CN107406839A - 稳定的rna溶液 - Google Patents

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Abstract

本文描述用于保护RNA不受水性溶液中自动催化和二价阳离子诱导的降解的方法和组合物。

Description

稳定的RNA溶液
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年3月6日提交的美国临时专利申请号62/129,625的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。
背景技术
核糖核酸(RNA)可用于多种应用，包括cDNA文库构建和通过测序的基因表达分析、数字扩增、Northern印迹、微阵列杂交或RT-PCR。这些应用各自通常需要在水性溶液相中贮存或处理RNA。然而，RNA在水性溶液中天然不稳定，因此必须谨慎操作以确保RNA样品的质量得到充分维持以供这些应用。例如，必须小心地保护RNA不被RNA酶降解。此外，RNA可通过多种酶非依赖性机制降解，包括自动催化降解。在一些情况中，RNA下游加工所需的化合物或条件可能会增加RNA降解。例如，溶液中游离或螯合的二价阳离子的存在可能会通过酶促或非酶促机制增加RNA的降解，而这类二价阳离子可能是实现所需酶催化和/或杂交反应所必需的。作为另一示例，热也可通过酶促或非酶促机制增加RNA的降解，而所述热可能是RNA分析方法的要素。
发明内容
一方面，本发明提供保护RNA在水性溶液中不被降解的方法，所述方法包括：-提供一种溶液，其包含：i.水；ii.RNA；iii.二价阳离子；和iv.含磷或含硫化合物；和-在至少25℃、37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所提供的溶液，其中，相较于包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA，前述RNA被保护不受降解。
在一些实施方式中，所述提供包括从细胞或组织纯化RNA。在一些情况中，所述纯化的RNA不含或基本不含来自细胞或组织的内源性宿主蛋白质。在一些实施方式中，所述RNA具有0.1pg/mL～500μg/mL的浓度。在一些实施方式中，所提供的溶液还包含DNA酶。在一些情况中，所述DNA酶具有0.01U/μL～0.2U/μL的浓度。在一些情况中，所述RNA来自细胞或组织，并且所述DNA酶对于衍生所述RNA的细胞或组织是外源的或异源的。在一些情况中，所述DNA酶是重组DNA酶。在一些情况中，所述重组DNA酶是重组牛胰DNA酶I。
在一些情况中，在至少37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所提供的溶液之前，所述方法包括在适于进行DNA酶反应的条件下孵育所提供的溶液。在一些情况中，在适于进行DNA酶反应的条件下孵育所提供的溶液之前，所提供的溶液包含DNA并且所述DNA酶反应降解所述DNA。在一些情况中，所提供的溶液的DNA的质量是所提供的溶液中的RNA的质量的30％或更少。在一些情况中，所提供的溶液中的DNA在所述DNA酶反应进行之前具有低于50ng/μL的浓度。在一些情况中，所述DNA是基因组DNA。在一些情况中，所述基因组DNA源自细胞或组织，并且所述RNA源自相同细胞或组织。
在一些实施方式中，所述方法包括在至少55℃、58℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所提供的溶液，并且在至少55℃、58℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所提供的溶液使DNA酶失活。在一些实施方式中，在至少55℃、58℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所提供的溶液之后，所述方法包括对所提供的溶液中的RNA定量。
在一些实施方式中，所述在至少55℃、58℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所提供的溶液包括，在约55℃～约110℃、约55℃～约100℃、约55℃～约99℃、约55℃～约95℃、约55℃～约90℃、约55℃～约85℃、约55℃～约80℃、约55℃～约75℃、约55℃～约70℃、约55℃～约65℃、约55℃～约60℃、约60℃～约110℃、约60℃～约100℃、约60℃～约99℃、约60℃～约95℃、约60℃～约90℃、约60℃～约85℃、约60℃～约80℃、约60℃～约75℃、约60℃～约70℃、约60℃～约65℃、约65℃～约110℃、约65℃～约100℃、约65℃～约99℃、约65℃～约95℃、约65℃～约90℃、约65℃～约85℃、约65℃～约80℃、约65℃～约75℃或约65℃～约70℃的温度孵育所提供的溶液。
在一些情况中，相较于对于包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA的定量，所述方法提供更高的定量准确性。
在一些情况中，所述定量包括，使所述RNA或其部分与逆转录酶接触，由此将RNA或其部分逆转录成cDNA。在一些情况中，在所述逆转录期间或之后，所述RNA被RNA酶H降解。在一些情况中，将所述RNA或其部分转录成cDNA的逆转录酶包含RNA酶H。在一些情况中，所述RNA酶H是与将所述RNA或其部分转录成cDNA的逆转录酶结构不同的酶。在一些情况中，在使所述RNA或其部分与逆转录酶接触之前，所提供的溶液不含RNA酶或基本不含RNA酶。在一些情况中，在所述逆转录之后，所述方法还包括扩增逆转录的cDNA的至少部分。在一些情况中，所述方法还包括实时监测所述扩增反应。在一些情况中，所述定量包括，使所述RNA、其部分，或逆转录酶介导的所述RNA的产物或其部分与互补核酸接触。在一些情况中，所述互补核酸被固定在固体表面上(例如，固定在流式细胞中或微阵列上)。在一些情况中，所述互补核酸包含一种或多种寡核苷酸引物。
在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物选自下组：磷酸盐或酯、磷酸甘油、磷酸葡糖、磷酸核糖、焦磷酸盐或酯，和多磷酸盐或酯。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物是硫酸盐或酯。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有0.1mM～500mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有5mM的浓度。在一些情况中，所述含磷或含硫化合物对于所述RNA是异源的。在一些实施方式中，所述二价阳离子是或包含二价钙阳离子。在一些情况中，所述钙具有10μM～1mM的浓度。
在一些实施方式中，所述二价阳离子是或包含镁阳离子。在一些情况中，所述镁具有0.1mM～10mM的浓度。在一些实施方式中，所提供的溶液包含两种化学上不同的二价阳离子。在一些情况中，这两种化学上不同的二价阳离子是镁阳离子和钙阳离子。在一些情况中，钙具有10μM～1mM的浓度并且镁具有0.1mM～10mM的浓度。
在另一方面中，本发明提供水性溶液包含：i.水；ii.RNA；iii.二价阳离子；和iv.含磷或含硫化合物，其中，相较于包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA，所述RNA被保护不受降解。在一些实施方式中，所述溶液与所述RNA向cDNA的逆转录相容。在一些实施方式中，相较于包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA，所述溶液经设置以提供对所述溶液中的RNA的浓度的更准确的定量。在一些实施方式中，所述RNA具有0.1pg/mL～500μg/mL的浓度。在一些实施方式中，所述RNA纯化自细胞或组织。在一些情况中，所述纯化的RNA不含或基本不含来自细胞或组织的内源性宿主蛋白质。
在一些实施方式中，所述溶液还包含DNA酶。在一些情况中，所述DNA酶具有0.01U/μL～0.2U/μL的浓度。在一些情况中，所述RNA来自细胞或组织，并且所述DNA酶对于衍生所述RNA的细胞或组织是外源的或异源的。在一些情况中，所述DNA酶是重组DNA酶。在一些情况中，所述重组DNA酶是牛胰DNA酶I。在一些情况中，所述DNA酶是热失活的DNA酶。在一些情况中，所述溶液包含热失活的DNA酶，其浓度对应于0.01U/μL～0.2U/μL的活性的DNA酶。
在一些实施方式中，所述溶液还包含DNA。在一些情况中，所述DNA是基因组DNA。在一些情况中，所述DNA是DNA酶消化的，例如，被DNA酶(例如，重组和/或异源的DNA酶)消化的。在一些情况中，所述溶液中DNA的质量是所述溶液中RNA的质量的30％或更少。在一些情况中，所述溶液中的DNA具有低于50ng/μL的浓度。在一些情况中，所述基因组DNA源自细胞或组织，并且所述RNA源自相同细胞或组织。
在一些实施方式中，所述溶液在至少25℃、37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度。在一些实施方式中，所述溶液在约25℃～约110℃、约25℃～约100℃、约25℃～约99℃、约25℃～约95℃、约25℃～约90℃、约25℃～约85℃、约25℃～约80℃、约25℃～约75℃、约25℃～约70℃、约25℃～约65℃、约25℃～约60℃、约25℃～约55℃、约30℃～约110℃、约30℃～约100℃、约30℃～约95℃、约30℃～约90℃、约30℃～约85℃、约30℃～约80℃、约30℃～约75℃、约30℃～约70℃、约30℃～约65℃、约40℃～约110℃、约40℃～约100℃、约40℃～约95℃、约40℃～约90℃、约40℃～约85℃、约40℃～约80℃、约40℃～约75℃、约40℃～约70℃或约40℃～约65℃的温度。
在一些实施方式中，所述溶液还包含寡核苷酸核酸扩增引物和dNTP。在一些实施方式中，所述溶液还包含寡核苷酸扩增引物对。在一些实施方式中，所述溶液还包含逆转录酶。在一些实施方式中，所述溶液还包含DNA依赖性DNA聚合酶(例如，重组DNA依赖性DNA聚合酶和/或DNA依赖性DNA聚合酶，其对所述RNA是外源的或异源的)。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物选自下组：磷酸盐或酯、磷酸甘油、磷酸葡糖、磷酸核糖、焦磷酸盐或酯，和多磷酸盐或酯。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物对于所述RNA是异源的。
在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物是硫酸盐或酯。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有0.1mM～500mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有5mM的浓度。在一些实施方式中，所述二价阳离子是钙阳离子。在一些情况中，所述钙具有10μM～1mM的浓度。在一些情况中，所述二价阳离子是镁阳离子。在一些情况中，所述镁具有0.1mM～10mM的浓度。
