後のパターンを、
オートラジオグラフィーにより読み取っていたが、最近
蛍光標識を用いてゲル電気泳動分離を行いながら、実時
間で塩基配列を決定する装置が開発され普及してきてい
る。この装置を用いると、一度に２０〜３０種のＤＮＡ
断片の塩基配列を４００〜５００塩基長まで決定するこ
とができる。しかし、より長いＤＮＡ断片の塩基配列決
定は容易でなく、（１）ショットガン法、（２）ネステ
ィド・デリーション法、（３）ウォーキング法等、幾つ
かの方法が提案されている。上記（１）ショットガン法
は、ＤＮＡを超音波、その他の手法で小さく切断し（数
百塩基長〜数千塩基長）、プラスミド等のベクターにＤ
ＮＡ断片を埋め込み、大腸菌等に感染させた後、寒天培
養を行いＤＮＡ断片の組み込まれたベクターを持つ大腸
菌を分離、分取してＤＮＡを取り出し塩基配列を決定す
る。このプロセスでは、取り出してくるＤＮＡ断片の配
列および元のＤＮＡにおける部位などは不明であり、元
のＤＮＡ配列を得るには実質５〜１０倍のＤＮＡ配列を
決める必要があるうえ、操作が多く複雑で自動化にも不
向きな難点がある。上記（２）ネスティドデリーション
法は、ベクターに組み込まれたＤＮＡを取り出し、その
長さをあらかじめ計測し、長さ順に並べて、無駄なく長
さ順に解析を行う方法であり、重複して解析する率を３
〜４倍にまで低減することができる。しかし、この方法
は手間が掛かるうえ、クローニングなど自動化が難しい
プロセスが含まれている。上記（３）第３のウォーキン
グ法は、長いＤＮＡの塩基配列を端からまず決定する。
一度に配列が決定できる長さは４００〜５００塩基程度
である。ついで、配列決定開始地点から４００塩基前後
の決定された塩基配列と相補的なＤＮＡオリゴマーを人
工合成し、塩基配列決定のプライマーとして第２回目の
配列決定を行う。このような配列決定を順次行うことに
より、長いＤＮＡの塩基配列を決定するものである。し
かし、この方法は最も効率の良い方法であるが、配列決
定用のプライマーをその都度合成しなければならないと
いう手間が掛かる問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述したごとく、従来
の最も効率が良いとされる上記（３）のウォーキング法
においても、配列決定用のプライマーをその都度合成し
なければならないという手間の掛かる問題があった。
の最も効率が良いとされる上記（３）のウォーキング法
においても、配列決定用のプライマーをその都度合成し
なければならないという手間の掛かる問題があった。
【０００４】本発明の目的は、従来技術における問題点
を解消し、ウォーキング法の難点、すなわち、測定の度
に行うプライマー合成の手間を省き、効率の良いＤＮＡ
塩基配列の決定法およびその装置を提供することにあ
る。
を解消し、ウォーキング法の難点、すなわち、測定の度
に行うプライマー合成の手間を省き、効率の良いＤＮＡ
塩基配列の決定法およびその装置を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記本発明の目的を達成
するために、本発明は独自の新しい手法を提案するもの
であり、基本的には鋳型ＤＮＡの３′末端側から塩基配
列を決定するものであり、また数百〜１ｋ（キロ）塩基
の長さ相補鎖合成を行い、この配列決定済みの２本鎖領
域にある制限酵素切断部を切断し、配列決定済み部分の
ＤＮＡを除去し、ついで残存部に、既知配列のＤＮＡオ
リゴマーを結合させ、この部分をプライマー結合部とし
てＤＮＡ塩基の配列決定を繰り返すことにより、従来の
ウォーキング法のように、測定の度に行うプライマー合
成の手間を省き、効率の良いＤＮＡ塩基配列の決定を行
う方法とするものである。具体的には、特許請求の範囲
に記載のような構成とするものである。すなわち、本発
明の請求項１に記載のように、ＤＮＡの塩基配列を決定
する方法において、少なくとも（１）ＤＮＡの５′末端
側を固相担体の表面に固定して、１本鎖を得るプロセス
と、（２）３′末端側にプライマーをハイブリダイズし
て塩基配列を決定するプロセスと、（３）３′末端側か
らの相補鎖合成により得られた２本鎖部分を制限酵素に
より切断し、生じた遊離ＤＮＡを除去するプロセスと、
（４）上記切断部に、２本鎖部分を含むＤＮＡオリゴマ
ーをハイブリダイズさせてプライマーとするか、もしく
は配列既知のオリゴヌクレオチドを結合し、その１部配
列と、実質相補的な配列を含むプライマーを用いて３′
末端から塩基配列を決定するプロセスによりＤＮＡの塩
基配列を決定する方法であって、少なくとも上記（３）
〜（４）のプロセスを１回以上繰り返して行い、ＤＮＡ
塩基配列を順次決定するＤＮＡ塩基配列決定方法とする
ものである。本発明は請求項２に記載のように、請求項
１において、（３）のプロセスにおける相補鎖合成は、
ＤＮＡ合成鎖長の平均値を制御可能とする条件下で相補
鎖合成を行うＤＮＡ塩基配列決定方法とするものであ
る。また、本発明は請求項３に記載のように、請求項２
において、合成ＤＮＡ相補鎖の平均鎖長の制御は、ＤＮ
Ａシーケンス反応と同様に、ＤＮＡ合成基質中にヌクレ
オチド類似物を混合して基質として用いるＤＮＡ相補鎖
合成によるＤＮＡ塩基配列決定方法とするものである。
また、本発明は請求項４に記載のように、請求項２にお
いて、ＤＮＡ相補鎖の平均合成鎖長は、鋳型となるＤＮ
Ａの配列を認識して結合するＤＮＡおよびその類似体も
しくは蛋白質により、特定部以降の相補鎖合成を障害す
る手法を用いるＤＮＡ塩基配列決定方法とするものであ
る。また、本発明は請求項５に記載のように、請求項１
において、３′末端側から部分的相補鎖合成と、それに
続く制限酵素切断により５′末端側から所定の長さのＤ
ＮＡ断片群を順次作製するプロセスを少なくとも含むＤ
ＮＡ塩基配列決定方法とするものである。また、本発明
は請求項６に記載のように、請求項１において、（３）
のプロセスで生じた切断部に、配列既知のオリゴマーを
結合させ、プライマーがハイブリダイズする部位を設け
るプロセスを含むＤＮＡ塩基配列決定方法とするもので
ある。また、本発明は請求項７に記載のように、請求項
１において、１部が２本鎖状となったプライマーを用い
て相補鎖合成するプロセスを含むＤＮＡ塩基配列決定方
法とするものである。また、本発明は請求項８に記載の
ように、請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載
のＤＮＡ塩基配列の決定を行う装置であって、（１）Ｄ
ＮＡを固相担体の表面に固定した試料ＤＮＡを作製する
