JP2014512826A - 核酸分析のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2011年4月25日に出願された米国仮特許出願第61/478,777号(この出願は、参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
本明細書において言及する刊行物、特許および特許出願は全て、個々の刊行物、特許または特許出願がそれぞれ、参照により組み込まれていることを具体的かつ個々に示すのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
一般に、バーコード付け(または「タグ付け」)により、1つの試料当たりの配列決定のコストを低下させるために、核酸の試料をプールし、さらにまた、どの試料から、配列読取りが得られるかを決定する能力を保持することが可能になり得る。別個のライブラリーの調製物を、各試料について調製することができ、各試料は、それ自体の独自のバーコードを有し得る。次いで、独自のバーコードを有する、別個に調製したライブラリーを、プールし、配列を決定することができる。結果として得られるデータセットのそれぞれの配列読取りから、該配列読取り中のバーコードを介して、元々の試料に遡ることができる。
より小さい液滴(例えば、内側の液滴)を、より大きい液滴(例えば、外側の液滴)と融合させるためのいくつかの方法が、例えば、米国特許出願公開第20110053798号に開示されている。場合によっては、加熱/冷却して温度を変化させること、圧力を加えること、(例えば、化学添加剤を介して)組成を変更すること、(例えば、音波処理を介して)音響エネルギーを加えること、(例えば、光化学反応を刺激するための)光に対する曝露、電場を適用すること、または任意のそれらの組合せにより、内側の液滴(または区画)を、外側の液滴(または区画)と融合させることができる。場合によっては、上記内側の液滴を、外側の液滴に自発的に融合させることができる。処理は、連続的であってもよく、または時間的に変動してもよい(例えば、拍動性、ショックおよび/または反復処理)。上記処理により、エマルジョンのパラメータを、徐々にまたは迅速に変化させて、液滴の融合の定常状態または一過性の開始をもたらすことができる。上記区画の安定性、および液滴の融合を引き起こすための処理に対するそれらの応答性を、それらの形成の間に、内側/外側の区画の1つまたは複数の相に適当な界面活性剤のタイプ、界面活性剤の濃度、臨界ミセル濃度、イオン強度等を選択することによって決定することができる。
バーコードは、アダプター上に存在し得、バーコードを有するアダプターを、ライゲーションによりポリヌクレオチドに結合することができる。多様なタイプのアダプターを、本明細書に記載する方法、組成物、システムおよびキットにおいて使用することができる。例えば、アダプターは、二本鎖配列を含むことができる。二本鎖配列を有するアダプターは、1つの平滑末端を含むことができる。場合によっては、二本鎖配列を有するアダプターは、2つの平滑末端を含む。二本鎖配列を有するアダプターは、1つの3’オーバーハングを含むことができる。二本鎖配列を有するアダプターは、2つの3’オーバーハングを含むことができる。二本鎖配列を有するアダプターは、1つの5’オーバーハングを含むことができる。場合によっては、二本鎖配列を有するアダプターは、2つの5’オーバーハングを含むことができる。二本鎖配列を有するアダプターは、5’オーバーハングおよび3’オーバーハングを含むことができる。場合によっては、アダプターは、一本鎖核酸のみを含む。
アダプターは、1つまたは複数のバーコード(タグ)配列を含むことができる。バーコード配列は、独自の識別子となり得る。いくつかの実施形態では、バーコードは、約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50個の塩基もしくは塩基対、約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50個超の塩基もしくは塩基対、約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50個未満の塩基もしくは塩基対、または少なくとも約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50個の塩基もしくは塩基対である。いくつかの実施形態では、バーコードは、約4〜約6個の塩基もしくは塩基対(bp)、約4〜約7個の塩基もしくは塩基対、約4〜約8個の塩基もしくは塩基対、約4〜約9個の塩基もしくは塩基対、約4〜約10個の塩基もしくは塩基対、約4〜約12個の塩基もしくは塩基対、約4〜約14個の塩基もしくは塩基対、約4〜約16個の塩基もしくは塩基対、約4〜約18個の塩基もしくは塩基対、約4〜約20個の塩基もしくは塩基対、約5〜約10個の塩基もしくは塩基対、約5〜約15個の塩基もしくは塩基対、約5〜約20個の塩基もしくは塩基対、約5〜約25個の塩基もしくは塩基対、約5〜約30個の塩基もしくは塩基対、約5〜約35個の塩基もしくは塩基対、約5〜約40個の塩基もしくは塩基対、または約5〜約50個の塩基もしくは塩基対である。いくつかの実施形態では、バーコード中の塩基は、近接する。いくつかの実施形態では、バーコード中の塩基は、近接しない。いくつかの実施形態では、アダプターは、バーコードを含まない。
アダプターは、1つまたは複数のプライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの部位を含むことができる。1つまたは複数のプライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの部位は、約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50個の塩基、約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50個超の塩基、約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50個未満の塩基、または少なくとも約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50個の塩基であり得る。プライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの部位を使用して、増幅のために、オリゴヌクレオチドプライマーを上記アダプターにアニールさせること、または配列決定反応のために、プライマーを該アダプターにアニールさせることができる。アダプターは、2つ以上のオリゴヌクレオチドのプライマーまたはプローブ、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個以上のオリゴヌクレオチドのプライマーまたはプローブのアニーリングのための配列を含むことができる。アダプターは、配列決定プライマーおよび増幅プライマーをアニールさせるための部位を有し得る。アダプターにアニールするプライマーまたはプローブの長さは、約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30個の塩基、約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30個超の塩基、約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30個未満の塩基、または少なくとも約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30個の塩基であり得る。
