JP2012506704A - 核酸を修飾するためのトランスポゾン末端組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物を用いて標的DNAからタグ化DNA断片のライブラリーを作製する方法、組成物、及びキットに関する。作製されたssDNA断片は、例えばハイスループット、大規模並列、及び/又はマルチプレックスDNAシークエンシングを初めとする種々の用途のための鋳型として有用である。
特に断りのない限り又は本明細書中に異なるように記載されていない限り、本発明に関する用語及び記述は以下に記すように理解されるものとする。
5’AGATGTGTATAAGAGACAG3’(配列番号1)
を示す転移鎖及び以下の「非転移トランスポゾン末端配列」:
5’CTGTCTCTTATACACATCT3’(配列番号2).
を示す非転移鎖を含む。
序論
本発明は、核酸を処理する方法及び組成物、特にトランスポゾン組成物を用いてDNAを断片化及びタグ化する方法及び組成物に関する。本発明の方法、組成物、及びキットは、ゲノム、サブゲノム、転写産物、メタゲノム、又はRNA発現の分析のために(例えば、マイクロアレイ分析のための標識された標的の作製における使用のため;例えば、コピー数変化の分析のため、一塩基多型の検出及び分析のため、及び土壌起源又は水起源等の環境試料に由来する遺伝子を発見するため)、任意の起源(source)に由来する任意の目的のdsDNA(RNAから調製された二本鎖cDNAを含む)を含む標的DNAからジタグ化直鎖ssDNA断片又はタグ化環状ssDNA断片(及びその増幅産物)のライブラリーを作製するのに有用である。方法は種々のプロセスにおいて有用であり、そのようなプロセスとしては、限定されるものではないが、培養又は成長の条件が未知の1又は複数の微生物又は環境生物を含む1又は複数の生物の全ゲノムを増幅するプロセス(例えば全ゲノム増幅すなわちWGA)、リアルタイムPCR、エマルションPCR、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、比較ゲノムシークエンシング(CGS)、及び蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)等の用途向けのDNA特異的プローブ(例えば染色体特異的プローブ、例えば染色体ペイント、又は例えば遺伝子若しくは遺伝子座に特異的なプローブ)を調製するプロセスが含まれる。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、方法は、大規模並列DNAシークエンシング(いわゆる「次世代シークエンシング」)の鋳型の作製にも使用される。これらのプロセス及び用途のそれぞれは、研究及び分子診断目的の両方で使用される。
本明細書に開示する本発明の方法の全実施形態で、標的DNAの切断による断片化及び各断片の5’末端へのタグの連結を同時に行うためにインビトロの転位反応を用いる。方法は全て関連しているので、特定の実施形態に関連して特に断りのない限り、一実施形態に関して本明細書中に示す方法は本明細書に記載の別の実施形態にも用いることができる。インビトロ転位反応を用いる本明細書に開示する方法の全実施形態は、別個のトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物、又は、トランスポザーゼとトランスポゾン末端組成物との間で形成された安定な複合体を含む単一のトランスポソーム組成物、のいずれかを用いて反応を組み立てることで行うことができる。したがって、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物の使用を記載しているいずれの方法でも、トランスポザーゼとトランスポゾン末端組成物とから作製されるトランスポソーム組成物を使用してよく、トランスポソーム組成物の使用を記載しているいずれの方法でも、トランスポソーム組成物を構成するトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物を別個に使用してよいと理解される。このことを本発明の一般的方法の1つを以下にの2通りに記述することで説明する。
方法の好ましい実施形態の1つは、インビトロ転位反応中で標的DNAと少なくとも1つのトランスポソームを、アニーリングされた5’タグ化DNA断片の集合が生成される条件下で、そのために十分な時間、インキュベートする工程;次いで、アニーリングされた5’タグ化DNA断片の集合を、熱サイクルなしの条件下で、鎖置換活性又は5’ヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼとインキュベートする工程であって、アニーリングされた5’タグ化DNA断片が変性されず、DNAポリメラーゼが、アニーリングされた5’タグ化DNA断片の各鎖の3’末端を相補鎖を鋳型として用いて伸張させるか、非転移鎖を置換又は消化し、その結果、ジタグ化dsDNA断片を含むタグ化DNA断片のライブラリーが生成される工程を含む。
