JP4571650B2 - 連続流式高性能反応装置 - Google Patents

Description

本発明は、連続的に流れる流体を反応させるための高性能装置に関し、より詳しくはポリメラーゼ連鎖反応のように時間に応じた反復的な温度調節及び繰り返し反応が求められる反応を遂行する、固体相の加熱ブロック及びキャピラリーチューブを含む連続流式高性能反応装置に関する。

ＤＮＡは１９８３年にムリスら（Mullis et al.）によって開発されたポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction; ＰＣＡ）というＤＮＡ複製技術によってインビトロ（in vitro）で人為的に複製されることができる。ＰＣＲは酵素を用いた反応であって、酵素の種類によって２つ又は３つの温度範囲における反復的な温度調節が求められる。

通常、ＰＣＲは次のような３段階からなる。即ち、複製される二本鎖鋳型ＤＮＡ（double-stranded template DNA）を２つの一本鎖ＤＮＡ（single-stranded DNA）に変性させる熱変性（melting）段階；変性された一本鎖ＤＮＡにプライマーを結合させて反応が開始される位置を指定し、酵素反応の開始を助けるアニーリング（annealing）段階；及びプライマーが結合された位置からＤＮＡを複製して完全な二本鎖ＤＮＡを作り出す伸張（extension）段階；とからなる。前記ＰＣＲの３段階が終了すると、ＤＮＡの最終量は２倍となる。すなわち、ＰＣＲが繰り返してｎ回遂行されると、ＤＮＡの最終量は２^ｎ倍となる。従来のＰＣＲ反応器システムでは、温度調節が可能な加熱ブロック（heating block）が用いられ、この加熱ブロックはＰＣＲ容器を受容するようにデザインされている。ＰＣＲはＰＣＲ容器を加熱ブロックに挿入して一定の時間間隔で繰り返して温度を調節することにより遂行される。

具体的に、ＰＣＲを成功的に遂行するための重要な要素のうち一つが温度調節である。特に、ＰＣＲの３段階の中でもアニーリング段階における温度調節が極めて重要であるが、これはアニーリング段階の温度が適切でなければ、増幅の効率や特異性が減少し、これによって、ＰＣＲ収率が低下するからである。更に、ＰＣＲが終了するまで数時間がかかることを勘案するとき、ＰＣＲ過程を実時間で迅速で且つ連続的にモニターリングすることは、ＤＮＡが増幅される間にＰＣＲ効率を向上させるに当たって極めて重要なことである。

１９９０年代にＰＣＲのためのラブ・オン・ア・チップ（lab-on-a-chip）概念が導入されてから、ＰＣＲのための他の技術が開発されている（Northrup et al., Anal. Chem. 1998, 70, 918-922; Waters et al., Anal. Chem. 1998, 70, 5172-5176; Cheng et al., Nucleic Acids Res. 1996, 24, 380-385）。特に、連続的な流相でＰＣＲを遂行することができる装置及び方法の開発が、一つのチップから多くの種類のＤＮＡを効率的に分析するための重要な課題として台頭した。

例えば、１９９８年にマンツらは連続的な流相でＰＣＲを遂行することが可能な装置を開発した（Manz et al., Science, 1998, 280, 1046-1048）。マンツらはＰＣＲ過程の変性、アニーリング、及び伸張反応段階の一連の反応の調節のために温度調節可能な３つの銅ブロックを一列に配列し、生成されたＰＣＲ産物は前記銅ブロック上に搭載されたガラス基板上の微細チャンネルを介して流れるようにした。３つの相異なる反応領域の温度は９５℃→７２℃→６０℃へとよどみなく調節できるようにした。しかし、このような配列に内在する問題点は、変性された一本鎖ＤＮＡ試料がアニーリング反応チャンバー以前に伸張反応チャンバーを通過するので、反応の正確度をかなり減少させるということである。

クェークらは一列配列の代わりに変性、アニーリング及び伸張の順序からなる加熱ブロックの円形配列を用いることで、前記の問題を解決しようとした（Quake et al., Electrophoresis, 2002, 23, 1531-1536）。

ロエラード（Roeraade）らは互いに異なる温度に調節される円形の水槽を用いたキャピラリーチューブ内で連続流式ＰＣＲが可能な装置を製作した。前記装置は水槽の壁に複数の小さな孔を設け、この孔を介して水槽の回りにテフロン（登録商標）チューブを巻き付ける方法を利用して製作された（Roeraade et al., J. Anal. Chem, 2003, 75, 1-7）。しかし、前記装置は温度及び水の蒸発を調節するために一定した速度で水をポンプするための攪拌装置を必要とし、このため、小型化した携帯用ＰＣＲ装置の開発が困難であった。

従って、本発明の目的はポリメラーゼ連鎖反応のように時間に応じた反復的な温度調節及び繰り返し反応を遂行する、固体相の加熱ブロックとキャピラリーチューブとを含む高性能連続流式反応装置を提供することである。

本発明の他の目的は、前記高性能連続流式反応装置を用いた高性能連続流式核酸増幅方法を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明は互いに異なる温度に調節された複数の固体加熱ブロックと、流体注入口である第１末端と流体排出口である第２末端を有し、第１末端から第２末端への連続的な流体のフローを許容する１つ以上のキャピラリーチューブと、を含み、前記キャピラリーチューブが前記複数の加熱ブロックを順次に又は繰り返して接触させることを特徴とする高性能連続流式反応装置を提供する。

また、本発明は前記反応装置において、前記複数の加熱ブロック間に介在して接触し、それらの加熱ブロックが互いに接触しないように配設された１つ以上の断熱ブロックを更に含むことを特徴とする高性能連続流式反応装置を提供する。

