CN103717749A - 用于核酸分析的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于分析的方法、组合物和试剂盒，其中许多分析涉及扩增反应如数字PCR或小滴数字PCR。这些分析可用于诸如测序、拷贝数变异分析等应用。在一些情况下，这些分析涉及将样品细分为多个分区(例如，小滴)并合并这些分区与其他包含具有条码的衔接头的分区。

Description

用于核酸分析的方法和组合物

交叉引用

本申请要求于2011年4月25日提交的美国临时专利申请61/478,777的权益，该申请通过引用整体并入本文。

背景技术

新一代测序具有许多有用的应用，并可用于分析多种样品。新一代测序应用需要改进的多路复用(multiplexing)样品的方法。也需要改进的对分区的多核苷酸进行条码标记并分析该条码标记的多核苷酸的方法。

测定靶序列的拷贝数可具有许多有用的应用。需要改进的测定靶序列拷贝数的方法。

发明内容

本公开内容提供了可在测序和其他应用中使用的方法，在一些实例中，本公开内容提供了一种方法，其包括：a.将多个衔接头细分为多个第一分区，其中每个第一分区平均具有第一体积，并且其中衔接头包含独特条码；b.将包含多种多核苷酸的样品细分为多个第二分区，其中每个第二分区平均具有第二体积，其中第二体积大于第一体积；c.将至少一个第一分区与至少一个第二分区合并以形成合并的分区；和d.用至少一个衔接头标记所述多种多核苷酸中的一种或其片段。

该方法可包括：a.将多个衔接头细分为多个第一分区，其中每个第一分区平均具有第一体积，并且其中衔接头包含独特条码；b.将包含多种多核苷酸的样品细分为多个第二分区，其中每个第二分区平均具有第二体积，其中所述第二体积小于所述第一体积；c.将至少一个所述第一分区与至少一个所述第二分区合并以形成合并的分区；和d.用至少一个所述衔接头标记所述多种多核苷酸中的一种或其片段。

通常，在本文公开的方法中，第一分区为小滴。在一些实例中，所述第二分区为小滴。在一些情况下，所述小滴在不混溶的流体内。

在一些情况下，多核苷酸为基因组DNA。例如，基因组DNA可以是高分子量DNA。在一些情况下，将基因组DNA样品进行分区，以使得给定的分区不可能包含来自相同基因座但来自不同染色体的两种或更多种多核苷酸或其片段。

在一些情况下，第一分区为第一小滴且第二分区为第二小滴；并且在合并前，至少一个第二小滴包含至少一个第一小滴。在其他情况下，第一分区为第一小滴且第二分区为第二小滴；并且在合并前，至少一个第二小滴不包含至少一个第一小滴。在一些情况下，第一分区为第一小滴且第二分区为第二小滴；并且在合并前，至少一个第一小滴包含至少一个第二小滴。在一些情况下，第一分区为第一小滴且第二分区为第二小滴；并且在合并前，至少一个第一小滴不包含至少一个第二小滴。

包含样品的分区的体积可以不同于包含衔接头的分区的体积。例如，第二体积为第一体积的体积的至少两倍。在其他情况下，第一体积为第二体积的体积的至少两倍。本文公开的方法可进一步包括改变小滴的温度。

在一些情况下，该方法进一步包括通过包括使用控制器的方法来合并小滴，以使得每个第一小滴与每个第二小滴合并。在一些情况下，合并包括随机合并包含多核苷酸的小滴与包含衔接头的小滴。该方法可进一步包括汇集（pool）衔接头标记的多核苷酸或其片段。

通常，该方法进一步包括分析衔接头标记的多核苷酸或其片段。所述分析可涉及对衔接头标记的多核苷酸或其片段进行测序。所述分析可包括确定衔接头标记的多核苷酸或其片段是否位于相同的分区内；或者，在一些情况下，评估通过测序产生的任意两个序列读取值来自相同或不同分区的可能性。

在一些情况下，该方法进一步包括使第二分区内的多核苷酸断裂以形成多核苷酸片段。可通过用内切核酸酶断裂多核苷酸来产生多核苷酸片段。

在一些情况下，通过将衔接头连接至多个合并分区内的多核苷酸上来标记多核苷酸。该标记可通过多种手段完成；例如，可使用转座子完成标记。

通常，本文的方法包括扩增反应。通常，扩增包括聚合酶链式反应；或者，扩增可以是不同类型的反应，如多重置换扩增。通常，扩增被标记的多核苷酸；并且在一些情况下，它们在标记之前进行扩增。

在一些情况下，每个第一分区平均包含少于五个衔接头。通常，每个所述第二分区平均包含所述多种多核苷酸中的少于五种。在一些情况下，样品的细分包括乳化或混合样品与第二分区。通常，多个衔接头的细分包括乳化或混合多个衔接头与第二分区。

在一些方面，本公开内容提供了一种方法，其包括：a.将细胞器分为多个分区，其中每个分区平均包含少于五个细胞器；b.裂解所述多个分区中的细胞外细胞器，其中所述裂解从细胞器中释放RNA；c.由在具有包含条码的衔接头的所述多个分区中释放的RNA产生标记的cDNA，其中所述多个分区中的每个分区包含具有独特条码的衔接头。在一些情况下，细胞器为细胞外细胞器如外来体。在一些情况下，产生标记的cDNA包括用分区特异性条码化(barcoded)引物对释放的RNA的逆转录。该方法可进一步包括对标记的cDNA进行测序和/或确定标记的cDNA是否来自相同的细胞器。

本发明还提供了一种方法，其包括：a.将微生物分成多个分区，b.从所述多个分区中的微生物获得多核苷酸；和c.用包含条码的衔接头标记所述多个分区中的多核苷酸，其中所述多个分区中的每个分区包含具有独特条码的衔接头。在一些情况下，每个所述分区平均包含少于五种微生物。该方法可进一步包括对标记的多核苷酸进行测序和/或确定标记的多核苷酸片段是否来自相同的分区。

援引并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而以相同程度并入本文，犹如特别地和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。

附图说明

新特征在随附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对在其中利用到原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对特征和优点的更好的理解，在附图中：

图1A和1B图示了合并包含样品的小滴与包含具有条码的衔接头的小滴的方法。

图2图示了使用利用共同标记物检测到的参照物来确定高拷贝数靶标的拷贝数的方法。

具体实施方式

本文总体上描述了用于多核苷酸测序的文库制备的方法、组合物和试剂盒。该方法、组合物和试剂盒可用于将多核苷酸样品分为多个分区，并且所述多个分区中的每一个可具有一组独特的包含条码的衔接头。文库制备可在所述多个分区(例如，小滴)中的每一个中进行。可汇集分区的内容物并进行测序以产生序列读取值，并且可利用条码来鉴定哪些序列读取值来自相同的分区。本文提供了方法、组合物、系统和试剂盒的多个实施方案。

概述

通常，条码化(或“标记”)能够允许汇集核酸样品以便降低每个样品的测序成本，而仍保持确定序列读取值来源于哪个样品的能力。可为每个样品制备单独的文库制备物，并且每个样品可具有其自己的独特条码。而后可汇集分别制备的具有独特条码的文库并对其进行测序。得到的数据集的每个序列读取值可通过该序列读取值中的条码追溯到原始样品。

在本文提供的方法中，可将样品中的多核苷酸分成多个分区，例如小滴。可将具有独特条码(或“标签”)的衔接头提供至包含多核苷酸的多个分区中的每一个分区中。可对具有条码衔接头的多核苷酸进行测序，并且可以利用条码来确定两个或更多个序列读取值是否产生自相同分区中的一种或多种核苷酸。

可将条码衔接头束缚在分区内，例如，乳液的水相，例如小滴内。可通过合并填充有衔接头的分区(例如，小滴)和含有样品-多核苷酸的分区(例如小滴)来完成条码标记。在一些情况下，填充有衔接头的分区小于含有样品-多核苷酸的分区(参见，例如，图1A)。可将条码化的衔接头分成在大小上小于含有样品-多核苷酸的分区的多个分区。可以形成较大的含有样品-多核苷酸的分区。填充有条码化衔接头的分区可与含有样品-多核苷酸的分区合并，并且衔接头可附接于多核苷酸上。例如，含有样品多核苷酸的分区可以比含有衔接头的分区的平均大小平均大1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍、50,000倍或100,000倍。含有样品多核苷酸的分区可以比含有衔接头的分区的平均体积平均大1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍、50,000倍或100,000倍。在一些情况下，形成含有样品-多核苷酸的分区以使得它们含有填充有衔接头的分区。例如，填充有衔接头的分区(例如，小滴)可与多核苷酸样品乳化以使得含有样品-多核苷酸的分区(例如，小滴)最终包含填充有衔接头的分区。填充有衔接头的小滴可以破裂(例如，通过温度调节)以释放可用于文库制备的反应组分(例如，PCR或连接组分)。在一些实施方案中，温度调节包括升温至大约、高于约或至少约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃，持续大约、多于约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60min。在一些实施方案中，温度调节可持续大约、多于约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24hr。在一些情况下，填充有衔接头的小滴不包含在含有样品的小滴内。在这样的情况下，可将单独的小滴合并在一起。

在一些情况下，填充有衔接头的分区比含有样品-多核苷酸的分区大(参见，例如，图1B)。可将条码化衔接头分成在大小上大于含有样品-多核苷酸的分区的多个分区。可形成较小的含有样品-多核苷酸的分区。填充有条码化衔接头的分区可与含有样品-多核苷酸的分区合并，并且衔接头可附接于多核苷酸上。例如，含有衔接头的分区比含有样品的分区的平均大小平均大1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍、50,000倍或100,000倍。含有衔接头的分区可以比含有样品的分区的平均体积平均大1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍、50,000倍或100,000倍。在一些情况下，形成含有衔接头的分区以使它们包含含有样品的分区。例如，在一些实施方案中，填充有样品-多核苷酸的分区(例如，小滴)可与衔接头乳化以使得含有衔接头的分区(例如，小滴)最终包裹含有样品的分区。在这样的情况下，含有样品的小滴可以破裂(例如，通过温度调节)以便可以合并不同类型小滴的内容物。在一些实施方案中，温度调节包括升温至大约、高于约或至少约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃，持续大约、多于约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60min。在一些实施方案中，温度调节可持续大约、多于约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24hr。在一些情况下，填充有样品-多核苷酸的小滴不包含在含有衔接头的小滴内。在这样的情况下，可将单独的小滴合并在一起。

微流体装置可用于合并预先制备的衔接头试剂和多个样品-多核苷酸分区，以使得每个样品-多核苷酸分区包含衔接头试剂。例如，1000x1000(一百万)个分区可使用正方形装置，并且每种多核苷酸可用两个条码进行标记。一百万个独特标识符可用2,000个不同的条码来构建。具有1,000个不同条码的试剂可加载在装置的水平通道中，并且可将用于另一组1,000个不同条码的试剂加载在装置的垂直通道中。一百万个分区中的每一个分区均可具有其自己的独特条码组合。

在一些情况下，以受控的方式合并含有样品-多核苷酸的分区(例如，小滴)和填充有衔接头的分区(例如，小滴)，例如，一个样品多核苷酸的小滴和一个独特衔接头的小滴。在一些情况下，填充有衔接头的分区随机地与含有样品-多核苷酸的分区合并。

以下实例阐明了一种方法的实施方案。可制备多种(N种)类型的一大组小滴。每种类型的小滴可加载有其自己的条码。N值可由条码的长度(L)部分地决定。例如，N可以大至4^L。因此，如果L=10，大约可产生1百万种不同的小滴类型。可在每个分区内进行标准的测序文库制备。一旦制备了文库，则可(例如，通过使小滴破裂)合并所有分区的内容物并将其加载至核酸测序仪上。测序仪可产生许多文库多核苷酸的序列读取值。在相同小滴内制备的多核苷酸可含有相同的条码。如果条码的数目足够大，则可推测含有相同条码的分子来自相同的分区。如果N足够大(例如，大于在实验中实际使用的填充有衔接头的分区的数目)，则可预期任何两个含有样品-多核苷酸的分区可由不同的填充有衔接头的分区来标记。然而，如果N不是很大，则可用相同的衔接头来标记样品-多核苷酸分区。在这种情况下，可对任何两个读取值来自相同或不同的含样品分区的可能性进行概率评估。对于许多应用来说，概率评估可能是足够的。

在一些实施方案中，例如在测序反应中，可多路复用的不同样品的数目可以为大约、多于约、少于约或至少约1000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000或10,000,000个样品。在一些实施方案中，在本文所述的方法中多路复用约1000至约10,000、约10,000至约100,000、约10,000至约500,000、约100,000至约500,000、约100,000至约1,000,000、约500,000至约1,000,000、约1,000,000至约5,000,000或约1,000,000至约10,000,000个样品。

条码标记的一些方法在例如公开号为20110033854的美国专利申请中有所描述。

融合较小的小滴(例如，内部小滴)和较大的小滴(例如，外部小滴)

用于融合较小的小滴(例如，内部小滴)和较大的小滴(例如，外部小滴)的一些方法在例如公开号为20110053798的美国专利申请中有所描述。在一些情况下，可通过加热/或冷却以改变温度、施加压力、改变组分(例如，通过化学添加剂)、应用声能(例如，通过超声处理)、暴露于光(例如，用来刺激光化学反应)、应用电场或其任意组合，将内部小滴(或分区)与外部小滴(或分区)融合。在一些情况下，内部小滴可与外部小滴自发地融合。处理可以是连续的或者可以在时间上变化(例如，脉动、冲击和/或重复处理)。该处理可提供乳液参数的逐渐变化或快速变化，以实现小滴融合的稳态或瞬态引发。分区的稳定性及其对诱导小滴融合的处理的响应性可在其形成过程中通过对一个或多个内部/外部分区相选择合适的表面活性剂类型、表面活性剂浓度、临界胶束浓度、离子强度等来确定。

融合可产生融合乳液。融合可自发地发生，使得在加工融合的小滴之前除了充分的时间延迟(或无延迟)之外无需处理。或者，可处理内部/外部小滴以便可控地诱导小滴的融合以形成分析混合物。

可加工融合的乳液。加工可包括使融合乳液经历任何条件或一组条件，在该条件下至少一个感兴趣的反应可以发生(和/或停止)，并持续任何合适的时间段。因此，加工可包括将融合乳液的温度保持在预先设定点附近，在两个或更多个预先设定点之间改变融合乳液的温度(如对融合乳液进行热循环)，将融合乳液暴露于光，改变施加到融合乳液上的压力，向融合乳液中加入至少一种化学物质，将电场应用于融合乳液，或其任意组合。

可在加工之后和/或期间从融合乳液检测信号。在本文的其他部分进一步对检测进行了描述。尤其可对信号进行光学、电学、化学或其组合的检测。所检测的信号可包括与融合乳液中进行的至少一个感兴趣的反应相对应的测试信号。备选地，或者另外地，所检测的信号可包括与融合溶液中存在的代码相对应的代码信号。测试信号和代码信号通常是可辨别的，并且可使用相同的或不同的检测器进行检测。例如，测试信号和代码信号各自均可作为荧光信号进行检测，该信号基于激发波长(或光谱)、发射波长(或光谱)和/或在融合小滴中的不同位置可以是可辨别的(例如，就融合小滴而言代码信号由于比测试信号更局部化而可能是可以检测的)。作为另一个实例，测试信号和代码信号可被检测为不同的光学特征，如测试信号被检测为荧光，而代码信号被检测为光反射率。作为又一实例，可对测试信号进行光学检测，并对代码信号进行电学检测，反之亦然。

衔接头

条码可存在于衔接头上，并且具有条码的衔接头可通过连接作用附接至多核苷酸上。在本文所述的方法、组合物、系统和试剂盒中可使用多种类型的衔接头。例如，衔接头可包含双链序列。具有双链序列的衔接头可包含一个平端。在一些情况下，具有双链序列的衔接头包含两个平端。具有双链序列的衔接头可包含一个3’突出端。具有双链序列的衔接头可包含两个3’突出端。具有双链序列的衔接头可包含一个5’突出端。在一些情况下，具有双链序列的衔接头可包含两个5’突出端。具有双链序列的衔接头可包含5’突出端和3’突出端。在一些情况下，衔接头仅包含单链核酸。

当衔接头具有一个或多个突出端时，突出端可以为大约、多于约、少于约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基。例如，3’突出端可以为大约、多于约、少于约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基。5’突出端可以为大约、多于约、至少约或少于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基。如果衔接头包含两个突出端，则突出端可包含相同或不同数目的碱基。

衔接头的最长的链可以为大约、多于约、少于约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个碱基。如果衔接头包含双链部分，则双链部分可以为大约、多于约、至少约或少于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个碱基对。

衔接头可包含DNA和/或RNA。在一些情况下，衔接头包含DNA。在一些情况下，衔接头包含RNA。在一些情况下，衔接头包含DNA和RNA。

衔接头可包含双链核酸。在一些情况下，衔接头包含双链DNA。在一些情况下，衔接头包含双链RNA。在一些情况下，衔接头包含DNA/RNA杂合双链体。

衔接头可包含单链核酸。在一些实施方案中，衔接头包含单链RNA。在一些情况下，衔接头包含单链DNA。在一些情况下，衔接头包含单链RNA和DNA。

当衔接头包含双链序列时，衔接头的一条链可仅包含DNA，而衔接头的一条链可仅包含RNA。第一链可包含DNA和RNA，而第二链可仅包含DNA。第一链可包含DNA和RNA，而第二链可仅包含RNA。如果衔接头的链包含DNA和RNA两者，则DNA可以位于RNA的5’或者DNA可以位于RNA的3’。在一些实施方案中，衔接头是单链的并且包含DNA和RNA，并且DNA位于RNA的5’或RNA的3’。

