CN104471385B

CN104471385B - 用于对反应产物实时采样的方法

Info

Publication number: CN104471385B
Application number: CN201380020733.5A
Authority: CN
Inventors: 刘宇; 李琛
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 2012-04-19
Filing date: 2013-04-18
Publication date: 2017-05-03
Anticipated expiration: 2033-04-18
Also published as: EP2839275A1; US20150075983A1; KR102032123B1; CN104471385A; JP6168140B2; KR20150013178A; US9910012B2; JP2015514994A; WO2013158898A1

Abstract

用于分析来自微流体器件中的检定腔室(11)的反应产物的方法，该方法包括以下步骤：(I)将样品从腔室(11)朝向分离通道(4)移动到加载通道(12)中，和(III)通过分离通道(4)中的电泳分离，分析在加载通道(12)和分离通道(4)的交叉点(16)处存在的样品。在该分离期间，执行将加载通道中的接下来的样品朝向预加载通道(13)移动的步骤(II)。

Description

用于对反应产物实时采样的方法

技术领域

本发明涉及被构造成在反应腔室中执行反应、将反应腔室内容物的样品移动到分离通道、并且分析分离通道中的样品的微流体器件和操作这种器件的方法。

背景技术

用于进行化学和生物分析物的分析的微流体器件继续受到高度关注。术语“微流体”或“微尺度”器件通常指的是用于操纵流体的、包括微流体元件(例如，通道和/或腔室)网络的器件，其中，至少一个元件具有在从大约0.5μm至大约500μm的范围中的至少一个尺寸。例如，通道可以具有在该范围内的深度/或宽度，同时腔室可以至少具有在该范围内的深度。

如现有技术中已知的，微流体器件使得能够进行小规模反应，它们提供许多益处，诸如减少试剂使用量、减小样品大小以及快速操作。另外，在单个器件内集成若干个功能是可能的，其中，样品可以从一个器件元件运送到另一个，以便进行后续处理、反应或分析。由于操作者或机器人站的样品处理减少、空间要求较小以及甚至可以远程或野外使用，所以集成反过来使得能够进一步提高样品吞吐量。

而且，许多样品槽(sample well)、反应腔室和/或分析区域可以设置在单个器件上，该单个器件原理上允许并行多个分析。然而，如果处理只能依次进行，也可能出现瓶颈。例如，因为在检测器系统(例如，激光或光检测器)或分析通道被共享的情况下一个样品必须等待先前样品的分析完成，所以样品吞吐量经常被分析步骤限制。微流体通道和槽的微流体器件布局也是问题，并且器件的几何可以用于通过缩短分析物从一个微流体元件到另一个的运送时间来提高吞吐量。

Dubrow等人在美国专利5,976,336中公开了基于通道几何来提高器件吞吐量的示例。Dubrow等人公开了用于对设置在多个样品池中的不同样品的电泳分离分析的器件。这些器件具有单个分析通道，但是样品池位于分析通道的各侧，以在最小化样品必须行进以达到分析通道的距离的同时，最大化池的数量。而且，虽然从位于分离通道的一侧的池引入的一个样品通过电泳分离而分析，但是来自通道的相反侧的池的样品可以被预加载，即，达到加载通道中的靠近分离通道的位置。在完成第一样品的分析时，预放置在加载通道中的样品可以完成其沿着加载通道从其样品池到与分析通道的交叉点的运送，然后被注入到分析通道中以便进行分析。

包括除了仅样品池之外的功能和微流体元件的器件对高吞吐量和/或缩短的分析时间呈现出不同的挑战和瓶颈。具体地，包括反应腔室的微流体器件呈现出使器件内的样品移动与反应的发展进行协调的挑战。例如，对于热循环反应，由热循环造成的对样品和/或运送特性的温度诱致变化必须被考虑，并且会限制何时可以移除样品以便分析或其他用途。

很好地适于微流体器件的一个应用是执行核酸扩增反应并分析扩增产物的集成器件。例如，将用于扩增反应(诸如PCR)的腔室与用于毛细管电泳(CE)检测的分离通道组合，提供了一种用于实时跟踪扩增的进展并对原始样品中的靶标(target)量进行量化的方法。

这种集成器件的示例在现有技术中是已知的，包括PCR-CE器件。Bousse和Zhang在转让给相同受让人的美国专利8,394,324中公开了一个这样的器件，此处以引证方式并入上述申请的全部内容。器件中的反应腔室中的溶液被热循环，以生成PCR扩增产物，并且在特定循环之后，反应产物的样品被移除并针对在扩增反应中生成的产物量来分析。然而，通常地，PCR-CE集成器件在进行CE分离的同时，或至少直到样品从该腔室运送到分离通道为止，暂停热循环处理。该暂停延长了完成分析所需的总时间。因此，仍然需要能够更有效地协调样品移动并在较少时间内完成分析，以增加样品吞吐量并降低操作成本的器件和方法。

发明内容

提供了一种用于样品的快速分析的集成微流体器件以及用于操作器件的方法。具体地，该器件被构造成用于在腔室中执行反应、将反应产物的一部分时常从该腔室移动并且分析产物。该器件可以通常称作反应/分析微流体器件。使用所公开的方法，与现有技术中已知的方法相比，因为器件结构使得能够同时执行特定处理而不是依次执行并且方法预期同时执行特定处理而不是依次执行，所以明显缩短完成反应和所生成的产物的周期性分析的时间。还公开了将用于执行反应和检测处理的器件和辅助设备组合的系统。

在一个实施方式中，提供了一种微流体器件，该器件包括反应腔室；加载通道，该加载通道从所述反应腔室通向加载废物槽；分离通道，该分离通道从分离头槽通向分离废物槽并且与所述加载通道交叉；以及预加载通道，该预加载通道在所述反应腔室与所述加载通道/分离通道交叉点之间的位置从所述加载通道通向预加载废物槽。

器件可以包括超过一个的反应腔室，并且附加腔室可以经由相同的加载通道或不同的加载通道连接到相同的分离通道。或者，附加反应腔室可以连接到不同的分离通道。可以根据应用、期望的测试吞吐量、制造能力、将用作包括器件的系统的一部分的诸如温度控制器、检测装载、电源等的周边设备来调整器件的容量(反应腔室和分离通道的数量)和布局。

在另一个实施方式中，微流体器件还包括侧通道，该侧通道从加载通道通向侧头槽，其中，加载通道/侧通道接合点在反应腔室与加载通道/预加载通道接合点之间。

在另一个实施方式中，微流体器件还包括富集染料通道，该富集染料通道从分离通道通向富集染料槽，其中，分离通道/富集染料通道接合点在分离通道中检测点的下游。

在进一步的实施方式中，微流体器件还包括电极，这些电极位于腔室或与腔室的内容物电化学以及流体连通的槽(加载废物槽、预加载废物槽、分离头槽、分离废物槽，以及富集染料槽和侧头槽(如果存在))中。优选地，电极被独立控制。凭借对施加于电极的电压(电势)或流过电极的电流的独立控制，样品成分可以电动力地在器件中的特定位置之间移动。电极位于使得它们可以与各个腔室或槽中的溶液(即，腔室中的溶液，或加载废物槽中的溶液等)电接触。

反应腔室连接到至少两个接入通道和至少一个加载通道。各个接入通道从腔室通向分离接入槽。流体(例如，反应溶液)利用接入通道添加于反应腔室。通常，流体被引入到第一接入槽中，经由第一接入通道移动到腔室中，并最终填充腔室。移动的空气通过第二接入通道和第二接入槽离开。因此，至少两个接入通道连接到该腔室，使得流体可以从一个接入通道流到该腔室中、填充该腔室并通过第二接入通道离开。在一个实施方式中，接入通道连接到该腔室的相对侧的腔室。

如上所述，反应腔室还连接到加载通道。加载通道是分析通道网络的一部分。分析通道网络包括加载通道、预加载通道和分离通道，和如果存在则侧通道。

分析通道网络中的通道的尺寸被设计为使得能够通过器件协调少量材料的移动。设计基于若干个考虑因素。一个考虑因素涉及与反应腔室有关的分析通道网络的尺寸和/或流阻。如美国专利8,394,324中描述的，该通道网络可以被构造成具有的内部容积小于反应腔室的内部容积，以便仅需要移除反应腔室中的小部分成分，以便在通道网络中进行分析或其他用途。例如，通道网络中的通道的组合容积可以比反应腔室容积大约小100倍，或大约小100倍至大约1000倍，或从大约300倍到大约1000倍。而且，如美国专利8,394,324中描述的，器件可以被设计为包括分析通道网络，其中，通道具有小的截面积，使得通道网络的水力流阻大于反应腔室的水力流阻。例如，调整通道尺寸，使得分析通道网络与反应腔室之间的流阻比是大约10₃或更大、或大约10₃至大约10⁹、或大约10³至大约10⁷、或大约10⁴至大约10⁶，在从反应腔室到加载通道的入口处提供门通功能(gate function)。美国专利8,394,324中提供了可以用于实现水力流阻的这种值的设计考虑和示例性通道尺寸。

第二个考虑涉及沿着加载通道、在接合点与和其他通道的交叉点之间的长度和预加载通道的长度。通过提供满足本文描述的用于指定通道部分的长度的设计标准的器件，该器件可以用于允许分析通道网络内协调样品移动并更快分析一系列样品的方法。下面讨论用于加载通道区段的长度的设计标准和用于这种区段的典型范围。

还提供了一种系统，该系统包括反应/分析微流体器件，和用于执行本发明的方法的辅助设备。辅助设备可以包括热循环器器件、用于与微流体器件一起使用控制电极组处的电势和/或电流的电源、和检测器件。

