DE69024061T2 - Spektral auflösbare Rhodaminfarbstoffe für Nucleinsäure Sequenz Bestimmung. - Google Patents

Spektral auflösbare Rhodaminfarbstoffe für Nucleinsäure Sequenz Bestimmung.

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren zur Sequenzbestimmung einer Nudeinsäure, genauer auf die Verwendung von Rhodaminfarbstoffen, um DNS-Fragmente von ähnlicher Größe, die durch Gel-Elektrophorese separiert wurden, zu identifizieren.
  • Die Fähigkeit, DNS-Sequenzen zu bestimmen, ist für das Verständnis der Funktion und Steuerung von Genen und die Anwendung vieler Grundtechniken der Molekularbiologie entscheidend. Die natürliche DNS besteht aus zwei linearen Polymeren oder Strängen von Nucleotiden. Jeder Strang ist eine Kette von Nucleosiden, die durch Phosphodiesterbindungen verbunden sind. Die beiden Stränge werden in gegenparalleler Ausrichtung durch Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basen von den Nucleotiden der beiden Stränge zusammengehalten: Deoxyadenosin (A) gepaart mit Thymidin (T) und Deoxyguanosin (G) gepaart mit Deoxycytidin (C).
  • Derzeit gibt es zwei grundlegende Ansätze für die DNS Sequenzbestimmung: das Dideoxy-Kettenterminationsverfahren, z.B. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 74, S. 5463-5467 (1977), und das chemische Degradationsverfahren, z.B. Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 74, S. 560-564 (1977). Das Kettenterminationsverfahren wurde auf verschiedene Arten verbessert und dient als Basis für alle derzeit verfügbaren automatischen DNS-Sequenziergeräte, z.B. Sanger et al., J. Mol. Biol., Bd. 143, S. 161-178 (1980); Schreier et al., J. Mol. Biol., Bd. 129, S. 169-172 (1979); Smith et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, S. 2399-2412 (1985); Smith et al., Nature, Bd. 321, S. 674-679 (1987); Prober et al., Science, Bd. 238, S. 336-341 (1987), Abschnitt II, Meth. Enzymol., Bd. 155, S. 51-334 (1987); Church et al., Science, Bd. 240, S. 185-188 (1988); und Connell et al., Biotechniques, Bd. 5, S. 342-348 (1987).
  • Sowohl das Kettenterminations- als auch das chemische Degradationsverfahren erfordern die Erzeugung eines oder mehrerer Sätze von markierten DNS-Fragmenten, die alle einen gemeinsamen Ursprung haben und alle mit einer bekannten Base enden. Der Satz oder die Sätze von Fragmenten müssen nach Größe separiert werden, um Informationen über die Sequenz zu erhalten. Bei beiden Verfahren werden die DNS-Fragmente durch Gelelektrophorese mit hoher Auflösung separiert. Bei den meisten automatischen DNS- Sequenziergeräten werden Fragmente mit unterschiedlichen Endbasen mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, die entweder an einen Primer gebunden sind, z.B. Smith et al. (1987, s.o.) oder an die Base eines End- Dideoxynucleotids, z.B. Prober et al. (s.o.). Die markierten Fragmente werden verbunden und zur elektrophoretischen Separation auf dieselbe Gelsäule geladen. Die Basensequenz wird durch die Analyse des Fluoreszenzsignals bestimmt, das von den Fragmenten abgegeben wird, wenn sie während des Separationsvorgangs an einem stationären Detektor vorbeikommen.
  • Einen Satz Farbstoffe zu erhalten, um die verschiedenen Fragmente zu markieren, ist bei solchen DNS-Sequenziersystemen sehr schwierig. Erstens ist es schwierig, drei oder mehr Farbstoffe zu finden, die keine stark überlappenden Emissionsbänder haben, da die übliche Halbwertbreite von Fmissionsbändern für organische Fluoreszenzfarbstoffe bei ca. 40-80 nm liegt und die Breite des sichtbaren Spektrums nur ca. 350-400 nm umfaßt. Zweitens kann der Satz, selbst wenn Farbstoffe mit nicht überlappenden Emissionsbändern gefunden werden, immer noch ungeeignet für die DNS-Sequenzierung sein, falls die entsprechenden Fluoreszenzleistungen zu gering sind. Pringle et al., DNA Core Facilities Newsletter, Bd. 1, S. 15-21 (1988) legen z.B. Daten vor, die anzeigen, daß eine erhöhte Gelmenge geringe Fluoreszenzleistungen nicht ausgleichen kann. Drittens wird die Anregung schwierig, wenn verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig verwendet werden, da die Absorptionsbänder der Farbstoffe oft weit auseinanderliegen. Die wirksamste Anregung tritt auf, wenn jeder Farbstoff bei der Wellenlänge belichtet wird, die dem Maximum seines Absorptionsbandes entspricht. Wenn verschiedene Farbstoffe verwendet werden, ist man oft gezwungen, zwischen der Empfindlichkeit des Detektionssystems und den erhöhten Kosten für separate Anregungsquellen für jeden Farbstoff abzuwägen. Viertens werden die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Farbstoffe und die Mittel, mit denen sie an die Fragmente gebunden werden, bedenklich groß, wenn die Anzahl der Fragmente mit verschiedenen Größen in einer einzigen Gelsäule höher als einige Hundert ist. Ladung, Molekulargewicht und Gestalt der Farbstoffe und Verbinder dürfen die elektrophoretische Mobilität von Fragmenten mit ähnlicher Größe nicht negativ beeinflussen, so daß eine übermäßige Bandverbreiterung auftritt oder die Bandpositionen auf dem Gel umgekehrt werden, wodurch die Übereinstimmung zwischen der Bandordnung und der Ordnung der Basen in der Nucleinsäure, deren Sequenz bestimmt werden soll, zerstört wird. Schließlich müssen die Fluoreszenzfarbstoffe mit der Chemikalie kompatibel sein, die für die Erzeugung oder Manipulation der Fragmente verwendet wird. Beim Kettenterminationsverfahren dürfen die Farbstoffe, die für die Markierung von Primern und/oder der Dideoxykettenenden verwendet werden, beispielsweise nicht mit der Aktivität der verwendeten Polymerase oder reversen Transkriptase interferieren.