方法の別の実施形態は、インビトロ転位反応中で標的DNAを少なくとも1つのトランスポソームとインキュベートして5’タグ化dsDNA断片を作製する工程;5’タグ化dsDNA断片を変性させて5’タグ化ssDNA断片を作製する工程;及び5’タグ化ssDNA断片と、ターミナルトランスフェラーゼからなるDNAポリメラーゼ及びターミナルトランスフェラーゼ用の少なくとも1つのdNTP基質とを、ターミナルトランスフェラーゼがポリ(dNMP)からなる第2のタグを5’タグ化DNA断片の3’末端に連結する条件下で、そのために十分な時間、インキュベートすることで、ジタグ化DNA断片を含むタグ化DNA断片のライブラリーを作製する工程、を含む(例えば図3)。この方法のいくつかの実施形態では、トランスポソームのトランスポゾン末端組成物を構成する非転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの3’末端がブロックされており(例えば、3’末端ヌクレオチドとしてジデオキシヌクレオチド又は3’−O−メチル−ヌクレオチドを有する非転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドを用いる)、このブロックされた3’ヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼによるポリ(dNMP)の付加を防止することで、非転移トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの後ろのタグ化を防止する。
方法の更に別の実施形態は、インビトロ転位反応中で標的DNAを少なくとも1つのトランスポソームとインキュベートして5’タグ化dsDNA断片を作製する工程;5’タグ化dsDNA断片を変性させて5’タグ化ssDNA断片を作製する工程(例えば95℃に加熱して急冷する);並びにDNAポリメラーゼ及び末端タグ化用オリゴヌクレオチド(例えば図4)を用いて第2のタグを5’タグ化ssDNA断片に連結することで、ジタグ化DNA断片を含むタグ化DNA断片のライブラリーを作製する工程、を含む。いくつかの好ましい実施形態では、DNAポリメラーゼ及び末端タグ化用オリゴヌクレオチドを用いて第2のタグを5’タグ化DNA断片の3’末端に連結するステップは、
(1)5’部分及び3’部分を含む又はからなる末端タグ化用オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、5’部分が、5’タグ化ssDNA断片の3’末端に連結したい第2のタグの配列に相補的な配列を示し、3’部分が、DNAポリメラーゼにより伸張されないように3’末端ヌクレオチドがブロックされた3〜8個(例えば3、4、5、6、7、又は8個のランダムヌクレオチドを含む又はからなるランダム配列を示す、工程;
(2)末端タグ化用オリゴヌクレオチドが5’タグ化ssDNA断片にアニーリングする条件下で、そのために十分な時間、5’タグ化ssDNA断片を末端タグ化用オリゴヌクレオチドに接触させる工程;
(3)末端タグ化用オリゴヌクレオチドを鋳型として5’タグ化ssDNA断片の3’末端が伸張されるDNA重合条件下で、そのために十分な時間、末端タグ化用オリゴヌクレオチドをアニーリングさせた5’タグ化ssDNA断片を反応混合物中でDNAポリメラーゼと接触させることで、第2のタグを3’末端に連結して5’及び3’タグ化ssDNA断片を作製する工程、を含む。いくつかの実施形態では、末端タグ化用オリゴヌクレオチド中にランダム配列の代わりに半ランダム配列を用いる。
方法の好ましい実施形態の1つは、アニーリングされた5’タグ化DNA断片の集合が作製される条件下で、そのために十分な時間、インビトロ転位反応中で標的DNAを少なくとも1つのトランスポソームとインキュベートする工程;次いで、アニーリングされた5’タグ化DNA断片に第2のタグが連結される条件下で、そのために十分な時間、アニーリングされた5’タグ化dsDNA断片の集合を鋳型依存性(又は相同性)DNAリガーゼ並びに3’部分及び5’部分を含む又はからなるライゲーションタグ化用オリゴデオキシヌクレオチドとインキュベートすることで、アニーリングされたジタグ化DNA断片を含むDNA断片のライブラリーを作製する工程であって、ライゲーションタグ化用オリゴデオキシヌクレオチドの3’部分が、アニーリングされた5’タグ化DNA断片の集合の3’末端に連結したい任意の配列を示す第2のタグ(例えば任意配列)を示し、5’部分が、5’モノリン酸基を有し且つランダム配列を示す、工程、を含む。いくつかの好ましい実施形態では、方法は更に、アニーリングされたジタグ化DNA断片を含むDNA断片のライブラリーを変性させる(例えば95℃に加熱して急冷する)ことでジタグ化ssDNA断片を含むDNA断片のライブラリーを作製するステップを含む。
インビトロ転位反応で標的DNAからタグ化DNA断片のライブラリーを作製する方法の好ましい一実施形態では、方法は、標的DNAを1又は複数のトランスポソーム組成物とインキュベートする工程であって、各トランスポソーム組成物がトランスポザーゼ及びトランスポザーゼと転位複合体を形成するヘアピントランスポゾン末端組成物の複合体を含み、ヘアピントランスポゾン末端組成物が5’リン酸含有オリゴヌクレオチドを含む又はからなり、5’リン酸含有オリゴヌクレオチドが、5’末端に非転移トランスポゾン末端配列を示し且つ3’末端に転移トランスポゾン末端配列を示し且つ細胞内ステムループを形成するのに十分な長さの介在任意タグ配列を非転移トランスポゾン末端配列と転移トランスポゾン末端配列の間に示すものであり、標的DNAにヘアピントランスポゾン末端組成物が挿入されることでアニーリングされた5’タグ化DNA断片が生成される条件下で、そのために十分な時間インキュベートする工程;次いで、アニーリングされた5’タグ化DNA断片の集合を、インビトロ転位反応後に生じるアニーリングされた5’タグ化DNA断片中の一本鎖ギャップと同じ長さを単独又は組合せで有する1又は複数のランダム配列5’リン酸含有オリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートする工程であって、標的DNAの一本鎖ギャップにランダム配列オリゴヌクレオチドがアニーリングすることでアニーリングされた5’タグ化DNA断片の集合中の一本鎖ギャップが埋められる条件下で、そのために十分な時間、インキュベートする工程;次いで、アニーリングしたランダム配列オリゴヌクレオチドが互いに又は隣接する5’タグ化DNA断片の5’末端にライゲーションされる条件下で、そのために十分な時間、一本鎖ギャップが埋められ且つアニーリングされた5’タグ化DNA断片の集合を鋳型依存性リガーゼとインキュベートすることで、タグ化環状DNA断片のライブラリーを作製する工程、を含む。