在一些实施方式中，所述溶液包含两种化学上不同的二价阳离子。在一些实施方式中，这两种化学上不同的二价阳离子是镁阳离子和钙阳离子。在一些情况中，钙具有10μM～1mM的浓度并且镁具有0.1mM～10mM的浓度。在一些实施方式中，所述溶液不含RNA酶。
附图简要说明
图1A：说明由经历不同条件的RNA样品衍生的cDNA模板获得的实时扩增结果。相较于未经热处理的样品(尤其是在较低RNA输入的情况下)，在存在MgCl2和CaCl2且没有含磷或含硫化合物的情况下，使包含RNA的水性溶液升温至75℃，导致严重Cq延迟。
图1B：说明由经历不同条件的RNA样品衍生的cDNA模板获得的实时扩增结果。相较于图1A的溶液，5mMβ-磷酸甘油(BGP)的添加使热处理过程中的RNA稳定，导致较少Cq延迟。
图1C：说明由经历不同条件的RNA样品衍生的cDNA模板获得的实时扩增结果。10mMBGP使RNA更稳定，并且减少热诱导的Cq延迟。实验结果进一步汇总于实施例3的表3中。
定义
除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。通常，本文所用的命名和下述细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室步骤均为本领域熟知和常用的。使用标准技术进行核酸和肽合成。按照本领域和各种通用参考文献所述的常规方法进行这些技术和步骤(通常参见，Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2版(1989)冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold SpringHarbor,N.Y.)，其通过引用纳入本文)，将它们引入本文全文中。本文所用的命名以及下述分析化学和有机合成中的实验室步骤均为本领域熟知且常用。也可使用标准技术或其变型进行化学合成或化学分析。
本文所用的“核酸”表示DNA、RNA、单链、双链、或更高度聚集的杂交基序及其任意化学修饰。修饰包括但不限于，提供整合入其它电荷、极化性、氢键、静电相互作用、与核酸配体碱基或核酸配体整体的连接点和作用点的化学基团的那些修饰。这类修饰包括但不限于，肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2'-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿核苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合如异碱基(isobases)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸也可包含非天然碱基，如硝基吲哚。修饰还可包括3'和5'修饰，例如用荧光团(例如，量子点)或其他部分加帽。核苷酸可由其普遍认可的单字母代码表述。
本文中所用的术语“RNA”指核糖核酸，及其任何化学修饰形式，排除使RNA成为DNA的化学修饰形式。RNA可以是单链，或双链，或更加高度聚积的形式。RNA可通过本领域已知的任何方式提供，包括但不限于，体外转录、从生物体纯化、化学合成，或其组合。RNA可以是，但不限于，mRNA、rRNA、tRNA、微小RNA，或总RNA。RNA可以是纯化的RNA(例如，纯化的mRNA、纯化的rRNA、纯化的tRNA、纯化的微小RNA，或纯化的总RNA)。
本文中所用的“保护RNA不被降解”指增加RNA在溶液中的稳定性。关于核糖核酸(RNA)所述的稳定性指，RNA在溶液中耐受酶促、自动催化的、金属-催化的，或pH依赖性降解或其组合的能力。组合物、反应混合物或方法增加RNA稳定性的能力可通过将稳定化的RNA与未用本文所述的用于增加稳定性的方法或组合物处理的溶液中的RNA或不处于本文所述的用于增加稳定性的反应混合物中的RNA做比较来确定。所述比较可通过对于RNA或其cDNA产物进行试验来进行，例如，逆转录酶扩增试验(例如，RT-PCR)、微阵列试验、高通量测序、电泳(例如，凝胶或毛细管电泳)，或光谱(例如，质谱)。
本文中所用的短语“不含内源性宿主蛋白质”指已从RNA提取来源的宿主生物体、细胞或组织的蛋白质组分纯化出来的RNA，或包含已从RNA提取来源的宿主生物体的蛋白质组分纯化的出来的RNA的反应混合物。本领域技术人员应理解，所述RNA，或包含所述RNA的反应混合物，可具有采用高度敏感的方法可检测的小量的内源性宿主蛋白质。然而，一般而言，所述RNA，或包含所述RNA的反应混合物，至少或至少约90％、95％、99％、99.9％、99.999％或更大程度地不含内源性宿主蛋白(例如，w/w)。
本文中所用的术语“无RNA酶”指缺乏或基本缺乏可检测的RNA酶活性的组合物、溶液或反应混合物。在一些情况中，所述组合物、溶液或反应混合物通过应用RNA酶抑制剂而变得无RNA酶，所述RNA酶抑制剂例如，SUPERase·InTM、RNAse OUTTM、ANTI-RNASE、RNAsecureTM，或人胎盘RNA酶抑制剂(可获自新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs))。在一些情况中，所述组合物、溶液或反应混合物通过应用蛋白质修饰剂，例如焦碳酸二乙酯，而变得无RNA酶。本领域技术人员应理解，尽管具有良好实验室实践，溶液或反应混合物仍可具有采用高度敏感的方法可检测的小量的污染的RNA酶活性。然而，一般而言，所述溶液或反应混合物具有少于约1pg/μL、0.1pg/μL、0.01pg/μL、0.001pg/μL，或0.0001pg/μL活性的RNA酶的污染水平。这样，无RNA酶溶液或反应混合物具有少于约0.001、0.0001、0.00001，或0.000001单位的RNA酶活性的污染水平。
本文中所用的术语“DNA酶反应”指，在足以降解或消除溶液中长度大于3个核苷酸的DNA寡核苷酸的条件下，孵育包含DNA酶(例如，重组和/或异源的DNA酶)的溶液的方法。所述条件可包括在约或至少约20℃、25℃或37℃的温度孵育含DNA酶的溶液。在一些情况中，所述条件可包括在处于或至少约25℃或37℃的温度孵育含DNA酶的溶液。在一些情况中，所述条件可包括在约或至少约37℃的温度孵育含DNA酶的溶液。在一些情况中，所述条件包括在包含DNA酶且还包含包含钙或钙和镁二价阳离子的溶液中孵育该DNA酶。在一些情况中，所述条件包括在包含DNA酶且还包含足够的钙和/或镁二价阳离子以供有效(例如，最优)DNA酶活性的溶液中孵育该DNA酶。
术语“核酸扩增”或“扩增反应”或“扩增”指用于倍增核酸靶序列拷贝的任何体外方法。这类方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、DNA连接酶链反应(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；《PCR方案：方法和应用指南》(Innis等编，1990))、(LCR)、QBeta RNA复制酶、和基于RNA转录(如TAS和3SR)的扩增反应以及本领域技术人员已知的其它反应。
本文中所用的术语“异源的”指自然中不一起存在的两个要素。例如，DNA酶I酶对于RNA是异源的，可指纯化自细胞、组织或生物体的RNA和纯化自不同来源的DNA酶I酶(例如，纯化自不同生物体的细胞或组织的重组DNA酶I酶)。
具体实施方式
I.引言
用于制备、纯化、贮存和分析核糖核酸(RNA)的组合物、方法和试剂盒在生物学和生物技术的各个领域广泛使用。一般而言，溶液中的RNA相对于其脱氧核糖核的(DNA)对应物极其不稳定。该稳定性的缺乏源自几种不同现象。例如，RNA酶在环境中无处不在，并且高度稳定且具有持续性。因此，RNA酶污染可造成溶液中RNA的不稳定。RNA酶污染可通过应用无RNA酶的供应源、RNA酶抑制剂和良好的实验室实践来得到减轻或消除。
溶液中的RNA稳定性也可能被RNA降解的自动催化和金属催化的机制而减小。尽管金属-催化的降解可至少部分地通过在某些条件下螯合该溶液中的游离金属而减轻，但在一些情况中，金属催化的RNA降解可因金属螯合化合物的应用而加重。自动催化的或金属催化的降解机制也可至少部分地通过将RNA溶液保持在低温(例如，8℃、6℃、4℃或更低)而减轻。然而，这样的低温可能与一种或多种分析步骤不相容，例如体外转录、RNA扩增、RNA的体外翻译、RNA的DNA酶消化以去除任何污染的DNA、DNA酶的热失活、核酸的热变性，或所述RNA向cDNA的逆转录。类似地，金属螯合化合物可能会抑制这些分析步骤中的一种或多种。
本发明的发明人已发现含磷或含硫化合物(例如，其中，所述磷或硫是磷酸盐或酯或硫酸盐或酯的形式)可惊人地增加高于或约高于4℃、6℃或8℃的温度的溶液中的RNA稳定性。因此，本文中描述用含磷或含硫化合物来增加溶液中RNA稳定性的方法、组合物和反应混合物。所述方法、组合物和反应混合物可用于，例如，在一种或多种RNA制备、贮存、操作或分析步骤之前、期间或之后，减少或消除RNA降解(例如，金属催化的、自动催化的、酶促或其它情况)。例如，本文中描述在体外转录、RNA扩增、体外翻译、DNA酶消化、DNA酶热失活，或RNA在升高的温度(例如，在约或至少约10℃、15℃、20℃、25℃、37℃、40℃、50℃、55℃、58℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度)的溶液中孵育之前、期间或之后提高RNA稳定性的方法、组合物和反应混合物。在一些情况中，所述方法、组合物和反应混合物可促进低于约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃或80℃的升高的温度的溶液中的RNA稳定性。
在一些情况中，所述方法、组合物和反应混合物可促进约10℃～约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、37℃、35℃、30℃、25℃或20℃；约15℃～约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、37℃、35℃、30℃、25℃或20℃；约20℃～约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、37℃、35℃、30℃或25℃；或约25℃～约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、37℃、35℃或30℃的温度的溶液中的RNA稳定性。
在一些情况中，所述方法、组合物和反应混合物可促进约25℃～约110℃、约25℃～约100℃、约25℃～约99℃、约25℃～约95℃、约25℃～约90℃、约25℃～约85℃、约25℃～约80℃、约25℃～约75℃、约25℃～约70℃、约25℃～约65℃、约25℃～约60℃、约25℃～约55℃、约30℃～约110℃、约30℃～约100℃、约30℃～约95℃、约30℃～约90℃、约30℃～约85℃、约30℃～约80℃、约30℃～约75℃、约30℃～约70℃、约30℃～约65℃、约40℃～约110℃、约40℃～约100℃、约40℃～约95℃、约40℃～约90℃、约40℃～约85℃、约40℃～约80℃、约40℃～约75℃、约40℃～约70℃或约40℃～约65℃的温度的溶液中的RNA稳定性。