手段と、（２）固相担体に固定した試料ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡ塩基配列決定反応を行う手段と、（３）固
相担体の表面に固定した試料ＤＮＡを鋳型として相補鎖
合成を行い、２本鎖部分を制限酵素で切断した後、遊離
ＤＮＡを除去する手段と、（４）上記切断部に、２本鎖
部分を含むＤＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせてプ
ライマーとするか、もしくは配列既知のオリゴヌクレオ
チドを結合し、その１部配列と、実質相補的な配列を含
むプライマーを用いて３′末端から塩基配列を決定する
手段を少なくとも備えたＤＮＡ塩基配列決定装置とする
ものである。
するために、本発明は独自の新しい手法を提案するもの
であり、基本的には鋳型ＤＮＡの３′末端側から塩基配
列を決定するものであり、また数百〜１ｋ（キロ）塩基
の長さ相補鎖合成を行い、この配列決定済みの２本鎖領
域にある制限酵素切断部を切断し、配列決定済み部分の
ＤＮＡを除去し、ついで残存部に、既知配列のＤＮＡオ
リゴマーを結合させ、この部分をプライマー結合部とし
てＤＮＡ塩基の配列決定を繰り返すことにより、従来の
ウォーキング法のように、測定の度に行うプライマー合
成の手間を省き、効率の良いＤＮＡ塩基配列の決定を行
う方法とするものである。具体的には、特許請求の範囲
に記載のような構成とするものである。すなわち、本発
明の請求項１に記載のように、ＤＮＡの塩基配列を決定
する方法において、少なくとも（１）ＤＮＡの５′末端
側を固相担体の表面に固定して、１本鎖を得るプロセス
と、（２）３′末端側にプライマーをハイブリダイズし
て塩基配列を決定するプロセスと、（３）３′末端側か
らの相補鎖合成により得られた２本鎖部分を制限酵素に
より切断し、生じた遊離ＤＮＡを除去するプロセスと、
（４）上記切断部に、２本鎖部分を含むＤＮＡオリゴマ
ーをハイブリダイズさせてプライマーとするか、もしく
は配列既知のオリゴヌクレオチドを結合し、その１部配
列と、実質相補的な配列を含むプライマーを用いて３′
末端から塩基配列を決定するプロセスによりＤＮＡの塩
基配列を決定する方法であって、少なくとも上記（３）
〜（４）のプロセスを１回以上繰り返して行い、ＤＮＡ
塩基配列を順次決定するＤＮＡ塩基配列決定方法とする
ものである。本発明は請求項２に記載のように、請求項
１において、（３）のプロセスにおける相補鎖合成は、
ＤＮＡ合成鎖長の平均値を制御可能とする条件下で相補
鎖合成を行うＤＮＡ塩基配列決定方法とするものであ
る。また、本発明は請求項３に記載のように、請求項２
において、合成ＤＮＡ相補鎖の平均鎖長の制御は、ＤＮ
Ａシーケンス反応と同様に、ＤＮＡ合成基質中にヌクレ
オチド類似物を混合して基質として用いるＤＮＡ相補鎖
合成によるＤＮＡ塩基配列決定方法とするものである。
また、本発明は請求項４に記載のように、請求項２にお
いて、ＤＮＡ相補鎖の平均合成鎖長は、鋳型となるＤＮ
Ａの配列を認識して結合するＤＮＡおよびその類似体も
しくは蛋白質により、特定部以降の相補鎖合成を障害す
る手法を用いるＤＮＡ塩基配列決定方法とするものであ
る。また、本発明は請求項５に記載のように、請求項１
において、３′末端側から部分的相補鎖合成と、それに
続く制限酵素切断により５′末端側から所定の長さのＤ
ＮＡ断片群を順次作製するプロセスを少なくとも含むＤ
ＮＡ塩基配列決定方法とするものである。また、本発明
は請求項６に記載のように、請求項１において、（３）
のプロセスで生じた切断部に、配列既知のオリゴマーを
結合させ、プライマーがハイブリダイズする部位を設け
るプロセスを含むＤＮＡ塩基配列決定方法とするもので
ある。また、本発明は請求項７に記載のように、請求項
１において、１部が２本鎖状となったプライマーを用い
て相補鎖合成するプロセスを含むＤＮＡ塩基配列決定方
法とするものである。また、本発明は請求項８に記載の
ように、請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載
のＤＮＡ塩基配列の決定を行う装置であって、（１）Ｄ
ＮＡを固相担体の表面に固定した試料ＤＮＡを作製する
手段と、（２）固相担体に固定した試料ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡ塩基配列決定反応を行う手段と、（３）固
相担体の表面に固定した試料ＤＮＡを鋳型として相補鎖
合成を行い、２本鎖部分を制限酵素で切断した後、遊離
ＤＮＡを除去する手段と、（４）上記切断部に、２本鎖
部分を含むＤＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせてプ
ライマーとするか、もしくは配列既知のオリゴヌクレオ
チドを結合し、その１部配列と、実質相補的な配列を含
むプライマーを用いて３′末端から塩基配列を決定する
手段を少なくとも備えたＤＮＡ塩基配列決定装置とする
ものである。
【０００６】
【作用】本発明のＤＮＡ塩基配列決定法は、請求項１に
記載のように、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法におい
て、少なくとも（１）ＤＮＡの５′末端側を固相担体の
表面に固定して、１本鎖を得るプロセスと、（２）３′
末端側にプライマーをハイブリダイズして塩基配列を決
定するプロセスと、（３）３′末端側からの相補鎖合成
により得られた２本鎖部分を制限酵素により切断し、生
じた遊離ＤＮＡを除去するプロセスと、（４）上記切断
部に、２本鎖部分を含むＤＮＡオリゴマーをハイブリダ
イズさせてプライマーとするか、もしくは配列既知のオ
リゴヌクレオチドを結合し、その１部配列と、実質相補
的な配列を含むプライマーを用いて３′末端から塩基配
列を決定するプロセスによりＤＮＡの塩基配列を決定す
る方法であって、少なくとも上記（３）〜（４）のプロ
セスを１回以上繰り返して行い、ＤＮＡ塩基配列を順次
決定するＤＮＡ塩基配列決定方法とするものである。こ
のように、塩基配列を決定して歩行していく長さを、制
限酵素で切断される間隔とし、この切断部に既知配列を
結合させてプライマー配列の１部とすることにより、あ
まり多くない若干の種類のプライマーをあらかじめ用意
することで、プライマー合成の手間を省いている。ま
た、鋳型ＤＮＡの３′末端側から、あまり長くない領域
について相補鎖合成し、２本鎖となった領域を切断する
ことを繰り返し行うことで、ＤＮＡの３′末端側から少
しずつＤＮＡを削っては配列決定を繰り返すことで、極
めて効率のよいＤＮＡ塩基の配列決定歩行を実現できる
効果がある。また、本発明は請求項２に記載のように、