衔接头可包含发夹结构(或发夹环)。发夹结构可包含DNA和/或RNA。发夹环中的非碱基配对碱基的数目可以是大约、多于约或至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。发夹环中的非碱基配对碱基的数目可以是约4至约8、约4至约10、约4至约14、约4至约16、约4至约20、约4至约24、约4至约26或约4至约30个碱基。衔接头的茎(碱基配对部分)长可以是大约、多于约或至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对。

在一些情况下，发夹衔接头仅连接至多核苷酸的一端。在一些情况下，第一发夹衔接头连接至多核苷酸的一端，第二发夹衔接头连接至多核苷酸的另一端。连接至多核苷酸每一端的发夹衔接头可包含相同的核酸序列或不同的核酸序列。连接至多核苷酸每一端的发夹衔接头可具有条码，并且该条码可以是相同的或不同的。连接至多核苷酸一端的发夹衔接头可具有条码，而连接至多核苷酸另一端的发夹衔接头可缺乏条码。

在一些情况下，衔接头连接至多核苷酸上，使得多个衔接头和多核苷酸是散布的。

条码

衔接头可包含一个或多个条码(标签)序列。条码序列可以是独特标识符。在一些实施方案中，条码为大约、多于约、少于约或至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基或碱基对。在一些实施方案中，条码为约4至约6个碱基或bp、约4至约7个碱基或bp、约4至约8个碱基或bp、约4至约9个碱基或bp、约4至约10个碱基或bp、约4至约12个碱基或bp、约4至约14个碱基或bp、约4至约16个碱基或bp、约4至约18个碱基或bp、约4至约20个碱基或bp、约5至约10个碱基或bp、约5至约15个碱基或bp、约5至约20个碱基或bp、约5至约25个碱基或bp、约5至约30个碱基或bp、约5至约35个碱基或bp、约5至约40个碱基或bp或约5至约50个碱基或bp。在一些实施方案中，条码中的碱基是连续的。在一些实施方案中，条码中的碱基是不连续的。在一些实施方案中，衔接头不包含条码。

在衔接头中条码可以是双链的。在一些情况下，在衔接头中条码是单链的。在衔接头中条码可包含双链和单链序列。衔接头可包含大约、多于大约、至少约或少于约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的条码。如果衔接头包含多于一个条码，则在衔接头上条码可彼此间隔大约、多于约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基或碱基对。

可购买到的包含具有条码的衔接头的试剂盒可以在本文所述的方法中使用。例如，包含具有条码的衔接头的试剂盒可包括ENCORE^TM384多路系统

其可包含384分子条码化的文库衔接头。用于ION TORRENT^TM的ENCORE^TMNGS多路文库系统可包含可连接至片段上的具有条码的衔接头。ENCORE^TM完整RNA-Seq IL多路系统1-8

和ENCORE^TM完整RNA-Seq IL多路系统9-16

可提供用于多路测序的条码化衔接头。ENCORE^TM完整RNA-Seq DR多路系统1-8和ENCORE^TM完整RNA-Seq DR多路系统9-16

可提供专用读取(DR)条码设计。来自LIFE TECHNOLOGIES^TM的具有含有条码的衔接头的试剂盒的实例包括5500SOLiD^TM片段文库条码衔接头1-16、5500SOLiD^TM片段文库条码衔接头1-96、5500SOLiD^TM片段文库条码衔接头17-32、5500SOLiD^TM片段文库条码衔接头33-48、5500SOLiD^TM片段文库条码衔接头49-64、5500SOLiD^TM片段文库条码衔接头65-80、5500SOLiD^TM片段文库条码衔接头81-96、5500SOLiD^TM片段文库核心试剂盒、5500SOLiD^TM片段文库标准衔接头、用于5500遗传分析系统的LIBRARY BUILDER^TM片段核心试剂盒、SOLiD^TM片段文库条码化试剂盒1-96、SOLiD^TM片段文库条码化试剂盒模块17-32、SOLiD^TM片段文库条码化试剂盒模块33-48、SOLiD^TM片段文库条码化试剂盒模块49-64、SOLiD^TM片段文库条码化试剂盒模块65-80、SOLiD^TM片段文库条码化试剂盒模块81-96、SOLiD^TMRNA条码化试剂盒模块1-16、SOLiD^TMRNA条码化试剂盒模块1-48、SOLiD^TMRNA条码化试剂盒模块1-96、SOLiD^TMRNA条码化试剂盒模块17-32、SOLiD^TMRNA条码化试剂盒模块33-48、SOLiD^TMRNA条码化试剂盒模块49-64、SOLiD^TMRNA条码化试剂盒模块49-96、SOLiD^TMRNA条码化试剂盒模块65-80或SOLiD^TMRNA条码化试剂盒模块81-96。

其他可购买到的具有含有条码的衔接头的试剂盒包括SureSelect AB条码衔接头试剂盒(AGILENT TECHONOLOGIES)、Bioo Scientific的AIR^TM条码化衔接头、NEXTFLEX^TMDNA条码、

TRUSEQ^TMRNA和DNA样品制备试剂盒、

Technologies DEEPSEQ^TMFFPE溶液、用于的

Multiplex Oligos(索引引物1-12)或用于

的

多路复用小RNA文库制品(MultiplexSmall RNA Library Prep)组(索引引物1-12)。

多核苷酸可通过连接至包含条码的衔接头而接受条码。该连接可涉及一种或多种连接酶的使用。可通过用包含条码的引物进行扩增而将条码连接至多核苷酸。

条码可与引物结合位点相邻。条码可以位于引物结合(退火、杂交)位点3’侧0或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基。

引物/探针结合位点

衔接头可包含一个或多个引物、探针或寡核苷酸杂交位点。所述一个或多个引物、探针或寡核苷酸杂交位点可以为大约、多于约、少于约或至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基。引物、探针或寡核苷酸杂交位点可用于将寡核苷酸引物与用于扩增的衔接头退火或将引物与用于测序反应的衔接头退火。衔接头可包含用于退火多于一个寡核苷酸引物或探针例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个寡核苷酸引物或探针的序列。衔接头可具有用于退火测序引物和扩增引物的位点。与衔接头退火的引物或探针可以为大约、多于约、少于约或至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基长度。

限制酶位点

衔接头可包含一个或多个限制酶结合位点和或切割位点。可结合或切割衔接头的限制酶可以为，例如，AatII、Acc65I、AccI、AciI、AclI、AcuI、AfeI、AflII、AflIII、AgeI、AhdI、AleI、AluI、AlwI、AlwNI、ApaI、ApaLI、ApeKI、ApoI、AscI、AseI、AsiSI、AvaI、AvaII、AvrII、BaeGI、BaeI、BamHI、BanI、BanII、BbsI、BbvCI、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BclI、BfaI、BfuAI、BfuCI、BglI、BglII、BlpI、BmgBI、BmrI、BmtI、BpmI、Bpu10I、BpuEI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BsaJI、BsaWI、BsaXI、BseRI、BseYI、BsgI、BsiEI、BsiHKAI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BsoBI、Bsp1286I、BspCNI、BspDI、BspEI、BspHI、BspMI、BspQI、BsrBI、BsrDI、BsrFI、BsrGI、BsrI、BssHII、BssKI、BssSI、BstAPI、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BstXI、BstYI、BstZ17I、Bsu36I、BtgI、BtgZI、BtsCI、BtsI、Cac8I、ClaI、CspCI、CviAII、CviKI-1、CviQI、DdeI、DpnI、DpnII、DraI、DraIII、DrdI、EaeI、EagI、EarI、EciI、Eco53kI、EcoNI、EcoO109I、EcoP15I、EcoRI、EcoRV、FatI、FauI、Fnu4HI、FokI、FseI、FspI、HaeII、HaeIII、HgaI、HhaI、HincII、HindIII、HinfI、HinP1I、HpaI、HpaII、HphI、Hpy166II、Hpy188I、Hpy188III、Hpy99I、HpyAV、HpyCH4III、HpyCH4IV、HpyCH4V、KasI、KpnI、MboI、MboII、MfeI、MluI、MlyI、MmeI、MnlI、MscI、MseI、MslI、MspA1I、MspI、MwoI、NaeI、NarI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、NciI、NcoI、NdeI、NgoMIV、NheI、NlaIII、NlaIV、NmeAIII、NotI、NruI、NsiI、NspI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、PacI、PaeR7I、PciI、PflFI、PflMI、PhoI、PleI、PmeI、PmlI、PpuMI、PshAI、PsiI、PspGI、PspOMI、PspXI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、RsrII、SacI、SacII、SalI、SapI、Sau3AI、Sau96I、SbfI、ScaI、ScrFI、SexAI、SfaNI、SfcI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SmlI、SnaBI、SpeI、SphI、SspI、StuI、StyD4I、StyI、SwaI、T、TaqαI、TfiI、TliI、TseI、Tsp45I、Tsp509I、TspMI、TspRI、Tth111I、XbaI、XcmI、XhoI、XmaI、XmnI或ZraI。

衔接头可包含IIS型限制酶结合位点。IIS型限制酶可在距非回文不对称识别位点的限定距离处切割DNA。IIS型限制酶的实例包括AarI、Acc36I、AccBSI、AciI、AclWI、AcuI、AloI、Alw26I、AlwI、AsuHPI、BaeI、BbsI、BbvCI、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BfiI、BfuAI、BfuI、BmgBI、BmrI、BpiI、BpmI、Bpu10I、Bpu10I、BpuAI、BpuEI、BsaI、BsaMI、BsaXI、Bse1I、Bse3DI、BseGI、BseMI、BseMII、BseNI、BseRI、BseXI、BseYI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、Bso31I、BspCNI、BspMI、BspQI、BspTNI、BsrBI、BsrDI、BsrI、BsrSI、BssSI、Bst2BI、Bst6I、BstF5I、BstMAI、BstV1I、BstV2I、BtgZI、BtrI、BtsCI、BtsI、CspCI、Eam1104I、EarI、EciI、Eco31I、Eco57I、Eco57MI、Esp3I、FauI、FauI、FokI、GsuI、HgaI、Hin4I、HphI、HpyAV、Ksp632I、LweI、MbiI、MboII、MlyI、MmeI、MnlI、Mva1269I、NmeAIII、PctI、PleI、PpiI、PpsI、PsrI、SapI、SchI、SfaNI、SmuI、TspDTI、TspGWI或Taq II。限制酶可结合衔接头内的识别序列并切割衔接头外(例如，在多核苷酸中)的序列。

限制酶可以是甲基化敏感的限制酶。甲基化敏感的限制酶可特异性地切割甲基化的DNA。甲基化敏感的限制酶可特异性地切割未甲基化的DNA。甲基化敏感的酶可包括，例如，DpnI、Acc65I、KpnI、ApaI、Bsp120I、Bsp143I、MboI、BspOI、NheI、Cfr9I、SmaI、Csp6I、RsaI、Ecl136II、SacI、EcoRII、MvaI、HpaII、MSpJI、LpnPI、FsnEI、DpnII、McrBc或MspI。

衔接头可包含针对一种或多种切刻内切核酸酶、I型内切核酸酶或III型内切核酸酶的一个或多个识别位点。切刻内切核酸酶只能水解双链体的一条链以产生“带切口的”而非切割的DNA分子。切刻可产生3-羟基和5’-磷酸。切刻酶的实例包括Nt.CviPII、Nb.BsmI、Nb.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI或Nt.BstNBI。I型内切核酸酶可在与识别位点相距随机距离的不同位点处切割。III型内切核酸酶可识别两个独立的相反方向的非回文序列。III型限制酶的实例包括EcoP15和EcoP1。

在本文所述的方法、组合物和/或试剂盒中使用的一种或多种限制酶可以是杂合蛋白或嵌合蛋白的成分。例如，包含酶活性(例如，内切核酸酶活性)的限制酶的结构域可与另一种蛋白质例如DNA结合蛋白质融合。DNA结合蛋白质可将该杂合体靶向至DNA上的特定序列。具有酶活性的结构域的核酸切割活性可以是序列特异性的或非序列特异性的。例如，来自IIs型限制性内切核酸酶FokI的非特异性切割结构域可以用作杂合核酸酶的酶(切割)结构域。具有酶活性的结构域可切割的序列可受限于杂合体经由DNA结合域与DNA的物理束缚。DNA结合域可来自真核或原核转录因子。DNA结合域可识别连续核酸序列的大约或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碱基或碱基对。DNA结合域可识别序列的约9至约18个碱基或碱基对。DNA结合域可以为，例如，锌指DNA结合域。DNA结合域可来自天然存在的蛋白质。可将DNA结合域工程化为特异性结合任何期望的核苷酸序列。杂合体可以是锌指核酸酶(例如，锌指核酸酶)。杂合蛋白质可以作为多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体等)起作用。

修饰

衔接头可包含一种或多种末端修饰。衔接头可包含一个5’磷酸。衔接头可包含两个5’磷酸。衔接头可包含一个3’羟基。衔接头可包含两个3’羟基。衔接头可缺乏3’羟基。

衔接头可包含一种或多种3’末端修饰。3’末端修饰可以为，例如，3’-氨基、3’-黑洞猝灭剂(例如，BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2)、3’-生物素、3’-胆固醇、3’-dabcyl CPG、3’dabsyl CPG、3’-染料(例如，荧光素-CGP、Tamra-CPG、Rox-CPG、Cal Fluor560-CPG、Quasar570(Cy3取代)-CGP、Quasar670(Cy5取代)-CPG、Quasar705(Cy5.5取代)-CPG、Pulsar650-CPG、Epoch Richmond Red-CPG、Epoch YakimaYellow-CPG、吖啶-CPG、3’-反向连接(具有连接至载体的5’-OH和可用于链延伸的3’-OH)、3’-磷酸。衔接头可包含本文所述的任何荧光染料。

衔接头可包含一种或多种5’末端修饰。5’末端修饰可以为，例如，5’-氨基、5’-生物素、5’-洋地黄毒苷(DIG)、5’磷酸基团或5’-巯基。衔接头可包含5’醛、5’碱性磷酸酶、5’胺、5’辣根过氧化物酶(HRP)、5’荧光素、5’HEX、5’ROX、5’TET或5’TAMRA。5’修饰可以为分子探针染料，例如，Alexa Fluor488、Alexa Fluro532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor594、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor750、FL、

530/550、

493/503、

558/569、

564/570、576/589、581/591、

FL-X、

TR-X、

TMR、

R6G、

R6G-X、

630/650、

650/665、CASCADE BLUE^TM染料、MARINA BLUE^TM、OREGON

514、OREGON

488、OREGON

488-X、PACIFIC BLUE^TM染料、RHODAMINE GREEN^TM染料、RHODOL GREEN^TM染料、RHODAMINE GREEN^TM-X、RHODAMINERED^TM-X、TEXAS或TEXAS RED^TM-X。

可通过连接体例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20将修饰连接至核酸链。连接体可以是，例如，PC(光可切割的)间隔区、己二醇、间隔区9(三甘醇间隔区)、间隔区18(18原子六-乙二醇间隔区)、1’,2’二脱氧核糖(dspacer)、或I-连接体(来自Exiqon)。

衔接头可包含一个或多个甲基。

衔接头可用规范核苷酸(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)来合成。衔接头可用一种或多种非规范核苷酸制备。非规范核苷酸可以是dUTP。衔接头可包含脱氧尿嘧啶或脱氧肌苷。

衔接头可包含一种或多种RNA样核苷，例如，ANA(阿拉伯糖基)、LNA(锁定的)、2’-O甲基RNA、FANA(2’-氟代阿拉伯糖基)或2’-氟RNA。衔接头可包含DNA样核苷，例如，β-D-DNA、β-L-DNA或α-D-DNA。

衔接头可包含一种或多种5’-3硫代磷酸连接或反向连接(5’-5’或3’-3’)。衔接头可包含A-硫代磷酸、C-硫代磷酸、G-硫代磷酸或T-硫代磷酸。

衔接头中的修饰的碱基可包括，例如，LNA(锁定核酸)、2-氨基嘌呤、三聚体-20、氟代碱基、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、5-溴dU、脱氧尿苷、反向dT、双脱氧C、5-甲基dC、脱氧肌苷、5-硝基吲哚、ribo A、ribo C、ribo G、ribo U或-+2’O-甲基RNA碱基。衔接头可具有本文所述的任何类型的核酸修饰。

在一些实施方案中，衔接头是化学合成的。在一些实施方案中，衔接头不是化学合成的。

可在样品多核苷酸上找到本文所述的修饰。

分区

可通过可用于数字PCR的任何分离模式形成分区。分区可以为微流体通道，纳流体装置或微流体装置或微量滴定板上的孔，或微流体装置中的反应室。分区可以是阵列表面上的区域。分区可以是乳液的水相(例如小滴)。本文描述了产生小滴的方法。