アダプターは、1つまたは複数の制限酵素の結合部位および/または切断部位を含むことができる。アダプターに結合することまたはアダプターを切断することができる制限酵素は、例えば、AatII、Acc65I、AccI、AciI、AclI、AcuI、AfeI、AflII、AflIII、AgeI、AhdI、AleI、AluI、AlwI、AlwNI、ApaI、ApaLI、ApeKI、ApoI、AscI、AseI、AsiSI、AvaI、AvaII、AvrII、BaeGI、BaeI、BamHI、BanI、BanII、BbsI、BbvCI、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BclI、BfaI、BfuAI、BfuCI、BglI、BglII、BlpI、BmgBI、BmrI、BmtI、BpmI、Bpu10I、BpuEI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BsaJI、BsaWI、BsaXI、BseRI、BseYI、BsgI、BsiEI、BsiHKAI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BsoBI、Bsp1286I、BspCNI、BspDI、BspEI、BspHI、BspMI、BspQI、BsrBI、BsrDI、BsrFI、BsrGI、BsrI、BssHII、BssKI、BssSI、BstAPI、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BstXI、BstYI、BstZ17I、Bsu36I、BtgI、BtgZI、BtsCI、BtsI、Cac8I、ClaI、CspCI、CviAII、CviKI−1、CviQI、DdeI、DpnI、DpnII、DraI、DraIII、DrdI、EaeI、EagI、EarI、EciI、Eco53kI、EcoNI、EcoO109I、EcoP15I、EcoRI、EcoRV、FatI、FauI、Fnu4HI、FokI、FseI、FspI、HaeII、HaeIII、HgaI、HhaI、HincII、HindIII、HinfI、HinP1I、HpaI、HpaII、HphI、Hpy166II、Hpy188I、Hpy188III、Hpy99I、HpyAV、HpyCH4III、HpyCH4IV、HpyCH4V、KasI、KpnI、MboI、MboII、MfeI、MluI、MlyI、MmeI、MnlI、MscI、MseI、MslI、MspA1I、MspI、MwoI、NaeI、NarI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、NciI、NcoI、NdeI、NgoMIV、NheI、NlaIII、NlaIV、NmeAIII、NotI、NruI、NsiI、NspI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、PacI、PaeR7I、PciI、PflFI、PflMI、PhoI、PleI、PmeI、PmlI、PpuMI、PshAI、PsiI、PspGI、PspOMI、PspXI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、RsrII、SacI、SacII、SalI、SapI、Sau3AI、Sau96I、SbfI、ScaI、ScrFI、SexAI、SfaNI、SfcI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SmlI、SnaBI、SpeI、SphI、SspI、StuI、StyD4I、StyI、SwaI、T、TaqαI、TfiI、TliI、TseI、Tsp45I、Tsp509I、TspMI、TspRI、Tth111I、XbaI、XcmI、XhoI、XmaI、XmnIまたはZraIであり得る。
アダプターは、1つまたは複数の末端の改変を含むことができる。アダプターは、1つの5’ホスフェートを含むことができる。アダプターは、2つの5’ホスフェートを含むことができる。アダプターは、1つの3’ヒドロキシルを含むことができる。アダプターは、2つの3’ヒドロキシルを含むことができる。アダプターは、3’ヒドロキシルを欠く場合がある。
区画を、デジタルPCRのために使用することができる、分離の任意のモードにより形成することができる。区画は、マイクロ流体チャネル、ナノもしくはマイクロ流体デバイスまたはマイクロタイタープレートのウェル、あるいはマイクロ流体デバイスの反応チャンバーであり得る。区画は、アレイ表面上の領域であり得る。区画は、エマルジョンの水相(例えば、液滴)であり得る。液滴を生成する方法を、本明細書に記載する。
本開示は、例えば、液滴デジタルPCRを使用して、液滴中の遺伝物質を操作するための組成物、方法およびキットを含む。本明細書に記載する液滴は、米国特許第7,622,280号に記載されているエマルジョン組成物(または2つ以上の不混和性の流体の混合物)、および国際出願公開第WO/2010/036352号、第1発明者:Colstonに記載されている、デバイスにより生成される液滴を含むことができ、それらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。エマルジョンという用語は、本明細書で使用する場合、不混和性の液体の混合物(例として、油と水)を指すことができる。油相および/または油中水型のエマルジョンにより、水性の液滴内の反応混合物の区画に分けることが可能になり得る。いくつかの実施形態では、上記エマルジョンは、連続的な油相内に、水性の液滴を含むことができる。その他の実施形態では、本明細書において提供するエマルジョンは、水中油型エマルジョンであり、ここで、上記液滴が、連続的な水相内の油の液滴である。本明細書において提供する液滴を使用して、コンパートメント間の混合を阻止することができ、各コンパートメントは、その内容物を、蒸発、およびその他のコンパートメントの内容物との合体(coalescing)から保護することができる。1つまたは複数の酵素反応が、液滴中で発生し得る。
区画、例えば、エマルジョンの水相は、1つまたは複数の添加剤を含むことができ、それらの添加剤として、これらに限定されないが、非特異的なバックグラウンド/ブロッキング核酸(例えば、サケ精子DNA)、バイオプリザバティブ(例えば、アジ化ナトリウム)、PCRエンハンサー(例えば、ベタイン(N,N,N−トリメチルグリシン;[カルボキシメチル]トリメチルアンモニウム)、トレハロース等)、および/または阻害剤(例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤)が挙げられる。例えば、ベタインおよびDMSOを含む、GCに富む添加剤を、本明細書において提供する方法中でアッセイする試料に添加することができる。
区画、例えば、エマルジョンの水相は、オリゴヌクレオチドプライマーを含むことができる。上記オリゴヌクレオチドプライマーを、増幅のために使用することができる。区画、例えば、エマルジョンの水相内における増幅のためのプライマーは、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9もしくは1.0μM、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9もしくは1.0μM超、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9もしくは1.0μM未満、または少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9もしくは1.0μMの濃度を有し得る。各プライマーの濃度は、約0.5μMであり得る。プライマーを、二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するための既知のパラメータに従って設計することができる。異なるプライマー対は、別のプライマー対とほぼ同じ温度で、例えば、別のプライマー対の約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10℃以内でアニールおよび融解することができる。場合によっては、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、500、1000、5000または10,000個以上よりも多いプライマーを、最初に使用する。かかるプライマーは、本明細書に記載する遺伝子標的にハイブリダイズすることが可能であり得る。約2〜約10,000個、約2〜約5,000個、約2〜約2,500個、約2〜約1,000個、約2〜約500個、約2〜約100個、約2〜約50個、約2〜約20個、約2〜約10個または約2〜約6個のプライマーを使用することができる。