更に、本発明は（ａ）前記高性能連続流式反応装置のキャピラリーチューブの第１末端に１つ以上のＰＣＲ混合液を注入する段階と、（ｂ）適切な速度でＰＣＲ混合液の流速を制御しながら第２末端から排出されるＰＣＲ産物を回収する段階を含むことを特徴とする高性能連続流式核酸増幅方法を提供する。

本発明による装置において、それぞれの加熱ブロックはキャピラリーチューブの特定の部位を加熱する役割を果たし、これらの加熱ブロックの温度はヒーター及び温度センサーを用いて互いに異なる温度に調節できる。ヒーター及び温度センサーは加熱ブロックに取り付けられるか、加熱ブロックに形成された孔に挿入することも可能である。

前記加熱ブロックの材質としては、熱伝導性に優れている物質であれば、いずれも制限なく使用可能であり、銅、鉄、アルミニウム、黄銅、金、銀、白金などの金属であることが好ましく、高い熱伝導性を有するポリマーも使用できる。

前記断熱ブロックは、それぞれの加熱ブロック間の熱伝達を防止する役割をする。前記断熱ブロックの材質としては、高い絶縁特性を有する物質であれば制限なく使用することができ、ベークライト（bakelite）或いはアクリルポリマー樹脂を利用することが望ましい。

前記加熱ブロック及び断熱ブロックは、必要によって円筒形、楕円形、四角形などの形状に製造され、その形状は特に限定されない。前記キャピラリーチューブは、流体注入口である第１末端及び流体排出口である第２末端を有し、第１末端から第２末端への連続的な流体のフローを可能にして流体の移動通路及び反応空間としての役割を果たす。前記キャピラリーチューブは商業的に利用可能なキャピラリーチューブであれば、いずれも使用可能である。前記キャピラリーチューブは、ガラス、ポリマーなど多様な種類の材質からなり得るが、１００℃以上の熱によく耐えられ、水溶液や有機溶媒などが浸透できないガラス、溶融シリカ、ポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluoroethylene；PTFE、商品名：テフロン（登録商標））又はポリエチレンであることが好ましい。

特に、前記キャピラリーチューブの材質がガラスである場合には、本発明による装置を製造する過程、例えば、キャピラリーチューブを加熱ブロックに円形に巻き付ける過程において、キャピラリーチューブが割れないようにキャピラリーチューブの外壁をポリイミド又はＰＴＦＥなどでコーティングすることが望ましい。一方、前記キャピラリーチューブを実時間反応検出のための装置に使用する場合は、光線が通過できるように透明なキャピラリーチューブを用いることが望ましい。キャピラリーチューブの外壁がポリイミドでコーティングされる場合、光線が照射されて蛍光が発生する部分のコーティングを取り除くことが好ましい。

また、前記キャピラリーチューブの内壁は、ＤＮＡやタンパク質の吸着を防止するためにシラン化することが望ましい。シラン化（silanization）は、当該分野における公知の方法によって遂行できる。前記シラン化に用いられる物質としては、ガラス表面と反応して疎水性基をその表面に形成する物質が望ましく、トリメチルクロロシラン、ジメチルジクロロシラン、メチルトリクロロシラン、トリメチルメトキシシラン、ジメチルジメトキシシラン、及びメチルトリメトキシシランからなる群から選択される少なくとも１つ以上の物質が特に好ましい。

前記キャピラリーチューブの直径及び長さは、キャピラリーチューブ内に流れる流体の種類及び遂行する反応の種類などを考慮して様々に調節できる。一般的にキャピラリーチューブの直径は、内径が１０乃至３００μｍ、外径が５０乃至５００μｍの範囲であることが望ましく、キャピラリーチューブの長さは０．５ｍ乃至５ｍの範囲を有することが好ましい。

本発明による反応装置において、キャピラリーチューブの互いに異なる温度に調節される加熱ブロックとの接触は、加熱ブロックの外面にキャピラリーチューブを巻き付けることで達成できる。加熱ブロックの外面にキャピラリーチューブを巻き付ける一つの方法は、加熱ブロックの外面に一定の寸法及び一定の間隔を有する螺旋溝を形成した後、前記螺旋溝にキャピラリーチューブを固定することである。前記螺旋溝の寸法及び間隔は、固定するキャピラリーチューブの直径によって異なり、この螺旋溝の深さは大略１００μｍ乃至５００μｍ、幅は１００μｍ乃至５００μｍ、そして間隔は１００μｍ乃至１０００μｍを有するように形成することが望ましい。

前記キャピラリーチューブは互いに異なる温度に調節されている複数の加熱ブロックに順次に１回以上接触させる。加熱ブロックに巻きつけられるキャピラリーチューブの巻きつけ回数は、反応の種類、反応の正確度、要求される反応産物の量、反応試料の初期量などによって多様であるが、望ましくは１０回乃至５０回、より望ましくは２０回乃至３０回であることが好ましい。

なお、前記高性能連続流式反応装置のそれぞれの加熱ブロックの温度をＰＣＲ遂行で要求される反応温度に設定し、流体としてＰＣＲ混合液をキャピラリーチューブに注入して、前記反応装置を用いてＰＣＲを遂行することができる。

従って、本発明は、（ａ）前記高性能連続流式反応装置のキャピラリーチューブの第１末端に１つ以上のＰＣＲ混合液を注入する段階と、（ｂ）適正な速度でＰＣＲ混合液の流速を制御しながら第２末端から排出されるＰＣＲ産物を回収する段階と、を含む高性能連続流式核酸増幅方法を提供する。

