KR100593263B1 - 연속 흐름상 반응 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시간에 따른 반복적인 온도조절이 필요한 반응에 응용하기 위한 연속 흐름상 반응 장치에 관한 것으로, 서로 다른 온도로 조절되는 둘 이상의 고체상 가열 블록, 및 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지며 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 허용하는 모세관을 포함하고, 상기 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다.

본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치는 연속적으로 흐르는 유체를 반응시키는데 유용하게 이용될 수 있으며, 특히 중합효소 연쇄반응에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

연속 흐름상 반응 장치{HIGH THROUGHPUT DEVICE FOR PERFORMING CONTINUOUS-FLOW REACTIONS}

도 1a 및 도 1b는 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치의 하나의 실시태양을 도시한 것이다.

도 2a 및 도 2b는 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치의 다른 하나의 실시태양을 나타낸 개략도 및 실제 제조한 사진을 각각 도시한 것이다.

도 3a는 본 발명에 따른 다중 연속 흐름상 반응 장치를 제조하기 위하여 모세관이 감긴 가열 블록-단열 블록 조립체를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.

도 3b는 본 발명에 따른 예시적인 다중 연속 흐름상 반응 장치의 평면도이다.

도 3c는 본 발명에 따른 예시적인 다중 연속 흐름상 반응 장치의 정면도이다.

도 3d는 일예로서 제조한 본 발명에 따른 다중 연속 흐름상 반응 장치의 사진이다.

도 3e는 도 3d의 장치에 모세관을 감고 히터와 센서를 장착한 본 발명에 따른 다중 연속 흐름상 반응 장치의 사진이다.

도 4는 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치에 실시간 검출 장치를 연결한, 연속 흐름상의 실시간 반응 검출을 위한 장치의 예시도이다.

도 5는 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치로 PCR을 수행한 후, 시료의 DNA 증폭 여부를 확인한 겔 사진이다.

도 6은 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치에 서로 다른 조성을 갖는 PCR 혼합용액을 순차적으로 주입하여 PCR을 수행한 후, 시료의 DNA 증폭 여부를 확인한 겔 사진이다.

<도면의 주요 부호에 대한 설명>

11, 21, 22, 23, 31, 32, 33... 가열 블록

12... 단열 블록 13... 모세관

27... PCR 혼합용액 28... 증폭된 DNA

41... 레이저 광선 42... 형광

43... 이색거울 44... 대물렌즈

본 발명은 연속적으로 흐르는 유체를 반응시키기 위한 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 중합효소 연쇄반응과 같이 시간에 따른 반복적인 온도조절과 반복 반응이 요구되는 반응을 수행하는 고체상 가열 블록과 모세관을 포함하는 연 속 흐름상 반응 장치에 관한 것이다.

DNA는 다른 생체 분자들과는 달리 생체 밖에서의 인위적인 복제가 가능하다. 이는 1983년에 뮬리스 등(Mullis et al.)에 의해 개발된 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)이라는 DNA 복제 기술에 의한 것이다. PCR은 효소를 이용한 반응 방법으로 효소의 종류에 따라서 두 가지 또는 세 가지 온도의 반복적인 조절이 요구된다.

일반적으로 PCR 단계는 복제할 대상인 이중가닥 주형 DNA(template DNA)를 단일가닥으로 풀어주는 변성(melting) 단계, 풀어진 단일 가닥에 반응이 시작될 곳을 지정해주며 효소 반응이 시작하는 것을 도와주는 수십 bp 정도의 프라이머를 결합시키는 어닐링(annealing) 단계, 그리고 프라이머가 붙은 위치부터 DNA를 복제해 완전한 이중 나선 구조의 DNA를 만드는 연장(extension) 단계 등 세 단계로 구분되어진다. 상기 세 단계가 완료되면 DNA는 원래의 양보다 이론적으로 2배가 증가하게 되며, 이 과정을 반복적으로 n번 수행했을 경우 최종적으로 DNA의 양은 원래의 양에 비해 이론적으로 2ⁿ배가 된다. 일반적인 PCR 장치에는 온도조절이 가능한 가열 블록(heating block)이 사용되며, 상기 가열 블록은 PCR 용기의 삽입이 가능하도록 디자인되어 있다. PCR은 상기 가열 블록에 PCR 용기를 삽입하고 일정한 시간 간격에 따른 온도의 변화를 반복적으로 조절하여 수행된다.

한편, PCR을 성공적으로 수행하기 위한 중요한 요소 중 한 가지가 온도의 조 절이다. PCR의 3단계의 온도 중에서도 특히 어닐링 단계의 온도를 적절히 조절하는 것이 매우 중요한데, 이는 어닐링 단계의 온도가 적절하지 못하면 증폭의 효율이나 특이성이 매우 감소하여, 순수하며 충분한 양의 DNA를 얻을 수 없기 때문이다. 나아가, DNA 증폭 도중에 PCR 효율을 알 수 있는 실시간 검출 수단 또한 매우 중요한데, 이는 PCR 완결에 소요되는 시간이 일반적으로 수 시간임을 감안할 때 PCR의 성공 여부를 신속히, 그리고 연속적으로 판단하는 것이 매우 유리하기 때문이다.

1990년대 초반부터 작은 크기의 칩(chip) 상에서 물질의 분석과 반응 등 일련의 과정을 수행할 수 있는 랩온어칩(lab-on-a-chip) 기술이 발달하면서, 칩 상에서 PCR을 할 수 있는 기술들 또한 활발히 개발되고 있다(Northrup et al., Anal. Chem. 1998, 70, 918-922; Waters et al., Anal. Chem. 1998, 70, 5172-5176; Cheng et al., Nucleic Acids Res. 1996, 24, 380-385). 특히 많은 종류의 DNA에 대한 분석을 하나의 칩에서 원활히 수행하기 위해서 유체의 연속적인 흐름상에서 PCR을 수행할 수 있는 장치 및 방법의 개발이 중요하게 대두되었다.

이러한 장치를 구현하기 위해 1998년 만츠 등(Manz et al., Science, 1998, 280, 1046-1048)은 온도조절이 가능하도록 제작한 세 개의 구리 블록을 일렬로 배열하여 각각의 구리 블록을 순서대로 변성, 연장 및 어닐링 단계를 수행하는 온도로 조절하고, 상기 구리 블록 위에 미세 채널을 가지는 유리 칩을 올려놓고 채널 내에 PCR 혼합 용액이 흐르게 함으로써 연속적인 유체의 흐름상에서 PCR을 구현할 수 있는 장치를 개발하였다. 그러나, 변성, 연장 및 어닐링 단계를 수행하는 구리 블록의 일렬배열이 온도의 완만한 감소(95℃ -> 72℃ -> 60℃)에는 적합할지 몰라도, 단일 가닥으로 나누어진 DNA 시료가 어닐링 온도에 다다르기 전에 상당 시간동안 연장 온도의 블록 위를 통과하게 되어 반응의 특이성을 떨어뜨리는 단점으로 작용할 수 있기 때문에 가열 블록이 변성, 어닐링 및 연장의 순으로 배열된 새로운 장치의 개발이 필요하였다.