区画、例えば、エマルジョンの水相は、蛍光検出のための1つまたは複数のプローブを含むことができる。上記1つまたは複数のプローブのそれぞれの濃度は、約0.1、0.2、0.3、0.4もしくは0.5μM、約0.1、0.2、0.3、0.4もしくは0.5μM超、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4もしくは0.5μM、または約0.1、0.2、0.3、0.4もしくは0.5μM未満であり得る。蛍光検出のための上記1つまたは複数のプローブの濃度は、約0.25μMであり得る。PCRにおける標的核酸の濃度についての妥当な範囲は、約1pg〜約500ngの間であり得る。プローブは、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39もしくは40塩基長、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39もしくは40塩基長超、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39もしくは40塩基長未満、または少なくとも約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39もしくは40塩基長であり得る。プローブは、約8〜約40個、約10〜約40個、約10〜約35個、約10〜約30個、約10〜約25個、約10〜約20個、約15〜約40個、約15〜約35個、約15〜約30個、約15〜約25個、約15〜約20個、約18〜約40個、約18〜約35個、約18〜約30個、約18〜約25個または約18〜22個の塩基であり得る。プローブ(例えば、Taqmanプローブ)上で使用する標識(蛍光団、色素)は、例えば、6−カルボキシフルオレセイン(FAM)、テトラクロロフルオレセイン(tetrachlorofluorescin)(TET)、4,7,2’−トリクロロ−7’−フェニル−6−カルボキシフルオレセイン(VIC)、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、テトラメチルローダミン、ROX、ならびにJOE、Alexa Fluor色素、例えば、Alexa Fluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、633、647、660、680、700および750;Cascade Blue、Marina Blue、Oregon Green500、Oregon Green514、Oregon Green488、Oregon Green488−X、Pacific Blue、Rhodamine Green、Rhodol Green、Rhodamine Green−X、Rhodamine Red−X、ならびにTexas Red−Xであり得る。上記標識は、上記プローブの5’末端、上記プローブの3’末端、プローブの5’末端および3’末端の両方、または上記プローブの内部にあり得る。独自の標識を使用して、実験において異なる遺伝子座をそれぞれ検出することができる。プローブ、例えば、Taqmanプローブは、クエンチャー、例えば、上記3’クエンチャーを含むことができる。3’クエンチャーは、例えば、TAMARA、DABCYL、BHQ−1、BHQ−2またはBHQ−3であり得る。場合によっては、本明細書で提供する方法において使用するクエンチャーは、ブラックホールクエンチャー(BHQ)である。場合によっては、上記クエンチャーは、マイナーグローブバインダー(MGB)である。場合によっては、上記クエンチャーは、蛍光クエンチャーである。その他の場合には、上記クエンチャーは、非蛍光クエンチャー(NFQ)である。
区画、例えば、エマルジョンの水相は、ポリメラーゼを含むことができる。上記ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼであり得る。上記DNAポリメラーゼは、例えば、T4DNAポリメラーゼ、DEEP VENT(商標)DNAポリメラーゼ、LONGAMP(登録商標)Taq、PHUSION(登録商標)High Fidelity DNAポリメラーゼ、LONGAMP(登録商標)Hot Start Taq、Crimson LONGAMP(登録商標)Taq、Taq DNAポリメラーゼ、Crimson Taq DNAポリメラーゼ、ONETAQ(登録商標)DNAポリメラーゼ、QUICK−LOAD(登録商標)DNAポリメラーゼ、VENTR(登録商標)DNAポリメラーゼ、Hemo KLENTAQ(登録商標)、Bsu DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼI、Large(Klenow)、Klenow断片、Phi29DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Pfx DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、バクテリオファージ29(bacteriophase 29)、REDTAQ(商標)、またはT7DNAポリメラーゼであり得る。上記DNAポリメラーゼは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を含むことができる。上記DNAポリメラーゼは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を含むことができる。上記DNAポリメラーゼは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性および5’→3’エキソヌクレアーゼ活性の両方を含むことができる。上記DNAポリメラーゼは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性も5’→3’エキソヌクレアーゼ活性も含まない場合がある。上記DNAポリメラーゼは、鎖置換(strand displacement)活性を含むことができる。場合によっては、上記DNAポリメラーゼは、鎖置換活性を含まない。上記DNAポリメラーゼの誤り率は、1×10−6個未満の塩基であり得る。
油相は、フッ素化ベースオイルを含むことができ、それは、フッ素化界面活性剤、例として、過フッ素化(perfluorinated)ポリエーテルと組み合わせることによってさらに安定化させることもできる。上記ベースオイルは、HFE7500、FC−40、FC−43、FC−70または別の一般的なフッ素化油のうちの1つまたは複数であり得る。アニオン性界面活性剤は、アンモニウムKrytox(Krytox−AM)、Krytox FSHのアンモニウム塩、またはKrytox−FSHのモルホリノ誘導体であり得る。Krytox−ASは、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%もしくは4.0%w/w、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%もしくは4.0%w/w超、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%もしくは4.0%w/w未満、または少なくとも約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%もしくは4.0%w/wの濃度で存在し得る。Krytox−ASの濃度は、約1.8%であり得る。Krytox−ASの濃度は、約1.62%であり得る。Krytox−FSHのモルホリノ誘導体は、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%もしくは4.0%w/w、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%もしくは4.0%w/w超、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%もしくは4.0%w/w未満、または少なくとも約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%もしくは4.0%w/wの濃度で存在し得る。Krytox−FSHのモルホリノ誘導体の濃度は、約1.8%であり得る。いくつかの実施形態では、Krytox−FSHのモルホリノ誘導体の濃度は、約1.62%である。
