JP2649102B2 - 核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料 - Google Patents
核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料Info
- Publication number
- JP2649102B2 JP2649102B2 JP2513838A JP51383890A JP2649102B2 JP 2649102 B2 JP2649102 B2 JP 2649102B2 JP 2513838 A JP2513838 A JP 2513838A JP 51383890 A JP51383890 A JP 51383890A JP 2649102 B2 JP2649102 B2 JP 2649102B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rhodamine
- carbon atoms
- dideoxy
- group
- dye
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title abstract description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title abstract description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title abstract description 11
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 title abstract description 11
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title abstract description 6
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 title description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 14
- VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N chembl402140 Chemical compound Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N/CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N 0.000 claims abstract description 12
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N rhodamine 110 Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N)=CC2=[O+]C2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 35
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 30
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 13
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 13
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims description 12
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 11
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 11
- OCLZPNCLRLDXJC-NTSWFWBYSA-N 2-amino-9-[(2r,5s)-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical group C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](CO)O1 OCLZPNCLRLDXJC-NTSWFWBYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 7
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=CC(=[NH+]CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 claims description 3
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 claims description 2
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N Zalcitabine Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)CC1 WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N 0.000 claims 8
- BTOTXLJHDSNXMW-POYBYMJQSA-N 2,3-dideoxyuridine Chemical group O1[C@H](CO)CC[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 BTOTXLJHDSNXMW-POYBYMJQSA-N 0.000 claims 6
- XKKCQTLDIPIRQD-JGVFFNPUSA-N 1-[(2r,5s)-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)CC1 XKKCQTLDIPIRQD-JGVFFNPUSA-N 0.000 claims 3
- 229960000523 zalcitabine Drugs 0.000 claims 3
- WVXRAFOPTSTNLL-NKWVEPMBSA-N 2',3'-dideoxyadenosine Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO)O1 WVXRAFOPTSTNLL-NKWVEPMBSA-N 0.000 claims 2
- COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 4-carboxy-3-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]benzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(C([O-])=O)=CC=C1C(O)=O COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- YMZMTOFQCVHHFB-UHFFFAOYSA-N 5-carboxytetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C([O-])=O YMZMTOFQCVHHFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyrhodamine 6G Chemical compound [Cl-].C=12C=C(C)C(NCC)=CC2=[O+]C=2C=C(NCC)C(C)=CC=2C=1C1=CC(C(O)=O)=CC=C1C(=O)OCC VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 claims 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims 1
- CVQOAJMWCZVVJS-UHFFFAOYSA-N dihydroxyphosphinothioyl phosphono hydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=S CVQOAJMWCZVVJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 claims 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 15
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- -1 nucleoside triphosphate Chemical class 0.000 description 14
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- STNNHWPJRRODGI-UHFFFAOYSA-N carbonic acid;n,n-diethylethanamine Chemical compound [O-]C([O-])=O.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC STNNHWPJRRODGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 6
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 6
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- JNGRENQDBKMCCR-UHFFFAOYSA-N 2-(3-amino-6-iminoxanthen-9-yl)benzoic acid;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O JNGRENQDBKMCCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000005020 Acaciella glauca Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UFJPAQSLHAGEBL-RRKCRQDMSA-N dITP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 UFJPAQSLHAGEBL-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 235000003499 redwood Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HWMVXEKEEAIYGB-UHFFFAOYSA-K Isocitric acid, DL- Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)C(O)C(C([O-])=O)CC([O-])=O HWMVXEKEEAIYGB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 125000006319 alkynyl amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- KDELTXNPUXUBMU-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid boric acid Chemical compound OB(O)O.OB(O)O.OB(O)O.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KDELTXNPUXUBMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LIZOFKWBNVAHPD-UHFFFAOYSA-N 2h-triazolo[4,5-d]triazine Chemical compound C1=NN=NC2=C1NN=N2 LIZOFKWBNVAHPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUJRUSRXHJKUQE-UHFFFAOYSA-N 5-carboxy-X-rhodamine triethylammonium salt Chemical compound CC[NH+](CC)CC.[O-]C(=O)C1=CC(C(=O)[O-])=CC=C1C1=C(C=C2C3=C4CCCN3CCC2)C4=[O+]C2=C1C=C1CCCN3CCCC2=C13 BUJRUSRXHJKUQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNWRLMRKDSGSPL-UHFFFAOYSA-N 5-iodopyrimidine Chemical compound IC1=CN=CN=C1 DNWRLMRKDSGSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- IMONOBVOMFRFGW-IONNQARKSA-N [(2s,5r)-5-(4-aminopyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)oxolan-2-yl]methanol Chemical compound C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO)O1 IMONOBVOMFRFGW-IONNQARKSA-N 0.000 description 1
- OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O)CC[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- ZXZIQGYRHQJWSY-NKWVEPMBSA-N [hydroxy-[[(2s,5r)-5-(6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy]phosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O)CC[C@@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 ZXZIQGYRHQJWSY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000001539 acetonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 125000002015 acyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical group OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- WGLUMOCWFMKWIL-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;methanol Chemical compound OC.ClCCl WGLUMOCWFMKWIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012156 elution solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N hexamethylphosphoric triamide Chemical compound CN(C)P(=O)(N(C)C)N(C)C GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBTOZLQBSIZIKS-UHFFFAOYSA-N methoxide Chemical compound [O-]C NBTOZLQBSIZIKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 125000002568 propynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
- C09B11/04—Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
- C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
- C09B11/24—Phthaleins containing amino groups ; Phthalanes; Fluoranes; Phthalides; Rhodamine dyes; Phthaleins having heterocyclic aryl rings; Lactone or lactame forms of triarylmethane dyes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Spectrometry And Color Measurement (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は一般に核酸の配列を決定するための方法に関
するもので、さらに特に、ゲル電気泳動によって分離さ
れた同じ大きさに分類されたDNAフラグメントを同定す
るためのローダミン染料の使用に関するものである。
するもので、さらに特に、ゲル電気泳動によって分離さ
れた同じ大きさに分類されたDNAフラグメントを同定す
