KR20210029845A - 리가제-연관 핵산 원형화 및 증폭 - Google Patents

Abstract

임의의 중간 정제 단계 없이 선형 DNA로부터 단일 반응 용기 내에서 단일 가닥 DNA 환을 생성하고 증폭하는 방법이 본원에 제공된다. 단일 가닥 DNA 환은 주형-비의존성 단일 가닥 DNA 라이게이션을 통해 생성된다. 혈액으로부터 추출된 순환 핵산의 전체-게놈 증폭법이 제공된다. 개시된 방법을 수행하기 위한 키트도 또한 제공된다.

Description

리가제-연관 핵산 원형화 및 증폭{LIGASE-ASSISTED NUCLEIC ACID CIRCULARIZATION AND AMPLIFICATION}

본 발명은 일반적으로, 주형-비의존성 단일 가닥 DNA 라이게이션을 통한 단일 가닥 또는 이중 가닥 선형 DNA로부터 단일 가닥 DNA 환(circle)의 생성에 관한 핵산 분석법에 관련된다. 이것은 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification)을 통한 단일 가닥 DNA 환의 증폭 및/또는 검출에 추가로 관련된다. 단일 가닥 DNA 환의 생성 및 후속 DNA 증폭은 임의의 중간 단리 및/또는 정제 단계 없이 단일 반응 용기에서 수행된다. 방법을 수행하기 위한 키트도 또한 제공된다.

DNA 증폭은 표적 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 복제하여 그의 복수의 복사체를 생성하는 과정이다. dsDNA의 개별 가닥은 역평행이고 상보적이기 때문에, 각 가닥은 그의 상보적 가닥의 생성을 위한 주형 가닥으로 기능할 수 있다. 주형 가닥은 전체로 또는 말단절단 부분으로 보존되고, 상보적 가닥은 DNA 폴리머라제에 의해 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP)로부터 조립된다. 상보적 가닥 합성은 주형 가닥에 혼성화되는 프라이머 서열의 3' 말단에서부터 시작하여 5'→3' 방향으로 진행된다.

전체 게놈 증폭(WGA)은 표적 DNA의 비-특이적 증폭에 관련된다. WGA는 가닥 분리(strand displacing) 활성을 갖는 높은 정확도의 DNA 폴리머라제(예컨대, Phi29 폴리머라제)와 함께 표적 DNA의 복수의 위치에서 DNA 합성을 프라이밍하기 위한 랜덤 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 다중 분리 증폭(MDA) 기법에 의해 흔히 달성된다. 게놈이파이(GenomiPhi)(지이 헬스케어(GE Healthcare), 미국) 및 레플리G(RepliG)(퀴아젠(Qiagen)) 키트와 같은 현재 시판되는 WGA 시스템이 고분자량 표적 DNA에서 최적의 결과를 제공하지만, 이들 시스템의 성능은 표적 DNA가 짧고 및/또는 매우 단편화될 경우에는 열악하다. 표적 DNA가 단편화되고 서열 길이가 약 1000 뉴클레오티드 미만인 경우, 종래 방법을 사용하는 표적 DNA의 증폭은 감소된 증폭 속도, 특히 표적 DNA의 말단 근처에서 상당한 서열 탈락(dropout), 및 매우 서열-편향된 증폭을 야기한다. 주형 DNA의 길이가 감소함에 따라, 그 가닥이 여러 번 프라이밍될 가능성은 MDA 반응에서 감소한다. 이것은 이들보다 짧은 단편의 증폭 가능성을 감소시킨다. 따라서, 짧고 단편화된 DNA의 비-특이적 증폭을 위한 효율적인 방법이 매우 필요하다.

라이게이션-매개된 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 단편화된 dsDNA를 증폭하기 위해 사용되었다. 그러나, 오직 소분획의 단편화된 DNA만이 이들 반응에서 증폭되어 부적절한 게놈 커버리지를 야기한다. 단편화된 표적 dsDNA를 효율적으로 증폭하기 위해, 이들은 먼저 수선되고, 그 다음 평활 말단 라이게이션에 의해 콘카테머화(concatamerized)되어 1000 염기쌍(bp) 초과의 서열을 생성할 수 있다. 그러나, 흔히 상대적으로 더 고농도의 표적 DNA가 콘카테머화 및 후속 증폭을 촉진하기 위해 필요하다. 이중 가닥 표적 DNA의 원형화는 MDA, WGA, 과분지 롤링 서클 증폭(RCA) 및 초병렬 DNA 서열분석을 포함한 다양한 핵산 기반 분석법에도 또한 이용되었다. 단편화된 dsDNA를 효과적으로 원형화하고 증폭하기 위해, 단편화된 DNA의 이중 가닥 말단은 먼저 수선되고, 이후 평활 말단 라이게이션되어 이중 가닥 DNA 환을 형성한다. 그러나, 500 bp 미만의 길이의 이중 가닥 DNA 단편을 원형화하는 것은 힘들다.

이중 가닥 DNA는 변성되어 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 생성할 수 있고, 이는 리가제를 사용한 주형-의존성 분자내 라이게이션 반응으로 추가적으로 원형화될 수 있다. 그러나, 표적 DNA의 사전 서열 정보가 주형-의존성 원형화를 수행하기 위해 필요하다. ssDNA의 주형-비의존성 분자내 라이게이션도 또한 보고되었다. 예컨대, TS2126 RNA 리가제(상표명 써모파지(ThermoPhage)^TM RNA 리가제 II 또는 써모파지^TM ssDNA 리가제(프로캐리아(Prokaria), 아이슬란드 매티스) 또는 서크리가제(CircLigase)^TM ssDNA 리가제(에피센터 바이오테크놀로지스(Epicenter Biotechnologies), 미국 위스콘신주)가 디지털 DNA 볼을 만들고, 및/또는 게놈 DNA와 같은 DNA의 위치-특이적 절단 및 증폭을 위해 사용되었다. mRNA의 5'-말단 단편으로부터 제조된 선형 단일 가닥 상보적 DNA(cDNA) 분자도 또한 TS2126 RNA 리가제를 사용한 원형화 후 롤링 서클 복제를 통해 증폭되었다. cDNA에 센스 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 적절히 도입함으로써, 원형화된 cDNA 주형은 전사 기질로서 작용하는 것으로 나타났고, 따라서 생물학적 샘플 내 mRNA 분자의 증폭을 일으킨다. 또한, TS2126 RNA 리가제는 cDNA 말단의 랜덤 증폭(RACE)를 위한 cDNA 말단을 증폭하기 위해 사용되었다. 제한된 양의 단편화된 DNA로부터, 롤링 서클 증폭을 위한 DNA 주형이 TS2126 RNA 리가제를 이용함으로써 또한 생성되었다. 방법은 선형, 단편화된 dsDNA를 변성시켜 선형 ssDNA 단편을 얻고, 서크리가제^TM ssDNA 리가제로 선형 ssDNA를 라이게이션하여 단일 가닥 DNA 환을 얻고, 그 다음 RCA를 통해 랜덤 프라이머 및 Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 단일 가닥 DNA 환을 증폭시키는 것을 포함하였다. 그러나, 반응 조건을 최적화한 이후조차, 생성된 단일 가닥 원형 DNA의 양은 매우 가변적이고 서열 의존성이었다. 예컨대, 5'G 및 3'T 뉴클레오티드를 포함한 올리고뉴클레오티드는 동일한 라이게이션 조건 하에서 5'A 및 3'C를 포함한 그의 상보적 올리고뉴클레오티드보다 상당히 더 잘 라이게이션되었다. 또한, 분자내 라이게이션 효율은 동일하거나 매우 유사한 크기를 갖지만 뉴클레오티드 서열의 작은 차이를 갖는 선형 ssDNA 서열 중에서 가변적이었다. 효율은 상이한 크기(예컨대, 100 염기 내지 수천 염기 크기 범위의 서열 길이)의 선형 ssDNA 서열 중에서도 또한 가변적이었다. 더욱이, 라이게이션-증폭 반응의 모든 수행은 중간 단리, 정제 및/또는 세척 단계를 포함하였고, 따라서 라이게이션-증폭 워크플로우를 번잡하게 만들었다. 예컨대, 원형화 후 롤링 서클 증폭에 의한 단편화된 DNA의 포렌식(forensic) 샘플의 분석은 5' DNA 인산화, 어댑터 라이게이션, DNA 원형화, 및 전체-게놈 증폭을 포함하는 복수 단계로 수행되었다. 각 단계 반응은 다음 단계를 수행하기 전에 반응 세척작업을 받았다. 라이게이션과 증폭이 단일 반응 용기에서 수행될 경우, 어떠한 증폭의 이점도 관찰되지 않았다. 그러나, 복수 단계 과정은 흔히 주형 DNA의 손실을 야기하여 분석의 실패를 초래하였다. 따라서, 어떤 서열 편향도, 어떤 중간 세척 단계 없이 단일 반응 용기에서 짧은 DNA 서열을 비-특이적으로 증폭하기 위한 효율적인 방법이 매우 필요하다.

일부 실시양태에서, 선형 DNA로부터 단일 가닥 DNA 환을 생성하는 방법이 제공된다. 방법은 선형 DNA를 제공하는 단계, 포스페이트 공여자의 존재 하에서 폴리뉴클레오티드 키나제와 함께 선형 DNA를 인큐베이션함으로써 이를 말단-수선하여 5' 말단의 포스페이트 기와 3' 말단의 히드록실 기를 갖는 라이게이션 가능한 DNA 서열을 생성하는 단계, 및 단일 가닥 DNA 환을 생성하기 위해 리가제로 수선된, 라이게이션 가능한 DNA 서열의 분자내 라이게이션을 수행하는 단계를 포함한다. 방법의 모든 단계는 임의의 중간 단리 또는 정제 단계 없이 단일 반응 용기 내에서 수행된다. 포스페이트 공여자는 구아노신 트리포스페이트(GTP), 시티딘 트리포스페이트(CTP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP) 또는 그의 조합일 수 있다. 선형 DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA일 수 있다. DNA는 순환 DNA와 같은 단편화된 DNA일 수 있다. 라이게이션 가능한 DNA는, 이중 가닥 형태로 존재한다면, 분자내 라이게이션 반응 이전에 변성될 필요가 있다. 단일 가닥 DNA 서열의 주형-비의존성, 분자내 라이게이션이 가능한 미리-아데닐화된 리가제가 라이게이션 반응을 위해 이용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 분자내 라이게이션 단계 이전에 DNA 미리-아데닐화 단계를 이용하는, 선형 DNA로부터 단일 가닥 DNA 환을 생성하는 방법이 제공된다. 선형 DNA는 임의적으로, 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 존재 하에서 폴리뉴클레오티드 키나제와 함께 인큐베이션되어 5' 말단에 포스페이트 기 및 3' 말단에 히드록실 기를 포함하는 라이게이션 가능한 DNA 서열을 생성할 수 있다. 선형 DNA로부터 라이게이션 가능한 DNA 서열의 생성은 선형 DNA가 매우 단편화된 형태로 존재한다면 선호될 수 있다. 그 다음, 선형 DNA 또는 라이게이션 가능한 DNA 서열은 ATP의 존재 하에서 아데닐화 효소와 함께 인큐베이션되어 5' 아데닐화된 DNA 서열을 생성한다. 그 다음, 5' 아데닐화된 DNA 서열은 5' 아데닐화된 DNA 서열의 주형-비의존성 분자내 라이게이션이 가능한 비-아데닐화된 리가제와 함께 인큐베이션되어 단일 가닥 DNA 환을 생성한다. 방법의 모든 단계는 임의의 중간 단리 또는 정제 단계 없이 단일 반응 용기 내에서 수행된다. ATP는, 비-아데닐화된 리가제가 ATP-의존성 리가제라면, 분자내 라이게이션 반응 이전에 (예컨대, 반응 혼합물을 포스파타제와 함께 처리함으로써) 반응 혼합물로부터 제거되어야 할 수 있다. 5' 아데닐화된 DNA가 이중 가닥 형태로 존재한다면, 이것은 분자내 라이게이션 반응 이전에 변성되어야 할 필요가 있다.