一般的に、ＰＣＲは（ａ）二本鎖鋳型ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に変性させる熱変性（melting）段階；（ｂ）前記一本鎖ＤＮＡにプライマーを結合するアニーリング（annealing）段階；及び前記プライマーの結合位置からＤＮＡを複製して二本鎖ＤＮＡを作り出す伸張（extension）段階；の３段階とからなる。また、各段階の反応遂行時に求められる適正温度及び時間条件が存在する。このような温度及び時間条件は鋳型ＤＮＡの塩基配列及びプライマー、そして使用されるポリメラーゼや触媒の種類など、個別ＰＣＲ反応条件によって異なるが、熱変性段階は９５〜１００℃で１〜６０秒、アニーリング段階は４５〜６５℃で１〜１２０秒、そして伸張段階は主に６５〜７２℃で３０〜１２０秒遂行することが望ましい。

前記核酸増幅方法において、高性能連続流式反応装置の各々の加熱ブロックの温度は前述した熱変性、アニーリング、及び伸張温度に設定されることが望ましく、最も望ましくはそれぞれ約９５℃、６０℃、及び７２℃に設定されることが好適である。

前記キャピラリーチューブは、熱変性、アニーリング、及び伸張温度に適するように設定された加熱ブロックを順次に繰り返して接触するので、キャピラリーチューブ内に注入されたＤＮＡ鋳型も増幅することになる。

前記核酸増幅方法において、ＰＣＲサイクルは前記キャピラリーチューブが加熱ブロックに繰り返して接触する回数によって決められる。前記回数は場合によって異なるが、１０回乃至５０回、より望ましくは２０内乃至３０回であることが好適である。

ＰＣＲ混合液はＰＣＲを遂行するために要求される反応物質を含み、具体的にＭｇＣｌ_２、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）混合液、プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼバッファー、及び鋳型ＤＮＡを含む。なお、実時間ポリメラーゼ連鎖反応（real-time PCR）における容易な検出のために、前記プライマーは分子指標（molecular beacon）であることができ、前記ＰＣＲ混合液はインターカレーティング色素（intercalating dye）を更に含むことができる。

前記分子指標はＰＣＲにおけるアニーリング段階後に蛍光が検出されるように特別に工夫されたプライマーを指す。分子指標は、通常、数十個の塩基からなり、両末端には蛍光を発する蛍光物質と、その蛍光に対する消光物質（quencher）がそれぞれ存在する。前記分子指標はガラス状態でヘアピン構造（hair pin structure）を有するが、このときは蛍光物質と消光物質とが近接しているから、蛍光発生が抑制される。しかし、前記分子指標がＰＣＲのアニーリング段階で鋳型ＤＮＡに結合されると、蛍光物質と消光物質間の距離が遠ざかり、消光物質による抑制が解消されるので、分子指標上の蛍光色素が蛍光を帯びることになる。ＰＣＲを遂行することによって、鋳型ＤＮＡの量が増加し、これに伴って鋳型ＤＮＡと結合される分子指標の量も増加するようになる。従って、分子指標を用いて蛍光度を測定することで、ＰＣＲの毎反応サイクルにおけるＤＮＡ増幅度を実時間で観察することができるようになる。

前記インターカレーティング色素は、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合して蛍光を放出する。ＥｔＢｒ（Ethidium bromide）のように当該分野においてインターカレーティング色素として知られているものであれば制限なく使用することができ、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ（登録商標）のように商業的に利用可能な染料も使用できる。前記インターカレーティング色素はＰＣＲで増幅された二本鎖ＤＮＡに特異的に結合して蛍光を発する。したがって、この蛍光信号の強度を測定することにより、増幅産物の量を測定することができる。

本発明による核酸増幅方法において、キャピラリーチューブにＰＣＲ混合液を注入し、ＰＣＲ混合液の流速を調節するためには、シリンジポンプを利用することが望ましい。シリンジポンプによってＰＣＲ混合液はキャピラリーチューブの第１末端から第２末端まで移動するようになる。ＰＣＲ混合液の流速はＰＣＲ反応条件によって多様に調節でき、最適のＰＣＲ結果が得られるように反応毎に調節されることができる。具体的に、キャピラリーチューブ内に注入されたＰＣＲ混合液の流速は０．１μL／ｍｉｎ乃至５μL／ｍｉｎの範囲であることが好ましい。

前記ＰＣＲ混合液はキャピラリーチューブに連続的又は断続的に注入される。互いに異なる組成を有するＰＣＲ混合液を断続的に注入する場合、‘キャリオーバ（carryover）’が問題になり得る。‘キャリオーバ’とは、以前の試料によって後続の試料が汚染されることを意味する。これを防止するためには、各々の試料注入後に空気層や、例えばブロモフェノールブルー（bromophenol blue）のように試料と混じらない有機溶媒などを注入して資料を分離するようにすることが望ましい。さらに、以前の試料によって後続の試料が汚染されることを防止するために、試料注入の合間に空気層や有機溶媒などとは別途に水又は緩衝溶液（buffer）のような溶媒を挿入することで、以前の試料の残留物を完全に除去することが好ましい

以下、本発明による連続流式反応装置の具体的な実施形態を添付図面を参照して詳細に説明する。

本発明の好適な第１実施形態によれば、高性能連続流式反応装置は、互いに異なる温度に調節される複数の加熱ブロック１１の周りにキャピラリーチューブ１３を巻き付けることで製造できる。図１ａ及び図１ｂに示したように、前記加熱ブロック１１は並列又は直列に配置することができる。前記キャピラリーチューブ１３は加熱ブロックの周りに巻き付けられて互いに異なる温度に調節される加熱ブロックと接触することになる。図１ａに示したように、並列に並べられた加熱ブロック１１の周りにキャピラリーチューブ１３が巻き付けられた場合、前記キャピラリーチューブに注入される流体は互いに異なる温度に調節される加熱ブロックを順次に又は繰り返して２回以上通過しながら反応するようになる。これに対し、図１ｂに示したように、直列に配置された加熱ブロック１１の周りにキャピラリーチューブ１３が巻き付けられた場合、前記キャピラリーチューブ内の流体が互いに異なる温度に調節される加熱ブロックを順次に通過しながら反応することになる。