るためのローダミン染料の使用に関するものである。
背景 DNA配列を決定する能力は遺伝子の機能とコントロー
ルを理解するためおよび分子生物学の基本技術の多くの
応用するために非常に重要である。本来のDNAは２個の
鎖状ポリマー、またはヌクレオチドの連鎖からなる。各
鎖はホスホジエステル結合によって連結したヌクレオチ
ドの鎖である。２つの連鎖は水素結合によって２つの連
鎖のヌクレオチドの相補的塩基：チミジン（Ｔ）をもつ
デオキシアデノシン（Ａ）およびデオキシシチジン
（Ｃ）をもつデオキシグアノシン（Ｇ）、との間で水素
結合によって逆平行の配向で共に保持されている。
ルを理解するためおよび分子生物学の基本技術の多くの
応用するために非常に重要である。本来のDNAは２個の
鎖状ポリマー、またはヌクレオチドの連鎖からなる。各
鎖はホスホジエステル結合によって連結したヌクレオチ
ドの鎖である。２つの連鎖は水素結合によって２つの連
鎖のヌクレオチドの相補的塩基：チミジン（Ｔ）をもつ
デオキシアデノシン（Ａ）およびデオキシシチジン
（Ｃ）をもつデオキシグアノシン（Ｇ）、との間で水素
結合によって逆平行の配向で共に保持されている。
現在DNA配列決定には２つの基本的なアプローチがあ
る：ジデオキシ・チェイン・ターミネーター法、例えば
サンガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、5463
〜5467頁（1977）；および化学分解方法、例えばマキサ
ムら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、560〜564頁
（1977）。鎖末端方法は幾つかの方法で改良され、あら
ゆる一般に入手できる自動化DNA配列決定機器として役
に立っている。例えばサンガーら、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー、第143巻、161〜178頁（1
980）；シュライヤーら、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー、第129巻、169〜172頁（1979）；
スミスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第13
巻、2399〜2412頁（1985）；スミスら、ネイチャー、第
321巻、674〜679頁（1987）；プロバーら、サイエン
ス、第238巻、336〜341頁（1987）、セクションII、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー、第155巻、51〜334頁
（1987）；チャーチら、サイエンス、第240巻、185〜18
8頁（1988）；およびコンネルら、バイオテクニクス、
第５巻、342〜348頁（1987）。
る：ジデオキシ・チェイン・ターミネーター法、例えば
サンガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、5463
〜5467頁（1977）；および化学分解方法、例えばマキサ
ムら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンシーズ、第74巻、560〜564頁
（1977）。鎖末端方法は幾つかの方法で改良され、あら
ゆる一般に入手できる自動化DNA配列決定機器として役
に立っている。例えばサンガーら、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー、第143巻、161〜178頁（1
980）；シュライヤーら、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー、第129巻、169〜172頁（1979）；
スミスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第13
巻、2399〜2412頁（1985）；スミスら、ネイチャー、第
321巻、674〜679頁（1987）；プロバーら、サイエン
ス、第238巻、336〜341頁（1987）、セクションII、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー、第155巻、51〜334頁
（1987）；チャーチら、サイエンス、第240巻、185〜18
8頁（1988）；およびコンネルら、バイオテクニクス、
第５巻、342〜348頁（1987）。
鎖末端および化学分解方法は１またはそれ以上のセッ
トの標識を付されたDNAフラグメントの世代を必要と
し、各々は共通の起原をもち各々は既知の塩基を末端と
する。次にフラグメントの単数または複数のセットは大
きさによって分離され配列情報を得る。両者の方法にお
いて、DNAフラグメントは高分解能ゲル電気泳動によっ
て分離される。最も自動化されたDNA配列決定機器で
は、異なる末端塩基を有するフラグメントは異なる蛍光
染料を用いて標識を付され、プライマーに結合するか、
例えばスミスら（1987、上記）、あるいは末端ジデオキ
シヌクレオチドの塩基に結合する、例えばプロバーら
（上記）。標識フラグメントは一緒にされて電気泳動分
離のための同じゲルカラムに装填される。フラグメント
が分離過程の間に静置検出器を通過するときフラグメン
トによって放出される蛍光信号を分析することによって
塩基配列は決定される。
トの標識を付されたDNAフラグメントの世代を必要と
し、各々は共通の起原をもち各々は既知の塩基を末端と
する。次にフラグメントの単数または複数のセットは大
きさによって分離され配列情報を得る。両者の方法にお
いて、DNAフラグメントは高分解能ゲル電気泳動によっ
て分離される。最も自動化されたDNA配列決定機器で
は、異なる末端塩基を有するフラグメントは異なる蛍光
染料を用いて標識を付され、プライマーに結合するか、
例えばスミスら（1987、上記）、あるいは末端ジデオキ
シヌクレオチドの塩基に結合する、例えばプロバーら
（上記）。標識フラグメントは一緒にされて電気泳動分
離のための同じゲルカラムに装填される。フラグメント
が分離過程の間に静置検出器を通過するときフラグメン
トによって放出される蛍光信号を分析することによって
塩基配列は決定される。
異なるフラグメントを標識するための一組の染料を入
手することはこのようなDNA配列決定システムでは主要
な難点である。第１に、有機蛍光染料に対する代表的な
発光バンド半幅は約40〜80ナノメートル（nm）であり可
視スペクトルは約350〜400nmに過ぎないので、有意に重
なる発光バンドを持たない３種またはそれ以上の染料を
見出すことは困難である。第２に、重ならない発光バン
ドをもつ染料を見出したとしても、そのセットはそれぞ
れの発光効率が低すぎる場合DNA配列決定のために未だ
不適であるかも知れない。例えば、プリングルら、DNA
・コア・ファシリティス・ニュースレター、第１巻、15
〜21頁（1988）には、増大したゲル荷重の低い蛍光効率
を補償できないことを示すデータがある。第３に、幾つ
かの蛍光染料を同時に使用する場合、染料の吸収バンド
が広く分離することが多いので励起が難しくなる。最も
有効な励起は各染料をその吸収バンドの最高値に相当す
る波長で発光する場合に生じる。幾つかの染料を使用す
る場合、検出システムの感度と各染料に対する別々の励
起源を与えるコスト増加との間にトレードオフを行うよ
うに強いられることが多い。第４に、ゲルの単一カラム
中の異なる大きさに分類されたフラグメントの数が数百
よりも大きい場合、染料の物理化学的性質、およびフラ
グメントに連結される手段が臨界的に重要になる。染料
およびリンカーの電荷、分子量およびコンホメーション
は接近した大きさに分類されたフラグメントの電気泳動
による移動度に、広範囲なバンドの広がりが起こるよう
にあるいはゲル上のバンドの位置が逆になり、これによ
ってバンドの順序および配列を決定するための核酸中の
塩基の順序との間の一致を壊すように、不利に影響して
はならない。
手することはこのようなDNA配列決定システムでは主要
な難点である。第１に、有機蛍光染料に対する代表的な
発光バンド半幅は約40〜80ナノメートル（nm）であり可
視スペクトルは約350〜400nmに過ぎないので、有意に重
なる発光バンドを持たない３種またはそれ以上の染料を
見出すことは困難である。第２に、重ならない発光バン
ドをもつ染料を見出したとしても、そのセットはそれぞ
れの発光効率が低すぎる場合DNA配列決定のために未だ
不適であるかも知れない。例えば、プリングルら、DNA
・コア・ファシリティス・ニュースレター、第１巻、15
〜21頁（1988）には、増大したゲル荷重の低い蛍光効率
を補償できないことを示すデータがある。第３に、幾つ
かの蛍光染料を同時に使用する場合、染料の吸収バンド
が広く分離することが多いので励起が難しくなる。最も
有効な励起は各染料をその吸収バンドの最高値に相当す
る波長で発光する場合に生じる。幾つかの染料を使用す
る場合、検出システムの感度と各染料に対する別々の励
起源を与えるコスト増加との間にトレードオフを行うよ
うに強いられることが多い。第４に、ゲルの単一カラム
中の異なる大きさに分類されたフラグメントの数が数百
よりも大きい場合、染料の物理化学的性質、およびフラ
グメントに連結される手段が臨界的に重要になる。染料
およびリンカーの電荷、分子量およびコンホメーション
は接近した大きさに分類されたフラグメントの電気泳動
による移動度に、広範囲なバンドの広がりが起こるよう
にあるいはゲル上のバンドの位置が逆になり、これによ
ってバンドの順序および配列を決定するための核酸中の
塩基の順序との間の一致を壊すように、不利に影響して
はならない。
最後に、蛍光染料はフラグメントを造りまたは操作す
るために用いられる化学物質と相溶性がなければならな
い。例えば、鎖末端方法においてプライマーに標識を付
けるために用いられる染料および／またはジデオキシ・
チェイン・ターミネーターは使用したポリメラーゼまた
は逆転写酵素の活性を妨げてはならない。
るために用いられる化学物質と相溶性がなければならな
い。例えば、鎖末端方法においてプライマーに標識を付
けるために用いられる染料および／またはジデオキシ・
チェイン・ターミネーターは使用したポリメラーゼまた
は逆転写酵素の活性を妨げてはならない。
これらのきびしい制約のために、数組の蛍光染料だけ
が、自動化DNA配列決定におよび診断および分析の技術
に使用できることが見出された、例えばスミスら（198
5、上記）；プロバーら（上記）；フードら、ヨーロッ
パ特許出願8500960;およびコンネルら（上記）。
が、自動化DNA配列決定におよび診断および分析の技術
に使用できることが見出された、例えばスミスら（198
5、上記）；プロバーら（上記）；フードら、ヨーロッ
パ特許出願8500960;およびコンネルら（上記）。
上記の観点では、DNA配列決定のような、多くの分析
および診断の技術は、（１）物理化学的に類似のもの、
（２）ゲル上の蜜に配置されたDNAバンドのような空間
的に重なっている標的物質の検出ができるもの、（３）
自動化DNA配列決定の最近の方法によって単一ゲルカラ
ム上で決定することができる塩基の数を広げるもの、
（４）広範囲の予備および手先のテクニックと共に使用
するために影響を受けやすいもの、（５）その他上に挙
げた多くの必要な条件を満足するもの、である新しいセ
ットの蛍光染料の入手容易性によって有意に促進される
であろう。
および診断の技術は、（１）物理化学的に類似のもの、
（２）ゲル上の蜜に配置されたDNAバンドのような空間
的に重なっている標的物質の検出ができるもの、（３）
自動化DNA配列決定の最近の方法によって単一ゲルカラ
ム上で決定することができる塩基の数を広げるもの、
（４）広範囲の予備および手先のテクニックと共に使用
するために影響を受けやすいもの、（５）その他上に挙
げた多くの必要な条件を満足するもの、である新しいセ
ットの蛍光染料の入手容易性によって有意に促進される
であろう。
発明の概要 本発明は電気泳動により分離される異なる３′−末端
ヌクレオチドを有するDNAフラグメントが異なるローダ
ミン染料によって同定されるDNA配列決定の方法にあ
る。特に、本発明は以下に定義したローダミン標識ヌク
レオチドおよび本発明方法におけるそれらの使用を含
む。本発明は一部は、DNAポリメラーゼ、特にTagDNAポ
リメラーゼによって成長DNA鎖に容易に組み込まれる鎖
末端ヌクレオチドに連結したスペクトル分析できるロー
ダミン染料のセットの発見に基づくものである。ここで
使用するように語「鎖末端ヌクレオチド」は、成長DNA
鎖にDNAポリメラーゼによって組み込まれた後は、さら
にポリヌクレオチド鎖が伸長、または付加することを妨
げるヌクレオチドまたはその類似体を指す。通常、この
ようなヌクレオチドの鎖末端性は糖部分の３′ヒドロキ
シルの不在または改良に依存する。好ましくは、鎖末端
ヌクレオチドは２′,3′−ジデオキシヌクレオチドであ
る。
ヌクレオチドを有するDNAフラグメントが異なるローダ
ミン染料によって同定されるDNA配列決定の方法にあ
る。特に、本発明は以下に定義したローダミン標識ヌク
レオチドおよび本発明方法におけるそれらの使用を含
む。本発明は一部は、DNAポリメラーゼ、特にTagDNAポ
リメラーゼによって成長DNA鎖に容易に組み込まれる鎖
末端ヌクレオチドに連結したスペクトル分析できるロー
ダミン染料のセットの発見に基づくものである。ここで
使用するように語「鎖末端ヌクレオチド」は、成長DNA
鎖にDNAポリメラーゼによって組み込まれた後は、さら
にポリヌクレオチド鎖が伸長、または付加することを妨
げるヌクレオチドまたはその類似体を指す。通常、この
ようなヌクレオチドの鎖末端性は糖部分の３′ヒドロキ
シルの不在または改良に依存する。好ましくは、鎖末端
ヌクレオチドは２′,3′−ジデオキシヌクレオチドであ
る。
ここで使用するように染料のセットに関係する語「ス
ペクトル分析できる」は、染料の蛍光放出バンドが充分
に明確であり、すなわち充分に重なっておらず、各染料
が結合している標的物質、例えばポリヌクレオチドを、
例えばバンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシス
テムを用いる標準光検出システムまたはその類似のシス
テムによって発生した蛍光信号に基づいて区別すること
ができることを意味し、前記システムは米国特許4,230,
558号、4,811,218号等、またはホイーレスら、フロー・
シトメトリイ：インストルメンテージョン・アンド・デ
ータ・アナリシス（アカデミック・プレス・ニューヨー
ク、1985）の21〜76頁に記載されたようなシステムが挙
げられる。
ペクトル分析できる」は、染料の蛍光放出バンドが充分
に明確であり、すなわち充分に重なっておらず、各染料
が結合している標的物質、例えばポリヌクレオチドを、
例えばバンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシス
テムを用いる標準光検出システムまたはその類似のシス
テムによって発生した蛍光信号に基づいて区別すること
ができることを意味し、前記システムは米国特許4,230,
558号、4,811,218号等、またはホイーレスら、フロー・
シトメトリイ：インストルメンテージョン・アンド・デ
ータ・アナリシス（アカデミック・プレス・ニューヨー
ク、1985）の21〜76頁に記載されたようなシステムが挙
げられる。
本発明のローダミンを３′−末端ヌクレオチドに標識
を付けるために用いるときはいつでも、本発明の重要な
特徴は４種の染料によって作られたDNAフラグメントの
電気泳動移動度への事実上同等の貢献である。この結果
は、標識と隣接するヌクレオチドとの間の配座相互作用
が主として標識DNAフラグメントの電気泳動移動度にお
ける変動性の原因であると信じられているので予期しな
いことである。染料標識プライマーが常に、染料は常に
ヌクレオチドの同じ配列と相互に作用するので、電気泳
動移動度において一層小さい変異性を生じることが期待
されていた。しかし、本発明の一部は、３′−標識ヌク
レオチドをもつフラグメントが染料標識プライマーをも
つ同等のフラグメントよりも電気泳動移動度において非
常に小さい変異性をもつという発見である。
を付けるために用いるときはいつでも、本発明の重要な
特徴は４種の染料によって作られたDNAフラグメントの
電気泳動移動度への事実上同等の貢献である。この結果
は、標識と隣接するヌクレオチドとの間の配座相互作用
が主として標識DNAフラグメントの電気泳動移動度にお
ける変動性の原因であると信じられているので予期しな
いことである。染料標識プライマーが常に、染料は常に
ヌクレオチドの同じ配列と相互に作用するので、電気泳
動移動度において一層小さい変異性を生じることが期待
されていた。しかし、本発明の一部は、３′−標識ヌク
レオチドをもつフラグメントが染料標識プライマーをも
つ同等のフラグメントよりも電気泳動移動度において非
常に小さい変異性をもつという発見である。
発明の詳細な説明 本発明のローダミン染料のスペクトル分析できるセッ
トはテトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ローダミ
ン110、およびローダミン6Gから成り、これらは、それ
ぞれ式Ｉ〜IVによって表される。全体にわたり、カラー
・インデックス（アソシエーション・オブ・テキスタイ
ル・ケミスツ、第２版、1971）炭素ナンバリング図式を
使用する、すなわちプライムを付した数字はキサンテン
構造の炭素を指し、プライムを付していない数字は９′
−フェニルの炭素を指す。
トはテトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ローダミ
ン110、およびローダミン6Gから成り、これらは、それ
ぞれ式Ｉ〜IVによって表される。全体にわたり、カラー
・インデックス（アソシエーション・オブ・テキスタイ
ル・ケミスツ、第２版、1971）炭素ナンバリング図式を
使用する、すなわちプライムを付した数字はキサンテン
構造の炭素を指し、プライムを付していない数字は９′
−フェニルの炭素を指す。