이에 퀘이크 등(Quake et al., Electrophoresis, 2002, 23, 1531-1536)은 종래 가열 블록의 일렬배열 대신 변성, 어닐링 및 연장 단계를 수행하는 온도로 설정된 가열 블록의 원형 배열을 통하여 이러한 문제를 해결하고자 하였다.

한편, 로에라드 등(Roeraade et al., J. Anal. Chem. 2003, 75, 1-7)은 서로 다른 온도로 조절되며, 원형으로 이어져 있는 수조를 제작하고 이들의 사이 벽에 조그만 구멍을 여러 개 내고, 여기에 테프론(Teflon) 튜브를 통과시켜 수조에 감는 방법을 이용하여 모세관 속에서 연속 흐름상의 PCR이 가능한 장치를 제작하였다. 그러나, 온도 조절 매체로 물을 사용함으로써 온도 조절을 위해 별도의 교반 장치가 필요하고, 덮개를 씌우지 않은 상태에서는 물의 증발로 인해 계속적인 물의 보충이 필요하며, 이러한 이유로 장치의 소형화 및 편리한 운용에 제약이 따르는 단점이 있었다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적 은 중합효소 연쇄반응과 같이 시간에 따른 반복적인 온도조절과 반복 반응이 요구되는 반응을 수행하는, 고체상 가열 블록과 모세관을 포함하는 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 이용한 고성능 연속 흐름상 핵산 증폭 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서로 다른 온도로 조절되는 둘 이상의 고체상 가열 블록, 및 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지며 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 허용하는 모세관을 포함하고, 상기 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는, 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 반응 장치에서 상기 가열 블록과 접촉하고 각각의 가열 블록이 서로 직접적으로 접촉하지 않도록 배열된 단열 블록을 포함하는 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 상기 고성능 연속 흐름상 반응 장치의 모세관의 제1 말단에 PCR 혼합용액을 주입하는 단계; 및 (2) 적정한 속도로 용액의 흐름을 제어하면서 제2 말단으로부터 배출되는 PCR 산물을 회수하는 단계를 포함하는, 고성능 연속 흐름상 핵산 증폭 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 모세관 내에 흐르는 연속 흐름상의 유체에 대한 반응, 예컨대 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)을 연속적이며 다중으로 수행할 수 있는 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다는 데에 특징이 있다.

구체적으로, 본 발명은 서로 다른 온도로 조절되는 둘 이상의 고체상 가열 블록, 및 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지며 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 허용하는 모세관을 포함하고, 상기 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는, 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다.

상기 반응 장치는 상기 가열 블록과 접촉하고 각각의 가열 블록이 서로 직접적으로 접촉하지 않도록 배열된 단열 블록을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 장치는 구체적으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 데에 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 장치에 있어서, 각각의 고체상 가열 블록은 모세관의 특정 부위에 열을 가하는 역할을 하며, 히터 및 온도 센서에 의해 서로 다른 온도로 조절될 수 있다. 히터와 온도 센서는 가열 블록에 부착되거나 가열 블록에 형성된 구멍에 삽입될 수 있다.

상기 가열 블록의 재질로는 열전도성이 우수한 물질이면 한없이 사용될 수 있다. 구체적으로 구리, 철, 알루미늄, 황동, 금, 은, 백금 등의 금속성 물질인 것이 바람직하고, 열전도성이 높은 고분자 물질도 사용될 수 있다.

상기 단열 블록은 각각의 가열 블록간의 열전달을 방지하는 역할을 한다. 상기 단열 블록의 재질로는 열전도성이 거의 없는 절연성 물질이면 제한없이 사용될 수 있으나, 벡크라이트(bakelite) 또는 아크릴 고분자 수지를 이용하는 것이 바람직하다.

상기 가열 블록과 단열 블록의 형상에 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 필요에 따라 원통형, 타원형, 각형 등의 형상으로 제조될 수 있다.

상기 모세관은 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지고, 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 가능하게 하여 유체의 이동 통로 및 반응 공간으로서의 역할을 수행한다. 상기 모세관은 상업적으로 이용가능한 모세관이면 제한없이 사용될 수 있으며, 재질은 유리, 고분자 등 다양한 종류가 가능하지만, 바람직하게는 100℃ 이상의 열에 잘 견디고, 수용액이나 유기 용매 등이 침투하지 않는 유리, 용융 실리카, 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene; PTFE, 상품명:테프론) 또는 폴리에틸렌인 것이 바람직하다.

특히, 상기 모세관의 재질이 유리인 경우에는 본 발명의 일태양에 따른 장치를 제조하는 과정에서, 예컨대, 모세관을 가열 블록에 원형으로 감는 과정에서 모세관이 깨지지 않도록 모세관의 외벽을 폴리이미드 또는 PTFE 등으로 코팅하는 것이 바람직하다. 한편, 상기 모세관을 실시간 반응 검출을 위한 장치에 사용하는 경우에는 광선이 통과할 수 있도록 투명한 모세관을 사용하는 것이 바람직한데, 모 세관의 외벽이 폴리이미드로 코팅된 경우에는 광선이 조사되고 형광이 나오는 부분의 코팅을 제거하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 모세관의 내벽은 DNA나 단백질의 흡착을 방지하기 위해 실란(silane)류의 물질로 코팅하는 것이 바람직하고, 이러한 코팅은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 상기 실란류의 물질은 유리 표면과 반응하여 소수성기를 나타내는 물질들이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 트리메틸클로로실란, 디메틸디클로로실란, 메틸트리클로로실란, 트리메틸메톡시실란, 디메틸디메톡시실란 및 메틸트리메톡시실란으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질이 바람직하다.