方法の好ましい実施形態の1つは、インビトロ転位反応中で標的DNAを少なくとも1つのトランスポソームとインキュベートする工程であって、トランスポソームを構成する転移鎖の5’末端が5’リン酸基を有し、アニーリングされた5’タグ化DNA断片の集合が作製される条件下でそのために十分な時間インキュベートする工程;次いで、アニーリングされた5’タグ化dsDNA断片を変性させて5’タグ化ssDNA断片を得る工程(例えば95℃に加熱して急冷する);次いで、ライゲーション反応中で5’タグ化ssDNA断片を鋳型非依存性(又は非相同性(non−homologous))リガーゼとインキュベートする工程であって、5’タグ化ssDNA断片が分子内でライゲーションされて標的DNAの一部の配列及びタグ配列をそれぞれが示すタグ化環状ssDNA断片のライブラリーが作製される条件下でそのために十分な時間インキュベートする工程、を含む。
本発明者らが観察した特定の配列データは、サイズが10Kb未満のdsDNA分子を含む標的DNAの末端から得られた次世代配列データの提示が、その標的DNAの中央から得られた配列データの提示と比べて少ないことを示していた。理論により限定されるものではないが、この観察結果に対する説明の1つとして、2つのトランスポゾン末端組成物が直鎖dsDNA分子の末端に逆向きに挿入されたDNA断片を見つける確率が、2つのトランスポゾン末端組成物が直鎖dsDNA分子の中央に逆向きに挿入されたDNA断片を見つける確率よりも低い可能性がある。この問題を解決するために、本発明者らは、標的DNAを構成するdsDNA分子の末端の配列を示すDNA断片をより良く表すDNA断片ライブラリーを作製する更なる方法を開発した。
タグ化DNA断片のライブラリーを作製するための本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は更に、ジタグ化DNA断片、タグ化環状ssDNA断片、又は扇形DNA断片を含むタグ化DNA断片のライブラリーを増幅する工程を含む。
本発明の方法のためのキット及び組成物も本発明に含まれる。キットは、本発明の方法を実施するために有用な個々の組成物の組合せであり、組成物は方法中で一緒に使用するために最適化されている。組成物は、本発明の方法の少なくとも1つのステップのための個々の成分を含む。本発明は、本発明の任意の2つの新規な組成物若しくはキットの組合せ又はキットに用いられる任意の新規な組成物から構成され得る任意のキットを含む。いくつかの実施形態では、キット又は組成物は、本明細書に記載の任意のキット又は組成物の亜集合を含む又はからなり、これは、特定の目的又は用途に方法を適合できる柔軟性を使用者に与えたり、亜集合を含む又はからなるキット又は組成物と一緒に使用者が他の組成物を使用できるようにする等の任意の理由のための任意の適当な組合せであり得る。
本発明の組成物の一実施形態は、トランスポザーゼと(i)転移トランスポゾン末端配列を示す3’部分及びタグドメインの配列を示す5’部分を有する転移鎖、並びに(ii)非転移トランスポゾン末端配列のみを示す5’リン酸含有非転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とがインビトロ転位反応で活性な複合体を形成する、トランスポソーム組成物である。いくつかの実施形態では、タグドメインは次世代のシークエンシング又は増幅で使用するためのタグドメインである。いくつかの実施形態では、タグドメインは、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、増幅タグドメイン、及び転写プロモータードメインから選択される。
本発明の一実施形態は、次世代又は核酸増幅用の鋳型の調製に使用するための5’タグ化DNA断片のライブラリーを作製するためのキットであって、トランスポザーゼと、(i)転移トランスポゾン末端配列を示す3’部分及び次世代シークエンシング又は増幅反応で使用するためのタグドメインのための配列を示す5’部分を有する転移鎖並びに(ii)非転移トランスポゾン末端配列のみを示す5’リン酸含有非転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物と、を含み、トランスポザーゼがトランスポゾン末端組成物とインビトロ転位反応で活性な複合体を形成する、トランスポソーム組成物;及びインビトロ転位反応中での終濃度が10%になる量のジメチルホルムアミドを含む反応バッファー、を含む、キットである。
本発明の例示的実施形態の詳細な説明を以下のセクションに記載する。
I.トランスポザーゼ及びDNAポリメラーゼを用いたDNAの断片化及びジタグ化
III.標的DNAの断片化、タグ化、及び1種類のプライマーを用いた増幅
II.トランスポザーゼ及びリガーゼを用いたDNAの断片化及びタグ化
IV.トランスポザーゼ及びリガーゼを用いたds標的DNAからのタグ化環状ssDNA断片の作製
V.ヘアピントランスポゾン末端組成物のインビトロ転位によるdsDNAの断片化及びタグ化
