CN107109474B - 用于核酸检测的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

提供用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法、组合物、反应混合物、试剂盒和/或系统。在一些方面，所述方法、组合物、反应混合物、试剂盒和/或系统包括使所述样品在反应混合物中在产生关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下经历核酸扩增反应。在一些方面，扩增所产生的互补序列。

Description

用于核酸检测的方法和组合物

交叉参考

本申请要求于2014年8月19日提交的美国临时申请号62/039,207的利益，所述申请通过引用并入本文。

发明背景

小的非编码RNA在许多生物中充当重要的基因表达调节剂。He等人，Nat RevGenetics 2004，5（7）: 522-31。例如，已在植物和动物，包括人、小鼠、果蝇（Drosophila）和秀丽隐杆线虫（C. elegans）中鉴定了几百种微小RNA（miRNA）（Bino等人，2004，PLoS Biol.2（11）: e363）。具体地，已显示单链miRNA与不同人类疾病相关，例如生物过程如细胞凋亡、增殖、上皮细胞形态发生、神经和肌肉细胞分化中的缺陷，脂肪/胆固醇/葡萄糖稳态和病毒感染相关。参见例如，Esquela-Kerscher A & Slack FJ，Nat. Rev. Cancer，2006，6（4）:259-69；Michael等人，Mol. Cancer Res.，2003，1（12）: 882-91；Dimmeler S & NicoteraP，EMBO Mol. Med. 2013，5（2）: 180-90。近期发现提示影响这些过程的许多miRNA在循环系统中是丰富和稳定的，这使得miRNA和其他类似的调节性小非编码RNA是用于疾病诊断和鉴定的无价生物标记物，以及潜在的治疗靶。Brase JC等人，Mol. Cancer 2010，26（9）:306；Chen等人，Cell Res. 2008，18（10）: 997-1006。

然而，小RNA（包括微小RNA）由于许多原因而难以检测和定量。首先，小RNA很短；例如，微小RNA通常约20个核苷酸长，这大致是常规PCR引物的长度。这使得PCR扩增非常困难，所述PCR扩增是用于检测和定量的重要方法。其次，许多小RNA密切相关；例如，相同miRNA家族的许多成员是非常保守的，并且有时仅相差一个核苷酸。这使得准确分析特定小RNA的影响变得困难。

已设计了几种常规技术来满足这种需要，并且所有这些技术都具有许多严重的缺点。例如，第一种方法是基于茎环的RT-PCR。Chen等人，Nucleic Acids Res. 2005，33（20）:e179。在该方法中，茎环形状的RT引物结合miRNA的最后6个核苷酸并生成延长的cDNA。然后通过miRNA特异性正向引物和通用反向引物扩增该延长的cDNA。在RT-PCR期间，推测通过TaqMan探针确保定量的准确性。然而，使用该方法的缺点是缺乏特异性，因为用户不能利用解链曲线分析来控制特异性。此外，TaqMan探针结合由RT引物贡献的序列，其不一定是miRNA独有的。

第二种方法利用对miRNA的聚A尾部，并且使用加上标签的聚T引物用于RT。Shi等人，Biotechniques 2005，39（4）: 519-25。然而，使用这种方法的缺点是多方面的。首先，具有共同3'端的小RNA可能被错误地聚腺苷酸化。其次，聚腺苷酸化的效率是未知的。第三，在小RNA端的2'-氧甲基修饰阻断该多聚腺苷酸化。例如，植物miRNA携带这种2-氧甲基修饰。因此，存在可以解决这些缺点中的一个或多个的替代系统的相当大的需求。

发明概述

能够特异性、准确地和/或廉价地检测和/或定量小的非编码RNA的有利系统和/或方法将克服上述技术障碍中的一个或多个。这样的系统和/或方法将极大地促进利用小的非编码RNA用于诊断或其他临床应用的全部潜力。

相应地，本发明提供了用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法、组合物、反应混合物、试剂盒和/或系统。这些方法、组合物、反应混合物、试剂盒和/或系统可特别用于检测短核酸。在一个方面，本发明提供了用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法，所述方法包括使样品在反应混合物中在产生关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下经历核酸扩增反应，其中所述反应混合物包含：（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列D和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）环引物的序列A与靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）环引物的序列B与靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在靶多核苷酸上5'至3'定向；和（b）聚合酶，其沿靶多核苷酸从5'至3'延伸环引物的序列B，所述靶多核苷酸充当用于模板引导的引物延伸的模板，以产生靶多核苷酸的互补序列。

在一个实施方案中，所述方法还包括在反向引物和任选正向引物存在下，扩增样品中关于靶多核苷酸中的区域的互补序列，其中反向引物和正向引物显示出与扩增产物和环引物的序列互补性。在一些实施方案中，正向引物与接头序列中的序列特异性杂交。在一些实施方案中，反向引物与序列特异性杂交，所述序列与相对于序列A'或B'为5'的靶多核苷酸的一部分互补。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的核酸扩增产物。在一些实施方案中，检测步骤包括检测来自反应混合物中与产物具有序列互补性的探针的信号。在一些实施方案中，序列A为长度2nt至约10nt，并且序列B为长度2nt至约10nt。在一些实施方案中，序列A和B的组合长度为约5nt至约20nt。在一些实施方案中，序列A和B的组合长度足以与靶多核苷酸特异性杂交，以实现环引物的延伸。在一些实施方案中，当最佳比对时，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少80%互补。在一些实施方案中，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少90%互补。在一些实施方案中，序列A'的3'端在序列B'的1nt至约5nt内。在一些实施方案中，接头序列包含选自下述的一种或多种序列元件：一种或多种条形码序列、一种或多种限制性酶识别序列、一种或多种寡核苷酸探针结合序列或其互补体、一种或多种测序引物退火序列或其互补体、以及这些序列的组合。在一些实施方案中，接头序列包含多种不同环引物共有的通用序列。

在另一个方面，本发明提供了用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法，所述方法包括使样品在产生关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下，经历具有环引物、正向引物、反向引物和聚合酶的核酸扩增反应，其中所述反应混合物包含：（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列D和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）环引物的序列A与靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）序列B与靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）聚合酶，其沿靶多核苷酸从5'至3'延伸环引物的序列B，所述靶多核苷酸充当用于模板引导的引物延伸的模板，以产生靶多核苷酸的互补序列；（c）反向引物，其显示出与相对于序列A'或B'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（d）正向引物，其与和环引物互补的序列特异性杂交。在一个实施方案中，所述方法进一步包括检测核酸扩增的产物。在一些实施方案中，检测步骤包括检测来自反应混合物中与产物具有序列互补性的探针的信号。在一些实施方案中，序列A为长度2nt至约10nt，并且序列B为长度2nt至约10nt。在一些实施方案中，序列A和B的组合长度为约5nt至约20nt。在一些实施方案中，序列A和B的组合长度足以与靶多核苷酸特异性杂交，以实现环引物的延伸。在一些实施方案中，当最佳比对时，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少80%互补。在一些实施方案中，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少90%互补。在一些实施方案中，序列A'的3'端在序列B'的1nt至约5nt内。在一些实施方案中，接头序列包含选自下述的一种或多种序列元件：一种或多种条形码序列、一种或多种限制性酶识别序列、一种或多种寡核苷酸探针结合序列或其互补体、一种或多种测序引物退火序列或其互补体、以及这些序列的组合。在一些实施方案中，接头序列包含多种不同环引物共有的通用序列。

在一些实施方案中，所述方法包括在单一反应混合物中在产生关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下，产生关于靶多核苷酸中的区域的互补序列，其中所述反应混合物包含：（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列D和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）环引物的序列A与靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）序列B与靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）聚合酶，其沿靶多核苷酸从5'至3'延伸环引物的序列B，所述靶多核苷酸充当用于模板引导的引物延伸的模板，以产生靶多核苷酸的互补序列；（c）反向引物，其显示出与相对于序列A'或B'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（d）正向引物，其与和环引物互补的序列特异性杂交。

在一个方面，本发明提供了用于检测样品中少数等位基因的存在的方法，所述少数等位基因是与在单个碱基位置处更丰富的相应等位基因不同的序列变体。可在相同的反应或不同的反应中检测不同的等位基因，其中使用对于等位基因之一特异性的环引物检测每个等位基因。在一个实施方案中，所述方法包括使样品在反应混合物中在扩增少数等位基因和包含序列变体的更丰富的等位基因的区域的条件下，经历使用一对环引物的核酸扩增反应，其中反应混合物包含：（a）第一环引物，其包含在单链上从5'到3'定向的序列A1、接头序列D1和序列B1；其中所述第一环引物经由下述与少数等位基因特异性杂交：（i）环引物的序列A1与少数等位基因上的序列A1'之间的序列互补性，和（ii）环引物的序列B1与少数等位基因上的序列B1'之间的序列互补性，其中序列A1'和序列B1'在少数等位基因上5'至3'定向；（b）第二环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A2、接头序列D2和序列B2；其中所述第二环引物经由下述与更丰富的等位基因特异性杂交：（i）环引物的序列A2与更丰富的等位基因上的序列A2'之间的序列互补性，和（ii）环引物的序列B2与少数等位基因上的序列B2'之间的序列互补性，其中序列A2'和序列B2'在更丰富的等位基因上的5'至3'定向；和（c）聚合酶，其将第一和第二环引物的序列B1和序列B2沿分别的等位基因从5'延伸至3'，所述等位基因充当模板引导的引物延伸的模板，以产生分别的等位基因的互补序列。在另一个实施方案中，所述方法包括使样品的一部分在反应混合物中在扩增少数等位基因和包含序列变体的更丰富的等位基因的区域的条件下，经历使用一对环引物的核酸扩增反应；其中第一反应混合物包含第一环引物和聚合酶，第二反应混合物包含第二环引物和聚合酶，并且进一步地其中：（a）第一环引物，其包含在单链上从5'到3'定向的序列A1、接头序列D1和序列B1；其中所述第一环引物经由下述与少数等位基因特异性杂交：（i）环引物的序列A1与少数等位基因上的序列A1'之间的序列互补性，和（ii）环引物的序列B1与少数等位基因上的序列B1'之间的序列互补性，其中序列A1'和序列B1'在少数等位基因上5'至3'定向；（b）第二环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A2、接头序列D2和序列B2；其中所述第二环引物经由下述与更丰富的等位基因特异性杂交：（i）环引物的序列A2与更丰富的等位基因上的序列A2'之间的序列互补性，和（ii）环引物的序列B2与少数等位基因上的序列B2'之间的序列互补性，其中序列A2'和序列B2'在更丰富的等位基因上的5'至3'定向；和（c）聚合酶，其将第一或第二环引物的序列B1或序列B2沿分别的等位基因从5'延伸至3'，所述等位基因充当模板引导的引物延伸的模板，以产生分别的等位基因的互补序列。在一些实施方案中，两个等位基因在其上不同的单碱基位置由A1/A2或B1/B2跨越。在一些实施方案中，两个等位基因在两个位置不同，其中一个位置由A1/A2跨越，并且第二位置由B1/B2跨越。D1的序列可以与D2的序列相同或不同。当D1和D2的序列不同时，第一和第二环引物的扩增产物可以被选择性扩增和/或检测。使用所述一对环引物产生的扩增产物的扩增和检测可以根据本文所述的任何合适的方法执行。

在实践本文公开的任何方法中，靶多核苷酸可以是DNA分子。在一些实施方案中，靶多核苷酸是RNA分子。在一些实施方案中，靶多核苷酸是非编码RNA分子。在一些实施方案中，非编码RNA分子选自：成熟微小RNA分子、前体微小RNA分子、初级微小RNA分子、siRNA分子、piRNA分子、piwiRNA、lncRNA、rRNA和shRNA分子。在一些实施方案中，靶多核苷酸长度小于100nt。在一些实施方案中，靶多核苷酸长度小于50nt。

在另一个方面，本发明提供了基于一对环引物的单核变异的测试，所述一对环引物在序列A和B中的一个碱基位置中不同，使得一个识别靶序列的一个等位基因，并且另一个识别靶序列的不同等位基因。环引物在环序列D中也不同，并且可以被选择性扩增和/或检测。

在另一个方面，本发明提供了用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的组合物，所述组合物包含环引物、正向引物和反向引物，其中：（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）序列A和靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）序列B和靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）反向引物，其显示出与相对于序列A'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（c）正向引物，其与接头序列中的序列特异性杂交。在一个实施方案中，组合物进一步包含与通过反向引物或正向引物的延伸产生的靶多核苷酸的互补序列具有序列互补性的检测探针。在一些实施方案中，序列A为长度2nt至约10nt，并且序列B为长度2nt至约10nt。在一些实施方案中，序列A和B的组合长度为约5nt至约20nt。在一些实施方案中，序列A和B的组合长度足以与靶多核苷酸特异性杂交，以实现环引物的延伸。在一些实施方案中，当最佳比对时，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少80%互补。在一些实施方案中，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少90%互补。在一些实施方案中，序列A'的3'端在序列B'的1nt至约5nt内。在一些实施方案中，靶多核苷酸可以是DNA分子。在一些实施方案中，靶多核苷酸是RNA分子。在一些实施方案中，当用于主题组合物中时，靶多核苷酸是非编码RNA分子。在一些实施方案中，非编码RNA分子选自：成熟微小RNA分子、前体微小RNA分子、初级微小RNA分子、siRNA分子、piRNA分子、piwiRNA、lncRNA、rRNA和shRNA分子。在一些实施方案中，接头序列包含选自下述的一种或多种序列元件：一种或多种条形码序列、一种或多种限制性酶识别序列、一种或多种寡核苷酸探针结合序列或其互补体、一种或多种测序引物退火序列或其互补体、以及这些序列的组合。在一些实施方案中，接头序列包含多种不同环引物共有的通用序列。

在一些实施方案中，用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的组合物在容器中。在一些实施方案中，容器是孔、板、管、室、流动池或芯片。在一些实施方案中，用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的组合物是脱水形式。在一些实施方案中，用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的组合物是试剂盒的形式。在一些实施方案中，本公开内容提供了使用试剂盒形式的组合物用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法，所述方法包括在包含靶多核苷酸、环引物、正向引物、反向引物和聚合酶的反应混合物中执行核酸扩增反应，以获得可检测量的扩增子，其中所述靶多核苷酸长度小于约100nt。在一些实施方案中，使用试剂盒形式的组合物用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法进一步包括在包含靶多核苷酸、环引物、正向引物、反向引物和聚合酶的反应混合物中执行核酸扩增反应，以获得可检测量的扩增子，其中所述靶多核苷酸长度小于约100nt，并且扩增反应具有小于30的循环阈值（C_T）。

在另一个方面，本发明提供了用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的反应混合物，所述反应混合物包含环引物、正向引物、反向引物和聚合酶，其中：（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）序列A和靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）序列B和靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）反向引物，其显示与相对于序列A'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（c）正向引物，其与接头序列中的序列特异性杂交。在一个实施方案中，反应混合物进一步包含与通过反向引物或正向引物的延伸产生的靶多核苷酸的互补序列具有序列互补性的检测探针。在一些实施方案中，序列A为长度2nt至约10nt，并且序列B为长度2nt至约10nt。在一些实施方案中，序列A和B的组合长度为约5nt至约20nt。在一些实施方案中，序列A和B的组合长度足以与靶多核苷酸特异性杂交，以实现环引物的延伸。在一些实施方案中，当最佳比对时，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少80%互补。在一些实施方案中，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少90%互补。在一些实施方案中，序列A'的3'端在序列B'的1nt至约5nt内。在一些实施方案中，靶多核苷酸是DNA分子。在一些实施方案中，靶多核苷酸是RNA分子。在一些实施方案中，当用于主题组合物中时，靶多核苷酸是非编码RNA分子。在一些实施方案中，非编码RNA分子选自：成熟微小RNA分子、前体微小RNA分子、初级微小RNA分子、siRNA分子、piRNA分子、piwiRNA、lncRNA、rRNA和shRNA分子。在一些实施方案中，接头序列包含选自下述的一种或多种序列元件：一种或多种条形码序列、一种或多种限制性酶识别序列、一种或多种寡核苷酸探针结合序列或其互补体、一种或多种测序引物退火序列或其互补体、以及这些序列的组合。在一些实施方案中，接头序列包含多种不同环引物共有的通用序列。