式中： Ａは結合官能基に変換することができるカルボキシ
ル、スルホニル、またはアミノのような基であり、そし
て Ｂはアニオン酸性基、好ましくはカルボキシルまたは
スルホニルであり、最も好ましくはカルボキシルであ
る。
ル、スルホニル、またはアミノのような基であり、そし
て Ｂはアニオン酸性基、好ましくはカルボキシルまたは
スルホニルであり、最も好ましくはカルボキシルであ
る。
好ましくは、本発明のローダミン標識鎖末端ヌクレオ
チドは次式で表される： XTP−Ｌ−Ｒ 式中、XRPは鎖末端ヌクレオシドトリホスフェートで
あり;Rはテトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ロー
ダミン110、およびローダミン6Gから成る群れから選ば
れたローダミン染料であり；およびＬはヌクレオシドト
リホスフェートの塩基とローダミン染料との間の連結基
である。
チドは次式で表される： XTP−Ｌ−Ｒ 式中、XRPは鎖末端ヌクレオシドトリホスフェートで
あり;Rはテトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ロー
ダミン110、およびローダミン6Gから成る群れから選ば
れたローダミン染料であり；およびＬはヌクレオシドト
リホスフェートの塩基とローダミン染料との間の連結基
である。
XTPは、組み込まれた後にさらに鎖が伸長することを
妨げるのに用いられたDNAポリメラーゼの天然のヌクレ
オシドトリホスフェートの類似体である。幾つかのこの
ような類似体は４種の天ヌクレオシドトリホスフェート
の各々に対して入手でき、例えばホッブズら（上記）は
リストを示している。好ましくは、XTPは２′,3′−ジ
デオキシヌクレオシドトリホスフェートである。さらに
好ましくは、XTPは２′,3′−ジデオキシ−７−デアザ
アデノシントリホスフェート、２′,3′−ジデオキシシ
チジントリホスフェート、２′,3′−ジデオキシ−７−
デアザグアノシン、２′,3′−ジデオキシウリジントリ
ホスフェート、および２′,3′−ジデオキシ−７−デア
ザイノシントリホスフェートから成る群れから選ばれ
る。ここで使用するように語「ジデオキシヌクレオシ
ド」は糖部分が環式または非環式であるヌクレオシド類
似体を含む。従来のナンバリングは、ヌクレオシドの塩
基または糖の特定の炭素原子に例えばコーンバーグ、DN
Aレプリケーション（フリーマン、サンフランシスコ、1
980）を引用するときはいつでも使用される。
妨げるのに用いられたDNAポリメラーゼの天然のヌクレ
オシドトリホスフェートの類似体である。幾つかのこの
ような類似体は４種の天ヌクレオシドトリホスフェート
の各々に対して入手でき、例えばホッブズら（上記）は
リストを示している。好ましくは、XTPは２′,3′−ジ
デオキシヌクレオシドトリホスフェートである。さらに
好ましくは、XTPは２′,3′−ジデオキシ−７−デアザ
アデノシントリホスフェート、２′,3′−ジデオキシシ
チジントリホスフェート、２′,3′−ジデオキシ−７−
デアザグアノシン、２′,3′−ジデオキシウリジントリ
ホスフェート、および２′,3′−ジデオキシ−７−デア
ザイノシントリホスフェートから成る群れから選ばれ
る。ここで使用するように語「ジデオキシヌクレオシ
ド」は糖部分が環式または非環式であるヌクレオシド類
似体を含む。従来のナンバリングは、ヌクレオシドの塩
基または糖の特定の炭素原子に例えばコーンバーグ、DN
Aレプリケーション（フリーマン、サンフランシスコ、1
980）を引用するときはいつでも使用される。
Ｌはジデオキシヌクレオチドと染料との間の結合の長
さと剛性を大きく変えることができるように幾らかの異
なる形態に従う。例えば本発明と共に使用できる幾つか
の適当な塩基標識方法は、例えば、ギブソンら、ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ、第15巻、6455〜6467頁
（1987）；ゲベイエフら、ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ、第15巻、4513〜4535頁（1987）；ハララムビジ
スら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第15巻、48
56〜4876頁（1987）等に報告された。好ましくは、Ｌは
本発明の染料のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）
エステルをジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ
誘導塩基と反応されて形成される。この場合において、
Ｌは、（１）ローダミンの５−または６−炭素と（２）
ローダミンを結合する塩基の炭素との間の部分として使
われる。好ましくは、Ｌは３−カルボキシアミノ−１−
プロピニルである。シトシン・チミン、およびアデニン
のこのようなアルキルアミノ誘導ジデオキシヌクレオチ
ドの合成はホップスらによるヨーロッパ特許出願番号87
305844.0およびここに引例として挙げるホッブス、ジャ
ーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、第54巻、
3420頁（1989）によって教示される。簡単には、アルキ
ニルアミノ誘導ジデオキシヌクレオチドは適当なハロジ
デオキシヌクレオシド（通常はホップスら（上記）によ
って教示されているような５−ヨードピリミジンおよび
７−ヨード−７−デアザプリンジオキシヌクレオシド）
およびCu（Ｉ）をフラスコに入れ、空気を除くようにAr
を吹き込み、乾燥DMFを添加し、続いてアルキニルアミ
ン、トリエチルアミンおよびPd（０）を添加して生成さ
れる。反応混合物を数時間、または薄層クロマトグラフ
ィがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、攪
拌することができる。保護されていないアルキニルアミ
ンを使用する場合、アルキニルアミノヌクレオシドを、
反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生成したハイ
ドロハライドを中和するように水酸化アンモニウムを含
む溶出溶媒を用いるシルカゲルでクロマトグラフ処理を
行って単離することができる。保護されたアルキニルア
ミンを使用する場合、メタノール／塩化メチレンを反応
混合物に添加し、強塩基性アニオン交換樹脂の重炭酸塩
の形によって続ける。次にスラリーを約45分間攪拌し、
濾過し、追加のメタノール／塩化メチレンを用いて樹脂
を洗うことができる。一緒に合わせた濾液を濃縮しメタ
ノール−塩化メチレングラディエントを用いるシリカゲ
ルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製するこ
とができる。トリホスフェートが標準技術によって得ら
れる。
さと剛性を大きく変えることができるように幾らかの異
なる形態に従う。例えば本発明と共に使用できる幾つか
の適当な塩基標識方法は、例えば、ギブソンら、ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ、第15巻、6455〜6467頁
（1987）；ゲベイエフら、ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ、第15巻、4513〜4535頁（1987）；ハララムビジ
スら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第15巻、48
56〜4876頁（1987）等に報告された。好ましくは、Ｌは
本発明の染料のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）
エステルをジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ
誘導塩基と反応されて形成される。この場合において、
Ｌは、（１）ローダミンの５−または６−炭素と（２）
ローダミンを結合する塩基の炭素との間の部分として使
われる。好ましくは、Ｌは３−カルボキシアミノ−１−
プロピニルである。シトシン・チミン、およびアデニン
のこのようなアルキルアミノ誘導ジデオキシヌクレオチ
ドの合成はホップスらによるヨーロッパ特許出願番号87
305844.0およびここに引例として挙げるホッブス、ジャ
ーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、第54巻、
3420頁（1989）によって教示される。簡単には、アルキ
ニルアミノ誘導ジデオキシヌクレオチドは適当なハロジ
デオキシヌクレオシド（通常はホップスら（上記）によ
って教示されているような５−ヨードピリミジンおよび
７−ヨード−７−デアザプリンジオキシヌクレオシド）
およびCu（Ｉ）をフラスコに入れ、空気を除くようにAr
を吹き込み、乾燥DMFを添加し、続いてアルキニルアミ
ン、トリエチルアミンおよびPd（０）を添加して生成さ
れる。反応混合物を数時間、または薄層クロマトグラフ
ィがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、攪
拌することができる。保護されていないアルキニルアミ
ンを使用する場合、アルキニルアミノヌクレオシドを、
反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生成したハイ
ドロハライドを中和するように水酸化アンモニウムを含
む溶出溶媒を用いるシルカゲルでクロマトグラフ処理を
行って単離することができる。保護されたアルキニルア
ミンを使用する場合、メタノール／塩化メチレンを反応
混合物に添加し、強塩基性アニオン交換樹脂の重炭酸塩
の形によって続ける。次にスラリーを約45分間攪拌し、
濾過し、追加のメタノール／塩化メチレンを用いて樹脂
を洗うことができる。一緒に合わせた濾液を濃縮しメタ
ノール−塩化メチレングラディエントを用いるシリカゲ
ルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製するこ
とができる。トリホスフェートが標準技術によって得ら
れる。
上記参照によるアルキニルアミン誘導ジデオキシグア
ノシンは特に改良されたグアニン先駆物質（６−メトキ
シ−２−メチルチオ−７−デアザプリン、Ｘ）を必要と
し、これは出発物質、６−ヒドロキシ−２−メチルチオ
−７−ジアザプリン、XXから得られる。XXの６−クロロ
−２−メチルチオ−７−デアザプリン、XXXへの転換は
ロビンズとノエル（ジャーナル・オブ・ヘテロサイクリ
ック・ケミストリー、第１巻、34頁（1964）に従い、続
いてクロロ置換体をメトキサイド（還流メタノール中の
ナトリウム塩）を用いて置換しＸを生成する： 好ましくは、ローダミンNHSエステルを米国特許出願
第06/941、985号の教示に従って合成する。ローダミンN
HSエステルを合成する方法の重要な特徴は、（１）高収
率の生成物を室温で生成するようにローダミン染料の５
−または６−形態のエステル化のために存在する実質的
に計算量のジ−Ｎ−スクシンイミジルカーボネート（DS
C）および４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）を有す
る反応条件、および（２）反応体への転換逆行を妨げる
ように、好ましくは５以下のpKaを有する酸性化合物を
用いて新しく合成された生成物を処理することである。
本発明の一般的な反応図は式IXによって定義される： これらの方法は酸の形の５−または６−カルボキシロ
ーダミン（異性体の混合物として、または純異性体とし
て）を当量のDSCおよびDMAPの極性アプロチック溶媒の
溶液を用いて反応させ、カルボキシル Ｎ−ヒドロキシ
サクシンイミドエステルを生成することからなる。適当
な極性アプロチック溶媒はN,N−ジメチルホルムアミド
（DMF）、ピリジン、ヘキサメチルホスホルアミド（HMP
A）等を含む。最も好ましくは、DMFは反応溶媒として用
いられる。異性体として混合されるNHSエステルはさら
に使用するために各異性体に分離することができる。最
も好ましくは、試料を保存するために、酸の形の５−ま
たは６−カルボキシルローダミンをまず標準の分離技
術、例えばエドムンドソンら、モレキュラー・イムノロ
ジー、第21巻、561頁（1984）によって各異性体に分離
し、次いで各５−または６−カルボキシル異性体を上述
のように反応されて、それぞれ、５−または６−カルボ
キシルNHSエステルを形成し、これらを反応混合物から
分離し、再び標準技術を用いる。
ノシンは特に改良されたグアニン先駆物質（６−メトキ
シ−２−メチルチオ−７−デアザプリン、Ｘ）を必要と
し、これは出発物質、６−ヒドロキシ−２−メチルチオ
−７−ジアザプリン、XXから得られる。XXの６−クロロ
−２−メチルチオ−７−デアザプリン、XXXへの転換は
ロビンズとノエル（ジャーナル・オブ・ヘテロサイクリ
ック・ケミストリー、第１巻、34頁（1964）に従い、続
いてクロロ置換体をメトキサイド（還流メタノール中の
ナトリウム塩）を用いて置換しＸを生成する： 好ましくは、ローダミンNHSエステルを米国特許出願
第06/941、985号の教示に従って合成する。ローダミンN
HSエステルを合成する方法の重要な特徴は、（１）高収
率の生成物を室温で生成するようにローダミン染料の５
−または６−形態のエステル化のために存在する実質的
に計算量のジ−Ｎ−スクシンイミジルカーボネート（DS
C）および４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）を有す
る反応条件、および（２）反応体への転換逆行を妨げる
ように、好ましくは５以下のpKaを有する酸性化合物を
用いて新しく合成された生成物を処理することである。
本発明の一般的な反応図は式IXによって定義される： これらの方法は酸の形の５−または６−カルボキシロ
ーダミン（異性体の混合物として、または純異性体とし
て）を当量のDSCおよびDMAPの極性アプロチック溶媒の
溶液を用いて反応させ、カルボキシル Ｎ−ヒドロキシ
サクシンイミドエステルを生成することからなる。適当
な極性アプロチック溶媒はN,N−ジメチルホルムアミド
（DMF）、ピリジン、ヘキサメチルホスホルアミド（HMP
A）等を含む。最も好ましくは、DMFは反応溶媒として用
いられる。異性体として混合されるNHSエステルはさら
に使用するために各異性体に分離することができる。最
も好ましくは、試料を保存するために、酸の形の５−ま
たは６−カルボキシルローダミンをまず標準の分離技
術、例えばエドムンドソンら、モレキュラー・イムノロ
ジー、第21巻、561頁（1984）によって各異性体に分離
し、次いで各５−または６−カルボキシル異性体を上述
のように反応されて、それぞれ、５−または６−カルボ
キシルNHSエステルを形成し、これらを反応混合物から
分離し、再び標準技術を用いる。
好ましくは、新しく合成されたローダミンNHSエステ
ルを揮発性の、pKa＜５の有機可溶性酸、およびさらに
好ましくは、揮発性の、pKa＜１の有機可溶性酸化合
物、例えばHClまたはHBrのメタノール溶液、または最も
好ましくは、トリフルオロ酢酸を用いて処理する。
ルを揮発性の、pKa＜５の有機可溶性酸、およびさらに
好ましくは、揮発性の、pKa＜１の有機可溶性酸化合
物、例えばHClまたはHBrのメタノール溶液、または最も
好ましくは、トリフルオロ酢酸を用いて処理する。
本発明に使用するためのローダミン染料の若干の異性
体混合物は市販品として入手することができ、例えばモ
レキュラー・プローブス・インコーポレーテッド（Euge
ne,OR）、および他のものは米国特許2,242,572;2,153,0
59;3,822,270）;3,932,415;および4,005,092;の技術に
従って合成でき、これらすべては参照文献に加えられ
る。
体混合物は市販品として入手することができ、例えばモ
レキュラー・プローブス・インコーポレーテッド（Euge
ne,OR）、および他のものは米国特許2,242,572;2,153,0
59;3,822,270）;3,932,415;および4,005,092;の技術に
従って合成でき、これらすべては参照文献に加えられ
る。
本発明のローダミンは、類似の物理化学的な性質、例
えば大きさ、配座、電荷、疎水性等を有するポリヌクレ
オチドの一連の接近した間隔バンドまたはスポットが線
状または二次元の配置に存在する、ゲル電気泳動のよう
な、生物化学的分離方法に委ねられたポリヌクレオチド
の種類を同定するために特に良く適している。ここで使
用するように、「バンド」の語は類似のまたは同一の物
理化学的性質に基づいたポリヌクレオチドの空間的配置
または凝集を含む。通常のバンドはゲル電気泳動によっ
て染料−ポリヌクレオチドの共役体を分離する際に生じ
る。
えば大きさ、配座、電荷、疎水性等を有するポリヌクレ
オチドの一連の接近した間隔バンドまたはスポットが線
状または二次元の配置に存在する、ゲル電気泳動のよう
な、生物化学的分離方法に委ねられたポリヌクレオチド
の種類を同定するために特に良く適している。ここで使
用するように、「バンド」の語は類似のまたは同一の物
理化学的性質に基づいたポリヌクレオチドの空間的配置
または凝集を含む。通常のバンドはゲル電気泳動によっ
て染料−ポリヌクレオチドの共役体を分離する際に生じ
る。
好ましくは、本発明に従って同定されたポリヌクレオ
チドの種類は、対応が４種の可能な末端塩基と４種のス
ペクトル分析できる染料との間に確立されるように末端
ヌクレオチドの語において定義される。特に、ポリヌク
レオチドの種類はDNA配列のチェイン・ターミネーター
法の関係において生じ、この方法は染料−ポリヌクレオ
チドの共役体をゲル電気泳動によって大きさに従って分
離する。例えばゴールドおよびマシューズ、上述した；
リックウッドおよびハメス著、核酸のゲル電気泳動：実
際のアプローチ（IRLプレス・リミテッド、ロンドン、1
981）；またはオスターマン、プロティンと核酸の研究