請求項１において、（３）のプロセスにおける相補鎖合
成は、ＤＮＡ合成鎖長の平均値を制御可能とする条件下
で相補鎖合成を行うＤＮＡ塩基配列決定方法とすること
により、上記請求項１の共通の効果に加えて、塩基配列
を決定して歩行していく長さを任意に制御することがで
き、いっそう効率の良い塩基配列の決定を行うことがで
きる。また、本発明は請求項３に記載のように、請求項
２において、合成ＤＮＡ相補鎖の平均鎖長の制御は、Ｄ
ＮＡシーケンス反応と同様に、ＤＮＡ合成基質中にヌク
レオチド類似物を混合して基質として用いるＤＮＡ相補
鎖合成によるＤＮＡ塩基配列決定方法とすることによ
り、合成ＤＮＡ相補鎖の平均鎖長の制御が容易となり、
上記請求項１の共通の効果に加えて、効率の良い塩基配
列の決定を行うことができる。また、本発明は請求項４
に記載のように、請求項２において、ＤＮＡ相補鎖の平
均合成鎖長は、鋳型となるＤＮＡの配列を認識して結合
するＤＮＡおよびその類似体もしくは蛋白質により、特
定部以降の相補鎖合成を障害する手法を用いるＤＮＡ塩
基配列決定方法とすることにより、ＤＮＡ相補鎖の平均
合成鎖長の制御が容易となり、上記請求項１の共通の効
果に加えて、塩基配列の決定を効率良く行うことができ
る。また、本発明は請求項５に記載のように、請求項１
において、３′末端側から部分的相補鎖合成と、それに
続く制限酵素切断により５′末端側から所定の長さのＤ
ＮＡ断片群を順次作製するプロセスを少なくとも含むＤ
ＮＡ塩基配列決定方法とすることにより、上記請求項１
の共通の効果に加えて、いっそう効率の良い塩基配列の
決定を行うことができる。また、本発明は請求項６に記
載のように、請求項１において、（３）のプロセスで生
じた切断部に、配列既知のオリゴマーを結合させ、プラ
イマーがハイブリダイズする部位を設けるプロセスを含
むＤＮＡ塩基配列決定方法とすることにより、上記請求
項１の共通の効果に加えて、いっそう効率の良い塩基配
列の決定を行うことができる。また、本発明は請求項７
に記載のように、請求項１において、１部が２本鎖状と
なったプライマーを用いて相補鎖合成するプロセスを含
むＤＮＡ塩基配列決定方法とすることにより、上記請求
項１の共通の効果に加えて、塩基配列の決定を効率良く
行うことができる。また、本発明は請求項８に記載のよ
うに、請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の
ＤＮＡ塩基配列の決定を行う装置であって、（１）ＤＮ
Ａを固相担体の表面に固定した試料ＤＮＡを作製する手
段と、（２）固相担体に固定した試料ＤＮＡを鋳型とし
て、ＤＮＡ塩基配列決定反応を行う手段と、（３）固相
担体の表面に固定した試料ＤＮＡを鋳型として相補鎖合
成を行い、２本鎖部分を制限酵素で切断した後、遊離Ｄ
ＮＡを除去する手段と、（４）上記切断部に、２本鎖部
分を含むＤＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせてプラ
イマーとするか、もしくは配列既知のオリゴヌクレオチ
ドを結合し、その１部配列と、実質相補的な配列を含む
プライマーを用いて３′末端から塩基配列を決定する手
段を少なくとも備えたＤＮＡ塩基配列決定装置とするも
のである。このような装置構成とすることにより、上記
請求項１のＤＮＡ塩基配列決定法における効果と同様
に、ＤＮＡの３′末端側から少しずつＤＮＡを削っては
配列決定を繰り返すことで、極めて効率のよいＤＮＡ塩
基の配列決定歩行を実施する装置を実現できる効果があ
る。
記載のように、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法におい
て、少なくとも（１）ＤＮＡの５′末端側を固相担体の
表面に固定して、１本鎖を得るプロセスと、（２）３′
末端側にプライマーをハイブリダイズして塩基配列を決
定するプロセスと、（３）３′末端側からの相補鎖合成
により得られた２本鎖部分を制限酵素により切断し、生
じた遊離ＤＮＡを除去するプロセスと、（４）上記切断
部に、２本鎖部分を含むＤＮＡオリゴマーをハイブリダ
イズさせてプライマーとするか、もしくは配列既知のオ
リゴヌクレオチドを結合し、その１部配列と、実質相補
的な配列を含むプライマーを用いて３′末端から塩基配
列を決定するプロセスによりＤＮＡの塩基配列を決定す
る方法であって、少なくとも上記（３）〜（４）のプロ
セスを１回以上繰り返して行い、ＤＮＡ塩基配列を順次
決定するＤＮＡ塩基配列決定方法とするものである。こ
のように、塩基配列を決定して歩行していく長さを、制
限酵素で切断される間隔とし、この切断部に既知配列を
結合させてプライマー配列の１部とすることにより、あ
まり多くない若干の種類のプライマーをあらかじめ用意
することで、プライマー合成の手間を省いている。ま
た、鋳型ＤＮＡの３′末端側から、あまり長くない領域
について相補鎖合成し、２本鎖となった領域を切断する
ことを繰り返し行うことで、ＤＮＡの３′末端側から少
しずつＤＮＡを削っては配列決定を繰り返すことで、極
めて効率のよいＤＮＡ塩基の配列決定歩行を実現できる
効果がある。また、本発明は請求項２に記載のように、
請求項１において、（３）のプロセスにおける相補鎖合
成は、ＤＮＡ合成鎖長の平均値を制御可能とする条件下
で相補鎖合成を行うＤＮＡ塩基配列決定方法とすること
により、上記請求項１の共通の効果に加えて、塩基配列
を決定して歩行していく長さを任意に制御することがで
き、いっそう効率の良い塩基配列の決定を行うことがで
きる。また、本発明は請求項３に記載のように、請求項
２において、合成ＤＮＡ相補鎖の平均鎖長の制御は、Ｄ
ＮＡシーケンス反応と同様に、ＤＮＡ合成基質中にヌク
レオチド類似物を混合して基質として用いるＤＮＡ相補
鎖合成によるＤＮＡ塩基配列決定方法とすることによ
り、合成ＤＮＡ相補鎖の平均鎖長の制御が容易となり、
上記請求項１の共通の効果に加えて、効率の良い塩基配
列の決定を行うことができる。また、本発明は請求項４
に記載のように、請求項２において、ＤＮＡ相補鎖の平
均合成鎖長は、鋳型となるＤＮＡの配列を認識して結合
するＤＮＡおよびその類似体もしくは蛋白質により、特
定部以降の相補鎖合成を障害する手法を用いるＤＮＡ塩
基配列決定方法とすることにより、ＤＮＡ相補鎖の平均
合成鎖長の制御が容易となり、上記請求項１の共通の効
果に加えて、塩基配列の決定を効率良く行うことができ
る。また、本発明は請求項５に記載のように、請求項１
において、３′末端側から部分的相補鎖合成と、それに
続く制限酵素切断により５′末端側から所定の長さのＤ
ＮＡ断片群を順次作製するプロセスを少なくとも含むＤ