在系统的一个实施方式中，热循环器器件接触反应腔室的区域中的微流体器件，并且被操作，以控制反应腔室中流体的温度。热循环器器件可以能够加热或冷却其中一项或这两项。热循环器器件可以用于在固定温度培养流体，或者温度可以随着时间函数变化。在一个实施方式中，利用热循环器器件使反应腔室中流体的温度重复升降，使得存在必须的试剂、引物和靶标(target)时发生PCR。如本领域技术人员将容易理解地，使用本文描述的方法和系统，可以实现其他扩增反应，诸如连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、自持续序列扩增(SSSR)、转录介导扩增(TMA)和类似且相关的核酸检测技术。酶促反应也可以利用该方法和系统来分析。

在系统的一个实施方式中，检测装置包括用于执行分离通道的内容物的激光感生荧光检测的设备。例如，激光器、光学器件和检测器对齐，用于感生并检测来自分离通道内的成分的荧光。检测子系统与分离通道的对齐可以以多种方式完成。例如，微流体器件可以在相对于用于在装置内部对齐的基准面的已知位置处制造有分离通道的检测区域。或者，检测系统的组件(诸如，光源(例如，激光))可以在微流体器件上方被扫描，以经由本领域中已知的各种技术检测分离通道并附随检测器检测区域。示例包括在分离通道中设置荧光标记物质，并且通过检测荧光标记物质来定位检测区域。容纳在通道中的分离介质(诸如凝胶)可以包括荧光标记物质，或者为了在开始分析之前定位通道的目的，可以使荧光物质可以(例如，经由电泳)从与分离通道连通的侧通道临时移动到检测区域中。检测器件的许多变型是可能的并且对于本领域技术人员是公知的。变型包括光的波长、光束形状、检测中使用一个或更多个波长、以及光源和检测器的类型。具体应用所需要的灵敏性是选择检测装置的类型时的因素。

还提供了用于在微流体器件中分析含有诸如DNA、RNA等的核酸的检定样品(诸如临床样品)和在检定过程中形成的样品成分的方法。该方法使用如上所述的器件。

一种方法包括以下步骤：(a)将检定溶液添加到所述腔室中；(b)在所述分离头槽与分离废物槽间施加第一电压达第一持续时间，以将先前移动到加载通道/分离通道交叉区域中的在第一时间来自所述检定溶液的第一组样品成分注入到所述分离通道中，并且在所述分离通道中执行所述第一组样品成分的分析；(c)在所述腔室与所述预加载废物槽间施加第二电压达第二持续时间，以使来自所述检定溶液的第二组样品成分在第二时间从所述腔室经由所述加载通道移动到所述预加载通道中；(d)在步骤(b)之后，在所述预加载废物槽与所述加载废物槽间施加第三电压达第三持续时间，以使来自所述预加载通道的所述第二组样品成分移动到所述加载通道中并移动到所述加载通道/分离通道交叉区域中。

例如，在上述实施方式中且用于～100-500个碱基对DNA片段的分析中，500-3000V的第一电压可以施加达20-120秒，300-1000V的第二电压可以施加达20-60秒，并且400-1600V的第三电压可以施加达10-40秒。这些参数是对可能有用的电压和时间的数量级的指导；下面提供用于方法的操作的设计标准。

该方法可以还包括在该腔室中执行核酸扩增反应。该方法可以还包括重复至少两次以下步骤：步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)和(e)在步骤(c)结束时开始执行至少一个扩增循环(amplification cycle)，其中，第一次执行该系列步骤时可选地，省略步骤(b)；在步骤(d)和步骤(e)结束之后开始该后续一系列步骤；以及可选地，最后一次重复所述一系列步骤时，所述一系列步骤只包括步骤(b)。该方法可以附加包括上述方法，其中，步骤(b)和步骤(c)大约同时开始，并且在各个步骤(e)中执行一个扩增循环，该扩增循环在各个步骤(c)结束时开始。

一种方法包括以下步骤：(a)将检定溶液添加于所述腔室，(b)使来自所示腔室中的所述检定溶液的第一组样品成本经由所述加载通道移动到所述预加载通道中达第一持续时间，使得所述移动最慢的样品成分进入所述预加载通道中；(c)使所述预加载通道中的所述第一组样品成分的一部分从所述预加载通道朝向所述加载废物槽移动到加载通道/分离通道交叉槽中达第二持续时间，使得所述移动最慢的样品成分达到所述加载通道/分离通道交叉区域；(d)将来自所述加载通道/分离通道交叉区域的所述第一组样品成分注入到所述分离通道中；以及(e)在所述分离通道中分析所述第一组样品成分。该方法还包括以下步骤：(f)在大约开始步骤(e)时，使来自所述腔室中的所述检定溶液的第二组样品成分经由所述加载通道移动到所述预加载通道中达第一持续时间，其中，所述第二组样品成分的所述移动最慢的成分进入所述预加载通道。

一种方法包括在微流体器件中执行核酸扩增反应，并且在相同微流体器件中分析至少由分离通道中一次电泳分离而产生的产物的量。该方法包括以下步骤：(a)在扩增腔室中执行至少一个扩增循环，以生成扩增子(amplicon)；(b)通过电泳使扩增子经由加载通道从扩增腔室移动到预加载通道中；(c)执行至少一个扩增循环，以生成附加扩增子；(d)通过电泳使扩增子从预加载通道朝向加载废物槽移动到加载通道/分离通道交叉区域中；(e)至少两次执行以下步骤的循环：(1)使由电流扩增循环生成的电泳扩增子从反应腔室经由加载通道移动到预加载通道中，(2)将来自前一个扩增循环的、处于加载通道/分离通道交叉区域中的扩增子注入到所述分离通道中，(3)经由电泳沿着分离通道分离所注入的扩增子，(4)检测分离的扩增子，(5)可选地，在步骤(e)(1)之后并且在时间上至少部分地与步骤(e)(6)交叠，在扩增腔室中执行至少一个扩增循环，以及(6)通过电泳使扩增子从预加载通道朝向加载废物槽移动到加载通道/分离通道交叉点区域中，其中，通过检测随着扩增循环的数量变化的生成的扩增子来分析所述核酸扩增反应的进展。

一种方法包括以下步骤：(a)将检定溶液添加于腔室中；(b)将第一电压施加在腔室与加载废物槽的两端达第一持续时间，以(i)使在第一时间从检定溶液移除、且先前移动到加载通道中的第一组样品成分移动到加载通道/分离通道交叉区域并且(ii)使来自检定溶液的第二组样品成分在第二时间从腔室移动到加载通道中；(c)在步骤(b)之后，在第二持续时间，在腔室与预加载废物槽间施加第二电压达第二持续时间，以继续在第二时间将来自检定溶液的第二组样品成分从腔室和加载通道中朝向预加载废物槽移动；以及(d)在步骤(b)之后，在分离头槽与分离废物槽的两端施加第三电压达第三持续时间，以将第一组样品成分从加载通道/分离通道交叉区域注入到分离通道中并且对执行在分离通道中的第一组样品成分执行分析。

例如，在上述实施方式中且用于～100-500个碱基对DNA片段的分析中，500-1500V的第一电压可以施加达5-50秒，300-1000V的第二电压可以施加达20-60秒，并且500-3000V的第三电压可以施加20-120达秒。这些参数是对可能有用的电压和时间的数量级的向导；下面提供用于方法的操作的设计标准。

该方法可以还包括在该腔室中执行核酸扩增反应。该方法可以还包括重复至少两次以下系列步骤：步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)和(e)在步骤(c)结束时开始执行的至少一个扩增循环，其中，第一次执行该系列步骤时可选地省略步骤(d)；在步骤(d)和步骤(e)结束之后开始后续一系列步骤；以及可选地，最后一次重复所述一系列步骤时，所述一系列步骤只包括步骤(b)和步骤(d)。该方法可以附加包括上述方法，其中，步骤(c)和步骤(d)在各个步骤(b)结束时开始，并且在各个步骤(e)中执行一个扩增循环，该扩增循环在各个步骤(c)结束时开始。

一种方法包括以下步骤：(a)将检定溶液添加于腔室；(b)将来自腔室中的检定溶液的第一组样品成分的一部分移动到加载通道中达第一持续时间，使得移动最快的样品成分不到达加载通道/分离通道交叉区域；(c)将来自腔室中的检定溶液的第一组样品成分的第二部分和加载通道中的第一部分朝向预加载废物槽移动达第二持续时间；(d)将加载通道中的第一组样品成分沿着加载通道移动到加载通道/分离通道交叉区域中达第三持续时间，其中，第三持续时间与第一持续时间相同，使得：(i)在所述第三持续时间期间移动最慢的成分所移动的距离大于从加载通道/预加载通道接合点到所述加载通道/分离通道交叉点的距离，并且(ii)在第一持续时间、第二持续时间和第三持续时间之和期间移动最慢的成分所移动的距离大于沿着所述加载通道从所述腔室到所述加载通道/分离通道交叉点的距离；(e)将所述第一组样品成分从所述加载通道/分离通道交叉区域注入到所述分离通道中；以及(f)在所述分离通道中分析所述第一组样品分量。

该方法可以还包括在步骤(b)期间，将来自检定溶液的、之前移动到加载通道中的第二组样品成分移动到所述加载通道/分离通道交叉区域中，其中，所述第二组样品成分的移动最慢的样品成分到达所述加载通道/分离通道交叉区域，并且还包括：(g)在步骤(b)之后，将所述第二组样品成分从加载通道/分离通道交叉区域注入到所述分离通道中并且在所述分离通道中分析所述第二样品。

该方法可以进一步包括在步骤(d)期间，将第三组样品成分的第一部分从所述腔室中的所述检定溶液移动到所述加载通道中，其中，所述第三组样品成分的移动最快的成分不到达所述加载通道/分离通道交叉区域，还包括：(h)在步骤(f)期间，使来自所述腔室中的所述检定溶液的第三组样品成分的第二部分移动到加载通道中并且使加载通道中的第一部分朝向所述预加载废物槽移动达第四持续时间，，其中，所述第四持续时间与所述第二持续时间相同。