II.方法
本文描述保护RNA在溶液中不被降解的方法。在一些实施方式中，所述方法包括，形成或提供一种溶液(例如，反应混合物)，其包含水、RNA、二价阳离子和含磷或硫化合物化合物；并且，在至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所述溶液，其中，相较于包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA，所述RNA被保护不受降解。
在一些情况中，所述方法包括，在低于或低于约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃或80℃的温度孵育所述溶液。在一些情况中，所述方法包括在约至少或至少约37℃、38℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所述溶液。在一些情况中，所述方法包括在约、至少或至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所述溶液。在一些情况中，所述方法包括在约、至少或至少约55℃、56℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所述溶液。
在一些情况中，所述方法包括在约10℃～约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、37℃、35℃、30℃、25℃或20℃；约15℃～约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、37℃、35℃、30℃、25℃或20℃；约20℃～约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、37℃、35℃、30℃或25℃；或约25℃～约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、37℃、35℃或30℃的温度孵育所述溶液。在一些情况中，所述方法包括在约25℃～约110℃、约25℃～约100℃、约25℃～约99℃、约25℃～约95℃、约25℃～约90℃、约25℃～约85℃、约25℃～约80℃、约25℃～约75℃、约25℃～约70℃、约25℃～约65℃、约25℃～约60℃、约25℃～约55℃、约30℃～约110℃、约30℃～约100℃、约30℃～约95℃、约30℃～约90℃、约30℃～约85℃、约30℃～约80℃、约30℃～约75℃、约30℃～约70℃、约30℃～约65℃、约40℃～约110℃、约40℃～约100℃、约40℃～约95℃、约40℃～约90℃、约40℃～约85℃、约40℃～约80℃、约40℃～约75℃、约40℃～约70℃或约40℃～约65℃的温度孵育所述溶液。
在一些情况中，在一个或多个前述温度或温度范围的孵育包括使(例如，重组和/或异源的)DNA酶热失活。本文中描述供于DNA酶热失活的合适的孵育温度进而时间。例如，热失活DNA酶可以，例如，以约、至少或至少约5秒、10秒、15秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、7.5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、或1小时的时程进行。在一些情况中，热失活DNA酶进行约5分钟～30分钟、约7分钟～20分钟，或约10分钟。在一个示例性的实施方式中，DNA酶在约75℃热失活约10分钟，在约75℃热失活约10分钟，或在约70℃热失活约25～30分钟。在一些情况中，所述DNA酶是热不稳定的DNA酶并且通过在约58℃的温度孵育所述溶液约5分钟而热失活。下文描述其它孵育时间和温度。
例如，相较于通过在其它条件相同或基本相同的溶液中孵育RNA获得的降解，RNA可在含磷或含硫化合物的存在下被保护而不降解。例如，相较于具有相同或相似的二价阳离子浓度、pH或温度的溶液，RNA可被保护而不降解。
在一些情况中，在一个或多个前述温度或温度范围进行的孵育包括贮存所述RNA溶液。例如，所述RNA溶液可贮存在约高于或高于约4℃、6℃、8℃或10℃的温度。在一些情况中，所述RNA溶液可贮存在约4℃～约37℃、约10℃～约37℃、约15℃～约37℃、约4℃～约30℃、约10℃～约30℃、约15℃～约30℃、约4℃～约25℃或约10℃～约25℃的温度。在一些情况中，所述RNA稳定化的RNA溶液可贮存至少约4小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、24小时、1.5天、2天、3天或更久。
在一些情况中，所述RNA可经保护不受自动催化降解。例如，该RNA可经保护不受碱促进的酯基转移介导的自动催化降解。参见，例如，J.Am.Chem.Soc.,1999,121,5364-72。在一些情况中，所述含磷或含硫化合物可通过与RNA主链的一种或多种的核糖的2’位置的羟基基团相互作用来抑制自动催化降解。在一些情况中，该相互作用可减少、抑制或阻遏RNA的一个或多个磷酸二酯键被2’羟基基团的氧亲核攻击。
在一些情况中，所述反应混合物包含纯化自生物体、细胞或组织的RNA。用于从生物体、细胞或组织纯化RNA的方法、组合物和试剂盒包括但不限于采用或包含硫氰酸胍和苯酚的那些。参见Chomczynski和Sacchi,Anal Biochem.1987年4月；162(1):156-9。此外或或者，RNA可通过醇沉淀或固相纯化技术(例如，寡dT珠、柱等)纯化自生物体、细胞或组织。
在一些实施方式中，所述RNA不含或基本不含来自该RNA纯化来源的细胞或组织的内源性宿主蛋白质。例如，在一些情况中，包含RNA的提供的溶液不是来自所述宿主细胞、生物体或组织的纯化的蛋白质制备物或蛋白质:RNA复合物。作为另一示例，包含RNA的提供的溶液不是细胞裂解物或其亚细胞组分(例如，胞液、核或核组分)。作为另一示例，包含RNA的提供的溶液不是条件培养基。
包含RNA的提供的溶液可包含大范围的合适的浓度的RNA。例如，所述RNA可以是高浓度的RNA储液，该储液可经稀释供于一种或多种后续分析或制备方法。因此，所述RNA可具有500μg/mL，或1mg/mL，或更高的浓度。在一些情况中，所述RNA具有0.1pg/mL～500μg/mL的浓度。在一些情况中，所述RNA具有适于进行DNA酶反应以去除污染的基因组DNA的浓度。在一些情况中，所述RNA具有适于进行逆转录反应以从RNA模板或其部分形成cDNA的浓度。在一些情况中，所述RNA可具有约10pg/mL～约100μg/mL；约50pg/mL～约100μg/mL；约60pg/mL～约60μg/mL的浓度；或具有约50pg/mL；60pg/mL；70pg/mL；80pg/mL；90pg/mL；100pg/mL；1μg/mL；5μg/mL；10μg/mL；25μg/mL；50μg/mL；75μg/mL；100μg/mL；150μg/mL；200μg/mL；250μg/mL；300μg/mL；400μg/mL；500μg/mL；或更高的浓度。
在一些实施方式中，包含RNA的提供的溶液还包含DNA，例如基因组DNA。在一些情况中，所述DNA源自、提取自或纯化自，与该RNA来源相同的细胞、生物体或组织。在一些情况中，所述DNA是双链DNA，或双链或单链基因组DNA。在一些情况中，所述DNA经DNA酶消化。在一些情况中，所述RNA和DNA或其部分是RNA DNA杂合体形式。
在一些情况中，所述DNA的浓度低于所述溶液中的RNA。例如，所述DNA的浓度可以是所述溶液中的RNA的浓度的30％、10％、1％，或少于所述溶液中的RNA的浓度的30％、10％或1％。在一些情况中，所述溶液中DNA的质量是所述溶液中RNA的质量的30％、10％、5％、1％或少于1％。在一些情况中，所述溶液中DNA的质量与RNA的质量的比例可以是约或少于约1/3、1/4/、1/5、1/6、1/10、1/15、1/20、1/25、1/30、1/50、1/100、1/200、1/250、1/300、1/400、1/500或1/1000。在一些情况中，包含RNA的提供的溶液中的DNA具有约或少于约1mg/mL、500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、25μg/mL、20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、20ng/mL、15ng/mL、10ng/mL、5ng/mL，或1ng/mL的浓度。因此，包含RNA的提供的溶液中的DNA可具有约或少于约1μg/μL、500ng/μL、250ng/μL、100ng/μL、50ng/μL、40ng/μL、30ng/μL、25ng/μL、20ng/μL、15ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、500pg/μL、250pg/μL、100pg/μL、50pg/μL、25pg/μL、20pg/μL、15pg/μL、10pg/μL、5pg/μL，或1pg/μL的浓度。在一些情况中，包含RNA的提供的溶液中的DNA具有约或少于约1ng/mL、500pg/mL、250pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、20pg/mL、15pg/mL、10pg/mL、5pg/mL，或1pg/mL的浓度。
在一个实施方式中，包含RNA的提供的溶液是包含适于通过DNA酶消化污染的DNA或基因组DNA(若存在)的消化缓冲剂中的纯化的RNA的溶液。例如，所述溶液可包含DNA酶。作为另一示例，所述溶液可包含DNA被DNA酶酶促降解所需的钙或镁离子。在一些情况中，所述DNA酶不是从其提取或以其它形式衍生所述RNA的宿主生物体、细胞或组织的内源性的DNA酶。在一些情况中，所述DNA酶对于从其提取或以其它形式衍生所述RNA的宿主生物体、细胞或组织是外源的或异源的。在一些情况中，所述DNA酶是重组酶。合适的重组酶包括重组牛胰DNA酶I(例如，可获自新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))。其它合适的重组酶可包括天然地或经修饰以比牛胰DNA酶I更加热不稳定的酶，例如，HL-dsDNA酶，可获自ArcticZymes公司。
在一些情况中，所提供的溶液包含约0.01U/μL～约0.2U/μL；或约0.019～约0.125U/μL浓度的DNA酶。在一些情况中，所提供的溶液以约或至少约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.0625、0.07、0.08、0.09、0.1、0.125、0.15、0.175，或0.2U/μL的浓度包含DNA酶。在一些情况中，所述DNA酶是热失活的，并且以单位/体积计的浓度指对于未被热失活的DNA酶的以单位/体积计的对应浓度。