ＮＡ塩基配列決定方法とすることにより、上記請求項１
の共通の効果に加えて、いっそう効率の良い塩基配列の
決定を行うことができる。また、本発明は請求項６に記
載のように、請求項１において、（３）のプロセスで生
じた切断部に、配列既知のオリゴマーを結合させ、プラ
イマーがハイブリダイズする部位を設けるプロセスを含
むＤＮＡ塩基配列決定方法とすることにより、上記請求
項１の共通の効果に加えて、いっそう効率の良い塩基配
列の決定を行うことができる。また、本発明は請求項７
に記載のように、請求項１において、１部が２本鎖状と
なったプライマーを用いて相補鎖合成するプロセスを含
むＤＮＡ塩基配列決定方法とすることにより、上記請求
項１の共通の効果に加えて、塩基配列の決定を効率良く
行うことができる。また、本発明は請求項８に記載のよ
うに、請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の
ＤＮＡ塩基配列の決定を行う装置であって、（１）ＤＮ
Ａを固相担体の表面に固定した試料ＤＮＡを作製する手
段と、（２）固相担体に固定した試料ＤＮＡを鋳型とし
て、ＤＮＡ塩基配列決定反応を行う手段と、（３）固相
担体の表面に固定した試料ＤＮＡを鋳型として相補鎖合
成を行い、２本鎖部分を制限酵素で切断した後、遊離Ｄ
ＮＡを除去する手段と、（４）上記切断部に、２本鎖部
分を含むＤＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせてプラ
イマーとするか、もしくは配列既知のオリゴヌクレオチ
ドを結合し、その１部配列と、実質相補的な配列を含む
プライマーを用いて３′末端から塩基配列を決定する手
段を少なくとも備えたＤＮＡ塩基配列決定装置とするも
のである。このような装置構成とすることにより、上記
請求項１のＤＮＡ塩基配列決定法における効果と同様
に、ＤＮＡの３′末端側から少しずつＤＮＡを削っては
配列決定を繰り返すことで、極めて効率のよいＤＮＡ塩
基の配列決定歩行を実施する装置を実現できる効果があ
る。
【０００７】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げ、図面を用いて
さらに詳細に説明する。 〈実施例１〉本実施例においては、図１（ａ）〜（ｇ）
に示すように、ヌクレオチド類似物を添加して相補鎖合
成を行い、相補鎖合成で生成するＤＮＡの平均鎖長を調
製する場合を示す。目的とするＤＮＡの５′末端側を磁
気ビーズに固定した試料ＤＮＡ１を用意する。この試料
ＤＮＡの調製法は〔Clin.Chem.37,1626-1632（1991）〕
に記載のビオチン化プライマーとストレプロトアビジン
固定化磁気ビーズを用いる方法と同様である。この鋳型
ＤＮＡの３′末端には既知配列のプライマー結合部位
が、図１（ａ）のプライマー結合部３に示すように、ラ
イゲーション等により、あらかじめ結合されている。プ
ライマー配列として、よく用いられるものは、表１に示
す配列番号１のユニバーサルプライマーである。
さらに詳細に説明する。 〈実施例１〉本実施例においては、図１（ａ）〜（ｇ）
に示すように、ヌクレオチド類似物を添加して相補鎖合
成を行い、相補鎖合成で生成するＤＮＡの平均鎖長を調
製する場合を示す。目的とするＤＮＡの５′末端側を磁
気ビーズに固定した試料ＤＮＡ１を用意する。この試料
ＤＮＡの調製法は〔Clin.Chem.37,1626-1632（1991）〕
に記載のビオチン化プライマーとストレプロトアビジン
固定化磁気ビーズを用いる方法と同様である。この鋳型
ＤＮＡの３′末端には既知配列のプライマー結合部位
が、図１（ａ）のプライマー結合部３に示すように、ラ
イゲーション等により、あらかじめ結合されている。プ
ライマー配列として、よく用いられるものは、表１に示
す配列番号１のユニバーサルプライマーである。
【０００８】
【表１】
【０００９】図１（ａ）〜（ｇ）は、本実施例における
ＤＮＡ塩基配列決定法の手順を示す説明図である。操作
に先立ち、〔Ｓａｕ ３Ａ１〕などの３〜５種の制限酵
素の切断部配列と既知配列（通常ユニバーサルプライマ
ー配列を用いるが、他の配列であってもよい）の一部を
含むプライマーを用意するが、これら既知配列の３′側
に任意の２塩基あるいは３塩基を付加したプライマーを
制限酵素ごとに１６種（４塩基種×４塩基種）用意す
る。制限酵素としては２００塩基〜４００塩基ごとに切
断部の現われる４塩基認識酵素を用いる。用途によって
は、６塩基認識酵素などを用いてもよい。数種の制限酵
素を用意するのは、単一の制限酵素を用いた場合、切断
部が長い塩基長にわたって現われないことがあるからで
ある。このような場合は、別の４塩基認識酵素を用いて
切断する。鋳型ＤＮＡを精製して、反応チップに入れ、
プライマー、シーケンシング試薬を加えてシーケンシン
グ反応を行う。反応試薬混合液中のダイデオキシヌクレ
オチドｄｄＮＴＰとデオキシヌクレオチドｄＮＴＰの比
は、図４（ａ）〜（ｇ）のシーケンシング反応プロトコ
ールに示すように、熱サイクル下で反応を行う。もちろ
ん、熱サイクルを用いなくてもよいが、より多くの鋳型
ＤＮＡを必要とする。反応条件などについては、図４
（ａ）〜（ｇ）の各反応過程で示した通りである。ｄｄ
ＮＴＰが取り込まれると、相補鎖伸長反応は停止するの
で、ｄｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ比を大きくすると、平均して
短い断片が多くなる。ここで用いた熱サイクルシーケン
シング反応では、まず、図１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に
示すように、相補鎖合成を用いたシーケンシング用ＤＮ
Ａ断片（合成されたＤＮＡ２本鎖部）２０の作製を行
う。ついで、昇温し、合成鎖（合成されたＤＮＡ２本鎖
部）２０を遊離し、鋳型ＤＮＡを１本鎖とする。つい
で、降温し、プライマーをハイブリダイズさせ、シーケ
ンシング反応を繰り返す。この結果、鋳型ＤＮＡのコピ
ー数の何倍ものシーケンシング反応生成物であるＤＮＡ
断片（合成されたＤＮＡ２本鎖部）２０を得ることがで
きる。この生成したＤＮＡ断片２０を取り出し、常法に
したがい塩基配列の決定を行う。一方、残された鋳型Ｄ
ＮＡには、シーケンシング反応で生成した種々長さのＤ
ＮＡ断片（合成されたＤＮＡ２本鎖部）２０の１部がハ
イブリダイズした状態にある。長いものでは１ｋ（キ
ロ）塩基以上のものもあるが、大部分は４００〜６００
塩基以下である。塩基配列決定した情報をもとに、４０
０塩基長近傍にある４塩基認識制限酵素を調べる。 図