상기 모세관의 직경과 길이는 모세관 내에 흐르는 유체의 종류 및 수행하는 반응의 종류 등에 따라 다양하지만, 직경은 내경이 10 내지 300㎛, 외경이 50 내지 500㎛의 범위인 것이 바람직하고, 길이는 0.5m 내지 5m의 범위를 갖는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 반응 장치에 있어서, 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록과 접촉하도록 하는 것은 가열 블록의 외면에 모세관을 감는 것에 의해 달성될 수 있다. 가열 블록의 외면에 모세관을 감는 방법으로는 가열 블록의 외면에 일정 크기와 일정 간격을 갖는 나선형 홈을 형성한 후, 상기 나선형 홈에 모세관을 고정하는 방법을 이용할 수 있다. 상기 나선형 홈의 크기와 간격은 고정하는 모세관의 직경에 따라 달라질 수 있지만, 대략 깊이는 100㎛ 내지 500㎛, 폭은 100 ㎛ 내지 500㎛, 그리고 간격은 100㎛ 내지 1000㎛를 갖도록 형성하는 것이 바람직하다.

상기 모세관은 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록에 순차적으로 1회 접촉할 수도 있고, 반복적으로 2회 이상 접촉할 수도 있다. 가열 블록에 감기는 모세관의 횟수는 반응의 종류, 반응의 정확도, 요구되는 반응 산물의 양, 반응시료의 초기 양 등에 따라 다양하지만, 10회 내지 50회, 보다 바람직하게는 20회 내지 30회 감는 것이 바람직하다.

한편, 상기 고성능 연속 흐름상 반응 장치의 각각의 가열 블록의 온도를 PCR을 수행하는데 요구되는 반응 온도로 설정하고, 유체로 PCR 혼합용액을 모세관에 주입한다면, 상기 반응 장치를 이용하여 PCR을 수행할 수 있다.

따라서, 본 발명은 (1) 상기 고성능 연속 흐름상 반응 장치의 모세관의 제1 말단에 PCR 혼합용액을 주입하는 단계; 및 (2) 적정한 속도로 용액의 흐름을 제어하면서 제2 말단으로부터 배출되는 PCR 산물을 회수하는 단계를 포함하는, 고성능 연속 흐름상 핵산 증폭 방법을 제공한다.

일반적으로 PCR은, (a) 주형 DNA인 이중가닥 DNA(dsDNA)를 단일가닥 DNA(ssDNA)로 나누는 변성(melting) 단계, (b) 상기 단일가닥 DNA에 프라이머가 결합하는 어닐링(annealing) 단계, 그리고 (c) 상기 프라이머가 붙은 위치부터 DNA를 합성해 이중가닥 DNA를 만드는 연장(extension) 단계의 3단계로 이루어지며, 각 단계의 반응을 수행하는데 요구되는 온도조건과 적정반응을 수행하기 위한 시간조건 이 있다. 이러한 온도 및 시간조건은 주형 DNA의 염기서열과 프라이머, 그리고 사용되는 중합효소 또는 촉매의 종류 등 개별 PCR 반응조건에 따라 다를 수 있지만, 구체적으로, 변성 단계는 95~100℃에서 1~60초, 어닐링 단계는 45~65℃에서 1~120초, 그리고, 연장 단계는 주로 65~72℃에서 30~120초로 수행하는 것이 바람직하다.

상기 핵산 증폭 방법에 있어서, 고성능 연속 흐름상 반응 장치의 각각의 가열 블록의 온도는 위에서 언급한 변성, 어닐링 및 연장온도로 설정되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 각각 약 95℃, 60℃ 및 72℃로 설정되는 것이 바람직하다.

상기 모세관이 변성, 어닐링 및 연장온도에 맞도록 설정된 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하게 되므로, 모세관 내에 주입된 PCR 혼합용액도 상기 온도 범위를 순차적으로 또는 반복적으로 지나면서 핵산(DNA)이 증폭되게 된다.

상기 핵산 증폭 방법에 있어서, 상기 모세관이 가열 블록에 반복적으로 접촉하는 횟수는 PCR 싸이클 횟수가 된다. 상기 횟수는 경우에 따라 다를 수 있지만, 10회 내지 50회, 보다 바람직하게는 20회 내지 30회인 것이 바람직하다.

PCR 혼합용액은 PCR을 수행하기 위해 요구되는 반응 물질을 포함하며, 구체적으로, MgCl₂, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합액, 프라이머, 내열성 DNA 중합효소, 내열성 DNA 중합효소 완충용액 및 주형 DNA를 포함한다. 한편, 실시간 PCR(real-time PCR)에서의 용이한 검출을 위하여, 상기 프라이머로는 분자 표지(molecular beacon)가 이용될 수 있고, 상기 PCR 혼합용액에 인터칼레이팅 염 료(intercalating dye)가 추가로 포함될 수 있다.

상기 분자 표지는 어닐링 후에 형광 검출이 가능하도록 고안된 특별한 형태의 프라이머를 말한다. 분자 표지는 보통 수십개의 염기로 이루어지며, 양쪽 말단에는 형광을 낼 수 있는 형광물질과 그 형광에 대한 소광제(quencher)가 각각 존재한다. 상기 분자 표지는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하는데, 이 때는 형광물질과 소광제가 근접해 있어 형광발생이 억제된다. 하지만, 상기 분자 표지가 PCR의 어닐링 단계에서 주형 DNA에 어닐링되면, 이 때는 형광물질과 소광제와의 거리가 멀어져 소광제에 의한 억제가 해소되므로 분자 표지상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. PCR을 수행함에 따라 주형 DNA의 양이 증가하게 되고 이에 따라 주형 DNA와 어닐링되는 분자 표지의 양도 증가하게 되므로, 분자 표지를 이용하여 형광 정도를 측정함으로써 PCR의 매 반응 싸이클에서의 DNA 증폭 정도를 실시간으로 관찰할 수 있게 된다.

상기 인터칼레이팅 염료는 이중가닥 DNA에 특이적으로 결합하여 형광을 방출하는 것으로서, EtBr(Ethidium bromide)과 같이 당업계에서 인터칼레이팅 염료로 알려진 것이면 제한없이 사용될 수 있고, SYBR GREEN^TM과 같이 상업적으로 이용가능한 염료도 사용될 수 있다. 상기 인터칼레이팅 염료는 PCR로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 증폭 방법에 있어서, 모세관에 PCR 혼합용액을 주입하 고 용액의 흐름을 제어하기 위해서는 주사기 펌프를 이용하는 것이 바람직하며, 주사기 펌프에 의해 PCR 혼합용액은 모세관의 제1 말단에서 제2 말단까지 이동하게 된다. 용액의 이동속도는 PCR 반응조건에 따라 다양하며, 최적의 PCR 결과를 얻을 수 있도록 매 반응마다 조절될 수 있다. 구체적으로, 모세관 내에 주입된 PCR 혼합용액의 이동속도는 0.1㎕/min 내지 5㎕/min의 범위인 것이 바람직하다.