いくつかの実施形態では、上記エマルジョンを、液体様の界面薄膜を有する、高度に単分散性の液滴を生成するように製剤化し、それは、加熱することによって、固体様の界面薄膜を有するマイクロカプセルに変換することができる;かかるマイクロカプセルは、反応プロセス、例として、PCR増幅を通して、それらの内容物を保持することが可能なバイオリアクターとして挙動することができる。マイクロカプセル形態への変換は、加熱の際に起こり得る。例えば、かかる変換は、約50、60、70、80、90もしくは95℃を上回る温度、約50、60、70、80、90もしくは95℃超の温度、または少なくとも約50、60、70、80、90もしくは95℃の温度で起こり得る。いくつかの実施形態では、この加熱は、サーモサイクラーを使用して行なう。加熱プロセスの間、流体または鉱油のオーバーレイを使用して、蒸発を阻止することができる。過剰な、連続相の油を、加熱の前に、除去してもまたは除去しなくてもよい。生体適合性のカプセルは、広い範囲の熱的および機械的なプロセシングにわたって合体および/または凝集に対して抵抗性であり得る。
区画(例えば、液滴)内におけるライブラリーの調製には、試料中のポリヌクレオチドの断片化およびアダプターのライゲーションを包含し得る。一般に、上記断片化は、区画(例えば、液滴)内で起こるが、しかし、いくつかの適用例では、上記断片化は、区画化する前におこる場合がある。断片化を、酵素的に、例えば、エンドヌクレアーゼを使用して達成することができる。上記エンドヌクレアーゼは、例えば、AatII、Acc65I、AccI、AciI、AclI、AcuI、AfeI、AflII、AflIII、AgeI、AhdI、AleI、AluI、AlwI、AlwNI、ApaI、ApaLI、ApeKI、ApoI、AscI、AseI、AsiSI、AvaI、AvaII、AvrII、BaeGI、BaeI、BamHI、BanI、BanII、BbsI、BbvCI、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BclI、BfaI、BfuAI、BfuCI、BglI、BglII、BlpI、BmgBI、BmrI、BmtI、BpmI、Bpu10I、BpuEI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BsaJI、BsaWI、BsaXI、BseRI、BseYI、BsgI、BsiEI、BsiHKAI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BsoBI、Bsp1286I、BspCNI、BspDI、BspEI、BspHI、BspMI、BspQI、BsrBI、BsrDI、BsrFI、BsrGI、BsrI、BssHII、BssKI、BssSI、BstAPI、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BstXI、BstYI、BstZ17I、Bsu36I、BtgI、BtgZI、BtsCI、BtsI、Cac8I、ClaI、CspCI、CviAII、CviKI−1、CviQI、DdeI、DpnI、DpnII、DraI、DraIII、DrdI、EaeI、EagI、EarI、EciI、Eco53kI、EcoNI、EcoO109I、EcoP15I、EcoRI、EcoRV、FatI、FauI、Fnu4HI、FokI、FseI、FspI、HaeII、HaeIII、HgaI、HhaI、HincII、HindIII、HinfI、HinP1I、HpaI、HpaII、HphI、Hpy166II、Hpy188I、Hpy188III、Hpy99I、HpyAV、HpyCH4III、HpyCH4IV、HpyCH4V、KasI、KpnI、MboI、MboII、MfeI、MluI、MlyI、MmeI、MnlI、MscI、MseI、MslI、MspA1I、MspI、MwoI、NaeI、NarI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、NciI、NcoI、NdeI、NgoMIV、NheI、NlaIII、NlaIV、NmeAIII、NotI、NruI、NsiI、NspI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、PacI、PaeR7I、PciI、PflFI、PflMI、PhoI、PleI、PmeI、PmlI、PpuMI、PshAI、PsiI、PspGI、PspOMI、PspXI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、RsrII、SacI、SacII、SalI、SapI、Sau3AI、Sau96I、SbfI、ScaI、ScrFI、SexAI、SfaNI、SfcI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SmlI、SnaBI、SpeI、SphI、SspI、StuI、StyD4I、StyI、SwaI、T、TaqαI、TfiI、TliI、TseI、Tsp45I、Tsp509I、TspMI、TspRI、Tth111I、XbaI、XcmI、XhoI、XmaI、XmnIまたはZraIであり得る。
断片化に続いて、アダプターをポリヌクレオチドにライゲーションするステップを行うことができる。いくつかの実施形態では、ライゲーションのステップが、断片化のステップに続かない。区画、例えば、エマルジョンの水相は、リガーゼを含むことができる。上記リガーゼは、例えば、T4DNAリガーゼ、E.coli DNAリガーゼ、Taq DNAリガーゼ、9°N(商標)DNAリガーゼ、T4RNAリガーゼ1(ssRNAリガーゼ)、T4RNAリガーゼ2(dsRNAリガーゼ)、またはT4RNAリガーゼ2、切断型(NEB)であり得る。
ポリヌクレオチドを、区画化する前に増幅することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、区画(例えば、エマルジョンの水相、例えば、液滴)中にある間に増幅する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、区画中での断片化の前に増幅する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、区画中での断片化の後に増幅する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、区画中での断片化の前にも断片化の後にも増幅する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、区画中でアダプターをポリヌクレオチドにライゲーションする前に、区画中で増幅する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、区画中でアダプターを該ポリヌクレオチドにライゲーションした後に、該区画中で増幅する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、アダプターを該ポリヌクレオチドにライゲーションし、異なる区画からのポリヌクレオチドをプールした後に増幅する。