在一些实施方案中，用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的反应混合物在容器中。在一些实施方案中，容器是孔、板、管、室、流动池或芯片。在一些实施方案中，用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的反应混合物是脱水形式。在一些实施方案中，用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的反应混合物是试剂盒的形式。

在一些实施方案中，使用主题试剂盒的方法包括在包含靶多核苷酸、环引物、正向引物、反向引物和聚合酶的反应混合物中执行核酸扩增反应，以获得可检测量的扩增子，其中所述靶多核苷酸长度小于约100nt。在一些实施方案中，靶多核苷酸长度小于约100nt，并且扩增反应具有小于30的循环阈值（C_T）。

在另一个方面，本发明提供了用于检测样品中的靶多核苷酸的系统，所述系统包括：（a）配置为接收客户请求以对样品执行检测反应的计算机；（b）在权利要求37的反应混合物中执行核酸扩增反应以产生扩增产物的扩增系统；和（c）报告生成器，其向接收者发送报告，其中所述报告含有检测对应于所述扩增产物的量的检测信号的结果。在一个实施方案中，接收方是客户。在一些实施方案中，计算机可读介质包括代码，所述代码在由一个或多个处理器执行后，实施检测样品中的靶多核苷酸的方法，所述方法包括：（a）接收客户请求，对样品执行检测反应；（b）在权利要求40的反应混合物中执行核酸扩增反应，以产生扩增产物；和（c）生成含有检测对应于扩增产物的量的检测信号的结果的报告。

在公开内容的各个方面的任一个中，环引物的接头序列可以包含发夹结构。

本发明的方法、组合物、反应混合物、试剂盒和/或系统可用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列。足以实现第一引物延伸和随后扩增两者的试剂可以同时或在不同时间添加。在其他实施方案中，第一引物延伸反应的产物可以全部或部分、稀释或未稀释地转移到在其中进行扩增过程的分开容器中。合适容器的非限制性实例包括微量离心管、锥形管、薄壁管、条管、多孔板、微流体装置和微阵列。在一些实施方案中，关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列或其扩增产物可用于检测和/或定量起始材料中的靶多核苷酸。主题方法和装置可特别用于检测遗传相关性、诊断、预后和/或诊断。

通过引用并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个个别出版物、专利或专利申请被具体且个别指出通过引用并入。

附图简述

在所附权利要求中特别阐述了本发明的新颖特征。通过参考下述详述将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详述阐述了利用本发明的原理的举例说明性实施方案以及附图，在所述附图中：

图1显示了本公开内容的互补序列扩增方案的示例性示意图。

图2显示了根据本公开内容的实施方案，通过特异性引物生成的逆转录（RT）产出的示例性毛细管电泳（CE）分析。

图3显示了根据本公开内容的实施方案，通过具有不同浓度的引物的qPCR的RT产物的示例性扩增。

图4显示了根据本公开内容的实施方案，在42℃或37℃下由特异性引物生成的RT产出的示例性CE分析。

图5显示了根据本公开内容的实施方案，通过特异性引物生成的RT产出的示例性分析。

图6显示了根据本公开内容的实施方案，使用特异性RT引物通过不同miRNA生成的RT产物的示例性CE分析。

图7显示了根据本公开内容的实施方案，具有单核苷酸差异的miRNA之间的区分的实例。

图8示出了可用于公开内容的方法、组合物、反应混合物、试剂盒和/或系统中的计算机系统的非限制性实例。

图9描述了公开内容的互补序列扩增方案的示例性示意图。

图10显示了根据本公开内容的实施方案，miRNA家族成员的特异性扩增的实例引物和结果。

图11提供了显示根据本公开内容的实施方案，miRNA家族成员（let-7a、b、c、d和e）的靶扩增敏感性的结果。结果指示至少约25-250个miRNA拷贝/μL的灵敏度。测定效率为约80-90%。

图12提供了根据本公开内容的实施方案，示出背景信号减少的引物和扩增结果的实例。

图13描绘了根据本公开内容的实施方案，特异性引物的3'互补序列的长度的示例性分析结果。

图14描绘了根据本公开内容的实施方案，5'和3'互补序列的长度的示例性分析结果。

图15描绘了根据本公开内容的实施方案，5'和3'臂序列的长度的示例性分析结果。

图16A和16B显示了使用阻断寡核苷酸的背景减少的示例性方案和示例性分析的结果。

图17A和17B显示了根据公开内容的实施方案，RT-PCR条件的示例优化的结果。RT引物浓度为约50nM。温度概况如下：25℃ 45分钟；85℃ 5分钟。

定义

术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行已知的或未知的任何功能。下述是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、基因间DNA、由连锁分析限定的基因座（loci）（基因座（locus））、外显子、内含子、信使RNA（mRNA）、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA（siRNA）、短发夹RNA（shRNA）、微小RNA（miRNA）、小核仁RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、衔接子和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在聚合物装配之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分、标签、反应性部分或结合配偶体缀合。除非另有说明，否则当提供时，多核苷酸序列以5'至3'方向列出。

如本文使用的，术语“靶多核苷酸”和“靶序列”可互换使用，并且指具有靶序列的核酸分子群体中的核酸分子或多核苷酸，本发明的一种或多种寡核苷酸被设计为与所述靶序列杂交。在一些实施方案中，靶序列唯一地识别来源于样品，例如特定基因组、线粒体、细菌、病毒或RNA（例如mRNA、miRNA、初级miRNA或前体miRNA）序列的序列。在一些实施方案中，靶序列是由多个不同靶多核苷酸共享的共同序列，例如与不同靶多核苷酸连接的共同衔接子序列。“靶多核苷酸”可以用于指包含在一条或两条链上的靶序列的双链核酸分子或者包含靶序列的单链核酸分子，并且可以来源于用于分离或生成核酸分子的任何来源或过程。靶多核苷酸可以包含一种或多种（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种）靶序列，其可以是相同或不同的。一般而言，不同的靶多核苷酸包含不同的序列，例如一个或多个不同的核苷酸或者一种或多种不同的靶序列。

“杂交”和“退火”指其中一个或多个多核苷酸反应以形成复合物的反应，所述复合物经由核苷酸残基的碱基之间的氢键合稳定。氢键合可通过沃森克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。复合物可以包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单条自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以构成在更广泛的过程例如PCR的起始或通过核酶的多核苷酸的酶促切割中的步骤。可以经由与第二序列的核苷酸残基的碱基氢键合稳定的第一序列被说成可与第二序列“杂交”。在这种情况下，第二序列也可以说成可与第一序列杂交。

“互补体（complement）”、“互补体（complements）”、“互补的”和“互补性”指与给定序列完全互补并且可杂交的序列。一般而言，可与第二序列或第二序列组杂交的第一序列可与第二序列或第二序列组特异性或选择性杂交，使得与第二序列或第二序列组的杂交在杂交反应期间优选（例如在给定的条件例如本领域通常使用的严格条件下热力学更稳定）于与非靶序列的杂交。通常，可杂交序列在其各自长度的全部或一部分上共享一定程度的序列互补性，例如在25%-100%互补性之间，包括至少约25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%序列互补性。

如应用于多核苷酸的术语“杂交”指经由核苷酸残基的碱基之间的氢键合稳定的复合物中的多核苷酸。氢键合可通过沃森克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。复合物可以包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单条自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以构成在更广泛的过程例如PCR反应的起始、连接反应、测序反应或切割反应中的步骤。

本发明适用于扩增各种短RNA分子和非编码RNA分子。如本文使用的，术语“非编码RNA分子”或“短RNA分子”指不编码蛋白质的任何RNA分子。非编码RNA分子的非限制性实例包括：微小RNA（miRNA）、piwi相互作用RNA（piRNA）、短干扰RNA（siRNA）、短发夹RNA（shRNA）、小核RNA（snRNA）、小核仁（snoRNA）、转移RNA（tRNA）和核糖体rna（rRNA）。如本文使用的，术语“微小RNA”用于指成熟微小RNA的生物发生中的任何形式的微小RNA，包括初级微小RNA（初级miRNA）、前体微小RNA（前体miRNA）和成熟微小RNA。RNA靶可以以小于1,000,000、100,000、10,000、5,000、2,500、1,000、500或100个拷贝或拷贝/细胞存在。

如本文使用的，“成熟微小RNA”指具有在19至30个核苷酸范围内的长度的RNA分子。术语“微小RNA”和“miRNA”可以互换使用。本领域已知的miRNA的非限制性实例包括：miR-1、miR-7、miR-9*、miR-10a、miR-10b、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17-3p、miR-17-5p、miR-18、miR-19a、miR-19b、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-27a、miR-28、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-30a-5p、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e-5p、miR-30e-3p、miR-31、miR-32、miR-33、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、miR-98、miR-99a、miR-99b、miR-100、miR-101、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-107、miR-122、miR-122a、miR-124、miR-124、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126*、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-130a、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-135a、miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146、miR-147、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154*、miR-154、miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-182*、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-187、miR-188、miR-189、miR-190、miR-191、miR-192、miR-193、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-196b、miR-197、miR-198、miR-199a*、miR-199a、miR-199b、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-208、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、miR-213、miR-214、miR-215、miR-216、miR-217、miR-218、miR-220、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-296、miR-299、miR-301、miR-302a*、miR-302a、miR-302b*、miR-302b、miR-302d、miR-302c*、miR-302c、miR-320、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-330、miR-331、miR-337、miR-338、miR-339、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR-363、miR-367、miR-368、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373*、miR-373、miR-374、miR-375、miR-376b、miR-378、miR-379、miR-380-5p、miR-380-3p、miR-381、miR-382、miR-383、miR-410、miR-412、miR-422a、miR-422b、miR-423、miR-424、miR-425、miR-429、miR-431、miR-448、miR-449、miR-450、miR-451、let7a、let7b、let7c、let7d、let7e、let7f、let7g、let7i、miR-376a和miR-377。本发明的方法适用于其的靶的进一步实例以及上述微小RNA靶的序列可以在如Griffith-Jones等人（2004），Nucleic Acids Research 32:D109-D111，和Griffith-Jones等人（2006），Nucleic Acids Research 34: D140-D144中所述的“miRBase序列数据库”中找到。

如本文使用的，术语“前体微小RNA”和“前体miRNA”可互换地用于指其加工释放成熟miRNA的任何分子。前体miRNA分子包含二级结构区域，其包含通过促成双链区的区域之间的序列形成的双链RNA的区域和环区域，导致发夹样结构。术语“初级RNA”和“初级miRNA”可互换地用于指其加工导致前体miRNA的任何分子。初级miRNA可以来自各种基因组来源，包括但不限于不同转录物、基因间区、其他转录物的非翻译区和内含子（包括所谓的“mirtron”）。

如本文使用的，术语“短干扰RNA”和“siRNA”可互换地用于指短于约50、40、35、30、25、20或更少的核苷酸的任何RNA分子，其能够基于互补性诱导基因靶的沉默。沉默通常由Argonaute蛋白介导，并且通常由短RNA分子触发起始。沉默可以是转录后或转录的。siRNA分子可以与其表达降低的一种或多种基因完全或部分互补，并且沉默可以伴随或不伴随mRNA转录物的切割而实现。如本文使用的，术语“短发夹RNA”和“shRNA”可互换地用于指具有由不参与碱基配对的区域分开、能够彼此碱基配对的两个区域的任何单链RNA分子，其加工释放一种或多种siRNA。shRNA可以是细胞（内源）或人工（外源）起源的。内源siRNA包括“piRNA”，其是一类Piwi相互作用RNA中的任一种。

此外，如本领域技术人员将了解的，一些miRNA可以进一步根据其在广泛多样的生物和广泛多样的组织中影响基因调节的能力进行表征。单个基因可以被多重miRNA调节，并且miRNA调节可以协同地起作用。单个miRNA也可能能够调节多重mRNA，例如，一些估计已提示单个人miRNA可以调节高达100-200种基因。近期还描述了高达30%的人基因是miRNA调节的靶。miRNA可以从各种生物中分离，所述生物的非限制性实例包括哺乳动物、两栖动物、昆虫、线虫、植物和在从后生动物到病毒范围内的许多其他生物。miRNA可以在生物之间、在生物内的组织之间差异表达，并且在生物内时间调节。miRNA调节可以影响多重过程。受miRNA基因调节影响的过程的非限制性实例包括：分化、发育、老化、细胞凋亡、肿瘤发生、代谢、细胞生长和细胞增殖（Zhou等人（2007），BMC Genomics 8: 396；和Lu等人（2008），PLoS ONE 3（10）: e3420）。由于受影响的许多途径，miRNA及其靶的失调已牵涉许多疾病，其非限制性实例包括：心血管疾病、自身免疫性病症、牛皮癣、病毒感染、精神分裂症、脂质代谢紊乱、肥胖、哮喘、唐氏综合征、肾功能障碍、体液稳态、发育异常、真性红细胞增多症、特应性湿疹、强直性肌营养不良、帕金森氏病、糖尿病、神经变性、图雷特氏综合征、脆性x综合征（Lu等人（2008），PLoS ONE 3（10）: e3420）。miRNA及其靶的失调已进一步牵涉许多癌症，其非限制性实例包括：多发性骨髓瘤、淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、儿科伯基特淋巴瘤、成人伯基特淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、实体癌、造血系统恶性肿瘤、结肠癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、套细胞淋巴瘤、垂体腺瘤、白血病、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌、甲状腺乳头状癌、膀胱癌、生殖细胞肿瘤、脑瘤和睾丸生殖细胞肿瘤。同上。像这样，miRNA可用作诊断、预后和治疗疾病中的标记物。

如本文使用的，术语“同源性”指与参考核苷酸序列同源的核苷酸序列。相比之下，术语“互补的”和“互补体”指例如在PCR反应的杂交阶段期间，能够与参考核苷酸序列碱基配对的核苷酸序列。此外，“非互补的”用于指例如在PCR反应的杂交阶段期间，在给定的一组条件下缺乏足够的互补序列以与参考序列稳定碱基配对的序列。同源性和互补性的程度可以根据给定的应用而变，并且可以多于5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或多于95%。此外，如本文使用的，术语“基本上非互补的”指与参考序列小于约50%、40%、30%、20%、10%或小于约5%互补的核苷酸序列序列。应理解具有相似结构的嘌呤和嘧啶含氮碱基根据沃森克里克配对是功能上等价的；并且例如通过甲基化的类似含氮碱基的相互取代不构成材料取代。

如本文使用的，术语“扩增（amplify）”、“扩增（amplifies）”、“扩增（amplified）”、“扩增（amplification）”和“扩增子”指使用引物依赖性聚合酶用于复制核酸的任何方法和/或那些过程的产物。在一个优选实施方案中，使用包含如上所述的第一和第二引物的一对引物借助于PCR来实现扩增。扩增的产物可以经历子序列分析，包括但不限于解链曲线分析、核苷酸测序、单链构象多态性测定、等位基因特异性寡核苷酸杂交、DNA印迹分析和限制性核酸内切酶消化。