상기 PCR 혼합용액은 모세관에 연속적 또는 단속적으로 주입될 수 있다, 서로 다른 조성을 갖는 PCR 혼합용액이 단속적으로 주입되는 경우 '시료 이월(carryover)'이 문제될 수 있다. '시료 이월'이란 앞에 지나간 시료에 의해 뒤에 따라가는 시료가 오염되는 것을 말한다. 이를 방지하기 위해서는 각각의 시료가 공기층이나 브로모페놀 블루(bromophenol blue)와 같이 시료와 섞이지 않는 유기 용매 등에 의해 나누어지도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 앞에 지나간 시료에 의해 뒤에 따라가는 시료가 오염되는 것을 방지하기 위해 시료의 주입 사이에는 공기층 또는 유기 용매 등과는 별도로 물 또는 완충 용액과 같은 용매를 삽입하여 먼저 지나간 시료의 잔재를 씻어주는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치의 구체적인 실시태양을 도면을 참조하여 설명한다.

본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치는 서로 다른 온도로 조절되는 둘 이상의 고체상 가열 블록(11)의 둘레에 모세관(13)을 감아올림으로써 제조될 수 있다(도 1a 및 도1b 참조). 상기 가열 블록(11)은 병렬 또는 직렬로 나열될 수 있 으며, 상기 모세관(13)은 가열 블록 둘레에 감겨서 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록과 접촉하게 된다. 도 1a에 도시된 반응 장치와 같이, 병렬로 나열된 가열 블록(11)의 둘레에 모세관(13)이 감긴 경우, 상기 모세관에 주입되는 유체는 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 2회 이상 통과하면서 반응하게 되지만, 도 1b에 도시된 반응 장치와 같이, 직렬로 나열된 가열 블록(11)의 둘레에 모세관(13)이 감긴 경우에는 상기 모세관 내의 유체는 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록을 순차적으로 통과하면서 반응하게 된다.

또한, 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치에는 각각의 가열 블록의 온도 조절을 보다 용이하게 하기 위하여, 가열 블록끼리 서로 직접적으로 접촉하지 않도록 배열된 단열 블록이 포함될 수 있다.

상기 장치의 일예로, 본 발명은 (1) 서로 다른 온도로 조절되는 세 개의 고체상 가열 블록; (2) 상기 가열 블록과 접촉하고 각각의 가열 블록이 서로 직접적으로 접촉하지 않도록 배열된 단열 블록; 및 (3) PCR 혼합용액 주입구인 제1 말단과 PCR 산물 배출구인 제2 말단을 가지며, 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 용액의 흐름을 허용하는 모세관을 포함하고, 상기 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 세 개의 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉함으로써 PCR을 수행하는 장치를 제공한다.

상기 PCR을 수행하는 반응 장치의 일예가 도 2a 및 도 2b에 도시되어 있다. 도 2a에는 하나의 단열 블록(12)에 서로 다른 온도로 조절되는 세 개의 가열 블록(21, 22, 23)이 조립되고, 상기 가열 블록의 외면에 모세관이 감겨 있는 PCR 반응 장치의 개략도가 도시되어 있고, 도 2b에는 실제 제조한 장치 사진이 도시되어 있다.

가열 블록들(21, 22, 23)은 앞서 설명한 바와 같이, 히터와 센서가 각각 삽입될 수 있어 각각의 온도가 독립적으로 조절되어 PCR 반응의 각 단계에서 필요한 온도로 설정될 수 있다. 단열 블록(12)은 가열 블록간의 서로 다른 온도가 유지되기 용이하도록 열전도성이 매우 낮은 물질로 만들어진다. 상기 PCR 혼합용액(27)이 모세관(13)을 따라 변성, 어닐링 및 연장 온도에 맞도록 설정된 가열 블록들(21, 22, 23)과 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하면서 주형 DNA(핵산)가 증폭되어 많은 양의 DNA(28)를 얻을 수 있게 된다.

한편, 상기 단열 블록이 포함된 반응 장치의 다른 예로, 본 발명은 고체상 가열 블록과 단열 블록의 조립체로서, 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지며 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 허용하는 모세관이 감겨 있는 둘 이상의 조립체가, 온도조절이 가능한 가열 블록 또는 단열 블록에 조립되어 둘 이상의 독립적인 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 다중 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다.

상기 다중 연속 흐름상 반응 장치에 있어서, 상기 온도조절이 가능한 가열 블록은 둘 이상일 수 있다.

상기 다중 연속 흐름상 반응 장치의 일예가 도 3a 내지 도 3e에 도시되어 있 다. 도 3a를 참조하여 다중 연속 흐름상 반응 장치를 제조하는 방법을 설명한다. 먼저, 하나의 가열 블록(11)에 하나의 단열 블록(12)을 조립하여 가열 블록-단열 블록 조립체를 제조한 후, 상기 조립체에 모세관(13)을 감는다. 모세관이 감긴 네 개의 가열 블록-단열 블록 조립체를 별도로 존재하는 온도조절이 가능한 세 개의 가열 블록(31, 32, 33)에 각각 조립하되, 상기 세 개의 가열 블록(31, 32, 33)이 각각 둘 이상의 조립체와 접촉하도록 조립함으로써 다중 연속 흐름상 반응 장치를 완성한다.

위와 같은 방법으로 제작된 다중 연속 흐름상 반응 장치의 평면도와 정면도가 각각 도 3b 및 도 3c에 도시되어 있고, 실제 제조한 장치 사진이 도 3d 및 도 3e에 도시되어 있다.

상기 다중 반응 장치는 동시에 네 곳에서 반응을 수행할 수 있으며, 상기 장치에 조립된 7 개의 가열 블록(11x4; 31, 32, 33)은 네 곳에서의 개별적인 작동을 위해 서로 다른 온도로 조절될 수 있다. 가열 블록-단열 블록 조립체에 감겨 있는 모세관(13)은 각각의 위치에 따라 접촉하는 가열 블록이 다르게 되며, 도 3b에서 보듯이, 각 모세관(13)은 서로 다른 온도로 조절되는 세 개의 가열 블록(11, 31, 33 또는 11, 32, 33)에 반복적으로 접촉하게 된다. 가열 블록의 온도에 따라 조절되는 모세관 내부의 온도는 모세관을 지나는 유체의 온도에 곧바로 반영되며, 유체는 서로 다른 세 가지 온도 구간을 반복적으로 지나게 된다.

상기 다중 연속 흐름상 반응 장치를 이용하면, 한번에 네 개의 모세관에서 반응을 수행할 수 있는 잇점이 있다.