本明細書中に記載される方法は、ポリヌクレオチドを操作および分析するために使用され得る。ポリヌクレオチドという用語または文法的等価物は、一緒に共有結合した少なくとも2つのヌクレオチドを指し得る。本明細書中に記載される核酸は、ホスホジエステル結合を含み得るが、ある場合には、(例えば、プライマーおよび標識プローブなどのプローブの構築において)本明細書中に概略されるように、例えば以下を含む代替的骨格を有し得る核酸アナログが含まれる:ホスホルアミド(例えば、Beaucageら、Tetrahedron 49巻(10号):1925頁(1993年)およびその中の参考文献;Letsinger、J. Org. Chem. 35巻:3800頁(1970年);Sprinzlら、Eur. J. Biochem. 81巻:579頁(1977年);Letsingerら、Nucl. Acids Res. 14巻:3487頁(1986年);Sawaiら、Chem. Lett. 805頁(1984年)、Letsingerら、J. Am. Chem. Soc. 110巻:4470頁(1988年);ならびにPauwelsら、Chemica Scripta 26巻:141 91986)を参照のこと)、ホスホロチオエート(Magら、Nucleic Acids Res. 19巻:1437頁(1991年);および米国特許第5,644,048号)、ホスホロジチオエート(Briuら、J. Am. Chem. Soc. 111巻:2321頁(1989年)、O−メチルホスホロアミデート(O−methyl phosphoroamidate)結合(例えば、Eckstein、Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach、Oxford University Pressを参照のこと)ならびにペプチド核酸(本明細書中で「PNA」ともいう)骨格および結合(例えば、Egholm、J. Am. Chem. Soc. 114巻:1895頁(1992年);Meierら、Chem. Int. Ed. Engl. 31巻:1008頁(1992年);Nielsen、Nature、365巻:566頁(1993年);Carlssonら、Nature 380巻:207頁(1996年)を参照のこと。これらは全て、参照により組み込まれる)。他のアナログ核酸には、以下を含む二環式構造を有するものが含まれる:本明細書中で「LNA」ともいうロックド核酸(LNAは、リボース環が、2’−O原子を4’−C原子と連結するメチレン橋架けによって「ロックされた」核酸アナログのクラスである)(例えば、Koshkinら、J. Am. Chem. Soc. 120.13252 3頁(1998年)を参照のこと);陽性骨格(Denpcyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92巻:6097頁(1995年);非イオン性骨格(例えば、米国特許第5,386,023号、同第5,637,684号、同第5,602,240号、同第5,216,141号および同第4,469,863号;Kiedrowshiら、Angew. Chem. Intl. Ed. English 30巻:423頁(1991年);Letsingerら、J. Am. Chem. Soc. 110巻:4470頁(1988年);Letsingerら、Nucleoside & Nucleotide 13巻:1597頁(1994年);第2章および第3章、ASC Symposium Series 580、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、編者Y. S. SanghuiおよびP. Dan Cook;Mesmaekerら、Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4巻:395頁(1994年);Jeffsら、J. Biomolecular NMR 34巻:17頁(1994年);Tetrahedron Lett. 37巻:743頁(1996年)を参照のこと)、ならびに米国特許第5,235,033号および同第5,034,506号ならびに第6章および第7章、ASC Symposium Series 580、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、編者Y. S. Sanghui およびP. Dan Cook中に記載されるものを含む非リボース骨格。1つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の定義内に含まれる(例えば、Jenkinsら、Chem. Soc. Rev.(1995年)169〜176頁を参照のこと)。いくつかの核酸アナログは、Rawls、C & E News、1997年6月2日、35頁中に記載されている。これらの参考文献は全て、参照により本明細書中に明示的に組み込まれる。リボース−リン酸骨格のこれらの改変は、生理学的環境中でのかかる分子の安定性および半減期を増加させるために実施され得る。例えば、PNA:DNAおよびLNA−DNAハイブリッドは、より高い安定性を示し得、従って、いくつかの実施形態で使用され得る。上記標的核酸は、特定されたように一本鎖または二本鎖であり得、あるいは二本鎖配列または一本鎖配列の両方の一部分を含み得る。その適用に依存して、上記核酸は、DNA(例えば、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNAおよびcDNAが含まれる)、RNA(例えば、mRNAおよびrRNAが含まれる)またはハイブリッドであり得、この核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニン(xathanine)、ヒポキサタニン(hypoxathanine)、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組合せを含み得る。
本明細書中に記載される方法、組成物およびキットは、新世代の配列プラットフォームと共に使用され得る。例えば、バーコードを有するアダプターがポリヌクレオチドにライゲーションされ得、異なるバーコードを有するポリヌクレオチドの異なる試料がプールされ得、該プールされたポリヌクレオチドが、次世代配列決定を使用して配列決定され得、どの配列読取りが同じ区画(例えば、液滴)中のポリヌクレオチドから生成されたかを決定するためにバーコードが使用され得る。
、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900もしくは3000個未満の塩基、または少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900もしくは3000個の塩基である。いくつかの実施形態では、配列読取りは、約10〜約50塩基、約10〜約100塩基、約10〜約200塩基、約10〜約300塩基、約10〜約400塩基、約10〜約500塩基、約10〜約600塩基、約10〜約700塩基、約10〜約800塩基、約10〜約900塩基、約10〜約1000塩基、約10〜約1500塩基、約10〜約2000塩基、約50〜約100塩基、約50〜約150塩基、約50〜約200塩基、約50〜約500塩基、約50〜約1000塩基、約100〜約200塩基、約100〜約300塩基、約100〜約400塩基、約100〜約500塩基、約100〜約600塩基、約100〜約700塩基、約100〜約800塩基、約100〜約900塩基または約100〜約1000塩基である。
長い読取り、相特定およびデノボ配列決定