１においては、第１切断部１１、第２切断部１２、第３
切断部１３に相当する。ついで、その制限酵素を用いて
合成相補のハイブリダイズした鋳型ＤＮＡを切断する
〔図１（ｄ）〕。２本鎖部分は、鋳型ＤＮＡの３′末端
から出発して種々長さのものが約１ｋ塩基までの長さで
種々のものが存在する。制限酵素で完全に切断しても、
切断部２１は鋳型ＤＮＡの３′末端から数箇所に限定さ
れ、第４切断部１４のように、１本鎖部分は切断されな
い〔図１（ｅ）、（ｆ）〕。相補鎖合成がシーケンス反
応でなく、通常の（ｄｄＮＴＰを含まない）合成反応の
場合には、相補鎖は固相担体に固定された５′末端側ま
で延び、すべてが２本鎖状となる。この場合、制限酵素
で完全に消化すると、５′末端側が固相担体に固定され
た鋳型ＤＮＡは、５′末端から最初の制限酵素切断部で
切断された短いＤＮＡ断片だけとなる。このため５′末
端から順次配列決定をする試料として使用することがで
きない。一方、制限酵素量あるいは反応時間を減らし２
本鎖ＤＮＡを部分消化すると、固相単体に固定された末
端から種々長さのＤＮＡ断片が得られる。元のＤＮＡの
長さが数ｋ塩基（５〜１０Ｋ塩基）と長い場合には、非
常に多くの塩基断片種が生じるので、それらを分離、分
取せずに配列決定することは困難である。他方、ここで
用いたシーケンス反応を用いる手法では、合成されたＤ
ＮＡ２本鎖部２０のように、鋳型ＤＮＡの３′末端（固
相坦体に固定された５′側とは逆の側）から種々の長さ
で形成される。各ＤＮＡ断片（合成されたＤＮＡ２本鎖
部）２０のコピー数は長くなるほど減少し、１ｋ塩基長
以上のものは非常に少ない。このため切断部２１は、
３′末端から１ｋ塩基以内で主として起こる。ｄｄＮＴ
Ｐ／ｄＮＴＰ比をさらに大きくすると、よりいっそう短
い平均ＤＮＡ断片長が得られる。 この２本鎖部分であ
る第１切断部１１、第２切断部１２、第３切断部１３
を、４あるいは６塩基認識酵素で切断すると、固相担体
２に固定されたＤＮＡ断片（切断され固相に残ったＤＮ
Ａ断片）２２が得られる。切断部２１にはライゲーショ
ン、その他（トランスクリプターゼを用い、１本鎖とし
た３′末端にポリＡ鎖などをつけても良い。）により既
知配列（ライゲーションで導入した既知配列部）２３を
接合し、準備したプライマーが安定にハイブリダイズで
きるようにする。４塩基認識酵素の切断部２１が、この
２本鎖領域に現われる平均回数は、鎖長１ｋ塩基のとき
には４回である。１回の配列決定で決定できる塩基長は
４００〜６００塩基であり、この中に切断部２１は平均
２箇所現われる。これら切断部２１に続く３塩基が同じ
配列である確率は１／６４と非常に小さい。切断部２１
に続く３′側の二つの配列が任意のプライマー１６種
と、三つの配列が任意のプライマー６４種を用意してお
けば、次の配列決定開始部にだけ完全にハイブリダイズ
するプライマーを選択することは容易である。図１
（ａ）〜（ｇ）は、この様子を模式的に示したものであ
る。試料ＤＮＡ １として、Ｍ１３ ｍｐ１８と、表２に
示す配列番号２記載のプライマーを用い、シーケンシン
グ反応を行い４塩基認識酵素Ｓａｕ ３Ａ１で切断する
と、最初のプライマーハイブリダイズ部から２９６塩
基、３９６塩基、５４５塩基のところで切断される。こ
れらを、３′末端から近い順に、第１、第２…第ｎ切断
部と呼ぶ。さらに長い切断部位には４５７７塩基、５０
８８塩基などがあるが、合成相補鎖が延びないので、こ
こで切断されるＤＮＡのコピー数は非常に少なく、前３
者の１／１０以下である。
ＤＮＡ塩基配列決定法の手順を示す説明図である。操作
に先立ち、〔Ｓａｕ ３Ａ１〕などの３〜５種の制限酵
素の切断部配列と既知配列（通常ユニバーサルプライマ
ー配列を用いるが、他の配列であってもよい）の一部を
含むプライマーを用意するが、これら既知配列の３′側
に任意の２塩基あるいは３塩基を付加したプライマーを
制限酵素ごとに１６種（４塩基種×４塩基種）用意す
る。制限酵素としては２００塩基〜４００塩基ごとに切
断部の現われる４塩基認識酵素を用いる。用途によって
は、６塩基認識酵素などを用いてもよい。数種の制限酵
素を用意するのは、単一の制限酵素を用いた場合、切断
部が長い塩基長にわたって現われないことがあるからで
ある。このような場合は、別の４塩基認識酵素を用いて
切断する。鋳型ＤＮＡを精製して、反応チップに入れ、
プライマー、シーケンシング試薬を加えてシーケンシン
グ反応を行う。反応試薬混合液中のダイデオキシヌクレ
オチドｄｄＮＴＰとデオキシヌクレオチドｄＮＴＰの比
は、図４（ａ）〜（ｇ）のシーケンシング反応プロトコ
ールに示すように、熱サイクル下で反応を行う。もちろ
ん、熱サイクルを用いなくてもよいが、より多くの鋳型
ＤＮＡを必要とする。反応条件などについては、図４
（ａ）〜（ｇ）の各反応過程で示した通りである。ｄｄ
ＮＴＰが取り込まれると、相補鎖伸長反応は停止するの
で、ｄｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ比を大きくすると、平均して
短い断片が多くなる。ここで用いた熱サイクルシーケン
シング反応では、まず、図１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に
示すように、相補鎖合成を用いたシーケンシング用ＤＮ
Ａ断片（合成されたＤＮＡ２本鎖部）２０の作製を行
う。ついで、昇温し、合成鎖（合成されたＤＮＡ２本鎖
部）２０を遊離し、鋳型ＤＮＡを１本鎖とする。つい
で、降温し、プライマーをハイブリダイズさせ、シーケ
ンシング反応を繰り返す。この結果、鋳型ＤＮＡのコピ
ー数の何倍ものシーケンシング反応生成物であるＤＮＡ
断片（合成されたＤＮＡ２本鎖部）２０を得ることがで
きる。この生成したＤＮＡ断片２０を取り出し、常法に
したがい塩基配列の決定を行う。一方、残された鋳型Ｄ
ＮＡには、シーケンシング反応で生成した種々長さのＤ
ＮＡ断片（合成されたＤＮＡ２本鎖部）２０の１部がハ
イブリダイズした状態にある。長いものでは１ｋ（キ
ロ）塩基以上のものもあるが、大部分は４００〜６００
塩基以下である。塩基配列決定した情報をもとに、４０
０塩基長近傍にある４塩基認識制限酵素を調べる。 図
１においては、第１切断部１１、第２切断部１２、第３
切断部１３に相当する。ついで、その制限酵素を用いて
合成相補のハイブリダイズした鋳型ＤＮＡを切断する
〔図１（ｄ）〕。２本鎖部分は、鋳型ＤＮＡの３′末端
から出発して種々長さのものが約１ｋ塩基までの長さで
種々のものが存在する。制限酵素で完全に切断しても、
切断部２１は鋳型ＤＮＡの３′末端から数箇所に限定さ
れ、第４切断部１４のように、１本鎖部分は切断されな