小滴的产生

本公开内容包括用于例如使用小滴数字PCR操作小滴中的遗传物质的组合物、方法和试剂盒。本文所述的小滴可包括在美国专利7,622,280中所述的乳液组合物(或两种或更多种不混溶流体的混合物)和由在公开号为WO/2010/036352的国际申请(第一发明人：Colston)中所述的装置产生的小滴，上述每个申请通过引用整体并入本文。本文所用的术语乳液可指不混溶液体(如油和水)的混合物。油相和/或油包水乳液可允许水性小滴内反应混合物的区室化。在一些实施方案中，乳液可包含连续油相内的水性小滴。在其他实施方案中，本文提供的乳液为水包油乳液，其中小滴为连续水相内的油小滴。本文提供的小滴可用于防止区室之间的混合，并且每个区室可防止其内容物蒸发以及防止其内容物与其他区室的内容物聚结(coalescing)。在小滴中可发生一种或多种酶反应。

本文所述的混合物或乳液可以是稳定的或不稳定的。乳液可以是相对稳定的并且具有最小的聚结。当小的小滴结合逐渐形成较大的小滴时可发生聚结。由小滴发生器产生的小滴中少于约0.00001%、0.00005%、0.00010%、0.00050%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、6%、7%、8%、9%或10%可与其他小滴聚结。乳液还可具有有限的絮凝，通过该过程分散相从悬浮液中呈片状析出。

如本文所述将样品分成小反应体积使得能够使用减少的试剂量，从而降低分析的材料成本。通过分区降低样品的复杂性也能够提高检测的动态范围，因为在不同的区室中较高丰度的分子可与较低丰度的分子分离，从而使较低丰度的分子有更高的比例与反应试剂接触，这转而可增强对较低丰度分子的检测。

可产生平均直径为大约、大于约、小于约或至少约0.001、0.01、0.05、0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150、160、180、200、300、400或500微米的小滴。小滴的平均直径可以为约0.001微米至约0.01微米、约0.001微米至约0.005微米、约0.001微米至约0.1微米、约0.001微米至约1微米、约0.001微米至约10微米、约0.001微米至约100微米、约0.001微米至约500微米、约0.01微米至约0.1微米、约0.01微米至约1微米、约0.01微米至约10微米、约0.01微米至约100微米、约0.01微米至约500微米、约0.1微米至约1微米、约0.1微米至约10微米、约0.1微米至约100微米、约0.1微米至约500微米、约1微米至约10微米、约1微米至约100微米、1微米至约500微米、约10微米至约100微米、约10微米至约500微米或约100微米至约500微米。

小滴体积可为大约、大于约、小于约或至少约0.001nL、0.01nL、0.1nL、1nL(100μm³)、10nL或100nL。可使用例如RAINSTORM^TM(RAINDANCE^TM)、来自ADVACED LIQUID LOGIC的微流体或ddPCR^TM(BIO-RAD)产生小滴。

使用微通道错流聚焦或物理搅拌产生乳液小滴的微流体方法可产生单分散或多分散乳液。小滴可以是单分散小滴。可产生小滴，使得所述小滴的大小变化不超过所述小滴的平均大小的±5%。可产生小滴，使得所述小滴的大小变化不超过所述小滴的平均大小的±2%。小滴发生器可从单一样品产生小滴群体，其中小滴的大小变化均不超过小滴总群的平均大小的±0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%。

小滴发生器中的流速和样品中核酸的长度均可对小滴的产生具有影响。减小拉伸的一种方法是降低流速；然而这可具有较低的通量以及增加的小滴大小的不期望的副作用。在极端情况下，长核酸可破坏小滴的形成，导致稳流而非离散的小滴。当核酸负载高时，减小样品中核酸的大小可改善小滴的形成。可使用具有高核酸负载(例如，高DNA负载、高RNA负载等)的样品。减小样品中核酸的长度(例如，通过消化、超声处理、热处理或剪切)可改善小滴的形成。

较高机械稳定性对于微流体操作和较高剪切流体加工(例如，在微流体毛细管中或在流体路径中经过90度弯折部分，如阀门)可能是有用的。预先或后续热处理的小滴或胶囊对标准移液操作和离心可能是机械稳定的。

可通过使油相流过含水样品而形成小滴。分区，例如乳液的水相，可包含缓冲的溶液和用于进行扩增反应例如PCR反应的试剂，包括核苷酸、引物、用于荧光检测的探针、模板核酸、DNA聚合酶和/或逆转录酶。

分区，例如乳液的水相，可包含缓冲的溶液和用于进行无固态珠(例如磁珠)的酶反应(例如，PCR)的试剂。缓冲的溶液可包含大约、多于约、至少约或少于约1、5、10、15、20、30、50、100或200mM的Tris。分区，例如乳液的水相，可包含一种或多种缓冲液，包括，例如，TAPS、N-二甘氨酸、Tris、三甲基甘氨酸(Tricine)、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、甲次胂酸盐、SSC、ADA、ACES、氯化胆胺、乙酰氨基甘氨酸、甘氨酰胺、马来酸盐、磷酸盐、CABS、哌啶、甘氨酸、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、苹果酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、丙酸盐、吡啶、哌嗪、组氨酸、双-tris、乙醇胺、碳酸盐、MOPSO、咪唑、双-TRIS丙烷、BES、MOBS、三乙醇胺(TEA)、HEPPSO、POPSO、肼、氨基丁三醇(Trizma)(tris)、EPPS、HEPPS、N-二甘氨酸、HEPBS、AMPSO、牛磺酸(AES)、硼酸盐、CHES、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、氢氧化铵、甲胺或MES。分区例如乳液的水相的pH可为约2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12或12.5。分区例如乳液的水相的pH可为约5至约9、约5至约8、约5至约7、约6.5至约8、约6.5至约7.5、约6至约7、约6至约9或约6至约8。

分区，例如乳液的水相，可包含盐，例如，乙酸钾、氯化钾、乙酸镁、氯化镁、乙酸钠或氯化钠。氯化钾的浓度可以为大约、大于约、至少约或小于约10、20、30、40、50、60、80、100、200mM。缓冲的溶液可包含约15mM Tris和约50mM KCl。

分区，例如乳液的水相，可包含核苷酸。核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸三磷酸分子，包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP，每一种的浓度为大约、大于约、小于约或至少约50、100、200、300、400、500、600或700μM。可将dUTP加入分区例如乳液的水相内至浓度为大约、小于约、大于约或至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000μM。分区例如乳液的水相中dUTP与dTTP的比值可为大约1:1000、1:500、1:250、1:100、1:75、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:5、1:4、1:3、1:2或1:1。

分区，例如乳液的水相，可包含一种或多种二价阳离子。该一种或多种二价阳离子可以是，例如，Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺或Zn²⁺。可将氯化镁(MgCl₂)以大约、大于约、至少约或小于约1.0、2.0、3.0、4.0或5.0mM的浓度加至分区例如乳液的水相中。MgCl₂的浓度可为大约3.2mM。可用硫酸镁以相似的浓度替代氯化镁。分区，例如乳液的水相，可包含氯化镁和硫酸镁两者。来自不同供应商的众多常用的商业化PCR缓冲液可以替代缓冲的溶液。

非离子型环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物可以以大约、大于约、小于约或至少约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1.0%的浓度加入分区例如乳液的水相中。分区或水相可包含生物表面活性剂。常用的生物表面活性剂包括非离子型表面活性剂，如Pluronic F-68、Tetronics、Zonyl FSN。Pluronic F-68可以约0.5%w/v的浓度存在。

添加剂

分区，例如乳液的水相，可包含一种或多种添加剂，包括但不限于非特异性背景/封闭核酸(如，鲑精DNA)、生物防腐剂(如，叠氮钠)、PCR增强剂(如，甜菜碱(N,N,N-三甲基甘氨酸；[羧甲基]三甲基铵)、海藻糖等)和/或抑制剂(如，RNA酶抑制剂)。可向本文提供的方法中分析的样品中加入包含例如甜菜碱和DMSO的富含GC的添加剂。

一种或多种添加剂可包括非特异性封闭剂如BSA或来自牛皮的明胶。明胶或BSA可以以约0.1%w/v到约0.9%w/v的浓度范围存在。其他封闭剂可包括β乳球蛋白、酪蛋白、乳粉或其他常见封闭剂。在一些情况下，BSA和明胶的浓度为约0.1%w/v。

一种或多种添加剂可包括2-吡咯烷酮、乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、B-羟乙基吡咯烷酮(HEP)、丙酰胺、NN-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基甲酰胺(MMP)、NN-二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、N-甲基乙酰胺(MMA)、聚乙二醇、四甲基氯化铵(TMAC)、7-脱氮-2’-脱氧鸟苷、T4基因32蛋白质、甘油或非离子型去污剂(Triton X-100、吐温20、Nonidet P-40(NP-40)、吐温40、SDS(例如，约0.1%SDS)、鲑精DNA、叠氮钠、甲酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇(BME)、2-巯基乙胺-HCl、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、半胱氨酸-HCl或植物多糖。一种或多种添加剂可以是乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺或suphalane。

引物

分区，例如乳液的水相，可包含寡核苷酸引物。寡核苷酸引物可用于扩增。在分区例如乳液的水相中用于扩增的引物可具有大约、大于约、小于约或至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0μM的浓度。每种引物的浓度可为大约0.5μM。可根据已知的参数设计引物以避免产生二级结构和自杂交。不同引物对可在大致相同的温度退火和解链，例如，与另一引物对相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃之内。在一些情况下，起初使用大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、500、1000、5000、10,000个或更多的引物。这类引物能够与本文所述的遗传靶标杂交。可使用约2到约10,000、约2到约5,000、约2到约2,500、约2到约1,000、约2到约500、约2到约100、约2到约50、约2到约20、约2到约10或约2到约6个引物。

引物可以通过许多方法制备，包括但不限于适当序列的克隆和使用本领域公知方法的直接化学合成(Narang等人,Methods Enzymol.68:90(1979)；Brown等人,Methods Enzymol.68:109(1979))。引物也可以从商业来源获得，如Integrated DNA Technologies、OperonTechnologies、Amersham Pharmacia Biotech、Sigma或LifeTechnologies。引物可具有相同的解链温度。引物的解链温度可以是约30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、81、82、83、84或85℃。引物的解链温度可以是约30到约85℃、约30到约80℃、约30到约75℃、约30到约70℃、约30到约65℃、约30到约60℃、约30到约55℃、约30到约50℃、约40到约85℃、约40到约80℃、约40到约75℃、约40到约70℃、约40到约65℃、约40到约60℃、约40到约55℃、约40到约50℃、约50到约85℃、约50到约80℃、约50到约75℃、约50到约70℃、约50到约65℃、约50到约60℃、约50到约55℃、约52到约60℃、约52到约58℃、约52到约56℃或约52到约54℃。

引物的长度可在5'端或3'端延长或缩短，从而产生有期望的解链温度的引物。引物对中的一个引物可以比另一个引物长。引物对内的引物的3'退火长度可以不同。另外，可以设计每个引物对的退火位置，以使引物对的序列和长度产生期望的解链温度。用于确定小于25个碱基对的引物的解链温度的方程为Wallace规则(Td=2(A+T)+4(G+C))。还可以使用计算机程序设计引物对，包括但不限于阵列设计软件(Array Designer Software)(Arrayit Inc.)、用于遗传分析的寡核苷酸探针序列设计软件(Oligonucleotide Probe SequenceDesign Software for Genetic Analysis)(Olympus Optical Co.)、NetPrimer和来自Hitachi Software Engineering的DNAsis。可使用软件程序，如Net Primer(免费的基于网络的程序，http://www.premierbiosoft.com/netprimer/index.html)来计算每个引物的TM(解链温度或退火温度)。引物的退火温度可在任何扩增循环后重新计算并升高，所述任何扩增循环包括但不限于约1、2、3、4、5次循环、约6次循环到约10次循环、约10次循环到约15次循环、约15次循环到约20次循环、约20次循环到约25次循环、约25次到约30次循环、约30次到约35次循环或约35次循环到约40次循环。在初始扩增循环后，可将引物的5'一半引入来自每个目的基因座的产物中；因此可基于每个引物的5'一半和3'一半的序列重新计算TM。

引物的退火温度可以在任何扩增循环后重新计算并升高，所述任何扩增循环包括但不限于约1、2、3、4、5次循环、约6次循环到约10次循环、约10次循环到约15次循环、约15次循环到约20次循环、约20次循环到约25次循环、约25次到约30次循环、约30次到约35次循环或约35次循环到约40次循环。在初始扩增循环后，可将引物的5'一半引入来自每个目的基因座的产物中，因此可基于每个引物的5'一半和3'一半的序列重新计算TM。

探针

分区，例如乳液的水相，可包含一种或多种用于荧光检测的探针。该一种或多种探针中每一种探针的浓度可以为大约、大于约、至少约或小于约0.1、0.2、0.3、0.4或0.5μM。该一种或多种用于荧光检测的探针的浓度可为约0.25μM。在PCR中，合适的靶核酸浓度范围可为约1pg到约500ng。探针可以为大约、大于约、小于约或至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基长。探针可为约8至约40、约10至约40、约10至约35、约10至约30、约10至约25、约10至约20、约15至约40、约15至约35、约15至约30、约15至约25、约15至约20、约18至约40、约18至约35、约18至约30、约18至约25或约18至22个碱基。探针(例如，Taqman探针)上使用的标记物(荧光团、染料)可以是，例如，6-羧基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、4,7,2′-三氯-7′-苯基-6-羧基荧光素(VIC)、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、四甲基罗丹明、ROX和JOE、Alexa Fluor染料，例如，AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、633、647、660、680、700和750；级联蓝(Cascade Blue)、海蓝(Marina Blue)、俄勒冈绿(Oregon Green)500、俄勒冈绿514、俄勒冈绿488、俄勒冈绿488-X、太平洋蓝(Pacific Blue)、罗丹明绿、对甲氨基酚绿(RhodolGreen)、罗丹明绿-X、罗丹明红-X和德克萨斯红-X。标记物可处于探针的5’端、探针的3’端、探针的5’端和3’端，或在探针内部。在实验中，可利用独特标记物检测每个不同的基因座。探针，如Taqman探针，可包含猝灭剂，例如，3’猝灭剂。3’猝灭剂可以是，例如，TAMARA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3。在一些情况下，在本文提供的方法中使用的猝灭剂是黑洞猝灭剂(BHQ)。在一些情况下，猝灭剂是小沟结合物(MGB)。在一些情况下，猝灭剂是荧光猝灭剂。在其他情况下，猝灭剂是非荧光猝灭剂(NFQ)。

聚合酶

分区，例如乳液的水相，可包含聚合酶。聚合酶可以是DNA聚合酶。DNA聚合酶可以是，例如，T4DNA聚合酶、DEEP VENT^TMDNA聚合酶、Taq、

高保真DNA聚合酶、

热启动Taq、Crimson

Taq、Taq DNA聚合酶、Crimson Taq DNA聚合酶、DNA聚合酶、

DNA聚合酶、

DNA聚合酶、Hemo

Bsu DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I大(Klenow)Klenow片段、Phi29DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pfx DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、噬菌体29、REDTAQ^TM或T7DNA聚合酶。DNA聚合酶可包含3’到5’外切核酸酶活性。DNA聚合酶可包含5’到3’外切核酸酶活性。DNA聚合酶可同时包含3’到5’外切核酸酶活性和5’到3’外切核酸酶活性。DNA聚合酶可既不包含3’到5’外切核酸酶活性也不包含5’到3’外切核酸酶活性。DNA聚合酶可包含链置换活性。在一些情况下，DNA聚合酶不包含链置换活性。DNA聚合酶的错误率可小于1x10^-6个碱基。

分区，例如乳液的水相，可包含逆转录酶。逆转录酶可以是AMV逆转录酶或M-MuLV逆转录酶。RNA聚合酶可包含5’到3’外切核酸酶活性。逆转录酶可同时包含3’到5’外切核酸酶活性和5’到3’外切核酸酶活性。逆转录酶可既不包含3’到5’外切核酸酶活性也不包含5’到3’外切核酸酶活性。逆转录酶可包含链置换活性。在一些实施方案中，逆转录酶不包含链置换活性。

分区，例如乳液的水相，可包含RNA聚合酶。RNA聚合酶可以是，例如，phi6RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶。

在一些实施方案中，分区，例如乳液的水相，包含聚(U)聚合酶或聚(A)聚合酶。

油相

油相可包含氟化基础油(base oil)，该基础油可通过与氟化表面活性剂如全氟化聚醚组合而额外得到稳定化。基础油可以是HFE7500、FC-40、FC-43、FC-70中的一种或多种或另一种常用氟化油。阴离子型表面活性剂可以是Krytox铵(Krytox-AM)、Krytox FSH的铵盐或Krytox-FSH的吗啉衍生物。Krytox-AS可以以大约、大于约、小于约或至少约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0%w/w的浓度存在。Krytox-AS的浓度可为大约1.8%。Krytox-AS的浓度可为大约1.62%。Krytox-FSH的吗啉衍生物可以以大约、大于约、小于约或至少约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0%w/w的浓度存在。Krytox-FSH的吗啉衍生物的浓度可为大约1.8%。在一些实施方案中，Krytox-FSH的吗啉衍生物的浓度可为大约1.62%。