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法、組成物およびキットは、ハプロタイプ相特定のために使用され得る。いくつかの実施形態では、IlluminaおよびABIが製造するものなどの短い読取りのシーケンサーは、相特定情報を提供できない場合がある。これらのシーケンサーは、100〜200塩基の読取りおよび30塩基の短さの読取りを生じ得る。454配列決定(Roche)は、約400塩基の配列読取りを生じ得る。いくつかの実施形態では、400塩基は、充分な相特定情報を得るには短すぎる場合がある。Pacific Biosciencesの技術を使用する配列決定は、約1000塩基の配列読取りを生じ得る。いくつかの実施形態では、1000塩基は、相特定情報を提供するには短すぎる。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法および組成物は、細胞、例えば個々の細胞を分析するために使用され得る。例えば、個々の細胞は、独自の区画へと分離され得、独自にバーコード化されたアダプターが各区画に付加され、各区画内のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの断片が、アダプターを上記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの断片にライゲーションさせることによってバーコード化され得、各区画由来のバーコード化されたポリヌクレオチドがプールされ得、そのプールされたポリヌクレオチドが配列決定され得、同じまたは異なる区画中で、および従って同じ細胞または異なる細胞中で配列読取りが生成されたかを決定するために、バーコードが使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法および組成物は、単一細胞トランスクリプトーム配列決定、単一細胞ゲノム配列決定または単一細胞メチローム配列決定のために使用される。
一態様では、単一細胞は、別個の区画(例えば、液滴)内に捕捉され得、この単一細胞が溶解され得る。各区画(例えば、液滴)中の個々の細胞由来のメッセンジャーRNAが、区画特異的バーコード化プライマーを用いて逆転写され得る。いくつかの実施形態では、適切な試薬(例えば、逆転写酵素、ヌクレオチド)が、より大きい液滴の内側にある区画(例えば、液滴)中に隔離され得る。上記逆転写酵素をメッセンジャーRNAと接触させることが望まれる場合、上記内部液滴を、(例えば加熱によって)破裂させ得る。逆転写(RT)反応の後には、独自のバーコードを取り込み得るライブラリー調製が続き得る。
いくつかの例では、個々の細胞は、別個の区画(例えば、液滴)に捕捉され得、単一細胞を有する区画由来のゲノムDNAが、(例えばアダプターを使用して)独自にバーコード化され得る。異なる区画由来のバーコード化されたゲノムDNAは、プールされ、配列を決定され得、そのバーコードは、どの配列読取りが同じ細胞由来かを決定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ゲノムDNAは、区画中で断片化される。いくつかの実施形態では、ゲノムDNAは、バーコードを有するアダプターを付加する前および/または後に増幅される。いくつかの実施形態では、ゲノムDNAは、アダプターがゲノムDNAにライゲーションされる前にも後にも増幅されない。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法および組成物は、ゲノムのメチル化を分析するために使用され得る。例えば、本明細書中に記載される方法は、単一細胞メチローム配列決定のために使用され得る。いくつかの実施形態では、個々の細胞は、例えば液滴へと区画化される。これらの区画は、メチル感受性酵素(例えばエンドヌクレアーゼ)から構成され得る。いくつかの実施形態では、このメチル感受性酵素は、メチル化された部位を消化する。これらの区画の各々は、独自にバーコード化されたアダプターを含み得る。例えば、メチル感受性酵素を含む区画(例えば、液滴)は、試料ポリヌクレオチドを含む区画と合体される。上記アダプターは、上記メチル感受性酵素による消化の前または後に上記区画中でポリヌクレオチドにライゲーションされ得る。バーコードでタグを付けたポリヌクレオチドがプールされ得、該ポリヌクレオチドが配列決定され得る。同じ区画由来の配列読取りが決定され得る。配列読取りの非存在は、区画中のポリヌクレオチドの消化を示し得る。いくつかの実施形態では、上記メチル感受性酵素は、メチル化されたDNAを消化しないが、メチル化されていないDNAを消化する。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法および組成物は、ゲノムのメチル化分析のために使用され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ビスルファイトで処理され得る。ビスルファイト(bifsulfite)は、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換し得る。ビスルファイトは、メチル化シトシンをウラシルに変換しない。処理されたおよび未処理のポリヌクレオチドは、複数の区画(例えば、液滴)へと区画化され得る。ポリヌクレオチドは上記区画中で断片化され得る。独自にバーコード化されたアダプターが、各区画に提供され得、ビスルファイト処理されたポリヌクレオチドにライゲーションされ得る。タグを付けたポリヌクレオチドがプールされ得、同じ区画および異なる区画由来の核酸のメチル化状態を決定するために配列決定され得る。
エキソソームは一般に、RNAを含み得る、小さい細胞外小胞などのオルガネラである。エキソソームは、mRNAおよび/またはmiRNAを含み得る。いくつかの実施形態では、個々のエキソソームは、別個の区画(例えば、液滴)へと区画化される。エキソソームは、各区画が平均して約5、4、3、2または1未満のエキソソームを含むように、区画化され得る。逆転写が、エキソソーム中のRNAをcDNAに変換するために使用され得る。独自にバーコード化されたアダプターが、区画化されたエキソソーム由来のポリヌクレオチドに付加され得る。これらの区画由来のポリヌクレオチドはプールされ得、そのプールされたポリヌクレオチドは配列決定され得、どの配列読取りが同じエキソソーム由来かを決定するために、上記バーコードが使用され得る。分析され得る他の型のオルガネラには、ミトコンドリアが含まれ得る(例えば、ミトコンドリアDNAが分析され得る)。
別の態様では、本明細書中に記載される方法および組成物は、メタゲノム分析のために使用され得る。メタゲノミクスは、環境試料中の遺伝物質の研究であり得る。いくつかの実施形態では、試料、例えば環境試料中の個々のウイルスおよび/または細菌は、複数の区画へと区画化され得、独自のバーコードを有するアダプターが各区画に付加され得、個々の生物またはウイルスは、そのゲノムおよび/またはトランスクリプトームが配列決定され得る。同じバーコードを有する配列読取りは、生物および/またはウイルスのゲノムまたはトランスクリプトームの配列を決定するためにアセンブルされ得る。
別の態様では、あらゆる細胞が、それら自身のバーコードのセットを有する独自の区画(例えばチャンバー)で終わるように、細胞を含む試料を区画化し得るマイクロ流体工学デバイスが工夫され得る。各細胞について個別に全ゲノムまたはトランスクリプトームを増幅することを可能にするために、各チャンバーの内容物は次いで個別に処理されて、希釈され、(例えば、エマルジョンを介して)さらに区画化され得る。全ゲノム増幅または他の増幅スキームは、ゲノムまたはトランスクリプトームの異なる部分間での競合の低下に起因して、区画化から利益を得うる。