一种方法包括以下步骤：(a)在所述扩增腔室中执行至少一个扩增循环以生成扩增子；(b)通过电泳使第一部分扩增子从所述扩增腔室沿着加载通道朝向加载废物槽移动到加载通道中，使得所述扩增子沿着所述加载通道移动一部分，但不到达加载通道/分离通道交叉点；(c)通过电泳使来自所述扩增腔室的第二部分扩增子与第一部分扩增子沿着加载通道朝向预加载废物槽移动到加载通道中；(d)在所述扩增腔室中执行一个扩增循环；以及(e)至少执行两次以下步骤环：(1)通过电泳(i)使由所述当前扩增循环产生的扩增子的第一部分从扩增腔室沿着加载通道朝向加载废物槽移动到加载通道中，使得由当前扩增循环产生的扩增子沿着所述加载通道移动一部分，但不到达加载通道/分离通道交叉点并且(ii)使在前一个扩增循环之后之前朝向预加载废物槽移动到加载通道中的扩增子沿着加载通道移动到加载通道/分离通道交叉区域中，(2)通过电泳使由当前扩增循环产生的第二部分扩增子与由当前扩增循环产生的加载通道中的第一部分扩增子沿着加载通道从扩增腔室朝向预加载废物槽移动到加载通道中，(3)将来自加载通道/分离通道交叉区域的扩增子注入到分离通道中，(4)通过电泳沿着分离通道分离所注入的扩增子，(5)检测分离的扩增子，(6)可选地，在步骤(e)(2)之后并且在步骤(e)(3)-(5)期间，在扩增腔室中执行至少一个扩增循环，其中，所述核酸扩增反应的进程通过检测作为扩增循环的数量的函数生成的扩增子来分析。

本发明的这些和其他目的和特征将在结合附图阅读本发明的以下详细描述时变得更全面地显见。

附图说明

图1A示出根据本发明的一个实施方式的微流体器件。

图1B示出根据本发明的一个实施方式的微流体器件。

图1C示出用于根据本发明的一个实施方式的微流体器件的设计参数的图解。

图2示出根据本发明的一个实施方式的样品成分的移动模式。

图3A、图3B和图3C示出根据本发明的一个实施方式的步骤的序列。

图4A、图4B和图4C示出根据本发明的实施方式的事件的示例性时间序列。

图5示出根据本发明的一个实施方式的样品成分的移动模式。

图6A、图6B和图6C示出根据本发明的一个实施方式的步骤的序列。

图7A和图7B示出根据本发明的实施方式的事件的示例性时间序列。

图8A和图8B示出根据示例1描述的本发明的一个实施方式执行的实时PCR-CE分析的结果。

图9A和图9B示出根据示例1描述的本发明的一个实施方式执行的实时PCR-CE分析的结果。

图10A和图10B示出根据示例2描述的本发明的一个实施方式执行的实时RT-PCR-CE分析的结果。

图11A和图11B示出根据示例3描述的本发明的一个实施方式执行的实时PCR-CE分析的结果。

具体实施方式

本发明的器件、方法和系统通常用于进行反应并分析单个微流体器件内的反应产物。该反应可以涉及分子生物学或化学反应或检定。反应条件可以包括对反应溶液进行培养或热循环。反应产物周期性地或时常从反应腔室收回，并经由通道网络运送到用于分析的分离通道。一个具体应用是用于实时PCR分析或定量PCR(qPCR)。在这种应用中，使寡核苷酸引物对在包含PCR反应所需的试剂(诸如聚合酶和核苷酸三磷酸)的溶液中与关注的样品接触。对反应溶液进行热循环，即，使反应溶液经受重复的温度循环，该温度循环分别支持双链多核苷酸的变性、引物退火到模板(template)、以及将引物延伸到多核苷酸产物(还称作扩增子)。可以在各个热循环或至少若干个热循环之后，确定扩增产物的扩增子的量，并且由此可以跟踪反应的进程。本发明的器件、方法和系统在一个微流体器件中设置用于进行扩增反应的腔室，并且与其连接的是用于测量在反应中生成的扩增子(多核苷酸产物)的量的分离通道。

相关应用包括使用检测DNA或RNA靶标的其他类型的核酸扩增反应，包括等温扩增法，用于生成指示目标分析物的存在(和量)的反应产物。虽然等温反应不根据由温度冲程限定的离散周期而进行，但是相同的原理应用于反应产物的周期性测量。

A.器件

图1A例示本发明的微流体器件100的实施方式。该器件包括用于执行反应的腔室11。

腔室11被设计为具有大约0.5μL至大约200μL的容积。腔室11的容积可以根据这里进行的反应的类型调整，使得反应产生足以由分析、检测或以其他方式使用的产物的量。例如，如果反应是扩增反应(诸如聚合酶链式反应(PCR))，则在器件中进行的PCR检定的期望灵敏性是设置反应腔室的容积的因素。如果可以可靠地扩增10个目标份数，并且如果期望的灵敏性是每微升1份，则反应腔室容积应当在至少大约10μL。预期容积为大约0.5μL、1.0、10、25、50、75、100、150或200μL的反应腔室。

可以使用例如接入通道18和接入通道19来将反应溶液引入到腔室11中。接入通道18和接入通道19从接入槽5和槽6(分别)通向腔室11。如这里例示的，接入通道可以接入腔室11的相对侧，以在避免该腔室中的流体内的气泡或孔的同时促进用反应溶液填充该腔室。例如，接入槽5中引入的溶液可以通过接入通道18运送、进入并填充腔室11、并且通过接入通道19离开该腔室。

通过将压力施加于流体，或通过电动力，可以例如经由毛细作用造成流体移动到腔室11中。该压力可以是施加在第一接入槽的正压力，或施加在第二接入槽的负压力。通常地，第一接入槽的容量应当足够大，以容纳足以填充该腔室和至少两个接入通道的至少一部分的流体的容积。第一接入槽的容量可以足够大，以容纳足以填充该腔室、至少两个接入通道、以及接入槽的至少一部分的流体的容积。

腔室11还与分析通道网络流体连通。分析通道网络包括加载通道12、预加载通道13、分离通道14以及如果存在则侧通道21。加载通道12从腔室11通向加载废物槽3。分离通道14从分离头槽4通向分离废物槽1，并且在加载通道/分离通道交叉点16与加载通道12交叉。预加载通道13在腔室11与加载通道/分离通道交叉点16之间的位置处从加载通道12通向预加载废物槽9。预加载通道13与加载通道12相交的点还可以称作加载通道/预加载通道接合点15。侧通道21在腔室11与加载通道/预加载通道接合点15之间的位置处从加载通道12通向侧废物槽8。侧通道21与加载通道12接触的点还可以称作加载通道/侧通道接合点17。加载通道与侧通道之间的接合点(接合点17)的位置可以与如图1A所示不同。例如，当侧通道用于将多核苷酸长度标记递送到加载通道以与样品成分混合时，侧通道可以在接合点15与交叉点16之间与加载通道12接合。否则关于接合点17的位置没有特定条件。在一些实施方式中，富集染料通道22从分离通道14通向富集染料槽2。富集染料通道/分离通道接合点通常位于分离通道的用作检测区域的部分的下游。

在一些实施方式中，槽7经由通道20与腔室11流体连通。这种槽提供从该槽到反应腔室11的流体连通和电化学连通。

电极(未示出)存在与各个槽1、2、3、4、7、8和9中。电极可以可选地存在在槽5和/或槽6中。电极可被独立控制。通过在两个电极之间施加电势差或者施加电势差使得通过特定电极实现特定电流(或对电极组的电势和电控制的组合)，可以沿着微流体器件中的两个点之间的路径感生电动运送。槽7中存在的电极可以用于在腔室11与分析通道网络内的另一点(通常是另一个槽，诸如加载废物槽3或预加载废物槽9)之间施加电势差。由此，例如，如下所述，槽7与多个槽中的另一个之间的电势差可以用于感生将反应溶液成分从腔室朝向加载废物槽3或预加载废物槽9到分析通道网络中的电动运送。电极可以设置为降低到槽中的外部电极，或者电极可以被微制造为器件本身的一部分。

如图1A所示，槽10不用在器件100的具体构造中。

沿着加载通道12从腔室11到交叉点16的距离(“距离A”)和从接合点15到交叉点16的距离(“距离B”)如图1B所示被设计为满足基于要使用器件100分析的成分移动性(mobility)并且因而速度的条件。距离A和距离B的示例性长度分别是0.1-2cm和0.01-0.2cm。这些范围通常反映实际上应用于～100-500个碱基对核酸片段的分析的通道区段的长度。下面描述详细的设计标准和这些区段长度之间的关系。凭借这些设计标准，器件100能够执行本发明的方法，从而比可能的情况快地提供结果(因为一些步骤能够同时执行)。

腔室11中的反应溶液中的带电成分(具有净正电荷或净负电荷的分子)可以如下分析。考虑要进行分析的反应溶液中的各个带电成分的电泳淌度(electrophoreticmobility)μ_i。对于通过在一对电极间施加电势差而建立的给定电场E，反应溶液成分的速度ν_i是ν_i＝μ_iE。在要分析的成分中，确定移动最快和最慢的成分。应当认识到在反应溶液中可以存在不是分析所关注的成分的带电粒种。这样的其他带电粒种不被包括在该确定中。例如，当本文公开的器件和方法应用于实时PCR分析时，关注的带电粒种包括从与反应溶液接触的引物对产生的扩增子。分别将动电速度指定为ν_fast和ν_slow。沿着加载通道12达距离A和距离B的长度应当是使以下条件得到满足：

(1)ν_fast(t_load)<距离A

(2)ν_slow(t_load+t_preload+t_load)>距离A

(3)ν_slow(t_load)>距离B

其中，ν_fast、ν_slow、距离A和距离B是如上限定的，并且t_load和t_preload分别是施加电势差以执行加载步骤和预加载步骤的时间段。由此，在时间段t_load期间，具有移动性μ的成分将移动距离μE(t_load)＝ν(t_load)＝D_load。现在，解释了将在加载步骤和预加载步骤期间行进的相对距离应用于器件设计，同时下面进一步说明步骤本身。