い〔図１（ｅ）、（ｆ）〕。相補鎖合成がシーケンス反
応でなく、通常の（ｄｄＮＴＰを含まない）合成反応の
場合には、相補鎖は固相担体に固定された５′末端側ま
で延び、すべてが２本鎖状となる。この場合、制限酵素
で完全に消化すると、５′末端側が固相担体に固定され
た鋳型ＤＮＡは、５′末端から最初の制限酵素切断部で
切断された短いＤＮＡ断片だけとなる。このため５′末
端から順次配列決定をする試料として使用することがで
きない。一方、制限酵素量あるいは反応時間を減らし２
本鎖ＤＮＡを部分消化すると、固相単体に固定された末
端から種々長さのＤＮＡ断片が得られる。元のＤＮＡの
長さが数ｋ塩基（５〜１０Ｋ塩基）と長い場合には、非
常に多くの塩基断片種が生じるので、それらを分離、分
取せずに配列決定することは困難である。他方、ここで
用いたシーケンス反応を用いる手法では、合成されたＤ
ＮＡ２本鎖部２０のように、鋳型ＤＮＡの３′末端（固
相坦体に固定された５′側とは逆の側）から種々の長さ
で形成される。各ＤＮＡ断片（合成されたＤＮＡ２本鎖
部）２０のコピー数は長くなるほど減少し、１ｋ塩基長
以上のものは非常に少ない。このため切断部２１は、
３′末端から１ｋ塩基以内で主として起こる。ｄｄＮＴ
Ｐ／ｄＮＴＰ比をさらに大きくすると、よりいっそう短
い平均ＤＮＡ断片長が得られる。 この２本鎖部分であ
る第１切断部１１、第２切断部１２、第３切断部１３
を、４あるいは６塩基認識酵素で切断すると、固相担体
２に固定されたＤＮＡ断片（切断され固相に残ったＤＮ
Ａ断片）２２が得られる。切断部２１にはライゲーショ
ン、その他（トランスクリプターゼを用い、１本鎖とし
た３′末端にポリＡ鎖などをつけても良い。）により既
知配列（ライゲーションで導入した既知配列部）２３を
接合し、準備したプライマーが安定にハイブリダイズで
きるようにする。４塩基認識酵素の切断部２１が、この
２本鎖領域に現われる平均回数は、鎖長１ｋ塩基のとき
には４回である。１回の配列決定で決定できる塩基長は
４００〜６００塩基であり、この中に切断部２１は平均
２箇所現われる。これら切断部２１に続く３塩基が同じ
配列である確率は１／６４と非常に小さい。切断部２１
に続く３′側の二つの配列が任意のプライマー１６種
と、三つの配列が任意のプライマー６４種を用意してお
けば、次の配列決定開始部にだけ完全にハイブリダイズ
するプライマーを選択することは容易である。図１
（ａ）〜（ｇ）は、この様子を模式的に示したものであ
る。試料ＤＮＡ １として、Ｍ１３ ｍｐ１８と、表２に
示す配列番号２記載のプライマーを用い、シーケンシン
グ反応を行い４塩基認識酵素Ｓａｕ ３Ａ１で切断する
と、最初のプライマーハイブリダイズ部から２９６塩
基、３９６塩基、５４５塩基のところで切断される。こ
れらを、３′末端から近い順に、第１、第２…第ｎ切断
部と呼ぶ。さらに長い切断部位には４５７７塩基、５０
８８塩基などがあるが、合成相補鎖が延びないので、こ
こで切断されるＤＮＡのコピー数は非常に少なく、前３
者の１／１０以下である。
【００１０】
【表２】
【００１１】表３に示す配列番号３と、表４に示す配列
番号４のオリゴマーを結合させた後、選択プライマーと
して表５に示す配列番号５を用いると、表６の配列番号
６に示したような配列結果が得られ、２９６塩基以降の
配列が決定できる。
番号４のオリゴマーを結合させた後、選択プライマーと
して表５に示す配列番号５を用いると、表６の配列番号
６に示したような配列結果が得られ、２９６塩基以降の
配列が決定できる。
【００１２】
【表３】
【００１３】
【表４】
【００１４】
【表５】
【００１５】
【表６】
【００１６】シーケンシング反応がＴａｑポリメレース
を用いた熱サイクル反応の場合には、反応終了時には図
２（ａ）〜（ｈ）に示したように、前回の酵素切断で２
本鎖部分が短く、第１切断部１１の部位に達せず、制限
酵素切断で切られずに長いまま残ったＤＮＡ断片４に
も、再ハイブリダイズした合成ＤＮＡ鎖５０で示すよう
にハイブリダイズする。これら２本鎖ＤＮＡを、制限酵
素を用いて再度切断すると第２切断部１２以降が、再ハ
イブリダイズした合成ＤＮＡ鎖３１のように、相補鎖の
長さに応じて切断されるので、上述の操作を繰り返すこ
とにより、順次塩基配列を決定することができる。本実
施例では、制限酵素の３′末端に、まず既知オリゴマー
を結合させてからプライマーをハイブリダイズしたが、
プライマーとその既知オリゴマーをハイブリダイズさせ
２本鎖オリゴマーとして、これをＤＮＡ断片にハイブリ
ダイズさせてプライマーとして機能させてもよい。
を用いた熱サイクル反応の場合には、反応終了時には図
２（ａ）〜（ｈ）に示したように、前回の酵素切断で２
本鎖部分が短く、第１切断部１１の部位に達せず、制限
酵素切断で切られずに長いまま残ったＤＮＡ断片４に
も、再ハイブリダイズした合成ＤＮＡ鎖５０で示すよう
にハイブリダイズする。これら２本鎖ＤＮＡを、制限酵
素を用いて再度切断すると第２切断部１２以降が、再ハ
イブリダイズした合成ＤＮＡ鎖３１のように、相補鎖の
長さに応じて切断されるので、上述の操作を繰り返すこ
とにより、順次塩基配列を決定することができる。本実
施例では、制限酵素の３′末端に、まず既知オリゴマー
を結合させてからプライマーをハイブリダイズしたが、
プライマーとその既知オリゴマーをハイブリダイズさせ
２本鎖オリゴマーとして、これをＤＮＡ断片にハイブリ
ダイズさせてプライマーとして機能させてもよい。
【００１７】〈実施例２〉本実施例においては、鋳型Ｄ
ＮＡの３′末端側の限られた領域を２本鎖状態とするの
に、ＤＮＡ塩基配列を認識して結合する蛋白質あるいは
ＤＮＡオリゴマーなどを用いる塩基配列法について説明
する。例として、反応阻害ＤＮＡオリゴマーを用いる場
合について述べる。試料ＤＮＡとして、Ｍ１３ ｍｐ１
８を用いた。 相補鎖合成を阻害するオリゴマーとして
は、Ｍａｅ ＩＩＩ切断部にハイブリダイズするオリゴ
マーを選び、その配列は５′ＧＴＸＡＣＸＸＹＹＹであ
る。Ｘは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの混合物、あるいはどの塩基
にもハイブリダイズするヌクレオチドアナログ〔Natur
369,492-493,（1994）〕記載の1-（2'-デオキシ-β-d-
リーボフラノシル）-3-ニトロピロール（1-（2'-deoxy-
β-d-ribofuranosyl）-3-nitoropyrrde）を使用した。
Ｙは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔのいずれかであり、６４種のオリ
