DE3841565C2 - Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren durch enzymatische Extension eines Oligonukleotidprimers in Gegenwart einer Polymerase, der vier Deoxyribonukleosidtriphosphate, jeweils eines der vier Dideoxynukleosidtriphosphate und der zu sequen­ zierenden Nukleinsäure als Matrize in vier verschiede­ nen Ansätzen, Markierung der abhängig von dem eingesetz­ ten Dideoxynukleosidtriphosphat entstehenden Nukleinsäu­ refragmente, gelelektrophoretische Auftrennung der die Fragmente enthaltenden Ansätze und Detektion der Sequenz über die Markierung.
Allgemein sind für Sequenzierung von DNA zwei Methoden bekannt, nämlich das chemische Abbauverfahren nach Maxam und Gilbert (A.M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 560 und A.M. Maxam und W. Gilbert, Methods in Enzymol. Vol. 65, (1980) Seite 499) und die enzymatische Dideoxykettenterminations­ methode (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). Bei der Methode nach Sanger werden, ausgehend von einer DNA-Matrize, viele ver­ schieden lange markierte DNA-Moleküle durch enzymatische Extension eines synthetischen Primers mit Hilfe von DNA-Polymerase und einer Mischung von Deoxy- und Dideoxy­ nukleosid-triphosphaten hergestellt. Hierbei wird jeweils in vier Ansätzen eine Mischung eines bestimmten Deoxynukleosid-triphosphates und eines entsprechenden Dideoxynukleosid-triphosphates zusammen mit den drei anderen Deoxynukleosid-triphosphaten eingesetzt. Hier­ durch wird ein statistischer Einbau der Dideoxynukleotide in die wachsenden DNA-Ketten erreicht, wobei nach dem Einbau eines Dideoxynukleotids die DNA-Kette aufgrund des Fehlens einer 3'-OH-Gruppe nicht mehr weiterwachsen kann. Es entstehen daher viele DNA-Fragmente, die statistisch gesehen, mindestens an jeder möglichen Einbaustelle ein Dideoxynukleosid enthalten und dort enden. Diese vier Ansätze mit jeweils an den Positionen einer Base endenden Fragmenten werden auf Polyacrylamid­ gelen in jeweils einer Spur getrennt und die Sequenz nach Autoradiographie ermittelt.
Bei der Maxam-Gilbert-Methode werden endmarkierte DNA- Moleküle chemisch in basenspezifischer Weise modifi­ ziert, ein partieller Strangabbruch bewirkt und die so erhaltenen Fragmente durch Polyacrylamidgel-Elektropho­ rese getrennt und die Sequenz nach Autoradiographie be­ stimmt.
Beide der bisher bekannten Methoden weisen Vor- und Nachteile auf. So ist es ein Vorteil der Sanger-Dideoxy­ methode, daß die Markierung und die Herstellung von basenspezifischen Fragmenten in einem Schritt kombiniert werden kann. Auch kann sowohl einzelsträngige- als auch doppelsträngige DNA sequenziert werden. Außerdem werden Möglichkeiten zur Sequenzierung von längeren DNA-Fragmenten durch sogenannte "shot gun"-Experimente in M13-Abkömmlingen etc. ermöglicht. Bis etwa 1986 wurde die DNA-Sequenzierung unter Verwendung von radio­ aktiven (32P oder 35S) Markierungen durchgeführt. Nach der Gelelektrophorese und Autoradiographie wurde die Nukleotidsequenz entweder manuell oder halbautomatisch bestimmt. Seither wurden aber auch Fluoreszenzmarkierun­ gen für die Dideoxysequenzierung verwendet (L.M. Smith et al. , Nature, 321 (1986) 674-679; W. Ansorge et al., J. Biochem. Biophys. Meth. 13 (1986) 315-323). Die Nukleotidsequenz konnte dabei automatisch während der Elektrophorese gelesen werden und direkt in einen Computer eingegeben werden.
Demgegenüber wird die Maxam-Gilbert-Methode für die Sequenzierung von langen DNA-Fragmenten aufgrund der folgenden Nachteile ungern angewandt: so müssen die DNA-Markierung und die Bildung von basenspezifischen Fragmenten in zwei getrennten Schritten durchgeführt werden, die vorhandenen Markierungstechniken sind auf­ wendig und erfordern das Vorhandensein von geeigneten Restriktionsstellen der zu sequenzierenden Nuklein­ säuren. Hierzu müssen für Standard-Markierungsmethoden nach Maxam und Gilbert vier Schritte durchgeführt wer­ den, nämlich die Spaltung von DNA mit einer Restrik­ tionsendonuklease, die enzymatische Markierung, Spal­ tung der markierten DNA-Fragmente mit einer zweiten Restriktionsendonuklease um zu erreichen, daß die mar­ kierten DNA-Fragmente nur an einer Seite markiert sind, und Isolierung der nur an einem Ende markierten DNA- Fragmente durch Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektro­ phorese.