在一些实施方式中，所提供的溶液在适于进行DNA酶反应的温度和条件孵育。在较高或较低温度孵育之前可进行DNA酶反应。例如，可在DNA酶的热失活之前进行DNA酶反应。作为另一示例，可进行DNA酶反应，然后，该反应混合物冷却至低温(例如，4℃)供于贮存。作为另一示例，可进行DNA酶反应，该反应混合物任选地冷却，然后，该反应混合物或其部分，可经升温以失活DNA酶，采用RNA作为模板进行逆转录反应，或扩增该RNA或由其衍生的cDNA，或其组合。
用于进行DNA酶反应的合适的温度可取决于反应混合物中的DNA酶的类型。例如，供于采用来自嗜热生物或超嗜热生物的DNA酶进行DNA酶反应的合适的温度可高于供于来自嗜温生物体的DNA酶的合适的温度。在一些实施方式中，供于进行DNA酶反应的合适的温度可包括但不限于约20℃、25℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃的温度。
供于失活DNA酶的合适的温度可取决于反应混合物中的DNA酶的类型。例如，冷适应的或热不稳定的DNA酶可在比嗜温或嗜热DNA酶低的温度失活。在一些情况中，所述DNA酶是热不稳定的DNA酶并且可在约或至少约40℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃的温度失活。在一些情况中，所述DNA酶来自嗜温生物体(例如，例如牛胰DNA酶I)并且可以在约或至少约60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃的温度热失活。在一些情况中，所述热不稳定的或嗜温DNA酶在低于约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃或80℃的温度热失活。
DNA酶热失活可通过在热失活温度孵育所述包含RNA的溶液足够的时间来进行。在一些情况中，较高温度可在较短时程内实现热失活。在一些情况中，如果热失活温度相对较低，则可能需要较长时程的高温孵育。合适的热失活时间包括但不限于，约或至少约0.5分钟、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟，或30分钟。
在一些实施方式中，所述方法包括逆转录RNA，或该RNA的特定区域、分子或序列成为cDNA。所述逆转录反应可通过多种方法进行。例如，所述RNA可与逆转录酶以及杂交至该RNA的特定区域、分子或序列的特异性引物接触。作为另一示例，所述RNA可与寡dT寡核苷酸和逆转录酶接触以逆转录聚腺苷酸化的RNA。作为另一示例，所述RNA可与一组简并引物(例如，随机六聚体，九聚体(septamer)、十聚体(octomer)、十一聚体(nonomer)、十二聚体(decamer)或其组合)以及逆转录酶接触，以逆转录总RNA。作为另一示例，所述RNA可与寡dT和简并引物与逆转录酶的组合接触。
在一些实施方式中，在逆转录RNA的步骤之后，降解RNA模板。在一些情况中，在逆转录RNA的步骤之后，降解处于RNA/DNA杂合体形式的RNA。在一些情况中，所述RNA模板可与RNA酶H酶接触以降解RNA/DNA杂合体中的RNA。在一些情况中，然后，通过逆转录酶进行的cDNA的第一链合成过程中产生的RNA:DNA杂合体中的RNA的降解之后进行cDNA的第二链合成。在一些情况中，包含RNA的提供的溶液在与逆转录酶接触之前不含RNA酶。在一些情况中，在与RNA酶H接触之前，或在通过使逆转录酶与RNA模板接触产生的RNA:DNA杂合体被RNA酶H降解之前，包含RNA的提供的溶液不含RNA酶。
在一些实施方式中，所述方法包括对溶液中的RNA的量定量，或对溶液中的RNA的特定区域或序列的量定量。在一些情况中，RNA的定量在去除或消化溶液中的DNA的步骤之后进行。在一些情况中，RNA的定量在DNA酶消化的步骤之后进行。在一些情况中，RNA的定量在DNA酶消化和DNA酶的热失活的步骤之后进行。在一些情况中，所述定量在包含RNA的提供的溶液在至少37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度的孵育步骤之后进行，其中，相较于包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA，前述RNA在该孵育温度被保护不受降解。在一些情况中，所述溶液的温度低于约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃或80℃。
在一些情况中，相较于对于包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA的定量，所述保护RNA不受降解提供更高的定量准确性。在一些情况中，定量的准确性是在至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育之前，溶液中RNA的量的准确性。例如，相较于在至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育之前或在DNA酶消化或DNA酶热失活之前的RNA的量，降解的RNA可导致检测到RNA的错误低定量。
RNA可通过本领域已知的多种方法定量。例如，RNA可与可检测地标记该RNA的染料接触。在一些情况中，未结合的染料可与RNA结合型染料分离。然后可分析RNA结合型染料的定量，例如，通过光谱或荧光技术，以定量RNA的量。或者，例如，当结合至RNA时，如果所述染料提供通过检测可区分的信号(例如，荧光增加)相较于未结合状态下的信号，可能不需要分离步骤。
在一些实施方式中，所述RNA定量包括逆转录RNA的步骤。例如，RNA被逆转录成cDNA，并且检测所得cDNA的量。在一些情况中，cDNA的量通过采用嵌入核酸染料来检测。在一些情况中，cDNA的量通过采用DNA依赖性DNA聚合酶和一种或多种引物扩增cDNA的至少部分并监测该扩增反应来检测。逆转录RNA和通过监测扩增反应定量所得cDNA的量的方法一般称为RT-qPCR试验。用于进行RT-qPCR试验的方法一般是本领域已知的。
在一些情况中，所述RT-qPCR采用非特异性扩增子检测试剂进行。例如，识别双链DNA扩增子的嵌入染料可用于监测扩增。或者，RT-qPCR可采用特定扩增子检测试剂进行。特定扩增子检测试剂的示例包括核酸探针，例如蝎子探针、Taq-man探针和分子信标。其它示例包括锁核酸探针、肽核酸探针、适体等。
在一些实施方式中，所述RNA定量包括使RNA，或由其衍生的逆转录的cDNA，杂交至固定互补核酸。例如，所述RNA或由其逆转录的cDNA可杂交至微阵列、流式细胞或包含一种或多种互补的固定化捕获寡核苷酸的其它固体表面。在一些情况中，RNA定量包括对RNA，或由其衍生的逆转录的cDNA进行测序的步骤。
提供的RNA溶液包含含磷或含硫化合物。在一些情况中，所述含磷化合物是磷化氢。在一些情况中，所述含磷化合物是包含直接共价键接至一个、两个、三个或四个氧原子的磷原子的化合物。在一些情况中，所述含磷化合物是磷氧化物。在一些情况中，所述含磷化合物是磷含氧酸(即，包含共价键接至磷原子的至少一个羟基基团的磷化合物)。在一些情况中，所述含磷化合物是亚磷酸盐或酯，或膦酸盐或酯，或有机磷酸盐或酯。在一些情况中，所述有机磷酸盐或酯是磷酸甘油，例如β-磷酸甘油(3-磷酸甘油)、磷酸核糖、磷酸葡糖，或磷酸果糖。在一些情况中，所述含磷化合物是磷酸二酯。在本发明内容中，所述含磷化合物不是DNA或RNA寡核苷酸。在一些情况中，所述含磷化合物对于所述溶液中的RNA是异源的。
在一个示例性的实施方式中，所述含磷化合物是磷酸盐或酯。在该实施方式中，包含RNA和磷酸盐或酯的提供的溶液可以，例如，通过向溶液引入多种不同磷酸盐来提供。例如，所述磷酸盐或酯可以二碱、单碱或三碱钠或钾磷酸盐的形式提供进入所述溶液。
在一些情况中，所述含磷化合物是包含焦磷酸盐或酯、二磷酸盐或酯，或三磷酸盐或酯的化合物。例如，所述含磷化合物可以是焦磷酸盐或酯、二磷酸盐或酯、三磷酸盐或酯，或其盐生物。焦磷酸盐或酯的示例性的衍生物包括但不限于，核苷焦磷酸盐或酯，例如腺苷、肌苷、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶焦磷酸盐或酯。三磷酸盐或酯的示例性的衍生物包括但不限于，核苷三磷酸盐或酯，例如腺苷、肌苷、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶三磷酸盐或酯。在一些情况中，所述含磷化合物是较高级别的多磷酸盐或酯，例如式[NaPO3]n[NaPO3(OH)]2、[KPO3]n[KPO3(OH)]2、[NaPO3]n[KPO3(OH)]2或[KPO3]n[NaPO3(OH)]2的物质，其中，n是2或3～2000或更多。
在一个示例性的实施方式中，所述含硫化合物是硫酸盐或酯。在该实施方式中，包含RNA和硫酸盐或酯的提供的溶液可以，例如，通过向溶液引入多种不同硫酸盐来提供。例如，硫酸盐或酯可以硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵或其组合的形式提供进入所述溶液。.在一些情况中，所述含硫化合物对于所述溶液中的RNA是异源的。
在一些情况中，包含RNA和含磷或含硫化合物的提供的溶液的pH可经调节或设置以维持在某pH或pH范围。例如，在一些情况中，所述含磷或含硫化合物可以是强或弱酸、强或弱碱，或作为pH缓冲剂发挥功能。因此，含磷或含硫化合物可改变溶液的pH。在一些情况中，该pH改变可通过向包含RNA的提供的溶液纳入额外的缓冲剂来减轻。
示例性的缓冲剂包括但不限于，以下一种或多种：三(羟甲基)氨基甲烷(三)、N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-氨基乙烷磺酸(HEPES)、N-三-(羟基甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(TES)、N-三(羟基甲基)甲基甘氨酸(Tricene)、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)、双-(2-羟基乙基)亚氨基-三-(羟基甲基)甲烷(双-三)、N-2-乙酰胺基亚氨基二乙酰乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酰乙酸(ACES)、哌嗪-N,N′-双(2-乙烷磺酸)(PIPS)、3-(N-吗啉)-2-羟基丙烷磺酸(MOPSO)、1、3-双[三(羟基甲基)甲基氨基]丙烷(双-三丙烷)、N,N-双-(2-羟基乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、3-(N-吗啉)丙烷磺酸(MOPS)、3-[N-双(羟基乙基)-氨基]-2-羟基丙烷磺酸(DIPSO)、3-[N-(三-羟基甲基)甲基氨基]-2-羟基丙烷磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N′双-(2-羟基丙烷)磺酸(POPSO)、N-羟基乙基哌嗪-N′-2-羟基丙烷磺酸(HEPPSO)、N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-氨基丙烷磺酸(EPPS)、N,N-双-(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)、3-N-(α,α-二甲基羟乙基)-氨基-2-羟基丙烷磺酸(AMPSO)和3-N-环己基氨基磺酸(CAPSO)。