본 발명의 이들 및 다른 특징, 측면 및 이점은 하기 상세한 설명을 상응하는 도면을 참조로 하여 읽는다면 보다 잘 이해될 것이다.
도 1은 단편화된 dsDNA의 리가제 이용 전체-게놈 증폭의 실시양태의 개략도를 보여준다.
도 2는 건강한 개인의 혈장으로부터 단리된 순환 DNA의 크기 프로파일을 보여준다.
도 3은 상이한 리가제를 사용한 혈액으로부터 추출된 순환 DNA의 리가제 이용 전체-게놈 증폭을 보여준다.
도 4는 4 개의 상이한 CODIS 유전자좌의 민감하고 균형잡힌 DNA 증폭을 위한 리가제 이용 전체-게놈 증폭의 효율성을 보여준다.
도 5는 12 개의 상이한 CODIS 유전자좌의 민감하고 균형잡힌 DNA 증폭을 위한 리가제 이용 전체-게놈 증폭의 효율성을 보여준다.
도 6은 상이한 반응 및 완충제 조건에서의 리가제 이용 전체-게놈 증폭의 효율성을 보여준다.
도 7은 리가제 이용 전체-게놈 증폭에서 고분자량 게놈 DNA의 증폭의 억제를 보여준다.
도 8은 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용한 단편화된 DNA의 처리(예컨대, 말단-수선) 후 처리된 단편화된 DNA의 리가제 이용 증폭을 포함하는 리가제 이용 전체-게놈 증폭의 개략도를 보여준다.
도 9는 GTP의 존재 하에서 PNK 및 서크리가제 II^TM를 이용한 단편화된 DNA의 리가제 이용 증폭의 단일 튜브 반응의 개략도를 보여준다.
도 10은 DYS14 남성-특이적 표지가 투입 DNA로부터 생성된 라이브러리를 사용하여 검출되는 것인, 남성-여성 혈장/혈액을 사용한 단일 튜브 리가제 이용 증폭 반응을 보여준다.
도 11은 단편화된 DNA의 인산화 및 미리-아데닐화 후 실질적으로 비-아데닐화된 리가제를 사용한 라이게이션의 개략도를 보여준다.
도 12는 실질적으로 비-아데닐화된 리가제를 사용한 미리-아데닐화된 DNA 서열의 강화된 원형화 효율을 보여준다.
도 13은 표적 DNA 서열이 미리-아데닐화되고 라이게이션이 비-아데닐화된 리가제를 사용하여 수행되었을 경우의 리가제 이용 전체-게놈 증폭의 강화된 효율을 보여준다.

하기 상세한 설명은 예시적인 것으로 본 발명 또는 본 발명의 용도를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 명세서를 통틀어, 특정 용어의 사례는 비-제한적 예시로서 고려되어야 한다. 단수 형태는 맥락상 명시적으로 달리 언급되지 않는 한 복수의 지새 대상을 포함한다. 명세서 및 청구항을 통틀어 본원에 사용된 근사 용어는 관련된 기본적인 기능의 변화를 일으키지 않으면서 허용가능한 수준에서 달라질 수 있는 임의의 정량적 표현을 수정하는 것으로 적용될 수 있다. 따라서, "약"과 같은 용어에 의해 수정된 값은 명시된 정확한 값에 제한되지 않는다. 달리 표시되지 않는 한, 명세서 및 청구항에서 제시된 사용된 분자량, 반응 조건과 같은 성분의 양, 특성을 표현하는 모든 수는 용어 "약"에 의해 모든 경우에서 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 표시되지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구항에서, 제시된 수 파라미터는 본 발명에 의해 얻어지는 것으로 이해되는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있다. 적어도, 그리고 청구 범위에 대한 균등론의 적용을 제한하지 않는 한, 각 수 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수의 측면에서 그리고 통상적인 반올림 기법을 적용함으로써 이해되어야 한다. 필요할 경우, 범위가 제시되었고, 이들 범위는 그 안의 모든 하위 범위를 포함한다. 청구된 발명의 주제를 보다 분명하고 정확하게 기재하고 설명하기 위해, 하기 기재 및 첨부된 청구항에서 사용된 특정 용어에 대해 하기 정의가 제공된다.

본원에 사용된 용어 "뉴클레오시드"는 핵산 염기(핵염기)가 당 모이어티에 연결된 글리코실아민 화합물을 의미한다. "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드 포스페이트를 의미한다. 뉴클레오티드는 표 1에 기재된 것과 같이, 그의 뉴클레오시드에 상응하는 알파벳 문자(문자 명칭)를 사용하여 표시될 수 있다. 예컨대, A는 아데노신(아데닌 핵염기를 함유하는 뉴클레오시드)을 지칭하고, C는 시티딘을 지칭하고, G는 구아노신을 지칭하고, U는 우리딘을 지칭하고, T는 티미딘(5-메틸 우리딘)을 지칭한다. W는 A 또는 T/U를 지칭하고, S는 G 또는 C를 지칭한다. N은 랜덤한 뉴클레오시드를 표시하고, dNTP는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 의미한다. N은 A, C, G, 또는 T/U 중 어떤 것도 될 수 있다.

<표 1: 다양한 뉴클레오티드의 문자 명칭>

본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드 유사체"는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 구조적으로 유사한 화합물을 의미한다. 뉴클레오티드 유사체는 변경된 포스페이트 골격, 당 모이어티, 핵염기, 또는 그의 조합을 가질 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 천연 뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드, 개질된 뉴클레오티드, 대용가능한 대체 모이어티(예컨대, 이노신)일 수 있다. 일반적으로, 그 중에서도 변경된 핵염기를 갖는 뉴클레오티드 유사체는 상이한 염기쌍 및 염기 중첩 특성을 부여한다. 본원에 사용된 용어 "LNA(Locked Nucleic Acid: 고정된 핵산) 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 당 모이어티가 리보핵산(RNA) 모방성 당 구조로 고정된 비시클릭 푸라노스 단위체를 함유하는 것인 뉴클레오티드 유사체를 의미한다. 데옥시리보핵산(또는 리보핵산)에서 LNA 뉴클레오티드로의 구조적 변화는 화학적 관점, 즉 2' 위치 및 4' 위치의 탄소 원자 사이의 부가적 연결부의 도입(예컨대, 2'-C, 4'-C-옥시메틸렌 연결부; 예컨대, Singh, S. K., et al., Chem. Comm., 4, 455-456, 1998, 또는 Koshkin, A. A., et al., Tetrahedron, 54, 3607-3630, 1998. 참조) 때문에 제한된다. LNA 뉴클레오티드의 푸라노스 단위체의 2' 및 4' 위치는 O-메틸렌(예컨대, 옥시-LNA: 2'-O, 4'-C-메틸렌-β-D-리보프라노실 뉴클레오티드), S-메틸렌(티오-LNA), 또는 NH-메틸렌 모이어티(아미노-LNA) 등에 의해 연결될 수 있다. 이러한 연결부는 푸라노스 고리의 구조적 자유도(conformational freedom)를 제한한다. LNA 올리고뉴클레오티드는 상보적 단일 가닥 RNA, 및 상보적 단일 및 이중 가닥 DNA에 대한 강화된 혼성화 친화도를 나타낸다. LNA 올리고뉴클레오티드는 A-유형(RNA-유사) 듀플렉스 구조를 유도할 수 있다. 변경된 포스페이트-당 골격(예컨대, PNA, LNA)을 갖는 뉴클레오티드 유사체는 그 중에서도 이차 구조 형성과 같은 쇄 특성을 흔히 개질한다. 문자 칭호 앞의 별(*) 기호는 그 문자에 의해 표시된 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 개질된 뉴클레오티드임을 지칭한다. 예컨대, *N은 포스포로티오에이트 개질된 랜덤 뉴클레오티드를 표시한다. 문자 칭호 앞의 플러스(+) 기호는 그 문자에 의해 표시된 뉴클레오티드가 LNA 뉴클레오티드임을 지칭한다. 예컨대, +A는 아데노신 LNA 뉴클레오티드를 표시하고, +N은 잠금 랜덤 뉴클레오티드(즉, 랜덤 LNA 뉴클레오티드)를 표시한다.

본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 올리고머를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "서열"은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 명세서를 통틀어, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 문자의 서열에 의해 표시될 때마다, 뉴클레오티드는 좌에서 우로 5'→3' 순서이다. 예컨대, 문자 서열 (W)_x(N)_y(S)_z, (여기서, x=2, y=3 및 z=1)에 의해 표시되는 올리고뉴클레오티드는 W가 5' 말단 뉴클레오티드이고 S가 3' 말단 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 서열 WWNNNS을 표시한다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA, RNA, 또는 그의 유사체(예컨대, 포스포로티오에이트 유사체)일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 개질된 염기 및/또는 골격(예컨대, 개질된 포스페이트 연결부 또는 개질된 당 모이어티)도 또한 포함할 수 있다. 핵산에 안정성 및/또는 다른 이점을 부여하는 합성 골격의 비-제한적 예시는 포스포로티오에이트 연결부, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 자일로스 핵산, 또는 그의 유사체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "프라이머"는 핵산 합성 반응을 프라이밍하기 위한 표적 핵산 서열(예컨대, 증폭될 DNA 주형)에 혼성화되는 짧은 선형 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드, 또는 키메라 서열일 수 있다. 프라이머는 천연, 합성, 또는 개질된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 프라이머 길이의 상한 및 하한 둘 모두는 실험적으로 결정된다. 프라이머 길이의 하한은 핵산 증폭 반응 조건에서 표적 핵산과의 혼성화 후 안정한 듀플렉스를 형성하는데 필요한 최소 길이이다. 매우 짧은 프라이머(흔히 3 개 뉴클레오티드 미만 길이)는 이러한 혼성화 조건 하에서 표적 핵산과의 열열학적으로 안정한 듀플렉스를 형성하지 않는다. 상한은 표적 핵산에서 미리 결정된 핵산 서열 이외의 영역에서 듀플렉스 형성을 가질 수 있는 가능성에 의해 보통 결정된다. 일반적으로, 적합한 프라이머 길이는 약 3 개 뉴클레오티드 길이 내지 약 40 개 뉴클레오티드 길이의 범위에 있다.

본원에 사용된 용어 "랜덤 프라이머"는 주어진 위치가 임의의 가능한 뉴클레오티드 또는 그의 유사체로 구성될 수 있는 방식의 올리고뉴클레오티드 서열의 임의의 주어진 위치에서 뉴클레오티드를 랜덤화함으로써(완전한 랜덤화) 생성된 프라이머 서열의 혼합물을 의미한다. 따라서, 랜덤 프라이머는 서열 내의 뉴클레오티드의 모든 가능한 조합으로 구성된 올리고뉴클레오티드 서열의 랜덤 혼합물이다. 예컨대, 육량체 랜덤 프라이머는 서열 NNNNNN 또는 (N)₆으로 표시될 수 있다. 육량체 랜덤 DNA 프라이머는 4 개의 DNA 뉴클레오티드, A, C, G, 및 T의 모든 가능한 육량체 조합으로 구성되어, 4⁶ (4,096) 개의 고유한 육량체 DNA 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 랜덤 혼합물을 생성한다. 랜덤 프라이머는 표적 핵산의 서열이 미지이거나 전체-게놈 증폭 반응에서 핵산 합성 반응을 프라이밍하기 위해 효과적으로 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "부분적으로 제한된 프라이머"는 올리고뉴클레오티드 서열의 일부 뉴클레오티드를 완전히 랜덤화하면서(즉, 뉴클레오티드가 A, T/U, C, G, 또는 그의 유사체 중 임의의 것일 수 있음), 일부 다른 뉴클레오티드의 완전한 랜덤화는 제약함으로써(즉, 특정 위치의 뉴클레오티드의 랜덤화가 A, T/U, C, G, 또는 그의 유사체의 가능한 조합보다 덜함) 생성된 프라이머 서열의 혼합물을 의미한다. 예컨대, WNNNNN으로 표시되는 부분적으로 제한된 DNA 육량체 프라이머는 혼합물 내 모든 서열의 5' 말단 뉴클레오티드가 A 또는 T인 프라이머 서열의 혼합물을 표시한다. 여기서, 5' 말단 뉴클레오티드는 완전한 랜덤 DNA 프라이머(NNNNNN)의 최대 네 가지 가능한 조합(A, T, G, 또는 C)과 반대로, 두 가지 가능한 조합(A 또는 T)으로 제한된다. 부분적으로 제한된 프라이머의 적합한 프라이머 길이는 약 3 개 뉴클레오티드 길이 내지 약 15 개 뉴클레오티드 길이의 범위 내에 있을 수 있다.