구체적으로, 상기 모세관 내부를 흐르는 유체로 DNA 증폭을 위한 PCR 혼합용액을 사용하는 경우, 상기 다중 연속 흐름상 반응 장치를 PCR에 이용할 수 있다. PCR을 수행하는 방법은 앞서 예시한 PCR을 수행하는 반응 장치에서 설명한 바와 같다(도 3c 참조). 즉, PCR 혼합용액(27)이 모세관(13)을 따라 변성(33), 어닐링(11) 및 연장(31, 32) 온도에 맞도록 설정된 가열 블록들을 반복적으로 접촉하면서 주형 DNA(핵산)가 증폭되어 많은 양의 DNA(28)를 얻을 수 있게 된다.

PCR 반응시 어닐링을 담당하는 가열 블록(11)은 각각의 시료에 대한 최적 어닐링 온도로 설정되는 것이 바람직하다. 최적 어닐링 온도는 프라이머와 주형 DNA의 염기서열에 따라 매 PCR 수행시마다 달라지지만, 대략 45℃에서 65℃ 사이에서 설정되는 것이 바람직하다. 변성을 담당하는 가열블록(33)은 모세관이 감긴 네 개의 가열 블록-단열 블록 조립체에 모두 접하며, 약 95℃ 정도로 설정되는 것이 바람직하다. 연장을 담당하는 가열 블록(31, 32)은 각각 모세관이 감긴 두 개의 가열 블록-단열 블록 조립체에 접하며, 사용되는 DNA 중합효소에 따라 온도가 설정되지만 보통 Taq 중합효소를 사용할 경우 72℃로 설정되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치에는 PCR에 이용시 DNA 증폭 정도를 실시간으로 조사하기 위하여 실시간 검출 장치가 결합될 수 있다.

구체적으로 본 발명은, 상기 고성능 연속 흐름상 반응 장치에 있어서, (a) 형광을 유발하는 광원과, 형광을 검출하는 검출기, 그리고 광선을 모세관에 조사한 후 발생하는 형광을 검출기로 모아주는 광학 장치로 이루어진 형광 유발 장치; (b) 상기 형광 유발 장치와 모세관의 상대적인 위치를 변화시킬 수 있는 스캔 장치를 추가로 포함하여, 실시간 반응 검출을 할 수 있는 것을 특징으로 하는 고성능 연속 흐름상 반응 장치를 제공한다.

상기 형광을 유발하는 광원으로는 특정 파장의 광선을 조사하는 레이저 또는 램프 등이 사용될 수 있고, 형광을 검출하는 검출기로는 PMT 또는 다이오드 등이 사용될 수 있다. 상기 광학 장치에는 레이저 광선은 통과시키고 형광 빛은 반사시키는 역할을 수행하는 이색거울과, 레이저 광선을 모세관에 모아주고 모세관으로부터 발생하는 형광을 모아 이색거울로 전달하는 역할을 수행하는 대물렌즈가 포함될 수 있다. 한편, 상기 스캔 장치는 형광 유발 장치가 고정된 상태에서 모세관이 감겨 있는 가열 블록을 일정속도로 왕복 이동시키거나 가열 블록이 고정된 상태에서 형광 유발 장치를 일정속도로 왕복 이동시켜 형광 유발 장치와 모세관의 상대적인 위치를 변화시키는 역할을 수행한다. 상기 실시간 반응 검출을 할 수 있는 고성능 연속 흐름상 반응 장치는 실시간 PCR(real-time PCR)에 이용될 수 있다.

도 4를 참조하여, DNA 증폭에 대한 실시간 검출방법을 설명한다. DNA가 증폭됨에 따라 형광을 발생시킬 수 있는 물질이 첨가된 PCR 혼합용액(27)을 모세관(13)에 주입한다. 이후, 특정 파장의 레이저 광선(41)을 이색거울(43)과 대물렌즈(44)를 거쳐 모세관(13)에 조사한다. 상기 모세관으로부터 발생하는 형광(42)의 양을 검출기로 측정하면 모세관 내에서 DNA의 증폭 정도를 실시간으로 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치는 연속적으로 흐르는 유체를 반응시키는데, 특히 PCR을 수행하는데 유용하게 이용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 다중 연속 흐름상 반응 장치의 경우는 서로 다른 반응 조건을 갖는 반응을 동시에 두 군데 이상에서 수행할 수 있는 장점이 있으며, 따라서 DNA 다중 증폭기기의 제작 등에 응용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 반응 장치는 그 크기를 소형으로 제작할 수 있으므로 휴대가 가능하도록 할 수 있을 뿐만 아니라, 모세관이 기존의 랩온어칩(lab-on-a-chip)의 채널의 크기와 비슷하므로 랩온어칩에 연결하여 DNA 분석 등에 응용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 연속 흐름상 반응 장치의 제작

(1-1) 연속 흐름상 PCR 장치의 제작

도 2a에 도시된 형상을 갖는 연속 흐름상 PCR 장치에서 세 개의 가열 블록(21, 22, 23)은 구리를 사용하여 제작하였고, 단열 블록(12)은 벡크라이트를 사용하여 제작하였다.

상기 세 개의 가열 블록과 단열 블록을 조립하여 내부에 단열 블록이 존재하고 상기 단열 블록을 동일한 길이의 호를 가지는 세 개의 가열 블록이 감싸는 형태 로 제작하였으며, 전체적으로 지름 30mm, 높이 65mm가 되도록 제작하였다(도 2b 참조).

각각의 가열 블록에는 가열을 위한 히터를 삽입하기 위한 구멍과 가열 블록의 온도를 측정하여 조절하기 위한 온도 센서를 삽입하기 위한 구멍을 만들었다. 구체적으로, 3.1mm 지름의 히터(지름 3.1mm, 길이 32mm, Firerod, Watlow, St. Louis, MO)를 삽입하기 위해 3.1mm 지름의 구멍을 가열 블록에 만들었고, 1mm 지름의 온도조절 센서(지름 1mm, 길이 27mm, Watlow, St. Louis, MO)를 삽입하기 위해 1mm 지름의 구멍을 만들었다.

상기 가열 블록-단열 블록 조립체의 둘레에 깊이 250㎛, 폭 250㎛의 홈을 1.5mm의 피치 차이를 두고 나선형으로 연속적으로 파내었다. 상기 나선형 홈은 모세관을 상기 가열 블록에 감을 때 모세관의 위치를 고정시켜 주며, 반응시 열전달이 용이하도록 해준다. 상기 나선형 홈이 가열 블록-단열 블록 조립체의 세로방향으로 33회전하도록 제작하였는데, 이는 DNA 증폭 반응에서 PCR 싸이클의 회수가 된다. 상기 가열 블록-단열 블록 조립체의 나선형 홈 전체를 감고, 용액 주입 및 용액 회수 등에 필요한 모든 부분을 합하여 모세관은 총 3.5미터를 사용하였다.