本発明は、トランスポザーゼを用いて1又は複数の二本鎖(dsDNA)分子を含む又はからなる標的DNAから5’タグ化断片を作製し、その後、第1のタグとは異なるDNA配列を示す第2のタグを前記5’タグ化DNA断片の3’末端に連結する、方法、組成物、及びキットを含む。第1のタグは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポゾン末端の転移鎖の配列を示し、また、必要に応じて、前記転移トランスポゾン末端の配列の5’に1又は複数のその他の配列を示してもよい。第2のタグは、PCR増幅反応を行わずにDNAポリメラーゼを用いてインビトロで5’タグ化DNA断片の3’末端に連結される。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、1又は複数の二本鎖(dsDNA)分子を含む又はからなる標的DNAから、5’及び3’タグ化DNA断片を含むDNA断片のライブラリーを作製する方法であって、
以下の1〜4を提供する工程:
1.1又は複数の二本鎖(dsDNA)分子を含む又はからなる標的DNA(例えば、真核及び/又は原核のゲノムDNA又はRNAの逆転写により調製された二本鎖cDNA)
2.トランスポザーゼ(例えば野生型又は変異体のトランスポザーゼ;例えば野生型又は変異体のTn5トランスポザーゼ、例えばEZ−Tn5(商標)トランスポザーゼ、又は例えばHYPERMU(商標)MuAトランスポザーゼ、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製)、及び
3.転位反応中にトランスポザーゼと機能的複合体を形成できるトランスポゾン末端(例えば野生型又は変異体のTn5トランスポザーゼ、例えばEZ−Tn5(商標)トランスポザーゼにより認識される、19bp外側末端(「OE」)トランスポゾン末端、内側末端(「IE」)トランスポゾン末端、又は「モザイク末端」(「ME」)トランスポゾン末端、あるいは、例えばHYPERMU(商標)MuAトランスポザーゼにより認識されるR1及びR2トランスポゾン末端)であって、組み合わされて二本鎖トランスポゾン末端の配列を示す転移鎖及び非転移鎖からなる二本鎖DNAを含み、転移鎖が第1のタグの配列を示す、トランスポゾン末端、及び
4.DNAポリメラーゼによる伸張が行われているDNA分子の3’末端の下流にある鋳型鎖にアニーリングしているDNAを鎖置換又は消化するDNAポリメラーゼ(すなわち、DNAポリメラーゼは鎖置換活性及び/又は5’ヌクレアーゼ活性を有する。例えば、Taq DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、FAILSAFE(商標)DNAポリメラーゼミックス;phi29 DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼI、及びDISPLACEACE(商標)DNAポリメラーゼ、全て米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社から入手可能);
標的DNAの両方の鎖へのトランスポザーゼが触媒するトランスポゾン末端の挿入によりそれぞれが5’末端に第1のタグを有する5’タグ化DNA断片(例えば図2)が生成される条件下で、そのために十分な時間、標的DNAをトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端とインキュベートする工程;及び
DNAポリメラーゼにより5’タグ化DNA断片の3’末端が伸張される条件下で、そのために十分な時間、インビトロ転位反応で生成された5’タグ化DNA断片をDNAポリメラーゼとインキュベートすることで、非転移トランスポゾン末端配列の少なくとも一部を示す第2のタグを5’タグ化DNA断片に連結して5’及び3’タグ化DNA断片を作製する工程
を含む方法を提供する。
5.第1のトランスポザーゼにより認識されるトランスポゾン末端(この実施形態中では「第1のトランスポザーゼ」に認識される「第1のトランスポゾン末端と呼ぶ)とは異なるトランスポゾン末端を認識する第2のトランスポザーゼ;及び
6.転位反応中で第2のトランスポザーゼと機能的複合体を形成できる第2のトランスポゾン末端であって、組み合わされて二本鎖トランスポゾン末端の配列を示す転移鎖及び非転移鎖を含み、転移鎖が第2のタグにより示される配列に相補的な配列を示す、トランスポゾン末端
を更に提供する工程;及び
標的DNAへの第1及び第2のトランスポザーゼが触媒する第1及び第2のトランスポゾン末端の挿入によりそれぞれが5’末端に第1のトランスポゾン末端又は第2のトランスポゾン末端の転移鎖の配列を示すDNA断片が生成される条件下で、そのために十分な時間、標的DNAを第1のトランスポザーゼ及び第1のトランスポゾン末端並びに第2のトランスポザーゼ及び第2のトランスポゾン末端とインキュベートする工程;及び
dsDNAの変性又は熱サイクルを含まないDNA重合条件下で、DNAポリメラーゼにより5’タグ化DNA断片の3’末端が伸張されるのに十分な時間5’タグ化DNA断片をDNAポリメラーゼとインキュベートすることで第2のタグを5’タグ化DNA断片に連結し、増幅反応を行うことなく、タグ化DNA断片(例えば、5’及び3’タグ化DNA断片)のライブラリーを作製する工程
を含む。
いくつかの実施形態では、DNAポリメラーゼ及びタグドメインの鋳型を含むオリゴヌクレオチドを用いて、タグ化DNA断片のライブラリーに含まれる5’及び3’タグ化DNA断片の3’末端にタグドメインを付加する(例えば図19)。いくつかの実施形態では、タグドメインの付加に使用するDNAポリメラーゼは耐熱性DNAポリメラーゼであり、オリゴヌクレオチドはPCRプライマーであり、タグドメインはPCRを行うことで第2のタグに連結される。