  • Aufgrund dieser strengen Beschränkungen wurden nur wenige Sätze von Fluoreszenzfarbstoffen gefunden, die bei der automatischen DNS-Sequenzierung und anderen diagnostischen und analytischen Techniken verwendet werden können, z.B. Smith et al. (1985, s.o.); Prober et al. (s.o.); Hood et al., Britisches Patent 2,115,175 sowie Connell et al. (so.).
  • Angesichts dieser Tatsache könnten viele analytische und diagnostische Techniken, z.B. die DNS-Sequenzierung, bedeutende Fortschritte machen, wenn neue Sätze von Fluoreszenzfarbstoffen verfügbar wären, die (1) physikalisch-chemisch ähnlich sind, (2) die Detektion von sich räumlich überlappenden Zielsubstanzen ermöglichen, z.B. eng versetzten DNS-Bändern auf einem Gel, (3) die Anzahl von Basen erhöhen, die mit derzeitigen Methoden der automatisierten DNS-Sequenzierung auf einer einzigen Gelsäule bestimmt werden können, (4) für die Verwendung in einem breiten Bereich von Herstellungs- und Manipulationstechniken geeignet sind, und (5) die zahlreichen oben aufgeführten Anforderungen auf andere Weise erfüllen.
  • Die in EP-A-0233053 beschriebenen Vorschläge erfüllen diese Anforderungen teilweise, indem sie vier Farbstoffe verwenden, nämlich Fluoreszein, 2',7'-dimethoxy-4',5'- dichlorofluoreszein, Tetramethylrhodamin und Rhodamin-X- Carboxyl- oder Sulfonsäure, die sich mit den 5'-Enden der Oligonucleotide verbinden. Es wurde jedoch nicht festgestellt, daß die Verwendung einer Gruppe von vier Farbstoffen, nämlich Tetramethylrhodamin, Rhodamin X, Rhodamin 6G und Rhodamin 110, die sich mit den 3'-Enden der Oligonucleotide verbinden, bestimmte eindeutige Vorteile hat.
  • Die Erfindung richtet sich auf ein Verfahren der DNS- Sequenzierung, bei dem elektrophoretisch separierte DNS- Fragmente mit verschiedenen 3'-End-Nucleotiden durch verschiedene Rhodaminfarbstoffe identifiziert werden. Insbesondere umfaßt die Erfindung die unten definierten rhodamin-markierten Nucleotide und ihre Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren. Die Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung eines Satzes von spektral auflösbaren Rhodaminfarbstoffen, die an kettenterminierende Nucleotide gebunden sind, die leicht durch DNS-Polymerasen, insbesondere Taq-DNS-Polymerase, in wachsende DNS- Ketten eingebaut werden. Der hierin verwendete Begriff "kettenterminierendes Nucleotid" bezieht sich auf ein Nucleotid oder Analogon davon, das eine weitere Verlängerung oder Erweiterung der Polynucleotidkette verhindert, nachdem es durch DNS-Polymerase in eine wachsende DNS-Kette eingebaut wurde. Normalerweise hängt die kettenterminierende Eigenschaft solcher Nucleotide von der Abwesenheit oder Modifikation des 3'-hydroxyls des Zukkeranteus ab. Die kettenterminierenden Nucleotide sind 2',3'-dideoxynucleotide.
  • Der hierin verwendete Begriff "spektral auflösbar" in bezug auf einen Satz Farbstoffe bedeutet, daß die Fluoreszenz-Emissionsbänder der Farbstoffe ausreichend unterschiedlich sind, d.h. nicht zu weit überlappen, so daß Zielsubstanzen, an denen die entsprechenden Farbstoffe befestigt werden, z.B. Polynucleotide, auf der Basis des Fluoreszenzsignals unterschieden werden können, das von den jeweiligen Farbstoffen durch normale Lichtdetektionssysteme erzeugt wird, z.B. durch Einsatz eines Systems aus Bandpaßfiltern und Fotozellen oder ähnlichem, wie von den beschriebenen Systemen in den U.S.-Patenten 4,230,558; 4,811,218 oder ähnlichen oder in Wheeless et al., S. 21-76 in Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis (Academic Press, New York, 1935) beispielhaft dargestellt.
  • Wenn die erfindungsgemäßen Rhodamine verwendet werden, um 3'-End-Nucleotide zu markieren, ist ein wichtiges Merkmal der Erfindung der praktisch äquivalente Beitrag zur elektrophoretischen Mobilität der DNS-Fragmente durch die vier Farbstoffe. Dieses Ergebnis ist unerwartet, da man annimmt, daß konforme Interaktionen zwischen der Markierung und den benachbarten Nucleotiden vor allem für die Variabilität bei der elektrophoretischen Mobilität markierter DNS-Fragmente verantwortlich isl. Es wurde erwartet, daß mit Farbstoff markierte Primer immer zu geringerer Variabilität bei der elektrophoretischen Mobilität führen würden, da der Farbstoff immer mit derselben Nucleotidsequenz zusammenwirken würde. Teil der vorliegenden Erfindung ist jedoch die Entdekkung, daß Fragmente mit 3'-markierten Nucleotiden eine wesentlich geringere Variabilität bei der elektrophoretischen Mobilität aufweisen als äquivalente Fragmente mit farbstoffmarkierten Primern.
  • Der spektral auflösbare Satz von erfindungsgemäßen Rhodaminfarbstoffen besteht aus Tetramethylrhodamin, Rhodamm X, Rhodamin 110 und Rhodamin 6G, die jeweils in den Formeln I-IV definiert sind. Das Kohlenstoffnumenerungsschema des Colour Index (Association of Textile Chemists, 2. Ausg., 1971) wird durchgängig verwendet, d.h. Zahlen mit Strichindex beziehen sich auf Kohlenstoffe in der Xanthenstruktur und Zahlen ohne Strichindex beziehen sich auf Kohlenstoffe im 9'-phenyl. Formel I Formel II Formel III Formel IV
  • worin:
  • A eine Gruppe, z.B. eine Carboxyl-, Sulfonyl- oder Aminogruppe, ist, die in eine Verkeltungsfunktion umgewandelt werden kann, und
  • B eine anionische saure Gruppe ist, vorzugsweise ein Carboxyl oder Sulfonyl, am besten Carboxyl.
  • Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen rhodaminmarkierten kettenterminierenden Nucleotide folgende Form:
  • XTP-L-R
  • worin XTP ein kettenterminierendes Nucleosidtriphosphat und R ein Rhodaminfarbstoff ist, der aus der Gruppe ausgewählt worden ist, die umfaßt: Tetramethylrhodamin, Rhodamin X, Rhodamin 110 und Rhodamin 6G; L ist eine Verkettungsgruppe zwischen der Base des Nucleosidtriphosphats und dem Rhodaminfarbstoff.
  • XTP ist ein Analogon des Substrats des natürlichen Nucleosidtriphosphats der verwendeten DNS-Polymerase, die eine weitere Verlängerung der Kette nach dem Einbau verhindert. Für jedes der vier natürlichen Nucleosidtriphosphate sind mehrere solcher Analoga verfügbar, z.B. geben Hobbs et al. (s.o.) eine Liste an. Vorzugsweise ist XTP ein 2',3'-dideoxynucleosidtriphosphat. Besser wird XTP aus der Gruppe ausgewählt, die umfaßt: 2',3'- dideoxy-7-deazaadenosintriphosphat, 2',3'-dideoxycytidintriphosphat, 2'3'-dideoxy-7-deazaguanosin, 2',3'-dideoxyuridintriphosphat und 2',3'-dideoxy-7-deazainosintriphosphat. Der hierin verwendete Begriff "Dideoxynucleosid" umfaßt Nucleosid-Analoga, deren Zuckeranteile entweder zyklisch oder azyklisch sind. Wenn auf spezielle Kohlenstoffatome einer Base oder den Zucker eines Nucleosids Bezug genommen wird, wird die konventionelle Numerierung verwendet, z.B. Kornberg, DNA Replication (Freeman, San Francisco, 1980).
  • L kann eine Anzahl verschiedener Formen annehmen, so daß die Länge und Stabilität der Verbindung zwischen den Dideoxynucleotiden und dem Farbstoff stark variieren kann. Es wurde beispielsweise von mehreren geeigneten Basenmarkierungsverfahren berichtet, die für die Erfindung verwendet werden können, z.B. Gibson et al., Nucleic Acids Research, Bd. 15, S. 6455-6467 (1987); Gebeyehu et al., Nucleic Acids Research, Bd. 15, S. 4513- 4535 (1987); Haralambidis et al., Nucleic Acids Research, Bd. 15, S. 4856-4876 (1987) und ähnliche. Vorzugsweise wird L durch die Reaktion eines N-hydroxysuccinimid-(NHS)-Esters von einem erfindungsgemäßen Farbstoff mit einer alkynylaminoderivatisierten Base eines Dideoxynucleotids gebildet. In diesem Fall wird L als die Hälfte zwischen (1) dem 5. oder 6. Kohlenstoff des Rhodamins und (2) dem Kohlenstoff der Base genommen, an der das Rhodamin befestigt wird. Vorzugsweise ist L 3-carboxyamino-1-propynyl. Die Synthese eines solchen alkynylaminoderivatisierten Dideoxynucleotids von Cytosin, Thymin und Adenin wird von Hobbs et al. in EP-A- 0251786 und Hobbs, J. Org. Chem., Bd. 54, S. 3420 (1989) gelehrt. Kurz, die alkynylaminoderivatisierten Dideoxynucleotide werden gebildel, indem das entsprechende Halodideoxynucleosid (normalerweise 5-iodopyrimidin- und 7-iodo-7-deazapurin-dideoxynucleoside wie von Hobbs et al. (s.o.) gelehrt wird) und Cu(I) in einen Kolben gegeben und mit Ar gespült werden, um die Luft zu entfernen, trockenes DMF zugegeben wird, gefolgt von der Zugabe eines Alkynylamins, Triethylamins und Pd(0). Die Reaktionsmischung kann mehrere Stunden lang gerührt werden oder bis die Dünnschicht-Chromatographie den Verbrauch des Halodideoxynucleosids anzeigt. Wenn ein ungeschütztes Alkynylamin verwendet wird, kann das Alkynylaminonucleosid durch Konzentration der Reaktionsmischung und Chromatographierung auf Siliziumdioxidgel mit einem eluierenden Lösungsmittel, das Ammoniumhydroxid enthält, um das Hydrohalid zu neutralisieren, das bei der Kopplungsreaktion erzeugt wird, isoliert werden. Wenn ein geschütztes Alkynylamin verwendet wird, können der Reaktionsmischung Methanol-/Methylenchlorid und anschließend die Bicarbonatform eines stark basischen Anionen-Austauschharzes zugegeben werden. Der flüssige Brei kann ca. 45 Minuten lang gerührt und dann gefiltert werden und das Harz mit zusätzlichem Methanol-/Methylenchlorid gespült werden. Die verbundenen Futrate können konzentriert und durch Blitzlichtchromatographie auf Siliziumdioxidgel mit einem Methanol-/Methylenchlorid-Gefälle gereinigt werden. Die Triphosphate werden mit Standardtechniken erhalten.