在仅有一种关注的样品成分的情况下，快粒种和慢粒种将是同一粒种，因此，在上述条件下，ν_fast＝ν_slow。更通常地，在反应溶液中将存在关注的至少两种粒种。例如，这两种粒种可以包括分析物和阳性对照(positive control)，或两种不同的分析物。在该反应是扩增反应的情况下，分析物是扩增产物。在反应是PCR反应的情况下，分析物是由使靶标序列扩增的的引物对产生的扩增子。

大范围的设计方案满足算式(1)-(3)的条件。没有唯一方案。反而，可以将时间段固定并且确定有效距离A和B的范围，或者可以将距离A和B固定并且确定用于加载和预加载步骤的时间的操作范围。

该条件阐述了以下要求。算式(1)规定移动最快的粒种在“加载步骤“的持续时间期间未行进距离A(从腔室11到交叉点16)。算式(2)规定移动最慢的粒种在两个“加载步骤”和一个“预加载步骤”的持续时间期间将至少行进距离A。最后，算式(3)规定移动最慢的粒种在“加载步骤”的持续时间期间将至少行进距离B(从接合点15到交叉点16)。这些步骤和针对移动的各种标准的导入可以从以下描述的方法步骤理解。

一个实施方式预期了分析多核苷酸产物。例如，反应可以是生成核酸扩增子的核酸扩增反应。典型的核酸扩增子产物具有大约2-3×10^-4cm²/sV的移动性。100V/cm的电场的施加将使扩增子产物以0.02-0.03cm/s的速度迁移。分别将t_load和t_preload设置为10s和20s得到加载通道的以下设计标准。

(1’)ν_fast(t_load)<距离A；0.03(10)＝0.3cm<距离A

(2’)ν_slow(t_load+t_preload+t_load)>距离A；0.02(40)＝0.8>距离A

(3’)ν_slow(t_load)>距离B；0.02(10)＝0.2cm>距离B

由此，对于给定的步骤时间，可以确定距离B应当小于0.2cm，而距离A应当大于0.3cm且小于0.8cm。沿着加载通道12从腔室11到接合点17的距离通过从距离A减去距离B而获得。将从腔室11到接合点17的距离称作距离C(参见图1B)，在区段长度距离B和距离C的方面，可以表达上述条件。由此，对于上述示例，

(1’)距离C>0.3cm-距离B

(2’)距离C<0.8cm-距离B

(3’)距离B<0.2cm

因此，上述算式规定对于t_load和t_preload时间和分析物速度的给定组的有效方案的范围。类似地，可以固定加载通道区段长度和分析物速度，并且确定合适的t_load和t_preload时间。

还可以以图形方式解这些算式。图1C示出例示用于加载通道区段的有效方案的范围的曲线图。曲线图的阴影区域指示与本文阐述的设计标准一致的从接合点15到交叉点16(距离B)和从腔室到接合点15(距离C)的加载通道的区段长度的范围。曲线图上所画的三条线例示由三个算式带来的限制。

根据本发明的微流体器件的制造通常涉及制备具有(具有不同尺寸、特别是具有不同深度的)流体特征件(例如，通道、腔室)的器件。例如，接入通道18和19以及腔室11通常较深，例如，50-500μm深，以容纳用于分析的所需样品容积。另一方面，分析通道网络通常包括具有小截面、较不深(例如，20-60μm深)的通道。通过使分析通道网络的截面和整个容积小，如上所述，仅需要移除反应溶液的一小部分以分析，并且对进入通道网络的大的水动力流阻充当阀。

微流体器件可以由本领域技术人员已知的合适材料制成。如美国专利8,394,324中公开的，现有技术中已知用于制备这种器件的方法。聚甲基丙烯酸甲酯和环烯聚合物适于制备不同尺寸(即，深度)的通道。针对它们与微制造技术的兼容性，选择材料，该技术包括接合材料，以制造器件。例如，器件可以由诸如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环烯聚合物(COP)或环烯共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚酯(PE)和其他合适的聚合物或弹性体、玻璃、石英和半导体材料等形成。

例如，通过环状单体(诸如二环[2,2,1]庚-2-烯(降冰片烯)、或1,2,3,4,4a，5,8,8a-八氢-1,4:5,8-二甲基萘(四十二环烯)bicylo[2.2.1]hept-2-ene(norbornene)或1,2,3,4,4a,5,8,8a-octahydro-1,4；5,8-dimenthanonaphthalene(tetracyclododecene))与乙烯的共聚作用，制造环烯共聚物(COC)。COC的示例包括Ticona的和MitsuiChemical的APEL^TM。COC还可以通过在加氢之后使各种环状单体的易位聚合开环来制备。这种共聚物的示例包括日本Synthetic Rubber的ARTON和Zeon Chemical的和共聚单种环状单体产生环烯共聚物(COP)。诸如Mitsubishi的聚碳酸酯等的PC和诸如Evonik CYRO的丙烯酸酯的线等的PMMA(例如，S10、L40、M30)是适合于制造微流体器件的合适塑料。

通常地，这种聚合物可以分许多等级。依赖于应用，FDA批准的等级可以是合适的(尽管其他类型的等级可能是足够的)。关于用于微流体器件的基板的选择的其他考虑包括制造的容易性和再现性，和光学测量中的低背景。本领域技术人员可以容易地优化这些参数。

通常地，包括腔室、通道和槽的网络的微流体器件可以由被接合到一起以形成器件的两个或更多个基板层制备。通常称作微制造技术的、用于这种器件的制造技术在本领域技术中已知。在器件制备方法的一个示例中，在包括第一层在内的基板的第一表面中微制造微流体腔室和通道特征件，并且第二层接合到其中微制造了特征件的第一层的第一表面，从而包围特征件。多层器件也可以被制备，并且是在现有技术中已知的。

在一个实施方式中，通过将聚合薄膜接合到内部限定有微流体网络的基板第一表面(即，呈现出沟、凹陷、槽、孔等的表面)以包围网络来制备器件，。薄膜可以具有大约20μm至大约500μm的厚度，或者大约50μm至大约200μm的厚度。可以根据厚度的均一性、可用性、接合的容易性、清晰性、光学特征、热特征、化学特征和其他物理特征来选择薄膜。如现有技术中已知的，接合技术包括层压、超声焊接、IR焊接等。薄膜材料可以和与其接合的基板的材料相同或不同。

B.使用器件的方法

满足这里描述的设计条件的器件可以使用本文公开的方法来操作，以分析来自腔室的两个或更多个样品的时间序列。这些方法用于分析腔室的内容物随着时间的变化。方法用于跟踪腔室中执行的反应的进展，或随时间监测腔室的内容物。例如，可以确定核酸扩增反应中产生的扩增子的量或酶促反应或结合反应的动力学。一个特定应用涉及跟踪PCR反应的进展。通过在从各个循环之后，或所选循环之后移除从腔室移除样品，并且在分析通道网络中对各个样品进行分离分析，可以分析PCR扩增子。

图2例示对于一个方法在器件中的样品成分的一般流程。在图2中，主要器件特征件利用与如图1所示相同的附图标记来示出。特征件包括腔室11、从腔室11通向加载废物槽3的加载通道12、从与加载通道12的接合点15通向预加载废物槽9的预加载通道13和从分离头槽4通向分离废物槽1并且在交叉点16处与加载通道12交叉的分离通道14。

样品成分的一般顺序和流动方向由虚线(I)’、(I)”、(II)和(III)指示。首先，样品成分从腔室11朝向加载废物槽3移动，导致由(I)’和(I)”指示的移动。根据该方法，两种不同的样品存在于加载通道12中，由(I)’和(I)”表示。然而，在第一次从腔室11移除样品成分时，在加载通道12中不存在先前样品，由此尚未有由(I)”表示的成分的流动。在第一次从腔室11移除样品成分时，存在如由(I)’指示的样品成分从腔室移动到加载通道12中。

接着，根据由(II)指示的移动，样品成分从腔室11朝向预加载废物槽9移动。由此，对于移动(II)，如由(I)’所示的移动到加载通道12中的样品成分继续沿着加载通道12移动，然后离开加载通道12进入预加载通道13。另外，来自腔室11的样品成分将继续移动到加载通道12中。由此，由于(I)’和(II)指示的移动的组合，样品成分将填充加载通道12直到接合点15，并且也可能在预加载通道13中找到。

在经过一些时间的之后并且适当移除下一组样品成分以进行分析，使样品成分从腔室11朝向加载废物槽3移动，这导致由(I)’和(I)”指示的移动。如以上针对先前移动到加载通道12中的初始样品成分组所描述的，下一组样品成分如由(I)’指示将进入加载通道12。并且，此时，因为样品成分先前已经移动到加载通道中直到接合点15，所以这些样品成分将沿着加载通道12经过加载通道/分离通道交叉点16朝向加载废物槽3移动。同样地，如果在后来从腔室11移除附加样品成分组以便进行分析，则将有两个不同的样品成分组存在在加载通道12中——从腔室11移除的先前组样品成分将存在在加载通道12中直到大约接合点15，而从腔室11移除的当前样品成分组将刚刚进入加载通道12。

样品成分的第三类型的移动由(III)指示。之前移动到加载通道/分离通道交叉点16中的样品成分被注入到分离通道14中，并且朝向分离废物槽1移动。随着样品成分沿着分离通道14移动，成分被分离并检测。这些各种移动的定时、坐标和持续时间将结合图3和图4进一步说明。