油相可包含用于调节油的性质如蒸汽压或粘度或表面张力的添加剂。非限制性实例包括全氟辛醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸醇。在一些实施方案中，加入1H,1H,2H,2H-全氟癸醇至约0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%、2.25%、2.50%、2.75%或3.00%w/w的浓度。在一些实施方案中，加入1H,1H,2H,2H-全氟癸醇至0.18%w/w的浓度。

微胶囊

在一些实施方案中，配制乳液以产生高度单分散的、具有液体样界面膜的小滴，这些小滴可通过加热转变成具有固体样界面膜的微胶囊；这些微胶囊能像生物反应器一样表现，在整个反应过程如PCR扩增中能够保持其内容物。加热时可发生向微胶囊形式的转变。例如，这种转变可在高于约、大于约或至少约50、60、70、80、90或95摄氏度的温度下发生。在一些实施方案中，使用热循环仪进行这种加热。在加热过程中，可使用流体或矿物油覆盖层防止蒸发。在加热前，可除去或不除去过多的连续相油。在众多的热处理和机械加工中，生物相容性胶囊可抵抗聚结和/或絮凝。

转变之后，可将胶囊储存在大约、高于约、低于约或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40摄氏度，其中一个实施方案包括将胶囊储存在低于约25摄氏度。在一些实施方案中，这些胶囊可用于生物医学应用，如大分子(尤其是含有核酸或蛋白质或二者的混合物的水性生物流体)的稳定、数字化封装；药物和疫苗递送；生物分子文库；临床成像应用等。

微胶囊可含有一种或多种核酸探针(例如，分子倒置探针、连接探针等)并且可抵抗聚结，尤其是在高温下。因此，PCR扩增反应可以非常高的密度(例如，每单位体积的反应数)发生。在一些实施方案中，每ml可发生多于100,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、2,500,000、5,000,000或10,000,000个单独的反应。在一些实施方案中，反应发生在单一孔内，例如，微量滴定板的孔内，而无需反应体积之间的相互混合。微胶囊还可含有使酶反应(例如PCR反应)能够发生所需的其他组分，例如，核苷酸、引物、探针、dNTPs、DNA或RNA聚合酶、逆转录酶、限制酶等。这些胶囊在众多热处理和机械加工中显示出对聚结和絮凝的抗性。

本文所述的组合物可包括包含两种或更多种不混溶流体如油和水的混合物的组合物，该流体含有一种类型的核酸探针(例如，TaqMan探针、分子倒置探针、连接探针等)。在一些情况下，该组合物包含本文所述的限制酶，例如，包含限酶(例如，甲基化敏感的酶)的小滴。在其他实施方案中，本文所述的组合物包含含有一种类型的核酸(例如，TaqMan探针、分子倒置探针、连接探针等)的微胶囊。这样的微胶囊可抵抗聚结，尤其是在高温下，并因此能够使扩增反应以非常高的密度(例如，每单位体积的反应数)发生。

断裂

分区(例如，小滴)内的文库制备可能需要样品中的多核苷酸的断裂和衔接头的连接。通常，断裂在分区(例如，小滴)内发生；但是在一些应用中，断裂可在分区之前发生。断裂可酶促地完成，例如使用内切核酸酶。该内切核酸酶可以是，例如，AatII、Acc65I、AccI、AciI、AclI、AcuI、AfeI、AflII、AflIII、AgeI、AhdI、AleI、AluI、AlwI、AlwNI、ApaI、ApaLI、ApeKI、ApoI、AscI、AseI、AsiSI、AvaI、AvaII、AvrII、BaeGI、BaeI、BamHI、BanI、BanII、BbsI、BbvCI、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BclI、BfaI、BfuAI、BfuCI、BglI、BglII、BlpI、BmgBI、BmrI、BmtI、BpmI、Bpu10I、BpuEI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BsaJI、BsaWI、BsaXI、BseRI、BseYI、BsgI、BsiEI、BsiHKAI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BsoBI、Bsp1286I、BspCNI、BspDI、BspEI、BspHI、BspMI、BspQI、BsrBI、BsrDI、BsrFI、BsrGI、BsrI、BssHII、BssKI、BssSI、BstAPI、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BstXI、BstYI、BstZ17I、Bsu36I、BtgI、BtgZI、BtsCI、BtsI、Cac8I、ClaI、CspCI、CviAII、CviKI-1、CviQI、DdeI、DpnI、DpnII、DraI、DraIII、DrdI、EaeI、EagI、EarI、EciI、Eco53kI、EcoNI、EcoO109I、EcoP15I、EcoRI、EcoRV、FatI、FauI、Fnu4HI、FokI、FseI、FspI、HaeII、HaeIII、HgaI、HhaI、HincII、HindIII、HinfI、HinP1I、HpaI、HpaII、HphI、Hpy166II、Hpy188I、Hpy188III、Hpy99I、HpyAV、HpyCH4III、HpyCH4IV、HpyCH4V、KasI、KpnI、MboI、MboII、MfeI、MluI、MlyI、MmeI、MnlI、MscI、MseI、MslI、MspA1I、MspI、MwoI、NaeI、NarI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、NciI、NcoI、NdeI、NgoMIV、NheI、NlaIII、NlaIV、NmeAIII、NotI、NruI、NsiI、NspI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、PacI、PaeR7I、PciI、PflFI、PflMI、PhoI、PleI、PmeI、PmlI、PpuMI、PshAI、PsiI、PspGI、PspOMI、PspXI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、RsrII、SacI、SacII、SalI、SapI、Sau3AI、Sau96I、SbfI、ScaI、ScrFI、SexAI、SfaNI、SfcI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SmlI、SnaBI、SpeI、SphI、SspI、StuI、StyD4I、StyI、SwaI、T、TaqαI、TfiI、TliI、TseI、Tsp45I、Tsp509I、TspMI、TspRI、Tth111I、XbaI、XcmI、XhoI、XmaI、XmnI或ZraI。

在一些实施方案中，断裂为机械断裂。在一些实施方案中，裂解或提取过程中产生的剪切力可机械地断裂多核苷酸。断裂可通过例如超声处理、热处理或剪切来完成。在一些实施方案中，机械断裂通过雾化进行。

在一些实施方案中，内切核酸酶为甲基化敏感的限制酶。在一些实施方案中，甲基化敏感的限制性酶特异性切割甲基化的多核苷酸。在一些实施方案中，甲基化敏感的限制酶特异性地切割未甲基化的多核苷酸。甲基化敏感的酶可包括，例如，DpnI、Acc65I、KpnI、ApaI、Bsp120I、Bsp143I、MboI、BspOI、NheI、Cfr9I、SmaI、Csp6I、RsaI、Ecl136II、SacI、EcoRII、MvaI、HpaII、MSpJI、LpnPI、FsnEI、DpnII、McrBc或MspI。

在一些实施方案中，多核苷酸的断裂如下完成：通过向多核苷酸中引入一种或多种非规范核苷酸(例如，dUTP)，通过切割非规范核苷酸的碱基(例如，使用诸如尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)或尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG))产生一个或多个脱碱基位点，并且在该一个或多个脱碱基位点断裂多核苷酸。断裂可通过酶剂或化学剂来进行。化学剂可以是，例如，聚胺，例如，N,N’-二甲基乙二胺(DMED)。酶剂可以是，例如，脱嘌呤/脱嘧啶内切核酸酶(APE1)。在一些实施方案中，断裂可如公开号为20110033854或20100022403的美国专利申请所述来完成。

连接

断裂之后可以是将衔接头连接至多核苷酸的步骤。在一些实施方案中，连接步骤不在断裂步骤之后。分区，例如乳液的水相，可包含连接酶。连接酶可以是，例如，T4DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶、9°N^TMDNA连接酶、T4RNA连接酶1(ssRNA连接酶)、T4RNA连接酶2(dsRNA连接酶)或截短的T4RNA连接酶2(NEB)。

分区，例如乳液的水相，可包含用于连接反应的试剂，例如，缓冲液、盐和/或还原剂。可在与包含多核苷酸的分区(例如乳液的水相)分开的分区(例如乳液的水相)中提供连接酶和其他试剂。包含连接酶的分区例如乳液的水相可与包含多核苷酸的分区例如乳液的水相合并。

连接反应可在大约、高于约、低于约或至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99℃的温度下发生。连接可在约4℃至约16℃、约16℃至约25℃、约25℃至约30℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约37℃至约50℃或约50℃至约65℃发生。

连接反应可以进行大约、长于约、短于约或至少约5min、15min、30min、45min或60min的一段时间。连接反应可以进行大约、长于约、短于约或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48hr的一段时间。连接反应可持续约5min至约15min、约5min至约30min、约5min至约45min、约5min至约60min、约30min至约60min、约30min至约90min、约30min至约120min、约1hr至约2hr、约1hr至约6hr、约1hr至约12hr、约12hr至约24hr或约12hr至约48hr。

可使用基于转座子的方法，如由NEXTERA^TM提供的方法，其中将DNA断裂并可在单步反应中连接衔接头(参见例如，http://www.epibio.com/newsletter/16-3_4-6.pdf)。TRANSPOSOME^TM复合物可包含游离转座子末端和转座酶。TRANSPOSOME^TM复合物可与靶双链DNA一起温育，并且可以断裂靶标。转座子末端寡核苷酸的转移链可共价连接至靶片段的5’末端。转座子整合和链转移可通过靶多核苷酸内的交错的dsDNA断裂而发生。得到的片段可具有单链缺口。可改变TRANSPOSOME^TM复合物的浓度来控制断裂的和标记的DNA文库的大小分布。转座子末端可包含条码。衔接头连接后可紧接着进行连接产物的PCR扩增以增加其浓度。

NEXTERA^TM技术可用于产生双标记的文库。这些文库可任选地条码化。这些文库可与例如Roche/454或

/

测序平台相兼容。为了产生平台特异性文库，可使用游离转座子末端或附加的转座子末端。可通过例如PCR引入平台特异性标签和任选的条码。扩增可通过例如乳液PCR(emPCR)或桥式PCR(bPCR)发生。

在一些实施方案中，将衔接头连接至多核苷酸的方法为在美国专利5,789,206或Arneson等人.(2008)Whole-Genome Amplificationby Adaptor-Ligation PCR of Randomly Sheared Genomic DNA(PRSG)Cold Spring Harbor Protocols中所述的那些方法。

可产生的多核苷酸片段的大小可为大约、多于约、至少约或少于约10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000或10,000,000个碱基或碱基对。在一些实施方案中，断裂的多核苷酸的大小为约50至约100、约50至约150、约50至约200、约100至约150、约100至约200、约100至约300、约150至约200、约150至约250、约200至约300、约200至约400、约300至约400、约300至约500、约400至约500、约400至约600、约500至约600、约500至约700、约600至约700、约600至约800、约700至约800、约700至约900、约800至约1000、约50至约500、约100至约500、约100至约1000、约50至约1500、约50至约2000、约1000至约2000或约1500至约2000个碱基或碱基对。在一些实施方案中，断裂的多核苷酸的大小为约1000至约5000、约1000至约10,000、约10,000至约20,000、约10,000至约50,000、约10,000至约100,000、约50,000至约100,000、约100,000至约200,000、约100,000至约500,000、约100,000至约1,000,000、约200,000至约1,000,000、约300,000至约1,000,000、约400,000至约1,000,000、约500,000至约1,000,000或约750,000至约1,000,000个碱基或碱基对。

扩增

多核苷酸可在进行分区前进行扩增。在一些实施方案中，多核苷酸在分区(例如，乳液的水相，例如，小滴)中进行扩增。在一些实施方案中，多核苷酸在于分区中断裂前进行扩增。在一些实施方案中，多核苷酸在于分区中断裂之后进行扩增。在一些实施方案中，多核苷酸在于分区中断裂之前和之后进行扩增。在一些实施方案中，在分区中将衔接头连接至多核苷酸之前在分区中扩增多核苷酸。在一些实施方案中，在分区中将衔接头连接至多核苷酸之后在分区中扩增多核苷酸。在一些实施方案中，在将衔接头连接至多核苷酸并汇集来自不同分区的多核苷酸之后扩增多核苷酸。

在一些实施方案中，扩增包括聚合酶链式反应(PCR)、数字PCR、逆转录PCR、定量PCR、实时PCR、等温扩增、线性扩增或等温线性扩增、定量荧光PCR(QF-PCR)、多重荧光PCR(MF-PCR)、单细胞PCR、限制性片段长度多态性PCR(PCR-RFLP)、PCR-RFLP/RT-PCR-RFLP、热启动PCR、巢式PCR、原位聚合酶群落(polony)PCR、原位滚环扩增(RCA)、桥式PCR(bPCR)、picotiterPCR、数字PCR、小滴数字PCR或乳液PCR(emPCR)。其他合适的扩增方法包括连接酶链式反应(LCR(寡核苷酸连接酶扩增(OLA))、转录扩增、循环探针技术(CPT)、分子倒置探针(MIP)PCR、自动维持序列复制、靶多核苷酸序列的选择性扩增、共有序列引物聚合酶链式反应(CP-PCR)、任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、多重置换扩增(MDA)、链置换扩增(SDA)和基于核酸的序列扩增(NABSA)。本文可使用的其他扩增方法包括在美国专利5,242,794、5,494,810、4,988,617和6,582,938中描述的那些方法。

在一些实施方案中，多重置换扩增(MDA)步骤可在多核苷酸的断裂和衔接头的连接之前在分区(例如，小滴)内进行，以扩增每个小滴中的DNA的量，从而覆盖更多捕获的多核苷酸。MDA可以是非基于PCR的扩增技术，该技术可涉及将多种引物(例如，六聚体引物)与多核苷酸模板退火，并引发DNA的合成(例如，使用Phi29聚合酶)。当DNA合成进行到下一合成起始位点时，聚合酶可置换新产生的DNA链并继续其链延伸。链置换可产生新合成的单链DNA模板，其他引物可与该模板退火。新合成的模板上的进一步的引物退火和链置换可导致超分支DNA网络。扩增过程中的序列脱分支可导致产物的高产率。为了分离DNA分支网络，可使用一种或多种S1核酸酶在置换位点切割片段。在得到的DNA片段上的切口可通过DNA聚合酶I来修复。产生的DNA片段可直接用于分析或将其连接起来以产生用于进一步测序分析的基因组文库。例如，在美国专利7,074,600中描述了MDA。

多核苷酸的扩增可在珠上发生。在其他实施方案中，扩增不在珠上发生。可进行热启动PCR，其中在加入聚合酶前将所述反应加热至95℃持续两分钟，或者可以在循环1中的第一加热步骤之前保持聚合酶无活性。可使用热启动PCR使非特异性扩增最小化。适合用于本文所述方法中的扩增的其他策略和方面在2010年7月8日公布的公开号为2010/0173394A1的美国专利申请中有所描述，其通过引用并入本文。

可使用任何数目的PCR循环来扩增DNA，例如，大约、多于约、至少约或少于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45次循环。扩增循环数可为约1至约45、约10至约45、约20至约45、约30至约45、约35至约45、约10至约40、约10至约30、约10至约25、约10至约20、约10至约15、约20至约35、约25至约35、约30至约35或约35至约40。

可对小滴中包含的样品进行热循环反应。小滴可在热循环过程中保持完整。小滴可在热循环过程中以大于约10,000小滴/mL、100,000小滴/mL、200,000小滴/mL、300,000小滴/mL、400,000小滴/mL、500,000小滴/mL、600,000小滴/mL、700,000小滴/mL、800,000小滴/mL、900,000小滴/mL或1,000,000小滴/mL的密度保持完整。小滴可在热循环过程中以大于约10,000小滴/mL至约100,000小滴/mL、10,000小滴/mL至约1,000,000小滴/mL或约100,000小滴/mL至约1,000,000小滴/mL的密度保持完整。在其他情况下，两个或更多个小滴可在热循环过程中合并。在其他情况下，多于100或多于1,000个小滴可在热循环过程中合并。