そして、本発明の好適な第２実施形態によれば、前記高性能連続流式反応装置は、それぞれの加熱ブロックの温度調節をより容易にするために、加熱ブロック同士が互いに直接接触しないように配設された断熱ブロックを含むことができる。

例えば、本発明は、互いに異なる温度に調節される３つの固体加熱ブロックと、２つの隣接した加熱ブロックと接触し、各々の加熱ブロックが互いに接触しないように配設された１つの断熱ブロックと、ＰＣＲ混合液の注入口である第１末端とＰＣＲ混合液の排出口である第２末端を有し、第１末端から第２末端への連続的な流体のフローを許容する１つのキャピラリーチューブと、を含み、前記キャピラリーチューブが互いに異なる温度に調節された３つの加熱ブロックを順次に又は繰り返して接触することでＰＣＲを遂行する高性能連続流式反応装置を提供する。

前記高性能連続流式反応装置の好適な第２実施形態が図２ａ及び図２ｂに示されている。図２ａには一つの断熱ブロック１２に互いに異なる温度に調節された３つの加熱ブロック２１、２２、２３が組み立てられ、前記加熱ブロックの外面にキャピラリーチューブが巻きつけられている装置の概略図が示されている。図２ｂには実際に製造した装置の写真が示されている。

前述したように、加熱ブロック２１、２２、２３にはヒーターとセンサーがそれぞれ挿入されることができ、各々の温度が独立的に調節されてＰＣＲ反応の各段階における必要な温度に設定できる。断熱ブロック１２は、加熱ブロック間の互いに異なる温度が容易に保たれるように、非常に低い熱伝導性を有する物質からなる。前記ＰＣＲ混合液２７がキャピラリーチューブ１３に沿って熱変性、アニーリング及び伸張反応温度に設定された加熱ブロック２１、２２、２３と順次に又は繰り返して接触する。その結果、鋳型ＤＮＡ（核酸）が増幅されて多量のＤＮＡ２８を生産する。

一方、断熱ブロックを備える本発明の好適な第３実施形態によれば、本発明は複数の加熱ブロック断熱ブロック組立体が温度調節可能な複数の加熱ブロックと組み立てられて２つ以上の独立的な反応を遂行し、それぞれの組立体上に流体注入口である第１末端と流体排出口である第２末端を有し、第１末端から第２末端への連続的な流体のフローを許容するキャピラリーチューブが巻き付けられていることを特徴とする高性能多重連続流式反応装置が提供される。

前記高性能多重連続流式反応装置において、前記温度調節可能な加熱ブロックは２つ以上であることができる。

前記多重連続流式反応装置の好適な第３実施形態が図３ａ乃至図３ｅに示されている。図３ａを参照して、多重連続流式反応装置を製造する方法について説明する。まず、一つの加熱ブロック１１に一つの断熱ブロック１２を組み立てて加熱ブロック−断熱ブロック組立体を製造した後、前記加熱ブロック−断熱ブロック組立体にキャピラリーチューブ１３を巻き付ける。キャピラリーチューブが巻き付けられた４つの加熱ブロック−断熱ブロック組立体を別途に存在する温度調節可能な３つの加熱ブロック３１、３２、３３にそれぞれ組み立てて前記３つの加熱ブロック３１、３２、３３が各々２つ以上の組立体と接触するように組み立てる。

前述のような方法により製作された多重連続流式反応装置の平面図及び正面図がそれぞれ図３ｂ及び図３ｃに示されている。また、前記多重連続流式反応装置の写真が図３ｄ及び図３ｅに示されている。

前記多重連続流式反応装置は４箇所で同時に反応を遂行することができる。前記多重反応装置に組み立てられた７つの加熱ブロック１１、１１、１１、１１、３１、３２、３３は、４箇所における個別的な作動のために互いに異なる温度に調節されることができる。加熱ブロック−断熱ブロック組立体に巻きつけられているキャピラリーチューブ１３は各々の位置によって接触する加熱ブロックが相異するようになる。図３ｂに示したように、各キャピラリーチューブ１３は互いに異なる温度に調節される３つの加熱ブロック１１、３１、３３又は１１、３２、３３に繰り返して接触することになる。キャピラリーチューブの内部温度は加熱ブロックの温度によって調節され、キャピラリーチューブ内に流れる流体の温度に影響を及ぼし、これによって流体は互いに異なる３つの温度区間を繰り返して通過するようになる。

前記多重連続流式反応装置を用いれば、一度に４つの独立的なキャピラリーチューブで反応を遂行することができるという利点がある。

具体的に、前記キャピラリーチューブ内を流れる流体としてＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ混合液を使用する場合、前記多重連続流式反応装置をＰＣＲに利用することができる。ＰＣＲを遂行する方法は、前述したＰＣＲを遂行する反応装置の方法と同様である（図３ｃ参照）。つまり、ＰＣＲ混合液２７がキャピラリーチューブ１３に沿って熱変性（加熱ブロック３３に該当する）、アニーリング（加熱ブロック１１に該当する）、及び伸張（加熱ブロック３１、３２に該当する）温度に適するように設定された加熱ブロックを繰り返して接触する。その結果、鋳型ＤＮＡ（核酸）が増幅されて多量のＤＮＡ２８を生産する。

ＰＣＲのアニーリング段階を遂行する加熱ブロック１１は、各々の試料に対する最適のアニーリング温度に設定されることが望ましい。最適のアニーリング温度はプライマーと鋳型ＤＮＡの塩基配列によってＰＣＲ遂行時ごとに異なるが、大略４５℃から６５℃の間で設定されることが望ましい。ＰＣＲの熱変性段階を遂行する加熱ブロック３３はキャピラリーチューブが巻き付けられている４つの加熱ブロック−断熱ブロック組立体に全部接触する。加熱ブロック３３の温度は約９５℃程度に設定されることが好ましい。ＰＣＲの伸張段階を遂行する加熱ブロック３１、３２は、それぞれキャピラリーチューブが巻きつけられている２つの加熱ブロック−断熱ブロック組立体に接触する。加熱ブロック３１、３３の温度は、使用されるＤＮＡポリメラーゼによって決められるが、Ｔａｑポリメラーゼを使用する場合、７２℃に設定されることが望ましい。

