JP2006509996A - サンプル生体材料の1種以上のサンプル成分を分離及び単離するための方法、システム及び装置 - Google Patents
サンプル生体材料の1種以上のサンプル成分を分離及び単離するための方法、システム及び装置 Download PDFInfo
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- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
Abstract
Description
本願は米国仮特許出願第60/369,371号(出願日2002年4月2日)の優先権を主張し、その開示内容全体を全目的で参考資料として本明細書に組込む。
図1は簡易微細流路デバイスの一部の積層構造の模式図であり、夫々上面図(パネルA)、側面図(パネルB)、及び斜視図(パネルC)である。
本発明は一般には、例えば分離マトリックスを利用する分離機能と、その後に後続処理又は分析用として目的サンプル材料の選択成分又はフラクションを分岐又は抽出する単離機能を含む分析操作を同一デバイスで実施するための改良方法、デバイス及びシステムに関する。特に、これらの方法及びシステムは核酸フラグメント、蛋白質フラグメント等の分離と単離に特に適している。
II.定義
III.システム
III.電気泳動分離と分離された所望成分の単離
V.実施例
本発明の原理を以下の実施例により例証する。
図2の微細流路デバイスがオフチップクローニング法で後続使用した少量のDNA PCRフラグメントを分離し、正確に単離できることを例証し、本発明の方法及びデバイスを使用して十分な量の単離PCRフラグメントを収集し、クローニング反応で有効に使用できることを確かめるために以下の実験を実施した。
750bp DNA産物の作製
PCR産物のサンプルクローニング操作
クローン分析
結果
PCR産物定量
微細流路デバイスから分取した750bp PCR産物のTOPOクローニング
系列希釈750bp PCR産物のTOPOクローニング
Claims (92)
- サンプル材料を複数の分離成分に分離し、前記分離成分の1種以上を単離する方法であって、
分離マトリックスを内部に配置した分離導管を含む微細流路基板を配置する段階と;
分離導管で前記1種以上のサンプル成分を検出するために分離導管の長手方向の第1の位置に前記分離導管と感覚伝達する検出器を配置する段階と;
前記第1の位置の下流の第2の位置で前記分離導管と液体連通するサンプル成分収集導管を前記基板に配置する段階と;
前記検出器から受信した情報に基づいて前記分離導管から前記サンプル成分収集導管へのサンプル成分の移動を制御するために前記検出器と液体管理システムに作動的に結合したプロセッサーを配置する段階と;
第1のサンプル材料を分離導管に通して輸送し、第1のサンプル材料を複数のサンプル成分に分離する段階と;
前記複数のサンプル成分を前記第1の位置で前記検出器により検出する段階と;
プロセッサーから液体管理システムへの命令に応答して前記複数のサンプル成分の選択された1種以上を前記分離導管からサンプル成分収集導管に移動させる段階を含む前記方法。 - 更にローディング端と廃棄物端をもつサンプルローディング導管を含み、ローディング端をサンプル材料のソースと接触させ、第1の差圧をサンプルローディング導管に加えてサンプル材料をサンプルローディング導管のローディング端内に移動させ、サンプルローディング導管の廃棄物端に向かって移動させる段階を更に含む請求項1に記載の方法。
- 第1の差圧をサンプルローディング導管に供給するためにサンプルローディング導管の廃棄物端に負圧を加える請求項2に記載の方法。
- サンプルローディング導管と分離導管が第1の液体接点で液体連通しており、サンプルローディング導管内のサンプル材料の一部を第1の液体接点に通して分離導管内に移動させる段階を更に含む請求項2に記載の方法。