多核苷酸

本文所述的方法可用于操作和分析多核苷酸。术语多核苷酸或语法等同物可指共价连接在一起的至少两个核苷酸。本文所述的核酸可含有磷酸二酯键，尽管在如本文所概述的一些情况中(例如在引物和探针如标记探针的构建中)，包括可能具有替代骨架的核酸类似物，该骨架包含，例如，磷酰胺(参见例如，Beaucage等人，Tetrahedron49(10):1925(1993)和其中的参考文献；Letsinger,J.Org.Chem.35:3800(1970)；Sprinzl等人,Eur.J.Biochem.81:579(1977)；Letsinger等人,Nucl.Acids Res.14:3487(1986)；Sawai等人,Chem.Lett.805(1984)，Letsinger等人,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；和Pauwels等人,Chemica Scripta26:14191986))、硫代磷酸酯(Mag等人，NucleicAcids Res.19:1437(1991)；和美国专利5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等人，J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989)、O-甲基亚磷酰胺连接(参见例如，Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Oxford University Press)和肽核酸(此处又称“PNA”)骨架和连接(参见例如，Egholm,J.Am.Chem.Soc.114:1895(1992)；Meier等人,Chem.Int.Ed.Engl.31:1008(1992)；Nielsen,Nature,365:566(1993)；Carlsson等人,Nature380:207(1996)，均通过引用并入)。其他核酸类似物包括具有双环结构的那些核酸类似物，包括锁定核酸(LNA为一类核酸类似物，其中通过连接2’-O原子和4’-C原子的亚甲基桥锁定核糖环)，本文也称作“LNA”(参见例如，Koshkin等人,J.Am.Chem.Soc.120.132523(1998))；正骨架(positive backbones)(Denpcy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6097(1995)；非离子骨架(参见例如，美国专利5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863；Kiedrowshi等人，Angew.Chem.Intl.Ed.English30:423(1991)；Letsinger等人，J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；Letsinger等人，Nucleoside &Nucleotide13:1597(1994)；ASC Symposium Series580，第2章和第3章，“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”，Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编；Mesmaeker等人，Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4:395(1994)；Jeffs等人,J.Biomolecular NMR34:17(1994)；Tetrahedron Lett.37:743(1996))和无核糖骨架，包括美国专利5,235,033和5,034,506以及ASC Symposium Series580，第6章和第7章，“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”,Ed.Y.S.Sanghui和P.Dan Cook中描述的那些骨架。包含一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内(参见例如，Jenkins等人,Chem.Soc.Rev.(1995)169-176页)。在Rawls，C & E News,1997年6月2日，第35页中描述了几种核酸类似物。所有这些参考文献均通过引用特定地并入本文。可对核糖-磷酸骨架进行这些修饰以增加这类分子在生理环境下的稳定性和半衰期。例如，PNA：DNA和LNA-DNA杂合体可显示出更高的稳定性，并因此可以在一些实施方案中使用。如所说明的，靶核酸可以是单链的或双链的，或者同时含有双链或单链序列的部分。取决于应用，核酸可以是DNA(包括，例如，基因组DNA、线粒体DNA和cDNA)、RNA(包括，例如mRNA和rRNA)或杂合体，其中核酸可包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任意组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤(xathanine)、次黄嘌呤(hypoxathanine)、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等在内的碱基的任意组合。

本文提供的方法、组合物和试剂盒可用于分析多核苷酸(例如，DNA、RNA、线粒体DNA、基因组DNA、mRNA、siRNA、miRNA、cRNA、单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA、tRNA、rRNA、cDNA等)。所述方法、组合物和试剂盒可用来评估与第二多核苷酸的量相比的第一多核苷酸的量。所述方法可用来分析溶液中的合成质粒的量；检测从受试者或环境中获得的样品中的致病生物(例如，微生物、细菌、病毒、寄生虫、逆转录病毒、慢病毒、HIV-1、HIV-2、流感病毒等)。所述方法也可用于在较大的多核苷酸群体中存在罕见的多核苷酸群体的其他应用中。可通过克隆，例如，克隆至质粒、酵母或细菌人工染色体中而获得多核苷酸。可通过分离的mRNA的逆转录来获得多核苷酸。

在一些实施方案中，分析基因组DNA。在一些实施方案中，基因组DNA来自于哺乳动物，例如，人。基因组DNA可从正常体细胞组织、生殖组织或患病组织(例如，肿瘤组织)中获得。在一些实施方案中，使用大约、大于约、至少约或小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个基因组当量。基因组当量可以是基因组单拷贝中DNA的量(例如，一个二倍体细胞具有2个基因组当量的DNA)。在一些实施方案中，使用约1至约10、约1至约15、约1至约20、约1至约25、约1至约30、约1至约35、约1至约40、约1至约45、约1至约50、约1至约55、约1至约60、约5至约10、约5至约15、约5至约20、约5至约25、约5至约30、约5至约35、约5至约40、约5至约45、约5至约50、约5至约55、约5至约60、约10至约20、约10至约30、约10至约40、约10至约50或约10至约50个基因组当量。在一些实施方案中，使用大约、大于约、至少约或小于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000或10,000,000个基因组当量。在一些实施方案中，使用约100至约1000、约100至约10,000、约100至约100,000、约100至约1,000,000、约100至约10,000,000、约1000至约10,000、约1000至约100,000、约1000至约1,000,000、约1000至约10,000,000、约10,000至约100,000、约10,000至约1,000,000、约10,000至约10,000,000、约100,000至约1,000,000、约100,000至约10,000,000或约1,000,000至约10,000,000个基因组当量。

在一些实施方案中，保护多核苷酸免受剪切。可保护多核苷酸免受剪切的添加剂包括，例如，亚精胺、精胺、聚(N-乙烯吡咯烷酮)40(PVP40)或Co(NH₃)₆Cl₃。在一些实施方案中，例如，当多核苷酸从一个容器转移至另一个容器时，使用大孔移液管以避免多核苷酸的剪切。用于保护多核苷酸免受剪切的方法和组合物例如在Kovacic等人.(1995)Nucleic Acids Research23:3999-4000以及Gurrieri S和Bustamante C.(1997)Biochem J.326:131-138中有所描述。

本文所述的可进行分区(例如，在小滴中)的多核苷酸或多核苷酸片段的长度可为大约、多于约、至少约或少于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000、10,000,000、20,000,000、30,000,000、40,000,000、50,000,000、60,000,000、70,000,000、80,000,000、90,000,000、100,000,000、110,000,000、120,000,000、130,000,000、140,000,000、150,000,000、160,000,000、170,000,000、180,000,000、190,000,000、200,000,000、210,000,000、220,000,000、230,000,000、240,000,000或250,000,000个核苷酸或碱基对。

可将个体染色体分成个体分区。可以如本文所述进行分区的人染色体可包括染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X或Y。

在一些实施方案中，使用温和处理步骤来从样品中获得大的多核苷酸。温和处理步骤可包括，例如，低速离心，使用蛋白酶K和/或RNase消化释放基因组DNA，或透析。在一些实施方案中，不进行诸如涡旋、高速离心或乙醇沉淀等步骤。

新一代测序

本文所述的方法、组合物和试剂盒可与新一代测序平台一起使用。例如，可将具有条码的衔接头与多核苷酸连接，可汇集具有不同条码的多核苷酸的不同样品，汇集的多核苷酸可使用新一代测序进行测序，并且可使用条码来确定哪些序列读取值产生自相同分区(例如，小滴)中的多核苷酸。

在一些实施方案中，新一代测序技术为454测序(Roche)(参见例如，Margulies,M等人.(2005)Nature437:376-380)。454测序可包括两个步骤。在第一步中，可将DNA剪切为大约300-800个碱基对的片段，并且该片段可以是平端的。而后可将寡核苷酸衔接头连接至片段的末端。衔接头可作为扩增引物杂交以及片段测序的位点。可使用例如可含有5'抗生素标签的衔接头B将片段连接至DNA捕获珠，例如，涂覆有链霉亲和素的珠。可通过杂交将片段连接至DNA捕获珠上。每个珠可捕获单一片段。连接至珠上的片段可在油-水乳液的小滴内进行PCR扩增。结果可能为每个珠上克隆扩增的DNA片段的多个拷贝。乳液可被破坏，而扩增的片段仍保持结合于其特定珠上。在第二步中，可在孔中捕获珠(皮升大小；PicoTiterPlate(PTP)装置)。表面可以设计为使得每个孔仅适合一个珠。可将PTP装置加载至用于测序的仪器中。可以平行地对每个DNA片段进行焦磷酸测序。加入一种或多种核苷酸可以产生可由测序仪器中的CCD相机记录的光信号。信号强度可与掺入的核苷酸的数目成正比。焦磷酸测序可以利用可在核苷酸加入时释放的焦磷酸盐(PPi)。PPi可在腺苷5'磷酰硫酸的存在下被ATP硫酸化酶转化为ATP。萤光素酶可利用ATP将萤光素转化为氧化萤光素，并且该反应可产生被检测和分析的光。

在一些实施方案中，新一代测序技术为SOLiD技术(AppliedBiosystems;Life Technologies)。在SOLiD测序中，可将基因组DNA剪切为片段，并且可将衔接头连接至该片段的5'和3'端以产生片段文库。或者，可通过将衔接头连接至片段的5'和3'端、环化该片段、消化被环化的片段以产生内部衔接头，并将衔接头连接至得到的片段的5'和3'端以产生配对的文库，来引入内部衔接头。接着，可在含有珠、引物、模板和PCR组件的微反应器中制备克隆珠群体。PCR后，可使模板变性并且可富集珠以分离具有延伸模板的珠。选定的珠上的模板可经过允许其结合至载玻片上的3'修饰。测序引物可与衔接头序列结合。一组四种荧光标记的二碱基探针可竞争与测序引物的连接。可通过探询每个连接反应中的每个第一和第二碱基来获得二碱基探针的特异性。模板的序列可通过部分随机寡核苷酸与可由特定荧光团鉴别的确定碱基(或碱基对)的连续杂交和连接来确定。记录颜色之后，可切割并去除连接的寡核苷酸，而后可重复该过程。在一系列连接循环之后，可去除延伸产物，并且可利用与n-1位置互补的引物重置模板以供第二轮连接循环。对于每个序列标签，可完成五轮引物重置。通过引物重置过程，可在两个独立的连接反应中通过两种不同的引物探询大多数碱基。通过使用多碱基编码方案用额外的引物进行测序，可获得最高达99.99%的准确度。

在一些实施方案中，新一代测序技术为SOLEXA测序(Illumina测序)。SOLEXA测序可基于在固体表面上使用折回PCR和锚定引物对DNA的扩增。SOLEXA测序可包括文库制备步骤。可将基因组DNA断裂，并且可修复并腺苷酸化所剪切的末端。可将衔接头加至片段的5'和3'端。可对片段进行大小选择并纯化。SOLEXA测序可包括簇生成步骤。DNA片段可通过与附接在流动池通道表面上的一丛(a lawnof)寡核苷酸杂交而附接至流动池通道的表面上。可延伸该片段并通过桥式扩增进行克隆扩增以产生独特的簇。片段变为双链，并且可以使该双链分子变性。固相扩增的多次循环后进行变性可在流动池的每个通道中产生相同模板的单链DNA分子的大约1,000个拷贝的数百万个簇。可切割反向链并将其洗掉。可锁定末端，并且引物可与DNA模板杂交。SOLEXA测序可包含测序步骤。可同时对数以亿计的簇进行测序。引物、DNA聚合酶和四种荧光团标记的可逆终止核苷酸可用于进行连续测序。所有四种碱基可彼此竞争模板。核苷酸掺入之后，使用激光激发荧光团，并且捕获图像并记录第一碱基的身份。去除每个掺入的碱基的3'终止子和荧光团，并重复引入、检测和鉴定步骤。每个循环可读取单一碱基。

在一些实施方案中，新一代测序技术包含Pacific Biosciences的实时(SMRT^TM)技术。在SMRT中，四种DNA碱基中的每一种均可连接至四种不同荧光染料中的一种上。这些染料可以是磷酸连接的。单一DNA聚合酶可用零模式波导(ZMW)底部的模板单链DNA的单分子进行固定化。ZMW可以是一种限制结构，它使得能够相对于可在ZMW内外(以微秒)迅速扩散的荧光核苷酸的背景，观察由DNA聚合酶引起的单核苷酸的掺入。核苷酸掺入增长中的链中可能需要数毫秒。在这段时间内，荧光标记物可被激发并产生荧光信号，并且可切去荧光标签。ZMW可被从下向上照射。来自激发光束的衰减光可穿透每个ZMW的下部20-30nm。可建立检测限为20仄升(10^-21升)的显微镜。微小检测体积可提供背景噪音降低的1000倍改善。染料的相应荧光的检测可指示掺入了哪种碱基。可重复该过程。

在一些实施方案中，新一代测序为纳米孔测序(参见例如，SoniGV和Meller A.(2007)Clin Chem53:1996-2001)。纳米孔可以是大约1纳米直径的小洞。纳米孔在传导流体中的浸渍和穿过它的电势的施加，由于穿过纳米孔的离子的传导，可产生轻微电流。流动的电流的量对于纳米孔的大小可能是敏感的。当DNA分子穿过纳米孔时，DNA分子上的每个核苷酸均可不同程度地阻塞纳米孔。因此，随着DNA分子通过纳米孔，通过纳米孔的电流的变化可代表DNA序列的读取。纳米孔测序技术可来自Oxford Nanopore Technologies；例如，GridION系统。单一纳米孔可插入覆盖微孔上部的聚合物膜中。每个微孔可具有用于单个传感的电极。微孔可制造为阵列芯片，每个芯片具有100,000个或更多的微孔。可使用仪器(或节点)分析该芯片。可实时地对数据进行分析。一次可运行一个或多个仪器。纳米孔可以是蛋白质纳米孔，例如，蛋白质α溶血素，一种七聚体蛋白质孔。纳米孔可以是制备的固态纳米孔，例如，在合成膜(例如，SiNx或SiO₂)中形成的纳米大小的洞。纳米孔可以是杂合孔(例如，蛋白质孔整合至固态膜中)。纳米孔可以是具有集成传感器的纳米孔(例如，隧道电极检测器、电容检测器或基于石墨烯的纳米间隙或边缘状态检测器(参见例如，Garaj等人.(2010)Nature vol.67,doi:10.1038/nature09379))。可将纳米孔功能化以用于分析特定类型的分子(例如，DNA、RNA或蛋白质)。纳米孔测序可包含“链测序”，其中完整的DNA聚合物可穿过蛋白质纳米孔，当DNA在孔中移位时进行实时测序。酶可分离双链DNA的链并将链穿过纳米孔进行供应。DNA在一端可具有发夹结构，并且系统可读取两条链。在一些实施方案中，纳米孔测序为“外切核酸酶测序”，其中可用进行性外切核酸酶从DNA链上切割单个核苷酸，并且该核苷酸可穿过蛋白质纳米孔。核苷酸可短暂地结合至孔中的分子(例如，环糊精)上。电流的特征性破坏可用于鉴定碱基。可使用来自GENIA或NABsys的纳米孔测序技术。在GENIA的技术中，工程化的蛋白质孔可嵌入脂双层膜中，并且“主动控制(Active Control)”技术可实现高效纳米孔-膜组装和对DNA移动通过通道的控制。

在一些实施方案中，新一代测序包含离子半导体测序(例如，使用来自Life Technologies(Ion Torrent)的技术)。离子半导体测序可利用以下事实：当核苷酸掺入DNA链中时，可释放出离子。为了进行离子半导体测序，可形成微加工孔的高密度阵列。每个孔可容纳单一DNA模板。在孔的下方可以是离子敏感层，并且在离子敏感层下方可以是离子传感器。当向DNA中加入核苷酸时，释放出H+，其可作为pH的变化进行测量。H+离子可转化为电压并用半导体传感器进行记录。阵列芯片可用一种接一种的核苷酸连续充满。可能不需要扫描、光或相机。

在一些实施方案中，新一代测序为DNA纳米球测序(例如Complete Genomics所进行的；参见例如，Drmanac等人.(2010)Science327:78-81)。可分离、断裂并大小选择DNA。例如，DNA可断裂(例如，通过超声处理)至约500bp的平均长度。衔接头(Ad1)可连接至片段的末端。衔接头可用于与锚杂交以用于测序反应。可对具有结合至每一末端的衔接头的DNA进行PCR扩增。可修饰衔接头序列以使得互补的单链末端彼此结合形成环状DNA。可对DNA进行甲基化以保护其免受在后续步骤中使用的IIS型限制酶的切割。衔接头(例如，右侧衔接头)可具有限制识别位点，并且限制识别位点可保持非甲基化。衔接头中的非甲基化的限制识别位点可被限制酶(例如，AcuI)识别，并且DNA可被AcuI在距右侧衔接头右侧13bp处切割以形成线性双链DNA。第二轮的右侧和左侧衔接头(Ad2)可连接至线性DNA的任一端上，并且可对结合有两个衔接头的所有DNA进行PCR扩增(例如，通过PCR)。可修饰Ad2序列以允许它们彼此结合并形成环状DNA。可将DNA甲基化，但是左侧Ad1衔接头上的限制酶识别位点可保持非甲基化。可应用限制酶(例如，AcuI)，并且可距Ad1左侧13bp切割DNA以形成线性DNA片段。第三轮右侧和左侧衔接头(Ad3)可连接至线性DNA的右翼和左翼，并且可对得到的片段进行PCR扩增。可修饰衔接头以使它们能够彼此结合并形成环状DNA。可加入III型限制酶(例如，EcoP15)；EcoP15可距Ad3左侧26bp和距Ad2右侧26bp切割DNA。这种切割可去除DNA的大区段并再一次使得DNA线性化。第四轮右侧和左侧衔接头(Ad4)可连接至DNA，可扩增DNA(例如，通过PCR)，并对其进行修饰以使得它们彼此结合并形成完全环状的DNA模板。可使用滚环复制(例如，使用Phi29DNA聚合酶)来扩增DNA的小片段。四衔接头序列可含有回文序列，该回文序列可杂交并且单链可自身折叠形成平均直径可大约为200-300纳米的DNA纳米球(DNB^TM)。DNA纳米球可附着(例如，通过吸附)至微阵列(测序流动池)。流动池可以是涂覆有二氧化硅、钛和六甲基二硅氮烷(HMDS)以及光阻材料的硅晶片。可通过将荧光探针连接至DNA，通过非链式测序(unchained sequencing)来进行测序。被探询位置的荧光的颜色可通过高分辨率相机进行可视化。可确定衔接头序列之间的核苷酸序列的身份。