可以通过使用探针来检测扩增产物。如本文使用的，术语“探针”指携带可检测成员并且与靶核酸具有互补性的多核苷酸，因此能够与所述靶杂交并且被所述可检测成员检测。在某些实施方案中，探针可以包括沃森克里克碱基或修饰的碱基。修饰的碱基包括但不限于AEGIS碱基（来自Eragen Biosciences），其已在例如美国专利号5,432,272；5,965,364；和6,001,983中描述。在某些方面，碱基通过天然磷酸二酯键或不同的化学键连接。不同的化学键包括但不限于肽键或LNA键，其在公开的PCT申请WO 00/56748和WO 00/66604中描述。

除非另有说明，否则本发明的实践采用在本领域的技术内的生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术。参见例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，第2版（1989）；CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR B1OLOGY（F. M. Ausubel等人编辑，（1987））；系列METHODS INENZYMOLOGY（Academic Press，Inc.）: PCR 2: A PRACTICAL APPROACH（M. J.MacPherson，B. D. Hames和G. R. Taylor编辑（1995））以及ANIMAL CELL CULTURE（R.I.Freshney，编辑（1987））。

发明详述

本发明提供用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法、组合物、反应混合物、试剂盒和/或系统。这些方法、组合物、反应混合物、试剂盒和/或系统可特别用于检测短核酸。

方法：

在一个方面，本发明提供了用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法，所述方法包括使样品在反应混合物中在产生关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下经历核酸扩增反应，其中所述反应混合物包含：（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列D和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）环引物的序列A与靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）环引物的序列B与靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在靶多核苷酸上5'至3'定向；和（b）聚合酶，其沿靶多核苷酸从5'至3'延伸环引物的序列B，所述靶多核苷酸充当用于模板引导的引物延伸的模板，以产生靶多核苷酸的互补序列。

在另一个方面，本发明提供了用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法，所述方法包括使样品在产生关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下，经历具有环引物、正向引物、反向引物和聚合酶的核酸扩增反应，其中所述反应混合物包含：（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列D和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）环引物的序列A与靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）序列B与靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）聚合酶，其沿靶多核苷酸从5'至3'延伸环引物的序列B，所述靶多核苷酸充当用于模板引导的引物延伸的模板，以产生靶多核苷酸的互补序列；（c）反向引物，其显示出与相对于序列A'或B'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（d）正向引物，其与和环引物互补的序列特异性杂交。

在本文公开的任何方法中使用或在任何组合物中存在的环引物指在其两端处与靶多核苷酸具有两段互补性的多核苷酸。该方法中使用的序列A是在环引物的5'端处的互补段，并且该方法中使用的序列B是在环引物的3'端处的互补段。在该方法中使用的这两个序列与靶多核苷酸的序列A'和B'碱基配对，其中A'定位比B'更5'。序列A'和B'彼此非常接近，并且仅通过在靶多核苷酸上的N'序列分开，如该方法中使用的。序列A和A'可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，序列A为长度5-15个核苷酸（例如长度10个核苷酸）。序列B和B'可以是至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，序列B为长度4-6个核苷酸。序列N'可以是1、2、3、4或5个核苷酸。在方法中使用的环引物上的序列A和B之间的间插接头序列（序列D）可以具有足够的长度，以允许环引物的结构空间同时使A和B分别对A'和B'退火。

在实践任何公开内容的方法中，环引物一般被设计成以A-A'碱基配对和B-B'碱基配对与靶多核苷酸特异性杂交。聚合酶然后使用靶多核苷酸作为模板从序列B的3'端延伸，以生成关于靶多核苷酸的互补序列，其中互补体针对区域N'，A'，然后经由模板引导的引物延伸生成的靶多核苷酸的剩余部分以该顺序产生。在模板引导的引物延伸期间，当聚合酶从序列B的3'端延伸时，A-A'杂交被敲除。第一互补序列因此将从5'到3'具有下述区域：A、D、B、N、A和靶多核苷酸的剩余部分。该互补序列由于通过序列D提供的长度而更长。该互补序列也可以是比靶多核苷酸更稳定的形式；例如，如果靶多核苷酸是miRNA并且聚合酶是逆转录酶，则该互补序列是更长的DNA多核苷酸，其更稳定。

设计用于任何主题方法或组合物的环引物的一个考虑是对于A-A'和B-B'选择的互补性区域。因为模板引导的引物延伸在序列B的3'端处发生，使得仅在靶多核苷酸上的B'的5'区域被扩增，所以期望A'和B'区域选择为相对接近于靶多核苷酸的3'端。这种选择确保足够数量的靶多核苷酸序列是A-A'和B-B'杂交的5'，以包括在第一互补序列中。

环引物、序列A和序列B的长度将取决于本领域已知的许多因素，例如引物的所需杂交温度、靶核酸序列和待扩增的不同靶核酸序列的复杂性。将环引物的核酸序列并入每个合成的第一互补核酸分子的序列内。在一些实施方案中，位于环引物的3'端处的第一互补核酸多核苷酸与靶互补核酸多核苷酸的至少一部分互补，并且因此能够与靶互补核酸多核苷酸的至少一部分杂交，并且可以是长度至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，第一互补核酸分子包含与靶序列的一个或多个核苷酸错配，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个错配。基本上非互补序列的选择将取决于待扩增的靶。这种基本上非互补的序列可以是人工的或设计的，例如在另一生物中发现的序列、在另一物种中发现的序列、在另一亚种中发现的序列、来自相同物种的不同成员的基本上非互补序列、选自与靶基本上非互补的区域来自相同主体的序列、已知与靶基本上非互补的随机生成的序列、或已知与靶基本上非互补的特别设计的序列。

在一些实施方案中，用于实践主题方法的序列A为长度2nt至约10nt，并且序列B为长度2nt至约10nt。在一些实施方案中，序列A和B的组合长度为约5nt至约20nt。在一些实施方案中，序列A和B的组合长度足以与靶多核苷酸特异性杂交以实现环引物的延伸。在一些实施方案中，当最佳比对时，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少80%互补。在一些实施方案中，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少90%互补。在一些实施方案中，序列A'的3'端在序列B'的1nt至约5nt内。

如方法中使用的环引物设计的另一个考虑是A-A'和B-B'杂交序列中的核苷酸数目。核苷酸的总数可以增加环引物和靶多核苷酸复合物的特异性和稳定性。该复合物的特异性和稳定性有助于靶多核苷酸的随后扩增和定量的准确性。需要时，序列B中的核苷酸数目可以大于序列A中的核苷酸数目，以增加效率，使得在从序列B的3'端的引物延伸的延长期间，AA'杂交被敲除。

在一些实施方案中，序列A和B在核苷酸碱基中具有相等的长度，包含至少3、4、5、6、7、8、9或10个但不超过约50个核苷酸。在另一个实施方案中，序列A是2个核苷酸，并且序列B是3个核苷酸。在另一个实施方案中，序列A是2个核苷酸，并且序列B是4个核苷酸。在另一个实施方案中，序列A是3个核苷酸，并且序列B是4个核苷酸。

设计环引物的相关考虑是A和B序列的组合长度，其一般足以允许与靶多核苷酸的特异性杂交。这种杂交应当足够稳定，以允许随后延长序列B的3'端的时间。在一些实施方案中，A和B的组合长度为约5至50个核苷酸、约5至约10个核苷酸、或约5 至约15个核苷酸。

环引物中A和B序列的互补性程度一般足以与靶多核苷酸特异性杂交。这种杂交应当足够稳定，以允许随后延长序列B的3'端的时间。在一些实施方案中，当序列最佳比对时，A和B序列与序列A'和B'的线性串联至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互补。

环引物中的序列A和B之间的核苷酸数目一般对应于序列N'和N的长度，这可以影响在第一互补链合成期间在序列B的3'端处的聚合酶延伸的效率。距离越大，聚合酶越容易配合环引物以起始模板引导的引物延伸且敲除A-A'杂交。然而，对于更大的距离，环引物和靶多核苷酸之间的结合特异性可以降低，因为更大的N'个核苷酸与由环引物的序列A和B指定的序列不特异性相互作用。在一些实施方案中，序列A'的3'端在序列B'的5'端的1nt至约10nt内、1nt至约5nt内、或2nt至约5nt内。

可以设计环引物以检测单核苷酸变异。例如，主题方法可利用在序列A和B中的一个碱基位置中不同的一对环引物，使得一个识别靶序列的一个等位基因，并且另一个识别靶序列的不同等位基因。环引物在环序列D中也不同，并且可以被选择性扩增和/或检测。

在一个实施方案中，一个环引物结合等位基因核苷酸以及相邻序列，并且另一个环引物结合与等位基因核苷酸紧相邻的序列；前者仅捕获一个等位基因，而后者捕获两个等位基因。在随后的检测、定量和扩增步骤期间，可以选择性区别可以具有不同接头序列的两个环引物，这依次又允许靶多核苷酸的不同等位基因与第一互补序列区别检测、定量且扩增。

主题环引物中的接头序列D一般被设计为具有用于AA'和B-B'两者的杂交的足够长度，其依次又增加环引物结合正确小RNA靶的特异性。在一个实施方案中，接头序列为约5至约100、10至约80或20至约50个核苷酸。在一些其他实施方案中，接头序列为长度约10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100个核苷酸。

需要时，主题方法中使用的或主题组合物中存在的接头序列可以包含一种或多种序列元件，包括但不限于一种或多种条形码序列、一种或多种限制性酶识别序列、一种或多种寡核苷酸探针结合序列或其互补体、一种或多种测序引物退火序列或其互补体、在多种不同环引物或不同环引物的子集之间共享的一种或多种共同序列、用于形成发夹的一对或多对互补序列或这些的组合。在一些实施方案中，接头序列包含多种不同环引物共有的通用序列。两个或更多个序列元件可以彼此不相邻（例如由一个或多个核苷酸分开）、彼此相邻、部分重叠或完全重叠。例如，扩增引物退火序列也可以充当测序引物退火序列。序列元件可以具有任何合适的长度，例如长度约、小于约或多于约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。

在一些实施方案中，接头序列包含用于形成发夹结构的一对或多对互补序列。一对序列中的每个序列可以称为“茎序列”。一对茎序列中的茎序列可以在其整个长度上完全互补，或者可以包含一个或多个（例如1、2、3、4、5个或更多）错配。在一些实施方案中，一对茎序列中的茎序列至少80%、85%、90%、95%或100%互补。茎序列可以是任何合适的长度，例如长度约或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，茎序列长度在5-10个核苷酸之间（例如长度7个核苷酸）。可以设计茎序列，使得通过其杂交形成的茎具有例如在35-90℃、40-75℃、45-65℃或50-55℃之间的特定解链温度（Tm）。在一些实施方案中，通过茎序列之间的杂交形成的茎具有在60-72℃之间的Tm。每个茎序列在接头序列内的位置可以改变。一般而言，茎序列之间的接头内的序列在茎序列之间杂交后形成环结构。茎序列之间的距离可以影响形成环的序列的长度，例如长度至少约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个核苷酸的环序列。在一些实施方案中，环序列为长度5-10个核苷酸（例如长度5个核苷酸）。环序列可以被设计为缺乏靶结合序列（例如与miRNA靶互补的序列）。茎可包括紧在环引物序列A和/或序列B中核苷酸之前的核苷酸。可替代地，环引物可包含在茎序列的端与序列A或序列B中的一个或两个的起点之间的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个）核苷酸，所述序列可称为“臂序列”。包含形成发夹结构的接头序列的环引物可以包含无、一个或两个臂，其中每个臂的长度彼此独立地选择。在一些实施方案中，一个或两个臂被设计为长度在5-15个核苷酸之间。

在一些实施方案中，接头序列包含独特的序列以有助于随后检测，定量目的靶多核苷酸的产生的互补序列。在产生第一互补体序列后，接头序列的一部分与正向引物互补。因此，在接头序列内具有特定条形码可以允许不同的环引物通过不同的正向引物但相同的反向引物扩增、检测或定量。在一些实施方案中，一个环引物的序列A和B可以结合与另一个环引物的序列A和B的相同靶多核苷酸略微不同的区域，这允许更大的特异性和/或用户验证。由于接头序列中不同的条形码，通过不同的正向引物不同地结合，可以促进这些不同环引物的后续扩增、检测和定量。

在一些实施方案中，接头包含一种或多种限制性酶识别序列。扩增后，用限制性消化可以显著改善检测的准确度，使得仅含有接头序列限制位点的从第一互补体序列扩增的真正产物被切割并且列表用于检测和定量。

在其他实施方案中，接头序列包含一种或多种寡核苷酸探针结合序列、寡核苷酸探针结合序列的互补体、引物退火序列或引物退火序列的互补体。在扩增期间，以序列特异性方式杂交的另外探针（如TaqMan）或增加扩增特异性的另外引物可以利用这些序列，以允许关于靶多核苷酸的第一互补序列的准确扩增的更大保证。

在其他实施方案中，接头序列包含与反应混合物中利用的所有环引物共同的区域。所有环引物共有的这种接头序列可以降低检测和定量的成本，因为随后的探针（例如TaqMan探针）、酶促消化及其序列、正向引物和作用于环引物的任何其他试剂可以跨越用于检测许多不同的靶多核苷酸的许多不同环引物在用途中是通用的。

在一些实施方案中，多个环引物中的每一个被设计为使得每个环引物或每个第一互补核酸分子的解链温度在35℃和90℃之间，例如在40℃和 75℃之间、在45℃和65℃之间、或在50℃和55℃之间。在一些实施方案中，多个环引物中的每一个被设计为使得每个环引物或每个互补核酸分子的解链温度为约、小于约或多于约40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、72℃、75℃、80℃或更高。在一些实施方案中，第一引物可以以约、至少约或至多约10、50、100、150、200、250、300、350至300、350、400、450、500、550、600、800、10000 nM或μM，或其间可衍生的任何范围或值的浓度存在。

在使用环引物和来自序列B的3'端的模板引导的引物延伸产生第一互补序列之后，使用靶多核苷酸作为模板，该第一互补序列变成用于扩增后续反应的模板，包括用于定量以及检测的目的。为了生成另外的拷贝，第一互补序列，尤其是对于在其内与靶多核苷酸互补的区域，正向引物与接头序列D内的序列特异性杂交，并且反向引物与比靶多核苷酸上的序列A'更5'的序列特异性杂交，其将比第一互补序列上的序列A更3'。然后可以在随后的反应中指数地扩增侧接所选引物的这个特定区域，非常类似于常规PCR。

在一些实施方案中，用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法进一步包括在反向引物和任选正向引物的存在下，扩增关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的步骤，其中反向引物和正向引物分别显示出与扩增产物和环引物的序列互补性。在一些实施方案中，正向引物与接头序列中的序列特异性杂交。在一些实施方案中，反向引物与序列特异性杂交，所述序列与相对于序列A'或B'为5'的靶多核苷酸的一部分互补。

正向和反向引物一般足够长，以在扩增反应的条件下引发靶核酸序列的模板引导的扩增。第二引物组引物的长度将取决于本领域已知的许多因素，例如引物的所需杂交温度、靶核酸序列和待扩增的不同靶核酸序列的复杂性。在一些实施方案中，正向和反向序列包含与靶序列的一个或多个核苷酸错配，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个错配。基本上非互补序列的选择将取决于待扩增的靶。这种基本上非互补的序列可以是人工的或设计的，例如在另一生物中发现的序列、在另一物种中发现的序列、在另一亚种中发现的序列、来自相同物种的不同成员的基本上非互补序列、选自与靶基本上非互补的区域来自相同主体的序列、已知与靶基本上非互补的随机生成的序列、或已知与靶基本上非互补的特别设计的序列。