본원에 기재된 용어 "말단 미스매치 프라이머-이량체 구조를 갖는 부분적으로 제한된 프라이머"는 부분적으로 제한된 프라이머 중에서 두 개의 개별 프라이머 서열이 3 개 이상의 뉴클레오티드의 내부 상동성을 갖고 서로 분자간 혼성화되어 어떠한 외가닥 말단도 갖지 않는 프라이머-이량체 구조, 또는 단일 뉴클레오티드 염기 3' 외가닥 말단을 갖는 프라이머-이량체 구조, 또는 두 개의 뉴클레오티드 염기 3' 외가닥 말단을 갖는 프라이머-이량체 구조를 형성할 때, 프라이머-이량체 구조 내 양 3' 말단 뉴클레오티드 모두에서 뉴클레오티드 미스매치(즉, 뉴클레오티드가 염기쌍 형성하지 않음)가 존재하는 것인, 부분적으로 제한된 프라이머 서열을 의미한다. 예컨대, WNNNS에 의해 표시되는 부분적으로 제한된 오량체 프라이머는 분자간 혼성화되어 어떠한 외가닥 말단도 갖지 않는 프라이머-이량체 구조를 형성할 때 양 3' 말단 뉴클레오티드 모두에서 말단 미스매치를 제공한다. 프라이머-이량체 구조에서, 세 개의 뉴클레오티드의 내부 상동성이 존재한다(즉, WNNNS에서 세 개의 랜덤 뉴클레오티드가 어떠한 외가닥 말단도 갖지 않는 프라이머-이량체 구조가 분자간 혼성화에 의해 형성될 때 서로 염기쌍 형성할 수 있음). 그러나, 이 프라이머 예시는 분자간 혼성화되어 단일 뉴클레오티드 염기 3' 외가닥 말단을 갖는 프라이머-이량체 구조를 형성할 때 말단 미스매치를 제공하지 않는다. 유사하게, WWNNNS에 의해 표시되는 부분적으로 제한된 육량체 프라이머는 분자간 혼성화되어 어떠한 외가닥 말단도 갖지 않는 프라이머-이량체 구조를 형성할 때 양 3' 말단 뉴클레오티드 모두에서 말단 미스매치를 제공한다. 더욱이, 이 프라이머 예시는 분자간 혼성화되어 단일 뉴클레오티드 염기 3' 외가닥 말단을 갖는 프라이머-이량체 구조를 형성할 때조차 양 3' 말단 뉴클레오티드 모두에서 말단 미스매치를 제공한다. WWWNNNS에 의해 표시되는 부분적으로 제한된 칠량체 프라이머는 분자간 혼성화되어 어떠한 외가닥 말단도 갖지 않는 프라이머-이량체 구조를 형성할 때 양 3' 말단 뉴클레오티드 모두에서 말단 미스매치를 제공한다. 또한, 이 프라이머 예시는 분자간 혼성화되어 단일 뉴클레오티드 염기 3' 외가닥 말단을 갖는 프라이머-이량체 구조를 형성하거나, 또는 두 개의 뉴클레오티드 염기 3' 외가닥 말단을 갖는 프라이머-이량체 구조를 형성할 때, 양 3' 말단 뉴클레오티드 모두에서 말단 미스매치를 제공한다.

본원에 제공된 용어 "롤링 서클 증폭(RCA)"은 롤링 서클 메커니즘을 통한 원형 핵산 주형(예컨대, 단일 가닥 DNA 환)을 증폭하는 핵산 증폭 반응을 의미한다. 롤링 서클 증폭 반응은 원형의, 흔히 단일 가닥인 핵산 주형에 대한 프라이머의 혼성화에 의해 개시된다. 그 다음, 핵산 폴리머라제는 원형 핵산 주형 주위로 계속하여 진행함으로써 원형 핵산 주형에 혼성화된 프라이머를 확장하여 핵산 주형의 서열을 반복하여 복제한다(롤링 서클 메커니즘). 롤링 서클 증폭은 원형 핵산 주형 서열의 탠덤(tandem) 반복 유닛을 포함하는 콘카테머를 통상적으로 생성한다. 롤링 서클 증폭은 선형 증폭 동역학을 나타내는 선형 RCA(LRCA)(예컨대, 단일 특이적 프라이머를 사용한 RCA)일 수 있거나, 또는 지수형 증폭 동역학을 나타내는 지수형 RCA(ERCA)일 수 있다. 롤링 서클 증폭은 또한, 과분지된 콘카테머를 생성하도록 복수의 프라이머를 사용하여 수행될 수도 있다(복수회 프라이밍된 롤링 서클 증폭 또는 MPRCA). 예컨대, 이중 프라이밍된 RCA에서, 하나의 프라이머는 선형 RCA에서와 같이 원형 핵산 주형에 상보적일 수 있는 반면, 다른 프라이머는 RCA 생성물의 탠덤 반복 유닛 핵산 서열에 상보적일 수 있다. 결과적으로, 이중 프라이밍된 RCA는 양 프라이머 모두가 관련된 복수-혼성화, 프라이머-확장, 및 가닥-분리 현상의 분기화 케스케이드를 특징으로하는 지수형(기하적) 증폭 동역학을 갖는 연쇄 반응이 진행될 수 있다. 이것은 콘카테머형의 이중 가닥 핵산 증폭 생성물의 구분된 세트를 흔히 생성한다. 롤링 서클 증폭은 Phi29 DNA 폴리머라제와 같은 적합한 핵산 폴리머라제를 사용하여 등온 조건 하에서 시험관 내에서 수행될 수 있다.

본원에 사용된 전유전체 증폭(MDA)은 증폭이 변성된 핵산에 대한 프라이머를 어닐링하는 단계 후 가닥 분리 핵산의 합성 단계를 포함하는 것인 핵산 증폭 방법을 의미한다. 핵산은 가닥 분리에 의해 합성되므로, 프라이밍 현상이 점진적으로 증가하면서 발생하여, 과분지된 핵산 구조의 네트워크를 형성한다. MDA는 소량의 게놈 DNA 샘플로부터 제한된 서열 편향성을 갖는 고분자량 DNA를 생성하기 위한 전체-게놈 증폭에 매우 유용하다. Phi29 DNA 폴리머라제 또는 Bst DNA 폴리머라제의 큰 단편과 같은, 그의 핵산 합성 활성과 별개의 가닥 분리 활성을 갖는 임의의 가닥 분리 핵산 폴리머라제가 MDA에 사용될 수 있다. MDA는 제한된 서열 편향성을 갖는 증폭을 달성하기 위해 랜덤 프라이머를 사용하여, 등온 반응 조건 하에서 흔히 수행된다.

본원에 사용된 용어 "미리-아데닐화된 리가제"는 그의 아데닐화된 형태로 존재하는 리가제를 의미한다. 아데닐화된 형태의 리가제는 ATP 또는 dATP 없이 5' 포스포릴 기 및 3' 히드록실 기를 갖는 선형, ssDNA 분자의 분자내 라이게이션이 가능하다. 미리-아데닐화된 리가제를 사용하는 라이게이션은 반응에 사용되는 리가제 분자의 높은 비율이 그의 아데닐화된 형태로 존재하는 라이게이션 반응을 의미한다. 일반적으로 리가제 분자의 60% 초과는 그의 아데닐화된 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 라이게이션 반응이 미리-아데닐화된 리가제를 사용하여 수행될 때, 반응에 이용되는 리가제 분자의 70% 초과는 그의 아데닐화된 형태로 존재할 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 라이게이션 반응이 미리-아데닐화된 리가제를 사용하여 수행될 때, 반응에 이용된 리가제 분자의 80%, 90%, 또는 95% 초과는 그의 아데닐화된 형태로 존재할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "아데닐화 효소"는 핵산 서열을 아데닐화시켜 5' 아데닐화된 핵산을 생성할 수 있는 효소를 의미한다. 본원에 사용된 5' 아데닐화된 핵산은 그의 3' 말단에 히드록실 기를 갖고, 그의 5' 말단에 아데닐화된 말단 뉴클레오티드를 갖는 핵산 서열을 의미한다. 예컨대, 5' 아데닐화된 DNA(AppDNA)는 그의 5' 말단에서 아데닐화되고 그의 3' 말단에 히드록실 기를 갖는 DNA 서열을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "비-아데닐화된 리가제"는 그의 비-아데닐화된 형태로 존재하는 리가제를 의미한다. 비-아데닐화된 형태의 리가제는 ATP 또는 dATP가 없을 때 3' 히드록실 기를 갖는 선형, 5'-아데닐화된 ssDNA 분자의 분자내 라이게이션이 가능하다. 비-아데닐화된 리가제를 사용한 라이게이션은 반응에 사용된 리가제 분자의 높은 비율이 그의 비-아데닐화된 형태로 존재하는 라이게이션 반응을 의미한다. 일반적으로, 리가제 분자의 60% 초과는 그의 비-아데닐화된 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 라이게이션 반응이 비-아데닐화된 리가제를 사용하여 수행될 때, 반응에 이용되는 리가제 분자의 70% 초과는 그의 비-아데닐화된 형태로 존재할 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 라이게이션 반응이 비-아데닐화된 리가제를 사용하여 수행될 때, 반응에 이용된 리가제 분자의 80%, 90%, 또는 95% 초과는 그의 비-아데닐화되지 않은 형태로 존재할 수 있다.