在一些情况中，包含RNA的提供的溶液的pH调节或维持在约6～约8.5。在一些情况中，包含RNA的提供的溶液的pH调节或维持在约6.5～约8。在一些情况中，包含RNA的提供的溶液的pH调节或维持在约7～约8。在一些情况中，包含RNA的提供的溶液的pH调节或维持在或约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。在一些情况中，包含RNA的提供的溶液的pH调节或维持在使磷酸盐或酯离子、钙离子或钙磷酸盐或酯(若存在)的沉淀消除或最小化的pH。
在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约0.1mM～约500mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约0.5mM～约250mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约0.5mM～约100mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约0.5mM～约50mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约0.5mM～约25mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约0.5mM～约15mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约或至少约0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、或22mM、23mM、24mM，或25mM的浓度。
在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物是钠或钾磷酸盐或酯(单碱、二碱或三碱)，具有0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM，或15mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物以硫酸盐的形式提供(例如，硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵)，具有1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、或22mM、23mM、24mM，或25mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物是β-磷酸甘油，具有1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、或22mM、23mM、24mM，或25mM的浓度。
提供的RNA溶液包含二价阳离子。在一些情况中，所述二价阳离子是二价镁阳离子。在一些情况中，所述二价阳离子是钙二价阳离子。在一些情况中，所述二价阳离子是锰二价阳离子。在一些情况中，所述二价阳离子可能是用于进行一种或多种酶促反应，包括但不限于DNA酶消化、逆转录、RNA:DNA杂合体中RNA的降解、第二链cDNA合成或核酸扩增的溶液所需的组分。在一些情况中，所提供的溶液包含两种或更多不同二价阳离子，例如镁和钙二价阳离子。
在一些实施方式中，所述提供的RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约10μM～约100mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供的RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约10μM～约50mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供的RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约10μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供的RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约100μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供的RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约250μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供的RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约250μM～约5mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供的RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约0.5mM～约5mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供的RNA溶液包含二价钙阳离子，具有是或约是0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.075mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、或22mM、23mM、24mM，或25mM的浓度。
在一些实施方式中，所述提供RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约10μM～约100mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约10μM～约50mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约10μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约10μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约100μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约250μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约250μM～约5mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供的RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约0.5mM～约5mM的浓度。在一些实施方式中，所述提供的RNA溶液包含二价镁阳离子，具有是或约是0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.075mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、或22mM、23mM、24mM，或25mM的浓度。
在一些实施方式中，包含RNA的提供的溶液包含钙二价阳离子，具有10μM～0.5mM，10μM～1mM，10μM～2mM，10μM～3mM，10μM～4mM，或10μM～5mM的浓度，和镁二价阳离子，具有0.1mM～2.5mM，0.1mM～5mM，0.1mM～10mM，0.1mM～15mM，0.1mM～20mM，0.1mM～30mM，0.1mM～50mM，0.01～10mM，0.01～15mM，0.01mM～20mM，0.01mM～30mM，或0.01mM～50mM的浓度。在一些情况中，包含RNA的提供的溶液包含0.1mM～1mM浓度的钙二价阳离子和0.5mM～5mM浓度的镁二价阳离子。在一些情况中，包含RNA的提供的溶液包含约0.5mM浓度的钙二价阳离子和约2.5mM浓度的镁二价阳离子。
本文所述的方法包括不同参数(例如，时间、温度、量和浓度)，组分(例如，RNA、DNA、DNA酶、RNA酶H、逆转录酶、DNA依赖性聚合酶、含磷或含硫化合物、引物、探针和阳离子)，和条件(例如，无RNA酶、不含宿主细胞蛋白质、外源的、异源的、重组的、消化的和保护不受降解的)的多种排列。所述方法包括本文所述的参数、组分或条件的任何组合。
III.组合物
本文描述保护RNA在溶液中不被降解的组合物。本文所述的组合物可保护RNA不受自动催化降解、金属催化的降解、碱促进的酯基转移介导的自动催化降解等。在一些情况中，所述RNA可被保护以不在升高的温度(例如，升高高于4℃)的溶液中降解。在一些情况中，相较于通过在其它条件相同或基本相同的溶液中孵育RNA获得的降解，溶液中的RNA可在含磷或含硫化合物的存在下被保护而不降解。例如，相较于具有相同或相似的二价阳离子浓度、pH或温度的溶液，RNA可被保护而不降解。
本文描述包含水、RNA、二价阳离子和含磷或含硫化合物的溶液，其中，相较于包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA，所述RNA被保护不受降解。在一些情况中，相较于其它条件相同但不包含含磷或含硫化合物的溶液中的RNA，所述RNA在至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度被保护不被降解。
在一些情况中，所述RNA在约10℃～约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、37℃、35℃、30℃、25℃或20℃；约15℃～约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、37℃、35℃、30℃、25℃或20℃；约20℃～约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、37℃、35℃、30℃或25℃；或约25℃～约110℃、104℃、100℃、99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、37℃、35℃或30℃的温度被保护不受降解。
在一些情况中，所述RNA在约25℃～约110℃、约25℃～约100℃、约25℃～约99℃、约25℃～约95℃、约25℃～约90℃、约25℃～约85℃、约25℃～约80℃、约25℃～约75℃、约25℃～约70℃、约25℃～约65℃、约25℃～约60℃、约25℃～约55℃、约30℃～约110℃、约30℃～约100℃、约30℃～约95℃、约30℃～约90℃、约30℃～约85℃、约30℃～约80℃、约30℃～约75℃、约30℃～约70℃、约30℃～约65℃、约40℃～约110℃、约40℃～约100℃、约40℃～约95℃、约40℃～约90℃、约40℃～约85℃、约40℃～约80℃、约40℃～约75℃、约40℃～约70℃或约40℃～约65℃的温度被保护不受降解。