本発明の好ましい方法の1つは、トランスポザーゼ及びそれと転位複合体を形成するトランスポゾン末端からなるトランスポソーム複合体をインビトロ転位反応中で標的DNAとインキュベートする工程であって、標的DNAの両方の鎖中の複数の部位に転移トランスポゾン末端が挿入される条件下でそのために十分な時間インキュベートする工程;インビトロ転位反応産物を鎖置換活性及び/又は5’ヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼとインキュベートする工程であって、5’末端に転移トランスポゾン末端が連結された標的DNAの各鎖の3’末端が標的DNAの逆鎖を鋳型として伸張される条件下で、そのために十分な時間インキュベートし、前記DNAポリメラーゼにより触媒されるそれぞれの伸張により、標的DNAの逆鎖に連結された転移トランスポゾン末端にアニーリングしている非転移トランスポゾン末端が置換又は消化され、その結果、5’末端に転移鎖を有し且つ3’末端に非転移鎖を有し且つそれぞれが標的DNAの異なる部分を含むジタグ化DNA断片のライブラリーが生成され、ジタグ化DNA断片の全集合が、その作製の元となった標的DNAの配列を実質的に表す、工程;及び、PCR熱サイクル条件下で、ジタグ化DNA断片のライブラリーと、耐熱性DNAポリメラーゼと、転移トランスポゾン末端配列の少なくとも一部を示す1種類のプライマーとをインキュベートすることでジタグ化DNA断片のライブラリーを増幅する工程、を含む。いくつかの好ましい実施形態では、方法は、耐熱性DNAポリメラーゼに基質として使用される1又は複数の標識dNTPの存在下で、ジタグ化DNA断片の増幅されたライブラリーを作製することにより、標識されたジタグ化DNA断片の増幅されたライブラリーを作製することを含む。
本発明は、トランスポザーゼを用いて1又は複数の二本鎖(dsDNA)分子を含む又はからなる標的DNAから5’タグ化断片を作製し、その後、第1のタグとは異なるDNA配列を示す第2のタグを前記5’タグ化DNA断片の3’末端に連結する、方法、組成物、及びキットを含む。第1のタグは、トランスポザーゼにより認識されるトランスポゾン末端の転移鎖の配列を示し、必要に応じて、前記転移トランスポゾン末端配列の5’に1又は複数のその他の配列を更に示す。第2のタグは核酸リガーゼを用いてインビトロで5’タグ化DNA断片の3’末端に連結される。
以下の1〜5を提供する工程:
1.1又は複数の二本鎖(dsDNA)分子を含む又はからなる標的DNA(例えば、真核及び/又は原核のゲノムDNA又はRNAの逆転写により調製された二本鎖cDNA)、
2.トランスポザーゼ(例えば野生型又は変異体のトランスポザーゼ;例えば野生型又は変異体のTn5トランスポザーゼ、例えばEZ−Tn5(商標)トランスポザーゼ、又は例えばHYPERMU(商標)MuAトランスポザーゼ、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社)、
3.転位反応中でトランスポザーゼと機能的複合体を形成できるトランスポゾン末端(例えば野生型又は変異体のTn5トランスポザーゼ、例えばEZ−Tn5(商標)トランスポザーゼにより認識される、19bp外側末端(「OE」)トランスポゾン末端、内側末端(「IE」)トランスポゾン末端、又は「モザイク末端」(「ME」)トランスポゾン末端、あるいは、例えばHYPERMU(商標) MuAトランスポザーゼにより認識されるR1及びR2トランスポゾン末端)であって、組み合わされて二本鎖トランスポゾン末端の配列を示す転移鎖及び非転移鎖からなる二本鎖DNAを含み、転移鎖が第1のタグの配列を示す、トランスポゾン末端、
4.DNA分子の3’ヒドロキシルにライゲーションさせることができる5’末端を有し、第2のタグの配列を示す、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチド、及び
5.核酸リガーゼ;
標的DNAへのトランスポザーゼが触媒するトランスポゾン末端の挿入によりそれぞれが5’末端に第1のタグを有する5’タグ化DNA断片が生成される条件下でそのために十分な時間、標的DNAをトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端とインキュベートする工程;及び
5’タグ化DNA断片の3’末端に第2のタグが連結されてタグ化DNA断片のそれぞれが5’末端に第1のタグを有し且つ3’末端に第2のタグを有する5’及び3’タグ化DNA断片のライブラリーが生成される条件下で、そのために十分な時間、5’タグ化DNA断片を核酸リガーゼ及びライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドとインキュベートする工程
を含む方法である。
いくつかの好ましい実施形態では、方法は、3’部分及び5’部分を含む又はからなるライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、3’部分が、5’タグ化DNA断片の3’末端に連結することを所望する任意の配列(すなわち、任意配列)を含む又はからなる第2のタグを示し、5’部分が、5’モノリン酸基を有し且つ5’末端にランダム配列(例えば約3〜約8ヌクレオチドからなるランダム配列)を示す、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを提供する工程を含む。いくつかの好ましい実施形態(例えば、トランスポザーゼが野生型又は変異体のTn5トランスポザーゼ(例えばEZ−Tn5(商標)トランスポザーゼ、又は例えばHYPERMU(商標) MuAトランスポザーゼ、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社)であり、核酸リガーゼが大腸菌DNAリガーゼである本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドの5’部分は4ヌクレオチドのランダム配列を示す。