需要时，环、正向和反向引物各自可以包含核苷酸类似物，例如修饰的核酸或其他非规范核苷酸。核苷酸类似物的其他非限制性实例包括但不限于2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-溴dU、脱氧尿苷、反转dT、双脱氧核苷酸、5-甲基dC、脱氧肌苷、锁核酸（LNA）、5-硝基吲哚和2'-O-甲基RNA碱基。

在一些实施方案中，正向和反向引物被设计为使得各自的解链温度在35℃和90℃之间，例如在40℃和75℃之间、在45℃和65℃之间、 或在50℃至55℃之间。在一些实施方案中，多个正向和反向引物中的每一个被设计为使得各自的熔解温度为约、小于约或多于约40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、72℃、75℃、80℃或更高。在进一步的实施方案中，环、正向和反向引物可以以约、至少约或至多约10、50、100、150、200、250、300、350至300、350、400、450、500、550、600、800、10000 nM或µM，或其间可衍生的任何范围或值的浓度存在于扩增反应中。

如上文注意到的，在一些实施方案中，通过使用本文公开的与包括正向和反向引物的第二组引物组合的环引物，达到主题方法中的第一互补核酸分子的扩增。第二引物组可以与环引物同时加入反应中。可替代地，在环引物延伸之后添加第二引物组。在另外其他实施方案中，可以在延伸反应后添加另外量的环引物。在延伸反应后添加一定量环引物可以伴随第二引物组的添加。在一些实施方案中，正向引物（例如与环引物内的序列的互补体杂交的引物）为长度约或至少约10、15、20个或更多个核苷酸。正向引物可以被设计为具有所需解链温度，例如55-75℃之间（例如62℃）的Tm。反向引物（例如与靶多核苷酸（例如miRNA）的互补体杂交的引物）可以被设计为具有一种或多种性质，例如55-75℃之间（例如62℃）的Tm。

在一些实施方案中，反应在单个反应混合物中在获得关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下发生，其中所述反应混合物包含：（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列D和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）环引物的序列A与靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）序列B与靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在靶多核苷酸上5'至3'定向；和（b）聚合酶，其沿靶多核苷酸从5'至3'延伸环引物的序列B，所述靶多核苷酸充当用于模板引导的引物延伸的模板，以产生靶多核苷酸的互补序列；（c）反向引物，其展示与关于序列A'或B'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（d）正向引物，其与和环引物互补的序列特异性杂交。

在一些实施方案中，主题方法利用与靶多核苷酸的量相比较过量存在的环、正向和/或反向引物。例如，所利用的环、正向和/或反向引物是与扩增反应中存在的靶多核苷酸的至少约1倍、10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1500倍、2000倍、3000倍、5000倍、7500倍、10000倍、20000倍、50000倍、100000倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍或更多倍。在一些实施方案中，环引物、正向引物和反向引物的使用允许一种或多种靶核酸分子扩增至可检测水平，其中在扩增之前在样品中存在一种或多种靶核酸分子的少于约5000、2500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、40、30、20、10、5个或更少拷贝。

第一互补序列的产生可以是一步RT-PCR或两步RT-PCR的一部分，其中反应混合物可以含有分别用于第一链合成和扩增的试剂，或者用于第一链合成和扩增两者一起的试剂。此外，用于随后扩增的反应混合物可以含有与第一互补序列产物杂交的不同引物，以获得不同长度或覆盖第一互补序列内的不同范围的产物。此外，定量或检测第一互补序列内的区域的特异性探针可增加特异性；例如，识别接头序列D中的特异性区域、靶多核苷酸序列或甚至第一互补序列中的这两个区域之间的重叠的TaqMan探针可以在产生靶核酸的第一互补序列之前、产生靶核酸的第一互补序列同时或产生靶核酸的第一互补序列之后加入反应混合物中。

第一互补序列的产生可以通过聚合酶实现。本领域中可获得广泛多样的聚合酶。非限制性实例包括RNA依赖性DNA聚合酶，例如来源于莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV-RT）、禽成髓细胞瘤病毒（AMV-RT）、牛白血病病毒（BLV-RT）、劳斯肉瘤病毒（RSV-RT）、人免疫缺陷病毒（HIV-RT）、劳斯相关病毒（RAV-RT）、成髓细胞瘤相关病毒（MAV-RT）或其他禽肉瘤白血病病毒（ASLV-RT）的逆转录酶（RT）、栖热菌属（Thermus）Z05聚合物、δZ05聚合酶及其任何修饰形式或衍生物。在一些实施方案中，RNA依赖性DNA缺乏RNaseH活性（例如，由Invitrogen，1600Faraday Avenue，PO Box 6482，Carlsbad，Calif. 92008销售的SUPERSCRIPT III™）。在一些实施方案中，具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶也具有DNA依赖性DNA聚合酶活性，并且用于逆转录和扩增步骤两者。

在任何一种主题方法中，环引物的引物延伸的条件可以取决于靶、第一引物的杂交要求、聚合酶、对其他试剂的要求和所需结果而变。改变引物延伸条件的方法是本领域已知的。许多试剂是商购可得的，并且可以优化浓度以达到期望的结果。典型的逆转录程序的非限制性实例包括在约42℃下进行约120分钟的引物延伸和通过在约80℃或高于约80℃的温度下温育约5分钟使酶失活的步骤。用于延伸的温育温度可以取决于所提及的因素而变，并且可以包括约、多于约或小于约25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃的温度或其间的任何温度。在一些实施方案中，延伸反应的温育温度为48℃至52℃。用于延伸的温育时间也可以改变，以包括约、多于约或小于约1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、180或更多分钟。失活时间和温度可以是达到酶失活的任何温度，并且可以包括但不限于约、多于约或小于约70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或95℃的温度，以及约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多分钟的时间。引物延伸之前可以是或不是热变性步骤，以破坏RNA分子之间的分子间和分子内相互作用。在一些实施方案中，引物延伸之前不进行热变性步骤。在一些实施方案中，逆转录程序不包括热失活步骤。在一些实施方案中，逆转录和PCR步骤是整合的，在单个管中执行。然后可以在环境温度下执行逆转录，其中优选热启动的聚合酶具有低活性。逆转录酶优选是莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）或禽成髓细胞瘤病毒（AMV）的天然或改造的变体。也可以使用具有两种活性的单一酶，例如Pyrophage（Lucigen Inc.）执行RT-PCR。

需要时，使用聚合酶链反应（PCR）酶促扩增第一互补核酸分子。该技术通常使用DNA依赖性DNA聚合酶，其是能够催化DNA聚合的酶。该方法的一个应用是检测或分离以低拷贝数存在的核酸。在某些方面，聚合酶在约或高于约20℃、23℃、25℃、37℃、42℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或更高下是活性的。在一些实施方案中，主题方法利用热稳定聚合酶。示例性的热稳定聚合酶包括但不限于嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）HB8（参见例如美国专利号5,789,224和美国公开20030194726）；突变型Thermus oshimai；水管致黑栖热菌（Thermus scotoductus）、嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）1B21；嗜热栖热菌GK24；水生栖热菌（Thermus aquaticus）聚合酶（AmpliTaq® FS或Taq（G46D；F667Y）（参见例如美国专利号5,614,365）、Taq（G46D；F667Y；E6811）和Taq（G46D；F667Y；T664N；R660G）；激烈热球菌（Pyrococcus furiosus）聚合酶；Thermococcus gorgonanus聚合酶；热球菌属（Pyrococcus）物种GB-D聚合酶；热球菌属（Thermococcus）物种（菌株9° N-7）聚合酶；嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）聚合酶；Tsp聚合酶；ThermalAce™聚合酶（Invitrogen）；黄栖热菌（Thermus flavus）聚合酶；Thermus litoralis聚合物；栖热菌属Z05聚合物；δZ05聚合物（例如δZ05 Gold DNA聚合物）；及其突变体、变体或衍生物。示例性的非热稳定聚合酶包括但不限于DNA聚合酶I；突变型DNA聚合酶I，包括但不限于Klenow片段和Klenow片段（减去3'至5'个核酸外切酶）；T4 DNA聚合酶；突变型T4 DNA聚合酶；T7 DNA聚合酶；突变型T7 DNA聚合酶；phi29 DNA聚合酶；和突变型phi29 DNA聚合酶。在一些实施方案中，在引物延伸步骤中使用的具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶是在第一引物延伸步骤中用于第一引物的引物延伸的相同酶，使得所述酶还具有RNA依赖性DNA聚合酶活性。

在一些实施方案中，主题方法利用热启动聚合酶。热启动聚合酶是需要热活化的修饰形式的DNA聚合酶（参见例如美国专利号6,403,341和7,122,355，通过引用在此整体并入）。这种聚合酶可以用于例如进一步增加灵敏度、特异性和产率；和/或进一步改善低拷贝靶扩增。通常，热启动酶以非活性状态提供。在热活化后，释放修饰或修饰剂，生成活性酶。许多热启动聚合酶可从不同商业来源获得，例如Applied Biosystems；Bio-Rad；eEnzymeLLC；Eppendorf North America；Finnzymes Oy；GeneChoice，Inc.；Invitrogen；JenaBioscience GmbH；MIDSCI；Minerva Biolabs GmbH；New England Biolabs；Novagen；Promega；QIAGEN；Roche Applied Science；Sigma-Aldrich；Stratagene；Takara MirusBio；USB Corp.；Yorkshire Bioscience Ltd；等等。

主题方法可用于同时产生具有不同序列的不同靶多核苷酸的互补序列。可以通过在延伸反应中使用多于一种不同的环引物来达到多于一种不同的第一互补核酸分子的生成，每种不同的环引物在其3'端处具有不同的第一序列，与多个不同的多核苷酸分子靶之一的至少一部分具有互补性。在一些实施方案中，可以选择这些不同的环引物序列，以具有与目的特定多核苷酸分子靶的至少一部分具有互补性的限定序列。在其他实施方案中，环引物序列是随机和未限定的或接近随机的，其中沿环引物序列的某些位置偏向一个或多个核苷酸，例如，包含从两种或更多种不同核苷酸随机选择的一个或多个核苷酸。可以组合多种不同的环引物，不同环引物各自的浓度相同或不同，以产生环引物的“库”。这种环引物库的使用允许同时产生多种不同的第一互补核酸分子，各自与多种不同的多核苷酸分子靶之一具有互补性。

在方法的一个进一步的实施方案中，多于一种不同的第一互补多核苷酸分子用作扩增的模板以产生多个拷贝。这可以通过在扩增反应中使用多于一组正向和反向引物来达到，每种不同的引物在其3'端处具有不同的第二序列，与多个不同的第一互补多核苷酸靶之一的至少一部分具有互补性。在一些实施方案中，可以选择这些不同的正向和反向引物，以具有与目的特定第一DNA分子靶的至少一部分具有互补性的限定序列。在其他方面，不同的正向和反向引物是随机和未限定的或接近随机的，其中沿序列的某些位置偏向一个或多个核苷酸，例如从两种或更多种不同核苷酸随机选择的一个或多个核苷酸。可以组合多种不同的正向和反向引物，不同引物各自的浓度相同或不同，以产生二级引物的“库”。 与环引物库组合的这种二级引物库的使用允许同时产生多种不同的第一互补序列分子，各自与多种不同靶多核苷酸分子靶之一的至少一部分具有互补性。

用于生产或扩增第一DNA分子的库中的引物组合可以是多种选项中的任何一种。使用第一引物库生产第一DNA分子随后可以为使用具有第二序列的一种或多种选择第二引物的扩增，所述第二序列与一个或多个选择的第一DNA分子具有互补性。可替代地，使用第一引物库生产第一DNA分子随后可以为使用第二引物库的扩增，其中库含有用于引物延伸反应的预期第一DNA分子产物各自的第二引物。在仍另外一个实施方案中，可以加入一对或多对第一和第二引物，以使用第一引物库扩增通过引物延伸产生的一个或多个第一DNA分子。引物库无需含有完全重叠的RNA子集和互补的第一DNA分子靶。

产生关于靶多核苷酸的互补序列和/或扩增双链靶多核苷酸的主题方法可以在相同的反应位点（例如包含在容器中）执行。用于产生互补序列的试剂和用于随后扩增的试剂可以同时或序贯加入。在一些实施方案中，用于进行环引物延伸反应和扩增反应两者的所有试剂一起加入，使得两个反应可以在无需样品的进一步操作下进行。在一些实施方案中，在环引物延伸反应后添加用于进行扩增反应的一种或多种试剂。在一些实施方案中，第一互补分子的扩增在与用于通过环引物的引物延伸产生第一DNA分子的分开容器中进行。当转移环引物延伸产物时，可以使用完全反应体积或其一部分。来自单环引物延伸反应的多重部分可以转移到多个分开的容器中，以便进行多重扩增反应。单独的反应容器可以具有与引物延伸反应中使用的相同或不同的类型。反应容器的非限制性实例包括微量离心管、锥形管、薄壁管、条管、多孔板、微流体装置和微阵列。

需要时，反应的不同步骤可以用偶联至支持物的一种或多种引物（例如环引物、正向或反向引物）发生。在一些实施方案中，一个或多个环引物偶联至固体支持物。在一些实施方案中，环连同正向和反向引物中的一种或多种偶联至支持物。偶联可以以多种方式实现，其非限制性实例包括两种或更多种分子之间的共价连接、静电相互作用和分子间相互作用。不同种类的固体支持物是本领域已知的，其非限制性实例包括晶片、芯片、珠、孔、板、微流体装置、微阵列和不同尺寸的管。固体支持物可以由能够支持这种偶联的各种材料构成，所述材料的非限制性实例包括硅、塑料、玻璃、聚合物、金属和半导体材料。

在实践一种或多种主题方法时，可以利用设计为同时扩增多种不同靶多核苷酸分子的反应容器，每种不同靶分子在不同位置中扩增。这可以以各种方式达到。在一个实施方案中，多个不同位置各自包含例如在阵列中具有第二序列的一个或多个引物，所述第二序列与特异性第一互补序列分子的至少一部分互补。不同的位置各自可以进一步包括用于生成和扩增特定靶多核苷酸的相应环引物。引物可以或可以不物理偶联至其各自不同的位置。可替代地，偶联至具有第二序列（其与特定第一互补序列分子的至少一部分具有互补性）的一种或多种引物的珠在与偶联至具有不同第二序列的一种或多种第二引物的其他珠的不同位置中分离，其中例如通过水包脂质乳剂或在表面上排列来达到分离。在一些实施方案中，通过第一互补序列分子的引物延伸的产生在不同位置中的扩增之前在溶液中游离完成。在其他实施方案中，例如当环引物以及正向和反向引物的第二引物组位于不同位置中时，通过第一互补序列分子的引物延伸的产生在不同位置中进行。