在一些情况中，相较于包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA，所述包含水、二价阳离子和含磷或含硫化合物的溶液经设置以提供对所述溶液中的RNA的浓度的更准确的定量。在一些情况中，定量的准确性是在至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育之前，溶液中RNA的量的准确性。例如，相较于在至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育之前或在DNA酶消化或DNA酶热失活之前的RNA的量，降解的RNA可导致检测到RNA的错误低定量。
在一些情况中，所述溶液与所述RNA向cDNA的逆转录相容。相容的溶液可包含逆转录酶和模板RNA。相容的溶液还可包含dNTP和一种或多种寡核苷酸引物。相容的溶液还可包含二价镁离子。相容的溶液还可包含缓冲剂、一种或多种钾或钠的氯化物或硫酸盐，以及任选地，还原剂。在一个实施方式中，所述溶液包含25mM Tris-HCl(pH 8.3)、37.5mM KC1、1.5mM MgCl2。在一个实施方式中，所述溶液包含50mM Tris-HCl、75mM KCl和3mM MgCl2，pH为8.3。在一些情况中，所述溶液包含10mM DTT或其它合适的还原剂。在一些情况中，所述溶液包含放线菌素D。与逆转录相容的其它合适的条件是本领域已知的。
包含RNA的溶液可包含大范围的合适的浓度的RNA。例如，所述RNA可以是高浓度的RNA储液，该储液可经稀释供于一种或多种后续分析或制备方法。因此，所述RNA可可具有500μg/mL，或1mg/mL，或更高的浓度。在一些情况中，所述RNA具有0.1pg/mL～500μg/mL的浓度。在一些情况中，所述RNA具有适于进行DNA酶反应以去除污染的基因组DNA的浓度。在一些情况中，所述RNA具有适于进行逆转录反应以从RNA模板形成cDNA的浓度。在一些情况中，所述RNA可具有约10pg/mL～约100μg/mL；约50pg/mL～约100μg/mL；约60pg/mL～约60μg/mL的浓度；或在约50pg/mL；60pg/mL；70pg/mL；80pg/mL；90pg/mL；100pg/mL；1μg/mL；5μg/mL；10μg/mL；25μg/mL；50μg/mL；75μg/mL；100μg/mL；150μg/mL；200μg/mL；250μg/mL；300μg/mL；400μg/mL；500μg/mL；或更高的浓度。
在一些情况中，所述反应混合物包含纯化自生物体、细胞或组织的RNA。用于从生物体、细胞或组织纯化RNA的方法、组合物和试剂盒包括但不限于采用或包含硫氰酸胍和苯酚的那些。参见Chomczynski和Sacchi,Anal Biochem.1987年4月；162(1):156-9。此外或或者，RNA通过醇沉淀或固相纯化技术(例如，寡dT珠、柱等)可纯化自生物体、细胞或组织。
在一些实施方式中，所述RNA不含或基本不含来自该RNA纯化来源的细胞或组织的内源性宿主蛋白质。例如，在一些情况中，包含RNA的提供的溶液不是来自所述宿主细胞、生物体或组织的纯化的蛋白质制备物。作为另一示例，包含RNA的提供的溶液不是细胞裂解物或其亚细胞组分(例如，胞液、核或核组分)。作为另一示例，包含RNA的提供的溶液不是条件限制性培养基。
在一些实施方式中，包含RNA的溶液还包含DNA，例如基因组DNA。在一些情况中，所述DNA源自、提取自或纯化自，与该RNA来源相同的细胞、生物体或组织。在一些情况中，所述DNA是双链DNA，或双链或单链基因组DNA。在一些情况中，所述DNA经DNA酶消化。在一些情况中，所述RNA和DNA或其部分是RNA DNA杂合体形式。
在一些情况中，所述DNA的浓度低于所述溶液中的RNA。例如，所述DNA的浓度可以是所述溶液中的RNA的浓度的30％、10％、1％，或少于所述溶液中的RNA的浓度的30％、10％或1％。在一些情况中，所述溶液中DNA的质量是所述溶液中RNA的质量的30％、10％、5％、1％或少于所述溶液中RNA的质量。在一些情况中，所述溶液中DNA的质量与RNA的质量的比例可以是约或少于约1/3、1/4/、1/5、1/6、1/10、1/15、1/20、1/25、1/30、1/50、1/100、1/200、1/250、1/300、1/400、1/500或1/1000。在一些情况中，包含RNA的溶液中的DNA具有约或少于约1mg/mL、500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、25μg/mL、20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、20ng/mL、15ng/mL、10ng/mL、5ng/mL，或1ng/mL的浓度。
在一个实施方式中，包含RNA的溶液是包含适于通过DNA酶消化污染的DNA或基因组DNA(若存在)的消化缓冲剂中的纯化的RNA的溶液。例如，所述溶液可包含DNA酶。作为另一示例，所述溶液可包含DNA被DNA酶酶促降解所需的钙或镁离子。在一些情况中，所述DNA酶不是从其提取或以其它形式衍生所述RNA的宿主生物体、细胞或组织的内源性的DNA酶。在一些情况中，所述DNA酶对于从其提取或以其它形式衍生所述RNA的宿主生物体、细胞或组织是外源的或异源的。在一些情况中，所述DNA酶是重组酶。合适的重组酶包括重组牛胰DNA酶I(例如，可获自新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))。其它合适的重组酶可包括天然地或经修饰以比牛胰DNA酶I更加热不稳定的酶，例如，HL-dsDNA酶，可获自ArcticZymes。
在一些情况中，包含RNA的溶液包含约0.01U/μL～约0.2U/μL；或约0.019～约0.125U/μL浓度的DNA酶。在一些情况中，所述溶液以约或至少约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.0625、0.07、0.08、0.09、0.1、0.125、0.15、0.175，或0.2U/μL的浓度包含DNA酶。在一些情况中，所述DNA酶是热失活的，并且以单位/体积计的浓度指以单位/体积计的对于未被热失活的DNA酶的对应浓度。
在一些情况中，所述溶液在至少或至少约10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、42℃、50℃、55℃、58℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度。在一些情况中，所述溶液在约10℃～至少约42℃、50℃、55℃、58℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度。在一些实施方式中，所述溶液在约10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、42℃、50℃、55℃、58℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度。
在一些实施方式中，所述溶液与DNA扩增相容。例如，所述溶液可包含一种或多种寡核苷酸扩增引物、dNTP和DNA依赖性DNA聚合酶。在一些实施方式中，所述溶液包含源自RNA的cDNA模板，供于扩增或定量检测。在一些情况中，所述RNA是已被识别并消化RNA:DNA杂合体中的RNA的RNA酶降解的RNA。
所述包含RNA的溶液包含含磷或含硫化合物。在一些情况中，所述含磷化合物是磷化氢。在一些情况中，所述含磷化合物是包含直接共价键接至一个、两个、三个或四个氧原子的磷原子的化合物。在一些情况中，所述含磷化合物是磷氧化物。在一些情况中，所述含磷化合物是磷含氧酸(即，包含共价键接至磷原子的至少一个羟基基团的磷化合物)。在一些情况中，所述含磷化合物是亚磷酸盐或酯，或膦酸盐或酯，或有机磷酸盐或酯。在一些情况中，所述有机磷酸盐或酯是磷酸甘油，例如β-磷酸甘油(3-磷酸甘油)、磷酸核糖、磷酸葡糖，或磷酸果糖。在一些情况中，所述含磷化合物是磷酸二酯。在本发明内容中，所述含磷化合物不是DNA或RNA寡核苷酸。
在一个示例性的实施方式中，所述含磷化合物是磷酸盐或酯。在该实施方式中，包含RNA和磷酸盐或酯的提供的溶液可以，例如，通过向溶液引入多种不同磷酸盐来提供。例如，所述磷酸盐或酯可以二碱、单碱或三碱钠或钾磷酸盐的形式提供进入所述溶液。
在一些情况中，所述含磷化合物是焦磷酸盐或酯、二磷酸盐或酯、三磷酸盐或酯，或多磷酸盐或酯包含化合物。例如，含磷化合物可以是焦磷酸盐或酯、二磷酸盐或酯、三磷酸盐或酯、多磷酸盐或酯，或其盐生物。焦磷酸盐或酯的示例性的衍生物包括但不限于，核苷焦磷酸盐或酯，例如腺苷、肌苷、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶焦磷酸盐或酯。三磷酸盐或酯的示例性的衍生物包括但不限于，核苷三磷酸盐或酯，例如腺苷、肌苷、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶三磷酸盐或酯。在一些情况中，所述含磷化合物是较高级别的多磷酸盐或酯，例如式[NaPO3]n[NaPO3(OH)]2、[KPO3]n[KPO3(OH)]2、[NaPO3]n[KPO3(OH)]2或[KPO3]n[NaPO3(OH)]2的物质，其中，n是2或3～2000或更多。
在一个示例性的实施方式中，所述含硫化合物是硫酸盐或酯。在该实施方式中，包含RNA和硫酸盐或酯的提供的溶液可以，例如，通过向溶液引入多种不同硫酸盐来提供。例如，硫酸盐或酯可以硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵或其组合的形式提供进入所述溶液。
所述溶液可包含一种或多种缓冲剂。示例性的缓冲剂包括但不限于，以下一种或多种：三(羟甲基)氨基甲烷(三)、N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-氨基乙烷磺酸(HEPES)、N-三-(羟基甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(TES)、N-三(羟基甲基)甲基甘氨酸(Tricene)、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)、双-(2-羟基乙基)亚氨基-三-(羟基甲基)甲烷(双-三)、N-2-乙酰胺基亚氨基二乙酰乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酰乙酸(ACES)、哌嗪-N,N′-双(2-乙烷磺酸)(PIPS)、3-(N-吗啉)-2-羟基丙烷磺酸(MOPSO)、1、3-双[三(羟基甲基)甲基氨基]丙烷(双-三丙烷)、N,N-双-(2-羟基乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、3-(N-吗啉)丙烷磺酸(MOPS)、3-[N-双(羟基乙基)-氨基]-2-羟基丙烷磺酸(DIPSO)、3-[N-(三-羟基甲基)甲基氨基]-2-羟基丙烷磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N′双-(2-羟基丙烷)磺酸(POPSO)、N-羟基乙基哌嗪-N′-2-羟基丙烷磺酸(HEPPSO)、N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-氨基丙烷磺酸(EPPS)、N,N-双-(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)、3-N-(α,α-二甲基羟乙基)-氨基-2-羟基丙烷磺酸(AMPSO)和3-N-环己基氨基磺酸(CAPSO)。