세 개의 가열 블록 중 특히 변성을 담당하는 가열 블록에 감기는 모세관은 초기의 변성이 완전하게 이루어지도록 초기 첫 번째 싸이클에서 반응이 시작되는 처음 부분을 길게 디자인하여 제작하였고, 연장을 담당하는 가열 블록에 감기는 모세관은 마지막 연장이 완전히 이루어지도록 최종 싸이클에서 반응이 끝나는 마지막 부분을 길게 디자인하여 제작하였다.

도 2a 및 도 2b에는 가열 블록-단열 블록 조립체에 모세관이 감긴 모습이 도시되어 있는데, 가열 블록의 양말단으로 모세관이 길게 돌출되어 있는 모습을 볼 수 있다.

모세관은 폴리이미드가 코팅된 외경 240㎛, 내경 100㎛의 용융 실리카 재질의 모세관을 사용하였다(Polymicro Technologies, Phoenix, AZ). DNA나 단백질 등의 생체물질의 유리 표면에 대한 흡착을 제거하기 위해 상기 모세관의 내벽을 실레인화 반응을 이용하여 코팅하였다. 먼저 모세관에 메탄올을 30분간 흘려준 후에 40℃에서 12시간 동안 건조시켰다. 이후, 0.02M 트리메틸클로로실란(trimethylchlorosilane)과 0.04M 이미다졸을 포함하는 DMF(dimethylformamide) 용액을 채워 하루동안 방치하였다. 실레인 반응이 완료된 모세관을 메탄올과 살균 증류수로 헹궈서 내벽이 코팅된 모세관을 제조하였다.

상기 모세관을 가열 블록-단열 블록 조립체의 외면에 형성된 나선형 홈을 따라 감아올려 연속 흐름상 PCR 장치를 제작하였다.

(1-2) 다중 연속 흐름상 PCR 장치의 제작

도 3b 내지 도 3e에 도시된 형상을 갖는 다중 연속 흐름상 PCR 장치를 제작하였다. 상기 장치에서 가열 블록과 단열 블록의 재질로는 상기 실시예 (1-1)에서와 같이 각각 구리와 벡크라이트를 사용하였다.

먼저, 하나의 가열 블록(11)에 하나의 단열 블록(13)을 조립하여 지름 20mm, 높이 40mm의 가열 블록-단열 블록 조립체를 제조하였다. 이와 같은 조립체를 네 개 제조한 후, 각각의 조립체의 둘레에 깊이 240㎛, 폭 240㎛의 홈을 1mm의 피치 차이를 두고 나선형으로 연속적으로 파내었다. 상기 나선형 홈이 각각의 조립체의 세로방향으로 34회전하도록 제작하였다. 상기 각각의 조립체의 나선형 홈 전체를 감고, 용액 주입 및 용액 회수 등에 필요한 모든 부분을 합하여 모세관은 약 2미터를 사용하였다.

상기 조립체에서 각각의 가열 블록에는 상기 실시예 (1-1)에서와 같이 히터와 온도 센서를 삽입하기 위한 구멍을 만들었고, 모세관은 상기 실시예 (1-1)에서 사용한 용융 실리카 재질의 모세관이나 PTFE 모세관(Cole-Parmer Instrument, Co.)을 사용하였다.

이후, 모세관을 감아 완성된 상기 네 개의 조립체를 별도로 존재하는 세 개의 가열 블록(31, 32, 33)에 각각 조립하되, 상기 세 개의 가열 블록 중 두 개의 가열 블록(31, 32)은 두 개의 모세관과 접촉하도록 하고, 하나의 가열 블록(33)은 네 개의 모세관과 접촉하도록 조립함으로써 다중 연속 흐름상 PCR 장치를 제작하였다(도 3b, 도 3d 및 도 3e 참조).

<실시예 2> 유체의 연속적인 흐름상에서의 PCR

상기 실시예 (1-1)에서 제조한 연속 흐름상 PCR 장치를 이용하여 모세관 내 유체(PCR 혼합용액)의 연속적인 흐름 상태에서 PCR을 수행하였다.

주형 DNA로는 박테리아 카나마이신 저항성 유전자로부터 분리한 플라스미드 DNA(promega)를 사용하였고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖 는 프라이머를 이용하여 상기 플라스미드 DNA 중 323bp의 단편을 증폭하였다. PCR 혼합용액은 총 50㎕ 기준에 3㎕의 25mM MgCl₂, 5㎕의 10X 내열성 DNA 중합효소 완충용액 (500mM KCl, 100mM Tris-HCl, 1% Triton™ X-100), 1㎕의 10mM PCR 뉴클레오티드 혼합액(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각이 물에 10mM씩 녹아 있는 것), 각각 3.3㎕의 12μM 업스트림, 다운스트림 프라이머, 0.25㎕의 5unit/㎕ Taq DNA 중합효소, 1㎕(1ng)의 주형 DNA, 그리고 33.15㎕의 살균된 3차 증류수가 포함된다.

모세관 내에 PCR 혼합 용액을 연속적으로 주입하고 0.3 - 5.0㎕/분의 일정 속도로 흐름을 조절하기 위해 주사기 펌프(22 Multiple Syringe Pump, Harvard Apparatus)를 이용하였다. 250㎕ 용량의 가스 타이트 주사기(gas tight syringe)에 PCR 혼합용액을 채우고 이를 펌프에 연결하였다. 주사기의 끝부분을 모세관의 유체 주입구 말단(변성 반응을 담당하는 가열 블록의 시작부분) 쪽에 연결한 후, 펌프를 조작하여 주사기를 밀어줌으로써 모세관에 주사기 내의 PCR 혼합용액이 주입되어 계속해서 흘러가도록 하였다.

상기 연속 흐름상 PCR 장치에서 각각의 가열 블록의 온도를 95℃, 60℃ 및 72℃로 설정하였고, 상기 PCR 혼합용액이 상기 가열 블록을 반복적으로 접촉하도록 하였다. PCR 혼합용액의 이동 속도를 각각 0.3, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0㎕/분으로 설정하고 PCR을 수행하였다.

0.3㎕/분의 속도에서는 용액 주입 후 90분 후에, 5㎕/분의 속도에서는 용액 주입 후 약 5분 30초 후에, 모세관의 유체 배출구 말단(연장 반응을 담당하는 가열 블록의 끝부분)에서 흘러나오는 용액을 수집하였다.