核酸リガーゼを用いて5’タグ化DNA断片の3’末端に第2のタグを連結することを含む方法のいくつかの実施形態では、5’タグ化DNA断片の3’末端に隣接するライゲーション鋳型にライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドをアニーリングさせずに、第2のタグを示すライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを5’タグ化DNA断片の3’末端に直接ライゲーションする。これらの実施形態では、ライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドは、ランダム配列を示さず、5’タグ化DNA断片への連結を所望する第2のタグの配列のみを示す。これらの実施形態では、ライゲーション鋳型を用いずに一本鎖5’タグ化DNA断片の3’末端にライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドが直接ライゲーションされる。これらの方法の実施形態では、核酸リガーゼは、ライゲーション連結部位での相補的な配列へのアニーリングを用いずに、3’ヒドロキシル基を有する一本鎖DNA分子を5’モノリン酸基を有する一本鎖DNA分子にライゲーションさせることができる核酸リガーゼ(例えば、T4 RNAリガーゼ1、T4 RNAリガーゼ2、バクテリオファージTS2126耐熱性RNAリガーゼ、及びCIRCLIGASE(商標)DNAリガーゼ(米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製)から選択される)であり、方法は更に、5’タグ化DNA断片を核酸リガーゼ及びライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドとインキュベートする前に5’タグ化DNA断片を含むdsDNAを変性させるステップを含む。
本発明は試料中の標的DNAからDNAシークエンシング又は核酸増幅反応における鋳型として使用するためのタグ化環状ssDNA断片の集合を含むライブラリーを作製するための方法、組成物、及びキットを含む。一般的に、ライブラリー中の各タグ化環状ssDNA断片は、標的DNAの一部とタグが隣り合った配列を示す。
以下の1〜4を提供する工程:
1.1又は複数の二本鎖(dsDNA)分子を含む又はからなる標的DNA(例えば、真核及び/又は原核のゲノムDNA、あるいは、RNA依存性DNAポリメラーゼ又は逆転写酵素を用いたRNAの逆転写により第1のcDNA鎖を作製し、次いで第1のcDNA鎖にアニーリングさせたプライマーを伸張させてdsDNAを作製することで調製された二本鎖cDNA);
2.ランスポザーゼ(例えば野生型又は変異体のトランスポザーゼ;例えば野生型又は変異体のTn5トランスポザーゼ、例えばEZ−Tn5(商標)トランスポザーゼ、例えばHYPERMU(商標)MuAトランスポザーゼ、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社)、
3.転位反応中でトランスポザーゼと機能的複合体を形成できるトランスポゾン末端組成物(例えば野生型又は変異体のTn5トランスポザーゼ、例えばEZ−Tn5(商標)トランスポザーゼにより認識される、19bp外側末端(「OE」)トランスポゾン末端、19bp内側末端(「IE」)トランスポゾン末端、又は19bp「モザイク末端」)「ME」)トランスポゾン末端を含む又はからなる)であって、組み合わされて二本鎖トランスポゾン末端の配列を示す転移鎖及び非転移鎖を含む又はからなり、転移鎖がタグの配列を示す、トランスポゾン末端組成物;
4.5’モノリン酸及び3’ヒドロキシル基を有するssDNAを鋳型非依存的に分子内ライゲーション又は環状化できる鋳型非依存性又は非相同性の核酸リガーゼ(例えば、RNAリガーゼ分子の大部分がアデニル化されているファージTS2126耐熱性RNAリガーゼ);
トランスポザーゼにより触媒される標的DNAへの転移鎖の挿入により5’タグ化DNA断片(例えば図2)が生成される条件下で、そのために十分な時間、標的DNAをトランスポザーゼ及びトランスポゾン末端組成物とインキュベートする工程;
5’タグ化DNA断片を含む標的DNAを変性させて5’タグ化ssDNA断片を得る工程;及び
5’タグ化ssDNA断片が分子内でライゲーションされて、それぞれが標的DNAの一部の配列及びタグの配列を示すタグ化環状ssDNA断片のライブラリーが生成される条件下で、そのために十分な時間、5’タグ化ssDNA断片を核酸リガーゼとインキュベートする工程;