また、ＰＣＲ遂行中にＤＮＡ増幅程度を実時間で調べるために、実時間検出装置が使用されることができる。

具体的に本発明は、 前記高性能連続流式反応装置において、蛍光を誘発する光源、蛍光を検出する検出器、及び光線をキャピラリーチューブに照射した後、発生する蛍光を検出器に集束させる光学装置を含む蛍光誘導装置と、前記蛍光誘導装置及びキャピラリーチューブの相対的な位置を変化させることができる走査装置とを更に含み、実時間反応進行度を探知することを特徴とする高性能連続流式反応装置を提供する。

前記蛍光を誘発する光源としては特定波長の光線を照射するレーザー又はランプなどが用いられ、蛍光を検出する検出器としてはＰＭＴ又はダイオードなどが用いられることができる。前記光学装置には、レーザー光線を通過させ蛍光光は反射させる役割をする二色鏡（dichromatic mirror）と、レーザー光線をキャピラリーチューブに集束させてキャピラリーチューブから発生する蛍光を集めて二色鏡に伝達する役割をする対物レンズとが含まれることができる。一方、前記走査装置は蛍光誘導装置が固定された状態で、キャピラリーチューブが巻きつけられている加熱ブロックを一定の速度で往復移動させるか、加熱ブロックが固定された状態で蛍光誘導装置を一定の速度で往復移動させることで、蛍光誘導装置及びキャピラリーチューブの相対的な位置を変化させる役割を果たす。

次に、図４を参照して、ＤＮＡ増幅に対する実時間検出方法について説明する。ＤＮＡが増幅されることにより、蛍光を発生する物質が添加されたＰＣＲ混合液２７をキャピラリーチューブ１３に注入する。その後、特定波長のレーザー光線４１を二色鏡４３と対物レンズ４４を経てキャピラリーチューブ１３に照射する。前記キャピラリーチューブから発生する蛍光４２の量を検出器で測定すると、キャピラリーチューブ内におけるＤＮＡの増幅程度を実時間で検出できる。

本発明による連続流式反応装置は、連続的に流れる流体を反応させるが、特にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の遂行に有用できる。更に、本発明による多重連続流式反応装置の場合は、互いに異なる反応条件を有する反応を同時に２箇所以上で遂行することができるという長所がある。従って、本発明による装置はサイズが小さくて携帯可能なＤＮＡ多重増幅機器の製作などに応用することができる。巻き付けられたキャピラリーチューブのサイズがバイオチップ上の微細チャンネルと類似するので、前記装置はラブ・オン・ア・チップ（lab-on-a-chip）と容易に一体化できる。また、実時間検出装置を結合することで、ＰＣＲ中にＤＮＡの増幅程度を実時間で確認することができる。

次に、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。但し、これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明がこれらに限定されるわけではない。

＜実施例１＞連続流式反応装置の製作
（１−１）連続流式ＰＣＲ装置の製作
図２ａに示したように、本発明による連続流式ＰＣＲ装置において、３つの加熱ブロック２１、２２、２３は銅を用いて製作し、断熱ブロック１２はベークライトを用いて製作した。

前記３つの加熱ブロックを断熱ブロックの各側面に搭載して直径３０ｍｍ、高さ６５ｍｍの加熱ブロック−断熱ブロック組立体を製作した（図２ｂ参照）。前記加熱ブロック−断熱ブロック組立体は、内部に断熱ブロックと該断熱ブロックを取り囲む同一の長さのアークを有する３つの加熱ブロックを有する。

各々の加熱ブロックには、加熱のためのヒーターを挿入するための穴と、加熱ブロックの温度を測定して調節するための温度センサーを挿入するための穴とを穿孔した。具体的に、ヒーター（Firerod, Watlow, St. Louis, MO）を挿入するための穴は３．１ｍｍの直径及び３２ｍｍの長さを有し、温度調節センサー（Watlow, St. Louis, MO）を挿入するための穴は１ｍｍの直径及び２７ｍｍの長さを有するように製作した。

前記加熱ブロック−断熱ブロック組立体の外周に深さ２５０μｍ、幅２５０μｍの螺旋溝をらせん回転（Turn of the helix）当たり１．５ｍｍのピッチ（pitch）で形成した。前記螺旋溝は加熱ブロックの周りにキャピラリーチューブの位置を固定させ、反応時に熱伝達を容易にする。前記螺旋溝が加熱ブロック−断熱ブロック組立体の縦方向へ３３回回転するように製作したが、これはＤＮＡ増幅反応に際してＰＣＲサイクルの回数となる。また、前記キャピラリーチューブは、前記加熱ブロック−断熱ブロック組立体の螺旋溝の全体を巻きつけるとともに、溶液注入及び溶液回収などに必要な全ての部分の周囲を取り囲むもので、総３．５メートルを使用した。

熱変性段階を遂行する加熱ブロックの先頭部及び伸張段階を遂行する加熱ブロックの終端部を巻き付けるキャピラリーチューブは、最初の熱変性段階から最終の伸張段階までの完全なＰＣＲが進行するように長く製作した。