  • Die Synthese aus dem alkynylaminderivatisierten Dideoxyguanosin gemäß den oben angegebenen Referenzen erfordert eine speziell modifizierte Guanin-Vorstufe (6-methoxy-2- methylthio-7-deazapurin, X), der aus dem Ausgangsmaterial, 6-hydroxy-2-methylthio-7-deazapurin, XX, erhalten wird. Die Umwandlung von XX in 6-chloro-2-methylthio-7- deazapurin, XXX, nach Robins und Noell (J. Heterocyclic Chem., Bd. 1, S. 34 (1964)) gefolgt von Verschiebung des Chlorsubstituenten mit Methoxid (Natriumsalz in zurückströmendem Methanol) ergibt X:
  • Vorzugsweise werden die Rhodamin-NHS-Ester gemäß der Lehre aus EP-A-0272007 synthetisiert. Wichtige Merkmale des Verfahrens zur Synthetisierung der Rhodamin-NHS- Ester umfassen (1) die Reaktionsbedingung, daß im wesentlichen stöchiometrische Mengen di-N-succinimidylcarbonat (DSC) und 4-dimethylaminopyridin (DMAP) für die Veresterung der 5- oder 6-Formen der Rhodaminfarbstoffe vorhanden sind, um hohe Produkterträge bei Raumtemperatur zu erzielen, und (2) die Behandlung des frisch synthetisierten Produkts mit einer sauren Verbindung, vorzugsweise mit einem PKA kleiner als 5, um die Rückumwandlung in Reaktanten zu verhindern. Das allgemeine Reaktionsschema der Erfindung ist in Formel IX definiert: 5- und 6-Carboxyrhodamin-Mischung oder 5- oder 6-Carboxyrhodamin-Isomer 5- und 6-Rhodamin-NHS-Ester(-Mischung) oder 6-Rhodamin-NHS-Ester (einzelnes Isomer)
    • Formel IX
  • Die Verfahren umfassen eine Reaktion der Säureform eines 5- oder 6-Carboxylrhodamins (entweder als Mischung aus Isomeren oder als reine Isomere) mit äquivalenten Mengen von DSC und DMAP in einem polarisierten aprotischen Lösungsmittel, um den Carboxyl-N-hydroxysuccinimidester zu bilden. Geeignete polarisierte aprotische Lösungsmittel sind N,N-dimethylformamid (DMF), Pyridin, Hexamethylphosphoramid (HMPA) oder ähnliche. Am besten wird DMF als Lösungsmittel für die Reaktion verwendet. Die isomerisch gemischten NHS-Ester können für die weitere Verwendung in ihre einzelnen Isomere separiert werden. Zur Konservierung der Reagenzien werden am besten die Säureformen der 5- oder 6-Carboxylrhodamine zuerst durch Standard-Separierungstechniken in ihre einzelnen Isomere separiert, z.B. Edmundson et al., Molecular Immunology, Bd. 21, S. 561 (1984), und dann werden die einzelnen 5- oder 6-Carboxylisomere wie oben beschrieben zur Reaktion gebracht, um die 5- bzw. 6-Carboxyl-NHS-Ester zu bilden, die ebenfalls durch Standardtechniken von der Reaktions mischung separiert werden.
  • Vorzugsweise wird der frisch synthetisierte Rhodamin- NHS-Ester mit einer flüchtigen, organisch löslichen Säure mit einem pKa< 5 behandelt, besser einer flüchtigen, organisch löslichen, sauren Verbindung mit einem pKa< 1, z.B. HCl oder HBR in Methanol, oder am besten Trifluoroazetylsäure.
  • Einige isomerische Mischungen aus Rhodaminfarbstoffen, die für die Erfindung verwendet werden können, sind im Handel erhältlich, z.B. bei Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), andere können gemäß den Lehren aus den U.S.- Patenten 2,242,572; 2,153,059; 3,822,270; 3,932,415 und 4,005,092 synthetisiert werden.
  • Die erfindungsgemäßen Rhodamine sind besonders gut für die Identifikation der Klassen von Polynucleotiden geeignet, die einem biochemischen Separationsverfahren unterzogen wurden, z.B. der Gelelektrophorese, wo eine Reihe von eng nebeneinanderliegenden Bändern oder Punkten von Polynucleotiden mit ähnlichen physikalischchemischen Eigenschaften, z.B. Größe, Gestalt, Ladung, Hydrophobie oder ähnlichen, in einer linearen oder planaren Anordnung vorhanden ist. Der hierin verwendete Begriff "Bänder" bezieht sich auf jede räumliche Gruppierung oder Anhäufung von Polynucleotiden auf der Basis ähnlicher oder identischer physikalisch-chemischer Eigenschaften. Normalerweise treten Bänder bei der Separation von Farbstoff-Polynucleotid-Konjugaten durch Gelelektrophorese auf.
  • Vorzugsweise werden Klassen von Polynucleotiden, die gemäß der Erfindung identifiziert werden, nach den Endnucleotiden definiert, so daß zwischen den vier moglichen Endbasen und den vier spektral auflösbaren Farbstoffen eine Übereinstimmung hergestellt wird. Insbesondere treten Klassen von Polynucleoliden im Zusammenhang mit den Kettenterminationsverfahren der DNS-Sequenzierung auf, wenn Farbstoff-Polynucleotid-Konjugale durch Gelelektrophorese nach Größe separiert werden, z.B. Gould und Matthews, s.o.; Rickwood und Hames, Hrsg., Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practical Approach, (IRL Press Limited, London, 1981) oder Osterman, Methods of Protein and Nucleic Acid Research, Bd. 1 (Springer Verlag, Berlin, 1984). Vorzugsweise ist der Geltyp Polyacrylamid mit einer Konzentration (Verhältnis von Gewicht zu Volumen) zwischen ca. 2 und 20%. Besser liegt die Konzentration des Polyacrylamidgels zwischen ca. 4 und 8%. Vorzugsweise enthält das Gel einen Strangseparations- oder Denaturierungsstoff. Genauere Verfahren zur Herstellung solcher Gele werden beschrieben in Maniatis et al., "Fractionation of Low Molecular Weight DNA and RNA in Polyacrylamide Gels Containing 98% Formamide or 7 M Urea", in Methods in Enzymology, Bd. 65, S. 299-305 (1980); Maniatis et al., "Chain Length Determination of Small Double- and Single-Stranded DNA Molecules by Polyacrylamide Gel Electrophoresis", Biochemistry, Bd. 14, S. 3787-3794, (1975); und Maniatis et al., Molecular doning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982), S. 179-185. Die optimalen Werte für Gelkonzentration, pH-Wert, Temperatur, Konzentration des Denaturierungsstoffs, usw., die bei einer bestimmten Separation eingesetzt werden, hängen von vielen Faktoren ab, z.B. dem Größenbereich der zu separierenden Nudeinsäuren, die Zusammensetzung ihrer Basen, ob sie einoder doppelsträngig sind, sowie die Art der Klassen, zu denen durch die Elektrophorese Informationen erhalten werden sollen. Entsprechend kann die Anwendung der Erfindung Standard-Vorversuche erfordern, um die Bedingungen für bestimmte Separationen zu optimieren. Vorzugsweise wird während der Polynucleotidkettenerweiterung Deoxyguanosintriphosphat durch Deoxyinosintriphosphat ersetzt, um die sogenannte "Bandkompression während der Elektrophorese zu verhindern, z.B. Mills et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 76, S. 2232-2235 (1979). Zum Beispiel werden Polynucleotide mit Größen im Bereich zwischen ca. 10 und 500 Basen separiert und erfindungsgemäß in folgendem Gel ermittelt: 6% Polyacrylamid aus 19 Teilen Acrylamid und 1 Teil Bis-Acrylamid, gebildet in einem EDTA-Puffer aus Tris-Borat mit einem pH-Wert von 8,3 (gemessen bei 25ºC) mit 48% (Gewicht/Volumen) Harnstoff. Das Gel wird bei ca. 50ºC verwendet.