Weitere Nachteile der Maxam-Gilbert-Methode sind, daß die Sequenzierung von einzelsträngiger DNA nicht ein­ fach möglich ist und Zufalls- und systematische Stra­ tegien, wie sie in Verbindung mit der enzymatischen Dideoxymethode durchgeführt werden, zur Sequenzierung von langen DNA-Fragmenten nicht angewandt werden können. Außerdem sind die chemischen Reaktionen in Lösung (wie von Maxam und Gilbert beschrieben) arbeitsaufwendig aufgrund der benötigten Fällungsschritte. Dieses Ver­ fahren wurde bisher auch nur in Verbindung mit radio­ aktiven Markierungen beschrieben.
Diese Nachteile der Maxam-Gilbert-Methode führten dazu, daß die Sequenzierung heutzutage meist nach der Methode von Sanger et al. durchgeführt wird. Ein weiterer großer Nachteil, den jedoch auch diese Methode aufweist, ist, daß die vier verschiedenen Extensionsreaktionen in verschiedenen Ansätzen durchgeführt werden müssen und bei der Gelelektrophorese auf verschiedene Spuren eines Gels aufgetragen werden müssen. Hierdurch können auf ein Gel nur die Fragmente relativ weniger Sequenzie­ rungsansätze aufgebracht werden, und die Durchführung von vier verschiedenen Ansätzen für jede zu sequenzie­ rende Nukleinsäure ist äußerst arbeits- und zeitaufwen­ dig.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile der Sequenzierungsmethode nach Sanger et al. zu vermeiden und eine schnell und einfach durchzuführen­ de Sequenzierungsmethode auf Basis der von Sanger et al. bekannten Methode bereitzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren durch enzymatische Extension eines Oligonukleotidprimers in Gegenwart einer Polymerase, der vier Deoxyribonukleosidtri­ phosphate, jeweils eines der vier Dideoxynukleosid­ triphosphate und der zu sequenzierenden Nukleinsäure als Matrize in vier verschiedenen Ansätzen, Markierung der abhängig von dem eingesetzten Dideoxynukleosid­ triphosphat entstehenden Nukleinsäurefragmente, gel­ elektrophoretische Auftrennung der die Fragmente ent­ haltenden Ansätze und Detektion der Sequenz über die Markierung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man mindestens zwei der Dideoxynukleosidtriphosphate in unterschiedlichen Mengen zusammen in einem Ansatz einsetzt und die Unterscheidung der Fragmente über die Intensität des Markierungssignals der Banden im Gel oder in einem anderen Trennverfahren trifft.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, in z. B. nur zwei Ansätzen, die jeweils zwei der Dideoxynukleo­ sidtriphosphate enthalten und in der Folge auf nur zwei Spuren eines Gels aufgetragen werden, eine Sequenzie­ rung durchzuführen. Dies wird ermöglicht durch die Verwendung der Dideoxynukleosidtriphosphate in ver­ schiedenen Mengen, so daß im Trennverfahren die Banden der Fragmente, die unter Verwendung des einen Dideoxy­ nukleosidtriphosphats entstanden sind, häufiger vorkom­ men als Banden von Fragmenten mit Abbruch an den Posi­ tionen des in geringerer Menge vorhandenen Dideoxynu­ kleosidtriphosphats. Daher kann bei der Sequenzdetektion eine Zuordnung der Banden zu den Basen der Sequenz über die Intensität des Markierungssignals getroffen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung setzt man je zwei der Dideoxynukleosidtriphosphate zusammen in einem Ansatz in einem Mengenverhältnis von mindestens 2 : 1 ein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung setzt man alle vier Dideoxynukleosidtriphos­ phate in einem Ansatz in einem Verhältnis von minde­ stens 4 : 3 : 2 : 1 ein. Durch dieses besonders bevor­ zugte Verfahren wird die Sequenzierung von Nukleinsäu­ ren in nur einem Ansatz und nach Auftragen auf nur eine Spur eines Sequenziergels ermöglicht. Das Verhältnis von 4 : 3 : 2 : 1 ist die unterste Grenze, und zur Erhöhung der Genauigkeit der Sequenzierung sollten Verhältnisse mit einem größeren Abstand für die einzel­ nen Dideoxynukleosidtriphosphate verwendet werden. Diese Abstände im Verhältnis der Dideoxynukleosidtri­ phosphate sind auch von dem verwendeten Polymerase-Enzym abhängig, wobei die Enzyme, die gleichförmige Peakmuster ergeben, mit einem geringeren Verhältnis der Dideoxynuk­ leosidtriphosphate eingesetzt werden können als Polymera­ sen, welche nicht so gleichförmige Peaks ergeben.