図２ａ及び図２ｂに示したように、加熱ブロック−断熱ブロック組立体において、加熱ブロックの両末端にキャピラリーチューブが長く突出している。

キャピラリーチューブは、ポリイミドをコーティングした外径２４０μｍ、内径１００μｍの溶融シリカ材質のものを使用した（Polymicro Technologies, Phoenix, AZ）。ＤＮＡやタンパク質などの生体物質がキャピラリーチューブの内壁に吸着されることを防止するために、前記キャピラリーチューブの内壁をシラン化した。シラン化のためには、まず、キャピラリーチューブにメタノールを３０分間流してから、４０℃にて１２時間乾燥させた後、０．０２ＭのＴＭＳ（trimethylchlorosilane）と０．０４Ｍのイミダゾールとを含むＤＭＦ（dimethylformamide）溶液を充たして常温で一日間放置した。シラン化反応が終了した後、キャピラリーチューブをメタノール及び減菌蒸留水で洗い流した（rinse）。

前記キャピラリーチューブを加熱ブロック−断熱ブロック組立体の外面に形成された螺旋溝に嵌合させることで、連続流式ＰＣＲ装置を製作した。

（１−２）多重連続流式ＰＣＲ装置の製作
図３ｂ乃至図３ｅに示したように、多重連続流式ＰＣＲ装置を製作した。前記装置において、加熱ブロック及び断熱ブロックの材質としては前記実施例（１−１）と同様にそれぞれ銅及びベークライトを用いた。

まず、一つの加熱ブロック１１に一つの断熱ブロック１２を組み立てて直径２０ｍｍ、高さ４０ｍｍの加熱ブロック−断熱ブロック組立体を製造した。このような組立体を４つ製造した。各々の組立体の外周に深さ２４０μｍ、幅２４０μｍの螺旋溝をらせん回転当たり１ｍｍのピッチで形成した。前記螺旋溝が組立体の縦方向へ３４回、回転するように製作した。また、前記キャピラリーチューブは、前記組立体の螺旋溝の全体を巻きつけるとともに、溶液注入及び溶液回収などに必要な全ての部分の周囲を取り囲むもので、約２メートルを使用した。

前記組立体において、各々の加熱ブロックには、前記実施例（１−１）と同様にヒーター及び温度センサーを挿入するための穴を穿孔した。前記実施例（１−１）で使用した溶融シリカキャピラリーチューブやＰＴＦＥキャピラリーチューブ（Cole-Parmer Instrument, Co.）を使用した。

キャピラリーチューブを巻き付けて完成された前記４つの組立体を別途 の３つの加熱ブロック３１、３２、３３に各々組み立て、２つの加熱ブロック３１、３２は２つのキャピラリーチューブと接触し、一つの加熱ブロック３３は４つのキャピラリーチューブと接触するように組み立てることにより、多重連続流式ＰＣＲ装置を製作した（図３ｂ、図３ｄ、及び図３ｅ参照）。

＜実施例２＞連続流式ＰＣＲ
前記実施例（１−１）で製造した装置を用いてキャピラリーチューブ内でのＰＣＲ混合液の連続流相でＰＣＲを遂行した。

鋳型ＤＮＡとしてはカナマイシン耐性遺伝子から分離したプラスミドＤＮＡ（promega）を使用し、配列番号１及び配列番号２に表示される塩基配列を有するプライマーを用いて前記プラスミドＤＮＡのうち３２３ｂｐの断片を増幅した。ＰＣＲ混合液（総５０μL）の組成を次のようであり、３μLの２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５μLの１０Ｘ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼバッファー（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ(登録商標) Ｘ−１００）、１μLの１０ｍＭ ＰＣＲヌクレオチド混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰがそれぞれ水に１０ｍＭずつ溶解されているもの）、３．３μLの１２μＭ アップストリームプライマー、３．３μLの１２ｍＭ ダウンストリームプライマー、０．２５μLの５ユニット／μL Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１μL（１ｎｇ）の鋳型ＤＮＡ、そして３３．１５μLの減菌された３次蒸留水の組成を有する。

キャピラリーチューブ内に０．３から５．０μL／分の流速で連続的にＰＣＲ混合液を注入するためにシリンジポンプ（22 Multiple Syringe Pump, Harvard Apparatus）を利用した。ガスタイトシリンジ（gas tight syringe）（２５０μL容量）にＰＣＲ混合液を充たしてこれをポンプに連結した。注射器の先端部をキャピラリーチューブの流体注入口の末端（熱変性反応を遂行する加熱ブロックの先頭部）側に連結した後ポンプすることにより、キャピラリーチューブにシリンジ内のＰＣＲ混合液が持続的に注入されて流れるようにした。

前記装置において、各々の加熱ブロックの温度を９５℃、６０℃、及び７２℃に保ち、前記ＰＣＲ混合液が前記加熱ブロックを繰り返して接触するようにした。ＰＣＲ混合液の移動速度をそれぞれ０．３、０．５、１．０、３．０、５．０μL／分に設定してＰＣＲを行った。

０．３μL／分の速度では溶液注入してから９０分後に、５μL／分の速度では溶液注入してから約５分後に、キャピラリーチューブの流体排出口の末端（伸張反応を行う加熱ブロックの終端）からＰＣＲ産物を集めた。

＜実施例３＞増幅されたＤＮＡの確認
ＰＣＲが終了した試料のＤＮＡ増幅の有無を確認するために、ゲル電気泳動を施した。前記実施例２で収得した１０μLのＰＣＲ産物をＴＢＥ緩衝溶液上で２％アガロースゲル電気泳動で分析した。ＤＮＡ増幅水準を確認するために、既存の市販の機器（ＭＢＳ ０．２Ｇ，Ｈｙｂａｉｄ， Ｕ．Ｋ．）を用いて増幅した陽性対照区用試料及びサイズマーカーを一緒にロードした。市販の機器におけるＰＣＲ条件は９５℃で２分、そして９５℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で２分であった。このようなサイクルを３３回繰り返し、７２℃にて５分間放置した。前記ＰＣＲ産物を４℃に冷却してＰＣＲ反応を終了した。