靶核苷酸序列或其区域的扩增可以在聚合酶链反应期间以多个循环执行。期望数目的扩增循环可以在1至45个扩增循环之间，例如1至25个扩增循环，或例如5至35个扩增循环，或例如10至45个扩增循环。循环参数将变化，并且可以基于许多因素进行优化，所述因素包括但不限于引物序列、引物解链温度、靶分子的长度、靶序列、靶的复杂性、靶群体的复杂性、聚合酶的最佳活性、以及其他试剂的要求。典型PCR方案的非限制性实例如下：（1）95℃10分钟，（2）95℃20秒，（3）50℃20秒，（4）72℃1分钟，（5）重复步骤2至4 四十次，（6）72℃10分钟，其中步骤（1）至（6）分别对应于初始解链、循环解链、杂交、延伸、循环计数和最终延伸。对于每个反应可以优化每个步骤的温度和持续时间，如从一个步骤到下一个步骤的温度变化速率一样。在一些实施方案中，可能能够组合步骤（3）（退火）和步骤（4）（延伸），并且可以完全排除步骤（6）。这种PCR方案的非限制性实例如下：（1）95℃10分钟，（2）95℃15秒，（3）60℃1分钟，（4）重复步骤2通过3 39次。在一些实施方案中，杂交温度为约、至少约或至多约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或更高。在一些实施方案中，杂交步骤的持续时间为约、至少约或至多约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、45、60、90、120或更多秒。在一些实施方案中，可能期望包括解链曲线分析。解链曲线分析参数的非限制性实例如下：（1）95℃15秒，（2）60℃15秒，（3）95℃15秒。

扩增反应的成功可以通过在扩增过程期间（例如实时）或扩增过程之后经由使用可检测标记物（例如探针或标记）检测扩增产物来确定。例如，扩增的DNA分子可以通过染料（例如，SYBR绿）的存在来检测且定量，所述染料在本发明方法的PCR扩增步骤期间优先或排他地结合双链DNA。例如，Molecular Probes，Inc.（29851 Willow Creek Road，Eugene，Oreg. 97402）销售包括SYBR绿染料的定量PCR反应混合物。作为进一步的实例，可以用于标记在实时PCR期间产生的双链DNA的另一种染料（称为“BEBO”）由Bengtsson，M.等人，Nucleic Acids Research 31（8）:e45（2003年4月15日）描述，所述出版物通过引用并入本文。例如，包括荧光团和猝灭剂的第一和/或第二引物可以用于引发本发明方法的PCR扩增步骤。在PCR期间在标记引物的延伸之后发生的荧光团和猝灭剂的物理分离允许荧光团发荧光，并且荧光可以用于测量PCR扩增产物的量。包括荧光团和猝灭剂的商购可得引物的实例包括Scorpion引物和Uniprimers，它们都由Molecular Probes，Inc销售。

在一些实施方案中，多重扩增中存在的寡核苷酸探针适合于监测作为时间函数产生的扩增产物的量。这样的寡核苷酸探针包括但不限于5' - 核酸外切酶测定（例如TaqMan™）探针（参见上文以及美国专利号5,538,848）、茎-环分子信标（参见例如美国专利号6,103,476和5,925,517以及Tyagi＆Kramer，1996）、无茎或线性信标（参见例如WO 99/21881）、PNA分子信标（参见例如美国专利号6,355,421和6,593,091）、线性PNA信标（参见例如Kubista等人、2001）、非FRET探针（参见例如美国专利号6,150,097）、Sunrise®™/Amplifluor®™探针（参见例如美国专利号6,548,250）、茎-环和双链体Scorpion™探针（参见例如Solinas等人，2001和美国专利号6,589,743）、凸环探针（参见例如美国专利号6,590,091）、假结探针（参见例如美国专利号6,548,250）、环状体（cyclicon）（参见例如美国专利号6,383,752）、MGB Eclipse™ 探针（Epoch Biosciences）、发夹探针（参见例如美国专利号6,596,490）、肽核酸（PNA）点亮探针、自装配纳米颗粒探针和二茂铁修饰的探针例如在美国专利号6,485,901；Mhlanga等人，2001；Whitcombe等人，1999；Isacsson等人，2000；Svanvik等人，2000；Wolffs等人，2001；Tsourkas等人，2002；Riccelli等人，2002；Zhang等人，2002；Maxwell等人，2002；Broude等人，2002；Huang等人，2002；和Yu等人，2001中描述。

在某些实施方案中，标记附着至一个或多个探针并且具有下述性质中的一种或多种：（i）提供可检测信号；（ii）与第二标记相互作用，以修饰由第二标记提供的可检测信号，例如FRET（荧光共振能量转移）；（iii）稳定杂交，例如双链体形成；和（iv）提供结合复合物或亲和组的成员，例如亲和性、抗体/抗原、离子复合物、半抗原/配体（例如生物素/抗生物素蛋白）。在仍另外其他方面，可以使用大量已知技术中的任何一种，采用已知的标记、连接、连接基团、试剂、反应条件、以及分析和纯化方法来完成标记的使用。

标记的其他非限制性实例包括生成或淬灭可检测的荧光、化学发光或生物发光信号的发光、光散射和光吸收化合物（参见例如Kricka，1992）和Garman，1997 ）。可用作标记的荧光报告染料包括但不限于荧光素（参见例如美国专利号5,188,934；6,008,379；和6,020,481）、罗丹明（参见例如美国专利号5,366,860；5,847,162；5,936,087；6,051,719；和6,191,278）；苯并吩噁嗪（参见例如美国专利号6,140,500）、包含供体和受体对的能量转移荧光染料（参见例如美国专利号5,863,727；5,800,996；和5,945,526）和花青素（参见例如Kubista，WO 97/45539）、以及能够生成可检测信号的任何其他荧光部分。荧光素染料的实例包括但不限于6-羧基荧光素；2',4',1,4,-四氯荧光素；和2',4',5',7',1,4-六氯荧光素。在某些方面，荧光标记选自SYBR®绿、6-羧基荧光素（“FAM”）、TET、ROX、VIC™和JOE。在某些实施方案中，标记是放射性标记。

在再一个进一步的实施方案中，标记是杂交稳定部分，其作用于增强、稳定或影响双链体的杂交，例如嵌合剂和嵌入染料（包括但不限于溴化乙锭、EvaGreen®和SYBR®绿）、小沟粘合剂和交联官能团（参见例如Blackburn，G.和Gait，M.编辑"DNA and RNAstructure" 于Nucleic Acids in Chemistry and Biology（1996）。标签包括通过特异性或非特异性捕获实现分子分离或固定的那些标记，例如生物素、地高辛和其他半抗原（参见例如，Andrus，1995）。

在一些实施方案中，不同的探针包括可彼此区别的可检测和不同的标记。例如，在某些实施方案中，标记是能够在不同的光谱可分辨的波长下发光的不同荧光团（例如，4种不同颜色的荧光团）；某些此类标记的探针是本领域已知的并且在上文以及美国专利号6,140,054和Saiki等人，1986中描述。

在一些实施方案中，可检测标记物用于在扩增反应完成后确定靶核酸分子的存在、不存在、相对丰度和/或数量。在一些实施方案中，可检测标记物是探针。在一些实施方案中，多种不同的探针用于同时检测多种不同的靶核酸分子扩增产物。探针可以结合到固体表面，例如在珠或阵列上。可以布置阵列上的探针，使得每个探针的位置是已知的，并且扩增产物与探针的杂交的检测鉴定扩增产物。可用于检测和/或定量非编码RNA分子的探针和阵列的实例在通过引用并入本文的US20080045418和US20080312099中提供。

本文公开的方法适用于产生任何类型的靶核酸分子的互补序列，包括但不限于DNA。在一些实施方案中，靶多核苷酸是RNA分子。在一些实施方案中，靶多核苷酸是非编码RNA分子。在一些实施方案中，非编码RNA分子选自：成熟微小RNA分子、前体微小RNA分子、初级微小RNA分子、siRNA分子、piRNA分子、piwiRNA、lncRNA、rRNA和shRNA分子。在一些实施方案中，靶多核苷酸长度小于100nt。在一些实施方案中，靶多核苷酸长度小于50nt。

在任何公开的方法中可用作扩增靶的非编码RNA分子可以从任何生物，例如真核生物或其部分，包括器官、组织和/或各个细胞包括培养细胞中分离。可以使用包括靶RNA的任何合适的制剂，例如总RNA、纯化的小RNA或者含有RNA和DNA两者的样品。可以通过涉及细胞裂解的程序从细胞中分离RNA，并且可以进一步涉及其中包含的蛋白质的变性。由其提取RNA的细胞可以是野生型细胞、操作的野生型细胞、修饰的细胞和操作的修饰的细胞，其中操作包括但不限于药物治疗。

可用作本发明方法中的扩增靶的短DNA分子可以从任何生物，例如真核生物或其部分，包括器官、组织和/或各个细胞包括培养细胞中分离，使用本领域已知的另外的标准步骤以去除一些或全部DNA。细胞裂解和核酸提取的程序是本领域众所周知的。这种程序的非限制性实例包括下述。可以用例如非离子去污剂完成细胞裂解，随后为微量离心以去除细胞核，且由此去除细胞DNA的大部分。可以使用硫氰酸胍裂解从不同类型的目的细胞中提取RNA，随后为CsCl离心以使RNA与DNA分离（参见Chirgwin等人，1979，Biochemistry 18:5294-5299）。RNA的提取和任选地与DNA的分离也可以通过有机提取，例如用苯酚、苯酚/氯仿/异戊醇或类似制剂（包括TRizol（Invitrogen）和TriReagent（Applied Biosystems））来完成。提取技术的其他非限制性实例包括：（1）有机提取，随后为乙醇沉淀，例如在某些实施方案中使用苯酚/氯仿有机试剂（Ausubel等人，1993），使用自动化核酸提取器，例如可得自Applied Biosystems（Carlsbad，Calif.）的Model 341 DNA Extractor；（2）固相吸附法（美国专利号5,234,809；Walsh等人，1991）；和（3）盐诱导的核酸沉淀方法（Miller等人，（1988），这种沉淀方法通常称为“盐析”方法。在某些实施方案中，上述分离方法之前可以为酶消化步骤，以帮助从样品中消除不想要的蛋白质，例如，用蛋白酶K或其他类似蛋白酶消化。参见例如美国专利号7,001,724，如果需要，则可以将RNase抑制剂加入裂解缓冲液中。对于某些细胞类型，可能期望向方案中加入蛋白质变性/消化步骤。含有RNA的样品可以包含多种不同的RNA分子，每种不同的RNA分子具有不同的核苷酸序列。

主题方法可特别用于扩增短靶序列包括短RNA分子。具有接头序列D的添加长度的环引物对第一互补序列添加长度用于随后的扩增。在一些实施方案中，靶多核苷酸为长度小于100nt、90nt、80nt、70nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt或15nt。

组合物：

在另一个方面，本发明提供了用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的组合物，所述组合物包含环引物、正向引物和反向引物，其中：（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）序列A和靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）序列B和靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）反向引物，其显示出与相对于序列A'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（c）正向引物，其与接头序列中的序列特异性杂交。

在主题组合物中体现的环引物可以是具有上文部分公开的一种或多种特征的任何环引物。例如，环引物包含在其两端处与靶多核苷酸的两段互补性。该组合物中使用的序列A是在环引物的5'端处的互补段，并且该组合物中使用的序列B是在环引物的3'端处的互补段。在该组合物中使用的这两个序列与靶多核苷酸的序列A'和B'碱基配对，其中A'定位比B'更5'。在另一个例子中，序列A'和B'彼此非常接近，并且它们仅通过在靶多核苷酸上的N'序列分开。在其他实施方案中，序列A和A'可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在其他例子中，序列B和B'可以是至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。序列N'可以是1、2、3、4或5个核苷酸。

需要时，环引物可以包含上文部分中公开的任何其他特征。例如，可能期望设计定位接近于靶多核苷酸的3'端的A'和B'区。这种选择确保足够数目的靶多核苷酸序列是A-A'和B-B'杂交的5'，以包括在第一互补序列中。例如，序列A为长度约2nt至约10nt或2nt至约5nt，并且序列B为长度约2nt至约10nt或长度2nt至约5nt。在一些实施方案中，序列A和B的组合长度为约5nt至约20nt、或5nt至约15nt、或5nt至约10nt。在一些实施方案中，序列A和B的组合长度足以与靶多核苷酸特异性杂交，以实现环引物的延伸。在一些实施方案中，当最佳比对时，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少80%、85%、90%、95%、99%或100%互补。在一些实施方案中，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少90%、95%、99%或100%互补。在一些实施方案中，序列A'的3'端在序列B'的1nt至约5nt内。

在一些实施方案中，序列B中的核苷酸数目可以大于序列A中的核苷酸数目，以增加效率，使得在从序列B的3'端的引物延伸的延长期间，AA'杂交被敲除，在一些实施方案中，序列A和B在核苷酸碱基中具有相等的长度，包含至少3、4、5、6、7、8、9或10个但不超过约50个核苷酸。在另一个实施方案中，序列A是2个核苷酸，并且序列B是3个核苷酸。在另一个实施方案中，序列A是2个核苷酸，并且序列B是4个核苷酸。在另一个实施方案中，序列A是3个核苷酸，并且序列B是4个核苷酸。

环引物中的序列A和B之间的核苷酸数目一般对应于序列N'和N的长度，这可能影响在第一互补链合成期间在序列B的3'端处的聚合酶延伸效率。在一些实施方案中，序列A'的3'端在序列B'的5'端的1nt至约10nt内、1nt至约5nt内、或2nt至约5nt内。

在一些实施方案中，环引物被设计为检测单核变化。例如，一对环引物在序列A和B中的一个碱基位置中不同，使得一个识别靶序列的一个等位基因，并且另一个识别靶序列的不同等位基因。环引物在环序列D中也不同，并且可以被选择性扩增和/或检测。

主题环引物中的接头序列D一般被设计为具有足够的长度用于AA'和B-B'两者的杂交，其依次又增加环引物结合正确小RNA靶的特异性。在一个实施方案中，接头序列为约5至约100、10至约80、或20至约50个核苷酸。在一些其他实施方案中，接头序列为长度约10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100个核苷酸。

需要时，主题方法中的使用或主题组合物中存在的接头序列包含选自下述的一种或多种序列元件：一种或多种条形码序列、一种或多种限制性酶识别序列、一种或多种寡核苷酸探针结合序列或其互补体、一种或多种测序引物退火序列或其互补体、以及这些序列的组合。在一些实施方案中，接头序列包含多种不同环引物共有的通用序列。

在一些实施方案中，接头序列包含独特的序列以有助于随后检测，定量目的靶多核苷酸的产生的互补序列。在产生第一互补体序列后，接头序列的一部分与正向引物互补。因此，在接头序列内具有特定条形码可以允许不同的环引物通过不同的正向引物但相同的反向引物扩增、检测或定量。在一些实施方案中，一个环引物的序列A和B可以结合与另一个环引物的序列A和B的相同靶多核苷酸略微不同的区域，这允许更大的特异性和/或用户验证。由于接头序列中不同的条形码，通过不同的正向引物不同地结合，可以促进这些不同环引物的后续扩增、检测和定量。

在一些实施方案中，接头包含一种或多种限制性酶识别序列。扩增后，用限制性消化可以显著改善检测的准确度，使得仅含有接头序列限制位点的从第一互补体序列扩增的真正产物被切割并且列表用于检测和定量。

在其他实施方案中，接头序列包含一种或多种寡核苷酸探针结合序列、寡核苷酸探针结合序列的互补体、引物退火序列或引物退火序列的互补体。在扩增期间，以序列特异性方式杂交的另外探针（如TaqMan）或增加扩增特异性的另外引物可以利用这些序列，以允许关于靶多核苷酸的第一互补序列的准确扩增的更大保证。