일부 실시양태에서, 선형 DNA로부터 단일 가닥 DNA 환을 생성하는 방법이 제공된다. 선형 DNA는 단편화된 선형 DNA일 수 있다. 단편화된 DNA는 순환 DNA, 고대 DNA, 또는 환경 노출에 의해 분해된 DNA, 또는 포르말린으로 고정된 DNA일 수 있다. 단편화된 선형 DNA의 길이는 15 뉴클레오티드 내지 21000 뉴클레오티드의 범위에 있을 수 있다. 단편화된 선형 DNA는 라이게이션 가능하지 않은 말단을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 예컨대, 선형 DNA는 5' 히드록실 기 또는 3' 포스포릴 기, 또는 둘 모두를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 선형 DNA를 제공하는 단계, 이를 포스페이트 공여자의 존재 하에서 폴리뉴클레오티드 키나제(PNK)와 인큐베이션시켜 선형 DNA를 말단-수선하여 5' 말단에 포스페이트 기 및 3' 말단에 히드록실 기를 갖 라이게이션 가능한 DNA 서열을 생성하는 단계, 및 리가제에 의해 라이게이션 가능한 DNA 서열의 분자내 라이게이션을 수행하여 단일 가닥 DNA 환을 생성하는 단계를 포함한다. 말단 수선은 라이게이션 가능한 DNA 서열을 생성하기 위해 5' 말단 뉴클레오티드의 인산화, 3' 말단 뉴클레오티드의 탈인산화, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 말단-수선된 라이게이션 가능한 DNA는, 이중 가닥 형태로 존재한다면, 분자내 라이게이션 반응 이전에 변성될 필요가 있다. 일부 실시양태에서, DNA는 PNK 반응 이전에 변성된다. 단일 가닥 DNA의 인산화 또는 탈인산화는 일반적으로 이중 가닥 평활 말단 또는 5'-외가닥의 말단에서보다 더 효율적이다. 포스페이트 공여자 및 반응 혼합물 내 그의 농도는 후속 분자내 라이게이션 반응을 억제하지 않을 만큼 선택된다. 예컨대, 아데노신 트리포스페이트(ATP) 또는 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP) 이외의 임의의 적합한 포스페이트 공여자가 PNK를 사용한 말단-수선 반응을 위해 사용될 수 있다. 적합한 포스페이트 공여자는 구아노신 트리포스페이트(GTP), 시티딘 트리포스페이트(CTP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 또는 데옥시티민 트리포스페이트(dTTP)를 포함하지만 그에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 미리-아데닐화된 리가제가 라이게이션 반응을 위해 사용된다. 주형-비의존성, 단일 가닥 DNA 서열이 가능한 임의의 미리-아데닐화된 리가제가 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 아데닐화된 형태의 TS2126 RNA 리가제가 주형-비의존성 분자내 라이게이션 반응을 위해 사용된다. 키나제 반응 및 라이게이션 반응은 ATP 및/또는 dATP 없이 수행된다. 방법의 모든 단계는 임의의 중간 단리 또는 정제 단계 없이 단일 반응 용기 내에서 수행된다. 방법의 개별 단계는 임의의 중간 정제 또는 단리 단계 없이 동시에 또는 순차적 방식으로 수행될 수 있다. 예컨대, GTP가 갖춰진 PNK는 선형 표적 DNA를 포함하는 핵산 용액을 함유하는 반응 용기(예컨대, 에펜도르프 튜브)에 첨가되어 선형 표적 DNA의 말단 수선을 촉진시킬 수 있다. 5' 인산화 및 3' 포스파타제 활성을 갖는 임의의 PNK(예컨대, T4 PNK)가 말단-수선 반응을 위해 사용될 수 있다. 각각 5' 인산화 또는 3' 포스파타제를 갖는 PNK의 조합도 말단-수선 반응을 위해 또한 사용될 수 있다. 일단 키나제 반응이 완결되면, 미리-아데닐화된 리가제가 동일한 반응 용기에 첨가되어 분자내 라이게이션 반응을 촉진시킬 수 있다.

선형 DNA는 천연 또는 합성 기원의 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA일 수 있다. DNA는 생물학적 샘플(예컨대, 생물학적 대상체로부터 얻은 샘플)로부터 얻거나 또는 생체내 또는 시험관내 미지의 대상(예컨대, 포렌식 검사 도중 얻은 DNA)으로부터 발견될 수 있다. 예컨대, 이것은 체액(예컨대, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 모유, 뇌척수액, 흉수, 림프액, 눈물, 객담, 타액, 대변, 폐흡입액, 인후 또는 생식기 표본액), 기관, 조직, 세포 배양액, 세포 분획, 절편(예컨대, 기관 또는 조직의 절편 부분), 또는 생물학적 대생체로부터 또는 생물학적 대상체의 특정 영역(예컨대, 질환 세포, 또는 순환 종양 세포를 함유하는 영역)으로부터 단리된 세포로부터 얻을 수 있지만, 그에 제한되지 않는다. 표적 선형 DNA(즉, 관심있는 선형 DNA)를 함유하거나 함유하는 것으로 추측되는 생물학적 샘플은 진핵세포 기원, 원핵세포 기원, 바이러스 기원, 또는 박테리오파지 기원의 것일 수 있다. 예컨대, 표적 선형 DNA는 곤충, 원생동물, 조류, 어류, 파충류, 포유류(예컨대, 래트, 마우스, 소, 개, 기니 피그, 또는 토끼), 또는 영장류(예컨대, 침팬지 또는 인간)로부터 얻어질 수 있다. 선형 DNA는 게놈 DNA이거나 또는 cDNA(상보적 DNA)일 수 있다. cDNA는 역전사효소를 사용하여 RNA 주형(예컨대, mRNA, 리보좀 RNA)로부터 생성될 수 있다. 선형 DNA는 단편화된 DNA일 수 있고, 라이게이션 가능하지 않은 말단 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예컨대, 선형 DNA는 DNA 리가제가 분자내 라이게이션 반응을 수행할 수 없는, 5' 히드록실 기 및/또는 3' 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 선형 DNA는 용액 내에 분산될 수 있거나, 또는 블롯, 어세이, 어레이, 유리 슬라이드, 미세적정 플레이트, 또는 ELISA 플레이트와 같은 고체 지지체에 부동화될 수 있다. 예컨대, 선형 DNA는 프라이머를 통해 기질에 부동화될 수 있고, 그 다음 원형화되고 증폭될 수 있다.

선형 DNA가 이중 가닥 형태로 존재할 경우, 이것은 분자내 라이게이션 반응 이전에 단일 가닥 형태로 변성될 필요가 있다. 이것은 dsDNA에서 ssDNA 서열로의 전환하기 위한 관련분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예컨대, dsDNA는 열적으로 변성되거나, 화학적으로 변성되거나, 또는 열적이면서 화학적으로 변성될 수 있다. dsDNA는 dsDNA의 융점을 감소시키는 변성제(예컨대, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 포름아미드, 우레아, 또는 그의 조합)를 사용하여 화학적으로 변성될 수 있다. 변성제는 매 10% (vol./vol.)의 변성제가 반응 혼합물에 첨가될 때마다 5 ℃ 내지 6 ℃ 만큼의 융점을 감소시킬 수 있다. 변성제 또는 변성제의 조합(예컨대, 10% 글리세롤 및 6-7% 에틸렌 글리콜)은 반응 혼합물(vol./vol.)의 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%를 차지할 수 있다. 혼성화 강화성(stringency)을 감소시키는 염이 저온에서 dsDNA를 화학적으로 변성시키기 위해 저 농도로 반응 완충제에 포함될 수 있다. dsDNA는 예컨대, 95 ℃에서 dsDNA를 가열함으로써 열적으로 변성될 수 있다.

변성 단계 이후, 생성된 ssDNA는 주형 없이 ssDNA 기질의 분자내 라이게이션이 가능한 DNA 또는 RNA 리가제로 처리되어 단일 가닥 DNA 환을 형성할 수 있다. 라이게이션 반응을 위해 사용될 수 있는 적합한 리가제는 TS2126 RNA 리가제, T4 DNA 리가제, T3 DNA 리가제, 또는 이. 콜라이(E. coli) DNA 리가제를 포함하지만 그에 제한되지 않는다. 선형 단일 가닥 DNA 분자에서 단일 가닥 DNA 환으로의 전환은 T4 RNA 리가제와 같은 라이게이션 효소를 사용한 주형-의존성 분자내 라이게이션 반응을 통해 전통적으로 수행된다. 그러나, 단일 가닥 DNA 또는 단일 가닥 RNA의 주형-의존성 분자내 라이게이션은 특히 ssDNA 분자의 원형화가 미지의 서열 및/또는 크기의 ssDNA 분자의 집단에서 수행될 경우에는 오직 제한된 성공률만을 나타냈다. 박테리오파지 T4 RNA 리가제 I는 주형-비의존성 분자내 라이게이션 활성을 나타냈지만, 이 활성은 선형 ssDNA 분자로부터 원형 ssDNA 분자를 생성하기 위한 실용적 용도로는 너무나도 낮고 비효율적이다.

일부 실시양태에서, ssDNA에서 단일 가닥 DNA 환으로의 전환은 5' 포스포릴 및 3' 히드록실 기를 갖는 선형 ssDNA 및/또는 ssRNA 기질에 대한 양호한 주형-비의존성 분자내 라이게이션 활성을 갖는 열안정성 RNA 리가제에 의해 수행된다. 리가제는 실질적으로 미리-아데닐화된 형태로 존재할 수 있다. 예컨대, 호열성 박테리아인 써무스 스코토두크투스(Thermus scotoductus)를 감염시키는 써무스 박테리오파지 TS2126에서 유래된 TS2126 RNA 리가제가 단편화된 선형 ssDNA에서 원형 ssDNA로의 주형-비의존성 원형화를 위해 이용될 수 있다. TS2126 RNA 리가제는 T4 RNA 리가제와 같은 많은 중온성 RNA 리가제보다 더 열안정적이다(약 75 ℃ 이하에서 안정함). TS2126 RNA 리가제 활성을 위한 온도의 범위는 예컨대, 약 50 ℃ 내지 약 75 ℃로, 약 40 ℃보다 훨씬 더 클 수 있다. 이 때문에, TS2126 RNA 리가제는 더 고온에서 사용될 수 있고, 이는 ssDNA의 바람직하지 않은 이차 구조를 추가로 감소시킨다. 선형 ssDNA의 원형화는 TS2126 RNA 리가제 이외의 리가제에 의해, 또는 토포이소머라제와 같은 DNA 접합 활성을 갖는 임의의 다른 효소를 이용함으로써 또한 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편화된 단일 가닥 DNA 분자의 원형화는 선형 단편화된 ssDNA 분자를 원형화시키는 높은 주형-비의존성 리가제 활성을 갖는 호열성 고세균인 메타노박테리움 써모아우토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum)으로부터 유래된 RNA 리가제 1(Mth RNA 리가제)에 의해 달성된다.

일부 실시양태에서, TS2126 RNA 리가제에 의한 ssDNA의 원형화의 효율을 개선하는 방법이 제공된다. 라이게이션 반응을 위한 8.0의 pH를 갖는 HEPES 완충제의 사용은 라이게이션 효율을 증가시켰다. 주형-비의존성 ssDNA 라이게이션은 반응이 TRIS 완충제(예컨대, 서크리가제^TM II에 대해, 에피센터에 의해 제안된 10x 반응 완충제는 0.33 M TRIS-아세테이트(pH 7.5), 0.66 M 포타슘 아세테이트, 및 5 mM DTT을 포함함)에서 수행될 경우 비효율적이었다. 또한, 라이게이션 반응을 위한 핵심적 보조인자인 망간은 TRIS 존재시 알칼리 조건 하에서 신속하게 산화되어 침전물을 형성한다. Mn²⁺에서 Mn³⁺로의 공기 산화는 Mn³⁺ 이온에 강력하게 착물형성할 수 있는 음이온에 의해 촉진될 수 있다. 예컨대, 동일한 부피의 HCl로 적절히 조정된 pH를 갖는 0.2 몰/리터 TRIS 및 2 mmol/리터 MnC1₂가 혼합되었을 때, 색깔 변화가 pH 9.3(TRIS 염기 단독의 pH)에서 즉각적이었고; pH 8.5에서 약 3 분의 초기 시간 지연을 가졌고; 8.3 미만의 pH 값에서는 1 시간 내에 검출되지 않았다. 반응은 더 낮은 pH에서는 일어나지 않았음에도 불구하고, 더 높은 pH에서 관찰된 변화는 산을 첨가함으로써 회복되지 않았다. TRIS 완충제에서 망간의 신속한 산화 때문에, 분자내 라이게이션이 TRIS 완충제에서 수행될 경우 더 고농도의 망간이 라이게이션 반응을 위해 핵심적이다(예컨대, 2.5 mM의 최종 농도로의 MnCl₂의 첨가). 또한, 시간이 지남에 따라 망간 농도가 계속해서 감소됨에 따라 반응물 내 망간의 작업 농도를 정확하게 예측하는 것이 어려워진다. 더 고농도의 망간은 라이게이션 및 증폭이 단일 반응 용기 내에서 수행될 때 증폭 도중 폴리머라제의 더 높은 오류율을 발생시킬 수 있다. 라이게이션 반응에서 TRIS 완충제를 HEPES 완충제로 대체함으로써, 효과적인 분자내 라이게이션이 0.5 mM 미만의 망간 이온 농도로 달성될 수 있다. HEPES와 별개로, 임의의 다른 구드(Good)의 완충제(예컨대, Good, Norman et al. Biochemistry, 5 (2): 467-477, 1966; 및 Good, Norman et al., Methods Enzymol., 24: 53-68, 1972. 참조)가 분자내 라이게이션 반응을 위해 이용될 수 있다.