- サンプル材料が核酸、蛋白質、又は炭水化物の1種を含む請求項4に記載の方法。
- サンプルローディング導管から液体接点を通って分離導管内にサンプル材料を移動させる段階が液体接点に電圧差を印加してサンプル材料をサンプルローディング導管から分離導管内に動電的に移動させることを含む請求項4に記載の方法。
- サンプル材料を分離する段階が分離導管に電圧差を印加してサンプル材料を1種以上のサンプル成分に電気泳動分離することを含む請求項1に記載の方法。
- サンプル成分収集導管が少なくとも第1の物質と液体連通しており、方法が所定量の第1の物質をサンプル成分収集導管内に輸送して1種以上のサンプル成分と混合する段階を更に含む請求項1に記載の方法。
- 第1の物質がプラスミド、希釈剤、洗浄剤、蛋白質アフィニティーラベル、又はライゲーション剤から選択される請求項8に記載の方法。
- サンプル成分収集導管が少なくとも第1のライゲーション酵素のソースと液体連通しており、方法が所定量の第1のライゲーション酵素をサンプル成分収集導管内に輸送して1種以上のサンプル成分と混合する段階を更に含む請求項1に記載の方法。
- サンプル成分収集導管で2種以上のサンプル成分のライゲーション反応を少なくとも1回実施する段階を更に含む請求項10に記載の方法。
- サンプル成分収集導管で少なくとも1種のサンプル成分とプラスミドのライゲーション反応を少なくとも1回実施する段階を更に含む請求項10に記載の方法。
- サンプル成分収集導管がATPを含有する少なくとも第1の緩衝液と液体連通しており、方法が所定量の少なくとも第1の緩衝液をサンプル成分収集導管内に輸送して1種以上のサンプル成分と混合する段階を更に含む請求項10に記載の方法。
- サンプル成分収集導管が少なくとも1種のプラスミドを含有する溶液のソースと液体連通しており、方法が成分収集導管の少なくとも一部で前記1種以上のサンプル成分を前記プラスミドとライゲーションする段階を更に含む請求項10に記載の方法。
- サンプル成分収集導管が少なくとも1個の成分収集ウェルと液体連通しており、方法が前記1種以上のサンプル成分を前記成分収集導管から前記少なくとも1個の収集ウェルに輸送する段階を更に含む請求項1に記載の方法。
- 1種以上のサンプル成分を少なくとも1個の収集ウェルで洗浄用緩衝液に暴露する段階を更に含む請求項15に記載の方法。
- 1種以上の成分を少なくとも1個の収集ウェルでボルテックスして1種以上の成分を均質化し、少なくとも1個の収集ウェルから取出し易くする段階を更に含む請求項16に記載の方法。
- 少なくとも1個の収集ウェルから取出した後に1種以上のサンプル成分材料に少なくとも1種の分析操作を実施する段階を更に含む請求項17に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の分析操作を実施する段階が1種以上のサンプル成分の質量分析による分析を実施することを含む請求項18に記載の方法。
- 前記プロセッサーが検出器を通る分離成分を表す検出器からの信号を受信し、分離導管における分離成分の滞留時間を測定し、分離成分の滞留時間をサンプル材料の既知サイズの標準参照の成分の滞留時間と比較することにより分離成分のサイズを決定するのに適したプログラミングを含むコンピューターを含む請求項1に記載の方法。
- 選択された1種以上のサンプル成分の決定されたサイズに基づいて分離された目的成分の選択された1種以上を分離導管からサンプル成分収集導管内に移動させるように液体管理システムに指令するようにコンピューターに命令を入力する段階を更に含む請求項20に記載の方法。
- 既知サイズの標準参照が標準サイジングラダーを分離することにより得られる請求項21に記載の方法。
- 第1のサンプル材料を分離導管に通して輸送して第1のサンプル材料を複数の第1のサンプル成分に分離する前に標準サイジングラダーの分離を実施する請求項22に記載の方法。