在其他实施方案中，接头序列包含与反应混合物中利用的所有环引物共同的区域。所有环引物共有的这种接头序列可以降低检测和定量的成本，因为随后的探针（例如TaqMan）、酶促消化及其序列、正向引物和作用于环引物的任何其他试剂可以跨越用于检测许多不同的靶多核苷酸的许多不同环引物在用途中是通用的。

在一些实施方案中，主题组合物以脱水形式制备。在一些实施方案中，将主题组合物包装在容器中。例如，容器可以是孔、板、管、室、烧瓶、瓶、注射器、流动池、芯片等等。

在一些实施方案中，将主题组合物包装为含有上述方法、组合物、反应混合物、测试和/或系统中公开的任何一种或多种元素的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含在一个或多个容器中的本发明的组合物。例如，试剂盒可以包括下述的一种或多种：包含与之附着的寡核苷酸的一种或多种固体支持物、用于附着至固体支持物的一种或多种寡核苷酸、一种或多种环引物、一种或多种扩增引物、利用这些中的任何的试剂、以及使用这些中的任何的说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含下述的一种或多种：（a）DNA连接酶，（b）DNA依赖性DNA聚合酶，（c）RNA依赖性DNA聚合酶，（d）随机引物，（e）具有3'至5'核酸外切酶活性的依赖性DNA聚合酶，（f）多个引物，每个引物具有多个所选序列之一，（g）DNA激酶，（h）DNA核酸外切酶，（i）磁珠和（j）适合于试剂盒中包含的一种或多种元素的一种或多种缓冲液。引物、其他寡核苷酸和试剂可以是但不限于本文所述的任何一种。试剂盒的元素可以进一步无限制地以任何量和/或组合提供（例如在相同的试剂盒或相同的容器中）。试剂盒可以进一步包含根据本发明的方法使用的另外试剂。试剂盒元素可以在任何合适的容器中提供，包括但不限于试管、小瓶、烧瓶、瓶、安瓿、注射器等等。试剂可以以可直接用于本发明方法的形式提供，或以需要在使用前制备的形式提供，例如在冻干试剂的重构中。试剂可以以等分试样提供以用于一次性使用或作为储备物，由其可以获得例如在多个反应中的多次使用。

在一个实施方案中，试剂盒可以包括包含下述组分中的一种或多种的反应混合物：靶多核苷酸、本文公开的环引物、正向引物、反向引物和聚合酶，以产生可检测量的扩增子，其中所述靶多核苷酸为长度小于约100nt。

需要时，主题试剂盒的组分可以在容器中在水性介质中或以冻干形式包装。当试剂盒中存在多于一种组分时，试剂盒一般还含有其中另外的组分可以分开置于其内的第二、第三或其他另外的容器。然而，组分的不同组合可以包含在一个或多个小瓶中。本发明的试剂盒通常还包括用于商业销售的用于容纳引物、探针、缓冲液、稀释剂的容器和/或在封闭式(close confinement)的任何其他试剂容器。这种容器可以包括所需小瓶保留在其中的注射或吹塑成型的塑料容器。当包含用于产生关于靶多核苷酸中的区域的互补序列的组合物的试剂盒的组分在一种或多种液体溶液中提供时，液体溶液通常是水溶液，其中无菌水溶液是特别优选的。然而，试剂盒的组分可以作为干燥粉末提供。当试剂和/或组分作为干粉形式提供时，可以通过加入合适的溶剂来重构粉末。设想溶剂也可以在另一个容器装置中提供。

在一些实施方案中，主题试剂盒包括给用户的关于如何使用试剂盒组分产生关于靶多核苷酸中的区域的互补序列的说明书。

需要时，主题试剂盒可以进一步包含一种或多种可检测标记物，以能够例如实时监测扩增产物的累积。可检测标记物的非限制性实例在上文描述，并且包括在PCR扩增步骤期间优先或排他地结合双链DNA的染料，例如SYBR绿染料或BEBO染料。在其他实施方案中，试剂盒可以包括第一和/或第二引物，其包括荧光团和猝灭剂以测量PCR扩增产物的量。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含上述任何种类的探针，以检测扩增反应的进展或产物。

主题试剂盒可以进一步包含产生关于靶多核苷酸中的区域的互补序列所必需的一种或多种试剂。例如，试剂盒可以包含可以用于合成第一DNA分子的任何RNA依赖性DNA聚合酶。RNA依赖性DNA聚合酶的非限制性实例包括来源于莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV-RT）、禽成髓细胞瘤病毒（AMV-RT）、牛白血病病毒（BLV-RT）、劳斯肉瘤病毒（RSV-RT）、人免疫缺陷病毒（HIV-RT）、劳斯相关病毒（RAV-RT）、成髓细胞瘤相关病毒（MAV-RT）或其他禽肉瘤白血病病毒（ASLV-RT）的逆转录酶（RT）、栖热菌属Z05聚合酶、δZ05聚合酶及其任何修饰形式或衍生物。在一些实施方案中，RNA依赖性DNA缺乏RNaseH活性（例如，由Invitrogen，1600Faraday Avenue，PO Box 6482，Carlsbad，Calif. 92008销售的SUPERSCRIPT III™）。在一些实施方案中，具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶也具有DNA依赖性DNA聚合酶活性，并且用于反应混合物中的逆转录和扩增步骤两者。

在另一个方面，本发明提供了用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的反应混合物，所述反应混合物包含环引物、正向引物和反向引物，其中：（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）序列A和靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）序列B和靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在靶多核苷酸上5'至3'定向；（b）反向引物，其显示出与相对于序列A'位于5'的靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和（c）正向引物，其与接头序列中的序列特异性杂交。

在反应混合物中使用的靶多核苷酸可以是短的非编码RNA或任何其他短RNA，包括微小RNA或上文方法部分中描述的任何其他靶多核苷酸。类似地，本文公开的任何环引物均可用于反应混合物中。环引物的特定序列的选择将取决于待生成的靶多核苷酸序列。

反应混合物可以包含产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列所必需的试剂，包括酶、缓冲液等等。例如，反应混合物可以包含可以用于合成第一DNA分子的任何RNA依赖性DNA聚合酶。RNA依赖性DNA聚合酶的非限制性实例包括来源于莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV-RT）、禽成髓细胞瘤病毒（AMV-RT）、牛白血病病毒（BLV-RT）、劳斯肉瘤病毒（RSV-RT）、人免疫缺陷病毒（HIV-RT）、劳斯相关病毒（RAV-RT）、成髓细胞瘤相关病毒（MAV-RT）或其他禽肉瘤白血病病毒（ASLV-RT）的逆转录酶（RT）、栖热菌属Z05聚合酶、δZ05聚合酶及其任何修饰形式或衍生物。在一些实施方案中，RNA依赖性DNA缺乏RNaseH活性（例如，由Invitrogen，1600 Faraday Avenue，PO Box 6482，Carlsbad，Calif. 92008销售的SUPERSCRIPT III™）。在一些实施方案中，具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶也具有DNA依赖性DNA聚合酶活性，并且用于反应混合物中的逆转录和扩增步骤两者。

在一些实施方案中，本发明的反应混合物进一步包含具有钾盐（例如氯化钾）、镁盐（例如氯化镁）、还原剂（例如二硫苏糖醇）、脱氧核苷三磷酸（例如dNTP）、去污剂、核苷酸或核苷酸类似物的缓冲液，以及用于实时监测扩增产物累积的一种或多种可检测标记物。

在一些实施方案中，用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的反应混合物在本文公开的容器中。在一些实施方案中，容器是孔、板、管、室、流动池或芯片。

主题方法和组合物可特别用于从小核酸靶分子例如miRNA分子产生和扩增cDNA分子。可以测量DNA分子的量，其可以提供原材料中的靶小核酸分子的量的测量。例如，本发明的方法、组合物、反应混合物、测试、试剂盒和/或系统可以用于测量活细胞中的特异性非编码RNA分子（例如特异性miRNA分子）的量。例如，本发明可以用于测量活体中的不同细胞类型中的特异性非编码RNA分子（例如特异性miRNA分子）的量，从而产生在体内的特异性非编码RNA分子分布的“图谱”。另外，本发明可以用于测量响应刺激（例如响应用药物治疗活细胞群体）在特异性非编码RNA分子（例如特异性miRNA分子）的量中的变化。

本发明的方法、组合物、反应混合物、测试、试剂盒和/或系统的实施方案可以用于诊断和/或评价患者中的状况或潜在状况，其包括测量一种或多种小核酸，例如来自患者的样品中的miRNA的表达。来自患者的样品中的表达和参考（例如正常或非病理样品中的表达）中的差异可以指示病理性、疾病或癌性状况或其风险。样品可以取自患有或疑似患有疾病或病理状况的患者。在某些方面，样品可以是但不限于组织（例如活检样品，特别是针吸活检样品）、血液、血清、血浆、胰液或其他体液。样品可以是新鲜的、冷冻的、固定的（例如福尔马林固定的）、包埋的（例如石蜡包埋的）或这些的组合（例如福尔马林固定和石蜡包埋的）。

本发明的方法、组合物、反应混合物、测试、试剂盒和/或系统在用于许多疾病或状况的小核酸样品的诊断筛选中特别有利。在某些实施方案中，诊断方法涉及鉴定在指示疾病或状况的样品（非正常样品）中差异表达的一种或多种RNA，例如miRNA。在某些实施方案中，诊断疾病或状况涉及检测和/或定量所表达的非编码RNA（和任选的一种或多种编码RNA）。在一些实施方案中，本发明的方法用于比较与状况相关的一个或多个样品以及与状况无关的一个或多个样品之间的非编码RNA的存在、不存在、相对丰度和/或数目，并且从而建立一种或多种非编码RNA的存在、不存在、相对丰度和/或数目与状况之间的关联性。与疾病表型相关的RNA称为“生物标记物”。在某些实施方案中，本发明提供了比传统定量逆转录酶PCR（qRT-PCR）方法（其依赖更长的扩增子（例如60-200nt））更短（例如<30nt）的扩增子的检测。临床样品经常遭受广泛的RNA降解，如果靶的扩增子大小与降解的RNA大约相同大小或更大，则这可能限制检测的灵敏度。使用较短的扩增子来检测靶改善了即使高度降解，靶也将被指数扩增的可能性。此外，使用较短的靶特异性扩增子来检测RNA可以提供在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品中的RNA的灵敏定量，其中RNA可以通过经由固定过程的共价修饰而受损，以及被包埋过程中使用的高温降解。

本发明还可以用于检测传染病中的核酸，例如RNA病毒如HIV、HCV和其他微生物。本发明还可以具有用于检测疾病例如白血病中的疾病特异性非编码RNA的效用，其中精确生物标记物的了解可以具有预后价值，以及指导治疗决策和疾病管理的其他方面，例如预测对所选择治疗的响应性。

特别地，本发明的方法、组合物、反应混合物、测试、试剂盒和/或系统可以用于评估关于疾病或状况的样品，所述疾病或状况包括但不限于：阿尔茨海默氏病，黄斑变性，慢性胰腺炎；胰腺癌；AIDS，自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病-胰岛素依赖性和非依赖性、系统性红斑狼疮和格雷夫斯病）；癌症（例如恶性、良性、转移性、癌前期）；心血管疾病（心脏病或冠状动脉疾病、中风缺血性和出血性以及风湿性心脏病）；神经系统疾病；以及通过致病性微生物的感染（足癣、水痘、普通感冒、腹泻病、流行性感冒、生殖器疱疹、疟疾、脑膜炎、肺炎、窦炎、皮肤疾病、链球菌性咽炎、结核、尿道感染、阴道感染、病毒性肝炎）；炎症（过敏、哮喘）；朊病毒疾病（例如CJD、库鲁病、GSS、FFI）。

可以通过本发明的方法、组合物、反应混合物、测试、试剂盒和/或系统评估的癌症包括包含细胞的癌细胞，以及来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的癌细胞。另外，癌症可以具体地具有下述组织学类型，尽管它但不限于这些：肿瘤，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁状腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉；实体瘤；类癌瘤；恶性；细支气管肺泡状腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包围性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂性腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌w/鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤，恶性；粒层细胞瘤，恶性；睾丸母细胞瘤，恶性；支持细胞癌；莱迪希细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦内罗氏瘤（brenner tumor），恶性；叶状瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间质性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞性牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞性纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；节细胞神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；髓样白血病；嗜碱粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。此外，可以在癌前，例如化生、发育不良和增生中评估RNA。

特别预期本发明可以用于评估疾病阶段例如增生、瘤形成、癌前和癌症之间的差异，或原发性肿瘤和转移性肿瘤之间的差异。此外，考虑也可以比较具有某些途径的活性中的差异的样品。这些途径包括下述和涉及下述因素的那些途径：抗体应答、细胞凋亡、钙/NFAT信号传导、细胞周期、细胞迁移、细胞粘附、细胞分裂、细胞因子和细胞因子受体、药物代谢、生长因子和生长因子受体、炎症应答、胰岛素信号传导、NFκ-B信号传导、血管生成、脂肪生成、细胞粘附、病毒感染、细菌感染、衰老、运动、葡萄糖转运、应激反应、氧化、老化、端粒延伸、端粒缩短、神经传递、凝血、干细胞分化、G蛋白偶联受体（GPCR）信号传导和p53活化。