在一些情况中，所述溶液的pH是约6～约8.5。在一些情况中，所述包含RNA的溶液的pH是约6.5～约8。在一些情况中，所述包含RNA的溶液的pH是约7～约8。在一些情况中，所述包含RNA的溶液的pH是或约是6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4，或8.5。在一些情况中，所述包含RNA的溶液的pH具有使磷酸盐或酯离子、钙离子或钙磷酸盐或酯(若存在)消除或最小化的pH。
在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约0.1mM～约500mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约0.5mM～约250mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约0.5mM～约100mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约0.5mM～约50mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约0.5mM～约25mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约0.5mM～约15mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物具有约或至少约0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、或22mM、23mM、24mM，或25mM的浓度。
在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物是钠或钾磷酸盐或酯(单碱、二碱或三碱)，具有0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM，或15mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物以硫酸盐的形式提供(例如，硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵)，具有1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、或22mM、23mM、24mM，或25mM的浓度。在一些实施方式中，所述含磷或含硫化合物是β-磷酸甘油，具有1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、或22mM、23mM、24mM，或25mM的浓度。
包含RNA的溶液包含二价阳离子。在一些情况中，所述二价阳离子是二价镁阳离子。在一些情况中，所述二价阳离子是钙二价阳离子。在一些情况中，所述二价阳离子是锰二价阳离子。在一些情况中，所述二价阳离子可能是用于进行一种或多种酶促反应，包括但不限于DNA酶消化、逆转录、RNA:DNA杂合体中RNA的降解、第二链cDNA合成或核酸扩增的溶液所需的组分。在一些情况中，所述溶液包含两种或更多不同二价阳离子，例如镁和钙二价阳离子。
在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约10μM～约100mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约10μM～约50mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约10μM～约10mM的浓度。在一些情况中，所述RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约10μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约100μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约250μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约250μM～约5mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价钙阳离子，具有约0.5mM～约5mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价钙阳离子，具有是或约是0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.075mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、或22mM、23mM、24mM，或25mM的浓度。
在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约10μM～约100mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约10μM～约50mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约10μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约100μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约250μM～约10mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约250μM～约5mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价镁阳离子，具有约0.5mM～约5mM的浓度。在一些实施方式中，所述RNA溶液包含二价镁阳离子，具有是或约是0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.075mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、或22mM、23mM、24mM，或25mM的浓度。
在一些实施方式中，包含RNA的溶液包含具有10μM～0.5mM、10μM～1mM、10μM～2mM、10μM～3mM、10μM～4mM、或10μM～5mM的浓度的钙二价阳离子，和具有0.1mM～2.5mM、0.1mM～5mM、0.1mM～10mM、0.1mM～15mM、0.1mM～20mM、0.1mM～30mM、0.1mM～50mM、0.01～10mM、0.01～15mM、0.01mM～20mM、0.01mM～30mM，或0.01mM～50mM的浓度的镁二价阳离子。在一些情况中，包含RNA的溶液包含0.1mM～1mM浓度的钙二价阳离子和0.5mM～5mM浓度的镁二价阳离子。在一些情况中，包含RNA的溶液包含约0.5mM浓度的钙二价阳离子和约2.5mM浓度的镁二价阳离子。
在一些实施方式中，所述包含RNA的溶液不含RNA酶，或基本不含RNA酶。
本文所述的组合物包括不同组分(例如，RNA、DNA、DNA酶、RNA酶H、逆转录酶、DNA依赖性聚合酶、含磷或含硫化合物、引物、探针和阳离子)，参数(例如，时间、温度、量和浓度)，和条件(例如，无RNA酶、不含宿主细胞蛋白质、外源的、重组的、异源的、消化的和保护不受降解)的多种排列。所述组合物包括本文所述组分、参数或条件的任何组合。
通过引用将本文引用的所有专利、专利申请和其它公开文献包括GenBank登录号全文纳入本文用于所有目的。
实施例
仅以说明的形式而非限制的形式提供以下实施例。本领域技术人员不难了解，可改变或调整各种非关键参数而获得基本相同或相似的结果。
实施例1：采用含磷化合物增加RNA稳定性
产生四个不同组的反应混合物，包含反应混合物的各组具有不同量的纯化的RNA(100,000；10,000；1,000；100；和10pg)(表1)。第一组反应混合物是包含水中的RNA的对照反应混合物(表1，栏2)。这些对照反应混合物在逆转录之前不在升高的温度孵育。在第二组中，DNA酶消化缓冲剂中的RNA在逆转录之前在75℃孵育5分钟(表1，栏3)。在第三组中，1mM的NaH2PO4添加至包含反应混合物的RNA和DNA酶消化缓冲剂，并且该混合物在逆转录之前在75℃孵育5分钟(表1，栏4)。在第四组中，5mM的NaH2PO4添加至包含反应混合物的RNA和DNA酶消化缓冲剂，并且该混合物在逆转录之前在75℃孵育5分钟(表1，栏5)。来自各组反应混合物的RNA用作RNA逆转录和定量PCR的模板以测定在其它情况下相同条件下获得的cDNA的量。结果示于表1。
表1.采用用指示温度和缓冲剂条件处理的RNA的RQ2试验的RT-qPCR结果。
如表1所示，含磷化合物(1mM或5mM NaH2PO4)的应用显著提高了热处理过程中RNA的稳定性。这一提高通过对照与升温的样品之间的Cq(ΔCq)相较于不具有含磷化合物的样品的ΔCq的小幅变化所指示。
实施例2：采用含硫化合物增加RNA稳定性
产生三个不同组的反应混合物，包含反应混合物的各组具有不同量的纯化的RNA(100,000；10,000；1,000；100；和10pg)(表2)。第一组反应混合物是包含水中的RNA的对照反应混合物(表2，栏2)。这些对照反应混合物在逆转录之前不在升高的温度孵育。在第二组中，DNA酶消化缓冲剂中的RNA在逆转录之前在75℃孵育5分钟(表2，栏3)。在第三组中，15mM的(NH4)2SO4添加至包含反应混合物的RNA和DNA酶消化缓冲剂，并且该混合物在逆转录之前在75℃孵育5分钟(表2，栏4)。来自各组反应混合物的RNA用作RNA逆转录和定量PCR的模板以测定在其它情况下相同条件下获得的cDNA的量。结果示于表2。
表2.采用用指示温度和缓冲剂条件处理的RNA的RQ2试验的RT-qPCR结果。
如表2所示，含硫化合物(15mM(NH4)2SO4)的应用显著提高了热处理过程中RNA的稳定性。这一提高通过对照和升温的样品之间的Cq(ΔCq)相较于不具有含硫化合物的样品的ΔCq的小幅变化而指示。
实施例3：采用含磷化合物增加RNA稳定性