方法、第１巻（スプリンガー−ベルラク、ベルリン、19
84）。好ましくはゲルのタイプは約２〜20パーセントの
間の濃度（重量対容量）を有するポリアクリルアミドで
ある。さらに好ましくは、ポリアクリルアミドゲル濃度
が約４〜８パーセントの間にある。好ましくはゲルはス
トランド分離または変性剤を含む。このようなゲルを構
成するための詳細な方法はマニアチスら、メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー、第65巻、299〜305頁（1980）の
「98％ホルムアミドまたは7M尿素を含有するポリアクリ
ルアミドゲルにおける低分子量DNAおよびRNAの分別」；
マニアチスら、バイオケミストリー、第14巻、3787〜37
94頁（1975）の「ポリアクリルアミドゲルにおける電気
泳動による小さい二重鎖および一重鎖DNA分子の鎖長決
定」；およびマニアチスら、モレキュー・クローニン
グ：実験室手法（コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリイ、ニューヨーク、1982）179〜185頁によって
与えられる。従って、これらの参照文献を参考として組
み込まれる。特別な分離に用いられる最適ゲル濃度、p
H、温度、変性剤の濃度等は、分離すべき核酸の大きさ
の範囲、それらの塩基組成；それらが一重鎖かまたは二
重鎖か、情報を電気泳動によって捜すための種類の性質
を含めて、多くのファクターに依存する。従って本発明
の応用は特定の分離のための条件を最適にするための標
準の予備試験を必要とするかも知れない。好ましくは、
ポリヌクレオチド鎖の伸長の間にデオキシイノシントリ
ホスフェートを、電気泳動中のいわゆる「バンド圧縮」
を避けるためデオキシグアノシントリホスフェートの代
わりに用いる。例えば、ミルスら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミク・サイエンシーズ、第
76巻、2232〜2235（1979）。例として、約10〜500塩基
の間の範囲の大きさを有するポリヌクレオチドを分離
し、次に示すゲル中で本発明に従って検出する:19部対
１部のアクリルアミドとビスアクリルアミドから作ら
れ、48パーセント（重量／容量）尿素を用いて、pH8.3
（25℃で測定した）にてトリス−ボレートEDTA緩衝液に
形成した６パーセントポリアクリルアミド。このゲルは
約50℃にて実施される。
チドの種類は、対応が４種の可能な末端塩基と４種のス
ペクトル分析できる染料との間に確立されるように末端
ヌクレオチドの語において定義される。特に、ポリヌク
レオチドの種類はDNA配列のチェイン・ターミネーター
法の関係において生じ、この方法は染料−ポリヌクレオ
チドの共役体をゲル電気泳動によって大きさに従って分
離する。例えばゴールドおよびマシューズ、上述した；
リックウッドおよびハメス著、核酸のゲル電気泳動：実
際のアプローチ（IRLプレス・リミテッド、ロンドン、1
981）；またはオスターマン、プロティンと核酸の研究
方法、第１巻（スプリンガー−ベルラク、ベルリン、19
84）。好ましくはゲルのタイプは約２〜20パーセントの
間の濃度（重量対容量）を有するポリアクリルアミドで
ある。さらに好ましくは、ポリアクリルアミドゲル濃度
が約４〜８パーセントの間にある。好ましくはゲルはス
トランド分離または変性剤を含む。このようなゲルを構
成するための詳細な方法はマニアチスら、メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー、第65巻、299〜305頁（1980）の
「98％ホルムアミドまたは7M尿素を含有するポリアクリ
ルアミドゲルにおける低分子量DNAおよびRNAの分別」；
マニアチスら、バイオケミストリー、第14巻、3787〜37
94頁（1975）の「ポリアクリルアミドゲルにおける電気
泳動による小さい二重鎖および一重鎖DNA分子の鎖長決
定」；およびマニアチスら、モレキュー・クローニン
グ：実験室手法（コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリイ、ニューヨーク、1982）179〜185頁によって
与えられる。従って、これらの参照文献を参考として組
み込まれる。特別な分離に用いられる最適ゲル濃度、p
H、温度、変性剤の濃度等は、分離すべき核酸の大きさ
の範囲、それらの塩基組成；それらが一重鎖かまたは二
重鎖か、情報を電気泳動によって捜すための種類の性質
を含めて、多くのファクターに依存する。従って本発明
の応用は特定の分離のための条件を最適にするための標
準の予備試験を必要とするかも知れない。好ましくは、
ポリヌクレオチド鎖の伸長の間にデオキシイノシントリ
ホスフェートを、電気泳動中のいわゆる「バンド圧縮」
を避けるためデオキシグアノシントリホスフェートの代
わりに用いる。例えば、ミルスら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミク・サイエンシーズ、第
76巻、2232〜2235（1979）。例として、約10〜500塩基
の間の範囲の大きさを有するポリヌクレオチドを分離
し、次に示すゲル中で本発明に従って検出する:19部対
１部のアクリルアミドとビスアクリルアミドから作ら
れ、48パーセント（重量／容量）尿素を用いて、pH8.3
（25℃で測定した）にてトリス−ボレートEDTA緩衝液に
形成した６パーセントポリアクリルアミド。このゲルは
約50℃にて実施される。
ゲル上の染料−ポリヌクレオチド共約体は標準手段、
例えば高光度水銀蒸気ランプ、レーザー等によって発光
される。好ましくは、ゲル上の染料−ポリヌクレオチド
はアルゴンイオンレーザーによって発生したレーザー
光、特に、アルゴンイオンレーザーの488〜514nmの発光
ラインによって発光される。
例えば高光度水銀蒸気ランプ、レーザー等によって発光
される。好ましくは、ゲル上の染料−ポリヌクレオチド
はアルゴンイオンレーザーによって発生したレーザー
光、特に、アルゴンイオンレーザーの488〜514nmの発光
ラインによって発光される。
これらのラインで同時にレーザー用として使える幾つ
かのアルゴンイオンレーザーは市販品として入手でき
る、例えばシオニクス社（サニイベール、CA）モデル20
01等。
かのアルゴンイオンレーザーは市販品として入手でき
る、例えばシオニクス社（サニイベール、CA）モデル20
01等。
本発明の重要な特徴はDNA配列決定方法における鎖伸
長のために使用されるDNAポリメラーゼである。好まし
くは、本発明の方法として使用されるポリメラーゼは、
マンガンまたはマグネシウム緩衝液を用いたTaqDNAポリ
メラーゼ、イニスらによって記載された、プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・サイエン
シーズ、第85巻、9436〜9440頁（1988）；およびマンガ
ン緩衝液を用いたT7DNAポリメラーゼ、デーバーらによ
って記載された、プロシーディングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・サイエンシーズ、第86巻、4076〜
4080頁（1989）、から成る群から選ばれる。一般に、未
知の配列を含む一重鎖DNA鋳型は標準技術によって、例
えばアプライド・バイオシステムズ・モデル370ADNA配
列決定システムのためのマニュアルに記載されているよ
うなM13mp18において調製される。同様に、プライマー
を鋳型に結合する、アニーリング反応は、標準プロトコ
ールによって行われている。異なる大きさに分類したDN
Aフラグメントを発生する伸長反応は、本発明のローダ
ミン標識ジデオキシヌクレオチドおよび使用した特定の
DNAポリメラーゼに対して最も効果的にする。
長のために使用されるDNAポリメラーゼである。好まし
くは、本発明の方法として使用されるポリメラーゼは、
マンガンまたはマグネシウム緩衝液を用いたTaqDNAポリ
メラーゼ、イニスらによって記載された、プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・サイエン
シーズ、第85巻、9436〜9440頁（1988）；およびマンガ
ン緩衝液を用いたT7DNAポリメラーゼ、デーバーらによ
って記載された、プロシーディングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・サイエンシーズ、第86巻、4076〜
4080頁（1989）、から成る群から選ばれる。一般に、未
知の配列を含む一重鎖DNA鋳型は標準技術によって、例
えばアプライド・バイオシステムズ・モデル370ADNA配
列決定システムのためのマニュアルに記載されているよ
うなM13mp18において調製される。同様に、プライマー
を鋳型に結合する、アニーリング反応は、標準プロトコ
ールによって行われている。異なる大きさに分類したDN
Aフラグメントを発生する伸長反応は、本発明のローダ
ミン標識ジデオキシヌクレオチドおよび使用した特定の
DNAポリメラーゼに対して最も効果的にする。
実施例 以下の実施例は本発明を説明するためのものである。
試薬の濃度、温度、および他の種々のパラメータの値は
単に本発明を例示するためのものであり、それを制限的
に考えるためのものではない。
試薬の濃度、温度、および他の種々のパラメータの値は
単に本発明を例示するためのものであり、それを制限的
に考えるためのものではない。
実施例1.6−TMR−NHS ６−TMR酸をカラムクロマトグラフィーによって５−
および６−TMR酸異性体の混合物から分離した。8.82mg
の６−TMR酸と10.5mgのDSCを0.5mlの乾燥DMF中にアルゴ
ン下に溶解した。テトラヒドロフラン（THF）に溶解し
たDMAPの0.5モル溶液の0.09mlを一滴ずつ添加した。室
温で２時間後、混合物を50mlのクロロホルムに入れ、1:
1のブラインと水の溶液を用いて３回洗浄した。クロロ
ホルムを蒸発させて残渣を20gのシルカゲルカラム（30
0:30:8の塩化メチレンとメタノールと酢酸溶離液）で精
製した。約0.4のRfの画分を乾燥するまで蒸発させ、酢
酸塩として8.6mgの６−TMR−NHSを生成した。
および６−TMR酸異性体の混合物から分離した。8.82mg
の６−TMR酸と10.5mgのDSCを0.5mlの乾燥DMF中にアルゴ
ン下に溶解した。テトラヒドロフラン（THF）に溶解し
たDMAPの0.5モル溶液の0.09mlを一滴ずつ添加した。室
温で２時間後、混合物を50mlのクロロホルムに入れ、1:
1のブラインと水の溶液を用いて３回洗浄した。クロロ
ホルムを蒸発させて残渣を20gのシルカゲルカラム（30
0:30:8の塩化メチレンとメタノールと酢酸溶離液）で精
製した。約0.4のRfの画分を乾燥するまで蒸発させ、酢
酸塩として8.6mgの６−TMR−NHSを生成した。
実施例2.5−TMR−NHS ５−TMR−NHSを、実施例１に記載したように、2mlの
乾燥DMF中、82.3mgの５−TMR酸、75mgのDSC、2mlの0.5
モルDMAPのTHF溶液0.70mlから調製した。
乾燥DMF中、82.3mgの５−TMR酸、75mgのDSC、2mlの0.5
モルDMAPのTHF溶液0.70mlから調製した。
実施例3.6−ROX−NHS ６−ROX酸をカラムクロマトグラフィーによって５−
および６−酸異性体の混合物から分離した。46.2mgの６
−ROX酸および58mgのDSCを2mlの乾燥DMF中にアルゴン下
に溶解し、0.5モルのDMAPのTHF溶液0.45mlを一滴ずつ添
加した。室温で1.5時間後、混合物を100mlのクロロホル
ムに入れ、1:1のブラインと水の溶液を用いて４回洗浄
した。クロロホルムを蒸発させて残渣を40gのシリカゲ
ルカラム（300:30:8の塩化メチレンとメタノールと酢酸
溶離液）上で精製した。約0.5のRfの画分を乾燥するま
で蒸発させ、酢酸塩として56.4mgの６−ROX−NHSを生成
した。
および６−酸異性体の混合物から分離した。46.2mgの６
−ROX酸および58mgのDSCを2mlの乾燥DMF中にアルゴン下
に溶解し、0.5モルのDMAPのTHF溶液0.45mlを一滴ずつ添
加した。室温で1.5時間後、混合物を100mlのクロロホル
ムに入れ、1:1のブラインと水の溶液を用いて４回洗浄
した。クロロホルムを蒸発させて残渣を40gのシリカゲ
ルカラム（300:30:8の塩化メチレンとメタノールと酢酸
溶離液）上で精製した。約0.5のRfの画分を乾燥するま
で蒸発させ、酢酸塩として56.4mgの６−ROX−NHSを生成
した。
実施例4.5−ROX−NHS ５−ROX−NHSを実施例３に記載したように、1.0mlの
乾燥DMF中、27.4mgの５−ROX酸、30.2mgのDSC、0.5モル
のDMAPのTHF溶液0.24mlから調製した。
乾燥DMF中、27.4mgの５−ROX酸、30.2mgのDSC、0.5モル
のDMAPのTHF溶液0.24mlから調製した。
実施例5.ローダミンNHSエステルの安定な配合物 ａ）実施例３からの0.44mgの６−カルボキシ−Ｘ−ロー
ダミンNHSエステルおよび0.01モルのエタノールアミン
のメタノール溶液80μｌを混合した。反応混合物とアセ
トニルおよび0.1モルのトリエチルアンモニウムアセテ
ート緩衝液（pH＝7.0）の逆相HPLCは、生成物が70％の
Ｘ−ローダミン酸および30％のＸ−ローダミンNHSエス
テル（エタノールアミンを用いたその反応から６−カル
ボキシ−Ｘ−ローダミンのエタノールアミドとして観察
された）から成っていることを示した。
ダミンNHSエステルおよび0.01モルのエタノールアミン
のメタノール溶液80μｌを混合した。反応混合物とアセ
トニルおよび0.1モルのトリエチルアンモニウムアセテ
ート緩衝液（pH＝7.0）の逆相HPLCは、生成物が70％の
Ｘ−ローダミン酸および30％のＸ−ローダミンNHSエス
テル（エタノールアミンを用いたその反応から６−カル
ボキシ−Ｘ−ローダミンのエタノールアミドとして観察
された）から成っていることを示した。
ｂ）実施例３からの0.15mgの６−カルボキシ−Ｘ−ロー
ダミンNHSエステルを100mlのクロロホルムに溶解した；
クロロホルム溶液を0.5モルの重炭酸ナトリウムを用い
て２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、0.1m
lの酢酸で処理し、乾燥するまで蒸発させた。0.35mgの
生成物をａ）と同様に正確に処理した；逆相HPLCは20％
の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸および80％の６−
カルボキシ−Ｘ−ローダミンNHSエステルを示した。
ダミンNHSエステルを100mlのクロロホルムに溶解した；
クロロホルム溶液を0.5モルの重炭酸ナトリウムを用い
て２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、0.1m
lの酢酸で処理し、乾燥するまで蒸発させた。0.35mgの
生成物をａ）と同様に正確に処理した；逆相HPLCは20％
の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸および80％の６−
カルボキシ−Ｘ−ローダミンNHSエステルを示した。
ｃ）酢酸の代わりにトリフルオロ酢酸を用いた以外は、
実施例３からの0.15mgの６−カルボキシ−Ｘ−ローダミ
ンNHSエステルをｂ）と同様に正確に処理した。0.19mg
の得られた固体をａ）と同様に正確に処理した；逆相HP
LCは＜５％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸および
＞95％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンNHSエステル
を示した。
実施例３からの0.15mgの６−カルボキシ−Ｘ−ローダミ
ンNHSエステルをｂ）と同様に正確に処理した。0.19mg
の得られた固体をａ）と同様に正確に処理した；逆相HP
LCは＜５％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸および
＞95％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンNHSエステル
を示した。
実施例6.R6G標識７−デアザ−２′,3′−ジデオキシア
デノシントリホスフェート（ddA−5R6G）の調製 上記のようにして得られた2.0μモルの７−（３″−
アミノ−１″−プロピニル）−７−デアザ−２′,3′−
ジデオキシアデノシントリホスフェート（凍結乾燥し
た）に、100μｌのDMF、3mgの５−ローダミン6G−NHSエ
ステルおよび50μｌの1.0Mトリエチルアンモニウムカー
ボネートをpH8.95で添加する。これを渦巻攪拌し室温で
そのまま終夜放置した。
デノシントリホスフェート（ddA−5R6G）の調製 上記のようにして得られた2.0μモルの７−（３″−
アミノ−１″−プロピニル）−７−デアザ−２′,3′−
ジデオキシアデノシントリホスフェート（凍結乾燥し
た）に、100μｌのDMF、3mgの５−ローダミン6G−NHSエ
ステルおよび50μｌの1.0Mトリエチルアンモニウムカー
ボネートをpH8.95で添加する。これを渦巻攪拌し室温で
そのまま終夜放置した。
次いで混合物をAX−300 220X4.6mmの７ミクロンカラ
ム上で１分間につき1.5mlの流速でHPLCによる精製をし
た。最初の溶出液は、60％の0.1Mトリエチルアンモニウ
ムカーボネート、pH7.0、40％のCH3CNであり、60％の0.
2Mトリエチルアンモニウムカーボネート、pH7.5、40％
のCH3CNへの線勾配で40分かけた。溶媒は収集生成物か
ら真空下に蒸発させて除去した。残渣を0.01Mトリエチ
ルアンモニウムアセテートpH7.0に溶解し、定量した。
ム上で１分間につき1.5mlの流速でHPLCによる精製をし
た。最初の溶出液は、60％の0.1Mトリエチルアンモニウ
ムカーボネート、pH7.0、40％のCH3CNであり、60％の0.