可以使用本发明的方法、组合物、反应混合物、测试、试剂盒和/或系统评估的细胞途径还包括但不限于下述：粘附或运动途径，包括但不限于涉及下述的那些：环状AMP、蛋白激酶A、G蛋白偶联受体、腺苷酸环化酶、L-选择素、E-选择素、PECAM、VCAM-1、α-辅肌动蛋白、桩蛋白、钙粘蛋白、AKT、整联蛋白-α、整联蛋白-β、RAF-1、ERK、PI-3激酶、纽蛋白、基质金属蛋白酶、Rho GTP酶、p85、三叶因子、肌动蛋白抑制蛋白、FAK、MAP激酶、Ras、小窝蛋白、钙蛋白酶-1、钙蛋白酶-2、表皮生长因子受体、ICAM-1、ICAM-2、丝切蛋白、肌动蛋白、凝溶胶蛋白、RhoA、RAC 1、肌球蛋白轻链激酶、血小板源生长因子受体或埃兹蛋白；任何细胞凋亡途径，包括但不限于涉及下述的那些：AKT、Fas配体、NFκB、半胱天冬酶-9、PI3激酶、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7、ICAD、CAD、EndoG、粒酶B、Bad、Bax、Bid、Bak、APAF-1、细胞色素C、p53、ATM、Bcl-2、PARP、Chk1、Chk2、p21、c-Jun、p73、Rad51、Mdm2、Rad50、c-Abl、BRCA-1、穿孔素、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-10、Rho、Jun激酶、Jun激酶激酶、R1p2、核纤层蛋白-A、核纤层蛋白-B1、核纤层蛋白-B2、Fas受体、H2O2、粒酶A、NADPH氧化酶、HMG2、CD4、CD28、CD3、TRADD、IKK、FADD、GADD45、DR3死亡受体、DR4/5死亡受体、FLIP、APO-3、GRB2、SHC、ERK、MEK、RAF-1、环状AMP、蛋白激酶A、E2F、视网膜母细胞瘤蛋白、Smac/Diablo、ACH受体、14-3-3、FAK、SODD、TNF受体、RIP、细胞周期蛋白D1、PCNA、Bcl-XL、PIP2、PIP3、PTEN、ATM、Cdc2、蛋白激酶C、钙调磷酸酶、IKKα、IKKβ、IKKγ、SOS-1、c-FOS、Traf-1、Traf-2、IκBβ或蛋白酶体；任何细胞活化途径，包括但不限于涉及下述的那些：蛋白激酶A、一氧化氮、小窝蛋白-1、肌动蛋白、钙、蛋白激酶C、Cdc2、细胞周期蛋白B、Cdc25、GRB2、SRC蛋白激酶、ADP-核糖基化因子（ARF）、磷脂酶D、AKAP95、p68、Aurora B、CDK1、Eg7、组蛋白H3、PKAc、CD80、PI3激酶、WASP、Arp2、Arp3、p16、p34、p20、PP2A、血管紧张素、血管紧张素转化酶、蛋白酶激活受体-1、蛋白酶激活受体-4、Ras、RAF-1、PLCβ、PLCγ、COX-1、G蛋白偶联受体、磷脂酶A2、IP3、SUMO1、SUMO 2/3、泛素、Ran、Ran-GAP、Ran-GEF、p53、糖皮质激素、糖皮质激素受体、SWI/SNF复合物的组分、RanBP1、RanBP2、输入蛋白、输出蛋白、RCC1、CD40、CD40配体、p38、IKKα、IKKβ、NFκB、TRAF2、TRAF3、TRAP5、TRAF6、IL-4、IL-4受体、CDK5、AP-1转录因子、CD45、CD4、T细胞受体、MAP激酶、神经生长因子、神经生长因子受体、c-Jun、c-Fos、Jun激酶、GRB2、SOS-1、ERK-1、ERK、JAK2、STAT4、IL-12、IL-12受体、一氧化氮合酶、TYK2、IFNγ、弹性蛋白酶、IL-8、上皮蛋白、IL-2、IL-2受体、CD28、SMAD3、SMAD4、TGFβ或TGFβ受体；任何细胞周期调节、信号传导或分化途径，包括但不限于涉及下述的那些：TNF、SRC蛋白激酶、Cdc2、细胞周期蛋白B、Grb2、Sos-1、SHC、p68、Aurora激酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、Eg7、p53、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶、神经生长因子、表皮生长因子、视网膜母细胞瘤蛋白、ATF-2、ATM、ATR、AKT、CHK1、CHK2、14-3-3、WEE/1、CDC25 CDC6、起点识别复合蛋白、p15、p16、p27、p21、ABL、cABL、SMAD、泛素、SUMO、热休克蛋白、Wnt、GSK-3、血管紧张素、p73任何PPAR、TGFα、TGFβ、p300、MDM2、GADD45、Notch、cdc34、BRCA-1、BRCA-2、SKP1、蛋白酶体、CUL1、E2F、p107、类固醇激素、类固醇激素受体、IκBα、IκBβ、Sin3A、热休克蛋白、Ras、Rho、ERK、IKK、PI3激酶、Bcl-2、Bax、PCNA、MAP激酶、动力蛋白、RhoA、PKAc、细胞周期蛋白AMP、FAK、PIP2、PIP3、整联蛋白、血小板生成素、Fas、Fas配体、PLK3、MEK、JAK、STAT、乙酰胆碱、桩蛋白、钙调磷酸酶、p38、输入蛋白、输出蛋白、Ran、Rad50、Rad51、DNA聚合酶、RNA聚合酶、Ran-GAP、Ran-GEF、NuMA、Tpx2、RCC1、Sonic Hedgehog、Crml、Patched（Ptc-1）、MPF、CaM激酶、微管蛋白、肌动蛋白、动粒相关蛋白、着丝粒结合蛋白、端粒酶、TERT、PP2A、c-MYC、胰岛素、T细胞受体、B细胞受体、CBP、IKβ、NFκB、RAC1、RAF1、EPO、二酰基甘油、c-Jun、c-Fos、Jun激酶、缺氧诱导因子、GATA4、β-连环素、α-连环素、钙、抑制蛋白、存活素、半胱天冬酶、半胱天冬酶原、CREB、CREM、钙粘蛋白、PECAM、皮质类固醇、集落刺激因子、钙蛋白酶、腺苷酸环化酶、生长因子、一氧化氮、跨膜受体、类视黄醇、G蛋白、离子通道、转录激活因子、转录共激活因子、转录阻遏物、白细胞介素、维生素、干扰素、转录辅阻遏物、核孔、氮、毒素、蛋白水解或磷酸化；任何代谢途径，包括但不限于涉及下述的那些：氨基酸生物合成、脂肪酸氧化、神经递质和其他细胞信号传导分子的生物合成、聚胺的生物合成、脂质和鞘脂的生物合成、氨基酸和营养物的分解代谢、核苷酸合成、类花生酸、电子传递反应、ER相关降解、糖酵解、纤维蛋白溶解、酮体形成、吞噬体形成、胆固醇代谢、食物摄入的调节、能量稳态、凝血酶原激活、 乳糖和其他糖的合成、多药抗性、磷脂酰胆碱的生物合成、蛋白酶体、淀粉样蛋白前体蛋白、Rab GTP酶、淀粉合成、糖基化、磷酸甘油酯的合成、维生素、柠檬酸循环、IGF-1受体、尿素循环、囊泡转运或补救途径。 进一步考虑本发明的核酸分子可用于关于任何上述途径或因子的诊断和治疗方法。 因此，在本发明的一些实施方案中，非编码RNA可以相对于上述途径或因子中的一种或多种差异表达。

表型性状还包括特征例如寿命、发病率、外观（例如秃头、肥胖）、力量、速度、耐力、生育力、对特定药物或治疗处理的敏感性或接受性（药物功效）、和药物毒性的风险。在这些表型性状方面不同的样品也可以使用所述方法进行评估。

在本发明的方法、组合物、反应混合物、测试、试剂盒和/或系统的某些实施方案中，可以生成核酸谱以评估这些谱并且使这些谱与药代动力学相关联。例如，可以在患者被治疗之前或在治疗期间创建RNA谱且评估患者肿瘤和血样，以确定是否存在其表达与患者后果相关的RNA。差异RNA的鉴别可以导致涉及其的诊断测定，所述诊断测定可以用于评估肿瘤和/或血样，以确定应该给患者提供何种药物方案。另外，该方法可以用于鉴定或选择适合于特定临床试验的患者。如果确定RNA谱与药物功效或药物毒性相关联，则它可能与该患者是否是接受药物或特定剂量的药物的适当患者相关。

在另一个方面，本发明提供了用于检测样品中的靶多核苷酸的系统，所述系统包括：（a）配置为接收客户请求以对样品执行检测反应的计算机；（b）在权利要求37的反应混合物中执行核酸扩增反应以产生扩增产物的扩增系统；和（c）报告生成器，其向接收者发送报告，其中所述报告含有检测对应于所述扩增产物的量的检测信号的结果。在一个实施方案中，接收方是客户。在一些实施方案中，计算机可读介质包括代码，所述代码在由一个或多个处理器执行后，实施检测样品中的靶多核苷酸的方法，所述方法包括：（a）接收客户请求，对样品执行检测反应；（b）在权利要求40的反应混合物中执行核酸扩增反应，以产生扩增产物；和（c）生成含有检测对应于扩增产物的量的检测信号的结果的报告。

在一些实施方案中，该系统进一步包括配置为接受购买核酸检测、定量或扩增服务的报价的网页。在一些实施方案中，显示是电子的例如网页。在一些实施方案中，该系统还包括显示器，其基于售出信息展示对顾问和/或其他医疗专业人员（例如，医学遗传学家或产科医生/妇科医生）的转诊。

互联网和万维网提供对信息的访问和分发。在一些实施方案中，网站可以特别适于有效提供允许客户购买核酸检测、定量或扩增服务的不同功能。该系统通常将包括网站驻留于其上的服务器。用户使用连接到服务器的接口，例如计算机监视器或电话屏幕，通过在弹出信息或将用户引导到另一网页的链接上点击或滚动来与网站交互。网站通常是交互式的，允许用户输入信息或查询并在接口上获得响应。

在系统和商业方法的一些实施方案中，网站可以允许客户购买、管理且查看核酸检测、定量或扩增的结果，以及更一般地了解这些结果的后果。例如，客户可以是寻求学习他或她的小RNA谱是否指示疾病谱的患者。可以向客户呈现购买核酸检测、定量或扩增服务的报价，以确定下述中的一个或多个：（i）客户的遗传状态；（ii）客户将发生一种或多种疾病或性状的可能性；和（iii）基于在客户的核酸样品中鉴定的致病性遗传变异，客户将发生一种或多种疾病或性状的可能性。

如果客户选择购买使用本发明的方法、组合物、反应混合物、测试、试剂盒和/或系统的核酸检测、定量或扩增服务，则客户可以例如通过在线信用卡交易、交换服务、直接电话咨询公司的工作人员和/或转诊给相关的医疗专业人员而支付费用。测试和转诊可以在购买时支付费用，或可以包括在初始用户注册费中。在一些实施方案中，服务是免费的，并且由公司通过与特定产品结合做其他产品广告来生成收入。例如，在客户在线下订单后，将订单发送到服务器进行处理。一旦支付已被验证，订单处理服务器就可以向运输供应商发送电子通知，以将核酸收集试剂盒邮寄给客户。在一个实施方案中，收集试剂盒与检测、定量和/或扩增服务分开，或者用户或客户已具有核酸收集试剂盒或从另一来源获得核酸收集试剂盒。通知也可以定期以电子方式发送给客户，包括订单确认以及订单和运送状态的更新。在本发明的商业方法的一些实施方案中，客户可以将样品存放在收集试剂盒内。本领域技术人员显而易见的任何样品可以存放到收集试剂盒中或收集试剂盒上。样品可以是含有对于本领域技术人员显而易见的待分析核酸的任何材料，例如体液如唾液或血液。然后可以将收集试剂盒送回公司用于送至实验室，或者可直接返回实验室进行处理。公司内部、与公司合作签约或公司外部的实验室，可以从提供的样品中分离客户的核酸。在已从样品中分离核酸后，装置（例如本文所述的仪器）可以用于检测、扩增和/或定量其存在。在一些实施方案中，核酸不必从样品中分离，以检测、定量和/或扩增核酸。

关于使用该方法、组合物、反应混合物、测试、试剂盒和/或系统检测、定量和/或扩增的核酸的信息可以电子发送到服务器用于存储和处理。服务器上的计算机代码可以对核酸信息执行，以推断客户的医疗保健信息学和/或确认致病性遗传变异体和/或非主体序列（如果有的话）的存在。然后可以将处理的核酸信息电子发送到服务器，其中服务器上的计算机代码可以对处理的核酸信息执行，以预测客户将具有由发现存在于客户的处理核酸信息中的致病性遗传变异引起的多个性状中的每一个的概率。然后，可以将结果电子传送到服务器用于存储。

在一个例子中，可以向客户发送通知以向客户警告结果的可用性。该通知可以是电子的，其非限制性实例包括文本消息、电子邮件或其他数据包；或该通知可以是非电子的，其非限制性实例包括来自顾问的电话或印刷通讯例如通过邮件发送的报告。提供给客户的结果可以向客户告知客户的一种或多种疾病或性状的携带者状态和/或客户将发生一种或多种疾病或性状的机会。在客户收到结果和转诊后，客户的订单可以被视为履行，并且结果和转诊可以通过在线网站帐户保持客户可访问。然后，如果客户希望但是在网站的范围之外，则客户可以选择进一步寻找离线的转诊。

实施例

给出下述实施例是用于举例说明本发明的不同实施方案的目的，并不意味着以任何方式限制本发明。本实施例连同本文所述的方法目前代表优选实施方案，是示例性的，并且不预期作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到涵盖在如由权利要求的范围限定的本发明的精神内的本文的变化和其他用途。

实施例1：用于miRNA定量的新型策略的示意性描述

本发明的互补序列扩增方案的示例性示意图表现在图1中。RT环引物含有三个部分：通用序列（由连接序列A和序列B的线表示）、在RT环引物的5'端处的miRNA互补序列（序列A）、以及在RT环引物的3'端处的miRNA互补序列（序列B）。RT反应从RT环引物的3'端（序列B）起始，并且生成含有miRNA和通用序列两者的杂交cDNA链。使用特定环引物的该RT在RNA靶或引物延伸的情况下使用逆转录酶或在DNA靶的情况下使用聚合酶。在其产生关于序列B杂交区域5'的靶多核苷酸中的区域的互补序列中，聚合酶敲除序列A与靶多核苷酸的杂交。在RT后，使用与通用序列互补的正向引物和与miRNA特异性序列互补的反向引物，通过qPCR来定量杂交cDNA。

实施例2：靶miRNA和引物

登录号MIMAT0000062，22nt）和

登录号MIMAT0000064，22nt）的序列得自miRBASE网站：http://www.mirbase.org/index.shtml。通过将hsa-let-7a-5p的鸟嘌呤替换为胞嘧啶生成hsalet-7x-test的序列

。在本报告中，三个合成miRNA被简化为let- 7a、let-7c和let-7x。合成的miRNA寡核苷酸和引物购自Integrated DNA Technologies（IDT）。引物如下命名且具有如下5'至3'列出的序列：“3+3”：

。

实施例3：逆转录和qPCR

RT反应溶液含有0.25 μg合成miRNA寡核苷酸和0.7 μM RT引物。RT缓冲液、dNTP、MgCl₂、RNaseOUT和SuperScript® III RT由试剂盒SuperScript® III First-StrandSynthesis System（Invitrogen by life technology，18080-051）提供。根据制造商的说明书执行RT。简言之，将10 μl反应溶液在Bio-Rad CFX仪器中在37℃、42℃或50℃下温育50分钟，随后在75℃下温育15分钟，然后将RT产出保持在4℃下。

根据制造商的说明书，通过毛细管电泳（CE）仪器、Fragment Analyzer（AdvancedAnalytical Technologies）以及Sensitivity RNA Analysis Kit（DNF-489-0500）分析RT产出。该反应含有RT引物，但没有miRNA模板设置为RT对照。

根据制造商的说明书，使用TATAA SYBR® Grandmaster® Mix执行qPCR。由RT生成的cDNA用TE-LPA缓冲液（将8 μl LPA悬浮于10 ml 1x Tris-EDTA中）稀释至大约10⁶拷贝/μl。然后将1 μl稀释的cDNA和200 nM PCR引物5+5 Fp（通用，

22nt）和5+5 Rp（miRNA特异性，

22nt）加入PCR反应溶液中。通过下式计算反应溶液中的靶cDNA的拷贝数：cDNA拷贝数= miRNA模板浓度（nM）x 6.022 x 10²³/（miRNA的长度x 650 x 10⁹）。使10 μl反应溶液在95℃下温育1分钟，随后为95℃5秒、52℃30秒和72℃10秒的45个循环。所有反应均重复进行。

实施例4：RT过程的验证

为了达到miRNA定量的最佳特异性，我们提出了如图1例示的新策略。首先，通过使用含有40 nt通用序列和5-10 nt miRNA特异性序列的引物的逆转录获得杂交cDNA模板。然后使用通用正向引物和miRNA特异性反向引物执行qPCR。

在该测定中，RT引物的5'和3'端都与靶miRNA重叠。因此，提出了一个问题：需要多少RT引物核苷酸与靶miRNA杂交，而不干扰逆转录酶连同miRNA模板的性能。为了解决这个问题，在实施例2中测试了具有与靶miRNA的5'和3'端互补的不同数目的核苷酸的不同RT引物。

存在通过RT引物“5+5”有效的RT。RT反应首先在50℃下进行。使用合成的miRNA let-7a作为模板，并且通过CE分析RT产出。在用引物“5+5”的RT后，与图2（B部分）中不含miRNA模板的RT对照相比较，在图2（A部分）中检测到比RT引物多18 nt的另外峰。在图2（A部分），具有大约74 nt的杂交cDNA的峰由箭头指示。图2（B部分）显示了含有引物5+5但不含miRNA的RT对照的结果。图2中的LM指示20-nt梯标记物。该结果指示杂交cDNA由RT引物“5+5”生成。