を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、5’タグ化直鎖ssDNA断片を環状化する本発明の方法において、(例えば、3’ヒドロキシル基及び5’モノリン酸基を有するssDNAの分子内ライゲーション、すなわち、環状化を行う)鋳型非依存性又は非相同性核酸リガーゼが用いられる。いくつかの好ましい実施形態では、核酸リガーゼは耐熱性RNAリガーゼである(例えば、バクテリオファージTS2126耐熱性RNAリガーゼ(米国特許第7,303,901号及びBlondal et al, Nucleic Acids Res 33: 135-142, 2005)、CIRCLIGASE(商標) ssDNAリガーゼ(米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製)、及び古細菌RNAリガーゼ(例えば、高温メタン生成菌RNAリガーゼ1又は「MthRnl」;Torchia, C et al., Nucleic Acids Res. 36:6218-6227, 2008)から選択される。「鋳型非依存性リガーゼ」又は「非相同性リガーゼ」とは、連結又はライゲーションすべきssDNAの末端に相補的配列をアニーリングさせずにssDNAのライゲーションを行う(すなわち、ライゲーションステップ中、2つの末端を互いに隣接させておくために2つの末端が相補的配列にアニーリングされない)リガーゼを意味する。これらの実施形態では、方法は、5’タグ化直鎖ssDNA断片を核酸リガーゼとインキュベートすることによりインビトロ転位反応で生成したアニーリングされた5’タグ化DNA断片を変性させるステップを含む。「分子内ライゲーション」とは、他のDNA分子の末端とライゲーションさせるのではなく、1つのssDNAの2つの末端を互いにライゲーションさせて環状ssDNA断片を作製することを意味する。
簡潔には、いくつかの実施形態では、方法は、dsDNAである標的DNAをインビトロ転位反応中でトランスポザーゼ及びヘアピントランスポゾン末端組成物とインキュベートして標的DNAを同時に断片化及びタグ化することで5’タグ化DNA断片の集合を含むライブラリーを作製する工程;次いで、標的DNAの一方の鎖の一部を含む各5’タグ化DNA断片の3’末端を、相補的部分(例えば標的DNAの逆鎖)を含む別の5’タグ化DNA断片の5’末端に連結することで、共有結合で閉じたタグ化環状DNA断片(例えば一本鎖の環状又はダンベル型構造を示す)のライブラリーを作製する工程、を含む。いくつかの好ましい実施形態では、連結ステップは、5’→3’エキソヌクレアーゼ(構造依存性5’ヌクレアーゼを含む)活性及び鎖置換の活性を有さないDNAポリメラーゼを用いて5’タグ化DNA断片の3’末端を伸張して5’タグ化DNA断片伸張産物を作製する工程及び鋳型依存性DNAリガーゼ(例えば、大腸菌DNAリガーゼ又は低温細菌若しくは低温バクテリオファージの鋳型依存性DNAリガーゼ)を用いて前記5’タグ化DNA断片伸張産物のそれぞれの3’末端を相補的な5’タグ化DNA断片伸張産物の5’末端にライゲーションする工程を含む。別の好ましい実施形態では、連結ステップは、インビトロ転位反応で生じた一本鎖ギャップを正確に埋める1又は複数の好適なサイズのランダム配列オリゴデオキシリボヌクレオチド(例えば、5’モノリン酸化又は5’アデニル化された、ランダム配列又は半ランダム配列オリゴデオキシリボヌクレオチド)(例えば、EZ−Tn5(商標)トランスポザーゼを用いたインビトロ転位により生じる一本鎖ギャップを埋めるための、ランダム配列又は半ランダム配列の9マー又はランダム配列の4マー及びランダム配列の5マーを含む又はからなる5’モノリン酸化ランダム配列オリゴデオキシリボヌクレオチド)と鋳型依存性DNAリガーゼ(例えば、大腸菌DNAリガーゼ又は低温細菌若しくは低温バクテリオファージの鋳型依存性DNAリガーゼ)と、5’タグ化DNA断片とを、ランダム配列オリゴヌクレオチドがアニーリングして5’タグ化DNA断片中の一本鎖ギャップを埋めてライゲーションされる条件下でそのために十分な時間インキュベートすることでタグ化環状DNA分子の集合を作製することを含む。
以下の1〜5を提供する工程:
1.1又は複数の二本鎖(dsDNA)分子を含む又はからなる標的DNA(例えば、真核細胞に由来するゲノム、ミトコンドリア、葉緑体若しくはその他のdsDNA及び/又は原核細胞に由来するゲノム若しくはエピソームDNA、又は真核及び/若しくは原核細胞のRNAを逆転写して第1のcDNA鎖を作製した後、第1のcDNA鎖にアニーリングさせたプライマーを伸張させることで調製した二本鎖cDNA);
2.トランスポザーゼ(例えば野生型又は変異体のトランスポザーゼ;例えば野生型又は変異体のTn5トランスポザーゼ、例えばEZ−Tn5(商標)トランスポザーゼ、例えばHYPERMU(商標)MuAトランスポザーゼ、米国ウィスコンシン州マディソンのエピセンターバイオテクノロジーズ社製);
3.転位反応中でトランスポザーゼと機能的複合体を形成でき且つタグの配列を示すヘアピントランスポゾン末端組成物であって、5’末端に非転移トランスポゾン末端配列(例えば、本明細書では、EZ−Tn5(商標)の非転移トランスポゾン末端配列に関して「MENTS」と呼ぶ)、3’末端に転移トランスポゾン末端配列(例えば、本明細書では、EZ−Tn5(商標)の転移トランスポゾン末端配列に関して「METS」と呼ぶ)、及び非転移トランスポゾン末端配列と転移トランスポゾン末端配列との間に分子内ステムループを形成できる十分な長さの介在配列(例えば、タグを付与するため等の任意の目的のためのもの)を示す5’リン酸含有オリゴヌクレオチドを含む又はからなり、ステムが、転位のための機能的な複合体をトランスポザーゼと形成する二本鎖トランスポゾン末端の配列を示し(例えば、ステムは、野生型又は変異体のTn5トランスポザーゼにより認識される、例えばEZ−Tn5(商標)トランスポザーゼにより認識される、19bp外側末端(「OE」)トランスポゾン末端、19bp内側末端(「IE」)トランスポゾン末端、又は19bp「モザイク末端」(「ME」)トランスポゾン末端の配列を示す)(又は、例えばMuAトランスポザーゼ用のR1及びR2MuAトランスポゾン末端)、ループが、任意配列であってよい介在配列を示す、ヘアピントランスポゾン末端組成物;