Obwohl auch alle für die Sequenzierung nach Sanger verwendbaren Markierungsarten, wie z. B. radioaktive Markierung, im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, ist es bevorzugt, zur Markierung einen Fluores­ zenzfarbstoff zu verwenden. In einer besonders bevor­ zugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man zur Markierung einen mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekop­ pelten Primer. Hierbei ist der Fluoreszenzfarbstoff vorzugsweise an die 5'-Phosphatgruppe des Primers über einen Linker gebunden (Fig. 1B).
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man zur Markierung mindestens ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff über einen Linker verbundenes Deoxy- oder Dideoxynukleosidtriphosphat. Hierbei ist es besonders bevorzugt, ein markiertes Deoxynukleosidtriphosphat zu verwenden, da hierbei das entstehende Nukleinsäurefragment mehrfach markiert werden kann, wogegen bei einer Markierung über Dide­ oxynukleosidtriphosphate oder über einen an der 5'- Phosphatgruppe fluoreszenzmarkierten Primer nur jeweils eine Fluoreszenzfarbstoffgruppe an das entstehende Nukleinsäurefragment gebunden wird. Die Signalinten­ sität kann daher mit Hilfe dieser bevorzugten Ausfüh­ rungsform der Erfindung noch erhöht werden.
Bei der Verwendung von markierten Deoxy- oder Dideoxy­ nukleosidtriphosphaten verwendet man bevorzugt solche, bei denen der Farbstoff über einen Linker an die C5- Position von Pyrimidinen oder an die N7-, C8- oder C7-Position von Purinen gekoppelt ist.
Als Linker werden im Rahmen der Erfindung vorzugsweise geradkettige oder verzweigte Amino- oder Mercapto-Koh­ lenwasserstoffeinheiten mit mehr als zwei Kohlenstoff­ atomen in der unverzweigten Kette verwendet. Besonders bevorzugt sind hierbei Aminoalkyl-, Aminoalkenyl- oder Aminoalkinylgruppen.
Im Rahmen der Erfindung können als zu sequenzierende Nukleinsäuren einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäu­ ren verwendet werden. Als Fluoreszenzfarbstoff werden erfindungsgemäß bevorzugt Fluorescein, Analoga davon oder Rhodamin verwendet, wobei Fluorescein besonders bevorzugt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfin­ dungsgemäße Verfahren in einer solchen Weise durchge­ führt, daß in zwei Ansätzen jeweils zwei verschiedene Dideoxynukleosidtriphosphate im Verhältnis 5 : 1, 6 : 1 oder 7 : 1 verwendet werden. Hierdurch können in beiden Spuren des Gels, auf die die beiden Ansätze aufgetragen wurden, jeweils die stärkeren Banden als zu den Dideoxy­ nukleosidtriphosphaten, welche in der höheren Menge ein­ gesetzt wurden, zugehörig identifiziert werden, und die anderen Banden als zugehörig zu den Basen, deren Dide­ oxynukleosidtriphosphat in der Menge 1 eingesetzt wurde.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden in nur einem Ansatz alle vier verschiedenen Dideoxynukleosidtriphosphate in einem Verhältnis von 16 : 8 : 4 : 1 eingesetzt. Auch bei diesen Verhältnissen ist eine Unterscheidung der Di­ deoxynukleosidtriphosphate und daher ein Ablesen der Basenfolge leicht möglich.