- 前記輸送段階の前に参照標準サイジングラダーをサンプル材料と混合する請求項23に記載の方法。
- 前記第1のサンプル材料と同時に既知サイズの2種以上のフランキングサイズマーカーを分離導管に通して輸送する段階を更に含む請求項24に記載の方法。
- 前記フランキングサイズマーカーと分離成分を検出器により検出する段階と、フランキングマーカーの既知サイズをサイジングラダーと比較して分離成分の正確なサイジング情報を獲得する段階を更に含む請求項25に記載の方法。
- 前記複数のサンプル成分の前記選択された1種以上を前記分離導管からサンプル成分収集導管内に移動させる前に第1のサンプル材料を分離導管に通して少なくとも2回輸送する段階を更に含む請求項26に記載の方法。
- 1種以上のサンプル成分をサンプル材料ソースから単離するための微細流路デバイスであって、
少なくとも1個の表面をもつ基板と;
前記基板の前記表面に形成された少なくとも第1及び第2のチャネル(第1のチャネルの長手方向の第1の位置で相互に交差し、前記第1及び第2のチャネル少なくとも一方は約0.1〜約500μmの範囲の少なくとも1個の横断面寸法をもつ)と;
分離マトリックスの存在下に第1のチャネルでサンプル材料を1種以上のサンプル成分に分離するのを制御するために少なくとも前記第1のチャネルに作動的に結合したサンプル材料分離システムと;
前記1種以上のサンプル成分の検出が行われるように前記第1の位置の上流で前記第1のチャネルの長手方向の第2の位置に配置された検出ゾーンと;
前記検出ゾーンで受信した情報に基づいて前記第1のチャネルから前記第2のチャネルへの選択された1種以上のサンプル成分の移動を制御するために少なくとも前記第2のチャネルに作動的に結合した液体管理システムを含む前記デバイス。 - 更に前記第2のチャネルと液体結合した少なくとも1個の成分収集リザーバーを基板に含む請求項28に記載のデバイス。
- 更に前記第2のチャネルと各々液体結合した2個以上の成分収集リザーバーを基板に含む請求項28に記載のデバイス。
- 更に前記第2のチャネルと各々液体結合した少なくとも5個以上の成分収集リザーバーを基板に含む請求項28に記載のデバイス。
- 更に前記第2のチャネルと液体結合した少なくとも第1の物質のソースを含む請求項28に記載のデバイス。
- 前記第1の物質がライゲーション酵素、希釈剤、緩衝液、又は標識剤の1種から選択される請求項32に記載のデバイス。
- 更に前記第2のチャネルと液体結合した少なくとも第1のライゲーション剤のソースを含む請求項28に記載のデバイス。
- 前記ライゲーション剤がライゲーション酵素を含む請求項34に記載のデバイス。
- 前記ライゲーション剤がATPを含有する緩衝液を含む請求項34に記載のデバイス。
- 前記ライゲーション剤がT4 DNAリガーゼを含む請求項34に記載のデバイス。
- 前記ライゲーション剤がトポイソメラーゼを含む請求項34に記載のデバイス。
- 更に前記サンプル成分の1種以上を少なくとも1種のプラスミドとライゲーションするために前記第2のチャネルと液体結合した前記プラスミドのソースを含む請求項34に記載のデバイス。
- 更に前記少なくとも1個の成分収集リザーバーの内側に配置されたリンス用緩衝液を含む請求項29に記載のデバイス。
- 前記サンプル分離システムが前記第1のチャネルと液体結合した少なくとも第1及び第2の液体リザーバーと、前記液体リザーバーの各々と電気結合した少なくとも1個の電極と、前記第1のチャネル内の前記分離マトリックスでの前記1種以上のサンプル成分の電気泳動分離を制御できるように前記電極に電圧を調節可能に印加するための制御システムを含む請求項28に記載のデバイス。
- 前記液体管理システムが前記第2のチャネルと液体結合した少なくとも第1及び第2の液体リザーバーと、前記液体リザーバーの各々と電気結合した少なくとも1個の電極と、前記第2のチャネルにおける前記1種以上のサンプル成分の動電的移動を制御できるように前記電極に電圧を調節可能に印加するための制御システムを含む請求項28に記載のデバイス。