  • Die Farbsloff-Polynucleotid-Konjugate auf dem Gel werden mit Standardvorrichtungen belichtet, z.B. Hochleistungs- Quecksilberdampflampen, Laser oder ähnliches. Vorzugsweise werden die Farbstoff-Polynucleotide auf dem Gel mit Laserlicht belichtet, das von einem Argonionenlaser erzeugt wird, besonders mit den 488 nm- und 514 nm- Emissionsbändern eines Argonionenlasers. Verschiedene Argonionenlaser, die auf diesen Bändern gleichzeitig Laserstrahlen abgeben, sind im Handel erhältlich, Z.B. bei Cyonics, Ltd. (Sunnyvale, CA), Modell 2001, oder ähnliche.
  • Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist die DNS-Polymerase, die beim DNS-Sequenzierverfahren für die Kettenerweiterung verwendet wird. Vorzugsweise wird die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Polymerase aus der Gruppe ausgewählt, die umfaßt: Taq-DNS-Polymerase, beschrieben von Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 85, S. 9436-9440 (1988), entweder mit Mangan- oder Magnesiumpuffer, und T7-DNS-Polymerase mit einem Manganpuffer, beschrieben von Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 86, S. 4076-4080 (1989). Allgemein wird die einsträngige DNS-Schablone, die die unbekannte Sequenz enthält, nach Standardtechniken hergestellt, z.B. in M13mp18 wie im Handbuch für das DNS-Sequenziersystem Modell 370A von Applied Biosystems beschrieben. Ähnlich wird die Glühreaktion, bei welcher der Primer an der Schablone befestigt wird, durch Standardprotokolle durchgeführt. Die Erweiterungsreaktion, bei der DNS- Fragmente verschiedener Größe erzeugt werden, ist für die erfindungsgemäßen rhodamin-markierten Dideoxynucleotide und die jeweils verwendete DNS-Polymerase optimiert.
    • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung. Die Konzentrationen der Reagenzien, Temperaturen und die Werte anderer variabler Parameter sollen nur als Beispiel für die Erfindung dienen und stellen keine Beschränkung derselben dar.
    • Beispiel 1. 6-TMR-NHS
  • 6-TMR-Säure wurde durch Säulenchromatographie aus einer Mischung der 5- und 6-TMR-Säureisomere separiert. 8,82 mg 6-TMR-Säure und 10,5 mg DSC wurden in 0,5 ml trockenem DMF unter Argon aufgelöst. 0,09 ml 0,5 M Lösung aus DMAP in Tetrahydrofuran (THF) wurden auf einmal zugegeben. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Mischung in 50 ml Chloroform gegeben und dreimal mit einer Lösung aus Salzlauge und Wasser im Verhältnis 1:1 gewaschen. Das Chloroform wurde verdampft und der Rest auf einer Säule aus 20 g Siliziumdioxidgel (Methylenchlorid: Methanol:Azetylsäureelution im Verhältnis 300:30:8) gereinigt. Fraktionen mit einem Rf von ca. 0,4 wurden bis zur Trockenheit verdampft und ergaben 8,6 mg 6-TMR-NHS als Azetylsäuresalz.
    • Beispiel 2. 5-TMR-NHS
  • 5-TMR-NHS wurde aus 82,3 mg 5-TMR-Säure, 75 mg DSC, 0,70 ml 0,5 M DMAP in THF in 2 ml trockenem DMF hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
    • Beispiel 3. 6-ROX-NHS
  • 6-ROX-Säure wurde durch Säulenchromatographie aus einer Mischung aus 5- und 6-Säureisomeren separiert. 46,2 mg 6-ROX-Säure und 58 mg DSC wurden in 2 ml trockenem DMF unter Argon aufgelöst, und 0,45 ml 015 M DMAP-Lösung in THF wurden auf einmal zugegeben. Nach 1,5 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Mischung in 100 ml Chloroform gegeben und viermal in einer Lösung aus Salzlauge und Wasser im Verhältnis 1:1 gewaschen. Das Chloroform wurde verdampft und der Rest auf einer Säule aus 40 g Siliziumdioxidgel gereinigt (Methylenchlorid:Methanol: Azetylsäureelution im Verhältnis 300:30:8). Fraktionen mit einem Rf von ca. 0,5 wurden bis zur Trockenheit verdampft und ergaben 56,4 mg 6-ROX-NHS als Azetylsäuresalz.
    • Beispiel 4. 5-ROX-NHS
  • 5-ROX-NHS wurde aus 27,4 mg 5-ROX-Säure, 30,2 mg DSC, 0,24 ml 0,5 M DMAP in THF in 1,0 ml trockenem DMF hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben.
    • Beispiel 5. Eine stabile Zusammensetzung aus Rhodamin-NHS-Estern
  • a) 0,44 mg 6-Carboxy-X-Rhodamin-NHS-Ester aus Beispiel 3 und 80 µl 0,01 M Ethanolamin in Methanol wurden verbunden. Die Umkehrphasen-HPLC der Reaktionsmischung mit Azetonitril und 0,1 M Triethylammoniumazetatpuffer (pH- Wert 7,0) zeigten, daß das Produkt aus 70% X-Rhodaminsäure und 30% X-Rhodamin-NHS-Ester (festgestellt als das Ethanolamid von 6-Carboxy-X-Rhodamin aus seiner Reaktion mit Ethanolamin) bestand.
  • b) 0,15 g 6-Carboxy-X-Rhodamin-NHS-Ester aus Beispiel 3 wurden in 100 ml Chloroform aufgelöst. Die Chloroformlösung wurde zweimal mit 0,5 M Natriumbicarbonat gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert, mit 0,1 ml Azetylsäure behandelt und bis zur Trockenheit verdampft. 0,35 mg des Produkts wurden genau wie unter a) behandelt. Die Umkehrphasen-HPLC zeigte 20% 6-Carboxy-X- Rhodaminsäure und 80% 6-Carboxy-X-Rhodamin-NHS-Ester.