Erfindungsgemäß wird es auch ermöglicht, die Sequenzie­ rung mit nur drei der vier verschiedenen Dideoxynukleo­ sidtriphosphate durchzuführen. Hierbei werden entweder in einem Ansatz alle drei Dideoxynukleosidtriphosphate, oder aber in einem Ansatz zwei Dideoxynukleosidtriphos­ phate und in einem zweiten Ansatz nur ein Dideoxynukleo­ sidtriphosphat eingesetzt. Nach Auftrennung beispiels­ weise in einem Polyacrylamidgel werden in gleichmäßigen Abständen Banden mit unterschiedlichen Signalintensi­ täten auftreten, wobei sich jedoch im Bandenmuster dort eine Lücke ergibt, wo sich die dem fehlenden Dideoxy­ nukleosidtriphosphat entsprechende Base in der zu sequenzierenden Nukleinsäure befindet.
Erfindungsgemäß werden zur Extension vorzugsweise das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, modifizierte oder unmodifizierte T7-DNA-Polymerase, Taq-Polymerase oder Reverse-Transkriptase verwendet. Von diesen Polymerasen ist die unmodifizierte T7-DNA-Polymerase besonders bevorzugt, da sie eine besonders gleichförmige Peak­ bildung bewirkt.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es weiter bevorzugt, daß man - vor der Extension in An­ wesenheit der Dideoxynukleosidtriphosphate - zur Ver­ größerung der Menge einer zu sequenzierenden doppel­ strängigen Matrizen-Nukleinsäure ausgehend von zwei synthetischen Primern in Anwesenheit einer Polymerase und der vier Deoxynukleosidtriphosphate mehrfach einen Zyklus durchläuft, der die Extension der Primer, Er­ hitzen, um eine Strangtrennung zu bewirken, und die erneute Zugabe von Polymerase umfaßt, die gebildeten Extensionsprodukte der beiden komplementären Stränge in einem Gel voneinander trennt und einen der beiden Stränge zur Sequenzierung einsetzt. Hierdurch wird es ermöglicht, auch Nukleinsäuren, die nur in sehr gerin­ gen Mengen vorhanden sind, unter Erhaltung gut sicht­ barer Banden im Gel zu sequenzieren. Dieses Amplifizie­ rungsverfahren zur Vergrößerung der Menge von DNA ist dem Fachmann unter der Bezeichnung Polymerase-Ketten- Reaktion (polymerase chain reaction) bekannt.
Zur Detektion wird erfindungsgemäß jeweils entsprechend der verwendeten Markierungsart vorgegangen. So werden radioaktiv markierte Fragmente durch Autoradiographie des Gels sichtbar gemacht. Bei der erfindungsgemäß bevorzugten Markierung über einen Fluoreszenzfarbstoff wird vorzugsweise nach Auftrennung der Fragmente in der Gelelektrophorese der Fluoreszenzfarbstoff durch Laser angeregt und dadurch ein besonders starkes Signal erhalten. Die Detektion kann daher mit der erfindungs­ gemäß bevorzugten Detektionsmethode auch in einer Apparatur durchgeführt werden, die gleichzeitig mit der Gelelektrophorese die Banden detektiert und sofort an einen Rechner weitergibt, der die Sequenz der zu sequen­ zierenden Nukleinsäure automatisch ausgibt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, besonders schnell und leicht viele verschiedene Nukleinsäuren nebeneinander zu sequenzieren und gleichzeitig auf ein Gel aufzutragen, wobei es weiter noch ermöglicht wird, bei Verwendung der bevorzugten Fluoreszenzmarkierung und der automatischen Detektion, die einzelnen Spuren des Gels nach erfolgtem Durchlauf wieder mit einer neuen sequenzierten Nukleinsäure zu belegen. Auch hierdurch kann die Sequenzierung vieler verschiedener DNA-Fragmente entscheidend beschleunigt werden.
Das folgende Beispiel erläutert in Verbindung mit der Abbildung die Erfindung weiter.
Fig. 1A und 1B zeigen die Lage der Fluoreszenz­ farbstoffmarkierung an einem Deoxy­ nukleosidtriphosphat bzw. Dideoxy­ nukleosidtriphosphat und an einem erfindungsgemäß verwedeten Oligo­ nukleotid-Primer.
Fig. 2 zeigt die graphische Darstellung der Peaks des Markierungssignals bei einer erfindungsgemäßen Sequenzierungsreaktion.
Fig. 3 zeigt Teile der DNA-Sequenz des Bakteriophagen M13mp18.