在一些实施方案中，新一代测序技术为Helicos真单分子测序(tSMS)(参见例如，Harris T.D.等人.(2008)Science320:106-109)。在tSMS技术中，可将DNA样品切割成大约100-200个核苷酸的链，并且可向每个DNA链的3'端添加polyA序列。可通过添加荧光标记的腺苷核苷酸来标记每个链。DNA链然后可与流动池杂交，流动池可含有数百万个固定至该流动池表面的oligo-T捕获位点。模板可以为约100百万个模板/cm²的密度。而后可将流动池加载至仪器，例如，HELISCOPE^TM测序仪上，并且激光可照射流动池的表面，揭示出每个模板的位置。CCD相机可定位(map)模板在流动池表面上的位置。然后可切割模板荧光标记物并将其洗掉。可通过引入DNA聚合酶和荧光标记的核苷酸开始测序反应。oligo-T核酸可作为引物。DNA聚合酶能够以模板指导的方式向引物中引入标记的核苷酸。可以去除DNA聚合酶和未掺入的核苷酸。指导荧光标记的核苷酸掺入的模板可以通过对流动池表面进行成像来检测。成像后，切割步骤可去除荧光标记物，并且可用其他荧光标记的核苷酸重复该过程直至达到期望的读取长度。可收集每个核苷酸添加步骤的序列信息。测序可以是非同步的。测序可包括每天或每小时至少十亿个碱基。

在一些实施方案中，测序技术可包含配对末端(paired-end)测序，其中可对正向和反向模板链进行测序。在一些实施方案中，测序技术可包含配对(mate pair)文库测序。在配对文库测序中，DNA可以是片段，并且可对2-5kb片段进行末端修复(例如，利用生物素标记的dNTPs)。DNA片段可以是环化的，并且可通过消化去除非环化的DNA。可使环状DNA断裂并对其进行纯化(例如，使用生物素标记物)。可对纯化的片段进行末端修复并将其连接至测序衔接头。

在一些实施方案中，序列读取值为大约、大于约、小于约或至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000个碱基。在一些实施方案中，序列读取值为约10至约50个碱基、约10至约100个碱基、约10至约200个碱基、约10至约300个碱基、约10至约400个碱基、约10至约500个碱基、约10至约600个碱基、约10至约700个碱基、约10至约800个碱基、约10至约900个碱基、约10至约1000个碱基、约10至约1500个碱基、约10至约2000个碱基、约50至约100个碱基、约50至约150个碱基、约50至约200个碱基、约50至约500个碱基、约50至约1000个碱基、约100至约200个碱基、约100至约300个碱基、约100至约400个碱基、约100至约500个碱基、约100至约600个碱基、约100至约700个碱基、约100至约800个碱基、约100至约900个碱基或约100至约1000个碱基。

在一些实施方案中，测序深度为大约、大于约、至少约或小于约1X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、11X、12X、13X、14X、15X、16X、17X、18X、19X、20X、21X、22X、23X、24X、25X、26X、27X、28X、29X、30X、31X、32X、33X、34X、35X、36X、37X、38X、39X、40X、41X、42X、43X、44X、45X、46X、47X、48X、49X、50X、51X、52X、53X、54X、55X、56X、57X、58X、59X、60X、61X、62X、63X、64X、65X、66X、67X、68X、69X、70X、71X、72X、73X、74X、75X、76X、77X、78X、79X、80X、81X、82X、83X、84X、85X、86X、87X、88X、89X、90X、91X、92X、93X、94X、95X、96X、97X、98X、99X、100X、110X、120X、130X、140X、150X、160X、170X、180X、190X、200X、210X、220X、230X、240X、250X、260X、270X、280X、290X、300X、350X、400X、450X、500X、550X、600X、650X、700X、750X、800X、850X、900X、950X、1000X、2000X、3000X、4000X、5000X、6000X、7000X、8000X、9000X、10,000X。在一些实施方案中，测序深度为约1X至约4X、约1X至约5X、约1X至约8X、约1X至约10X、约2X至约4X、约2X至约8X、约2X至约10X、约5X至约10X、约3X至约6X、约10X至约15X、约10X至约20X、约15X至约20X、约15X至约25X、约15X至约30X、约20X至约30X、约25X至约30X、约25X至约50X、约25X至约75X、约25X至约100X、约50X至约100X、约100X至约200X、约100X至约500X、约100X至约1000X、约200X至约500X、约500X至约750X、约500X至约1000X、约750X至约1000X、约1000X至约2000X、约1000X至约5000X、约1000X至约10,000X、约2000X至约5000X或约5000X至约10,000X。测序深度可以是对序列(例如，基因组)进行测序的次数。在一些实施方案中，使用Lander/Waterman方程计算覆盖范围。一般方程可以是：C=LN/G，其中C=覆盖范围；G=单倍体基因组长度；L=读取长度；且N=读取数。

应用

长读取值、定相(phasing)和从头测序

在一些实施方案中，本文所述的方法、组合物和试剂盒可用于单元型定相。在一些实施方案中，短读取测序仪，如Illumina和ABI制造的测序仪，可能无法提供定相信息。这些测序仪可产生100-200个碱基以及短至30个碱基的读取值。454测序(Roche)可产生约400个碱基的序列读取值。在一些实施方案中，400个碱基可能太短而不能产生足够的定相信息。使用来自Pacific Biosciences的技术的测序可产生约1000个碱基的序列读取值。在一些实施方案中，1000个碱基太短而不能提供定相信息。

短序列读取值可使得对大的基因组从头测序具有挑战。短序列读取值可使得很难确定除极少一部分的多态性之外的所有其他定相信息。本文所述的分区和条码化方案可用于使用长范围组装来重新构建较长读取值并在利用现有测序方法的同时提供定相信息。

新一代测序平台可能需要文库制备步骤。可使基因组DNA断裂，任选地排大小(sized)，并连接至可为一组通用引物提供杂交位点的核酸序列(例如，衔接头)上。一组通用引物可用于大规模克隆扩增，例如，在溶液中或在固体载体上。在一些实施方案中，随后可对这些克隆进行测序，因为在严格密闭空间中大量相同序列的存在可允许放大由测序反应发出的荧光(或其他)信号。

可将标签序列附加在作为引物结合位点的区域上，以使得共有条码可连接至来自特定样品的每个序列上。可混合来自不同样品的文库并在单一运行中进行测序。由于每次读取可包含条码，所以能够确定哪个样品产生任何给定的序列读取值。该过程可被称为样品多路复用，并可允许对于许多测序应用而言每个样品更加成本有效的定价。在一些实施方案中，每个序列读取值的一部分包括条码序列。

在一些实施方案中，可将高分子量DNA样品进行分区，以使得给定的分区不可能含有来自相同基因座但来自不同染色体的两个片段。在一些实施方案中，高分子量DNA可包含多于约10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000或200,000,000个碱基或碱基对的多核苷酸。在一些实施方案中，分离多核苷酸以使得在相同分区中同时具有母本和父本多核苷酸的基因组的任何给定区域为稀有事件。在一些实施方案中，少于10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.1%、0.01%或0.001%的分区具有来自相同基因座但来自不同染色体的两个片段。在一些实施方案中，将样品分区以使得每个分区(例如，小滴)发现大约或少于约20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.1%、0.01%或0.001%的单倍体基因组。在一些实施方案中，将样品进行分区以使得每个分区(例如，小滴)发现约0.1%至约1%、约0.5%至约1%、约0.25%至约0.75%、约1%至约5%、约1%至约2%、约1%至约10%或约5%至约10%的单倍体基因组。

文库制备可以如本文所述在分区(例如，小滴)内进行。在基因组中彼此略微接近地定位并被确定为来自相同分区(例如，在相同小滴中)的序列读取值可能彼此连接并因此位于相同的染色体上。以这种方式，可将单个的短读取值串联在一起形成更长的序列片段，参见例如，实施例1。

单细胞分析

在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用于分析细胞，例如，单个细胞。例如，可将单个细胞分成独特的分区，可向每个分区中加入独特条码化的衔接头，每个分区内的多核苷酸或多核苷酸片段可通过将衔接头连接至该多核苷酸或多核苷酸片段而条码化，可以汇集来自每个分区的条码化的多核苷酸，可对汇集的多核苷酸进行测序，并且可利用条码确定序列读取值是否产生于相同或不同分区，因而是否于相同或不同细胞中。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物用于单细胞转录组测序、单细胞基因组测序或单细胞甲基化组(methylome)测序。

人体中存在大约210种不同类型的细胞。被分区的单个细胞可以是人体中的任何类型的细胞。细胞可以是，例如，分泌激素的细胞、外分泌的上皮细胞、角质化上皮细胞、湿分层屏障上皮细胞、感觉转导细胞、自主神经元细胞、感觉器官或外围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元或神经胶质细胞、晶状体细胞、代谢或贮藏细胞、肾脏细胞、细胞外基质细胞、收缩细胞、血液或免疫系统细胞、色素细胞、生殖细胞、抚育细胞或间质细胞。血液或免疫系统细胞可以是，例如，红细胞(红血细胞)、巨核细胞(血小板前体)、单核细胞、结缔组织巨噬细胞、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞、树突细胞、小胶质细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织红细胞或干细胞。

单个细胞可来自本文所述的其他类型的样品。

在一些实施方案中，单个细胞来自环境样品。在一些实施方案中，将环境样品分成多个分区。环境样品可以是，例如，空气、水、农业物质或土壤。环境样品可以，例如，来自小溪、河流、池塘、湖泊、潟湖、水流(run)、三角洲、沼泽、盐沼、湿地、红树林沼泽、贮木场、护城河、海、泻湖、盆地、河流入口、小河(beck)、激流(boil)、运河、小海湾、河口、海湾、海港、入口、海洋、湾、污水处理设施、泥沼、海峡、泉水、溪流、石沼、洼地(wash)、湿地、超级基金场地（Superfund site）、煤矿、农场、牧场、沙漠、冰川、山脉或小湖。在一些实施方案中，样品来自池(例如，游泳池)、体育馆、学校、工作场所、办公室、大厅、电梯、洗手间、医院、医务所、风井或餐厅。在一些实施方案中，环境样品可来自于表面，例如，地板、桌子、皮肤、键盘、计算机、笔记本电脑、犯罪现场证据(例如，武器，如枪支或刀具)或门把手。在一些实施方案中，样品来自生物恐怖袭击。在一些实施方案中，样品包含细菌和/或病毒。在一些实施方案中，样品包含大约、至少约、多于约或少于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000种不同的物种和/或病毒类型。在一些实施方案中，环境样品包含约10至约100、约10至约1000、约100至约1000、约100至约10,000、约1000至10,000、约10,000至约50,000或约10,000至约100,000种不同的物种和/或病毒类型。

单细胞转录组测序

一方面，可在单独的分区(例如，小滴)内捕获单细胞，并且可将单细胞裂解。在每个分区(例如，小滴)中来自单个细胞的信使RNA可用分区特异性条码化引物进行逆转录。在一些实施方案中，合适的试剂(例如，逆转录酶、核苷酸)可隔离在较大的小滴内的分区(例如，小滴)中。当希望使逆转录酶接触信使RNA时，可使内部小滴破裂(例如，通过加热)。逆转录(RT)反应后可接着进行文库制备，后者可引入独特条码。

将在单细胞转录组测序中使用的小滴和条码的数目的计算可类似于实施例1中针对分析定相所述的计算。例如，为了分析2,000个细胞，可进行充分的分区以捕获单独小滴中的每个细胞。例如，2,000个细胞可在20,000个分区(例如，小滴)之间进行分区。可采取措施以确保每个具有细胞的分区(例如，小滴)接收独特条码(例如，在衔接头上)。例如，可通过使用10,000种不同的条码来实现该目标。

在分区、裂解、条码化和测序后，可分析序列读取数据以确定哪些转录物来自于相同的细胞。以这种方式，新一代测序的大容量可应用于大的细胞集合，同时保持单细胞分辨力。

单细胞基因组测序

在一些实例中，可在单独的分区(例如，小滴)中捕获单个细胞，并且可对来自具有单细胞的分区的基因组DNA进行独特条码化(例如，使用衔接头)。可汇集来自不同分区的条码化的基因组DNA并对其进行测序，并且可利用条码确定哪些序列读取值来自于相同的细胞。在一些实施方案中，基因组DNA在分区中断裂。在一些实施方案中，在加入具有条码的衔接头之前和/或之后扩增基因组DNA。在一些实施方案中，在将衔接头连接至基因组DNA之前或之后不扩增基因组DNA。

在一些实施方案中，每个细胞的序列覆盖范围可能较浅(例如，每个基因座几个读取值)。在一些实施方案中，单细胞基因组DNA测序可用于确定拷贝数变异(CNV)。

在一些实施方案中，在断裂和衔接头连接之前，在小滴内对细胞的基因组进行MDA。在一些实施方案中，进行MDA可提供更多的来自细胞的遗传物质以供测序。在一些实施方案中，MDA可引入偏倚(bias)。在一些实施方案中，扩增可导致一些拷贝数变异(CNV)信息的丢失。在一些实施方案中，在断裂和衔接头连接之前，不在小滴内对细胞的基因组进行MDA。

单细胞甲基化组测序

在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用于分析基因组的甲基化。例如，本文所述的方法可用于单细胞甲基化组测序。在一些实施方案中，可对单个细胞进行分区，例如，分成小滴。分区可包含甲基敏感的酶(例如，内切核酸酶)。在一些实施方案中，甲基敏感的酶消化甲基化位点。每个分区可包含独特条码化的衔接头。例如，将包含甲基敏感的酶的分区(例如，小滴)与包含样品多核苷酸的分区合并。在用甲基敏感的酶进行消化之前或之后，可将衔接头连接至分区中的多核苷酸上。可汇集条码标记的多核苷酸并对该多核苷酸进行测序。可确定来自相同分区的序列读取值。序列读取值的缺乏可表明分区中多核苷酸的消化。在一些实施方案中，甲基敏感的酶不消化甲基化的DNA，而是消化未甲基化的DNA。

基因组甲基化

在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用于基因组甲基化分析。在一些实施方案中，可用亚硫酸氢盐处理多核苷酸。亚硫酸氢盐可将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。亚硫酸氢盐不能将甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。可将处理的和未处理的多核苷酸分成多个分区(例如，小滴)。多核苷酸可在分区中断裂。可向每个分区提供独特条码化的衔接头并将其连接至亚硫酸氢盐处理的多核苷酸上。可汇集标记的多核苷酸并对其进行测序以确定来自相同或不同分区的核酸的甲基化状态。

外来体测序

外来体通常为细胞器，如可含有RNA的小的细胞外囊泡。外来体可包含mRNA和/或miRNA。在一些实施方案中，将单个外来体分成单独的分区(例如，小滴)。可对外来体进行分区以使得平均每个分区包含少于约五个、四个、三个、两个或一个外来体。可利用逆转录将外来体中的RNA转化为cDNA。独特条码化的衔接头可添加至来自分区的外来体的多核苷酸上。可汇集来自分区的多核苷酸，可对汇集的多核苷酸进行测序，并且可使用条码来确定哪些序列读取值来源于相同的外来体。可分析的其他类型的细胞器可包括线粒体(例如，可分析线粒体DNA)。

宏基因组学测序

另一方面，本文所述的方法和组合物可用于宏基因组学分析。宏基因组学可以是对环境样品中的遗传物质的研究。在一些实施方案中，可将样品如环境样品中的单个病毒和/或细菌分为多个分区，可向每个分区中加入具有独特条码的衔接头，并且可对单个生物体或病毒的基因组和/或转录组进行测序。可组装具有相同条码的序列读取值以确定该生物体和/或病毒的基因组或转录组的序列。

微流体

另一方面，可设计微流体装置，该装置可将包含细胞的样品进行分区，以使得每个细胞最终在具有其自己的一组条码的独特分区(例如，区室)中。随后可单独处理每个区室的内容物以稀释并进一步分区(例如，通过乳液)，以便能够对每个细胞单独进行全基因组或转录组扩增。由于基因组或转录组的不同部分之间的竞争降低，所以全基因组扩增或其他扩增方案可受益于分区。

液块(Slugs)

另一方面，可制备液块以捕获单个细胞并向其提供其自己的条码(例如，通过连接具有独特条码的衔接头)。液块可以是完全填满流动管直径的试剂的一系列液块。这些液块可破裂成许多(例如，数千个或更多)较小的小滴，以便在小滴中进行无偏倚的全基因组/转录组扩增。在一些实施方案中，液块可破裂为大约、至少约、多于约或小于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000个小滴。在一些实施方案中，液块可破裂为约100至约500、约100至约1000、约500至约1000、约1000至约1500、约1000至约2000、约1000至约5000、约1000至约10,000或约5,000至约10,000个小滴。在一些实施方案中，全基因组扩增在小滴中比在大体积中能够更好地运行。来自所有液块的小滴可混合在一起，因为已经为它们提供了具有独特条码的衔接头。可利用测序信息确定哪些读取值来自哪个液块。

蛋白质表达和核酸信息

在另一个实施方案中，本文所述的方法可用于捕获具有特定细胞表面标志物的细胞并分析来自该细胞的多核苷酸(例如，DNA或RNA)。在一些实施方案中，可将抗体连接至涂覆有具有独特条码的短DNA片段的珠上。每种抗体可以与其自身的独特序列相关联。抗体还可连接至含有DNA片段的小滴—该小滴可在适当的时候破裂。细胞可用这些抗体预先涂覆，然后在较大的小滴中连同小滴/细胞特异性条码衔接头一起被捕获。可以如本文所述接着进行文库制备，可对小滴的内容物进行测序，并且可根据条码来推断哪些读取值来自于哪个细胞。因此，该技术除了对细胞的基因组或转录组进行测序外，还允许获得关于它们的蛋白质的信息。在一些实施方案中，可通过FACS捕获一些相同的信息。