  • c) 0,15 g 6-Carboxy-X-Rhodamin-NHS-Ester aus Beispiel 3 wurden genau wie unter b) behandelt, mit dem Unterschied, daß die Azetylsäure durch Trifluoroazetylsäure ersetzt wurde. 0,19 mg des entstehenden Feststoffs wurden genau wie unter a) behandelt. Die Umkehrphasen-HPLC zeigte < 5% 6-Carboxy-X-Rhodaminsäure und > 95% 6-Carboxy- X-Rhodamin-NHS-Ester.
    • Beispiel 6. Herstellung von R6G-markiertem 7-deaza- 2',3'-dideoxyadenosintriphosphat (ddA-5R6G)
  • Zu 2,0 µmol 7-(3"-amino-1"-propynyl)-7-deaza-2',3'-dideoxyadenosintriphosphat (lyophilisiert), das wie beschrieben hergestellt wurde, werden 100 µl DMF, 3 mg 5- Rhodamin 6G-NHS-Ester und 50 ul 1,0 M Triethylammoniumcarbonat mit einem pH-Wert von 8,95 zugegeben. Diese Mischung wurde auf einem Vortex gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Mischung wurde dann durch HPLC auf einer AX-300, 220x4,6 mm, 7 Micron- Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml pro Minute gereinigt. Die Ausgangselution war zu 60% 0,1 M Triethylammoniumcarbonat mit einem pH-Wert von 7,0, zu 40% CH&sub3;CN mit einem linearen Gefälle zu 60% 1,2 M Triethylammoniumcarbonat mit einem pH-Wert von 7,5 und 40% CH&sub3;CN über 40 Minuten. Das Lösungsmittel wurde aus dem gesammelten Produkt durch Verdampfen unter Vakuum entfernt. Der Rest wurde in 0,01 M Triethylammoniumazetat mit einem pH-Wert von 7,0 aufgelöst und quantifiziert.
    • Beispiel 7. Herstellung von ROX-markiertem 2',3'- dideoxycytidintriphosphat (ddC-6ROX)
  • Zu 3,6 µmol 5- (3"-amino-1"-propynyl)-2',3'-dideoxycytidintriphosphat (wie beschrieben hergestellt) in 150 µl H&sub2;O wurden 5 mg 6-Rhodamin X-NHS-Ester in 60 µl DMSO und 50 µl 1,0 M Triethylammoniumcarbonat mit einem pH-Wert von 8,95 zugegeben. Dieses wurde auf einem Vortex gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Produkt wurde wie in Beispiel 6 gereinigt.
    • Beispiel 8. Herstellung von R110-markiertem 2',3'- dideoxyinosintriphosphat (ddG-5R110)
  • Zu 1,3 µmol 7-(3"-amino-1"-propynyl-7-deaza-2'3'-dideoxyguanosintriphosphat (lyophilisiert), wie beschrieben hergestellt, wurden 100 µl DMF, 4 mg 5-Rhodamin 110-NHS-Ester und 100 µl 1,0 M Triethylammoniumcarbonat mit einem pH-Wert von 8,95 zugegeben. Dieses wurde auf einem Vortex gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Produkt wurde wie in Beispiel 6 gereinigt.
    • Beispiel 9. Herstellung von TMR-markiertem 2',3'- dideoxythymidintriphosphat (ddT-6TMR)
  • 3,1 µmol 5-(3"-amino-1"-propynyl)-2',3'-dideoxyuridintriphosphat in 150 µl H&sub2;O, wie beschrieben hergestellt, wurden mit 150 µl DMF, 100 µl 1,0 M Triethylammoniumcarbonat mit einem pH-Wert von 8,95 und 4 mg 6-TMR-NHS- Ester gemischt. Dieses wurde auf einem Vortex gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Produkt wurde wie in Beispiel 6 gereinigt.
    • Beispiel 10. DNS-Sequenzanalyse mit rhodamin-markierten Dideoxynucleotiden und Taq-DNS- Polymerase mit einem Magnesiumpuffer
  • Die in den Beispielen 6-9 hergestellten rhodamin-markierten Dideoxynucleotide wurden verwendet, um DNS- Fragmente bei der Kettenterminationssequenzierung mit einem automatischen DNS-Sequenziergerät Modell 370A von Applied Biosystems (Foster City, CA) zu markieren. Das Protokoll des Herstellers (User Bulletin DNA Sequencer Model 370, Ausgabe Nr. 2, 12.8.1987), das zu Referenzzwecken beigefügt ist, wurde befolgt, um eine einsträngige Schablone M13mp18 zu erhalten. (Das M13 selbst diente als Testsequenz.) Der M13-Universalprimer wurde eingesetzt. Folgende Lösungen wurden hergestellt: 5X Taq-Mg-Puffer (50 mM Tris-Cl, pH-Wert 8,5, 50 mM MgCl&sub2;, 250 mM NaCl), Farbstoff-Terminator-Mischung (2,7 µM ddg-5R110, 9,00 µM ddA-5R6G, 216,0 µM ddt-6TMR und 54,0 µM ddc-6ROX) sowie eine dNTP-Mischung (500 µM dITP, 100 µM dATP, 100 µM dTTP und 100 µM dCTP). Die Glühreaktion wurde ausgeführt, indem 3,6 µl 5X Taq-Mg-Puffer, 0,4 pmol DNS-Schablone, 0,8 µmol Primer und Wasser bis zu einem Volumen von 12,0 µl in einem Mikrozentrifugenröhrchen verbunden wurden. Die Mischung wurde 5-10 Minuten lang bei 55-65ºC inkubiert, langsam über einen Zeitraum von 20-30 Minuten auf eine Temperatur zwischen 4 und 20ºC abgekühlt, dann einmal zentrifugiert, um das Kondenswasser zu sammeln, gemischt und auf Eis gelegt. Der Mischung wurden dann 1,0 µl DNTP-Mischung, 2,0 µl Farbstoff-Terminator-Mischung, 4 Einheiten Taq-Polymerase und Wasser bis zu einem Volumen von 18,0 µl zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 60ºC inkubiert, dann auf Eis gelegt und mit 25,0 µl 10 mM EDTA mit einem pH-Wert von 8,0 verbunden, um die Reaktion abzulöschen. Die DNS in der Mischung wurde dann in einer Drehsäule (z.B. eine 1 ml Sephadex G-50-Säule, wie eine Select-D von 5 Prime to 3 Prime, West Chester, PA) gereinigt und Ethanol fiel aus (durch Zugabe von 4 µl 3 M Natriumazetat mit einem pH-Wert von 5,2 und 120 µl 95%igem Ethanol, 10 Minuten lang Inkubation auf Eis, 15minütiges Zentrifugieren, Dekantieren und Abgießen des Überstands, erneutes Auflösen in 70% Ethanol, Mischen auf einem Vortex, isminütiges Zentrifugieren, Dekantieren und Abgießen des Überstands sowie Sminütiges Trocknen in einer Vakuumzentrifuge). Die abgesetzte DNS wurde dann in 3 µl einer Lösung aus 5 Teilen entionisiertem Formamid und 1 Teil 50 mM EDTA mit einem pH-Wert von 8,0 erneut aufgelöst und auf einem Vortex gründlich gemischt. Bevor die Mischung auf das Gel gebracht wurde, wurde sie 2 Minuten lang bei 90ºC inkubiert, um die DNS zu denaturieren. Über 450 Basen des M13-Plasmids wurden mit der Basensuchroutine des automatischen Sequenzierers Modell 370A richtig identifiziert.