- 前記液体管理システムが前記第2のチャネルと液体結合した少なくとも第1及び第2の液体リザーバーと、前記リザーバーの少なくとも1個と結合した真空ソースと、前記第2のチャネルにおける前記1種以上のサンプル成分の移動を制御できるように前記少なくとも1個のリザーバーに真空を調節可能に加えるための制御システムを含む請求項28に記載のデバイス。
- 前記液体管理システムが前記第2のチャネルと液体結合した少なくとも第1及び第2の液体リザーバーと、前記リザーバーの少なくとも1個と結合した圧力ソースと、前記第2のチャネルにおける前記1種以上のサンプル成分の移動を制御できるように前記少なくとも1個のリザーバーに圧力を調節可能に加えるための制御システムを含む請求項28に記載のデバイス。
- 前記サンプル材料が蛋白質サンプルを含む請求項28に記載のデバイス。
- 前記サンプル材料が核酸サンプルを含む請求項28に記載のデバイス。
- サンプル材料を複数のサンプル成分に分離した後に前記サンプル材料の1種以上のサンプル成分を単離するためのシステムであって、
少なくとも1個の表面をもつ微細流路基板と;
前記表面に形成されており、分離マトリックスを内部に配置した分離導管と;
分離導管で前記1種以上のサンプル成分を検出するために分離導管の長手方向の第1の位置で前記分離導管と感覚伝達する検出器と;
前記表面に形成されており、前記第1の位置の下流の第2の位置で前記分離導管と液体連通するサンプル成分収集導管と;
少なくとも前記サンプル成分収集導管内の前記サンプル成分の少なくとも1種以上の移動を制御するための液体管理システムと;
前記検出器から受信した情報に基づいて前記分離導管から前記サンプル成分収集導管への1種以上のサンプル成分の移動を指令するように前記液体管理システムに命令するために前記検出器と前記液体管理システムに作動的に結合したプロセッサーを含む前記システム。 - 更に前記サンプル成分収集導管と液体結合した少なくとも1個の成分収集リザーバーを基板に含む請求項47に記載のシステム。
- 更に前記サンプル成分収集導管と各々液体結合した2個以上の成分収集リザーバーを基板に含む請求項47に記載のシステム。
- 更に前記サンプル成分収集導管と各々液体結合した少なくとも5個以上の成分収集リザーバーを基板に含む請求項47に記載のシステム。
- 更に前記サンプル成分収集導管と液体結合した少なくとも第1の物質のソースを含む請求項47に記載のシステム。
- 前記第1の物質がライゲーション酵素、希釈剤、緩衝液、又は標識剤の1種から選択される請求項51に記載のシステム。
- 更に前記サンプル成分収集導管と液体結合した少なくとも第1のライゲーション剤のソースを含む請求項47に記載のシステム。
- 前記ライゲーション剤がライゲーション酵素を含む請求項53に記載のシステム。
- 前記ライゲーション剤がATPを含有する緩衝液を含む請求項53に記載のシステム。
- 前記ライゲーション剤がT4 DNAリガーゼを含む請求項53に記載のシステム。
- 前記ライゲーション剤がトポイソメラーゼを含む請求項53に記載のシステム。
- 更に前記サンプル成分の1種以上を少なくとも1種のプラスミドとライゲーションするために前記サンプル成分収集導管と液体結合した前記プラスミドのソースを含む請求項53に記載のシステム。
- 更に前記少なくとも1個の成分収集リザーバーの内側に配置されたリンス用緩衝液を含む請求項48に記載のシステム。
- 更に前記分離導管と作動的に結合したサンプル分離システムを含み、前記サンプル分離システムが前記分離導管と液体結合した少なくとも第1及び第2の液体リザーバーと、前記液体リザーバーの各々と電気結合した少なくとも1個の電極と、前記分離導管内の前記分離マトリックスでの前記1種以上のサンプル成分の電気泳動分離を制御できるように前記電極に電圧を調節可能に印加するための制御システムを含む請求項47に記載のシステム。