ゴマーをあらかじめ用意する。このオリゴマーのいずれ
かがＤＮＡ中に現われる平均出現頻度は、約３００塩基
に１回である。まず、図３（ａ）〜（ｆ）に示すよう
に、３′末端のプライミング部(プライマー結合部)１０
０に、プライマーを結合させ、シーケンシング反応を行
う。得られた生成物を用いて配列決定を行う。配列決定
端に近いところにある反応阻害ＤＮＡオリゴマー１０１
（表７の配列番号７に示す）ＧＴＸＡＣＸＸＹ1Ｙ2Ｙ3
のハイブリダイズ位置を調べ、Ｙ1、Ｙ2およびＹ3を決
めて、反応阻害ＤＮＡオリゴマー１０１を選択する。
ＮＡの３′末端側の限られた領域を２本鎖状態とするの
に、ＤＮＡ塩基配列を認識して結合する蛋白質あるいは
ＤＮＡオリゴマーなどを用いる塩基配列法について説明
する。例として、反応阻害ＤＮＡオリゴマーを用いる場
合について述べる。試料ＤＮＡとして、Ｍ１３ ｍｐ１
８を用いた。 相補鎖合成を阻害するオリゴマーとして
は、Ｍａｅ ＩＩＩ切断部にハイブリダイズするオリゴ
マーを選び、その配列は５′ＧＴＸＡＣＸＸＹＹＹであ
る。Ｘは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの混合物、あるいはどの塩基
にもハイブリダイズするヌクレオチドアナログ〔Natur
369,492-493,（1994）〕記載の1-（2'-デオキシ-β-d-
リーボフラノシル）-3-ニトロピロール（1-（2'-deoxy-
β-d-ribofuranosyl）-3-nitoropyrrde）を使用した。
Ｙは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔのいずれかであり、６４種のオリ
ゴマーをあらかじめ用意する。このオリゴマーのいずれ
かがＤＮＡ中に現われる平均出現頻度は、約３００塩基
に１回である。まず、図３（ａ）〜（ｆ）に示すよう
に、３′末端のプライミング部(プライマー結合部)１０
０に、プライマーを結合させ、シーケンシング反応を行
う。得られた生成物を用いて配列決定を行う。配列決定
端に近いところにある反応阻害ＤＮＡオリゴマー１０１
（表７の配列番号７に示す）ＧＴＸＡＣＸＸＹ1Ｙ2Ｙ3
のハイブリダイズ位置を調べ、Ｙ1、Ｙ2およびＹ3を決
めて、反応阻害ＤＮＡオリゴマー１０１を選択する。
【００１８】
【表７】
【００１９】鋳型ＤＮＡにオリゴマーをハイブリダイズ
させ、プライマーを用いて相補鎖合成反応を行う。ＤＮ
Ａ鎖が短いので１０℃以下の温度で反応させる必要があ
り、本実施例では１０℃とした。鋳型ＤＮＡ（Ｍ１３）
に加えてＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase）、Sequencin
g用プライマー、反応基質および反応阻害用オリゴマー
１０１（３′末端は相補鎖合成しないように化学処理し
てある）を加えて、相補鎖合成反応を行う。本実施例で
は、反応阻害オリゴマーはプライマーから８３９塩基目
にあり、合成鎖長は約８３５塩基である。 生成物を４
塩基認識酵素Ｓａｕ ３Ａ１で切断すると、塩基長さが
約１００、１４４、２９６の２本鎖の塩基が第１切断部
１１、第２切断部１２、第３切断部１３で脱落し、この
脱落した長さだけ３′末端から短くなったＤＮＡ断片を
得ることができる。 切断部１０２には、ライゲーショ
ンにより既知配列を持ったオリゴマー（ライゲーション
で導入した既知配列部）１０４を結合させる。もちろ
ん、ターミナルトランスフェラーゼなどを用い、ヌクレ
オチドを末端に結合させていってもよい。以下の操作は
実施例１と同様であり、新たなプライマーを用いてシー
ケンシングを行い、ついでＤＮＡの切断を行う。この操
作を順次繰り返し行う。また、ハイブリダイズする阻止
オリゴマーを、配列決定領域の外に取ることもできる。
この場合、例えばＹ1＝Ｇとすると、オリゴマーが現わ
れる頻度は五つのヌクレオチドの種類と順序が固定され
ているので、約１ｋ塩基に１度となる。Ｙ2、Ｙ3を４種
の塩基の混合、すなわちＸとしてハイブリダイズさせる
と、このオリゴマーは平均１ｋ塩基ごとにハイブリダイ
ズすることになる。相補鎖合成は、最初のハイブリダイ
ズ部位で停止するので、鋳型ＤＮＡの３′末端から平均
１ｋ塩基程度の２本鎖部分を得ることができる。
させ、プライマーを用いて相補鎖合成反応を行う。ＤＮ
Ａ鎖が短いので１０℃以下の温度で反応させる必要があ
り、本実施例では１０℃とした。鋳型ＤＮＡ（Ｍ１３）
に加えてＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase）、Sequencin
g用プライマー、反応基質および反応阻害用オリゴマー
１０１（３′末端は相補鎖合成しないように化学処理し
てある）を加えて、相補鎖合成反応を行う。本実施例で
は、反応阻害オリゴマーはプライマーから８３９塩基目
にあり、合成鎖長は約８３５塩基である。 生成物を４
塩基認識酵素Ｓａｕ ３Ａ１で切断すると、塩基長さが
約１００、１４４、２９６の２本鎖の塩基が第１切断部
１１、第２切断部１２、第３切断部１３で脱落し、この
脱落した長さだけ３′末端から短くなったＤＮＡ断片を
得ることができる。 切断部１０２には、ライゲーショ
ンにより既知配列を持ったオリゴマー（ライゲーション
で導入した既知配列部）１０４を結合させる。もちろ
ん、ターミナルトランスフェラーゼなどを用い、ヌクレ
オチドを末端に結合させていってもよい。以下の操作は
実施例１と同様であり、新たなプライマーを用いてシー
ケンシングを行い、ついでＤＮＡの切断を行う。この操
作を順次繰り返し行う。また、ハイブリダイズする阻止
オリゴマーを、配列決定領域の外に取ることもできる。
この場合、例えばＹ1＝Ｇとすると、オリゴマーが現わ
れる頻度は五つのヌクレオチドの種類と順序が固定され
ているので、約１ｋ塩基に１度となる。Ｙ2、Ｙ3を４種
の塩基の混合、すなわちＸとしてハイブリダイズさせる
と、このオリゴマーは平均１ｋ塩基ごとにハイブリダイ
ズすることになる。相補鎖合成は、最初のハイブリダイ
ズ部位で停止するので、鋳型ＤＮＡの３′末端から平均
１ｋ塩基程度の２本鎖部分を得ることができる。
【００２０】
【発明の効果】以上詳細に説明したごとく、本発明のＤ
ＮＡ塩基配列決定法によれば、３′末端から塩基配列を
決定して、決定済みのＤＮＡ鎖を切断除去する操作を繰
り返し行い、１回の塩基配列決定操作では決定できない
長いＤＮＡを、３′末端から順次配列決定を行うことが
できる。塩基の配列決定をして、次に進むことを連続し
て行うことができるため、従来のショットガン法のよう
に、決定したＤＮＡ配列を繋げていくために多大の労力