    • Beispiel 11. DNS-Sequenzanalyse mit rhodamin-markierten Dideoxynucleotiden und T7-DNS-Polymerase mit einem Manganpuffer
  • Die Sequenzierreaktion wird wie in Beispiel 10 ausgeführt, mit dem Unterschied, daß (1) anstelle der Taq- DNS-Polymerase die modifizierte T7-DNS-Polymerase (Sequenasetm, erhältlich bei United States Biochemical Corp.) verwendet wird, z.B. Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 86, S. 4076-4080 (1989) und Bd. 84, S. 4767-4771 (1987) und (2) anstelle des 5X Taq-Mg-Puffers 5X T7-Mn-Puffer (100 mM Tris-Cl mit einem pH-Wert von 7,5, 75 mM Natriumisocitrat, 10 mM MnCl&sub2;, 250 mM NaCl) verwendet wird, die Farbstoff-Terminator-Mischung aus 1,8 µM ddg-5R110, 5,4 µM dda-5R6G, 5,8 µM ddt-6TMR und 9,0 µM ddc-6ROX besteht, die dNTP-Mischung aus 750 µM dITP, 150 µM dATP, 150 µM dTTP und 150 µM dCTP besteht und die Erweiterungsreaktion 10 Minuten lang bei 37ºC ausgeführt wird.
    • Beispiel 12. DNS-Sequenzanalyse mit rhodamin-markier ten Dideoxynucleotiden und Taq-DNS-Polymerase mit einem Manganpuffer
  • Die Sequenzierung wurde wie in Beispiel 10 ausgeführt, mit dem Unterschied, daß anstelle des 5X Taq-Mg-Puffers 5X Taq-Mn-Puffer (100 mM Tris-Cl mit einem pH-Wert von 7,5, 75 mM Natriumisocitrat, 10 mM MnCl&sub2;, 250 mM Natriumchlorid) verwendet wurden und die Farbstoff-Terminator- Mischung aus 3,6 µM ddG-5R110, 2,7 µM ddA-5R6G, 43,2 µM ddt-6TMR und 23,8 µM ddC-6ROX bestand. Über 450 Basen des M13-Plasmids wurden mit der Basensuchroutine des automatischen Sequenzierers Modell 370A richtig identifiziert.
  • Die vorangegangene Beschreibung bevorzugter Ausführungen der Erfindung wurde zu Zwecken der Veranschaulichung und Erläuterung gegeben. Sie soll nicht erschöpfend sein oder die Erfindung auf die genau beschriebene Form beschränken, und natürlich sind viele Modifikationen und Variationen in Anbetracht der oben angegebenen Lehre möglich. Die Ausführungen wurden ausgewählt und beschrieben, um die Prinzipien der Erfindung und ihre praktische Anwendung am besten zu erklären und es dadurch Fachleuten zu ermöglichen, die Erfindung am besten in verschiedenen Ausführungen anzuwenden, die für die speziell betrachtete Verwendung geeignet sind. Der Anwendungsbereich der Erfindung soll durch die beigefügten Patentansprüche definiert werden.

Claims (11)

1. Ein Verfahren zur Unterscheidung von Polynucleotiden mit unterschiedlichen 3'-End-dideoxynucleotiden beim Kettenterminationsverfahren der DNA-Sequenzierung, wobei das Verfahren die folgenden Stufen aufweist:
Bildung einer Mischung einer ersten, einer zweiten einer dritten und einer vierten Klasse von Polynucleotiden, wobei jedes Polynucleotid in der ersten Klasse ein 3'-End-dideoxyadenosin aufweist und mit einer ersten Markierung markiert worden ist, die aus der Gruppe ausgewählt worden ist, die umfaßt: Tetramethylrhodamin, Rhodamin X, Rhodamin 6G und Rhodamin 110; wobei jedes Polynucleotid in der zweiten Klasse ein 3'-Enddideoxycytidin aufweist und mit einer zweiten Marke markiert worden ist, die aus der Gruppe ausgewählt worden ist, die umfaßt Tetramethylrhodamin, Rhodamin X, Rhodamin 6G und Rhodamin 110; wobei jedes Polynucleotid in der dritten Klasse ein 3'-Enddideoxyguanosin aufweist und mit einer dritten Marke markiert worden ist, die aus der Gruppe ausgewählt worden ist, welche Tetramethylrhodamin, Rhodamin X, Rhodamin 6G und Rhodamin 110 umfaßt; und wobei jedes Polynucleotid in der vierten Klasse eine 3'-End-dideoxythymidin aufweist und mit einer vierten Marke markiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt worden ist, welche Tetramethylrhodamin, Rhodamin X, Rhodamin 6G und Rhodamin 110 umfaßt; wobei jede Klasse der Nucleotide in der Mischung mit einer unterschiedlichen Marke markiert worden ist;
elektrophoretisches Separieren der Polynucleotide in der Mischung an bzw. auf einem Gel, so daß Bänder von Polynucleotiden mit einander entsprechenden Größen gebildet werden;
Belichten der Bänder an bzw. auf dem Gel mit einem Belichtungsstrahl, wobei der Belichtungsstrahl geeignet ist, um die Marken fluoreszierend zu machen; und
Identifizieren der Klassen der Polynucleotide in den Bändern durch die Fluoreszenz- oder Absorptionsspektren der Marken.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das 3'-Enddideoxyadenosin 2',3'-dideoxy-7-deazaadenosin ist und die erste Marke mit Hilfe einer Verbindungsgruppe an dessen siebten Kohlenstoffatom befestigt ist; das 3'-End-dideoxycytidin 2',3'- dideoxycytidin ist und die zweite Marke mit Hilfe einer Verbindungsgruppe an dessen fünften Kohlenstoffatom befestigt ist; das 3'-End-dideoxyguanosin aus der Gruppe ausgewählt worden ist, welche 2',3'-dideoxy-7-deazaguanosin und 2',3'-dideoxy-7- deazainosin umfaßt, und die dritte Marke mit Hilfe einer Verbindungsgruppe an deren siebten Kohlenstoffatom befestigt ist; und das 3'-End-dideoxythymidin 2',3'-dideoxyuridin ist und die vierte Marke mit Hilfe einer Verbindungsgruppe mit dessen fünften Kohlenstoffatom verbunden ist.
3. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Verbindungsgruppe 3-carboxyamino-1-propynyl ist und die siebten Kohlenstoffatome des 2',3'-dideoxy-7-deazaadenosin und des dideoxy-guanosins, welche aus der Gruppe ausgewählt worden ist, die 2',3'-dideoxy- 7-deazaguanosin und 2',3'-dideoxy-7-deazainosin umfaßt, mit einem fünften oder sechsten Kohlenstoffatom der ersten bzw. dritten Marke verbindet und die fünften Kohlenstoffatome des Desdeoxycytidins und Desdeoxyuridins mit einem fünften oder sechsten Kohlenstoffatom der zweiten bzw. vierten Marke verbindet.
4. Das Verfahren nach Anspruch 3, weiterhin umfassend die Stufe, bei welcher eine Mehrzahl von Polynucleotiden mit Hilfe einer DNA-Polymerase in Anwesenheit eines Dideoxyadenosintriphosphats, eines Dideoxycytidin-triphosphats, eines Dideoxyguanosin-triphosphats und eines Dideoxythymidintriphosphats von einem Primer abgeleitet wird, um die erste, die zweite, die dritte und die vierte Klasse von Polynucleotiden zu bilden.
5. Das Verfahren nach Anspruch 4, in welchem die DNA-Polymerase aus der Gruppe ausgewählt wird, die Taq-DNA-Polymerase und T7- DNA-Polymerase umfaßt.
6. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei die 2',3'-dideoxy-7- deazaadenosin an das fünfte Kohlenstoffatom des Rhodamin 6G gebunden ist, das 2',3'-dideoxycytidin an das sechste Kohlenstoffatom des Rhodamin X gebunden ist, wobei Dideoxyguanosin, welches aus der Gruppe ausgewählt worden ist, die 2',3'-dideoxy-7-deazaguanosin und 2',3'-dideoxy-7- deazainosin umfaßt, an das fünfte Kohlenstoffatom von Rhodamin 110 gebunden ist und das 2',3'-dideoxyuridin an das sechsten Kohlenstoffatom von Tetramethylrhodamin gebunden ist.
7. Das Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem das 2',3'- dideoxy-7-deazaadenosin an das sechste Kohlenstoffatom des Rhodamin X gebunden ist, das 2',3'-dideoxycytidin an dem fünften Kohlenstoffatom des Rhodamin 6G gebunden ist, wobei das Dideoxyguanosin, welches aus der Gruppe ausgewählt worden ist, die 2',3'-dideoxy-7- deazaguanosin und 2',3'-dideoxy-7-deazainosin umfaßt an das fünfte Kohlenstoffatom von Rhodamin 110 gebunden ist, und das 2',3'-dideoxyuredin an das sechste Kohlenstoffatom von Tetramethylrhodamin gebunden ist.
8. Das Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem das 2',3'- dideoxy-7-deazaadenosin an dem sechsten Kohlenstoffatom von Rhodamin X gebunden ist, das 2',3'-dideoxycytidin an das fünfte Kohlenstoffatom von Rhodamin 110 gebunden ist, wobei das Dideoxyguanosin, welches aus der Gruppe ausgewählt worden ist, die 2',3'-dideoxy-7-deazaguanosin umfaßt und 2',3'-dideoxy-7- deazainosin umfaßt, an das sechste Kohlenstoffatom von Tetramethylrhodamin gebunden ist,, und das 2',3'-dideoxyuridin an das fünfte Kohlenstoffatom von Rhodamin 6G gebunden ist.
9. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das 2',3'-dideoxy-7- deazaadenosin an das fünfte Kohlenstoffatom von Rhodamin 6G gebunden ist, das 2',3'-dideoxycytidin an das fünfte Kohlenstoffatom von Rhodamin 110 gebunden ist, wobei das Dideoxyguanosin, welches aus der Gruppe ausgewählt worden ist, die 2',3'-dideoxy-7-deazaguanosin und 2',3'-dideoxy-7- deazainosin umfaßt, an das sechste Kohlenstoffatom von Rhodamin X gebunden ist, und das 2',3'-dideoxyuridin an das sechste Kohlenstoffatom von Tetramethylrhodamin gebunden ist.
10. Das Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem das 2',3'- dideoxy-7-deazaadenosin an das sechste Kohlenstoffatom von Rhodamin X gebunden ist, das 2',3'-dideoxycytidin an das sechste Kohlenstoffatom von Tetramethylrhodamin gebunden ist, wobei das Dideoxyguanosin, welches aus der Gruppe ausgewählt worden ist, die 2',3'-dideoxy-7-deazaguanosin und 2',3'-dideoxy-7- deazainosin umfaßt an das fünfte Kohlenstoffatom von Rhodamin 6G gebunden ist, und das 2',3'-dideoxyuridin an das fünfte Kohlenstoffatom von Rhodamin 110 gebunden ist.
11. Eine rhodamin-markierte Zusammensetzung, die aus der Gruppe ausgewählt worden ist, die umfaßt:
wobei R&sub1; aus der Gruppe ausgewählt worden ist, die 5- und 6- carboxyrhodamin X, 5- und 6-carboxyrhodamin 6G, 5- und 6- carboxyrhodamin 110 und 5- und 6-carboxytetramethylrhodamin umfaßt, und wobei R&sub2; ein Triphosphat, ein 1-thiotriphosphat oder ein Polynucleotid mit 10 bis 600 Basen ist.
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