JP2016525360A - リガーゼ支援核酸環状化及び増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
Wako DNA抽出器SPキット(和光純薬株式会社)を用いて、明らかに健康な個体の、クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース(CPD)で安定化させた血漿から循環DNAを単離した。約1.3ngを、TBE緩衝液を用いる2%アガロースゲルによる電気泳動により分析し、SYBR Goldで染色し、Typhoonイメージャで可視化した。図2に示されるように、循環DNAの大部分は約180bpの長さであった。さらなるそれよりも少ない量の配列は約370bpの長さであり、さらにそれよりもかなり少ない量のそれよりも高分子量の配列があった。
Claims (34)
- 線状DNAから一本鎖DNA環を生成するための方法であって、
(a)線状DNAを準備する工程と、
(b)線状DNAをリン酸供与体の存在下でポリヌクレオチドキナーゼとともにインキュベートして、5’末端にリン酸基を有し、3’末端にヒドロキシル基を有するライゲーション可能なDNA配列を生成する工程と、
(c)ライゲーション可能なDNA配列を、一本鎖DNA配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションが可能なリガーゼとともにインキュベートして、一本鎖DNA環を生成する工程と
を含んでおり、当該方法の工程の全てが、単離もしくは精製工程を介さずに単一の反応器で実施される、方法。 - 工程(b)が、アデノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸以外のリン酸供与体を用いて実施される、請求項1に記載の方法。
- リン酸供与体が、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸、ウリジン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- リン酸供与体がグアノシン三リン酸である、請求項3に記載の方法。
- 線状DNAが、ポリヌクレオチドキナーゼとともに200μM未満のグアノシン三リン酸の存在下でインキュベートされる、請求項4に記載の方法。
- 線状DNAが、ポリヌクレオチドキナーゼとともに30μMまでのグアノシン三リン酸及び2.5mMまでのマンガンイオンの存在下でインキュベートされる、請求項5に記載の方法。
- ライゲーション可能なDNA配列が二本鎖形態である場合に、工程(c)の前にライゲーション可能なDNA配列を変性させる工程をさらに含む、請求項4に記載の方法。
- リガーゼが、プレ−アデニル化リガーゼである、請求項7に記載の方法。
- プレ−アデニル化リガーゼが、プレ−アデニル化TS2126 RNAリガーゼである、請求項8に記載の方法。
- 工程(a)〜(c)が、単一の反応器において順次実施される、請求項9に記載の方法。
- 方法の工程の全てが、アデノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸の不在下で実施される、請求項10に記載の方法。
- 方法の工程の全てが、HEPES緩衝液で実施される、請求項11に記載の方法。
- 線状DNAが、循環DNA、ホルマリン固定パラフィン包埋試料から単離したDNA、環境条件にさらされた法医学DNA試料、又は非常に古いDNA試料である、請求項1に記載の方法。
- 等温条件下で一本鎖DNA環を増幅する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 一本鎖DNA環が、ローリングサークル増幅を介して増幅される、請求項14に記載の方法。
- ローリングサークル増幅が、ヌクレアーゼ耐性プライマーを用いて実施される、請求項15に記載の方法。
- ヌクレアーゼ耐性プライマーが、1以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項16に記載の方法。
- 一本鎖DNA環が、ランダムプライマー混合物を用いて増幅される、請求項15に記載の方法。
- 一本鎖DNA環が、末端ミスマッチプライマーダイマー構造を含む部分拘束プライマー混合物から本質的になるプライマー溶液を用いて増幅される、請求項15に記載の方法。
- 線状DNAから一本鎖DNA環を生成するための方法であって、
(a)線状DNAを準備する工程と、
(b)所望により線状DNAをアデノシン三リン酸の存在下でポリヌクレオチドキナーゼとともにインキュベートして、5’末端にリン酸基を有し、3’末端にヒドロキシル基を有するライゲーション可能なDNA配列を生成する工程と、
(c)線状DNA配列又はライゲーション可能なDNA配列を、アデノシン三リン酸の存在下でアデニル化酵素とともにインキュベートして、5’アデニル化DNA配列を生成する工程と、
(d)5’アデニル化DNA配列を、5’アデニル化一本鎖DNA配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションが可能な非アデニル化リガーゼとともにインキュベートして、一本鎖DNA環を生成する工程と
を含んでおり、当該方法の工程の全てが、単離もしくは精製工程を介さずに単一の反応器で実施される、方法。 - 5’アデニル化DNA配列が二本鎖形態である場合に、工程(d)の前に5’アデニル化DNA配列を変性させる工程をさらに含む、請求項20に記載の方法。
- アデニル化酵素が、好熱性古細菌Methanobacterium thermoautotrophicumに由来するRNAリガーゼ1である、請求項21に記載の方法。
- 非アデニル化リガーゼが、アデノシン三リン酸非依存性であり、自己アデニル化、脱アデニル化及びアデニル酸転移の欠けた変異体又は操作されたリガーゼである、請求項22に記載の方法。
- 変異体リガーゼが、好熱性古細菌Methanobacterium thermoautotrophicumに由来するRNAリガーゼ1の変異体である、請求項23に記載の方法。
- 5’アデニル化DNA配列を含む工程(c)の反応混合物をホスファターゼとともにインキュベートして、アデノシン三リン酸を反応混合物から除去する工程をさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 非アデニル化リガーゼが、サーマスバクテリオファージTS2126に由来するTS2126RNAリガーゼである、請求項25に記載の方法。
- 工程(a)〜(d)が、単一の反応器において順次実施される、請求項26に記載の方法。
- 線状DNAが、循環DNA、ホルマリン固定パラフィン包埋試料から単離したDNA、環境条件にさらされた法医学DNA試料、又は非常に古いDNA試料である、請求項20に記載の方法。
- 等温条件下で一本鎖DNA環を増幅する工程をさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 一本鎖DNA環が、ローリングサークル増幅を介して増幅される、請求項29に記載の方法。
- 一本鎖DNA環が、ヌクレアーゼ耐性プライマーを用いて増幅される、請求項30に記載の方法。
- ヌクレアーゼ耐性プライマーが、1以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項31に記載の方法。
- 一本鎖DNA環が、ランダムプライマー混合物を用いて増幅される、請求項30に記載の方法。
- 一本鎖DNA環が、末端ミスマッチプライマーダイマー構造を含む部分拘束プライマー混合物から本質的になるプライマー溶液を用いて増幅される、請求項30に記載の方法。
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