<실시예 3> 증폭된 DNA의 확인

PCR이 완료된 시료의 DNA 증폭 여부를 확인하기 위해서 겔 전기영동을 하였다. 상기 실시예 2에서 PCR 완료 후 수집된 시료 용액 10㎕를 2% 아가로즈 겔에 로딩하고 TBE 완충용액 상에서 전압을 걸어 전개하였다. 이 때 증폭이 원활히 진행되었는지 확인하기 위해 기존의 상업화된 기기(MBS 0.2G, Hybaid, U.K.)를 이용하여 증폭한 시료와 사이즈 마커를 함께 로딩하였다. 상업화된 기기에서의 PCR 조건은 95℃ 2분, 그리고 95℃ 30초, 60℃ 1분, 72℃ 2분의 조건을 33회 반복하였다. 그 후 72℃에서 5분간 방치하고 4℃로 냉각하여 반응을 종결하였다.

그 결과를 도 5에 도시하였다. 도 5에서 레인 1(양성대조구)은 기존의 PCR 기기를 이용하여 DNA를 증폭한 결과이고, 레인 2 내지 6은 모세관 내 PCR 혼합용액의 이동 속도에 따른 DNA 증폭 정도의 차이를 나타낸 것이며(왼쪽부터 0.3, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0㎕/분), 레인 7(음성대조구)은 증폭 과정을 거치지 않은 DNA을, 그리고, 레인 8은 증폭된 DNA의 크기를 가늠할 수 있는 사이즈 마커(size markers)를 나타낸 것이다. 도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 연속 흐름상 PCR 장치를 이용한 경우에도 DNA 증폭이 잘 이루어진다는 것을 알 수 있었고, 특히, PCR 혼합용액의 이동 속도가 느릴수록 증폭효율이 높다는 것을 알 수 있었는데, 이는 이동 속도가 느릴수록 연장(extension) 반응이 완전히 진행되기 때문인 것으로 생각된다.

<실시예 4> 서로 다른 조성을 갖는 PCR 혼합용액의 단속적 주입에 의한 DNA 증폭

본 발명에 따른 연속 흐름상 PCR 장치가 서로 다른 조성을 갖는 PCR 혼합용액을 순차적으로 주입하였을 경우에도 각각의 주형 DNA에 대한 증폭 반응을 수행할 수 있는지 여부를 조사하였다.

서로 다른 종류의 주형 DNA에 대한 순차적이며 연속적인 PCR을 수행하기 위해 4가지 주형 DNA와 각각의 DNA에 대한 한 쌍의 프라이머를 준비하였다. 각각의 주형 DNA와 프라이머 쌍은 아래 표 1과 같다.

시료 No.	주형 DNA	프라이머 쌍	구입처
1	lambda DNA	서열번호 1 및 서열번호 2 (주형 DNA의 500 bp의 부분을 증폭하도록 디자인)	Promega
2	박테리아 카나마이신 저항성 유전자로부터 분리한 플라스미드 DNA	서열번호 3 및 서열번호 4 (주형 DNA의 323 bp의 부분을 증폭하도록 디자인)	Takara
3	PCS2HA/LM04	서열번호 5 및 서열번호 6 (주형 DNA의 497 bp의 부분을 증폭하도록 디자인)	포항공대 생명과학과 실험실
4	Lhx3-LIM1	서열번호 7 및 서열번호 8 (주형 DNA의 267 bp의 부분을 증폭하도록 디자인)

각각의 주형 DNA와 프라이머들을 포함하는 PCR 혼합용액(시료 1 내지 시료 4)을 준비하였다. 각 PCR 혼합용액의 성분은 상기 실시예 2에서 사용한 것과 동일하게 하였다. 상기 표 1의 각각의 주형 DNA와 프라이머를 포함하는 PCR 혼합용액을 시료 1, 시료 2 등으로 구분하였을 때, 주입하는 순서는 시료 1(2㎕) - 공기층(< 1cm) - 브로모페놀 블루(2㎕) - 공기층(< 1cm) - 시료 2(2㎕) - 공기층(< 1cm) - 브로모페놀 블루(2㎕) - 공기층 - 시료 3(2㎕) - 공기층 (< 1cm) - 브로모페놀 블루(2㎕) - 공기층 - 시료 4(2㎕) - 공기층 (< 1cm) - 브로모페놀 블루(2㎕) - 공기층 - 시료 1(2㎕)을 반복하여 주입하였다.

상기에서 공기층과 브로모페놀 블루는 시료 이월 현상을 방지하기 위하여 주입되며, 구체적으로, 브로모페놀 블루는 브로모페놀 블루 완충용액(30% 글리세롤, 30mM EDTA, 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol)(Takara)을 사용하였다.

이 후 모세관의 유체 배출구 말단에서 PCR이 완료되어 나오는 각각의 PCR 산물을 브로모페놀 블루 용액의 색과 공기층으로 식별하여 채집하였다.

또한, 모세관 내벽의 코팅 유무에 따른 DNA 증폭 반응의 효율을 비교하기 위하여, 모세관의 내벽이 트리메틸클로로실란(TMS)으로 코팅된 모세관과 코팅되지 않은 모세관을 각각 이용하여 PCR을 수행하였다.

PCR이 완료된 시료의 DNA 증폭 여부를 확인하기 위해서 실시예 3과 동일한 방법으로 겔 전기영동을 하였다. 한편, DNA 증폭이 원활히 진행되었는지 확인하기 위해 기존의 상업화된 기기(MBS 0.2G, Hybaid, U.K.)를 이용하여 증폭한 시료와 사이즈 마커를 함께 로딩하였다. 상업화된 기기에서의 PCR 조건은 95℃ 2분, 그리고 95℃ 30초, 60℃ 1분, 72℃ 2분의 조건을 33회 반복하였다. 그 후 72℃에서 5분간 방치하고 4℃로 냉각하여 반응을 종결하였다.

그 결과를 도 6에 도시하였다. 도 6에서, 레인 1은 사이즈 마커이고, 레인 2, 4, 6 및 8 또는 레인 10, 12, 14 및 16은 시료 1 내지 시료 4에 대한 기존 상업 화된 PCR 기기에서의 증폭 결과를 나타낸다. 그리고, 레인 3, 5, 7 및 9는 각각 시료 1 내지 시료 4를 내벽이 TMS로 코팅되지 않은 모세관에서 증폭한 결과를 나타내는 것이고, 레인 11, 13, 15 및 17은 시료 1 내지 시료 4를 각각 내벽이 TMS로 코팅된 모세관에서 증폭한 결과를 나타내는 것이다.

도 6의 레인 11, 13 및 15에서 보는 바와 같이, 시료 1 내지 시료 3에 대한 증폭이 잘 이루어졌음을 확인할 수 있는 바, 본 발명에 따른 연속 흐름상 PCR 장치를 이용하면 서로 다른 주형 DNA를 순차적으로 증폭할 수 있다.