2Mトリエチルアンモニウムカーボネート、pH7.5、40％
のCH3CNへの線勾配で40分かけた。溶媒は収集生成物か
ら真空下に蒸発させて除去した。残渣を0.01Mトリエチ
ルアンモニウムアセテートpH7.0に溶解し、定量した。
実施例7.ROX標識２′,3′−ジデオキシシチジントリホ
スフェート（ddC−6ROX）の調製 150μｌの水に溶解した3.6μモルの５−（３″−アミ
ノ−１″−プロピニル）−２′,3′−ジデオキシシチジ
ントリホスフェート（上記のように得られた）に、60μ
ｌのDMSOに溶解した5mgの６−ローダミンＸ−NHSエステ
ルおよび50μｌの1.0Mトリエチルアンモニウムカーボネ
ートpH8.95を添加した。これを渦巻攪拌し室温でそのま
ま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に調製した。
スフェート（ddC−6ROX）の調製 150μｌの水に溶解した3.6μモルの５−（３″−アミ
ノ−１″−プロピニル）−２′,3′−ジデオキシシチジ
ントリホスフェート（上記のように得られた）に、60μ
ｌのDMSOに溶解した5mgの６−ローダミンＸ−NHSエステ
ルおよび50μｌの1.0Mトリエチルアンモニウムカーボネ
ートpH8.95を添加した。これを渦巻攪拌し室温でそのま
ま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に調製した。
実施例8.R110−標識２′,3′−ジデオキシイノシントリ
ホスフェート（ddG−5R110）の調製 上記のようにして得られた1.3μモルの７−（３″−
アミノ−１″−プロピニル）−７−デアザ−２′,3′−
ジデオキシグアノシントリホスフェート（凍結乾燥し
た）に100μｌのDMF、4mgの５−ローダミン110−NHSエ
ステル、および100μｌの1.0Mトリエチルアンモニウム
カーボネートpH8.95を添加した。これを渦巻攪拌し室温
にてそのまま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に
精製した。
ホスフェート（ddG−5R110）の調製 上記のようにして得られた1.3μモルの７−（３″−
アミノ−１″−プロピニル）−７−デアザ−２′,3′−
ジデオキシグアノシントリホスフェート（凍結乾燥し
た）に100μｌのDMF、4mgの５−ローダミン110−NHSエ
ステル、および100μｌの1.0Mトリエチルアンモニウム
カーボネートpH8.95を添加した。これを渦巻攪拌し室温
にてそのまま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に
精製した。
実施例9.TMR標識２′,3′−ジデオキシチミジントリホ
スフェート（ddT−6TMR）の調製 上記と同様にして得られた150μｌのH2Oに溶解した3.
1μモルの５−（３″−アミノ−１″−プロピニル）−
２′,3′−ジデオキシウリジントリホスフェートを、15
0μｌのDMF、100μｌの1.0Mトリエチルアンモニウムカ
ーボネートpH8.95、および4mgの６−TMR−NHSエステル
と共に混合した。これを渦巻攪拌し室温にてそのまま終
夜放置した。生成物を実施例６と同様に精製した。
スフェート（ddT−6TMR）の調製 上記と同様にして得られた150μｌのH2Oに溶解した3.
1μモルの５−（３″−アミノ−１″−プロピニル）−
２′,3′−ジデオキシウリジントリホスフェートを、15
0μｌのDMF、100μｌの1.0Mトリエチルアンモニウムカ
ーボネートpH8.95、および4mgの６−TMR−NHSエステル
と共に混合した。これを渦巻攪拌し室温にてそのまま終
夜放置した。生成物を実施例６と同様に精製した。
実施例10.ローダミン標識ジデオキシヌクレオチドおよ
びTaqDNAポリメラーゼとマグネシウム緩衝液を用いるDN
A配列分析 実施例６〜９において調製されたローダミン標識ジデ
オキシヌクレオチドを使用して、アプライド・バイオシ
ステムス（フォスター市、CA）モデル370 A自動化DNAシ
ーケンサーを用いる鎖末端配列決定のDNAフラグメント
に標識を付した。この製造業者のプロトコール（参照、
ユーザー・ブレタン・DNAシーケンサー・モデル370、発
行第２号、1987年８月12日）をM13mp18一重鎖鋳型を得
るために続けた。（このM13自身は試験配列として使っ
た）。M13ユニバーサルプライマーを用いた。次の溶液
を調製した:5X Taq Mg緩衝液（50mMトリス−C1 pH8.5、
50mMのMgCl2、250mMのNaCl）；染料−ターミネーターミ
ックス（2.7μＭのddG−5R110、9.00μＭのddA−5R6G、
216.0μＭのddT−6TMR、および54.0μＭのddC−6RO
X）；およびdNTPミックス（500μＭのdITP、100μＭのd
ATP、100μＭのdTTP、および100μＭのdCTP）。アニー
ル反応は、マイクロ遠心管に3.6μｌの5X Taq Mg緩衝
液、0.4pモルのDNA鋳型、0.8pモルのプライマー、およ
び容量12.0μｌまでの水を一緒にして行われた。混合物
を55〜65℃にて５〜10分間インキューベートし、20〜30
分かけて４〜20℃の温度までゆっくり冷却し、次いで一
度遠心分離して濃縮物を集め、混合し、氷上に置いた。
混合物に次に1.0μｌのdNTPミックス、2.0μｌの染料−
ターミネーターミックス、４ユニットのTaqポリメラー
ゼ、および容量18.0μｌまでにする水を添加した。混合
物を30分間60℃にてインキュべートし、次いで氷上に置
き、25.0μｌの10mMのEDTApH8.0と一緒にして反応物を
終わらせた。混合物中のDNAを次にスピンカラム（例え
ば1mlのセファデックスＧ−50カラム、例として５プラ
イムから３プライムまでのセレクト−Ｄ、ウェスト・チ
ェスター、PA）で精製し、エタノール沈澱をした（４μ
ｌの3M酢酸ナトリウムpH5.2および120μｌの95％エタノ
ールを添加した。氷上で10分間インキュベートし、15分
間遠心分離を行い、上澄液をデカントして排出し、70％
エタノールに懸濁し、攪拌し、遠心分離を15分間行い、
上澄液をデカントして排出し、真空遠心分離機で５分間
乾燥することによって）。沈澱したDNAを次に５部の脱
イオンホルムアミドおよび１部の50mMのEDTApH8.0から
成る溶液３μｌに再懸濁させて完全に渦巻攪拌をした。
ゲル上に装填する前に、混合物を90℃にて２分間インキ
ュベートしてDNAを変性させた。M13プラスミドのうち45
0個以上の塩基がモデル370A自動化シーケンサーの塩基
コーリングルーチンによって正確に同定された。
びTaqDNAポリメラーゼとマグネシウム緩衝液を用いるDN
A配列分析 実施例６〜９において調製されたローダミン標識ジデ
オキシヌクレオチドを使用して、アプライド・バイオシ
ステムス（フォスター市、CA）モデル370 A自動化DNAシ
ーケンサーを用いる鎖末端配列決定のDNAフラグメント
に標識を付した。この製造業者のプロトコール（参照、
ユーザー・ブレタン・DNAシーケンサー・モデル370、発
行第２号、1987年８月12日）をM13mp18一重鎖鋳型を得
るために続けた。（このM13自身は試験配列として使っ
た）。M13ユニバーサルプライマーを用いた。次の溶液
を調製した:5X Taq Mg緩衝液（50mMトリス−C1 pH8.5、
50mMのMgCl2、250mMのNaCl）；染料−ターミネーターミ
ックス（2.7μＭのddG−5R110、9.00μＭのddA−5R6G、
216.0μＭのddT−6TMR、および54.0μＭのddC−6RO
X）；およびdNTPミックス（500μＭのdITP、100μＭのd
ATP、100μＭのdTTP、および100μＭのdCTP）。アニー
ル反応は、マイクロ遠心管に3.6μｌの5X Taq Mg緩衝
液、0.4pモルのDNA鋳型、0.8pモルのプライマー、およ
び容量12.0μｌまでの水を一緒にして行われた。混合物
を55〜65℃にて５〜10分間インキューベートし、20〜30
分かけて４〜20℃の温度までゆっくり冷却し、次いで一
度遠心分離して濃縮物を集め、混合し、氷上に置いた。
混合物に次に1.0μｌのdNTPミックス、2.0μｌの染料−
ターミネーターミックス、４ユニットのTaqポリメラー
ゼ、および容量18.0μｌまでにする水を添加した。混合
物を30分間60℃にてインキュべートし、次いで氷上に置
き、25.0μｌの10mMのEDTApH8.0と一緒にして反応物を
終わらせた。混合物中のDNAを次にスピンカラム（例え
ば1mlのセファデックスＧ−50カラム、例として５プラ
イムから３プライムまでのセレクト−Ｄ、ウェスト・チ
ェスター、PA）で精製し、エタノール沈澱をした（４μ
ｌの3M酢酸ナトリウムpH5.2および120μｌの95％エタノ
ールを添加した。氷上で10分間インキュベートし、15分
間遠心分離を行い、上澄液をデカントして排出し、70％
エタノールに懸濁し、攪拌し、遠心分離を15分間行い、
上澄液をデカントして排出し、真空遠心分離機で５分間
乾燥することによって）。沈澱したDNAを次に５部の脱
イオンホルムアミドおよび１部の50mMのEDTApH8.0から
成る溶液３μｌに再懸濁させて完全に渦巻攪拌をした。
ゲル上に装填する前に、混合物を90℃にて２分間インキ
ュベートしてDNAを変性させた。M13プラスミドのうち45
0個以上の塩基がモデル370A自動化シーケンサーの塩基
コーリングルーチンによって正確に同定された。
実施例11.ローダミン標識ジデオキシヌクレオチドおよ
びT7DNAポリメラーゼとマンガン緩衝液を用いるDNA配列
分析 実施例10と同様に配列決定反応を行ったが、（１）Ta
q DNAポリメラーゼの代わりに修飾T7DNAポリメラーゼ
（シーケナーゼ（登録商標Sequenase、米国のバイオケ
ミカル社から入手できる）を使用する、例えばタボール
ら、プロシーディンング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンシーズ、第86巻、4076〜4080頁
（1989）および第84巻、4767〜4771頁（1987）、および
（２）5X Taq Mg緩衝液の代わりに5X T7 Mn緩衝液（100
mMのトリス−Cl pH7.5、75mMのイソクエン酸ナトリウ
ム、10mM MnCl2、250mMのNaCl）を使用し、染料−ター
ミネーターミックスは1.8μＭのddG−5R110、5.4μＭの
ddA−5R6G、5.8μＭのddT−6TMR、および9.0μＭのddC
−6ROMから成り、dNTPミックスは750μＭのdITP、150μ
ＭのdATP、150μMdTTP、および150μＭのdCTPから成
り、伸長反応は37℃にて10分間行った。
びT7DNAポリメラーゼとマンガン緩衝液を用いるDNA配列
分析 実施例10と同様に配列決定反応を行ったが、（１）Ta
q DNAポリメラーゼの代わりに修飾T7DNAポリメラーゼ
（シーケナーゼ（登録商標Sequenase、米国のバイオケ
ミカル社から入手できる）を使用する、例えばタボール
ら、プロシーディンング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンシーズ、第86巻、4076〜4080頁
（1989）および第84巻、4767〜4771頁（1987）、および
（２）5X Taq Mg緩衝液の代わりに5X T7 Mn緩衝液（100
mMのトリス−Cl pH7.5、75mMのイソクエン酸ナトリウ
ム、10mM MnCl2、250mMのNaCl）を使用し、染料−ター
ミネーターミックスは1.8μＭのddG−5R110、5.4μＭの
ddA−5R6G、5.8μＭのddT−6TMR、および9.0μＭのddC
−6ROMから成り、dNTPミックスは750μＭのdITP、150μ
ＭのdATP、150μMdTTP、および150μＭのdCTPから成
り、伸長反応は37℃にて10分間行った。
実施例12.ローダミン標識ジデオキシヌクレオチドおよ
びTaqDNAポリメラーゼとマンガン緩衝液を用いるDNA配
列分析 実施例10と同様に配列決定反応を行ったが、5X Taq M
g緩衝液の代わりに5X Taq Mn緩衝液（100mMのトリス−C
l pH7.5、75mMのイソクエン酸ナトリウム、10mM MnC
l2、250mMの塩化ナトリウム）を使用し、染料−ターミ
ネーターミックスは、3.6μＭのddG−5R110、2.7μＭの
ddA−5R6G、43.2μＭのddT−6TMR、および28.8μＭのdd
C−6ROXから成った。M13プラスミドのうち450個以上の
塩基がモデル370A自動化シーケンサーの塩基コーリング
ルーチンによって正確に同定された。
びTaqDNAポリメラーゼとマンガン緩衝液を用いるDNA配
列分析 実施例10と同様に配列決定反応を行ったが、5X Taq M
g緩衝液の代わりに5X Taq Mn緩衝液（100mMのトリス−C
l pH7.5、75mMのイソクエン酸ナトリウム、10mM MnC
l2、250mMの塩化ナトリウム）を使用し、染料−ターミ
ネーターミックスは、3.6μＭのddG−5R110、2.7μＭの
ddA−5R6G、43.2μＭのddT−6TMR、および28.8μＭのdd
C−6ROXから成った。M13プラスミドのうち450個以上の
塩基がモデル370A自動化シーケンサーの塩基コーリング
ルーチンによって正確に同定された。
前述の本発明の好適例の開示は説明と解説のために示
した。この開示された正確な形に本発明を網羅または制
限するものではなく、多くの改変および変形が上述の教
示の観点から可能であることは明らかである。これらの
例は本発明の原理およびその実際の応用を最良に説明す
るために選択され記載されたものであり、これによって
当該技術分野における他の熟練者が予期された特定の用
途に適合するように種々の具体化および種々の改変にお
いて本発明の範囲はここに添付する特許請求の範囲によ
って明確にするつもりである。
した。この開示された正確な形に本発明を網羅または制
限するものではなく、多くの改変および変形が上述の教
示の観点から可能であることは明らかである。これらの
例は本発明の原理およびその実際の応用を最良に説明す
るために選択され記載されたものであり、これによって
当該技術分野における他の熟練者が予期された特定の用
途に適合するように種々の具体化および種々の改変にお
いて本発明の範囲はここに添付する特許請求の範囲によ
って明確にするつもりである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャールス アール コンネル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94062 レッドウッド シティ，キング ストリート 167 (72)発明者 ジェイ スコット イーデイ アメリカ合衆国 インディアナ州 46236 インディアナポリス，ブリッタ ニイ シティ，ノース 8531 (72)発明者 ステベン フング アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94306 パロ アルト，アドベ プレイ ス 420 (72)発明者 エヌ デービス ハーシー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94303 サン カルロス，エルム スト リート 800，208号 (72)発明者 リンダ ジー リー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94303 パロ アルト，ステリング ド ライブ 3187 (72)発明者 ステベン エム メンシェン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94526 フレモント，バンダ ウエイ 768 (72)発明者 サム エル ウー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94061 レッドウッド シティ，カルロ ス アベニュ 450 (56)参考文献 特開 平１−180455（ＪＰ，Ａ) 欧州公開272007（ＥＰ，Ａ１) Ｊ．ＯＲＧ．ＣＨＥＭ．，54（14) （1989）Ｐ．3420−3422 ＣＨＥＭＩＣ ＡＬ ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ，93：249411
Claims (11)
- 【請求項１】異なる３′−末端ジデオキシヌクレオチド
を有するポリヌクレオチドをDNA配列決定のチェインタ
ーミネーション法において識別する方法において、この
方法が： 第１、第２、第３、および第４の種類のポリヌクレオチ
ドの混合物を形成し、第１の種類の各ポリヌクレオチド
が３′−末端ジデオキシアデノシンを有し、テトラメチ
ルローダミン、ローダミンＸ、ローダミン6G、およびロ
ーダミン110から成る群から選ばれる第１の染料を用い
て標識を付され；第２の種類の各ポリヌクレオチドが
３′−末端ジデオキシシチジンを有し、テトラメチルロ
ーダミン、ローダミンＸ、ローダミン6G、およびローダ
ミン110から成る群から選ばれる第２の染料を用いて標
識を付され；第３の種類の各ポリヌクレオチドが３′−
末端ジデオキシグアノシンを有し、テトラメチルローダ
ミン、ローダミンＸ、ローダミン6G、およびローダミン
110から成る群から選ばれる第３の染料を用いて標識を
付され；第４の種類の各ポリヌクレオチドが３′−末端
ジデオキシチミジンを有し、テトラメチルローダミン、
ローダミンＸ、ローダミン6G、およびローダミン110か
ら成る群から選ばれる第４の染料を用いて標識を付さ
れ； 混合物中の各種類のポリヌクレオチドが異なる染料を用
いて標識を付されており； 同じ大きさに分類されたポリヌクレオチドのバンドを形
成するように混合物中のポリヌクレオチドをゲル上に電
気泳動によって分離し； ゲル上のバンドを照明ビームを用いて発光させ、この照
明ビームは染料に蛍光を生じさせることをが出来；そし
て バンド中のポリヌクレオチドの種類を染料の蛍光または
吸収スペクトルによって同定する、 工程から成るポリヌクレオチドの識別方法。 - 【請求項２】前記３′−末端ジデオキシアデノシンが
２′,3′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンであり、
前記第１の染料が結合基のためにその７炭素原子に結合
しており；前記３′−末端ジデオキシシチジンが２′,
3′−ジオキシシチジンであり、前記第２の染料が結合
基のためにその５炭素原子に結合しており；前記３′−
末端ジデオキシグアノシンが２′,3′−ジデオキシ−７
−デアザグアノシンおよび２′,3′−ジデオキシ−７−
デアザイノシンから成る群から選ばれ、前記第３の染料
が結合基のためにその７炭素原子に結合しており；前記
３′−末端ジデオキシチミジンが２′,3′−ジデオキシ
ウリジンであり、前記第４の染料が結合基のためにその
５炭素原子に結合している特許請求の範囲第１項記載の
方法。 - 【請求項３】前記結合基が３−カルボキシアミノ−１−
ポロピニルであり、前記２′,3′−ジデオキシ−７−デ
アザアデノシン、および２′,3′−ジデオキシ−７−デ
アザグアノシンおよび２′,3−ジデオキシ−７−デアザ
イノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノ
シンの、７炭素原子を、前記第１および第３の染料の５
または６炭素原子に、それぞれ結合し、前記ジデオキシ
シチジンおよび前記ジデオキシウリジンの５炭素原子を
前記第２および第４の染料の５または６炭素原子に、そ
れぞれ結合している特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】さらにプライマーから複数のポリヌクレオ
チドをDNAポリメラーゼによって、ジデオキシアデノシ
ントリホスフェート、ジデオキシシチジントリホスフェ
ート、ジデオキシグアノシントリホスフェート、および
ジデオキシチミジントリホスフェートの存在で伸長し、
前記第１、第２、第３、および第４の種類のポリヌクレ
オチドを形成する工程を含む特許請求の範囲第３項記載
の方法。 - 【請求項５】前記DNAポリメラーゼがTaq DNAポリメラー
ゼおよびT7DNAポリメラーゼから成る群から選ばれる特
許請求の範囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】前記２′,3′−ジデオキシ−７−デアザア
デノシンがローダミン6Gの５炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシシチジンがローダミンＸの６炭素
原子に結合し、２′,3′−ジデオキシ−７−デアザグア
ノシンおよび２′,3′−ジデオキシ−７−デアザイノシ
ンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンが
ローダミン110の５炭素原子に結合し、前記２′,3′−
ジデオキシウリジンがテトラメチルローダミンの６炭素
原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】前記２′,3′−ジデオキシ−７−デアザア
デノシンがローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシシチジンがローダミン6Gの５炭素
原子に結合し、２′,3′−ジデオキシ−７−デアザグア
ノシンおよび２′,3′−ジデオキシ−７−デアザイノシ
ンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンが
ローダミン110の５炭素原子に結合し、前記２′,3′−
ジデオキシウリジンがテトラメチルローダミンの６炭素
原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項８】前記２′,3′−ジデオキシ−７−デアザア
デノシンがローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシシチジンがローダミン110の５炭
素原子に結合し、２′,3′−ジデオキシ−７−デアザグ
アノシンおよび２′,3′−ジデオキシ−７−デアザイノ
シンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシン
がテトラメチルローダミンの６炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシウリジンがローダミン6Gの５炭素
原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項９】前記２′,3′−ジデオキシ−７−デアザア
デノシンがローダミン6Gの５炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシシチジンがローダミン110の５炭
素原子に結合し、２′,3′−ジデオキシ−７−デアザグ
アノシンおよび２′,3′−ジデオキシ−７−デアザイノ
シンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシン
がローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記２′,3′−
ジデオキシウリジンがテトラメチルローダミンの６炭素
原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項１０】前記２′,3′−ジデオキシ−７−デアザ
アデノシンがローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシシチジンがテトラメチルローダミ
ンの６炭素原子に結合し、２′,3′−ジデオキシ−７−
デアザグアノシンおよび２′,3′−ジデオキシ−７−デ
アザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキシグ
アノシンがローダミン6Gの５炭素原子に結合し、前記
２′,3′−ジデオキシウリジンがローダミン110の５炭
素原子に結合している特許請求の範囲第５項記載の方
法。 - 【請求項１１】次の群から選ばれるローダミン標識化合
物。 （式中のR1は５−および６−カルボキシローダミンＸ、
５−および６−カルボキシローダミン6G、５−および６
−カルボキシローダミン110、および５−および６−カ
ルボキシテトラメチルローダミンから成る群から選ば
れ、R2はトリホスフェート、１−チオトリホスフェー
ト、または10〜600塩基のポリヌクレオチドである。）