라이게이션 반응 혼합물 내의 ssDNA 환은 롤링 서클 증폭(RCA) 방법을 통해 등온 조건 하에서 증폭될 수 있다. DNA 폴리머라제, 프라이머, 및 dNTP를 포함하는 증폭 시약이 동일한 반응 용기에 첨가되어 증폭 반응 혼합물을 생산하고 RCA 반응을 개시할 수 있다. 증폭 반응 혼합물은 단일 가닥 DNA 결합 단백질 및/또는 적합한 증폭 반응 완충제와 같은 시약을 추가로 포함할 수 있다. ssDNA 환의 증폭은 라이게이션이 수행되는 동일한 반응 용기에서 수행된다. ssDNA 환의 단리 또는 정제 및/또는 리가제의 제거는 증폭 반응 이전에 필요하지 않다. 증폭된 DNA는 DNA 검출을 위해 현재 알려진 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다.

RCA는 Phi29 DNA 폴리머라제와 같은 관련분야에 공지된 임의의 DNA 폴리머라제를 사용하여 수행될 수 있다. 이는 랜덤 프라이머 혼합물을 사용하거나 특이적 프라이머를 사용함으로써 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 랜덤 프라이머가 RCA 반응을 위해 사용된다. 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체(예컨대, LNA 뉴클레오티드, 2-아미노-A, 또는 2-티오 T 개질체)를 포함하는 프라이머 서열도 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-저항성 프라이머(예컨대, 적절한 위치에 포스포로티오에이트 기를 포함하는 프라이머 서열)이 증폭 반응을 위해 이용될 수 있다(예컨대, NNNN*N*N). 일부 실시양태에서, RCA는 ssDNA 환을 랜덤 프라이머 혼합물을 포함하는 프라이머 용액과 접촉시켜 핵산 주형-프라이머 복합체를 형성하기; 핵산 주형-프라이머 복합체를 DNA 폴리머라제 및 데옥시리보핵산 트리포스페이트와 접촉시키기; 및 핵산 주형을 증폭시키기에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머 용액은 WWNNS와 같은 부분적으로 제한된 프라이머를 포함한다. 부분적으로 제한된 프라이머는 말단 미스매치 프라이머-이량체 구조를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 (W)_x(N)_y(S)_z(여기서, x, y, 및 z는 서로 독립적인 정수 값이고, x의 값은 2 또는 3이고, y의 값은 2, 3, 또는 4이고, z의 값은 1 또는 2임)로 구성된 부분적으로 제한된 프라이머가 RCA 반응을 위해 사용된다. 부분적으로 제한된 프라이머는 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개질된 뉴클레오티드를 포함하고, 말단 미스매치 프라이머-이량체 구조를 갖는 뉴클레아제-저항성, 부분적으로 제한된 프라이머가 RCA 반응을 위해 이용된다. 적합한 프라이머 서열은 +W+WNNS, W+W+NNS, +W+WNNNS, W+W+NNNS, W+W+NN*S, +W+WNN*S, W+W+NNN*S, +W+WNNN*S, W+W+N*N*S, +W+WN*N*S, W+W+NN*N*S, 또는 +W+WNN*N*S을 포함하지만 그에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, RCA 반응은 ssDNA 환을 말단 미스매치 프라이머-이량체 구조를 포함하는 부분적으로 제한된 프라이머 혼합물로 본질적으로 이루어진 프라이머 용액과 접촉시키기, 및 ssDNA 환을 증폭시키기에 의해 수행된다. 일부 다른 실시양태에서, RCA 반응은 ssDNA 환을 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 부분적으로 제한된 프라이머 혼합물로 본질적으로 이루어진 프라이머 용액과 접촉시키기, 및 ssDNA 환을 증폭시키기에 의해 수행된다. ssDNA 환의 RCA는 감소된 서열 탈락 및 감소된 증폭 편향성으로 다량의 DNA를 생산한다. ssDNA 라이게이션 및 증폭의 전체 과정은 임의의 중간 정제 또는 단리 단계 없이 단일 튜브에서 수행될 수 있다.

일부 실시양태에서, 전유전체 증폭(MDA)를 통한 제한된 양의 선형 단편화된 DNA의 증폭 방법이 제공된다. MDA의 종래 방법은, 선형 단편화된 DNA에서 수행될 경우, 감소된 증폭 속도 및 매우 서열-편향된 증폭을 야기한다. 더욱이, 상당한 서열 탈락이 특히 단편화된 DNA의 말단 근처에서 흔히 관찰된다. 이들 제한을 극복하기 위해, 단편화된 dsDNA가 먼저 ssDNA로 전환된다. 그 다음, ssDNA는 주형-비의존성 분자내 라이게이션 반응을 통해 단일 가닥, 원형 DNA(즉, DNA 환)으로 전환되어, 문제가 되는 DNA 말단을 제거한다. 심지어 500 bp보다 더 짧은 ssDNA 서열도 ssDNA의 주형-비의존성 분자내 라이게이션을 사용하여 원형화될 수 있다. 또한, ssDNA의 라이게이션이 주형-비의존성 방식으로 수행될 경우, 어떠한 표적 서열의 사전 지식도 DNA 환을 생성하기 위해 필요하지 않다. 원형화 이전에, 단편화된 DNA는 PNK로 처리되어 라이게이션 가능하지 않은 말단을 수선할 수 있다. 단편화된 ssDNA의 원형화 이후, MDA는 원형화된 DNA에서 수행될 수 있다. 증폭 반응은 롤링 서클 증폭(RCA) 방법을 이용하여 등온 조건 하에서 수행될 수 있다. RCA는 템플리파이(TempliPhi)^TM RCA 키트(지이 헬스케어)와 같은 시판되는 RCA 증폭 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 템플리파이^TM 롤링 서클 증폭은 보다 높은 민감도 및 증폭 균형을 제공하는 잠금 핵산을 함유하는 랜덤 프라이머를 이용한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-저항성 프라이머가 RCA 반응을 위해 사용된다. 본원에 개시된 방법은 증폭 민감도를 개선하고, 서열 탈락을 줄이며, 보다 균형잡힌 증폭을 가능하게 한다. 단일 가닥 단편화된 DNA의 주형-비의존성 원형화가 보다 저농도에서조차 더 짧은 서열에서 달성될 수 있기 때문에, 리가제 이용 전체 게놈 증폭이 매우 단편화된 DNA(예컨대, 혈장 내 순환 DNA)의 증폭을 위해 이용될 경우, 더 빠른 동역학 및 개선된 서열 커버리지를 갖는 보다 균형잡힌 DNA 증폭이 달성될 수 있다. 예컨대, ssDNA의 지속 길이는 ssDNA의 주형-비의존성 원형화에서 15 뉴클레오티드만큼 짧을 수 있다. 서크리가제^TM가 라이게이션 반응을 위해 이용될 경우, 표준 조건 하에서, 사실상 어떠한 선형 콘카테머 또는 원형 콘카테머도 생산되지 않는다. 또한, 원형화 및 증폭 반응 둘 모두가 임의의 중간 정제 또는 단리 단계 없이 단일 반응 용기 내에서 수행되어, 오염의 가능성을 줄이고 증폭 워크플로우를 단순화시킬 수 있다. 리가제 이용 전체 게놈 증폭 방법은 순환 혈장 DNA, 포르말린으로 고정된 파라핀 포매(FFPE) 샘플로부터 단리된 단편화된 DNA, 환경 조건에 노출된 포렌식 DNA 샘플, 또는 고대 DNA 샘플을 분석하기 위해 이용될 수 있지만, 그에 제한되지 않는다. 단순화된 라이브러리는 qPCR 또는 서열분석을 통한 증폭된 서열의 표적화된 검출을 위해 추가로 사용될 수 있다.

ssDNA 단편에서 DNA 환으로의 사전 라이게이션 후 롤링 서클 증폭을 포함하는 본원에 기재된 다양한 라이게이션 이용 전체 게놈 증폭 방법은 고 분자량 게놈 DNA에 비해 단편화된 DNA의 우선적인 증폭을 제공한다. 예컨대, 순환 DNA를 포함하는 혈장 시료는 정제 과정 도중 혈액 세포로부터 방출된 게놈 DNA에 흔히 오염될 수 있다. MDA를 통한 전체 게놈 증폭의 종래 방법은 순환 DNA 및 게놈 DNA 둘 모두를 증폭한다. 반면, 단편화된 순환 DNA 분자가 먼저 TS2126 RNA에 의해 원형화된 후 Phi29 DNA 폴리머라제를 이용한 RCA를 통해 원형화된 DNA 분자의 증폭이 수행될 경우, 순환 DNA는 고 분자량 게놈 DNA에 비해 우선적으로 증폭되었다. 게놈 DNA에 비해 단편화된 DNA의 이러한 우선적인 증폭은 진단학적으로 연관된 DNA가 다운스트림 분석을 위해 우선적으로 증폭될 수 있기 때문에, 진단적 응용에 특히 적합하다(실시예 4 참조). 또한, 리가제 이용 전체 게놈 증폭은 종래의 MDA 기반의 전체 게놈 증폭과 비교할 때 단편화된 DNA의 보다 강력한 증폭을 가능하게 한다.

도 1은 단편화된 dsDNA의 리가제 이용 전체 게놈 증폭의 실시양태의 개략도를 도시한다. 이중 가닥 DNA의 지속 길이는 훨씬 더 길고(~150 bp) 그의 내재적 강도는 500 bp 미만의 단편의 원형화를 매우 비효율적으로 만든다. 또한, 약 250 bp 범위의 작은 이중 가닥 단편화된 DNA 분자에서, 원형화는 말단이 적절한 정렬(~10.5 bp/회전)을 취하지 않는 이상 비효율적이다. 반면, 단일 가닥 단편화된 DNA의 원형화의 지속 길이는 이중 가닥 단편화된 DNA와 비교할 때 대략 15 뉴클레오티드로 매우 작다. 도 1에 도시된 것처럼, 리가제 이용 전체 게놈 증폭에서, 단편화된 dsDNA는 먼저 단일 가닥 DNA 환으로 전환된다. 이것은 95 ℃에서 충분한 기간 동안 단편화된 이중 가닥 DNA를 인큐베이션시켜 dsDNA를 단일 가닥으로 변성시킴으로써 달성될 수 있다. 그 다음, 단편화된 ssDNA는 단일 가닥 DNA 기질의 주형-비의존성, 분자내 라이게이션이 가능한 DNA 또는 RNA 리가제로 처리되어 단일 가닥 DNA 환을 생성한다. 분자내 라이게이션에 사용될 수 있는 리가제의 비-제한적 예시는 서크리가제^TM, T3 DNA 리가제, T4 RNA 리가제, Mth RNA 리가제(MthRnl1), 또는 이. 콜라이 리가제를 포함한다. DNA 폴리머라제, 랜덤 프라이머, 및 dNTP를 포함하는 증폭 시약이 그 다음 첨가되어 단일 가닥 DNA 환에서 RCA 반응을 개시한다. RCA를 이용한 이 리가제 이용 전체 게놈 증폭은 종래의 전체 게놈 증폭 방법과 반대로 서열 탈락 및 증폭 편향성이 감소된 다량의 DNA를 생산한다. 따라서, 이것은 심지어 매우 단편화된 DNA를 증폭하고 검출하기 위해 사용될 수 있다. 단일 가닥 DNA 환의 생성 및 RCA에 의한 그의 후속 증폭의 전체 과정은 임의의 중간 정제 단계 없이 단일 튜브에서 행해진다.