- 前記液体管理システムが前記サンプル成分収集導管と液体結合した少なくとも第1及び第2の液体リザーバーと、前記液体リザーバーの各々と電気結合した少なくとも1個の電極と、前記サンプル成分収集導管における前記1種以上のサンプル成分の動電的移動を制御できるように前記電極に電圧を調節可能に印加するための制御システムを含む請求項47に記載のシステム。
- 前記液体管理システムが前記サンプル成分収集導管と液体結合した少なくとも第1及び第2の液体リザーバーと、前記リザーバーの少なくとも1個と結合した真空ソースと、前記サンプル成分収集導管における前記1種以上のサンプル成分の移動を制御できるように前記少なくとも1個のリザーバーに真空を調節可能に加えるための制御システムを含む請求項47に記載のシステム。
- 前記液体管理システムが前記サンプル成分収集導管と液体結合した少なくとも第1及び第2の液体リザーバーと、前記リザーバーの少なくとも1個と結合した圧力ソースと、前記サンプル成分収集導管における前記1種以上のサンプル成分の移動を制御できるように前記少なくとも1個のリザーバーに圧力を調節可能に加えるための制御システムを含む請求項47に記載のシステム。
- 前記サンプル材料が蛋白質サンプルを含む請求項47に記載のシステム。
- 前記サンプル材料が核酸サンプルを含む請求項47に記載のシステム。
- プロセッサーがコンピューターを含む請求項47に記載のシステム。
- コンピューターが検出器を通る分離成分を表す検出器からの信号を受信し、分離導管における分離成分の滞留時間を測定し、分離成分の滞留時間をサンプル材料の既知サイズの標準参照の成分の滞留時間と比較することにより分離成分のサイズを決定するのに適したプログラミングを含む請求項66に記載のシステム。
- コンピューターが選択された1種以上のサンプル成分の決定されたサイズに基づいて分離された目的成分の選択された1種以上を分離導管からサンプル成分収集導管に移動させるように液体管理システムを制御するようにプログラム可能である請求項67に記載のシステム。
- 更に1組の分子量標準ポリペプチドを含む請求項47に記載のシステム。
- 更に1組のDNA参照サイジングラダーを含む請求項47に記載のシステム。
- サンプル材料を複数の分離成分に分離し、微細流路デバイスで前記分離成分の1種以上を単離する方法であって、デバイス内に配置された分離導管でその内部に配置された分離マトリックスの存在下にサンプル成分を分離する段階と、分離導管の検出ゾーンでサンプル成分を検出する段階と、前記検出ゾーンで受信した情報に基づいてサンプル成分の選択された1種以上をデバイスのサンプル成分収集導管に輸送する段階を含む前記方法。
- 前記サンプル成分収集導管が前記検出ゾーンの下流で前記分離導管と交差する請求項71に記載の方法。
- サンプル成分収集導管でライゲーション反応を実施する段階を更に含む請求項71に記載の方法。
- 前記サンプル成分収集導管内で前記サンプル成分の1種以上をプラスミドとライゲーションする段階を更に含む請求項71に記載の方法。
- サンプル成分収集導管で前記サンプル成分の1種以上にクローニング操作を実施する段階を更に含む請求項71に記載の方法。
- 前記サンプル成分収集導管から洗浄用緩衝液を収容するデバイスの少なくとも1個の成分収集リザーバーに前記1種以上のサンプル成分を輸送する段階を更に含む請求項71に記載の方法。
- 前記選択された1種以上のサンプル成分を前記サンプル成分収集導管に輸送する段階が前記1種以上の成分材料を前記収集導管内に動電的に移動させることを含む請求項71に記載の方法。
- 前記選択された1種以上のサンプル成分を前記サンプル成分収集導管に輸送する段階が圧力駆動力を使用して前記1種以上の成分材料を前記収集導管内に移動させることを含む請求項71に記載の方法。