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/415,050 US5366860A (en) | 1989-09-29 | 1989-09-29 | Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination |
| US415,050 | 1989-09-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05502371A JPH05502371A (ja) | 1993-04-28 |
| JP2649102B2 true JP2649102B2 (ja) | 1997-09-03 |
Family
ID=23644158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2513838A Expired - Lifetime JP2649102B2 (ja) | 1989-09-29 | 1990-09-27 | 核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5366860A (ja) |
| EP (1) | EP0496749B1 (ja) |
| JP (1) | JP2649102B2 (ja) |
| AT (1) | ATE131210T1 (ja) |
| DE (1) | DE69024061T2 (ja) |
| WO (1) | WO1991005060A2 (ja) |
Families Citing this family (215)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1223831A (en) | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| USRE43096E1 (en) | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| US5821058A (en) * | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
| US6004446A (en) * | 1984-03-29 | 1999-12-21 | Li-Cor, Inc. | DNA Sequencing |
| US5863403A (en) * | 1984-03-29 | 1999-01-26 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Digital DNA typing |
| US4729947A (en) * | 1984-03-29 | 1988-03-08 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | DNA sequencing |
| US6086737A (en) * | 1984-03-29 | 2000-07-11 | Li-Cor, Inc. | Sequencing near infrared and infrared fluorescence labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels therefor |
| US5571388A (en) * | 1984-03-29 | 1996-11-05 | Li-Cor, Inc. | Sequencing near infrared and infrared fluorescense labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels thereof |
| US5360523A (en) * | 1984-03-29 | 1994-11-01 | Li-Cor, Inc. | DNA sequencing |
| US6207421B1 (en) | 1984-03-29 | 2001-03-27 | Li-Cor, Inc. | DNA sequencing and DNA terminators |
| US5516633A (en) * | 1991-08-15 | 1996-05-14 | Amersham Life Science, Inc. | DNA sequencing with a T7-type gene 6 exonuclease |
| US6194144B1 (en) | 1993-01-07 | 2001-02-27 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry |
| CA2158642A1 (en) * | 1993-03-19 | 1994-09-29 | Hubert Koster | Dna sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation |
| US5604097A (en) | 1994-10-13 | 1997-02-18 | Spectragen, Inc. | Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags |
| US6013445A (en) * | 1996-06-06 | 2000-01-11 | Lynx Therapeutics, Inc. | Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors |
| USRE43097E1 (en) | 1994-10-13 | 2012-01-10 | Illumina, Inc. | Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors |
| US5582705A (en) * | 1995-05-19 | 1996-12-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Multiplexed capillary electrophoresis system |
| US5614386A (en) * | 1995-06-23 | 1997-03-25 | Baylor College Of Medicine | Alternative dye-labeled primers for automated DNA sequencing |
| US5728529A (en) * | 1995-06-23 | 1998-03-17 | Baylor College Of Medicine | Alternative dye-labeled ribonucleotides, deoxyribonucleotides, and dideoxyribonucleotides for automated DNA analysis |
| EP0833936A4 (en) * | 1995-06-23 | 2005-03-02 | Baylor College Medicine | ALTERNATIVE DYE-MARKED PRIMERS, RIBONUCLEOTIDES, DEOXYRIBONUCLEOTIDES AND DIDEOXYRIBONUCLEOTIDES FOR AUTOMATIC DNA ANALYSIS AND HOMOGENEOUS AMPLIFICATION / DETECTION DETECTION |
| US5861287A (en) * | 1995-06-23 | 1999-01-19 | Baylor College Of Medicine | Alternative dye-labeled primers for automated DNA sequencing |
| WO1997025314A1 (en) * | 1996-01-11 | 1997-07-17 | Florida State University | Novel dicationic perylene dye and use for precipitation and quantitation of dna |
| US6020481A (en) * | 1996-04-01 | 2000-02-01 | The Perkin-Elmer Corporation | Asymmetric benzoxanthene dyes |
| US7825237B2 (en) * | 1996-05-03 | 2010-11-02 | Applied Biosystems, Llc | Oligonucleotides and analogs labeled with energy transfer dyes |
| US5945526A (en) * | 1996-05-03 | 1999-08-31 | Perkin-Elmer Corporation | Energy transfer dyes with enhanced fluorescence |
| US7388092B2 (en) * | 1996-05-03 | 2008-06-17 | Applera Corporation | Oligonucleotides and analogs labeled with energy transfer dyes |
| US5847162A (en) * | 1996-06-27 | 1998-12-08 | The Perkin Elmer Corporation | 4, 7-Dichlororhodamine dyes |
| US7550570B2 (en) | 2000-05-25 | 2009-06-23 | Applied Biosystems, Llc. | 4,7-dichlororhodamine dyes labeled polynucleotides |
| US6017712A (en) * | 1996-06-27 | 2000-01-25 | Lee; Linda | 4,7-dichlororhodamine dyes |
| US6080852A (en) | 1996-06-27 | 2000-06-27 | The Perkin-Elmer Corporation | 4,7-dichlororhodamine dyes |
| US5821356A (en) * | 1996-08-12 | 1998-10-13 | The Perkin Elmer Corporation | Propargylethoxyamino nucleotides |
| JPH11115436A (ja) | 1997-10-15 | 1999-04-27 | Toyota Autom Loom Works Ltd | 車軸揺動制御用流体圧シリンダの支持構造 |
| US5958694A (en) * | 1997-10-16 | 1999-09-28 | Caliper Technologies Corp. | Apparatus and methods for sequencing nucleic acids in microfluidic systems |
| US6583168B1 (en) | 1997-11-25 | 2003-06-24 | Applera Corporation | Sulfonated diarylrhodamine dyes |
| EP1051523A2 (en) * | 1998-02-02 | 2000-11-15 | Amersham Pharmacia Biotech AB | Nucleic acid analysis method |
| CA2319777C (en) | 1998-02-04 | 2008-01-08 | Amersham Pharmacia Biotech, Inc. | Dideoxy dye terminators |
| US6653462B2 (en) | 1998-05-29 | 2003-11-25 | Applera Corporation | Nucleotide compounds including a rigid linker |
| US5948648A (en) * | 1998-05-29 | 1999-09-07 | Khan; Shaheer H. | Nucleotide compounds including a rigid linker |
| US6096875A (en) | 1998-05-29 | 2000-08-01 | The Perlein-Elmer Corporation | Nucleotide compounds including a rigid linker |
| US6908770B1 (en) | 1998-07-16 | 2005-06-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Fluid based analysis of multiple analytes by a sensor array |
| US6432642B1 (en) * | 1999-01-15 | 2002-08-13 | Pe Corporation (Ny) | Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection |
| US6635419B1 (en) | 1999-02-16 | 2003-10-21 | Applera Corporation | Polynucleotide sequencing method |
| US6605434B1 (en) * | 1999-03-16 | 2003-08-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Direct bacterial lysate sequencing |
| DE19919119A1 (de) * | 1999-04-27 | 2000-11-02 | Drexhage Karl Heinz | Neue Carbopyronin-Fluoreszenz-Farbstoffe |
| US7022517B1 (en) | 1999-07-16 | 2006-04-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method and apparatus for the delivery of samples to a chemical sensor array |
| CA2379130A1 (en) | 1999-07-16 | 2001-01-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method and apparatus for the delivery of samples to a chemical sensor array |
| US6372907B1 (en) * | 1999-11-03 | 2002-04-16 | Apptera Corporation | Water-soluble rhodamine dye peptide conjugates |
| DE60135092D1 (de) | 2000-01-31 | 2008-09-11 | Univ Texas | Tragbare vorrichtung mit einer sensor-array-anordnung |
| US6465644B1 (en) * | 2000-05-02 | 2002-10-15 | Applera Corporation | Sulfonated [8,9] benzophenoxazine dyes and the use of their labelled conjugates |
| US6887664B2 (en) | 2000-06-06 | 2005-05-03 | Applera Corporation | Asynchronous primed PCR |
| EP1317464B1 (en) * | 2000-10-11 | 2009-05-13 | Applera Corporation | Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers |
| WO2002063270A2 (en) * | 2001-02-05 | 2002-08-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | The use of mesoscale self-assembly and recognition to effect delivery of sensing reagent for arrayed sensors |
| DE60216468T2 (de) * | 2001-03-09 | 2007-09-27 | Boston Probes, Inc., Bedford | Kombinationsoligomere betreffende verfahren, kits und zusammensetzungen |
| US6887690B2 (en) * | 2001-06-22 | 2005-05-03 | Pe Corporation | Dye-labeled ribonucleotide triphosphates |
| US6764710B2 (en) | 2001-07-18 | 2004-07-20 | Scimed Life Systems, Inc. | Light emitting markers for use with substrates |
| US7052512B2 (en) * | 2001-07-18 | 2006-05-30 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Fluorescent dyed lubricant for medical devices |
| US6856390B2 (en) | 2001-07-25 | 2005-02-15 | Applera Corporation | Time-delay integration in electrophoretic detection systems |
| WO2003045310A2 (en) | 2001-11-21 | 2003-06-05 | Applera Corporation | Digital assay |
| JP2006509996A (ja) * | 2002-04-02 | 2006-03-23 | カリパー・ライフ・サイエンシズ・インコーポレーテッド | サンプル生体材料の１種以上のサンプル成分を分離及び単離するための方法、システム及び装置 |
| CA2523626A1 (en) | 2002-04-26 | 2003-11-06 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method and system for the detection of cardiac risk factors |
| US20040137469A1 (en) | 2002-09-08 | 2004-07-15 | Casale Ralph A | Methods, compositions and libraries pertaining PNA dimer and PNA oligomer synthesis |
| WO2004026804A1 (en) | 2002-09-20 | 2004-04-01 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Anthraquinone quencher dyes, their methods of preparation and use |
| US7407747B2 (en) * | 2002-10-15 | 2008-08-05 | Applera Corporation | Method for drying dye-terminator sequencing reagents |
| DE10259374A1 (de) * | 2002-12-18 | 2004-07-08 | Atto-Tec Gmbh | Carboxamid-substituierte Farbstoffe für analytische Anwendungen |
| WO2004097371A2 (en) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | System and method for the detection of analytes |
| US7238482B2 (en) | 2003-05-07 | 2007-07-03 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts |
| WO2004101709A1 (en) | 2003-05-09 | 2004-11-25 | Applera Corporation | Phenyl xanthene dyes |
| EP1627025B1 (en) * | 2003-05-09 | 2016-10-12 | Applied Biosystems, LLC | Fluorescent polymeric materials containing lipid soluble rhodamine dyes |
| WO2004104922A2 (en) * | 2003-05-16 | 2004-12-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Image and part recognition technology |
| US9317922B2 (en) | 2003-05-16 | 2016-04-19 | Board Of Regents The University Of Texas System | Image and part recognition technology |
| US7417726B2 (en) | 2003-09-19 | 2008-08-26 | Applied Biosystems Inc. | Normalization of data using controls |
| WO2005043127A2 (en) | 2003-10-28 | 2005-05-12 | Epoch Biosciences, Inc. | Fluorescent probes for dna detection by hybridization with improved sensitivity and low background |
| AU2004290051A1 (en) | 2003-11-12 | 2005-05-26 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oilseed plants and oleaginous yeast |
| US7439341B2 (en) | 2003-11-14 | 2008-10-21 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Fluorescence quenching azo dyes, their methods of preparation and use |
| DE602004018732D1 (de) * | 2003-11-20 | 2009-02-12 | Exiqon As | Löscher-Zusammensetzung mit Anthraquinon |
| US7651868B2 (en) | 2003-12-11 | 2010-01-26 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Method and system for the analysis of saliva using a sensor array |
| JP4127204B2 (ja) * | 2003-12-17 | 2008-07-30 | セイコーエプソン株式会社 | 液晶表示装置の製造方法 |
| DE602004030041D1 (de) | 2003-12-22 | 2010-12-23 | Univ Pennsylvania | Verfahren und zusammensetzungen zur identifikation von rna-bindenden proteinen |
| US8101431B2 (en) | 2004-02-27 | 2012-01-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems |
| US8105849B2 (en) | 2004-02-27 | 2012-01-31 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements |
| WO2005118806A2 (en) * | 2004-05-28 | 2005-12-15 | Ambion, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS INVOLVING MicroRNA |
| WO2006016978A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-02-16 | Applera Corporation | Analog probe complexes |
| WO2006020947A2 (en) | 2004-08-13 | 2006-02-23 | Epoch Biosciences, Inc. | Phosphonate fluorescent dyes and conjugates |
| US7767834B2 (en) * | 2004-08-13 | 2010-08-03 | Elitech Holding B.V. | Phosphonylated fluorescent dyes and conjugates |
| US7588931B2 (en) | 2004-11-04 | 2009-09-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica |
| ES2534300T3 (es) | 2004-11-12 | 2015-04-21 | Asuragen, Inc. | Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN |
| US20060292586A1 (en) * | 2004-12-17 | 2006-12-28 | Schroth Gary P | ID-tag complexes, arrays, and methods of use thereof |
| US20060166238A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-07-27 | Ramsing Niels B | Probes, libraries and kits for analysis of mixtures of nucleic acids and methods for constructing the same |
| EP2813581B1 (en) | 2005-01-06 | 2018-06-27 | Applied Biosystems, LLC | Use of polypeptides having nucleic acid binding activity in methods for fast nucleic acid amplification |
| EP2233581A1 (en) | 2005-02-01 | 2010-09-29 | AB Advanced Genetic Analysis Corporation | Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension |
| US20070065948A1 (en) | 2005-03-15 | 2007-03-22 | Applera Corporation | Use of antibody-surrogate antigen systems for detection of analytes |
| WO2006127507A2 (en) | 2005-05-20 | 2006-11-30 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Compounds and methods for labeling oligonucleotides |
| CA2610793A1 (en) | 2005-05-31 | 2007-05-10 | Labnow, Inc. | Methods and compositions related to determination and use of white blood cell counts |
| DK2463386T3 (en) | 2005-06-15 | 2017-07-31 | Complete Genomics Inc | Nucleic acid analysis using random mixtures of non-overlapping fragments |
| US20070087360A1 (en) * | 2005-06-20 | 2007-04-19 | Boyd Victoria L | Methods and compositions for detecting nucleotides |
| US20070059713A1 (en) * | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Lee Jun E | SSB-DNA polymerase fusion proteins |
| JP4843044B2 (ja) * | 2005-10-05 | 2011-12-21 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 非蛍光性エネルギー移動 |
| EP1951900B1 (en) | 2005-10-07 | 2016-06-15 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
| US8092784B2 (en) * | 2005-11-30 | 2012-01-10 | Biotium, Inc. | Enzyme substrate comprising a functional dye and associated technology and methods |
| SG170028A1 (en) | 2006-02-24 | 2011-04-29 | Callida Genomics Inc | High throughput genome sequencing on dna arrays |
| CA2643700A1 (en) | 2006-02-24 | 2007-11-22 | Callida Genomics, Inc. | High throughput genome sequencing on dna arrays |
| WO2007106690A2 (en) | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Degenerate nucleobase analogs |
| WO2007140015A2 (en) | 2006-05-26 | 2007-12-06 | Althea Technologies, Inc | Biochemical analysis of partitioned cells |
| US20110016581A1 (en) | 2006-10-23 | 2011-01-20 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Delta-8 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids |
| US7910354B2 (en) | 2006-10-27 | 2011-03-22 | Complete Genomics, Inc. | Efficient arrays of amplified polynucleotides |
| US20090111706A1 (en) | 2006-11-09 | 2009-04-30 | Complete Genomics, Inc. | Selection of dna adaptor orientation by amplification |
| US7893227B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-02-22 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked nucleotides and nucleosides base modified with non-cleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
| US20080131878A1 (en) * | 2006-12-05 | 2008-06-05 | Asuragen, Inc. | Compositions and Methods for the Detection of Small RNA |
| US7897737B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-01 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked, nucleotides and nucleosides, base modified with photocleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
| AU2007333106A1 (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-19 | Asuragen, Inc. | miR-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
| US8013215B2 (en) | 2007-02-12 | 2011-09-06 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Production of arachidonic acid in oilseed plants |
| US7794701B2 (en) | 2007-04-16 | 2010-09-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Δ-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids |
| US20080274458A1 (en) * | 2007-05-01 | 2008-11-06 | Latham Gary J | Nucleic acid quantitation methods |
| US7816135B2 (en) | 2007-07-05 | 2010-10-19 | Becton, Dickinson And Company | Method of analyzing lymphocytes |
| EP2198050A1 (en) | 2007-09-14 | 2010-06-23 | Asuragen, INC. | Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof |
| WO2009067628A1 (en) | 2007-11-20 | 2009-05-28 | Applied Biosystems Inc. | Reversible di-nucleotide terminator sequencing |
| WO2009067632A1 (en) * | 2007-11-20 | 2009-05-28 | Applied Biosystems Inc. | Method of sequencing nucleic acids using elaborated nucleotide phosphorothiolate compounds |
| US8071562B2 (en) | 2007-12-01 | 2011-12-06 | Mirna Therapeutics, Inc. | MiR-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
| DE102007059752A1 (de) | 2007-12-10 | 2009-06-18 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Funktionalisierte, feste Polymernanopartikel enthaltend Epothilone |
| WO2009137807A2 (en) | 2008-05-08 | 2009-11-12 | Asuragen, Inc. | Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis |
| NZ590265A (en) | 2008-06-11 | 2012-11-30 | Lasergen Inc | Nucleotides and nucleosides and methods for their use in dna sequencing |
| CA2744716C (en) | 2008-12-18 | 2017-05-23 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Reducing byproduction of malonates in a fermentation process |
| US20100159452A1 (en) * | 2008-12-22 | 2010-06-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Method For Detecting a Target Nucleic Acid in a Sample |
| US8603792B2 (en) | 2009-03-27 | 2013-12-10 | Life Technologies Corporation | Conjugates of biomolecules to nanoparticles |
| EP2432796B1 (en) | 2009-05-21 | 2016-08-17 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Universal tags with non-natural nucleobases |
| EP2634266B1 (en) | 2009-05-22 | 2015-10-14 | Asuragen, INC. | miRNA biomarkers of prostate disease |
| US9155471B2 (en) | 2009-05-27 | 2015-10-13 | Lumicell, Inc'. | Methods and systems for spatially identifying abnormal cells |
| US8632975B2 (en) | 2009-06-05 | 2014-01-21 | Life Technologies Corporation | Nucleotide transient binding for sequencing methods |
| EP2775300A3 (en) | 2009-08-28 | 2015-04-01 | Asuragen, INC. | miRNA Biomarkers of Lung Disease |
| US9547007B2 (en) | 2009-09-22 | 2017-01-17 | The Trustees Of The University Of Pennslyvania | Methods and compositions for in-vivo enzyme capture |
| EP2507220B1 (en) | 2009-12-04 | 2016-10-05 | Biotium Inc. | Heterocycle-substituted xanthene dyes |
| GB0922377D0 (en) | 2009-12-22 | 2010-02-03 | Arab Gulf University The | Mutant LDL receptor |
| US9506057B2 (en) | 2010-03-26 | 2016-11-29 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Modifications for antisense compounds |
| EP2553123B1 (en) | 2010-03-26 | 2016-08-24 | Integrated DNA Technologies, Inc. | Methods for enhancing nucleic acid hybridization |
| US20120034603A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Tandem Diagnostics, Inc. | Ligation-based detection of genetic variants |
| US20130261003A1 (en) | 2010-08-06 | 2013-10-03 | Ariosa Diagnostics, In. | Ligation-based detection of genetic variants |
| CA2808000A1 (en) | 2010-08-26 | 2012-03-01 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Mutant delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids |
| DK2609203T3 (da) | 2010-08-26 | 2018-10-01 | Du Pont | Rekombinante mikrobielle værtsceller til større fremstilling af eicosapentaensyre |
| CN103080317B (zh) | 2010-08-26 | 2017-07-11 | 纳幕尔杜邦公司 | 突变型hpgg基序和hdash基序δ‑5去饱和酶以及它们在制备多不饱和脂肪酸中的用途 |
| JP6053684B2 (ja) | 2010-09-07 | 2016-12-27 | インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド | アンチセンス化合物の修飾 |
| JP6081366B2 (ja) | 2010-10-29 | 2017-02-15 | アスラジェン， インコーポレイテッド | リピート配列を分析するためのｍＰＣＲ法 |
| US9314304B2 (en) | 2010-12-08 | 2016-04-19 | Lumicell, Inc. | Methods and system for image guided cell ablation with microscopic resolution |
| WO2012103031A2 (en) | 2011-01-25 | 2012-08-02 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of genetic abnormalities |
| US10131947B2 (en) | 2011-01-25 | 2018-11-20 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies |
| US20120219950A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-08-30 | Arnold Oliphant | Assay systems for detection of aneuploidy and sex determination |
| EP2691518A1 (en) | 2011-03-31 | 2014-02-05 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Yarrowia diacylglycerol acyltransferase promoter regions for gene expression in yeast |
| US8906650B2 (en) | 2011-04-01 | 2014-12-09 | E I Du Pont De Nemours And Company | Yarrowia esterase/lipase promoter regions for gene expression in yeast |
| US20120247066A1 (en) | 2011-04-01 | 2012-10-04 | Ice House America, Llc | Ice bagging apparatus and methods |
| WO2012138613A1 (en) | 2011-04-05 | 2012-10-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Yarrowia n-alkane-hydroxylating cytochrome p450 promoter regions for gene expression in yeast |
| EP2702148A1 (en) | 2011-04-07 | 2014-03-05 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Yarrowia peroxisomal 2,4-dienoyl-coa reductase promoter regions for gene expression in yeast |
| WO2013039883A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-21 | Abbvie Biotherapeutics Inc. | Artificial nk cells and uses thereof |
| WO2013040251A2 (en) | 2011-09-13 | 2013-03-21 | Asurgen, Inc. | Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease |
| CN104024269B (zh) | 2011-09-13 | 2017-05-24 | 激光基因公司 | 5‑甲氧基，3’‑oh未阻断，可快速光切割的终止核苷酸以及用于核酸测序的方法 |
| US10501791B2 (en) | 2011-10-14 | 2019-12-10 | President And Fellows Of Harvard College | Sequencing by structure assembly |
| CN109082462B (zh) | 2012-05-21 | 2022-10-28 | 斯克利普斯研究所 | 样品制备方法 |
| WO2013184754A2 (en) | 2012-06-05 | 2013-12-12 | President And Fellows Of Harvard College | Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes |
| HUE036166T2 (hu) | 2012-07-20 | 2018-06-28 | Harvard College | Sejtalapú minõségellenõrzõ bioassay-k gyógyhatású élelmiszerekhez és gyógyszertermékekhez |
| US9476089B2 (en) | 2012-10-18 | 2016-10-25 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of making oligonucleotide probes |
| EP2929050A1 (en) | 2012-12-10 | 2015-10-14 | AdvanDx, Inc. | Use of probes for mass spectrometric identification of microorganisms or cells and associated conditions of interest |