图3A-图3C例示用于在微流体器件中的各个位置间施加电压以感生结合图2讨论的移动(I)’、(I)”、(II)和(III)的模式。根据本文中描述的微流体器件中图3A-图3C所示的三个模式的电压差VD1、VD2和VD3的重复施加得到对来自腔室11的一系列样品成分的快速分析。图3A示出在腔室11和加载废物槽3间施加第一电压VD1的施加。与腔室11关联的电极11e在图中例示成位于腔室11中，但是这是为了简化本文描述的器件的实施方式的视觉再现。对于图1A所描述的器件，如结合图3A和图3B描述的，在槽7(经由通道20与腔室11电化学连通)处的电极通常用于施加第一电压和第二电压。为了例如使阴离子分析物成分从腔室11移动到加载通道12中，加载废物槽3中的电极3e被偏置为正(阳极)，并且与腔室11电化学接触的电极11e被偏置为负(阴极)。该反向极化将造成阳离子分析物成分从腔室11沿着加载通道12移动到加载通道12中。在施加第一电压的时间段期间，加载通道12中存在的带电分析物成分将沿着通道朝向加载废物槽3移动，并且腔室11中的带电分析物成分将移动到加载通道12中。而且，图3A的第一电压VD1施加一段时间，使得：(i)在加载通道12中存在的移动最慢的分析物成分可以从接合点15至少移动到交叉点16，并且(ii)腔室11中移动最快的分析物进入加载通道12，但不到达交叉点16。

在如图3A所示施加第一电压VD1之后，如图3B所示，在腔室11中的电极11e与预加载废物槽9中的电极9e之间施加第二电压VD2将使带电分析物成分沿着加载通道12移动到预加载通道13中。另外，来自腔室11的带电分析物成分继续进入加载通道12。第二电压施加一段时间，使得样品成分将从腔室11移动到加载通道12中直到与预加载通道的接合点(接合点15)、靠近分离通道14的位置，并且到预加载通道13中。而且，第二电压VD2施加一段时间，使得在施加两次第一电压和施加一次第二电压的时间段中，最慢的带电分析物成分至少移动了从腔室11到加载通道/分离通道交叉点16的距离。

而且在如图3A所示施加第一电压VD1之后，如图3C所示，在分离头槽4中的电极4e与分离废物槽1中的电极1e之间施加第三电极VD3将造成加载通道/分离通道交叉点16中和周围存在的带电分析物成分移动到分离通道14中。加载通道/分离通道交叉区域中存在的带电分析物成分可以被注入到分离通道14中。所注入的材料不严格限于两个通道的字面上的交叉点内的分析物成分。相反，如本领域中知道的，字面上的交叉点和与该交叉点相邻的加载通道12的部分中存在的分析物成分也可以在该处理中注入到分离通道14中。从交叉点区域将要注入分析物成分的程度依赖于施加于相关槽的回调电压的定时和大小。第三电压VD3被施加达足以在分离通道14中执行分析物成分的分离和分析的一段时间。所需要的时间依赖于电场强度、分离介质中分析物的移动性、从交叉点16到检测点的距离等。在维持合适的检测灵敏性和分辨率的同时，为了快速分离时间，可以对这些因素优化。

图4A例示在根据本发明的执行反应并周期性地测量反应产物的一个方法中步骤的顺序和定时的示例性方案。该方案包括四个类型的步骤：(i)腔室中的反应时间段、(ii)从腔室朝向加载废物槽移动样品成分、(iii)从腔室朝向预加载废物槽移动样品成分、以及(iv)分离分析。在图4A中，执行五个反应时间段和在各个反应时间段之后产生的反应产物的后续后续五个分离分析。如可以从附图理解的，除了第一反应时间段的开始和最终分离分析的逐步结束之外，存在同时进行的两个步骤。如果任何步骤都没有交叠，则整个过程将花费510秒。通过在器件中根据本文公开的方法执行反应和分离分析，根据该示例中设置的时间参数，五个循环的整个过程将花费390秒。

合适的反应时间段由例如用于培养反应溶液的关注的时间段、或完成热程序所需的时间来管理。由此，在恒温下执行的反应可以被周期性地采样。该时间段可以是恒定的或变化的。或者，热循环(其中反应溶液的温度被升高和降低)可以构成反应时间段。热循环可以是PCR循环。如下面参照图4B和图4C更详细地描述的，超过一个的热循环可以在反应时间段期间执行。如图3A-图3C所述，移动步骤(ii)和(iii)以及分离步骤(iv)对应于第一电压、第二电压和第三电压的施加。如图4A所示，反应时间段是30秒，第一电压被施加达10秒的持续时间，第二电压被施加达20秒的持续时间，并且第三电压被施加达50秒的持续时间。

图4A例示的方案首先包括反应时间段，随后是施加第一电压VD1达第一持续时间以从腔室11朝向加载废物槽3移动样品成分，然后施加第二电压VD2达第二持续时间以从腔室11朝向预加载废物槽9移动样品成分。此时，直到第一反应时间段产生的反应产物已经移动上加载通道12到接合点15。因为样品成分还没有前进到交叉点16，所以不需要分离分析，然而，可以施加第三电压VD3达第三持续时间而没有不利影响。

接着，执行第二反应时间段，随后是再次施加第一电压VD1达第一持续时间。这时，第一反应时间段的样品成分朝向加载废物槽3移动并且到交叉点16中，且第二反应时间段的样品成分移动到加载通道12中。此时，在腔室11与预加载废物槽9间施加第二电压VD2，并且在分离头槽4与分离废物槽1间施加第三电压VD3。如所例示，并行地执行这两个处理。第二电压和第三电压大约同时开始施加。施加第二电压的步骤在施加第三电压的步骤(分离步骤)之前结束。在施加第三电压的步骤继续的同时，下一个反应时间段可以被启动。由此，完全在分离分析时间段内执行反应时间段。

通过调节分离分析参数(例如，分析物迁移的速度、到检测器的距离等)和反应时间段参数(例如，热循环器温度、时间、缓变率等)，这些时间段可以被调节为大约同时结束。通过大约同时结束这些步骤，从腔室11朝向加载废物槽3移动新产生的反应产物的后续步骤可以立即开始。

虽然图4A示出由五个反应时间段和五个反应分析物组成的示例性方案，但是可以根据实验的需要自由调节反应时间段和分离分析物的数量。例如，可以在腔室中对反应溶液的内容物执行一系列至少两个、五个、十个、十五个、二十个或二十五个、或多达50个分离分析物。在第一分离分析之前可以进行任意数量的反应时间段。通过延迟分离分析的开始，产物量可以积累到更容易测量的水平。在一些实施方式中，当在检测到在阈值水平之外的产物峰值时，或在检测到产物峰值之后的预定数量的反应时间段之后，可以停止分析。

分离分析也可以在每隔一个反应时间段、或每隔两个反应时间段、或在任意特定的反应时间段组之后、而不是在每个反应时间段之后执行。反应时间段不需要都是相同的持续时间，而可以根据需要或期望变化。在反应是核酸扩增反应(诸如PCR)的情况下，在分析所产生的产物量之前，可以执行大约8至大约17个热循环。此后，例如，可以在每个、或每隔一个热循环分析产物量。根据检测灵敏性、扩增效率、样品期望的靶标量、以及腔室容积和分析通道网络容积，所执行的总共热循环数量可以是大约35至大约45个循环。如果在检定样品中期望的目标分析物量大，则较少的循环可以是足够的。

表1例示如何通过调节所进行的热循环和CE分离分析的数量来优化整个分析。例如，CE分析可以与例如随着第十个反应循环开始，即，在已经执行了9个反应循环之后。而且，可以在每隔一个反应时间段而不是每个反应时间段之后，进行CE分析。另一个变型是在每隔一个反应时间段之后执行CE分析，直到检测到产物峰值为止，然后在每个循环之后执行分析以较精确地限定生长曲线。基于在特定周期数量之后将充分限定生长曲线的假定，在预设次数的分析之后，可以可选地停止该CE分析。例如，在特定实施方式中，在检测到产物峰值之后的8个、10个、12个或大约14个循环之后充分限定生长。表1例示的“峰值检测上的每个循环”模式示出在循环12中检测到产物峰值，此后随着循环14开始每个循环进行CE分析达10个连续循环，然后停止CE分析。在循环12与循环14之间出现间隙，因为循环12的分析结果直到已经完成反应循环13和14之后才会被知道。如果未检测到产物峰值，则CE分析将每隔一个循环继续达分析时间，由此，样品将被报告成是“阴性样品”。

表1

如表1所看到的，可以通过调节所执行的CE分析的数量，来实现进一步节省时间。不是每个循环对反应进行检定(其中，需要31次CE运行(该示例中))，而是在一些实施方式中，CE分析可以被预设为在每隔一个反应循环之后出现(其中，仅需要16次CE运行(在该示例中))。大约7.5分钟的时间节省的益处(如针对图4A和图4B中表示的时间参数估计的)应当平衡了限定生长曲线的精度损失。本领域技术人员可以容易地确定在应用该方法时哪个因素是更重要的。CE分析的数量的其他变型当然是可能的。在其他实施方式中，一旦检测到产物峰值，则CE分析的频率从每隔一个循环改变为每个循环(其中，会执行12次CE分析(在该示例中))。这里，在生长曲线的精度变化非常小的情况下，可以实现大约18分钟的节省，或每个循环模式检定时间的大约一半。

图4B例示在执行两个反应循环并测量从两个循环中的第二个循环产生的产物的实施方式中的步骤顺序和定时的示例性方案。换言之，在图4B中，每隔一个反应循环被分析。方案再次包括相同的四种步骤：(i)腔室中的反应时间段、(ii)从腔室朝向加载废物槽移动样品成分、(iii)从腔室朝向预加载废物槽移动样品成分、以及(iv)分离分析。在图4B中，示出八个反应时间段和每隔一个反应时间段之后产生的反应产物的后续四个分离分析。如在与图4A比较时可以从图4B理解的，在进行分离分析的同时，额外的反应时间段直接插入在进行一个反应时间段之后，并且随后的步骤等待第二反应时间段的结束。对于图4A的实施方式完全处理五个循环和五个分析的时间需要390秒，而在图4B的实施方式中六个反应循环和每隔一个的(三个)分析将需要相同的390秒。进一步的时间节省将随着更多的循环实现。