일부 실시양태에서, 라이게이션 가능하지 않은 DNA 말단을 수선하기 위한 단편화된 DNA의 처리를 포함하는 단편화된 DNA의 리가제 이용 전체 게놈 증폭을 위해 단일 튜브 워크플로우가 제공된다. 예컨대, 단편화된 단일 가닥 DNA가 5' 포스포릴 기 및 3' 히드록실 기를 함유하지 않는다면, 이것은 분자내 라이게이션 반응으로 라이게이션되지 않을 수 있다. 이러한 라이게이션 가능하지 않은 DNA 서열의 존재는 리가제 이용 전체 게놈 증폭에서 증폭 편향성을 야기할 수 있다. 예컨대, 도 8에 개략적으로 나타난 것처럼, 세포 사멸 동안 DNase II 소화작용에 의해 생성된 DNA 단편은 5' 히드록실 기, 3' 포스포릴 기를 함유할 수 있다. 5' 히드록실 기, 3' 포스포릴 기를 함유하는 이러한 이중 가닥 DNA 단편으로부터 기원한 단일 가닥 DNA 단편은 분자내 라이게이션 반응으로 원형화되지 않을 것이다. 따라서, DNase II 유형의 분해는 전체 게놈 증폭에서 과소 표시되기 쉽다. 일부 실시양태에서, 단편화된 DNA는 단편화된 DNA의 5' 히드록실 기를 인산화하고 및/또는 3' 포스포릴 기를 탈인산화하기 위해 키나제(예컨대, T4 폴리뉴클레오티드 키나제, TPK)로 처리된다. 반응에서 키나제의 포함은 5' 포스페이트를 함유하지 않은 집단에서 단편의 효율적인 원형화를 가능하게 한다. 키나제에 의해 단편화된 DNA의 5' 말단을 인산화한 후 단편화된 DNA를 증폭하면 보다 대표성을 갖는 라이브러리가 생성된다.

일부 실시양태에서, 단편화된 dsDNA의 인산화 수선은 T4 PNK 키나제를 사용하여 수행될 수 있다. 인산화 수선은 단편화된 dsDNA에서 또는 변성된 단편화된 ssDNA에서 수행될 수 있다. 인산화 수선이 dsDNA에서 수행된다면, 수선된 dsDNA는 그 다음 선형 ssDNA로 변성되고, 이는 서크리가제 II^TM(CLII로 축약함)를 사용하여 후속 원형화될 수 있다. 서크리가제 II^TM는 실질적으로 아데닐화된 형태의 TS2126 RNA 리가제를 포함한다. 서크리가제 II^TM에 의한 ssDNA의 주형-비의존성 분자내 라이게이션은 보다 고농도의 ATP 또는 dATP에 의해 억제된다. 그러나, 키나제에 의한 인산화 수선은 ATP의 존재를 흔히 필요로 한다. 또한, DNA를 손상시키지 않고 반응 혼합물로부터 ATP를 제거하는 것은 쉽지 않을 수 있다. 예컨대, ATP를 제거하기 위한 반응 혼합물의 포스파타제 처리는 (DNA가 예컨대, 미리-아데닐화에 의해 보호되지 않는 한) DNA의 탈인산화도 또한 초래고, 따라서 DNA 주형을 라이게이션 가능하지 않게 만들 것이다. 그 결과, 어떠한 중간 정제 또는 단리 단계도 없이 단일 튜브 내에서 단편화된 DNA의 인산화 및 ssDNA 환의 생성을 수행하는 것은 보통 어렵다. 본원에 제공된 방법은 키나제 반응 동안 ATP 대신 GTP, CTP, UTP 또는 dTTP를 이용한다. 서크리가제 II^TM는 GTP 또는 대안의 포스페이트 공여자(예컨대, CTP 또는 UTP)에 대해 더 내성을 갖기 때문에, 키나제 수선 단계 및 라이게이션 단계는 임의의 중간 정제 및/또는 단리 단계 없이 단일 반응 용기에서 수행될 수 있다. 키나제 반응 혼합물은 망간 염 및 베타인(쯔위터이온 트리메틸글리신)과 같은 부가적 시약을 추가로 포함할 수 있다. 일단 라이게이션되면, ssDNA 환은 증폭될 수 있다. 상대적으로 저농도의 GTP에서 라이게이션 및 증폭 반응을 수행함으로써, 본원에 기재된 단일 튜브 워크플로우는 효소 처리 사이의 간헐적인 세척 단계를 없애고 DNA 주형 손실을 최소화한다(키나제 수선, 라이게이션 및 증폭에 관한 단일 튜브 워크플로우의 개략도에 대한 도 9 참조).

일부 실시양태에서, 분자내 라이게이션 단계 이전에 DNA 미리-아데닐화 단계를 이용하는, 선형 DNA로부터 단일 가닥 DNA 환을 생성하기 위한 대안적 방법이 제공된다. 먼저, 선형 DNA가 ATP의 존재 하에서 폴리뉴클레오티드 키나제와 함께 인큐베이션되어 5' 말단에 포스페이트 기 및 3' 말단에 히드록실 기를 포함하는 라이게이션 가능한 DNA 서열을 생성할 수 있다. 그 다음, 라이게이션 가능한 DNA 서열은 아데노신 트리포스페이트의 존재 하에서 아데닐화 효소와 함께 인큐베이션되어 5' 아데닐화된 DNA 서열을 생성한다. 5' 아데닐화된 DNA 서열은 자유 3' 히드록실 기를 갖는다. 라이게이션 반응에서 ATP의 농도는 어떠한 아데닐화도 라이게이션 가능한 DNA 서열의 3' 말단에서 일어나지 않도록 선택된다. 그 다음, 5' 아데닐화된 DNA 서열은 5' 아데닐화된 DNA 서열의 주형-비의존성 분자내 라이게이션이 가능한 비-아데닐화된 리가제와 함께 인큐베이션되어 단일 가닥 DNA 환을 생성한다. ATP-의존성 비-아데닐화된 리가제가 분자내 라이게이션 반응을 위해 이용된다면, ATP는 분자내 라이게이션 반응 이전에 포스파타제로 반응 혼합물을 처리함으로써 반응 혼합물로부터 제거되어야 할 수 있다. 포스파타제에 의해 통상적으로 제거될 DNA의 말단 뉴클레오티드의 5' 포스페이트는 미리-아데닐화 때문에 포스파타제 처리로부터 보호된다. DNA가 이중 가닥 형태로 존재한다면, 이는 분자내 라이게이션 반응 이전에 변성되어야 할 필요가 있다. 방법의 모든 단계는 임의의 중간 단리 또는 정제 단계 없이 단일 반응 용기에서 수행된다.

일부 실시양태에서, 호열성 아케아벡테리아인 메타노박테리움 써모아우토트로피쿰으로부터 유래된 RNA 리가제 I(Mth RNA 리가제 1)과 같은 RNA 리가제가 ATP의 존재 하에서 사용되어 아데닐화된 형태의 선형 DNA를 생성한다. 자가-아데닐화, 탈-아데닐화 및/또는 아데닐레이트 전달이 결여된 돌연변이체 또는 적절히 조작된 ATP-비의존성 리가제가 아데닐화된 선형 DNA의 분자내 라이게이션 반응을 위해 사용되어 단일 가닥 DNA 환을 생성할 수 있다. 예컨대, Mth RNA 리가제의 모티프 V 리신 돌연변이체(K246A)가 이용될 수 있다. 이 돌연변이체는 미리-아데닐화된 기질에 대해 완전한 라이게이션 활성을 갖는다. 모티프 I(K97A)의 촉매성 리신에 대해 알라닌으로 치환된 Mth RNA 리가제 돌연변이체도 또한 이용될 수 있다. K97A 돌연변이체의 활성은 공여자 기질로서 미리-아데닐화된 RNA 또는 단일 가닥 DNA(ssDNA)에 대해서는 유사하지만, 수여체 기질로서 동일한 서열을 갖는 ssDNA에 비해 RNA에 대해서는 두 배의 선호도를 갖는다. TS2126 RNA 리가제와 같은 ATP-의존성 리가제가 5' 아데닐화된 DNA 서열의 분자내 라이게이션 반응을 위해 이용된다면, 반응에서 ATP는 라이게이션 반응 이전에 제거되어야 할 수 있다.

일부 실시양태에서, 대안의 워크플로우를 이용하는 리가제 이용 전체 게놈 증폭이 제공된다. 이 워크플로우의 개략도는 도 11에 제공된다. 방법은 라이게이션 및 증폭 이전에 단편화된 DNA를 키나제로 수선하기, 및 ATP의 존재 하에서 RNA 리가제 또는 DNA 리가제로 단편화된 DNA의 5' 말단의 미리-아데닐화를 포함한다. 라이게이션 가능하지 않은 말단을 갖는 서열(예컨대, 5' 히드록실 및/또는 3' 포스포릴 기를 포함하는 서열)을 포함하는 단편화된 DNA는 키나제로 처리함으로써 5' 말단에서 인산화되고 3' 말단에서 탈인산화되어 라이게이션 가능한 DNA 서열을 생성한다. 그 다음, 라이게이션 가능한 DNA 서열은 ATP의 존재 하에서 Mth RNA 리가제(MthRnl 1)와 같은 RNA 리가제를 사용하여 아데닐화되어 아데닐화된 형태의 단편화된 DNA를 생성할 수 있다. ATP는 포스파타제(예컨대, 새우 알칼리성 포스파타제(SAP))로 반응 혼합물을 처리함으로써 반응 혼합물로부터 후속 제거된다. DNA의 5' 아데닐화를 위한 관련분야에서 이용가능한 임의의 방법이 이용될 수 있다(예컨대, RNA 리가제, DNA 리가제, 또는 합성 방법). 그 다음, 미리-아데닐화된 단일 가닥 선형 DNA는 서크리가제 I^TM와 같이 낮은 수준으로 아데닐화된 RNA 리가제로 처리되어 분자내 라이게이션을 통해 DNA 환을 생성한다. 그 다음, DNA 환은 RCA를 사용하여 증폭된다. 서크리가제 I^TM로 분자내 라이게이션을 통해 DNA 환을 생성하는 실시양태에서, 분자내 DNA 라이게이션 및 후속 증폭 반응은 ATP 없이 수행된다. 키나제 처리 및 미리-아데닐화 반응 이후 반응 혼합물로부터 ATP의 제거는 서크리가제 I에 의한 미리-아데닐화된 ssDNA의 원형화가 ATP에 의해 억제되기 때문에 필수적이다. 일부 실시양태에서, ATP는 포스파타제로 처리함으로써 아데노신 및 포스페이트로 전환된다. 아데노신은 원형화 반응에 억제작용을 하지는 않지만, 결과적으로 생성되는 포스페이트는 분자내 라이게이션 반응을 억제할 수 있다. 생성된 포스페이트는 포스페이트-격리 효소로 또는 용액으로부터 포스페이트를 침전시키거나 제거하는 시약(LayneRT 수지와 같은 포스페이트 결합 수지)으로 반응 혼합물을 처리함으로써 추가로 제거될 수 있다. 포스페이트 제거는 말토스에서 글루코스 및 글루코스-1-포스페이트로의 전환을 촉매하는 말토스 인산화효소와 같은 효소로 반응 혼합물을 처리하여 용액에서 포스페이트를 제거함으로써 또한 달성될 수 있다. 반응에 키나제를 포함시키면 5' 포스페이트 및/또는 3' 히드록실 기를 함유하지 않는 집단에서 DNA 단편을 원형화시키고 증폭시켜, 리가제 이용 증폭을 통해 보다 대표성을 갖는 라이브러리가 생성된다. 표적 DNA의 미리-아데닐화는 분자내 라이게이션 반응을 위해 낮은 수준으로 아데닐화된 리가제(예컨대, 약 30% 아데닐화된 서크리가제 I^TM)의 사용을 촉진한다. 이것은 높은 수준으로 아데닐화된 리가제(예컨대, 서크리가제 II^TM)가 오직 1 회성으로 비-아데닐화된 DNA를 라이게이션하기 때문에 바람직할 수 있다. 따라서, 화학양론적 양의 리가제가 분자내 라이게이션 반응을 완결에 이르게 하기 위해 흔히 필요하다. 반면, (서크리가제 I^TM와 같은) 낮은 수준으로 아데닐화된 리가제는 높은 턴오버를 갖고, 복수의 미리-아데닐화된 DNA 분자에 대해 가역적이고 촉매성으로 또는 반복적으로 작용할 수 있다. 이것은 라이게이션 동역학을 증가시키고, 필요한 리가제의 양을 줄이며, 보다 어렵거나 복잡한 DNA 주형의 원형화의 증가를 잠재적으로 가능하게 한다.