| US9289502B2 (en) | 2013-03-08 | 2016-03-22 | Emerald Therapeutics, Inc. | Preparation of oligo conjugates |
| AU2014236561B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-08-16 | Lumicell, Inc. | Medical imaging device and methods of use |
| US9540685B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-01-10 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of identifying homologous genes using FISH |
| US9347095B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-05-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assays for mutation detection |
| CA2935789A1 (en) | 2014-01-05 | 2015-07-09 | Biomirna Holdings Ltd. | Lung cancer determinations using mirna |
| US10619210B2 (en) | 2014-02-07 | 2020-04-14 | The Johns Hopkins University | Predicting response to epigenetic drug therapy |
| WO2016028843A2 (en) | 2014-08-19 | 2016-02-25 | President And Fellows Of Harvard College | Rna-guided systems for probing and mapping of nucleic acids |
| CN107109474B (zh) | 2014-08-19 | 2021-03-19 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于核酸检测的方法和组合物 |
| CA2960821A1 (en) | 2014-09-09 | 2016-03-17 | Igenomx International Genomics Corporation | Methods and compositions for rapid nucleic acid library preparation |
| AU2015349870B2 (en) | 2014-11-21 | 2019-09-26 | Nanostring Technologies, Inc. | Enzyme- and amplification-free sequencing |
| WO2016094330A2 (en) | 2014-12-08 | 2016-06-16 | 20/20 Genesystems, Inc | Methods and machine learning systems for predicting the liklihood or risk of having cancer |
| WO2016177774A1 (en) | 2015-05-04 | 2016-11-10 | Academisch Medisch Centrum | Method of quantifying mirnas using normalization |
| WO2017015543A1 (en) | 2015-07-23 | 2017-01-26 | Asuragen, Inc. | Methods, compositions, kits, and uses for analysis of nucleic acids comprising repeating a/t-rich segments |
| US10696698B2 (en) | 2016-01-28 | 2020-06-30 | ACatechol, Inc. | Surface primer compositions and methods of use |
| AU2017268257B2 (en) | 2016-05-16 | 2023-09-07 | Nanostring Technologies, Inc. | Methods for detecting target nucleic acids in a sample |
| WO2018045162A1 (en) | 2016-09-01 | 2018-03-08 | Biogen Ma Inc. | Biomarkers predictive of primary progressive multiple sclerosis and uses thereof |
| KR102187291B1 (ko) | 2016-11-21 | 2020-12-07 | 나노스트링 테크놀로지스, 인크. | 화학적 조성물 및 이것을 사용하는 방법 |
| WO2018223053A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Affymetrix, Inc. | Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes |
| WO2018223055A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Affymetrix, Inc. | Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes |
| WO2019104070A1 (en) | 2017-11-21 | 2019-05-31 | Nanostring Technologies, Inc. | O-nitrobenzyl photocleavable bifunctional linker |
| JP2021523723A (ja) | 2018-05-14 | 2021-09-09 | ナノストリング テクノロジーズ，インコーポレイティド | 化学的組成物とそれを利用する方法 |
| JP2022514397A (ja) | 2018-12-20 | 2022-02-10 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 変更されたローダミン染料及びバイオアッセイにおけるそれらの使用 |
| SG11202106121SA (en) | 2018-12-20 | 2021-07-29 | Life Technologies Corp | Asymmetric rhodamine dye and use thereof in biological assays |
| BR102019006678A2 (pt) | 2019-04-02 | 2020-10-06 | Universidade Federal de Uberlândia | Processo de modificação da superfície de eletrodos para construção de biossensores eletroquímicos |
| EP3719144A1 (en) | 2019-04-05 | 2020-10-07 | Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario de la Paz (FIBHULP) | Mir-151a-3p as an universal endogenous control for exosome cargo normalization |
| US20220267857A1 (en) | 2019-07-19 | 2022-08-25 | Fundación Para La Investigación Biomédikca Del Hospital Universitario La Paz (Fibhulp) | Method for determining the response to treatment of a patient affected by non-small cell lung carcinoma (nsclc) |
| KR20220100589A (ko) | 2019-10-18 | 2022-07-15 | 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 | 임상 및 산업 규모의 온전한 조직 시퀀싱 |
| WO2021178893A2 (en) | 2020-03-06 | 2021-09-10 | Singular Genomics Systems, Inc. | Linked paired strand sequencing |
| EP4153606A2 (en) | 2020-07-13 | 2023-03-29 | Singular Genomics Systems, Inc. | Methods of sequencing complementary polynucleotides |
| KR20230056683A (ko) | 2020-07-23 | 2023-04-27 | 라이프 테크놀로지스 코포레이션 | 생물학적 분석에 사용하기 위한 에너지 전달 염료 접합체 |
| CA3186950A1 (en) | 2020-07-23 | 2022-01-27 | Scott Benson | Compositions, systems and methods for biological analysis involving energy transfer dye conjugates and analytes comprising the same |
| US20230366012A1 (en) | 2020-09-16 | 2023-11-16 | Nanostring Technologies, Inc. | Chemical compositions and methods of using the same |
| US20220228200A1 (en) | 2021-01-19 | 2022-07-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for internally controlled in situ assays |
| WO2022170212A1 (en) | 2021-02-08 | 2022-08-11 | Singular Genomics Systems, Inc. | Methods and compositions for sequencing complementary polynucleotides |
| US11884977B2 (en) | 2021-03-12 | 2024-01-30 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nanoarrays and methods of use thereof |
| WO2022192671A1 (en) | 2021-03-12 | 2022-09-15 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nanoarrays and methods of use thereof |
| US11578320B2 (en) | 2021-04-27 | 2023-02-14 | Singular Genomics Systems, Inc. | High density sequencing and multiplexed priming |
| WO2022256324A1 (en) | 2021-06-01 | 2022-12-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for analyte detection and probe resolution |
| EP4347880A1 (en) | 2021-06-02 | 2024-04-10 | 10X Genomics, Inc. | Sample analysis using asymmetric circularizable probes |
| US20230026886A1 (en) | 2021-07-13 | 2023-01-26 | 10X Genomics, Inc. | Methods for preparing polymerized matrix with controllable thickness |
| WO2023015192A1 (en) | 2021-08-03 | 2023-02-09 | 10X Genomics, Inc. | Nucleic acid concatemers and methods for stabilizing and/or compacting the same |
| EP4326898A1 (en) | 2021-08-16 | 2024-02-28 | 10X Genomics, Inc. | Probes comprising a split barcode region and methods of use |
| US20230242974A1 (en) | 2021-12-27 | 2023-08-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for rolling circle amplification |
| US20230279475A1 (en) | 2022-01-21 | 2023-09-07 | 10X Genomics, Inc. | Multiple readout signals for analyzing a sample |
| WO2023164570A1 (en) | 2022-02-23 | 2023-08-31 | Insitro, Inc. | Pooled optical screening and transcriptional measurements of cells comprising barcoded genetic perturbations |
| WO2023172665A2 (en) | 2022-03-10 | 2023-09-14 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nucleic acid delivery scaffolds |
| WO2023192616A1 (en) | 2022-04-01 | 2023-10-05 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for targeted masking of autofluorescence |
| WO2023215612A1 (en) | 2022-05-06 | 2023-11-09 | 10X Genomics, Inc. | Analysis of antigen and antigen receptor interactions |
| US20240026427A1 (en) | 2022-05-06 | 2024-01-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for in situ analysis of v(d)j sequences |
| WO2023220300A1 (en) | 2022-05-11 | 2023-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for in situ sequencing |
| US20240035071A1 (en) | 2022-06-17 | 2024-02-01 | 10X Genomics, Inc. | Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis |
| WO2024036304A1 (en) | 2022-08-12 | 2024-02-15 | 10X Genomics, Inc. | Puma1 polymerases and uses thereof |
| US20240084373A1 (en) | 2022-08-16 | 2024-03-14 | 10X Genomics, Inc. | Ap50 polymerases and uses thereof |
| WO2024081869A1 (en) | 2022-10-14 | 2024-04-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for analysis of biological samples |
| WO2024102736A1 (en) | 2022-11-08 | 2024-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Immobilization methods and compositions for in situ detection |
| WO2024107887A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for assessing performance of in situ assays |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4855225A (en) * | 1986-02-07 | 1989-08-08 | Applied Biosystems, Inc. | Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides |
| CA1340806C (en) * | 1986-07-02 | 1999-11-02 | James Merrill Prober | Method, system and reagents for dna sequencing |
| JP2527340B2 (ja) * | 1986-12-15 | 1996-08-21 | アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド | ロ―ダミン染料の５−及び６−スクシニミジルカルボキシレ―ト異性体 |
| US4962037A (en) * | 1987-10-07 | 1990-10-09 | United States Of America | Method for rapid base sequencing in DNA and RNA |
| US4965349A (en) * | 1987-12-24 | 1990-10-23 | Applied Biosystems, Inc. | Method of synthesizing oligonucleotides labeled with ammonia-labile groups on solid phase supports |
| US5051361A (en) * | 1988-10-19 | 1991-09-24 | Sigma Chemical Company | AZT immunoassays, derivatives, conjugates and antibodies |
| DE3841565C2 (de) * | 1988-12-09 | 1998-07-09 | Europ Lab Molekularbiolog | Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren |
-
1989
- 1989-09-29 US US07/415,050 patent/US5366860A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-09-27 AT AT90914874T patent/ATE131210T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 WO PCT/US1990/005565 patent/WO1991005060A2/en active IP Right Grant
- 1990-09-27 JP JP2513838A patent/JP2649102B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 DE DE69024061T patent/DE69024061T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 EP EP90914874A patent/EP0496749B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．ＯＲＧ．ＣＨＥＭ．，５４（１４）（１９８９）Ｐ．３４２０−３４２２ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ，９３：２４９４１１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05502371A (ja) | 1993-04-28 |
| ATE131210T1 (de) | 1995-12-15 |
| WO1991005060A3 (en) | 1991-05-16 |
| EP0496749A1 (en) | 1992-08-05 |
| DE69024061D1 (de) | 1996-01-18 |
| EP0496749B1 (en) | 1995-12-06 |
| US5366860A (en) | 1994-11-22 |
| EP0496749A4 (en) | 1993-06-16 |
| WO1991005060A2 (en) | 1991-04-18 |
| DE69024061T2 (de) | 1996-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2649102B2 (ja) | 核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料 | |
| US6358684B1 (en) | UV excitable fluorescent energy transfer dyes | |
| JP4554224B2 (ja) | 分子プローブとしての４，７−ジクロロフルオレセイン染料 | |
| JP4140976B2 (ja) | ４，７―ジクロロローダミン色素 | |
| US5863727A (en) | Energy transfer dyes with enhanced fluorescence | |
| US5187085A (en) | Nucleic acid sequence analysis with nucleoside-5'-o-(1-thiotriphosphates) | |
| JP3592173B2 (ja) | シアニンエネルギー転移色素 | |
| US6218124B1 (en) | Method for detecting oligonucleotides using UV light source |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090516 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100516 Year of fee payment: 13 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100516 Year of fee payment: 13 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100516 Year of fee payment: 13 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100516 Year of fee payment: 13 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110516 Year of fee payment: 14 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110516 Year of fee payment: 14 |