抗体可包括多克隆和单克隆抗体，以及这些抗体的抗原结合片段。抗体或该抗体的抗原结合片段的特征可在于对多肽或其肽部分具有至少约1x10⁵M^-1的特异性结合活性。可以使用保留对多肽的特异性结合活性的抗体的Fab、F(ab')₂、Fd、Fv、单链Fv(scFv)片段等。本领域技术人员可容易地确定抗体对多肽的特异性结合活性，例如，通过比较抗体对特定多肽与对照多肽(不是该特定多肽)的结合活性。制备多克隆或单克隆抗体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1988))。

抗体可包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体，包括，例如，单链抗体、嵌合抗体、双功能抗体和人源化抗体及其抗原结合片段。这类非天然存在的抗体可使用固相肽合成来构建，可重组产生，或者例如可以如Huse等人(Science246:1275-1281(1989))所述通过筛查由可变重链和可变轻链组成的组合文库来获得。制备功能抗体的这些和其他方法是本领域技术人员熟知的(Winter和Harris,Immunol.Today14:243-246(1993)；Ward等人,Nature341:544-546(1989)；Harlow和Lane,supra,1988)；Hilyard等人,Protein Engineering:A practicalapproach(IRL Press1992)；Borrabeck,Antibody Engineering,第二版(Oxford University Press1995))。

样品

将要使用本文提供的方法、组合物和试剂盒进行分析的样品可来源于包含核酸的非细胞实体(例如，病毒)或来自于基于细胞的生物体(例如，古生菌、细菌或真核生物域的成员)。在一些情况下，样品可从医院、实验室、临床或医学实验室获得。样品可包含核酸，例如，RNA或DNA。样品可包含无细胞核酸。在一些情况下，样品从诸如门或工作台等表面的拭子获得。

样品可来自受试者，例如，植物、真菌、真细菌、古细菌、原生生物(protest)或动物。受试者可以是为单细胞或多细胞生物体的生物体。受试者可以是培养的细胞，该细胞尤其可以是原代细胞或来自已确立的细胞系的细胞。样品最初可以任何合适的形式从多细胞生物体中分离。该动物可以是鱼，例如，斑马鱼。该动物可以是鸟，例如，鸡。该动物可以是哺乳动物。该哺乳动物可以是，例如，狗、猫、马、牛、小鼠、大鼠或猪。该哺乳动物可以是灵长类动物，例如，人、黑猩猩、猩猩或大猩猩。人可以是男性或女性。样品可来自人类胚胎或人类胎儿。在一些实施方案中，人可以是婴儿、儿童、青少年、成年人或老年人。女性可以是怀孕的、可以是疑似怀孕的或计划怀孕的。在一些实施方案中，样品来自植物。在一些实施方案中，样品包含一种或多种病毒。

样品可来自于健康受试者(例如，人受试者)。在一些实施方案中，样品取自妊娠至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26周的受试者(例如，待产孕妇)。在一些实施方案中，受试者受遗传疾病的影响，是遗传疾病的携带者，或者有遗传或发展为遗传疾病的危险，其中该遗传疾病是任何可能与遗传变异如突变、插入、添加、缺失、易位、点突变、三核苷酸重复疾病和/或单核苷酸多态性(SNP)相关的疾病。

样品可以取自患有特定疾病、病症或病状的受试者，或疑似患有特定疾病、病症或病状(或处于患病危险中)的受试者。例如，样品可来自癌症患者，疑似患有癌症的患者，或者处于患癌症危险中的患者。癌症可以是，例如，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、卡波西肉瘤、肛门癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑癌、颅咽管瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤(medulloeptithelioma)、松果体实质瘤、乳腺癌、支气管瘤、伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、类癌瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、结肠癌、结直肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、原位导管癌、子宫内膜癌、食管癌、尤因肉瘤、眼癌、眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤、纤维性组织细胞瘤、胆囊癌、胃癌、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、唇癌、口腔癌、肺癌、非小细胞癌、小细胞癌、黑素瘤、口腔癌、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、髓母细胞瘤、鼻腔癌、鼻窦癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体肿瘤、浆细胞肿瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、赛泽里综合征、皮肤癌、非黑素瘤、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。样品可来自癌症患者的癌组织和/或正常组织。

样品可来自已知患有遗传疾病、病症或病状的受试者。在一些情况下，已知受试者的基因，或基因的一部分，例如CFTR、因子VIII(F8基因)、β珠蛋白、血色病、G6PD、神经纤维瘤病、GAPDH、β淀粉样蛋白或丙酮酸激酶基因为野生型或基因突变型。在一些情况下，受试者的状态为已知或未知的，并检测受试者基因如CFTR、因子VIII(F8基因)、β珠蛋白、血色病、G6PD、神经纤维瘤病、GAPDH、β淀粉样蛋白或丙酮酸激酶基因的突变或遗传变异的存在。

在其他实施方案中，样品取自生育年龄的女性患者，并且，在一些情况下，女性患者未怀孕或怀孕状态未知。在另外其他的情况下，受试者为男性患者、男性准父亲或处于特定遗传异常危险中、诊断有或患有该遗传异常的男性患者。在一些情况下，已知女性患者受遗传疾病或遗传变异的影响，或者是其携带者，或处于特定遗传异常的危险中、诊断有或患有该遗传异常。在一些情况下，女性患者有关遗传疾病或遗传变异的状态可能是未知的。在进一步的实施方案中，样品取自基因序列拷贝数变异状态已知或未知的任何儿童或成年患者。在一些情况下，已知儿童或成年患者受遗传疾病或遗传变异的影响，或者是其携带者。

样品可以是房水、玻璃体液、胆汁、全血、血清、血浆、乳汁、脑脊液、耵聍、内淋巴(enolymph)、外淋巴、胃液、粘液、腹膜液、唾液、皮脂、精液、汗水、汗液、眼泪、阴道分泌物、呕吐物、粪便或尿。样品可从医院、实验室、临床或医学实验室获得。样品可取自受试者。样品可包含核酸。核酸可以是，例如，线粒体DNA、基因组DNA、mRNA、siRNA、miRNA、cRNA、单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA、tRNA、rRNA或cDNA。样品可包含无细胞核酸。样品可为细胞系、基因组DNA、无细胞血浆、福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)样品或急骤冻结的样品。福尔马林固定石蜡包埋的样品可在提取核酸之前脱石蜡。样品可来自器官，例如，心脏、皮肤、肝脏、肺、乳腺、胃、胰腺、膀胱、结肠、胆囊、脑等。

在一些实施方案中，样品是环境样品，例如，空气、水、农业物质或土壤。

当核酸为RNA时，RNA的来源可为本文所述的任何来源。例如，RNA可以是无细胞mRNA，可以来自组织活检、中心活检、细针抽出物、急骤冻结的或福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)样品。FFPE样品可在提取RNA之前脱石蜡。提取的RNA可在分析前加热到大约、高于约、低于约或至少约30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99℃。可将提取的RNA加热到任何前述温度，持续大约或至少约15min、30min、45min、60min、1.5hr、2hr、2.5hr、3hr、3.5hr、4hr、4.5hr、5hr、5.5hr、6hr、6.5hr、7hr、7.5hr、8hr、8.5hr、9hr、9.5hr或10hr。

RNA可用于多种下游应用。例如，可利用逆转录酶将RNA转化成cDNA，且cDNA可任选地经受PCR，如实时PCR。可在等温扩增反应如等温线性扩增反应中使用RNA或cDNA。RNA、产生的cDNA或由此扩增的分子可用于微阵列实验、基因表达实验、Northern分析、Southern分析、测序反应、新一代测序反应等。可对特定RNA序列进行分析，或者可对RNA序列进行全面分析。

可通过本领域普通技术人员可利用的手段从样品中提取核酸。

可处理样品以使其能够扩增。示例性的样品处理可包括，裂解样品的细胞以释放核酸，纯化样品(例如，将核酸与可能抑制扩增的其他样品组分分离)，稀释/浓缩样品，和/或将样品与用于扩增的试剂结合，该试剂如DNA/RNA聚合酶(例如，用于PCR扩增的热稳定DNA聚合酶)、dNTPs(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP(和/或dUTP))、用于每个待扩增的等位基因序列或多态基因座的引物组、能够与每个待扩增的等位基因序列特异性杂交的探针(例如荧光探针，尤其如TAQMAN探针或分子信标探针)、Mg²⁺、DMSO、BSA、缓冲液或其任意组合。在一些实例中，样品可以与限制酶、尿嘧啶-DNA糖苷酶(UNG)、逆转录酶或核酸处理的任何其他酶结合。

计算机

可以使用计算机存储和处理数据。可利用计算机可执行逻辑行使这种根据条码序列对序列读取值进行分组的功能。计算机可用于显示、存储、检索或计算来自分子谱分析的诊断结果；显示、存储、检索或计算来自基因组或核酸表达分析的原始数据；或显示、存储、检索或计算在本文所述的方法中有用的任何样品信息或患者信息。本文提供了包含用于实施本文所述的方法的计算机可读指令的系统。本文提供了包含指令的计算机可读介质，该指令当被计算机执行时，导致计算机实施本文所述的方法。

试剂盒

本文提供了用于实施此处描述的方法的试剂盒。该试剂盒可包含一种或多种限制酶、内切核酸酶、外切核酸酶、连接酶、聚合酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶、逆转录酶、拓扑异构酶、激酶、磷酸酶、缓冲液、盐、金属离子、还原剂、BSA、精胺、亚精胺、甘油、寡核苷酸、引物、探针或标记物(例如，荧光标记物)。该试剂盒可包含一套或多套说明书。

用于找齐(align)浓度不同的靶标的动态范围并消除参照基因的 生物变异的多路复用

本文还提供了用于估计拷贝数变异(CNV)的方法。一种或多种靶序列的拷贝数变异可在许多疾病和病症中发挥作用。一种分析靶序列拷贝数变异的方法是通过数字分析，如数字PCR或小滴数字PCR。然而，如果样品中靶核酸序列的多个拷贝在同一多核苷酸上，那么靶序列拷贝数的数字分析可能会低估样品中靶核酸序列的拷贝数。例如，在具有多个区室(例如，分区，空间上分离的区域)的数字PCR试验中，可将样品中的核酸进行分区，以使每个区室平均接收约0、1、2个或数个靶多核苷酸。每个分区(例如，小滴)可平均具有少于5、4、3、2或1个靶核酸拷贝。在一些情况下，至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175或200个分区(如，小滴)具有0个靶核酸拷贝。可计算含有多核苷酸的区室的数目。然而，如果靶核酸序列的两个拷贝在单一多核苷酸上，那么可能将含有该多核苷酸的区室计数为只具有一个靶序列。

例如，在2012年2月9日提交的美国专利申请13/385,277中公开了分析CNV的方法。例如，方法可用于物理分离靶核酸序列。通常，该方法可避免由于在单一多核苷酸上存在靶序列的多个拷贝而低估靶序列的拷贝数。在一些实施方案中，获得多核苷酸的第一样品；第一样品可以是，例如，基因组DNA样品。可将第一样品中的靶核酸序列进行物理分离(例如，通过使第一样品与一种或多种限制酶接触)。可将第一样品分成多个分区。可计算具有靶序列的分区的数目。然后可估计靶序列的拷贝数。

靶核酸可以是相同的；或者，在其他情况下，靶核酸可以是不同的。在一些情况下，靶核酸位于同一基因内。在一些情况下，靶核酸各自位于基因的不同拷贝(相同或接近相同的拷贝)中。在其他情况下，靶序列位于内含子内，或者位于基因之间的区域中。有时，一个靶序列位于基因中；而第二靶序列位于该基因外。在一些情况下，靶序列位于外显子内。

样品中不同的靶标常常可以以不同的拷贝数存在。在这样的情况下，以较低拷贝数水平存在的靶标可用多种探针进行探测，每个探针识别具有靶序列的不同基因座或区域。例如，靶标A可以以拷贝数3存在，而靶标B以拷贝数1存在。在这种情况下，靶标B可用3个引物/探针对进行探测以增加B-阳性小滴的数目，或增加来自包含靶标B的小滴的信号。探针可针对靶标B内的不同区域。通常，针对靶标B的探针用相同的标记物进行标记；但是，在一些情况下，可使用不同的标记物。因此，这类方法能够找齐具有不同拷贝数的靶标的动态范围。如本文进一步描述的，靶标B可以是不同的靶标或者可以是参照样品。因此，这类方法还可实现将靶标的动态范围与具有参照样品找齐。

在一些情况下，基因组包含一个靶序列。在一些情况下，基因组包含两个或更多个靶序列。当基因组包含两个或更多个靶序列时，靶序列可以大约或大于约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%相同。

分离两个靶序列可包括通过切割核酸序列上的特定位点将靶序列进行分离。在一些情况下，分离靶核酸序列可包括使第一样品与一种或多种限制酶接触。分离靶核酸序列可包括在位于靶核酸序列之间的位点消化多核苷酸。在一些情况下，靶核酸序列各自位于基因内。在一些情况下，消化所针对的位点位于两个基因之间。在一些情况下，为消化选定的位点位于基因中；并且，在一些情况下，该基因是与含有靶序列的基因相同的基因。在其他情况下，为消化选定的位点位于与靶序列的基因不同的基因中。在一些情况下，靶序列和消化所针对的位点位于同一基因中；并且靶序列位于消化所针对的位点的上游。在其他情况下，靶序列和消化所针对的位点位于同一基因中；但是靶序列位于消化所针对的位点的下游。在一些情况下，可通过用一种或多种限制酶处理核酸样品而将靶核酸进行分离。在一些情况下，可通过剪切将靶核酸分离。在一些情况下，可通过超声处理将靶核酸分离。

分离步骤(例如，利用一种或多种限制酶进行消化)后，样品可分为多个分区。多个分区中的每一个可包含约0、1、2个或数个靶多核苷酸。在一些情况下，每个分区(例如，小滴)可平均具有少于5、4、3、2或1个靶核酸拷贝。在一些情况下，至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175或200个小滴具有0个靶核酸拷贝。

通常，在分区中扩增靶核酸。在一些情况下，扩增包括使用一种或多种TaqMan探针。

在另一实施方案中，该方法进一步包括计算包含参照核酸序列的分区数的步骤。可知参照核酸序列在每个基因组中以特定拷贝数存在，并且可用于估计样品中靶核酸序列的基因组拷贝数。估计拷贝数可包括将含有靶序列的分区数与含有参照核酸序列的分区数进行比较。在另一种情况下，CNV的估计是通过靶核酸序列与参照序列的浓度比来确定的。

在另一实施方案中，该方法进一步包括分析第二样品的步骤，其中第二样品和第一样品来源于相同的样品(例如，将核酸样品分成第一样品和第二样品)。该方法可进一步包括不使第二样品与一种或多种限制酶接触。在一些情况下，该方法进一步包括将第二样品分成多个分区。该方法可进一步包括计算含有靶序列的第二样品的分区数。在另一实施方案中，该方法进一步包括计算含有参照序列的第二样品的分区数。在另一实施方案中，该方法包括估计第二样品中靶序列的拷贝数。在另一实施方案中，估计第二样品中靶序列的拷贝数包括比较具有靶序列的第二样品的分区数和具有参照序列的第二样品的分区数。

可以将第一样品中靶序列的拷贝数与第二样品中靶序列的拷贝数进行比较，以确定是否低估了第二样品中靶序列的拷贝数。拷贝数被低估的程度可指示所探询的拷贝是否全部在一条染色体上，或者是否至少一个拷贝在一条同源染色体上，而至少一个拷贝在另一条同源染色体上。如果每个二倍体基因组的值接近1，可说明是第一种情况，而值接近2，可说明是第二种情况。

例如，在公开号为20100203538的美国专利申请中描述了另外的通过扩增来确定拷贝数差异的方法。在美国专利6,180,349和Taylor等人(2008)PLoS One3(9):e3179中描述了用于确定拷贝数变异的方法。

本文所述的拷贝数变异可包括核酸序列的减少或增加。拷贝数变异可能是遗传的或可能是由新生(de novo)突变引起的。CNV可为一个或多个不同的级别。参见，例如，Redon等人,(2006)Global variationin copy number in the human genome.Nature444pp.444-454。CNV可由简单新生缺失、简单新生重复或缺失和重复两者引起。CNV可由多等位基因变异的组合引起。CNV可以是具有新生增加的复杂CNV。CNV可包括大约或多于约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续基因。CNV可包括约1个至约10个、约1个至约5个、约1个至约4个、约1个至约3个、约1个至约2个、约0个至约10个、约0个至约5个或约0个至约2个连续基因。拷贝数变异可包括大约或大于约100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、500,000、750,000、一百万、五百万或一千万碱基对的增加或减少。在一些情况下，拷贝数变异可包括约1,000至约10,000,000、约10,000至约10,000,000、约100,000至约10,000,000、约1,000至约100,000或约1,000至约10,000个核酸序列碱基对的增加或减少。拷贝数变异可能是核酸序列的缺失、插入或重复。在某些情况下，拷贝数变异可为串联重复。