일부 실시양태에서, 리가제 이용 전체 게놈 증폭 방법이 전혈 또는 소변과 같은 생물학적 샘플에서 순환 핵산(예컨대, 생물학적 샘플의 비-세포 분획으로부터의 순환 DNA)의 증폭 및 후속 검출을 위해 사용된다. 순환 핵산은 세포자살 또는 괴사 세포로부터 기원할 수 있거나, 또는 세포로부터 능동적으로 방출될 수 있다. 세포 뉴클레아제가 고분자량 게놈 DNA를 작은 뉴클레오좀-크기의 단편으로 분해하기 때문에, 순환 핵산은 자연적으로 매우 단편화된다. 매우 단편화된 순환 핵산은 흔히 종래의 핵산 증폭 방법으로 취급하기 어렵다. 또한, 순환 핵산은 혈류에 매우 소량으로 존재한다. 이중 가닥 순환 선형 핵산의 표준 롤링 서클 증폭(RCA)은 비효율적이고 매우 편향성을 갖는다. 롤링 서클 증폭 이전에 단일 가닥으로 순환 핵산을 분리하고 리가제로 원형화시키면 효율성이 개선되고 편향성이 감소된다. 이러한 희석된 DNA 주형으로 양호한 RCA 동역학 및 높은 민감도를 가능하게 하기 위해, LNA를 포함하는 프라이머를 이용하는 RCA 방법이 이용된다. 이 개선된 RCA는 미세 DNA 및 단일 세포 증폭을 위해 최적화되었다.

일부 실시양태에서, 전혈로부터의 순환 DNA를 증폭하는 방법이 제공된다. 순환 DNA는 전혈의 비-세포 분획(예컨대, 혈장 또는 혈청)으로부터 증폭된다. 이 방법은 전혈의 비-세포 분획을 수집하는 단계, 비-세포적 분획으로부터 순환 DNA(대부분 그의 자생적 이중 가닥 형태로 존재함)를 수집하는 단계, 이중 가닥 DNA를 변성시켜 선형 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계, 순환 단일 가닥 DNA 분자를 원형화시켜 단일 가닥 DNA 환을 생성하는 단계, 및 롤링 서클 증폭을 통해 단일 가닥 DNA 환을 증폭하는 단계를 포함한다. 지속 길이 때문에, 150 bp 미만의 길이의 서열을 갖는 dsDNA를 원형화하는 것은 일반적으로 가능하지 않고, DNA가 200 bp보다 길 때까지 dsDNA를 원형화시키는 것은 매우 어렵다. 반면, 15 뉴클레오티드(nt) 이상의 서열 길이를 갖는 선형 ssDNA 분자는 5' 말단이 인산화되고 3' 말단이 히드록실화된 이상 적합한 리가제에 의해 매우 효율적으로 원형화된다. 단일 가닥 DNA 환을 생성하기 위한 단일 가닥 DNA의 원형화는 단일 가닥 DNA의 주형-비의존성 분자내 라이게이션이 가능한 리가제를 이용함으로써 달성된다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 분자의 원형화는 서크리가제 II^TM와 같은 RNA 리가제로 단일 가닥 선형 DNA를 처리함으로써 수행된다.

일부 실시양태에서, 순환 DNA 검출의 민감도는 ssDNA 라이게이션 단계 및 RCA 이전에 폴리뉴클레오티드 키나제(PNK)로 순환 핵산을 인산화시킴으로써 추가로 증가된다. 워크플로우에서 PNK 단계를 도입한 후, 본원에 나타난 리가제 이용 전체 게놈 증폭 방법은 1% 농도로 첨가될 경우 여성 전혈에서 남성 순환 DNA를 검출할 수 있었다(3회 반복). 주형-비의존성 분자내 라이게이션은 ssDNA 주형이 5' 포스페이트 기 및 3' 히드록실 기를 갖지 않는 한 달성될 수 없다. 다양한 조건이 DNA 내에 5' 히드록실을 생산한다(혈액 내 DNase II 효소 절단, 및 포스파타제 활성을 포함). PNK 처리는 이 문제점을 제거하여 롤링 서클 증폭된 CNA 라이브러리의 다양성을 개선한다.

일부 실시양태에서, 선형 DNA로부터 단일 가닥 DNA 환의 생성을 위한 키트가 제공된다. 한 실시양태에서, 키트는 폴리뉴클레오티드 키나제, 포스페이트 공여자, ssDNA 서열의 주형-비의존성, 분자내 라이게이션이 가능한 미리-아데닐화된 리가제를 포함하고, 이들은 함께 포장된다. 폴리뉴클레오티드 키나제는 T4 PNK일 수 있다. 포스페이트 공여자는 GTP, UTP, CTP, 또는 dTTP로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 키트는 TS2126 리가제를 포함할 수 있다. 60% 초과의 TS2126 리가제가 미리-아데닐화될 수 있다. 키트는 완충제(예컨대, HEPES), DNA 증폭 시약(예컨대, DNA 폴리머라제, 프라이머, dNTP), 및 제공된 방법에 의한 단일 가닥 DNA 환의 생성을 위해 이용되는 다른 시약(예컨대, MnCl₂, 베타인)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 Phi29 DNA 폴리머라제 및 랜덤/부분적으로 제한된 프라이머를 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 키트는 아데닐화 효소, 포스파타제 및 비-아데닐화된 리가제를 포함하고, 이들은 함께 포장된다. 키트는 폴리뉴클레오티드 키나제 및/또는 포스페이트 공여자를 추가로 포함할 수 있다. 아데닐화 효소는 메타노박테리움 써모아우토트로피쿰으로부터 유래된 RNA 리가제 I(Mth RNA 리가제)일 수 있다. 비-아데닐화된 리가제는 리가제의 60% 초과가 비-아데닐화된 형태로 존재하는 TS2126 리가제의 조성일 수 있다. 키트는 선형 DNA로부터 단일 가닥 DNA 환의 생성을 위한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 실시는 오직 예시의 목적으로서 본원에 나타나고, 첨구된 청구항에 의해 정의된 것과 같이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안되는 하기 실시예로부터 보다 완전하게 이해될 것이다. 실시예 부분에서 사용되 일부 약어는 다음과 같이 풀어쓸 수 있다: "mg": 밀리그램; "ng": 나노그램; "pg": 피코그램; "fg" 펨토그램; "mL": 밀리리터; "mg/mL": 밀리리터 당 밀리그램; "mM": 밀리몰농도: "mmol": 밀리몰; "pM": 피코몰농도; "pmol": 피코몰; "μL": 마이크로리터; "min.": 분, 및 "h.": 시.

<실시예>

실시예 1: 혈장으로부터 순환 핵산의 전체 게놈 증폭:

순환 DNA를 와코(Wako) DNA 익스트렉터 SP 키트(와코 퓨어 케미칼 인더스트리스(Wako Pure Chemical Industries))를 사용하여 건강해 보이는 개인의 시트레이트-포스페이트-덱스트로스(CPD) 안정화된 혈장으로부터 단리하였다. 대략 1.3 ng을 TBE 완충제를 사용한 2% 아가로스 겔을 통해 전기영동으로 분석했고, SYBR 골드로 염색하여 타이푼(Typhoon) 이미저를 사용해 시각화하였다. 도 2에 도시된 것처럼, 대부분의 순환 DNA는 대략 180 bp의 길이였고, 대략 370 bp 길이의 부가적인 더 소량의 서열, 및 실질적으로 더 소량의 더 고분자량 서열이 존재하였다.

혈장으로부터의 350 pg 순환 DNA를 95 ℃에서 가열하여 주형을 변성시켰다. 그 다음, 변성된 단일 가닥 DNA 주형을 RNA 또는 DNA 리가제로 처리해 단일 가닥 DNA 환을 생성하였다. ATP-의존성 T4 DNA 리가제, 세포 코딩된 NAD-의존성 이. 콜라이 리가제 또는 호열성 RNA 리가제(서크리가제 II)를 라이게이션 반응에 사용하였다. 그 다음, 단일 가닥 DNA 환으로 라이게이션된 100 pg의 DNA는 Phi29 DNA 폴리머라제를 이용한 게놈이파이 키트(지이 헬스케어)를 사용한 전체 게놈 증폭을 받았다. 증폭을 프라이머 혼합물 +N+N(at N)(at N)(at N)*N(여기서, "at N"은 2-아미노 dA, 2-티오-dT, 통상의 G 및 통상의 C를 함유하는 랜덤 혼합물을 나타냄)을 사용해 수행하였다. 리얼-타임 증폭을 증폭 혼합물에 소량의 SYBR 그린 I를 첨가하고 테칸(Tecan) 플레이트 리더(테칸 SNiPer, 아머샴-파마시아 바이오테크(Amersham-Pharmacia Biotech))에서 시간에 따른 형광 신호 증가량을 모니터링함으로써 수행하였다. 비교를 위해, 동농도의 비처리된 게놈 DNA, 비처리된 혈장 DNA, 및 DNA 주형이 없는 샘플(주형 없는 증폭)을 포함시켰다.

도 3에 도시된 것처럼, 비처리된 단편화된 혈장 DNA의 증폭 동역학은 동량의 고분자량 게놈 DNA와 비교하면 훨씬 더 저조해서, 증폭의 결함을 시사하였다. 그러나, 단편화된 혈장 DNA가 서크리가제 II^TM를 사용해 전처리되어 단일 가닥 DNA 환으로 전환되면, 빠른 증폭 동역학이 달성되었다(도 3a). ATP-의존성 T4 DNA 리가제(도 3b) 및 세포 코딩된 NAD-의존성 이. 콜라이 DNA 리가제(도 3c)를 포함한 리가제도 또한 효과적이었으나, 단편화된 혈장 DNA의 증폭 동역학을 회복하는 데에는 덜 효율적이었다. 이들 예시에서, 증폭 동역학의 상대적 증가는 단일 가닥 DNA 주형의 분자내 라이게이션을 촉진하는 데에 있어서 각각의 리가제의 효율을 나타낸다.

실시예 2: 리가제 이용 전체 게놈 증폭에 의한 혈장으로부터의 증폭된 순환 핵산의 분석.

실시예 1에서 생성된 증폭된 DNA를 민감하고 균형잡힌 DNA 증폭을 촉진하기 위한 리가제 이용 전체 게놈 증폭 방법의 효율성을 샘플링하기 위한 네 개의 상이한 CODIS 유전자좌(vWA, TPOX, D8S1129, 및 D13S317)를 표적화하는 프라이머를 사용해 정량 PCR로 추가 분석하였다. 이들 DNA 농도를 비증폭된 DNA의 값과 비교해 증폭 이후 상대적 대표도를 결정하였다. 도 4에 보이는 것처럼, 양 실시예 모두에서, 비처리된 혈장 DNA의 증폭은 서열 탈락, 또는 테스트된 유전자좌에서 매우 과소 표시된 DNA의 생성을 초래하였다. 반면, 방법에 서크리가제 II^TM 또는 T4 DNA 리가제를 포함시키면 4 개의 유전자좌의 서열 탈락을 없애고, 증폭된 고분자량 게놈 DNA와 보다 유사한 대표성을 갖는 DNA를 생성하였다. 단일 가닥 DNA 리가제로서 서크리가제 II^TM를 사용한 실시예에서, 12 개의 상이한 CODIS 유전자좌를 표적화하는 프라이머를 사용한 정량 PCR(qPCR)에 의해 테스트된 12 개의 상이한 CODIS 유전자좌 중에서, 11 개가 증폭 이후에 회복된 반면, 증폭된 비처리된 혈장 DNA에서는 오직 4 개만이 존재하였다(도 5). 도 5에서, 보고된 Ct 값은 두 복제물의 평균치이다. Ct 값이 결정되지 않은 PCR 반응은 "X"로 표시하였다.