Beispiel 1 a) Fluoreszenzmarkierung des Primers
5'-(S-Triphenylmethyl-3-mercaptopropylphospho)d[GTAAAA- CGACGGCCAGT] wurde synthetisiert und gereinigt wie von Ansorge et al. in J. Biochem. Biophys. Met. 13 (1986), 315-322 beschrieben. Zu 100 nmol dieser Verbindung in 0,1 mol/l Triethylammoniumacetat-Lösung (1 ml, pH 7) wurden 500 nmol Silbernitrat zugegeben und 1 h in einem Eppendorfgefäß stehengelassen. Hierzu wurde Dithiotreitol (700 nmol) in 100 µl Wasser zugegeben und der Gefäßinhalt gemischt und 30 min stehengelassen. Durch Zentrifugation wurde das unlösliche Silbersalz entfernt. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß übergeführt und 1 mol/l wäßrige Natriumbicarbonatlösung zugegeben, um einen pH-Wert von 8,5 zu ergeben. Hierzu wurde eine Lösung von 3 mg (6 µmol) 5-Jodacetamidofluorescein (erhalten von Molekular Probes, Inc., Eugene, OR, USA) in N,N-Di­ methylformamid (300 µl) zugegeben und sorgfältig ge­ mischt, dann 6 Stunden im Dunklen aufbewahrt. Danach wurden 10 µl 2-Mercaptoethanol zugegeben, um überschüs­ siges Jodacetamid zu entfernen und dann die Lösung gegen Wasser (3×2 l) im Dunkeln dialysiert. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert und der farbstoff­ markierte Primer durch Ionenaustausch-HPLC auf einer Partisil-SAX-Säule gereinigt unter Verwendung eines Konzentrationsgradienten von Kaliumdehydrogenphosphat, pH 6,3 in Form Amid/Wasser (6 : 4 v/v) als Elutionsmit­ tel. Dieses Verfahren entfernt einen großen Teil von stark assoziiertem, aber nicht kovalent gebundenem Farb­ stoff. Das Produkt wurde durch Dialyse entsalzen und dann durch reverse Phase HPLC auf einer C8-Aquapor RP 300 Säule weiter gereinigt unter Verwendung von 0,1 mol/l Triethylammoniumacetat pH 7/Acetonitril als Elutionsmit­ tel. Der vollständig gereinigte Fluorescein-markierte Primer wurde weiter durch Dialyse entsalzt und im Dunkeln bei -20°C aufgehoben. Die Ausbeute an farbstoff­ markiertem Primer war 15% auf Basis des S-Trityl-Mate­ rials. Auf gleiche Art und Weise konnte ein Eosin-mar­ kierter Primer mit einer Ausbeute von 27% erhalten werden.
b) Sequenzierungsreaktion
Zuerst wurden in zwei Ansätzen in einem Zentrifugenröhr­ chen 1 µg Primerlösung und ca. bis 2 µg einzelsträngi­ ge M13mp18DNA und Sequenzierpuffer zu einem Gesamtvolu­ men von 10 µl zusammengegeben. Als Kontrolle wurde 1 bis 2 µg M13mp18DNA in einem Volumen von 7 µl eingesetzt.
Die Röhrchen wurden 2 min auf 65°C erhitzt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt über einen Zeitraum von 30 min. Während des Abkühlens hybridisiert der Primer an die dazu homologe Stelle der M13mp18DNA, nachdem die Tempera­ tur unterhalb 35°C gefallen ist, ist die Hybridisierung komplett. Zur tatsächlichen Sequenzierung wurden die folgenden Lösungen hergestellt:
Lösung T,C: 25 µl 0,5 mmol/l dTTP,
25 µl 0,5 mmol/l dCTP,
500 µl 0,5 mmol/l dGTP und
500 µl 0,5 mmol/l dATP,
5 µl 10,0 mmol/l ddTTP,
1 µl 10,0 mmol/l ddCTP und
500 µl TE-Puffer
Lösung G,A: 25 µl 0,5 mmol/l dGTP,
25 µl 0,5 mmol/l dATP, und jeweils
500 µl 0,5 mmol/l dTTP und dCTP,
5 µl 10 mmol/l ddACT und
1 µl 10 mmol/l ddGTP zusammen mit
500 µl TE-Puffer.