図５はＰＣＲ産物のゲル電気泳動結果を示す。図５において、レーン１（陽性対照区）は既存の市販の機器を用いてＤＮＡを増幅した結果であり、レーン２乃至６は０．３μL／分乃至５．０μL／分範囲での異なる流速におけるＤＮＡ増幅程度の差を示したもので（左側から０．３、０．５、１．０、３．０及び５．０μL／分）、レーン７（陰性対照区）はＰＣＲによって増幅されなかったＤＮＡを、そしてレーン８は増幅されたＤＮＡのサイズを測定するためのサイズマーカー（size marker）を示したものである。図５に示されたように、本発明による連続流式ＰＣＲ装置を利用することで、高効率のＤＮＡ増幅が可能であった。特に、ＰＣＲ混合液の移動速度が遅いほど、伸張反応が完全に進行するので、ＰＣＲ混合液の低い移動速度で増幅効率が高いことが分かった。

＜実施例４＞互いに異なるＰＣＲ混合液を用いた順次的ＤＮＡ増幅
本発明者らは、本発明による連続流式ＰＣＲ装置が互いに異なる組成を有するＰＣＲ混合液を順次に注入した場合でも各々の鋳型ＤＮＡに対する増幅反応を行うことができるか否かを調べた。

前述のようなＰＣＲを遂行するために、４つの鋳型ＤＮＡ及び各々のＤＮＡに対する一対のプライマーを含むＰＣＲ混合液を用意した。このとき、使用された鋳型ＤＮＡ及びプライマーは下記の表１に示した。

各々の鋳型ＤＮＡ及びプライマーを含むＰＣＲ混合液（試料１乃至試料４）を用意した。各ＰＣＲ混合液の成分は前記実施例２で使用したもの同じであった。試料は次のような順序で繰り返して注入した。即ち、試料１（２μL）−空気層（＜１ｃｍ）−ブロモフェノールブルー（２μL）−空気層（＜１ｃｍ）− 試料２（２μL）−空気層（＜１ｃｍ）−ブロモフェノールブルー（２μL）−空気層（＜１ｃｍ）− 試料３（２μL）−空気層（＜１ｃｍ）−ブロモフェノールブルー（２μL）−空気層（＜１ｃｍ）− 試料４（２μL）−空気層（＜１ｃｍ）−ブロモフェノールブルー（２μL）−空気層（＜１ｃｍ）−試料１（２μL）の順に注入した。

前述において、空気層とブロモフェノールブルー緩衝溶液（３０％ グリセロール、３０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３％ ブロモフェノールブルー、０．０３％ キシレンシアノール）（購入先：Ｔａｋａｒａ）はキャリオーバ（carryover）現象を防止するために各々のＰＣＲ混合液の間に注入した。

その後、キャピラリーチューブの流体排出口の末端において、各々のＰＣＲ産物をブロモフェノールブルー溶液の色と空気層の介在によって識別して集めた。

なお、ＤＮＡ増幅の効率において、内壁コーティング効果を確認するために、本発明者らはキャピラリーチューブの内壁がトリメチルクロロシラン（ＴＭＳ）でコーティングされたキャピラリーチューブ及びコーティングされていないキャピラリーチューブをそれぞれ用いてＰＣＲを行った。

ＰＣＲ産物のＤＮＡ増幅の有無を確認するために、実施例３と同様な方法で、ゲル電気泳動を行った。一方、ＤＮＡ増幅の程度を確認するために、市販の機器（ＭＢＳ ０．２Ｇ，Ｈｙｂａｉｄ，Ｕ．Ｋ．）を用いて増幅した陽性対照区試料とサイズマーカーを一緒にロードした。市販の機器でのＰＣＲ条件は９５℃で２分、それから９５℃で３０秒、６０℃で１分、７２℃で２分であった。このようなサイクルを３３回繰り返し、７２℃で５分間放置した。前記ＰＣＲ産物を４℃に冷却してＰＣＲ反応を終了した。

図６はＰＣＲ産物のゲル電気泳動結果を示す。図６において、レーン１は増幅されたＤＮＡのサイズを測定するためのサイズマーカーであり、レーン２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６は市販のＰＣＲ機器を用いて遂行した試料１乃至４に対するＤＮＡ増幅結果を示す。そして、レーン３、５、７、及び９は内壁がコーティングされていないキャピラリーチューブを用いた試料１乃至４に対するＤＮＡ増幅結果を示し、レーン１１、１３、１５及び１７は内壁がコーティングされたキャピラリーチューブを用いた試料１乃至４に対するＤＮＡ増幅結果を示すものである。

図６のレイン１１、１３及び１５から分かるように、試料１乃至３に対するＤＮＡ増幅が効率的に行われたことを確認することができる。その結果、本発明による装置は互いに異なるＰＣＲ混合液を利用した順次的ＤＮＡ増幅を行うことに適用可能である。

以上、本発明の好適な実施例について詳述したが、本発明の範囲は前述した実施例に制限されることはなく、特許請求範囲によって定義された本発明のカテゴリ内で当業者によって多様に修正又は変更できることは明らかである。

本発明の好適な第１実施形態による高性能連続流式反応装置を示す概略図である。 本発明の好適な第１実施形態による高性能連続流式反応装置を示す概略図である。 本発明の好適な第２実施形態による高性能連続流式反応装置を示す概略図である。 本発明の好適な第２実施形態による高性能連続流式反応装置を示す写真である。 本発明による多重連続流式反応装置を製造するためにキャピラリーチューブが巻き付けられた加熱ブロック−断熱ブロック組立体を製造する過程を示す図である。 本発明による多重連続流式反応装置の一例を示す平面図である。 本発明による多重連続流式反応装置の一例を示す正面図である。 本発明の好適な第３実施形態によって製造された多重連続流式反応装置を示す写真である。 図３ｄの装置にキャピラリーチューブを巻き付け、ヒーター及びセンサーを装着した本発明による多重連続流式反応装置を示す写真である。 本発明による連続流式反応装置に実時間検出装置を連結した、実時間反応検出のための装置の一例を示す図である。 本発明による連続流式反応装置によりＰＣＲを遂行した後、試料のＤＮＡ増幅の有無を確認したゲル写真である。 互いに異なる組成を有するＰＣＲ混合液を順次に注入してＰＣＲを遂行した後、試料のＤＮＡ増幅の有無を確認したゲル写真である。