类似地，图4C例示在执行两个反应循环并测量从两个循环中的第一个循环产生的产物的实施方式中的步骤顺序和定时的示例性方案。还在图4C中，分析每隔一个反应循环。方案再次包括相同的四种步骤：(i)腔室中的反应时间段、(ii)从腔室朝向加载废物槽移动样品成分、(iii)从腔室朝向预加载废物槽移动样品成分、以及(iv)分离分析。在图4C中，示出八个反应时间段和各对时间段的第一反应时间段之后产生的反应产物的后续四个分离分析物。如在与图4B比较时可以从图4C理解的，在该对的第一反应时间段之后，移除样品并且使样品经受样品移动(ii)和(iii)，然后，在执行前一个样品的分离分析的同时，出现第二反应时间段。对于图4A的实施方式完全处理五个循环和五个分析的时间需要390秒，而图4B的实施方式在相同的390秒执行六个反应循环和每隔一个的(三个)分析，在图4C的实施方式中，六个反应循环和三个的分析仅需要360秒。进一步的时间节省将随着更多的循环实现。

图5例示用于根据本发明的另一个方法的装置中样品成分的一般流程。在图5中，主器件特征件利用如图1所示相同的编号来示出。特征包括腔室11、从腔室11通向加载废物槽3的加载通道12、从与加载通道12的接合点15通向预加载废物槽9的预加载通道13、和从分离头槽4通向分离废物槽1并且在交叉点16与加载通道12交叉的分离通道14。

样品成分的一般顺序和流动方向由虚线(I)、(II)和(III)指示。首先，样品成分从腔室11朝向预加载废物槽9移动，得到由(I)指示的移动。第一次从腔室11移除样品成分时，在加载通道12中不存在之前的样品，由此尚没有要在分离通道中分析的样品成分组。

接着，根据由(II)指示的移动，由于移动(I)而曾移动到预加载通道13中的样品成分朝向加载通道12沿相反方向发送，然后那些样品成分中的至少一部分沿着加载通道12朝向加载废物槽3移动，并且占据加载通道/分离通道交叉点16。由此，由于由所指示的(I)和(II)的移动的组合，样品成分通常会填充加载通道12，直到在接合点16和经过接合点16，并且还可能在预加载通道13中找到。

样品成分的第三类型的移动由(III)指示。之前移动到加载通道/分离通道交叉点16中的样品成分注入到分离通道14中，并且朝向分离废物槽1移动。随着样品成分沿着分离通道14移动，成分被分离并检测。这些各种移动的定时、坐标和持续时间将结合图6和图7进一步说明。

因为移动路径不交叉且不交叠，所以同时执行移动(I)和(III)。在各个移动(I)和(III)之前的步骤、腔室11中的反应时间段(在(I)之前)和移动(II)(在(III)之前)可以同时执行，因为这些事件各不彼此干扰。在同时发生的事件对中的任一个不需要大致相同的时间量来执行来说，较短的事件可以在较长事件的时间段内的任何时间执行。例如，如果移动(II)在比反应时间段短的时间段中出现，则移动(II)可以例如(i)在与反应时间段大约相同的时间开始，但较早结束，(ii)在反应时间段期间开始，使得两者将在大约相同时间结束，或(iii)在一个反应时间段的时间内开始和结束。然而，应当注意的是，在用于执行较长事件所需的时间段之外，可以甚至出现较短事件的一部分。具体地，如果另一对事件在时间上不大致同时，则四个事件的相对定时可以不同地交叠，事件的不同组合同时出现，只要事件的执行不与另一个事件的执行干扰。例如，反应时间段还可以与移动(III)交叠。另一方面，反应时间段和移动(I)可能干扰，并且移动(I)和(II)以及(II)和(III)可能彼此干扰。然而，在一对事件(诸如，移动(I)和(III))在时间上粗略相等来说，那么当移动(I)和(III)不出现时，其他事件对，反应时间段和移动(II)将都发生。

图6A-图6C例示用于在微流体器件中的各个位置施加电压、以感生结合图5讨论的移动(I)、(II)和(III)的模式。根据本文中描述的微流体器件中图6A-图6C所示的三个模式的电压差VD1、VD2和VD3的重复施加得到快速分析来自腔室11的一系列样品成分。图6A示出在腔室11和预加载废物槽9间施加第一电压VD1。与腔室11关联的电极11e在图中例示位于腔室11中，但是这是为了简化本文描述的器件的实施方式的视觉再现。对于图1A所描述的器件，如结合图6A描述的，在槽7处(经由通道20与腔室11电化学连通)的电极通常用于施加第一电压。为了例如使阴离子分析物成分从腔室11移动到加载通道12中，预加载废物槽9中的电极9e被偏置为正(阳极)，并且与腔室11电化学接触的电极11e被偏置为负(阴极)。该反向极化将造成阳离子分析物成分从腔室11沿着加载通道12移动到加载通道12中。在施加第一电压的时间段期间，腔室11中的带电分析物成分将移动到加载通道12中。而且，图6A的第一电压在一时间段施加，使得：(i)腔室11中存在的移动最慢的分析物成分可以移动到预加载通道13中。

在如图6A所示施加第一电压VD1之后，如图6B所示，在电极9e与电极3e之间施加第二电压VD2将使带电分析物成分返回到加载通道12朝向加载废物槽3移动到预加载通道13之外。施加第二电压达一段时间，使得样品成分将从预加载通道13移动到交叉点16中。

而且在如图6B所示施加第二电压之后，如图6C所示，在分离头槽4中的电极4e与分离废物槽1中的电极1e之间施加第三电极VD3将造成加载通道/分离通道交叉点16中和周围存在的带电分析物成分移动到分离通道14中。加载通道/分离通道交叉区域中存在的带电分析物成分可以被注入到分离通道14中。所注入的材料不严格限于两个通道的字面上的交叉点内的分析物成分。相反，如本领域中知道的，字面上的交叉点和与该交叉点相邻的加载通道12的一部分中存在的分析物成分也可以在该处理中注入到分离通道14中。从交叉点区域注入分析物成分的程度依赖于相关槽的回调电压的定时和大小。第三电压被施加达足以在分离通道14中执行分析物成分的分离和分析的一段时间。所需要的时间依赖于电场强度、分离介质中分析物的移动性、从交叉点16到检测点的距离等。在维持合适的检测灵敏性和分辨率的同时，为了快速分离时间，可以对这些因素优化。

图7A例示在根据本发明的执行反应并周期性地测量反应产物的一个方法中步骤的顺序和定时的示例性方案。该方案包括四个类型的步骤：(i)腔室中的反应时间段、(ii)从腔室朝向加载废物槽移动样品成分、(iii)从腔室朝向加载废物槽移动样品成分、以及(iv)分离分析。在图7A中，执行五个反应时间段和在各个反应时间段之后产生的反应产物的后续后续五个分离分析。如可以从附图理解的，除了第一反应时间段的开始和最终分离分析的逐步结束之外，存在同时进行的两个步骤。如果任何步骤都没有交叠，则整个过程将花费610秒。通过在器件中根据本文公开的方法执行反应和分离分析，根据该示例中设置的时间参数，五个循环的整个过程将花费470秒。

合适的反应时间段由例如用于培养反应溶液的关注的时间段、或完成热程序所需的时间来管理。由此，在恒温下执行的反应可以被周期性地采样。该时间段可以是恒定的或变化的。或者，热循环(其中反应溶液的温度被升高和降低)可以构成反应时间段。热循环可以是PCR循环。如下面参照图7B更详细地描述的，超过一个的热循环可以在反应时间段期间执行。如图6A-图6C所述，移动步骤(ii)和(iii)以及分离步骤(iv)对应于第一电压、第二电压和第三电压的施加。如图7A所示，反应时间段是30秒，第一电压被施加达50秒的持续时间，第二电压被施加达10秒的持续时间，并且第三电压被施加达50秒的持续时间。

图7A所示的方案首先包括反应时间段，随后是施加第一电压VD1达第一持续时间以从腔室11通过加载通道12朝向预加载废物槽9移动样品成分到预加载通道13中。

接着，执行第二反应时间段，并且在该第二反应时间段期间，施加第二电压VD2达第二持续时间以使样品成分从预加载通道13朝向加载废物槽3移动到交叉点16中。这时，腔室内容物准备好被收回以进行后续分析，并且先前反应时间段的样品成分已经移动到加载通道/分离通道交叉区域中并且为准备好被分离分析。

由此，此时，在腔室11与预加载废物槽9间施加第一电压VD1，并且在分离头槽4与分离废物槽1间施加第三电压VD3。如图所示，并行地执行这两个处理。第一电压和第三电压可以大约同时开始施加。

通过调节分离分析参数(例如，分析物迁移的速度、到检测器的距离等)和反应时间段参数(例如，热循环器温度、时间、缓变率等)，这些时间段可以被调节为大约同时结束。通过大约同时结束这些步骤，从腔室11朝向预加载废物槽9移动新产生的反应产物的后续步骤可以立即开始。

虽然图7A示出由五个反应时间段和五个反应分析物组成的示例性方案，但是可以根据实验的需要自由调节反应时间段和分离分析物的数量。例如，可以在腔室中对反应溶液的内容物执行一系列至少两个、五个、十个、十五个、二十个或二十五个、或多达50个分离分析物。在第一分离分析之前可以进行任意数量的反应时间段。通过延迟分离分析的开始，产物量可以积累到更容易测量的水平。在一些实施方式中，当检测到在阈值水平之外的产物峰值时，或在检测到产物峰值之后的预定数量的反应时间段之后，停止分析。

表1的原理也可以应用于图7A的实施方式。由此，通过调节热循环和以类似方式进行的CE分离分析的数量，可以缩短整个分析时间。节省的时间量当然依赖于应用于检定的反应和分离参数。