を必要としたり、またウォーキンング法のようにＤＮＡ
塩基配列決定に先立ち、その都度プライマーとなるオリ
ゴマーを合成する手間を省略することができ、極めて効
率の良いＤＮＡ塩基配列の解析を行うことができる。
ＮＡ塩基配列決定法によれば、３′末端から塩基配列を
決定して、決定済みのＤＮＡ鎖を切断除去する操作を繰
り返し行い、１回の塩基配列決定操作では決定できない
長いＤＮＡを、３′末端から順次配列決定を行うことが
できる。塩基の配列決定をして、次に進むことを連続し
て行うことができるため、従来のショットガン法のよう
に、決定したＤＮＡ配列を繋げていくために多大の労力
を必要としたり、またウォーキンング法のようにＤＮＡ
塩基配列決定に先立ち、その都度プライマーとなるオリ
ゴマーを合成する手間を省略することができ、極めて効
率の良いＤＮＡ塩基配列の解析を行うことができる。
【図１】本発明の実施例１で例示したＤＮＡ塩基配列決
定法の手順を示すに説明図。用いたシーケンシング反応
プロトコール
定法の手順を示すに説明図。用いたシーケンシング反応
プロトコール
【図２】本発明の実施例１で例示したＤＮＡ塩基配列決
定法の手順を示すに説明図。
定法の手順を示すに説明図。
【図３】本発明の実施例２で例示したＤＮＡ塩基配列決
定法の手順を示すに説明図。
定法の手順を示すに説明図。
【図４】本発明の実施例１で例示したシーケンシング反
応プロトコールを示す説明図。
応プロトコールを示す説明図。
１…試料ＤＮＡ ２…固相担体 ３…プライマー結合部 ４…長いまま残ったＤＮＡ断片 １１…第１切断部 １２…第２切断部 １３…第３切断部 １４…第４切断部 ２０…合成されたＤＮＡ２本鎖部 ２１…切断部 ２２…切断され固相に残ったＤＮＡ断片 ２３…ライゲーションで導入した既知配列部 ２４…切断部に続く２塩基部 ３１…再ハイブリダイズした合成ＤＮＡ鎖 ５０…再ハイブリダイズした合成ＤＮＡ鎖 １００…プライマー結合部 １０１…反応阻害ＤＮＡオリゴマー １０２…切断部 １０４…ライゲーションで導入した既知配列部
Claims (8)
- 【請求項１】ＤＮＡの塩基配列を決定する方法におい
て、少なくとも（１）ＤＮＡの５′末端側を固相担体の
表面に固定して、１本鎖を得るプロセスと、（２）３′
末端側にプライマーをハイブリダイズして塩基配列を決
定するプロセスと、（３）３′末端側からの相補鎖合成
により得られた２本鎖部分を制限酵素により切断し、生
じた遊離ＤＮＡを除去するプロセスと、（４）上記切断
部に、２本鎖部分を含むＤＮＡオリゴマーをハイブリダ
イズさせてプライマーとするか、もしくは配列既知のオ
リゴヌクレオチドを結合し、その１部配列と、実質相補
的な配列を含むプライマーを用いて３′末端から塩基配
列を決定するプロセスによりＤＮＡの塩基配列を決定す
る方法であって、 少なくとも上記（３）〜（４）のプロセスを１回以上繰
り返して行い、ＤＮＡ塩基配列を順次決定することを特
徴とするＤＮＡ塩基配列決定法。 - 【請求項２】請求項１において、（３）のプロセスにお
ける相補鎖合成は、ＤＮＡ合成鎖長の平均値を制御可能
とする条件下で相補鎖合成を行うことを特徴とするＤＮ
Ａ塩基配列決定法。 - 【請求項３】請求項２において、合成ＤＮＡ相補鎖の平
均鎖長の制御は、ＤＮＡシーケンス反応と同様に、ＤＮ
Ａ合成基質中にヌクレオチド類似物を混合して基質とし
て用いるＤＮＡ相補鎖合成によることを特徴とするＤＮ
Ａ塩基配列決定法。 - 【請求項４】請求項２において、ＤＮＡ相補鎖の平均合
成鎖長は、鋳型となるＤＮＡの配列を認識して結合する
ＤＮＡおよびその類似体もしくは蛋白質により、特定部
以降の相補鎖合成を障害する手法を用いることを特徴と
するＤＮＡ塩基配列決定法。 - 【請求項５】請求項１において、３′末端側から部分的
相補鎖合成と、それに続く制限酵素切断により５′末端
側から所定の長さのＤＮＡ断片群を順次作製するプロセ
スを少なくとも含むことを特徴とするＤＮＡ塩基配列決
定法。 - 【請求項６】請求項１において、（３）のプロセスで生
じた切断部に、配列既知のオリゴマーを結合させ、プラ
イマーがハイブリダイズする部位を設けることを特徴と
するＤＮＡ塩基配列決定法。 - 【請求項７】請求項１において、１部が２本鎖状となっ
たプライマーを用いて相補鎖合成することを特徴とする
ＤＮＡ塩基配列決定法。 - 【請求項８】請求項１ないし請求項７のいずれか１項に
記載のＤＮＡ塩基配列の決定を行う装置であって、
（１）ＤＮＡを固相担体の表面に固定した試料ＤＮＡを
作製する手段と、（２）固相担体に固定した試料ＤＮＡ
を鋳型として、ＤＮＡ塩基配列決定反応を行う手段と、
（３）固相担体の表面に固定した試料ＤＮＡを鋳型とし
て相補鎖合成を行い、２本鎖部分を制限酵素で切断した
後、遊離ＤＮＡを除去する手段と、（４）上記切断部
に、２本鎖部分を含むＤＮＡオリゴマーをハイブリダイ
ズさせてプライマーとするか、もしくは配列既知のオリ
ゴヌクレオチドを結合し、その１部配列と、実質相補的
な配列を含むプライマーを用いて３′末端から塩基配列
を決定する手段を少なくとも備えたことを特徴とするＤ
ＮＡ塩基配列決定装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7148980A JPH09300A (ja) | 1995-06-15 | 1995-06-15 | Ｄｎａ塩基配列決定法およびその装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7148980A JPH09300A (ja) | 1995-06-15 | 1995-06-15 | Ｄｎａ塩基配列決定法およびその装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09300A true JPH09300A (ja) | 1997-01-07 |
Family
ID=15465005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7148980A Pending JPH09300A (ja) | 1995-06-15 | 1995-06-15 | Ｄｎａ塩基配列決定法およびその装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09300A (ja) |
-
1995
- 1995-06-15 JP JP7148980A patent/JPH09300A/ja active Pending
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