符号の説明

１１ 加熱ブロック
１２ 断熱ブロック
１３ キャピラリーチューブ
２１、２２、２３ 加熱ブロック
２７ ＰＣＲ混合液
２８ ＤＮＡ
３１、３２、３３ 加熱ブロック
４１ レーザー光線
４２ 蛍光
４３ 二色鏡
４４ 対物レンズ

Claims (21)

1. 複数の加熱ブロック−断熱ブロック組立体が温度調節可能な複数の加熱ブロックと組み立てられて２つ以上の独立的な反応の遂行を可能にし、それぞれの組立体上に流体注入口である第１末端と流体排出口である第２末端を有し、第１末端から第２末端への連続的な流体のフローを許容するキャピラリーチューブが巻きつけられていることを特徴とする高性能多重連続流式反応装置。
2. ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を遂行することを目的とする請求項１記載の高性能多重連続流式反応装置。
3. 前記加熱ブロックが、ヒーター及び温度センサーを用いて互いに異なる温度に調節されることを特徴とする請求項１記載の高性能多重連続流式反応装置。
4. 前記加熱ブロックが、銅、鉄、アルミニウム、黄銅、金、銀及び白金からなる群から選択された熱伝導性金属を用いて製造されることを特徴とする請求項１記載の高性能多重連続流式反応装置。
5. 前記断熱ブロックがベークライト又はアクリルポリマー樹脂を用いて製造されたことを特徴とする請求項１記載の高性能多重連続流式反応装置。
6. 前記キャピラリーチューブが、ガラス、溶融シリカ、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）及びポリエチレンからなる群から選択された材質で製造されたことを特徴とする請求項１記載の高性能多重連続流式反応装置。
7. 前記キャピラリーチューブの外壁が、ポリイミド又はポリテトラフルオロエチレンでコーティングされたことを特徴とする請求項１記載の高性能多重連続流式反応装置。
8. 前記キャピラリーチューブの内壁が、トリメチルクロロシラン、ジメチルジクロロシラン、メチルトリクロロシラン、トリメチルメトキシシラン、ジメチルジメトキシシラン、及びメチルトリメトキシシランからなる群から選択された少なくとも１つ以上の物質でコーティングされたことを特徴とする請求項１記載の高性能多重連続流式反応装置。
9. 前記キャピラリーチューブが、前記加熱ブロック−断熱ブロック組立体の外面に形成された螺旋溝に沿って固定されたことを特徴とする請求項１記載の高性能多重連続流式反応装置。
10. 前記キャピラリーチューブが、前記加熱ブロック−断熱ブロック組立体の外面周囲に１０回乃至５０回巻き付けられていることを特徴とする請求項１記載の高性能多重連続流式反応装置。
11. 蛍光を誘発する光源、蛍光を検出する検出器、及び光線をキャピラリーチューブに照射した後、発生する蛍光を検出器に集束させる光学装置を含む蛍光誘導装置と、
    前記蛍光誘導装置及びキャピラリーチューブの相対的な位置を変化させることができる走査装置とを更に含み、実時間反応進行度を探知できることを特徴とする請求項１記載の高性能多重連続流式反応装置。
12. 前記反応が実時間ポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする請求項１１記載の高性能多重連続流式反応装置。
13. （ａ）請求項１に記載の装置におけるキャピラリーチューブの第１末端に１つ以上のＰＣＲ混合液を注入する段階と、
    （ｂ）適切な速度でＰＣＲ混合液の流速を制御しながら第２末端から排出されるＰＣＲ産物を回収する段階を含むことを特徴とする高性能多重連続流式核酸増幅方法。
14. 請求項１に記載の装置におけるキャピラリーチューブを９５〜１００℃、４５〜６５℃及び６５〜７２℃に設定された加熱ブロックに順次に又は繰り返して接触させることを特徴とする請求項１３記載の高性能多重連続流式核酸増幅方法。
15. 前記キャピラリーチューブが、前記加熱ブロック−断熱ブロック組立体に１０回乃至５０回繰り返して接触することを特徴とする請求項１３記載の高性能多重連続流式核酸増幅方法。
16. 前記ＰＣＲ混合液が、ＭｇＣｌ_２、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）混合液、１つ以上のプライマー、１つ以上の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼバッファー、及び１つ以上の鋳型ＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１３記載の高性能多重連続流式核酸増幅方法。
17. 前記プライマーが分子指標（molecular beacon）であることを特徴とする請求項１６記載の高性能多重連続流式核酸増幅方法。
18. 前記ＰＣＲ混合液が、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合して蛍光を放出することができる１つ以上のインターカレーティング色素（intercalating dye）を更に含むことを特徴とする請求項１６記載の高性能多重連続流式核酸増幅方法。
19. 前記ＰＣＲ混合液が、ポンプによりキャピラリーチューブの第１末端から第２末端まで移動することを特徴とする請求項１３記載の高性能多重連続流式核酸増幅方法。
20. 前記段階（ａ）におけるＰＣＲ混合液が、連続的又は断続的に注入されることを特徴とする請求項１３記載の高性能多重連続流式核酸増幅方法。
21. 断続的に注入されるＰＣＲ混合液が互いに異なる組成を有する場合、１つの組成を有する組成物を注入した後、有機溶媒又は空気層を注入する段階を更に含むことを特徴とする請求項２０記載の高性能多重連続流式核酸増幅方法。

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