別の態様では、個々の細胞を捕捉し、(例えば、独自のバーコードを有するアダプターをライゲーションすることによって)それらに自身のバーコードを供給するために、スラグが作製され得る。スラグは、フローチューブの直径を完全に塞ぐ試薬の連続スラグであり得る。これらのスラグは、液滴中でのバイアスなしの全ゲノム/トランスクリプトーム増幅を実施するために、多くの(例えば、数千以上の)より小さい液滴へと分割され得る。いくつかの実施形態では、スラグは、約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000もしくは10,000の、少なくとも約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000もしくは10,000の、約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000もしくは10,000超の、または約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000もしくは10,000未満の液滴へと分割され得る。いくつかの実施形態では、スラグは、約100〜約500、約100〜約1000、約500〜約1000、約1000〜約1500、約1000〜約2000、約1000〜約5000、約1000〜約10,000または約5,000〜約10,000の液滴へと分割され得る。いくつかの実施形態では、全ゲノム増幅は、バルク中よりも液滴中でよりよく機能し得る。全ての上記スラグ由来の液滴は、既に独自のバーコードを有するアダプターが液滴に提供されているので、一緒に混合され得る。配列決定情報は、どの読取りがどのスラグ由来であるかを決定するために使用され得る。
別の実施形態では、本明細書中に記載される方法は、特定の細胞表面マーカーを有する細胞を捕捉し、該細胞由来のポリヌクレオチド(例えば、DNAまたはRNA)を分析するために使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体が、独自のバーコードを有する短いDNA断片で被覆されたビーズに連結され得る。各抗体は、それ自身の独自の配列と会合され得る。上記抗体はまた、適切に破裂され得る、DNA断片を含む液滴に連結され得る。細胞は、これらの抗体で予め被覆され得、次いで、液滴/細胞特異的バーコードアダプターと共に、より大きい液滴に捕捉され得る。ライブラリー調製が、本明細書中に記載されるように結果として起こり得、液滴の内容物が配列を決定され得、どの読取りがどの細胞に由来するかが、バーコードによって推察され得る。従って、この技術は、細胞のゲノムまたはトランスクリプトームを配列決定することに加えて、それらのタンパク質に関する情報を得ることを可能にする。いくつかの実施形態では、同じ情報のいくつかは、FACSを介して捕捉され得る。
本明細書中に提供される方法、組成物およびキットを使用して分析される試料は、核酸を含む非細胞実体(例えば、ウイルス)または細胞ベースの生物(例えば、古細菌、細菌または真核生物の(eukarya)領域のメンバー)に由来し得る。上記試料は、いくつかの場合には、病院、実験室、臨床実験室または医学実験室から取得され得る。試料は、核酸、例えば、RNAまたはDNAを含み得る。上記試料は、無細胞核酸を含み得る。いくつかの場合には、上記試料は、ドアまたはベンチ上部などの表面のスワブから取得される。
コンピューターが、データを保存および処理するために使用され得る。コンピューターに実行可能なロジックが、バーコード配列によって配列読取りを群分けするかかる機能を実行するために使用され得る。コンピューターは、分子プロファイリングからの診断結果を表示、保存、検索もしくは計算するために;ゲノムもしくは核酸発現分析からの生データを表示、保存、検索もしくは計算するために;または本明細書中に記載される方法において有用な任意の試料もしくは患者の情報を表示、保存、検索もしくは計算するために、有用であり得る。本明細書中に記載される方法を実施するためのコンピューター読取り可能な命令を含むシステムが、本明細書中で提供される。コンピューターによって実行される場合に本明細書中に記載される方法をコンピューターに実施させる命令を含む、コンピューター読取り可能な媒体が、本明細書中で提供される。
本明細書中に記載される方法を実施するためのキットが、本明細書中で提供される。上記キットは、1つまたは複数の制限酵素、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、バッファ、塩、金属イオン、還元剤、BSA、スペルミン、スペルミジン、グリセロール、オリゴヌクレオチド、プライマー、プローブまたは標識(例えば、蛍光標識)を含み得る。上記キットは、1つまたは複数のセットの指示を含み得る。
コピー数変動(CNV)を推定するための方法もまた、本明細書中で提供される。1つまたは複数の標的配列のコピー数変動は、多数の疾患および障害において役割を果たし得る。標的配列のコピー数変動を分析する1つの方法は、デジタル分析、例えば、デジタルPCRまたは液滴デジタルPCRを介した方法である。しかし、標的配列のコピー数のデジタル分析は、標的核酸配列の複数のコピーが試料中の同じポリヌクレオチド上に存在する場合、試料中の標的核酸配列のコピー数を過小評価し得る。例えば、複数のコンパートメント(compartment)(例えば、区画(partition)、空間的に隔離された(isolated)領域)を有するデジタルPCRアッセイでは、試料中の核酸は、それぞれのコンパートメントが平均して約0、1、2または数個の標的ポリヌクレオチドを受け取るように、区画化され得る。各区画は、平均して、1区画(例えば、液滴)当たり5、4、3、2もしくは1コピー未満の標的核酸を有し得る。いくつかの場合には、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200の区画(例えば、液滴)が、ゼロコピーの標的核酸を有する。ポリヌクレオチドを含むコンパートメントの数が数えられ得る。しかし、2コピーの標的核酸配列が単一ポリヌクレオチド上に存在する場合、そのポリヌクレオチドを含むコンパートメントは、標的配列を1つだけ有するとカウントされ得る。
1000ゲノム当量(約6ngのDNA)を、100Xの深度で配列決定し得る。1000ゲノム当量から、2,000コピーのあらゆる(正常コピー数の)標的が存在し得る。あらゆる遺伝子座について、大部分の断片が別個の区画で終わるように、ステップが取られ得る。上記2,000の断片の殆どが、独自のバーコードでタグを付けられることを確実にするためのステップもまた取られ得る。
Claims (45)
- a.複数のアダプターを複数の第1の区画に細分するステップであって、該第1の区画のそれぞれが平均して第1の体積を有し、該アダプターが、独自のバーコードを含むステップと、
b.複数のポリヌクレオチドを含む試料を、複数の第2の区画に細分するステップであって、該第2の区画のそれぞれが平均して第2の体積を有し、該第2の体積が、該第1の体積よりも大きいステップと、
c.該第1の区画のうちの少なくとも1つを、該第2の区画のうちの少なくとも1つと合体させて、合体区画を形成するステップと、
d.該複数のポリヌクレオチドのうちの1つまたはその断片に、該アダプターのうちの少なくとも1つを用いてタグを付けるステップと
を含む方法。 - a.複数のアダプターを複数の第1の区画に細分するステップであって、該第1の区画のそれぞれが平均して第1の体積を有し、該アダプターが、独自のバーコードを含むステップと、
b.複数のポリヌクレオチドを含む試料を、複数の第2の区画に細分するステップであって、該第2の区画のそれぞれが平均して第2の体積を有し、該第2の体積が、該第1の体積よりも小さいステップと、
c.該第1の区画のうちの少なくとも1つを、該第2の区画のうちの少なくとも1つと合体させて、合体区画を形成するステップと、
d.該複数のポリヌクレオチドのうちの1つまたはその断片に、該アダプターのうちの少なくとも1つを用いてタグを付けるステップと
を含む方法。 - 前記第1の区画が液滴である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第2の区画が液滴である、請求項3に記載の方法。