杂交cDNA的存在通过用PCR引物5+5 Fp和5+5 Rp的qPCR进一步证实，如图3（A部分）中所示。RT引物的浓度对于miRNA定量的准确性也是重要的。我们发现，当RT引物5+5的浓度从1.4降低到0.7 μM时，它显示对下游qPCR很少的干扰，不影响图3（A和B部分）中的RT过程。在图3（部分A）中，通过0.7 μM RT引物5+5生成RT产物。在图3（部分B）中，通过1.4 MRT引物5+5生成RT产物。对于图3部分A和B两者，扩增曲线I是杂交cDNA的扩增子，扩增曲线II是RT对照的扩增子。

在用实施例2中列出的其他引物执行RT后，其中无一在50℃下生成杂交cDNA。考虑到温度可能影响RT的结果，RT在37℃和42℃（实验室中使用的另外两个常见RT温度）下进行。如图4中所示，在两个温度下通过引物5+5生成cDNA。相比之下，在这两个测试温度的任一下，通过其他引物对仍未生成杂交cDNA。在图4（A部分）中，RT在42℃下执行。在图4（B部分）中，RT在37℃下执行。在图4（C部分），RT对照含有引物5+5，但不含miRNA。在图4中，新近生成的cDNA由箭头指示；LM指示梯标记物；RNA用20 nt指示。

高浓度的RT引物可以通过将cDNA产出的信号压缩至低RFU导致CE的假阴性读数。因此，RT引物的浓度从0.7 M降低到0.28 M。然后在图5（A和B部分）中用RT引物3+3的RT后观察到可能代表杂交cDNA产出的另外峰。为了确保杂交cDNA的存在，通过qPCR使用引物5+5Fp和5+5 Rp验证RT产物，并且Cq值仅比RT对照的那种多2.3个循环，如图5（C部分）中可见的。在图5（A部分）中，当RT引物3+3的浓度为1.4 μM时，观察到代表杂交cDNA产出的CE分析中的另外峰。在图5（B部分）中，当RT引物3+3的浓度为2.8 μM时，观察到表示杂交cDNA产出的CE分析中的另外峰。在图5（C部分）中，qPCR分析显示扩增曲线I代表由0.28 M引物3+3生成的RT产物的扩增子，并且扩增曲线II代表RT对照（不含miRNA模板的RT）的扩增子，所述RT对照含有0.28 M RT引物3+ 3。总之，含有靶miRNA序列的杂交cDNA可以通过引物对5+5逆转录。这些结果指示在测试的条件下，对于该靶，在RT引物的3'端处重叠miRNA序列的5 nt是用于起始RT过程最佳的。

实施例5：特异性的验证

通过使用let-7c和let-7x的合成miRNA（其与let-7a仅相差少至一个核苷酸）来评估该测定法的特异性。首先，评估RT的特异性。使用与let-7a完全匹配的RT引物5+5执行RT。通过CE检查RT的产出。结果指示从不同的miRNA模板生成相似量的RT产物，如图6（A-C部分）中所示。在图6（A部分）中，let-7a用作RT模板。在图6（B部分）中，let-7c用作RT模板。在图6（C部分）中，let-7x用作RT模板。在图6中，LM指示20 nt RNA梯标记物。

其次，评估qPCR的特异性。RT产物通过PCR引物5+5 Fp和5+5 Rp扩增。通过式2^{-（Cq非特异性 - Cq特异性）}计算完全匹配和错配靶之间的Cq差异的相对检测效率，假设完全匹配的100%效率。如图7中所示，当比较let-7a与let-7x的扩增结果时，观察到低至1.48%的非特异性信号水平。然而，区分let-7c与let-7a的特异性很低，显示let-7c对let-7a 21.8%的相对检测效率。通过使用另一批RT产物重复实验，并且获得相似的结果。在图7中，假设let-7a的扩增效率为100%，let-7c和let-7x的扩增Cq值针对let-7a，并且计算相对检测效率。

尽管let-7c和let-7x两者均具有与let-7a的一个核苷酸错配，但let-7c和let-7x针对let-7a的相对检测效率是相当不同的。这种差异可能由错配核苷酸的位置决定。对于let-7x，错配的核苷酸位于miRNA的3'端处，并且可以在qPCR过程期间被miRNA特异性PCR引物5+5 Rp覆盖。因此，在RT和qPCR两个过程期间达到let-7a与let-7x的区分。与let-7x不同，let-7c的错配核苷酸悬挂在let-7c的5'端处，并且在qPCR过程期间不存在与let-7x一样的扩增选择。此外，相对高的非特异性信号可能是由于在RT过程期间G-T的交叉反应。从这个角度来看，在优化RT和qPCR引物后，这种miRNA定量策略的特异性可能显著增强。

实施例6：用于miRNA定量的替代策略的示意性描述

图9中显示了环引物的替代结构的示例性示意图，其中环的部分折叠成发夹结构。引物含有5'识别元件（序列A）、5'臂序列（序列D）、具有茎（序列E＆G）和环（序列F）的发夹、3'臂 序列（序列H）和3'识别元件（序列B）。发夹稳定环结构，并且隔绝大部分碱基与样品中的其他核酸相互作用，因此降低背景。茎设计可以进行调整以修改系统的特征。通过将发夹结构引入环引物内的背景降低的实例显示于图12中。

实施例7：使用包含发夹的环引物验证特异性

图10显示了基于通过RT和qPCR测量的靶向let 7家族的前五个成员（let7a-e）的指示环引物，七个测定法的交叉反应性的分析结果。从miRBASE（www.mirbase.org/）获得hsa-let-7a-5p至hsa-let-7e-5p的序列。使用的RT和qPCR引物显示于图10（A部分）中。针对let7b和let7c各自设计了两种环引物。

根据制造商的说明书，使用TATAA GrandScript® Flex cDNA Synthesis Kit，在包含12pg合成miRNA寡核苷酸和50nM RT引物的10 μl反应体积中执行RT反应。对于每个miRNA靶，添加无核酸酶的水代替逆转录酶执行RT对照。使反应溶液在Bio-Rad CFX96仪器中在31℃下温育45分钟，随后在85℃下温育5分钟，然后保持在4℃下。

根据制造商的说明书，使用TATAA SYBR® GrandMaster® Mix，在含有400 nM引物的10 μl反应体积中执行qPCR。将来自RT的cDNA在无核酸酶的水中稀释5倍，并且将2 μl加入到每个qPCR中，除了其中加入无核酸酶的水代替cDNA的NTC之外。使反应溶液在Bio-Rad CFX384仪器中在95℃下温育30秒，随后为95℃5秒、60℃15秒和72℃10秒的45个循环，然后是以0.5℃/秒的步骤从65℃到95℃的熔融曲线。所有反应重复进行。

从qPCR获得的Cq值显示在图10（B部分）中，并且通过式2^{-（Cq非特异性 - Cq特异性）}计算的相对检测效率显示于图10（C部分）中。完全匹配的靶的C q值显著变化，这可能是由于模板浓度中的变化和/或环引物在引发RNA逆转录成cDNA的效率中的变化。除了几个例外，交叉重复活性低于2%，即使几个靶序列仅在单个碱基位置中不同。设计为靶向let7c的环引物之一显示与Let7b的20.1%交叉反应性，但与其他let7c环引物的交叉反应性降低至1.3%。对于与Let7c具有12.4%交叉反应的设计为靶向Let7b的环引物之一也观察到较低的特异性。然而，对于Let7b的另一环引物显示仅1.6%的交叉反应性。

实施例8：使用本发明的发夹环引物验证测定效率

使用发夹环引物的测定的广泛范围显示于图11中。miRNA hsp-let-7a-5p的输入量从2.5*10¹⁰ - 250个拷贝/RT反应不等。测定在所研究的范围内显示极佳的线性，并且qPCR系统的效率为约86%。

根据制造商的说明书，使用TATAA GrandScript® Flex cDNA Synthesis Kit，在包含50nM RT引物

的10 μl反应体积中执行RT反应。包括使用无核酸酶的水代替逆转录酶的RT阴性对照来测量背景信号。使反应溶液在Bio-Rad CFX96仪器中在25℃下温育45分钟，随后在85℃下温育5分钟，然后保持在4℃下。

根据制造商的说明书，使用TATAA SYBR® GrandMaster® Mix，在包含400 nM正向引物

和反向引物

的10 μl反应体积中执行qPCR。将来自RT的cDNA在无核酸酶的水中稀释4倍，并且将2 μl加入到每个qPCR中，除了其中加入无核酸酶的水代替cDNA的非模板对照之外。使反应溶液在Bio-Rad CFX384仪器中在95℃下温育30秒，随后为95℃5秒、60℃15秒和72℃10秒的45个循环，然后是以0.5℃/秒的步骤从65℃到95℃的熔融曲线。所有反应重复进行。

实施例9：使用包含发夹的环引物验证背景降低

改变环引物中的发夹设计以测试对背景信号的作用。设计具有相同的3'和5'识别元件，但在发夹、臂和环序列中具有小变异的四种环引物（图12）。阳性反应的Cq值非常相似，范围为16.07（RT18）至16.44（RT19），证明修饰对效率的作用可忽略不计。另一方面，阴性对照显示显著更高的变化，范围从RT10引物的Cq 34.86到RT18的Cq > 45（当运行45个循环时未观察到杂交）。这指示可以通过精细调谐设计来消除测定的背景信号，而不损害阳性信号。

根据制造商的说明书，使用TATAA GrandScript® Flex cDNA Synthesis Kit，在包含12pg合成miRNA寡核苷酸和50nM RT引物的10 μl反应体积中执行RT反应。对于每个靶，添加无核酸酶的水代替逆转录酶执行RT对照。使反应溶液在Bio-Rad CFX96仪器中在31℃下温育45分钟，随后在85℃下温育5分钟，然后保持在4℃下。

根据制造商的说明书，使用TATAA SYBR® GrandMaster® Mix，在包含400 nM正向引物

和反向引物

的10 μl反应体积中执行qPCR。将来自RT的cDNA在无核酸酶的水中稀释4倍，并且将2 μl加入到每个qPCR中，除了其中加入无核酸酶的水代替cDNA的非模板对照之外。使反应溶液在Bio-RadCFX384仪器中在95℃下温育30秒，随后为95℃5秒、60℃15秒和72℃10秒的45个循环，然后是以0.5℃/秒的步骤从65℃到95℃的熔融曲线。所有反应重复进行。

虽然本文已显示且描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员目前将想到众多变化、改变和取代，而不背离本发明。应当理解在实践本发明时可以采用本文所述的本发明实施方案的不同替代方案。旨在下述权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等价物的范围内的方法和结构。

Claims (16)

1.用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法，所述方法包括：使所述样品在反应混合物中在产生关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下经历核酸扩增反应，其中所述反应混合物包含：

（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列D和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）所述环引物的序列A与所述靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）所述环引物的序列B与所述靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在所述靶多核苷酸上5'至3'定向；和

（b）聚合酶，其沿所述靶多核苷酸从5'至3'延伸所述环引物的序列B，所述靶多核苷酸充当用于模板引导的引物延伸的模板，以产生所述靶多核苷酸的互补序列，

其中所述接头序列D包含发夹结构。

2.权利要求1的方法，其进一步包括在反向引物和正向引物存在下，扩增权利要求1的产物，其中所述反向引物与序列特异性杂交，所述序列与相对于序列A'或B'为5'的所述靶多核苷酸的一部分互补，并且所述正向引物与所述接头序列D中的序列特异性杂交。

3.权利要求2的方法，其进一步包括检测所述核酸扩增的产物，并且其中所述检测步骤包括检测来自与所述产物具有序列互补性的所述反应混合物中的探针的信号。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中序列A为长度2nt至10nt，并且序列B为长度2nt至10nt。

5.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述序列A和B的组合长度为5nt至20nt。

6.权利要求1至3中任一项的方法，其中当最佳比对时，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少80%互补。

7.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述序列A'的3'端在序列B'的1nt至5nt内。

8.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述靶多核苷酸是非编码RNA分子，并且其中所述非编码RNA分子选自：成熟微小RNA分子、前体微小RNA分子、初级微小RNA分子、siRNA分子、piRNA分子、piwiRNA、lncRNA、rRNA和shRNA分子。

9.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述接头序列D包含选自下述的一种或多种序列元件：一种或多种条形码序列；一种或多种限制性酶识别序列；一种或多种寡核苷酸探针结合序列或其互补体；一种或多种测序引物退火序列或其互补体；和这些的组合。

10.用于检测样品中少数等位基因的存在的方法，所述少数等位基因是与在单个碱基位置处更丰富的相应等位基因不同的序列变体，所述方法包括：使所述样品在反应混合物中在扩增少数等位基因和包含序列变体的更丰富的等位基因的区域的条件下，经历使用一对环引物的核酸扩增反应，其中反应混合物包含：

（a）第一环引物，其包含在单链上从5'到3'定向的序列A1、接头序列D1和序列B1；其中所述第一环引物经由下述与所述少数等位基因特异性杂交：（i）所述环引物的序列A1与所述少数等位基因上的序列A1'之间的序列互补性，和（ii）所述环引物的序列B1与所述少数等位基因上的序列B1'之间的序列互补性，其中序列A1'和序列B1'在所述少数等位基因上5'至3'定向；

（b）第二环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A2、接头序列D2和序列B2；其中所述第二环引物经由下述与更丰富的等位基因特异性杂交：（i）所述环引物的序列A2与所述更丰富的等位基因上的序列A2'之间的序列互补性，和（ii）所述环引物的序列B2与所述更丰富的等位基因上的序列B2'之间的序列互补性，其中序列A2'和序列B2'在所述更丰富的等位基因上的5'至3'定向；和

（c）聚合酶，其将所述第一和第二环引物的序列B1和序列B2沿分别的等位基因从5'延伸至3'，所述等位基因充当模板引导的引物延伸的模板，以产生分别的等位基因的互补序列，

其中所述接头序列D1和D2各自包含发夹结构。

11.用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的组合物，所述组合物包含环引物、正向引物和反向引物，其中：

（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列D和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）序列A和所述靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）序列B和所述靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在所述靶多核苷酸上5'至3'定向；

（b）反向引物，其显示出与相对于序列A'位于5'的所述靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和

（c）正向引物，其与所述接头序列中的序列特异性杂交，

其中所述接头序列D包含发夹结构。

12.权利要求11的组合物，其进一步包含与通过所述反向引物或所述正向引物的延伸产生的所述靶多核苷酸的互补序列具有序列互补性的检测探针。

13.权利要求11-12中任一项的组合物，其中所述组合物是脱水形式。

14.用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的反应混合物，所述反应混合物包含环引物、正向引物、反向引物和聚合酶，其中：

（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列D和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）序列A和所述靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）序列B和所述靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在所述靶多核苷酸上5'至3'定向；

（b）反向引物，其显示与相对于序列A'位于5'的所述靶多核苷酸中的序列的序列同源性；和

（c）正向引物，其与所述接头序列中的序列特异性杂交，

其中所述接头序列D包含发夹结构。

15.权利要求14所述的反应混合物，其进一步包含与通过所述反向引物或所述正向引物的延伸产生的所述靶多核苷酸的互补序列具有序列互补性的检测探针。

16.权利要求14至15中任一项的反应混合物，其中所述反应混合物是脱水形式。

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