在另一实施方案中，可由通过分区样品的实时PCR或ddPCR产生的荧光信号评估CNV单元型。在实时PCR或ddPCR实验后期之前，当试剂可能变为限制性的时，具有较高靶序列拷贝数的分区可比具有较低靶序列拷贝数的分区具有更强的信号。在一个实施方案中，可将样品(例如，在连接实验中使用的样品的子样品)进行分区，并且可对分区(例如，小滴)进行PCR。由于分区经历了靶核酸序列和/或参照核酸序列的指数扩增，所以可确定分区的平均荧光强度。平均强度可对应于靶序列的起始拷贝数。如果多个靶序列沿着单一多核苷酸链进行连接，那么捕获该链的分区(如，小滴)中的强度可高于捕获仅具有单一靶序列拷贝的链的分区(例如，小滴)的强度。具有较高平均振幅的阳性小滴的过量存在可提示存在具有多个CNV拷贝的单元型。相反，仅具有低平均振幅的阳性小滴的存在可提示在样品中仅存在具有单一CNV拷贝的单元型。在另一实施方案中，可基于分区的大小和分区中的试剂量来优化用于估计CNV的循环数。例如，具有较少试剂量的较小分区比预期具有较高试剂量的较大分区可能需要更少的扩增循环。

该方法可能是有用的，因为其甚至可用于分析多核苷酸上彼此接近的，例如，相距小于约10、9、8、7、6、5、4、5、2、1、0.7、0.5、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01兆碱基的靶序列拷贝；或多核苷酸上彼此非常接近的，例如，相距小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1千碱基的靶序列拷贝。在一些情况下，该方法可用于分析多核苷酸上彼此非常接近的，例如，相距在约1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或950个碱基对以内的靶序列拷贝。在一些情况下，该方法可用于分析相隔零(0)个碱基对的靶序列拷贝。在一些情况下，该方法可用于相同、近似相同和完全不同的靶序列。

在一些实施方案中，基因组中靶标的拷贝数为大约、大于约、小于约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000个拷贝/单倍体或二倍体基因组。在一些实施方案中，靶标的拷贝数为每个单倍体或二倍体基因组约2至约5、约2至约10、约2至约20、约2至约30、约2至约40、约2至约50、约2至约100、约5至约10、约5至约25、约5至约50、约5至约100、约10至约20、约10至约50、约10至约100、约25至约50、约25至约75、约25至约100、约100至约200、约100至约500、约100至约1000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约10,000、约10,000至约20,000、约10,000至约50,000、约10,000至约100,000或约50,000至约100,000。

在一些实施方案中，可通过使用具有一种针对靶标的荧光染料和另一种针对参照物的荧光染料的探针测定单一反应中靶标和参照物的量来分析CNV。在一些实施方案中，例如，当靶标拷贝数很高时，靶标的浓度(或量)可高于参照物的浓度(或量)。在这种情况下，在单一数字反应(例如，数字PCR)中测定靶标和参照物两者可能具有挑战，因为数字PCR的动态范围可能是有限的。例如，在基因组中靶标可以以10,000个拷贝存在，但参照物可以以每个基因组仅两个拷贝存在。

在一些实施方案中，可多路复用几种不同的针对参照物的靶标，其中每一种可使用具有相同荧光染料的探针检测。(参见例如，图2)。通常，这些不同的参照物靶标代表相同参照多核苷酸(例如，基因)中的不同的区域或基因座；虽然，在一些情况下，可使用不同的参照多核苷酸(例如，基因)。多种参照物的使用可提高参照物的计数并使得它们更接近于靶标的计数。在一些实施方案中，使用大约、多于约、至少约或少于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000种不同的参照物。在一些实施方案中，使用约2至约5、约2至约10、约2至约20、约2至约30、约2至约40、约2至约50、约2至约100、约5至约10、约5至约25、约5至约50、约5至约100、约10至约20、约10至约50、约10至约100、约25至约50、约25至约75、约25至约100、约100至约200、约100至约500、约100至约1000、约500至约1000、约1000至约5000、约1000至约10,000、约10,000至约20,000、约10,000至约50,000、约10,000至约100,000或约50,000至约100,000种不同的参照物。参照物可以是本文所述的任何参照序列。通常，参照物可以以不同于靶序列的拷贝数存在。例如，靶标可具有为参照数拷贝数的大约、大于约、小于约或至少约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍、200倍、500倍、700倍的拷贝数。在其他情况下，靶标的拷贝数等于参照物的拷贝数。在另外的其他情况下，参照物具有为靶序列拷贝数的大约、大于约、小于约或至少约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、75倍或100倍的拷贝数。

在一些实施方案中，与每个参照物退火的探针可包含相同的标记物，例如，荧光染料。取决于待多路复用的靶标的数目，可使用通用探针、LNA探针或连接方法。可使用本文所述的任何类型的探针来多路复用参照物。

本文所述的方法可用于在单一反应中测定几种基因表达靶标。可设计几种试验来针对最低表达的基因并使得测量的计数更接近于较高表达的基因的计数。

如果正在通过例如将mRNA转化为cDNA来研究相同基因上两个或更多个不同靶标的表达丰度，则可进行cDNA的限制酶切消化，以便确保给定基因上的不同靶标最终在不同的分区(例如，小滴)中。本文所述的其他断裂核酸的方法可用于分离靶标。

本文所述的方法还可用于在单一反应中测定病毒载量水平。病毒载量可通过估计体液中病毒的量来测定。在一些实施方案中，病毒载量的确定可包含PCR、逆转录PCR或基于核酸序列的扩增(NASBA)(基于转录的扩增系统(TAS))。例如，可利用PCR量化整合的DNA(例如，整合至细胞的染色体内)。可利用逆转录PCR通过将病毒RNA转化为cDNA来量化病毒RNA。在一些实施方案中，利用NASBA将病毒RNA转化为DNA，并且可将DNA转录为RNA。NASBA可包括将引物与RNA模板的3’端退火，逆转录RNA模板，用RNAse H降解RNA模板，将引物与DNA链的5’端退火，以及使用T7RNA聚合酶产生互补的RNA链。互补的RNA链可在反应循环中重复使用。在一些实施方案中，使用多种参照物，以使得样品中病毒核酸和参照核酸的量在用来测定病毒载量的方法的动态范围以内。在一些实施方案中，用于检测不同参照物的探针使用相同的标记物。在一些实施方案中，用于检测参照物的探针包含不同的标记物。

在一些实施方案中，多路复用对于使生物变异正常化也可能是有用的，其中参照物的拷贝数在个体之间不同。通过在多个靶标和/或参照序列中进行平均，可减少变异的影响。该方法可用于例如诊断试验，包括用于测定拷贝数改变的那些试验。

在一些实施方案中，可使用以每个二倍体基因组两个拷贝存在的参照序列，例如，管家基因(例如，维持基本的细胞功能所需的基因)。将靶标的浓度或量除以参照物的浓度或量可以得到每个基因组的靶标拷贝数的估计值。

在本文所述的方法中可用作参照物的管家基因可包括编码以下物质的基因：转录因子、转录阻抑物、RNA剪接基因、翻译因子、tRNA合成酶、RNA结合蛋白质、核糖体蛋白质、RNA聚合酶、蛋白质加工蛋白质、热激蛋白质、组蛋白、细胞周期调节物、细胞凋亡调节剂、癌基因、DNA修复/复制基因、碳水化合物代谢调节物、三羧酸循环调节物、脂类代谢调节物、氨基酸代谢调节物、核苷酸合成调节物、NADH脱氢酶、细胞色素c氧化酶、ATP酶、线粒体蛋白质、溶酶体蛋白质、变幻虫蛋白质、核糖核酸酶、氧化酶/还原酶、细胞骨架蛋白质、细胞粘着蛋白、通道或转运蛋白、受体、激酶、生长因子、组织坏死因子等。可在所述方法中使用的管家基因的具体实例包括，例如，HSP90、β-肌动蛋白、tRNA、rRNA、ATF4、RPP30和RPL3。

可使用单拷贝参照核酸(例如，基因)来确定拷贝数变异。可使用多拷贝参照核酸(例如，基因)来确定拷贝数以扩大动态范围。例如，多拷贝参照基因在基因组中可包含大约或多于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000个拷贝。

范围在本文中可以表示为从“大约”一个特定值，和/或到“大约”另一个特定值。当表示这种范围时，另一实施方案包括从一个特定值和/或到另一特定值。同样，当通过使用先行词“约”将数值表示为近似值时，将理解成该特定值形成了另一实施方案。应当进一步理解，每个范围的端点关于另一端点以及独立于另一端点都是有意义的。本文所用的术语“约”是指在特定使用环境内规定数值±15%的范围。例如，约10包括从8.5到11.5的范围。

实施例

实施例1：

可以在100X的深度对一千基因组当量(约6ng DNA)进行测序。对于1000基因组当量，每个(正常拷贝数)靶标可以有2,000个拷贝。可采取措施以使得对于每个基因座，大多数片段最终在单独的分区中。还可以采取措施以确保用独特条码标记2,000个片段中的大多数片段。

可通过增加分区的数目来实现第一个目标。例如，采用100,000个分区，预期来自不同染色体的特定基因座处的片段中仅有约0.5%最终在相同的分区中。应注意，根据来自具有相同条码的杂合SNP的不同等位基因的出现以及根据增加的条码对基因座的覆盖范围将很容易地确定许多这样的情况。

为了确保大多数片段用不同的条码标记，可使用大量不同的条码，并且可以使用分配条码以使得任何给定分区提供有少数(优选一个)含有条码的小滴的方法。这种分配可以是随机的，以使得一些分区接收零个条码、一些分区接收一个条码、一些分区接收多个条码。因此，对于100,000个分区，可提供100,000个条码化小滴。在这种情况下，预计37%的分区将不接收衔接头并将因此不可用于测序。如果以样品保存为目标，则可增加条码化小滴的数目。37%的分区可用单一条码进行条码化，并且多达25%可用潜在不同的条码进行编码。在上述情况下，740个片段将不可用于测序，740个片段将利用其自己的条码隔离，而500个片段将利用多个条码隔离。理想地，分区中与特定片段相关的所有740*1+360*2+…=2,000个条码均将是独特的。如果存在10,000种不同的条码类型，则80%以上的片段将是独特标记的。

如果基因组当量数较低，则可使用较少的分区和条码。

应注意，对于该应用而言不需要太完美，因为仅能捕获来自任何给定的基因组位置的一小亚组SNP，从而获得定相信息。如果大部分片段是无信息的也是可以接受的。

如果以受控方式向每个分区提供条码，则可以获得更高的样品处理效率。例如，可使用来自RAINDANCE^TM(RAINSTORM^TM)的小滴合并技术来合并含有样品的分区和含有条码的分区。小滴合并可使用与FLUIDIGM的阵列设计相似的微流体电路来进行。如果可以保证给定分区恰好接收一个ADF，则可使用更少的ADF和更少的ADF类型。

微流体芯片可以以类似的方式用于分区。可通过如上所述的通道的二维排列向样品分区提供其自己的条码。可通过结合垂直和水平条码很容易地提供大量独特条码。

虽然本文已经显示和描述了本文所述的方法、组合物、系统和试剂盒的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅通过举例的方式提供。在不偏离本文所述的方法、组合物、系统和试剂盒的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多更改、改变和替换。应当理解，在实施本文所述的方法、组合物、系统和试剂盒的过程中可采用该方法、组合物、系统和试剂盒的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定这些权利要求的范围内的方法、组合物、系统和试剂盒的范围，从而涵盖其等效方案。

Claims (45)

1.一种方法，包括：

a.将多个衔接头细分为多个第一分区，其中每个所述第一分区平均具有第一体积，并且其中所述衔接头包含独特条码；

b.将包含多种多核苷酸的样品细分为多个第二分区，其中每个所述第二分区平均具有第二体积，其中所述第二体积大于所述第一体积；

c.将至少一个所述第一分区和至少一个所述第二分区合并以形成合并的分区；和

d.用至少一个所述衔接头标记所述多种多核苷酸中的一种或其片段。

2.一种方法，包括：

a.将多个衔接头细分为多个第一分区，其中每个所述第一分区平均具有第一体积，并且其中所述衔接头包含独特条码；

b.将包含多种多核苷酸的样品细分为多个第二分区，其中每个所述第二分区平均具有第二体积，其中所述第二体积小于所述第一体积；

c.将至少一个所述第一分区和至少一个所述第二分区合并以形成合并的分区；和

d.用至少一个所述衔接头标记所述多种多核苷酸中的一种或其片段。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一分区为小滴。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述第二分区为小滴。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述小滴在不混溶的流体中。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多核苷酸为基因组DNA。

7.如权利要求4所述的方法，其中所述标记包括将包含一种所述衔接头的至少一个第一小滴与包含一种所述多核苷酸的至少一个第二小滴合并。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述第一分区为第一小滴，且所述第二分区为第二小滴；并且其中，在所述合并之前，所述至少一个第二小滴包含所述至少一个第一小滴。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述第一分区为第一小滴，且所述第二分区为第二小滴；并且其中，在所述合并之前，所述至少一个第二小滴不包含所述至少一个第一小滴。

10.如权利要求2所述的方法，其中所述第一分区为第一小滴，且所述第二分区为第二小滴；并且其中，在所述合并之前，所述至少一个第一小滴包含所述至少一个第二小滴。

11.如权利要求2所述的方法，其中所述第一分区为第一小滴，且所述第二分区为第二小滴；并且其中，在所述合并之前，所述至少一个第一小滴不包含所述至少一个第二小滴。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述第二体积为所述第一体积的所述体积的至少两倍。

13.如权利要求2所述的方法，其中所述第一体积为所述第二体积的所述体积的至少两倍。

14.如权利要求7所述的方法，进一步包括改变所述小滴的温度。

15.如权利要求7所述的方法，其中所述合并包括使用控制器以使得每个所述第一小滴与每个所述第二小滴合并。

16.如权利要求7所述的方法，其中所述合并包括随机合并包含多核苷酸的小滴和包含衔接头的小滴。

17.如权利要求1所述的方法，进一步包括汇集所述衔接头标记的多核苷酸或其片段。

18.如权利要求1所述的方法，进一步包括分析所述衔接头标记的多核苷酸或其片段。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述分析包括对所述衔接头标记的多核苷酸或其片段进行测序。

20.如权利要求1所述的方法，进一步包括确定所述衔接头标记的多核苷酸或其片段是否位于相同分区中。

21.如权利要求19所述的方法，进一步包括估计通过所述测序产生的任意两个序列读取值来自相同或不同分区的可能性。

22.如权利要求6所述的方法，其中对所述样品进行分区，以使得给定的分区不可能包含来自相同基因座但来自不同染色体的两种或更多种多核苷酸或其片段。

23.如权利要求6所述的方法，其中所述基因组DNA是高分子量DNA。

24.如权利要求1或2所述的方法，进一步包括使所述第二分区中的所述多核苷酸断裂以形成多核苷酸片段。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述多核苷酸片段通过用内切核酸酶断裂所述多核苷酸而产生。

26.如权利要求1所述的方法，其中通过将所述衔接头连接至多个所述合并的分区中的所述多核苷酸来标记所述多核苷酸。

27.如权利要求1所述的方法，其中使用转座子完成所述标记。

28.如权利要求1所述的方法，其中扩增所述标记的多核苷酸。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述扩增包括聚合酶链式反应。

30.如权利要求1所述的方法，其中在标记之前扩增所述多核苷酸。

31.如权利要求1或2所述的方法，其中每个所述第一分区平均包含少于五个衔接头。

32.如权利要求1或2所述的方法，其中每个所述第二分区平均包含所述多种多核苷酸中的少于五种。

33.如权利要求1所述的方法，其中所述样品的所述细分包括乳化或混合所述样品与所述第二分区。

34.如权利要求2所述的方法，其中所述多个衔接头的所述细分包括乳化或混合所述多个衔接头与所述第二分区。

35.如权利要求30所述的方法，其中所述扩增为多重置换扩增。

36.一种方法，包括：

a.将细胞器分成多个分区，其中每个分区平均包含少于五个细胞器，

b.裂解所述多个分区中的所述细胞外细胞器，其中所述裂解从所述细胞器中释放RNA；

c.由在具有包含条码的衔接头的所述多个分区中所述释放的RNA产生标记的cDNA，其中所述多个分区中的每个分区包含具有独特条码的衔接头。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述细胞器为细胞外细胞器。

38.如权利要求36所述的方法，其中所述细胞器为外来体。

39.如权利要求36所述的方法，其中所述产生标记的cDNA包括利用分区特异性条码化引物对所述释放的RNA的逆转录。

40.如权利要求36所述的方法，进一步包括对所述标记的cDNA进行测序。

41.如权利要求36所述的方法，进一步包括确定所述标记的cDNA是否来自相同的细胞器。

42.一种方法，包括：

a.将微生物分成多个分区，

b.从所述多个分区中的微生物获得多核苷酸；和

c.用包含条码的衔接头标记所述多个分区中的多核苷酸，其中所述多个分区中的每个分区包含具有独特条码的衔接头。

43.如权利要求42所述的方法，其中每个所述分区平均包含少于五种微生物。

44.如权利要求42所述的方法，进一步包括对所述标记的多核苷酸进行测序。

45.如权利要求42所述的方法，进一步包括确定所述标记的多核苷酸片段是否来自相同的分区。

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