- 前記サンプル成分収集導管内の前記1種以上のサンプル成分をMALDIマトリックス材料と混合して第1の混合物を形成する段階を更に含む請求項71に記載の方法。
- 第1の混合物を前記サンプル成分収集導管からデバイス少なくとも1個の成分収集リザーバーに輸送する段階を更に含む請求項79に記載の方法。
- 質量分析操作に備えて第1の混合物をデバイスの少なくとも1個の成分リザーバーから取出す段階を更に含む請求項80に記載の方法。
- 前記1種以上のサンプル成分が1種以上の蛋白質を含む請求項71に記載の方法。
- 前記1種以上のサンプル成分が1種以上の核酸を含む請求項71に記載の方法。
- 前記輸送段階の前に、分離導管における分離成分の滞留時間を測定する段階と、分離成分の滞留時間をサンプル材料の既知サイズの標準参照の成分の滞留時間と比較することにより分離成分のサイズを計算する段階を更に含む請求項71に記載の方法。
- 前記輸送段階が選択された1種以上の分離成分の計算されたサイズに基づいて前記選択された1種以上分離成分をサンプル収集導管内に輸送することを含む請求項84に記載の方法。
- サンプル材料を複数の分離成分に分離し、前記分離成分の1種以上を単離する方法であって、
その内部に分離マトリックスを配置した分離導管を含む微細流路基板を配置する段階と;
分離導管で前記1種以上のサンプル成分を検出するために分離導管の長手方向の第1の位置に前記分離導管と感覚伝達する検出器を配置する段階と;
前記第1の位置の下流の第2の位置で前記分離導管と液体連通するサンプル成分収集導管を前記基板に配置する段階と;
前記検出器と液体管理システムに作動的に結合しており、検出器を通る分離成分を表す検出器からの信号を受信し、分離導管における分離成分の滞留時間を測定し、分離成分の滞留時間をサンプル材料の既知サイズの標準参照の成分の滞留時間と比較することにより分離成分のサイズを決定するのに適したプログラミングを含むユーザープラグラマブルプロセッサーを配置する段階と;
選択された1種以上のサンプル成分の決定されたサイズに基づいて分離された目的成分の選択された1種以上を分離導管からサンプル成分収集導管内に移動させるように液体管理システムに指令するようにプロセッサーに命令を入力する段階と;
第1のサンプル材料を分離導管に通して輸送し、第1のサンプル材料を複数のサンプル成分に分離する段階と;
前記複数のサンプル成分を前記第1の位置で前記検出器により検出する段階と;
プロセッサーから液体管理システムへの前記命令に応答して前記複数の第1のサンプル成分の前記選択された1種以上を前記分離導管からサンプル成分収集導管内に移動させる段階を含む前記方法。 - 既知サイズの標準参照が標準サイジングラダーを分離することにより得られる請求項86に記載の方法。
- 第1のサンプル材料を分離導管に通して輸送して第1のサンプル材料を複数の第1のサンプル成分に分離する前に標準サイジングラダーの分離を実施する請求項87に記載の方法。
- 前記輸送段階の前に参照標準サイジングラダーをサンプル材料と混合する請求項87に記載の方法。
- 前記第1のサンプル材料と同時に既知サイズの2種以上のフランキングサイズマーカーを分離導管に通して輸送する段階を更に含む請求項86に記載の方法。
- 前記フランキングサイズマーカーと分離成分を検出器により検出する段階と、フランキングマーカーの既知サイズをサイジングラダーと比較して分離成分の正確なサイジング情報を獲得する段階を更に含む請求項90に記載の方法。
- 前記複数のサンプル成分の前記選択された1種以上を前記分離導管からサンプル成分収集導管内に移動させる前に第1のサンプル材料を分離導管に通して少なくとも2回輸送する段階を更に含む請求項91に記載の方法。
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