产生四个不同的组的反应混合物，包含反应混合物的各组具有不同量的纯化的RNA(1,000,000；100,000；10,000；1,000；100；和10pg)和基因组DNA(300,000；10,000；1,000；100；10；1)如表3中所示。第一组反应混合物是包含水中的基因组DNA和RNA的对照反应混合物(表3，栏2)。这些对照反应混合物在逆转录之前不在升高的温度孵育。在第二组中，具有DNA酶的DNA酶消化缓冲剂中的基因组DNA和RNA在逆转录之前在75℃孵育5分钟(表3，栏3)。在第三组和第四组中，5mM和10mM的β-磷酸甘油添加至对应的反应混合物的组，并且所述混合物在逆转录之前在75℃孵育5分钟(表3，栏4和5)。来自各组反应混合物的RNA用作RNA逆转录和定量PCR的模板以测定在其它情况下相同条件下获得的cDNA的量。结果示于表3和图1A-C。
如表3所示，含磷化合物BGP的应用显著提高了热处理过程中的RNA的稳定性。这一提高通过对照和升温的样品之间的Cq(ΔCq)相较于不具有BGP样品的ΔCq的小幅变化而指示。
表3.采用用指示温度和缓冲剂条件处理的RNA的RQ2RNA质量试验的RT-qPCR结果。

Claims (71)

1.一种保护RNA不在溶液中降解的方法，所述方法包括：
-提供溶液，其包含：i.水；ii.RNA；iii.二价阳离子；和iv.含磷或含硫化合物；和
-在至少25℃、37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所述溶液，其中，所述RNA相较于包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA而被保护不受降解。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述提供包括从细胞或组织纯化RNA。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述纯化的RNA不含来自细胞或组织的内源性宿主蛋白质。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述RNA浓度为0.1pg/mL～500μg/mL。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述溶液还包含DNA酶。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述DNA酶浓度为0.01U/μL～0.2U/μL。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述RNA来自细胞或组织，并且所述DNA酶对于衍生所述RNA的细胞或组织是外源的。
8.如权利要求5所述的方法，其中，所述DNA酶是重组DNA酶。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述重组DNA酶是牛胰DNA酶I。
10.如权利要求5所述的方法，其中，在至少37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所述溶液之前，所述方法包括在适于进行DNA酶反应的条件下孵育所述溶液。
11.如权利要求10所述的方法，其中，在适于进行DNA酶反应的条件下孵育所述溶液之前，所述溶液包含DNA，并且所述DNA酶反应降解所述DNA。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述溶液中DNA的质量是所述溶液中RNA的质量的30％或更少。
13.如权利要求11所述的方法，其中，在所述DNA酶反应进行之前，所述溶液中的DNA的浓度低于50ng/μL。
14.如权利要求11所述的方法，其中，所述DNA是基因组DNA。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述基因组DNA源自细胞或组织，并且所述RNA源自相同细胞或组织。
16.如权利要求5所述的方法，其中，所述方法包括在至少55℃、58℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所述溶液，并且，所述在至少55℃、58℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所述溶液使所述DNA酶失活。
17.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，在至少55℃、58℃、60℃、65℃、70℃或75℃的温度孵育所述溶液之后，所述方法包括对所述溶液中的RNA定量。
18.如权利要求17所述的方法，其中，相较于对包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA的定量，所述方法提供更高的定量准确性。
19.如权利要求17所述的方法，其中，所述定量包括使所述RNA或其部分与逆转录酶接触，由此将所述RNA或其部分逆转录成cDNA。
20.如权利要求19所述的方法，其中，在所述逆转录期间或之后，所述RNA被RNA酶H降解。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述RNA酶H是将所述RNA或其部分转录成cDNA的逆转录酶。
22.如权利要求20所述的方法，其中，所述RNA酶H是与将所述RNA或其部分转录成cDNA的逆转录酶结构不同的酶。
23.如权利要求19所述的方法，其中，在使所述RNA或其部分与逆转录酶接触之前，所述溶液不含RNA酶。
24.如权利要求19所述的方法，其中，在所述逆转录之后，所述方法还包括扩增逆转录的cDNA的至少部分。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述方法还包括实时监测所述扩增反应。
26.如权利要求1所述的方法，其中，所述含磷或含硫化合物选自下组：磷酸盐或酯、磷酸甘油、磷酸葡糖、磷酸核糖、焦磷酸盐或酯，和多磷酸盐或酯。
27.如权利要求1所述的方法，其中，所述含磷或含硫化合物是硫酸盐或酯。
28.如权利要求1所述的方法，其中，所述含磷或含硫化合物浓度为0.1mM～500mM。
29.如权利要求1所述的方法，其中，所述含磷或含硫化合物浓度为10或15mM。
30.如权利要求1所述的方法，其中，所述含磷或含硫化合物浓度为5mM。
31.如权利要求1所述的方法，其中，所述二价阳离子是二价钙阳离子。
32.如权利要求31所述的方法，其中，所述钙的浓度为10μM～1mM。
33.如权利要求1所述的方法，其中，所述二价阳离子是镁阳离子。
34.如权利要求33所述的方法，其中，所述镁的浓度为0.1mM～10mM。
35.如权利要求1所述的方法，其中，所述溶液包含两种化学上不同的二价阳离子。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述两种化学上不同的二价阳离子是镁阳离子和钙阳离子。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述钙的浓度为10μM～1mM并且所述镁的浓度为0.1mM～10mM。
38.一种水性溶液，其包含：i.水；ii.RNA；iii.二价阳离子；和iv.含磷或含硫化合物，其中，所述RNA相较于包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA而被保护不受降解。
39.如权利要求38所述的溶液，其中，所述溶液与所述RNA向cDNA的逆转录相容。
40.如权利要求38所述的溶液，其中，相较于包含二价阳离子但不包含所述含磷或含硫化合物的水性溶液中的RNA，所述溶液经设置以提供对所述溶液中的RNA的浓度的更准确的定量。
41.如权利要求38所述的溶液，其中，所述RNA的浓度为0.1pg/mL～500μg/mL。
42.如权利要求38所述的溶液，其中，所述RNA纯化自细胞或组织。
43.如权利要求42所述的溶液，其中，所述纯化的RNA不含来自细胞或组织的内源性宿主蛋白质。
44.如权利要求38所述的溶液，其中，所述溶液还包含DNA酶。
45.如权利要求44所述的溶液，其中，所述DNA酶浓度为0.01U/μL～0.2U/μL。
46.如权利要求44所述的溶液，其中，所述RNA来自细胞或组织，并且所述DNA酶对于衍生所述RNA的细胞或组织是外源的。
47.如权利要求44所述的溶液，其中，所述DNA酶是重组DNA酶。
48.如权利要求47所述的溶液，其中，所述重组DNA酶是牛胰DNA酶I。
49.如权利要求44所述的溶液，其中，所述DNA酶是热失活的DNA酶。
50.如权利要求38所述的溶液，其中，所述溶液还包含DNA。
51.如权利要求50所述的溶液，其中，所述DNA是基因组DNA。
52.如权利要求50所述的溶液，其中，所述DNA是经DNA酶消化的。
53.如权利要求50所述的溶液，其中，所述溶液中DNA的质量是所述溶液中RNA的质量的30％或更少。
54.如权利要求50所述的溶液，其中，所述溶液中的DNA的浓度低于50ng/μL。
55.如权利要求50所述的溶液，其中，所述基因组DNA源自细胞或组织，并且所述RNA源自相同细胞或组织。
56.如权利要求38所述的溶液，其中，所述溶液的温度为至少25℃、37℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃。
57.如权利要求38所述的溶液，其中，所述溶液还包含寡核苷酸核酸扩增引物和dNTP。
58.如权利要求38所述的溶液，其中，所述溶液还包含逆转录酶。
59.如权利要求38所述的溶液，其中，所述溶液还包含DNA依赖性DNA聚合酶。
60.如权利要求38所述的溶液，其中，所述含磷或含硫化合物选自下组：磷酸盐或酯、磷酸甘油、磷酸葡糖、磷酸核糖、焦磷酸盐或酯，和多磷酸盐或酯。
61.如权利要求38所述的溶液，其中，所述含磷或含硫化合物是硫酸盐或酯。
62.如权利要求38所述的溶液，其中，所述含磷或含硫化合物的浓度为0.1mM～500mM。
63.如权利要求38所述的溶液，其中，所述含磷或含硫化合物的浓度为5mM。
64.如权利要求38所述的溶液，其中，所述二价阳离子是钙阳离子。
65.如权利要求64所述的溶液，其中，所述钙具有10μM～1mM的浓度。
66.如权利要求38所述的溶液，其中，所述二价阳离子是镁阳离子。
67.如权利要求66所述的溶液，其中，所述镁的浓度为0.1mM～10mM。
68.如权利要求38所述的溶液，其中，所述溶液包含两种化学上不同的二价阳离子。
69.如权利要求68所述的溶液，其中，所述两种化学上不同的二价阳离子是镁阳离子和钙阳离子。
70.如权利要求69所述的溶液，其中，所述钙的浓度为10μM～1mM并且所述镁的浓度为0.1mM～10mM。
71.如权利要求38所述的溶液，其中，所述溶液不含RNA酶。
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WO2022000753A1 (zh) * 2020-06-28 2022-01-06 温州医科大学附属眼视光医院 一种防止rna降解的保护方法、保护序列、组合物和试剂盒及其应用

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