图7B例示在执行两个反应循环并测量从两个循环中的第二个循环产生的产物的实施方式中的步骤顺序和定时的示例性方案。换言之，在图7B中，分析每隔一个反应循环。方案再次包括相同的四种步骤：(i)腔室中的反应时间段、(ii)从腔室朝向加载废物槽移动样品成分、(iii)从预加载通道朝向预加载废物槽移动样品成分、以及(iv)分离分析。在图7B中，示出六个反应时间段和每隔一个反应时间段之后产生的反应产物的后续三个分离分析物。如在与图7A比较时可以从图7B理解的，在正常进行的第一个反应时间段之后，直接插入额外的反应时间段，并且随后的步骤等待第二反应时间段的结束。然而，对于图7A的实施方式，完全处理五个循环和五个分析的时间需要470秒，而在图7B的实施方式中，六个反应循环和每隔一个的(三个)分析将仅需要430秒。进一步的时间节省将随着更多的循环来实现。

C.示例

示例1：PCR反应

1-1.器件

PCR-CE微流体器件从注塑成型的聚碳酸酯基板和聚碳酸酯膜(GE塑料，125μmLexan8010)、由层压接合而制备。图1A示出微流体器件设计。器件的整个尺寸是大约45.5mm×25.5mm×5.5mm。反应腔室具有大约350μm的深度和大约25μL的容积。加载通道、预加载通道、分离通道和侧通道各大约30μm深和40μm宽。电极在层压之前丝网印刷在聚碳酸酯膜上。如所制备的，电极位于接触添加于基板/膜层压器件中的槽的溶液。

1-2.PCR反应溶液

用于扩增大肠杆菌(E.coli)序列的引物与以下序列合成，并使用了引物对：

SEQ ID NO:1(正向引物)5’-ATCTATGACTGTACGCCACTGTCCCTAG

SEQ ID NO:2(反向引物)5’-GCCTAGCAAACTCGGAAGATT

以以下构成制备PCR反应溶液：1X Taq酶缓冲液、3mM MgCl₂、1.5U富酶泰斯(Fermentas)Taq聚合酶/25μL、0.4μM引物(每个)、0.4mM dNTP和100mg/mL BSA。扩增靶标序列(100个碱基)容纳在大肠杆菌基因组中。基因组大肠杆菌DNA作为模板以10,000份/25μL反应溶液的浓度添加。

1-3.器件加载

按照以下准备示例1-1的微流体器件以进行操作。用包括pH为8的200mM TAPS缓冲液、2.5％聚二甲基丙烯酰胺筛分基质、和溴化乙锭二聚物荧光染料的分离凝胶，该分离凝胶填充分析通道网络。示例1-2的PCR反应溶液(25μL)加载到接入槽6中，并且通过毛细作用传送到腔室11。槽7填充有PCR缓冲液。其他槽填充有分离凝胶或标记或富集染料。试剂的分布在以下表格中示出。最终，15μL的20cst硅油添加于槽5和6(到反应腔室的入口)和槽7。

凝胶缓冲液：3mM MgCl₂、200mM TAPS、pH8.0

凝胶：2.5％PDMA31-146、凝胶缓冲液中的0.15μM EthD

富集染料：0.2μM5-羟基四甲基若丹明(TAMRA)、凝胶缓冲液中0.15μM EthD

标记：Fermentas NoLimits DNA：凝胶缓冲液中15、300、500bp(各1ng/μl)

PCR缓冲液：1倍Taq酶缓冲液、3mM MgCl₂、0.4mM dNTP、100mg/ml牛血清白蛋白(BSA)

将经加载的微流体器件放置在由连接到热电加热器/冷却器模块(Model HV56、Nextreme、Durham、NC)的扁平铜板组成的热循环器件(未示出)上。给Li等人的美国预授权公报2010/0200402(申请号12/600,171)(这里通过引证的方式将其全部内容并入)中公开的集流管降低到微流体器件的槽上，这使得在所有槽上方压力密封。20psi的压力通过支管器件等同施加于所有槽。

1-4.器件操作

由示例1-3制备的加载微流体器件的实时PCR-CE分析如下执行。用以下变性、退火和延长温度和延长时间，对PCR热循环方案进行程序化：

循环1：98℃达60秒、58℃达14秒并且77℃达8秒。

循环2-16：98℃达7秒、62℃达14秒并且77℃达8秒

循环17-结束：98℃达7秒、62℃达14秒并且77℃达39秒

首先，执行16个循环。然后，随着循环17开始，在各个PCR循环之后通过电泳从腔室移除PCR反应溶液的样品成分、移动到分离通道、并通过电泳进行分析。各个槽中的电极处的电势或电流根据以下方案控制：

第一步骤、第二步骤和第三步骤对应于如图3A-图3C所述的施加第一电压、第二电压和第三电压的施加。在开始PCR循环17之后29秒，初始化方案。电势和电流控制的第一步骤应用达10秒，第二步骤条件应用达21秒，并且第三步骤条件应用达29秒，然后重复用于第一步骤、第二步骤和第三步骤的电势和电流控制的方案，直到PCR反应的结束为止。

1-5.结果

通过执行示例1-4中描述的PCR和电泳方案，反应产物的样品以循环17开始在各个循环之后收回，并且经过毛细电泳分析。分析循环20、22、24、26、28、30、32、34和36的产物的电泳图在图8A示出(从左至右、从上方行到下方行)。在分析循环20的电泳图中，在左上部，三个标记峰值容易显见。三个峰值分别是15、300和500个碱基对标记。期望的扩增子(100个碱基对)峰值由箭头指示。期望的扩增子峰值在右上电泳图(分析循环24)中恰好是可感知的，并且在所示的最后电泳图(分析循环36)中主导电泳图。

图8B示出随着循环数量变化的针对相同的实验，产物(即，扩增子量)的生长曲线。

图9A示出针对如上所述执行的一系列实验的生长曲线，其中，实验中包括的靶标DNA的量是10¹、10²、10³和10⁴每25μL反应溶液。结果指示甚至使用这里描述的器件、方法和系统，检测到甚至最低份数(10份)。图9B示出交叉阈值对添加于图9A中报告的实验的份数日志的图。数据具有线性相关。

示例2：RT-PCR反应

2-1.器件

使用示例1-1中描述的器件。

2-2.RT-PCR反应溶液

用于扩增丙型肝炎病毒(HCV)和MS2抗菌素(RNA噬菌体)的引物被制备并包括在RT-PCT反应溶液中。而且，在本示例中，各个引物中的一个引物用荧光染料、5-羟基四甲基若丹明(TAMRA)标记。

HCV引物：

SEQ ID NO：35’-(TAMRA)-GAAAGCGTCTAGCCATGGCGT-3’

SEQ ID NO：45’-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCA-3’

MS2引物：

SEQ ID NO：55’-GGTATAGTGTGGGAAAAGGTG-3’

SEQ ID NO:65’-(TAM RA)-ACGAGAACG AACTG AGTAAAG-3’

检定被设计为具有两种内参照。MS2RNA噬菌体用于控制RNA提取和提纯过程。由噬菌体RNA的MS2引物进行的成功扩增以制造380bp扩增子指示检定过程将足以从HCV病毒颗粒提取HCV RNA。将MS2抗菌素用作用于RT-PCR检定的内参照由2005年Journal ofClinical Microbiology,第43(9)卷、第4551-4557页中Dreier等人描述。质粒还包括在合并可以由HCV引物对扩增的序列的反应溶液(以下)中。由此，如果HCV存在在样品中，则HCV引物对将制造两个不同的扩增产物：一个产物来自内参照质粒，并且一个产物来自HCV病毒颗粒。各个扩增子长度对于内参照是440bp并且对于HCV是250bp。来自内参照质粒的扩增产物的外观对PCR反应的正确条件进行控制。

RT-PCR反应溶液用以下组成来制备：

HCV高阳性对照病毒颗粒从Acrometrix(贝尼西亚加利福尼亚州(Benicia，CA))获得，该颗粒是根据世界卫生组织标准NIBSC96/798调整的产物。MS2抗菌素(菌株15597-B1)从Vrapur(圣迭戈，加利福尼亚州(San Diego，CA))获得。

成分被组合、被完全涡动并且短暂地旋转，30μL被传送到Bioneer RT预混合管(K-2041(Bioneer、阿拉米达，加利福尼亚))，其含有RTase酶、dNTP、Rnase抑制剂、反应缓冲液、跟踪染料和有专利的稳定剂的冻干混合物。管内容物留在腔室温1分钟，然后被涡动、短暂地旋转，并且28μL的内容物被传送到器件的腔室。

2-3.器件加载

按照以下准备示例2-1的微流体器件以进行操作。用包括pH为8的200mM TAPS缓冲液和3％聚二甲基丙烯酰胺筛分基质的分离凝胶填充分析通道网络。首先，15μL的分离凝胶添加到槽1，并且槽1上方的正压力用于将凝胶引入到通道网络中。然后，15μL的分离凝胶添加于槽3、4和9中的每一个。接着，15μL的富集染料添加于槽2，然后15μL的DNA标记溶液添加于槽8。示例2-2的PCR反应溶液(28μL)经由槽5添加于腔室。在完全填充腔室之后，15μL的分离凝胶缓冲液添加于槽7，并且轻压力施加于在槽7上方达10秒。最终，15μL的20cst硅油添加于槽5和6(到反应腔室的入口)和槽7。

在表中总结试剂的分布，并且在其下面列出溶液成分。

富集染料：凝胶缓冲液中0.2μM5-羟基四甲基若丹明(TAMRA)

凝胶缓冲液：3mM MgCl₂、200mM TAPS、pH8.0

凝胶：凝胶缓冲液中的3％PDMA31-146

PCR缓冲液：1X KOD缓冲液、3mM MgCl₂、200mM TAPS(pH8.0)、0.2％液体生物防腐剂300

DNA标记：凝胶缓冲液中用TAMRA标记的300和500个碱基对dsDNA(各1ng/μL)