이상 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 연속 흐름상 반응 장치는 연속적으로 흐르는 유체를 반응시키는데 유용하게 이용될 수 있으며, 특히 중합효소 연쇄반응에 유용하게 이용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 다중 연속 흐름상 반응 장치의 경우는 서로 다른 반응 조건을 갖는 반응을 동시에 두 군데 이상에서 수행할 수 있는 장점이 있으며, 따라서 DNA 다중 증폭기기의 제작 등에 응용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 반응 장치는 그 크기를 소형으로 제작할 수 있으므로 휴대가 가능하도록 할 수 있을 뿐만 아니라, 모세관이 기존의 랩온어칩(lab-on-a-chip)의 채널의 크기와 비슷하므로 랩온어칩에 연결하여 DNA 분석 등에 응용될 수 있다. 또한 PCR 수행시 DNA 증폭 여부를 실시간으로 알 수 있는 실시간 검출 장치를 결합함으로써 PCR 반응 진행여부를 용이하게 확인할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (25)

1. (1) 서로 다른 온도로 조절되는 둘 이상의 고체상 가열 블록; 및

   (2) 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지며 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 허용하는 모세관을 포함하고,

   상기 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는,

   고성능 연속 흐름상 반응 장치.
2. (1) 서로 다른 온도로 조절되는 둘 이상의 고체상 가열 블록;

   (2) 상기 가열 블록과 접촉하고 각각의 가열 블록이 서로 직접적으로 접촉하지 않도록 배열된 단열 블록; 및

   (3) 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지며, 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 허용하는 모세관을 포함하고,

   상기 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는,

   고성능 연속 흐름상 반응 장치.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 장치가 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 장치.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   각각의 가열 블록이 히터 및 온도 센서에 의해 서로 다른 온도로 조절되는 장치.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서.

   상기 가열 블록의 재질이 구리, 철, 알루미늄, 황동, 금, 은 및 백금으로 이루어진 그룹에서 선택되는 전열성 금속 물질인 장치.
6. 제2항에 있어서,

   상기 단열 블록의 재질이 벡크라이트 또는 아크릴 고분자 수지인 장치.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 모세관의 재질이 유리, 용융 실리카, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 및 폴리에틸렌으로 이루어진 그룹에서 선택되는 장치.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 모세관의 외벽이 폴리이미드 또는 PTFE로 코팅되는 장치.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 모세관의 내벽이 트리메틸클로로실란, 디메틸디클로로실란, 메틸트리클로로실 란, 트리메틸메톡시실란, 디메틸디메톡시실란 및 메틸트리메톡시실란으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 물질로 코팅되는 장치.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서,

    상기 가열 블록의 외면에 모세관이 감겨 있는 장치.
11. 제10항에 있어서,

    상기 모세관이 가열 블록의 외면에 형성된 나선형 홈에 의해 고정되는 장치.
12. 제10항에 있어서, 상기 모세관이 10회 내지 50회 감겨 있는 장치.
13. 제2항에 있어서,

    (1) 서로 다른 온도로 조절되는 세 개의 고체상 가열 블록;

    (2) 상기 가열 블록과 접촉하고 각각의 가열 블록이 서로 직접적으로 접촉하지 않도록 배열된 단열 블록; 및

    (3) PCR 혼합용액 주입구인 제1 말단과 PCR 산물 배출구인 제2 말단을 가지며, 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 용액의 흐름을 허용하는 모세관을 포함하고,

    상기 모세관이 서로 다른 온도로 조절되는 세 개의 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉함으로써 PCR을 수행하는 장치.
14. 제1항 또는 제2항에 있어서,

    (a) 형광을 유발하는 광원과, 형광을 검출하는 검출기, 그리고 광선을 모세관에 조사한 후 발생하는 형광을 검출기로 모아주는 광학 장치로 이루어진 형광 유발 장치;

    (b) 상기 형광 유발 장치와 모세관의 상대적인 위치를 변화시킬 수 있는 스캔 장치를 추가로 포함하여, 실시간 반응 검출을 할 수 있는 것을 특징으로 하는 장치.
15. 제14항에 있어서,

    상기 실시간 반응이 실시간 PCR(real-time PCR)인 것을 특징으로 하는 장치.
16. 고체상 가열 블록과 단열 블록의 조립체로서, 유체 주입구인 제1 말단과 유체 배출구인 제2 말단을 가지며 제1 말단으로부터 제2 말단으로의 연속적인 유체의 흐름을 허용하는 모세관이 감겨 있는 둘 이상의 조립체가, 온도조절이 가능한 가열 블록 또는 단열 블록에 조립되어 둘 이상의 독립적인 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 다중 연속 흐름상 반응 장치.
17. (1) 제1항 또는 제2항에 따른 고성능 연속 흐름상 반응 장치의 모세관의 제1 말단에 PCR 혼합용액을 주입하는 단계; 및

    (2) 적정한 속도로 용액의 흐름을 제어하면서 제2 말단으로부터 배출되는 PCR 산물 을 회수하는 단계를 포함하는,

    고성능 연속 흐름상 핵산 증폭 방법.
18. 제17항에 있어서,

    상기 모세관이 각각 95~100℃, 45~65℃ 및 65~72℃로 설정된 가열 블록을 순차적으로 또는 반복적으로 접촉하는 방법.
19. 제17항에 있어서,

    상기 모세관이 가열 블록을 반복적으로 접촉하는 횟수가 10회 내지 50회인 방법.
20. 제17항에 있어서,

    상기 PCR 혼합용액이 MgCl₂, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합액, 프라이머, 내열성 DNA 중합효소, 내열성 DNA 중합효소 완충용액 및 주형 DNA를 포함하는 방법.
21. 제20항에 있어서,

    상기 프라이머가 분자 표지(molecular beacon)인 방법.
22. 제20항에 있어서,

    PCR 혼합용액이 이중가닥 DNA에 특이적으로 결합하여 형광을 방출할 수 있는 인터 칼레이팅 염료(intercalating dye)를 추가로 포함하는 방법.
23. 제17항에 있어서,

    PCR 혼합용액이 펌프에 의해 모세관의 제1 말단에서 제2 말단까지 이동하는 방법.
24. 제17항에 있어서,

    단계 (1)의 PCR 혼합용액이 연속적 또는 단속적으로 주입되는 방법.
25. 제24항에 있어서,

    단속적으로 주입되는 PCR 혼합용액이 서로 다른 조성을 갖는 경우, 서로 다른 조성의 PCR 혼합용액 사이에 유기 용매 또는 공기층을 주입하는 방법.

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