Zu den beiden mit dem markierten Primer hybridisierten Proben wurden entweder 2 µl der Lösung T,C oder 2 µl der Lösung G,A zugegeben. Danach wurde 20 min bei Raumtemperatur inkubiert, dann 2 µl Formamid zugegeben, auf 95°C 2 min lang erhitzt, auf Eis abgekühlt und auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen. Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung der in einem Rechner gemessenen Intensitäten des durch Laser angeregten Fluoresceins für den darüber angegebenen Bereich der DNA-Sequenz. In Fig. 3 ist zum Vergleich ein Teil der M13mp18DNA dargestellt, wobei der in Fig. 2 gezeigte sequenzierte Bereich unterstrichen ist. In der oberen Kurve von Fig. 2 sind die Peaks dargestellt für Fragmente, die sich ergeben bei Zugabe von ddATP und ddGTP in einem Verhältnis von 5 : 1 in einem Ansatz, in der unteren graphischen Darstellung sind die Peaks für Fragmente gezeigt, die entstehen bei Zugabe von ddTTP und ddCTP in einem Verhältnis von 5 : 1 in einem Ansatz.

Claims (20)

1. Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren durch enzymatische Extension eines Oligonukleotid­ primers in Gegenwart einer Polymerase, der vier Deoxyribonukleosidtriphosphate, jeweils eines der vier Dideoxynukleosidtriphosphate und der zu sequenzierenden Nukleinsäure als Matrize in vier verschiedenen Ansätzen, Markierung der abhängig von dem eingesetzten Dideoxynukleosidtriphosphat entstehenden Nukleinsäurefragmente, gelelektropho­ retische Auftrennung der die Fragmente enthalten­ den Ansätze und Detektion der Sequenz über die Markierung, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei der Dideoxynukleosidtri­ phosphate in unterschiedlichen Mengen zusammen in einem Ansatz einsetzt und die Unterscheidung der Fragmente über die Intensität des Markierungs­ signals der Banden im Gel oder in einem anderen Trennverfahren trifft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man je zwei der Dideoxynukleosidtriphosphate zusammen in einem Ansatz in einem Mengenverhältnis von mindestens 2 : 1 einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Ansatz alle vier Dideoxynukleo­ sidtriphosphate in einem Verhältnis von mindestens 4 : 3 : 2 : 1 einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Markierung einen Fluoreszenzfarbstoff verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Markierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff einen mit dem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Primer verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzfarbstoff an die 5'-Phosphat­ gruppe des Primers über einen Linker gebunden ist.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Markierung mindestens ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff über einen Linker markiertes Deoxy- oder Dideoxynukleosidtriphosphat verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein markiertes Deoxynukleosidtriphosphat verwendet.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff über einen Linker an die C5-Posi­ tion von Pyrimidinen oder an die N7-, C8- oder C7-Position von Purinen gekoppelt ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Linker eine geradkeitige oder verzweig­ te Amino- oder Mercapto-Kohlenwasserstoffeinheit mit mehr als zwei C-Atomen in der unverzweigten Kette verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker eine Aminoalkyl- oder Aminoalkenyl- oder Aminoalkinylgruppe ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als zu sequenzierende Nukleinsäure eine einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäure verwen­ det.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein, Analoga davon oder Rhodamin verwendet.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man in zwei Ansätzen jeweils zwei verschiedene Dideoxynukleosidtriphosphate im Verhältnis 5 : 1, 6 : 1 oder 7 : 1 verwendet.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Ansatz alle vier verschiedenen Dideoxynukleosidtriphosphate in einem Verhältnis von 16 : 8 : 4 : 1 einsetzt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle von vier Dideoxynukleosidtri­ phosphaten nur drei davon in einem oder zwei Ansätzen verwendet.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Extension das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, modifizierte oder unmodifizierte T7-DNA-Polymerase, Taq-Polymerase oder Reverse- Transkriptase verwendet.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man unmodifizierte T7-DNA-Polymerase verwendet.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Extension in Anwesenheit der Dideoxynukleosidtriphosphate zur Vergrößerung der Menge einer zu sequenzierenden doppelsträngigen Matrizen-Nukleinsäure ausgehend von zwei syntheti­ schen Primern in Anwesenheit einer Polymerase und der vier Deoxynukleosidtriphosphate mehrfach einen Zyklus durchläuft, der die Extension der Primer, Erhitzen, um eine Strangtrennung zu bewirken, und die Zugabe neuer Polymerase umfaßt, die gebildeten Extensionsprodukte der beiden Stränge in einem Gel voneinander trennt und einen der Stränge zur Sequenzierung einsetzt.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Detektion nach Auftrennung der Fragmen­ te in der Gelelektrophorese den Fluoreszenzfarb­ stoff durch Laser anregt.
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