如示例1-3中描述的，将经加载的微流体器件放置在热循环器件上。

2-4.器件操作

由示例2-3制备的加载微流体器件的实时RTPCR-CE分析如下执行。

通过在42℃培养微粒体器件20分钟，执行反向逆转录酶(RT)反应。

用以下变性、退火和延长温度和延长时间，对PCR热循环方案进行程序化：

循环1-14：101℃达7秒、60℃达14秒并且74℃达8秒。

循环15-40：101℃达7秒、62℃达14秒并且77℃达39秒

在执行14个循环之后，随着循环15开始，在各个PCR循环之后通过电泳从腔室移除PCR反应溶液的样品成分、移动到分离通道、并经由电泳进行分析。各个槽中的电极处的电势或电流根据以下方案控制：

第一步骤、第二步骤和第三步骤对应于如图3A-图3C所述的施加第一电压、第二电压和第三电压。在开始PCR循环17之后29秒，初始化方案。电势和电流控制的第一步骤应用达10秒，第二步骤条件应用达21秒，并且第三步骤条件应用达29秒，然后重复用于第一步骤、第二步骤和第三步骤的电势和电流控制的方案，直到PCR反应的结束为止。

2-5.结果

在执行示例2-4中描述的PCR和电泳方案时，反应产物的样品以循环15开始在各个循环之后收回，并且经过毛细电泳(CE)分析。

通过执行示例2-4中描述的PCR和电泳方案，反应产物的样品以循环15开始在各个循环之后收回，并且经受毛细电泳分析。分析由循环23、24、25、26、27、28、29、30和31产生的产物的电泳图在图10A示出(从左至右、从上方行到下方行)。在分析循环23的产物的电泳图中，在左上部，两个标记峰值容易显见。两个峰值分别是300和500个碱基对标记。期望的扩增子(100个碱基对)峰值由箭头指示。期望的HCV扩增子峰值在右上电泳图(循环25中产生)中恰好是可感知的。MS2和内参照(IC)峰值从循环28开始出现。

用于HCV靶标的HCV的峰值的生长、MS2控制和PCR内参照展示了RNA从病毒颗粒提取，RNA由RT转换为DNA，DNA经由PCR扩增，并且从反应腔室收回扩增子产物、运送到分离通道并成功地由CE分析。

图10B示出针对相同的实验，产物和两种控制的生长曲线，即，扩增子量作为循环数的函数。如图10B所示，扩增子量与阈值2交叉的循环数(Cq)对于HCV是28.0，对于PCR内参照是30.6，并且对于MS2是33.6。

示例3：每隔一个循环进行采样的PCR反应

3-1.器件

使用示例1-1中描述的器件。

3-2.PCR反应溶液

用于扩增抗菌素-λ基因组的200个碱基区域的引物与以下序列合成，并且用于制备PCR反应溶液。反向引物用荧光染料，5-羟基四甲基若丹明(TAMRA)标记。

噬菌体-λ引物：

SEQ ID NO:7(正向引物)5’-CGGGATAACACGCTCACCTGA

SEQ ID NO:8(反向引物)5’-TAMRA-GGCCAGACCGAGCCTTCAATAC

以以下成分制备PCR反应溶液：1X PCR缓冲液(参见下面)、0.4mM dNTP、0.05U/μLKOD外(-)聚合酶、0.2％Procline300(Supelco，48912-U)、1％CHAPS(Dojindo实验腔室，C-008)、0.1％Olfine(Nissin，AK-02)、0.2μM正向引物、0.2μM反向引物。从Sigma-Aldrich获得的Lambda噬菌体DNA(产物D9768)作为模板以10,000份/25μL的反应溶液的浓度添加。

3-3.器件加载

按照以下准备示例3-1的微流体器件以进行操作。如示例2-3所述，用包括pH为8的200mM TAPS缓冲液和3％聚二甲基丙烯酰胺筛分基质的分离凝胶填充分析通道网络。示例3-2的PCR反应溶液(25μL)加载到接入槽6中，并且经由毛细作用递送到腔室11。槽7填充有PCR缓冲液。硅油(15μL；20cst)添加于槽5和6(到反应腔室的入口)和槽7。如下表所示，其他槽填充有如试剂的分布指示的分离凝胶或富集染料的标记。

富集染料：凝胶缓冲液中0.2μM5-羟基四甲基若丹明(TAMRA)

凝胶缓冲液：3mM MgCl₂、200mM TAPS、pH8.0

凝胶：凝胶缓冲液中的3％PDMA31-146

如示例1-3中描述的，加载的微流体器件安装在热循环器件上。

3-4.器件操作

由示例3-3制备的加载微流体器件的实时PCR-CE分析如下制备。用以下变性、退火和扩展温度和延长时间，对PCR热循环方案进行编程：

循环1：104℃达120秒、63.8℃达14秒并且74.5℃达8秒。

循环2-16：101℃达7秒、63.8℃达14秒并且74.5℃达8秒。

循环17：101℃达7秒、63.8℃达14秒并且74.5℃达59秒。

重复以下直到检定结束：

循环18(偶数)：101℃达7秒、63.8℃达14秒并且74.5℃达39秒。

循环19(奇数)：101℃达7秒、63.8℃达14秒并且74.5℃达8秒。

首先，执行17个循环。然后，随着循环18和19开始，PCR反应溶液的样品成分在各个偶数PCR循环(一对循环(例如，循环18、20)中的第一循环等)之后通过电泳29秒从腔室移除、移动到分离通道、并通过电泳进行分析。该定时图由图4C反映。各个槽中的电极处的电势或电流根据以下方案控制：

第一步骤、第二步骤和第三步骤对应于如图3A-图3C所述的第一电压、第二电压和第三电压的施加。在开始PCR循环18之后29秒，初始化方案。电势和电流控制的第一步骤应用达10秒，第二步骤条件应用达21秒，并且第三步骤条件应用达29秒，然后重复用于第一步骤、第二步骤和第三步骤的电势和电流控制的方案，直到PCR反应的结束为止。

3-5结果

通过执行示例3-4中描述的PCR和电泳方案，反应产物的样品以循环18开始在偶数循环之后收回，并且在微流体器件中经过毛细电泳分析。图11A示出分析由循环18、20、22、24、26、28、30、32和34的产物的一系列电泳图。在电泳图中，DNA标记峰值容易出现在大约25秒(300bp标记)和30秒(500bp标记)。大约15秒处的峰值是引物，并且200bp靶标扩增子(由箭头指示)出现在大约22秒。期望的扩增子峰值在中上电泳图中恰好可感知(循环20的产物)，并且在所示的最后电泳图中使该电泳图主导(循环34的产物)。图11B示出来自四个重复试验的、作为PC循环数的函数的靶标扩增子的量的生长曲线，并且展示了方法的再现性。

虽然已经相对于具体实施方式和应用描述了本发明，但是本领域技术人员将理解本文公开的本发明的应用和方法的范围。

Claims

1.一种用于分析微流体器件中的样品成分的方法，该微流体器件包括：腔室；加载通道，该加载通道从所述腔室通向加载废物槽；分离通道，该分离通道从分离头槽通向分离废物槽并且与所述加载通道交叉；以及预加载通道，该预加载通道在所述腔室与所述加载通道/分离通道交叉点之间的位置处从所述加载通道通向预加载废物槽，所述方法包括以下步骤：

(a)将检定溶液添加到所述腔室中；

(b)在所述腔室与所述加载废物槽间施加第一电压达第一持续时间，以(i)将在第一时间从所述检定溶液移除、且先前移动到所述加载通道中的第一组样品成分移动到加载通道/分离通道交叉区域并且(ii)将在第二时间从所述检定溶液移除的第二组样品成分从所述腔室移动到所述加载通道中；

(c)在步骤(b)之后，在所述腔室与所述预加载废物槽间施加第二电压达第二持续时间，以继续将在第二时间从所述检定溶液移除的所述第二组样品成分从所述腔室和所述加载通道中朝向所述预加载废物槽移动；以及

(d)在步骤(b)之后，在所述分离头槽与分离废物槽间施加第三电压达第三持续时间，以将所述第一组样品成分从所述加载通道/分离通道交叉区域注入到所述分离通道中并且对所述分离通道中的所述第一组样品成分执行分析，

其中，沿着加载通道从腔室到加载通道/分离通道交叉点的距离为距离A，从加载通道/预加载通道接合点(15)到加载通道/分离通道交叉点(16)的距离为距离B，距离A和距离B满足以下条件：

(1)ν_fast(t_load)<距离A

(2)ν_slow(t_load+t_preload+t_load)>距离A

(3)ν_slow(t_load)>距离B

其中，ν_fast是分析样品中最快成分的动电速度，ν_slow是分析样品中最慢成分的动电速度，t_load是第一持续时间，t_preload是第二持续时间。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)和(d)至少在时间上部分交叠。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(c)在步骤(d)结束之前结束。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(c)在步骤(b)结束时开始。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(d)在步骤(b)结束时开始。

6.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(b)在步骤(d)结束之后重复。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(b)、(c)和(d)的循环重复至少10次。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品成分通过电泳移动。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包括至少一种多核苷酸。

10.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：在步骤(a)之后在所述腔室中执行至少一个核酸扩增反应。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，以下步骤(b)-(e)的序列至少重复两次：

步骤(b)；

步骤(c)；

步骤(d)；和

(e)在步骤(c)结束时开始执行至少一个扩增循环，

其中，

在步骤(d)和步骤(e)结束之后开始后续的步骤序列。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，

第一次执行步骤(b)-(e)的序列时省略步骤(d)。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，

最后一次重复步骤序列时，所述步骤序列只包括步骤(b)和步骤(d)。

14.根据权利要求11所述的方法，其中，

当结束各个步骤(b)时，开始步骤(c)和步骤(d)；并且

在各个步骤(e)中执行一个扩增循环，该扩增循环在各个步骤(c)结束时开始。