실시예 3: 리가제 이용 전체 게놈 증폭을 위한 반응 조건의 최적화.

리가제 이용 DNA 증폭 반응을 TS2126 RNA 리가제에 의해 단일 가닥 DNA 분자의 라이게이션 반응의 효율을 최적화함으로써 추가로 최적화하였다. 표준적인 제조업체 추천 완충제에서 망간을 제거하면 증폭 속도가 배경 수준으로 감소됐기 때문에, 금속 이온의 존재는 라이게이션 반응에 필수적이었다. 비처리된 게놈 DNA 및 비처리된 혈장 DNA를 수정된 완충제 조건을 사용해 서크리가제 II^TM로 처리된 혈장 DNA 샘플과 비교하였다(도 6). 모든 완충제 조건은 33 mM KOAc, 0.5 mM DTT, 및 1 M 베타인을 함유하였다. 표시된 곳에서, 완충제는 33 mM TRIS-아세테이트(pH 7.5) 또는 33 mM HEPES-KOH(pH 8.0)을 함유했고, 부가적으로 2.5 mM MgCl₂ 또는 2.5 mM MnCl₂를 함유하였다. 리얼-타임 증폭을 증폭 혼합물에 소량의 SYBR 그린 I를 첨가하고 테칸 플레이트 리더에서 시간에 따른 형광 증가량을 모니터링함으로써 수행하였다. 증폭 역치는 배경 수준(2000 RFU) 초과로 형광량이 상승할 때의 시간이다.

리가제 이용 전체 게놈 증폭 반응(100 pg 샘플)의 증폭 동역학의 비교가 도 6에 도시된다. 마그네슘 및 망간 둘 모두는 표준 TRIS 완충제의 존재시 유사한 효과를 촉진했으나, HEPES 완충제, pH 8.0의 존재 하에서 망간 및 마그네슘의 조합이 높은 증폭 속도를 촉진하는데 가장 효과적인 것으로 관찰됐다. HEPES 완충제가 이 반응 조건에서 혈장 DNA의 원형화 효율을 증가시키는 것은 HEPES 완충제 내 망간 양이온의 산화가 감소되었기 때문일 수 있다.

실시예 4: 리가제 이용 전체 게놈 증폭에서 고분자량 게놈 DNA의 증폭의 억제.

비처리된 게놈 DNA의 전체 게놈 증폭 반응의 증폭 동역학을 서크리가제 I^TM 및 서크리가제 II^TM로 처리된 DNA 샘플(100 pg 샘플)과 비교하였다. 결과는 도 7에 보여진다. 도 7에 도시된 것처럼, 게놈 DNA의 서크리가제 처리는 고분자량 게놈 DNA의 증폭 속도에 (혈장 DNA에서의 양의 효과와 달리) 억제 효과를 발생시켰다. 억제는 서크리가제 I 및 서크리가제 II^TM 둘 모두에서 뚜렷하였다.

Phi29 기반의 증폭이 리가제에 의해 억제되는지 조사하기 위해, 비처리된 게놈 DNA를 활성 리가제가 존재할 때 증폭시켰다. 리얼-타임 증폭을 증폭 혼합물에 소량의 SYBR 그린 I를 첨가하고 테칸 플레이트 리더에서 시간에 따른 형광량 증가를 모니터링함으로써 수행하였다. 증폭 역치는 배경 수준(2000 RFU) 초과로 형광량이 상승할 때의 시간이다. 게놈 DNA 증폭 억제는 증폭 도중 존재하는 활성 리가제의 효과가 아니라는 것이 관찰됐다.

혈액 세포의 게놈 DNA가 흔히 순환 핵산의 시료를 오염시키고 덜 진단학적 값을 갖기 때문에, 고분자량 게놈 DNA에 대한 순환 증폭의 선호성은 특정 응용에서 이점일 수 있다.

실시예 5: 리가제 이용 전체 게놈 증폭을 이용한 단편화된 DNA의 단일 튜브 증폭 - 분자내 라이게이션 이전에 키나제에 의한 순환 DNA 단편의 인산화의 효과.

키나제에 의한 순환 DNA 단편의 인산화는 혈장 내 순환 DNA의 보다 민감한 검출을 가능하게 하였다. 키나제에 의해 처리된 투입 DNA로부터 생성된 라이브러리가 더 대표성을 가져서 DYS14 남성-특이적 표지의 보다 민감한 검출을 가능하게 한다는 것을 증명하기 위해, 남성-여성 혈장/혈액 혼합 실험을 수행하였다(도 10, 3/3 복제물, 반면 인산화가 행해지지 않는다면 오직 1/3만이 검출되었음). 100 μL의 혈액/혈장 혼합물을 다음과 같이 제조하였다: 100A: 100% 남성 혈장; 5A-C: 5% v/v로 여성 전혈에 첨가된 남성 혈장; 1A-C: 1% v/v로 여성 전혈에 첨가된 남성 혈장; 및 0A: 100% 여성 혈액. 혈장을 MF1 멤브레인(와트먼(Whatman))을 통해 측방 유동으로 혈액 세포로부터 분리한 후 건조된 셀룰로스 패드에 수집하여 밤새 저장하였다. 그 다음, 순환 DNA를 수정된 와코 익스트렉터 SP 키트(와코 퓨어 케미칼 인더스트리스), 표준 소듐 아이오다이드/세제 기반 방법에 의해 셀룰로스 패드로부터 단리하였다. 그 다음, 대략 1.8 ng의 DNA를 GTP, 망간, 및 베타인의 존재 하에서 T4 폴리뉴클레오티드 키나제가 있거나 없는 상태에서 처리했고, 그 다음 서크리가제 II^TM로 처리하여 단일 가닥 DNA 단편을 원형화하였다. 그 다음, DNA는 게놈이파이 전체 게놈 증폭(지이 헬스케어)을 받았고, 생성물을 정량 PCR로 분석하여 두 개의 표지: Y-염색체에 좌위된 멀티-카피 유전자이고 오직 남성 분획에서만 검출되는 Dys14, 및 염색체 16번에 좌위된 STR 유전자좌이고 남성 및 여성 분획에서 모두 검출가능한 D16S539의 검출을 평가하였다. 반응을 워크플로우에서 어떠한 중간 정제 또는 단리 단계 없이 단일 반응 용기에서 수행하였다. 이것은 상대적으로 저농도의 GTP에서 인산화 반응을 수행함으로써 달성됐다.

도 10은 반응에서 키나제의 포함이 5' 포스페이트를 함유하지 않은 집단 내의 DNA 단편의 원형화 및 증폭을 가능하게 하여, 더 대표성을 갖는 라이브러리를 생성한다는 것을 보여준다. 이것은 세포 사멸 도중 DNase II 소화작용에 의해 특이적으로 생성되는 5' 히드록실을 함유하는 DNA 단편을 포함할 것이다. 남성-여성 혈장/혈액 혼합 실험을 사용하면, 키나제로 처리된 투입 DNA로부터 생성된 라이브러리가 더 대표성을 가져서, DYS14 남성-특이적 표지의 보다 민감한 검출을 가능하게 한다는 점이 입증된다(3/3 복제물, 반면 인산화가 행해지지 않는다면 오직 1/3만이 검출되었음).

실시예 6: 원형화 반응 이전의 단편화된 DNA의 미리-아데닐화의 효과.

40 분의 인산화되거나 또는 미리-아데닐화된 작은 DNA 단편의 원형화의 효율이 서크리가제 효소의 상이한 양으로 평가된다. 5' 위치의 포스페이트 기 또는 아데닐화를 함유하는 64-머 올리고뉴클레오티드 2.5 pmol을 60 ℃에서 40 분 동안 서크리가제 I^TM 또는 서크리가제 II^TM의 양을 증가시키면서 처리하였다. 원형화의 퍼센트를 선형 및 원형 위치의 밴드의 세기를 스캐닝함으로써 결정하였다. 도 12에 도시된 것처럼, 단편화된 DNA의 미리-아데닐화는 라이게이션 및 증폭 동역학을 개선하였다. 도 12에서, P-64머는 5'-인산화된 64-nt 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ad-64는 미리-아데닐화된 64-nt 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 미리-아데닐화된 DNA는 표준 인산화된 DNA보다 더 빠르게 원형화되었다. 또한, 낮은 수준으로 아데닐화된 갖는 라이게이션 효소는 몰 과량으로 기질의 라이게이션을 촉매해서, 리가제가 미리-아데닐화된 DNA 분자를 라이게이션하기 위한 다수의 기회를 가져서 라이게이션 동역학을 증가시키고 더 어려운 주형의 원형화의 증가를 잠재적으로 가능하게 한다는 점을 시사하였다.

실시예 7: 미리-아데닐화 워크플로우를 사용한 5'-포스페이트 및 5'-히드록실-함유 올리고뉴클레오티드의 원형화.

5' 위치의 포스페이트 기 또는 히드록실 기를 갖는 64-머 올리고뉴클레오티드 5 pmol을 함유하는 반응물을 표시된 곳에서 37 ℃에서 1.25 U의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 처리하였다. 65 ℃에서 25 pmol Mth RNA 리가제로 인큐베이션한 후, 반응물을 0.25 유닛의 새우 알칼리성 포스파타제로 처리하였다. Mth RNA 리가제는 ATP 농도에 매우 민감하기 때문에, 표준 100 μM ATP 농도에서, Mth RNA 리가제는 DNA 말단을 거의 전적으로 아데닐화한다. 어떠한 분자내 라이게이션도 이 ATP 농도에서 Mth RNA 리가제에 의해 일어나지 않는다. 효소는 각각의 인큐베이션 후에 열-비활성화되었다. 최종적으로, 표시된 곳에서 반응물을 50 유닛의 서크리가제 I로 처리했고, 60 ℃에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 원형화의 퍼센트를 선형 및 원형 위치에서 밴드의 세기를 스캐닝함으로써 결정하였다(도 13). P-64머는 5'-인산화된 64-nt 올리고뉴클레오티드를 나타내고, ad-64머는 미리-아데닐화된 64-nt 올리규뉴클레오티드를 나타낸다.

도 11은 5'-포스페이트 또는 5'-히드록실 기를 함유하는 선형 올리고뉴클레오티드가 원형으로 전환되는 "단일 튜브" 미리-아데닐화 워크플로우를 보여준다. 이 "단일 튜브" 과정에서, 기질은 어떠한 중간 정제 과정 없이 폴리뉴클레오티드 키나제, Mth RNA 리가제, 새우 알칼리 포스파타제, 및 서크리가제 I^TM로 연달아 처리된다.

청구된 발명은 그의 정신 또는 본질적 특징에서 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 실시될 수 있다. 전술한 실시양태는 다양한 모든 가능한 실시양태 또는 예시로부터 선택된 실시양태 또는 예시이다. 따라서, 전술한 실시양태는 본원에 기재된 발명을 제한하기보다는 보여주는 것으로 모든 점에서 고려되어야 한다. 청구된 발명의 오직 특정한 특징이 본원에서 보여지고 기재되었지만, 관련 분야의 숙련자는 본 개시를 통해, 이들 및 다른 유형의 응용을 위한 적합한, 본 발명의 원리에 따른 방법을 사용기 위한 적합한 조건/파라미터를 식별하거나, 선택하거나, 최적화하거나, 또는 수정할 수 있을 것이라는 점을 이해해야 한다. 정확한 용도, 시약의 선택, 농도, 부피, 인큐베이션 시간, 인큐베이션 온도와 같은 변수의 선택 등은 의도된 구체적인 응용에 따라 대부분 달라질 수 있다. 따라서, 첨부된 청구항은 본 발명의 진정한 정신의 범위 내에서 모든 수정 및 변화를 커버하도록 의도된 것이라 이해해야 한다. 또한, 청구항의 의미 및 동등물의 범위에 속하는 모든 변화가 본원에 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (1)

1. 선형 DNA로부터 단일 가닥 DNA 환을 생성하는 방법.
   

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