- 前記液滴が、不混和性の流体内にある、請求項3に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、ゲノムDNAである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記タグを付けるステップが、前記アダプターのうちの1つを含む少なくとも1つの第1の液滴を、前記ポリヌクレオチドのうちの1つを含む少なくとも1つの第2の液滴と合体させるステップを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記第1の区画が第1の液滴であり、前記第2の区画が第2の液滴であり、前記合体させるステップの前に、少なくとも1つの該第2の液滴が、少なくとも1つの該第1の液滴を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の区画が第1の液滴であり、前記第2の区画が第2の液滴であり、前記合体させるステップの前に、少なくとも1つの該第2の液滴が、少なくとも1つの該第1の液滴を含まない、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の区画が第1の液滴であり、前記第2の区画が第2の液滴であり、前記合体させるステップの前に、少なくとも1つの該第1の液滴が、少なくとも1つの該第2の液滴を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記第1の区画が第1の液滴であり、前記第2の区画が第2の液滴であり、前記合体させるステップの前に、少なくとも1つの該第1の液滴が、少なくとも1つの該第2の液滴を含まない、請求項2に記載の方法。
- 前記第2の体積が、前記第1の体積の前記体積の少なくとも2倍である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の体積が、前記第2の体積の前記体積の少なくとも2倍である、請求項2に記載の方法。
- 前記液滴の温度を改変するステップをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記合体させるステップが、前記第1の液滴のそれぞれが前記第2の液滴のそれぞれと合体するような制御器の使用を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記合体させるステップが、ポリヌクレオチドを含む液滴を、アダプターを含む液滴とランダムに合体させるステップを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片をプールするステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片を分析するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分析するステップが、前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片の配列を決定するステップを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記アダプターでタグを付けたポリヌクレオチドまたはそれらの断片が、同じ区画に位置したかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記配列を決定するステップにより得られた任意の2つの配列の読取りが、同じまたは異なる区画から生じた可能性を推定するステップをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 所与の区画が、異なる染色体由来であるが、同じ遺伝子座由来の2つ以上のポリヌクレオチドまたはそれらの断片を含む可能性がないように、前記試料を区画化する、請求項6に記載の方法。
- 前記ゲノムDNAが、高分子量DNAである、請求項6に記載の方法。
- 前記第2の区画内の前記ポリヌクレオチドを断片化して、ポリヌクレオチドの断片を形成するステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドの断片が、前記ポリヌクレオチドを、エンドヌクレアーゼを用いて断片化することによって生成される、請求項24に記載の方法。
- 前記アダプターを、複数の前記合体区画内の前記ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって、該ポリヌクレオチドにタグを付ける、請求項1に記載の方法。
- 前記タグを付けるステップが、トランスポゾンを使用して達成される、請求項1に記載の方法。
- 前記タグを付けたポリヌクレオチドが増幅される、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、タグを付ける前に増幅される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の区画のそれぞれが平均して5つ未満のアダプターを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第2の区画のそれぞれが平均して5つ未満の、前記複数のポリヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記試料を前記細分するステップが、該試料を前記第2の区画と乳化させるステップまたは混合するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のアダプターを前記細分するステップが、該複数のアダプターを前記第2の区画と乳化させるステップまたは混合するステップを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記増幅が、多置換増幅である、請求項30に記載の方法。
- a.オルガネラを複数の区画に区画化するステップであって、各区画が平均して1つの区画当たり5つ未満のオルガネラを含む、ステップと、
b.該複数の区画中の細胞外の該オルガネラを溶解するステップであって、該溶解するステップにより、該オルガネラからRNAが放出される、ステップと、
c.該複数の区画中の該放出されたRNAから、バーコードを含むアダプターを用いて、タグを付けたcDNAを生成するステップであって、該複数の区画中の各区画が、独自のバーコードを有するアダプターを含むステップと
を含む方法。 - 前記オルガネラが、細胞外のオルガネラである、請求項36に記載の方法。
- 前記オルガネラが、エキソソームである、請求項36に記載の方法。
- 前記タグを付けたcDNAを生成するステップが、前記放出されたRNAの、区画特異的バーコードを付けたプライマーを用いての逆転写を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記タグを付けたcDNAの配列を決定するステップをさらに含む、請求項36に記載の方法。
- 前記タグを付けたcDNAが、同じオルガネラ由来であるかを決定するステップをさらに含む、請求項36に記載の方法。
- a.微生物を複数の区画に区画化するステップと、
b.該複数の区画中の該微生物からポリヌクレオチドを得るステップと、
c.該複数の区画中の該ポリヌクレオチドに、バーコードを含むアダプターを用いてタグを付けるステップであって、該複数の区画中の各区画が、独自のバーコードを有するアダプターを含むステップと
を含む方法。 - 前記区画のそれぞれが平均して5つ未満の微生物を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記タグを付けたポリヌクレオチドの配列を決定するステップをさらに含む、請求項42に記載の方法。
- 前記タグを付けたポリヌクレオチドの断片が、同じ区画由来であるかを決定するステップをさらに含む、請求項42に記載の方法。
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