4.(a)5’ヌクレアーゼ活性(5’→3’エキソヌクレアーゼ活性及び構造依存性5’ヌクレアーゼ活性を含む)及び鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼ(例えばT4 DNAポリメラーゼ);又は(b)単独又は組み合わせた長さが、トランスポザーゼ及びヘアピントランスポゾン末端組成物を用いた転位反応後に生じる5’タグ化DNA断片中の一本鎖ギャップと同じである、1又は複数のサイズのランダム配列オリゴヌクレオチド;
5.鋳型依存性リガーゼ(例えば、大腸菌DNAリガーゼ又は低温細菌若しくは低温バクテリオファージの鋳型依存性リガーゼ);
標的DNAにヘアピントランスポゾン末端組成物が挿入されて5’タグ化DNA断片の集合が生成される条件下で、そのために十分な時間、インビトロ転位反応中で標的DNAをトランスポザーゼ及びヘアピントランスポゾン末端組成物とインキュベートする工程(例えば、図2及び図3参照);
DNA断片中の一本鎖ギャップが埋められ且つ各5’タグ化DNA断片の3’末端が伸張されて標的DNAの相補的部分を含む別の5’タグ化DNA断片の5’末端に連結される条件下でそのために十分な時間5’タグ化DNA断片をインキュベートすることで、タグ化環状DNA断片のそれぞれが標的DNAの一部の両方の鎖の配列及びタグの配列を示すタグ化環状DNA断片のライブラリーを作製する工程;
を含む、方法である。
「pMETS」とは、EZ−Tn5(商標)トランスポゾン末端配列を示す19塩基の5’リン酸含有一本鎖トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドを指す。
5’pAGA TGT GTA TAA GAG ACAG 3’(配列番号1)
5’AGA TGT GTA TAA GAG ACAG3’(配列番号1)
5’pCTG TCT CTT ATA CAC ATCT3’(配列番号2)
5’pAGA TGT GTA TAA GAG ACAG3’(配列番号1)
3’ TCT ACA CAT ATT CTC TGTCp5’(配列番号2)
5’ AGA TGT GTA TAA GAG ACAG 3’(配列番号1)
3’ TCT ACA CAT ATT CTC TGTCp 5’(配列番号2)
5’pGCC TTG CCA GCC CGC TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG3’(配列番号4)
5’pGCC TTG CCA GCC CGC TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG 3’
3’T CTA CAC ATA TTC TCT GTCp5’
5’pTGA GCG GGC TGG CAA GGC3’(配列番号5)
5’GCC TCC CTC GCG CCA TCA GAG ATG TGT ATA AGA GAC AG3’(配列番号7)
5’GCC TCC CTC GCG CCA TCA GAG ATG TGT ATA AGA GAC AG3’
3’TC TAC ACA TAT TCT CTG TCp5’
5’GCC TTG CCA GCC CGC TCA GAG ATG TGT ATA AGA GAC AG3’(配列番号8)
5’GCC TTG CCA GCC CGC TCA GAG ATG TGT ATA AGA GAC AG3’
3’TC TAC ACA TAT TCT CTG TCp5’
5’GCC TCC CTC GCG CCA TCA G3’(配列番号9)
5’GCC TTG CCA GCC CGC TCA G3’(配列番号10)
5’GCC TCC CTC GCG CCA TCA G ACGCTCGACA AG ATG TGT ATA AGA GAC AG3’(配列番号11)
5’CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG AGA TGT GTA TAA GAG ACA G3’(配列番号12)
5’CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG AGA TGT GTA TAA GAG ACA G3’(配列番号13)
5’CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC3’(配列番号14)
5’CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TC3’(配列番号15)
5’AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACG CCT CCC TCG CGC CAT CAG3’(配列番号16)
5’ CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCT GCC TTG CCA GCC CGC TCA G3’(配列番号17)
5’ CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT GCATGT CGG TCT GCC TTG CCA GCC CGC TCA G3’(配列番号18)
5’AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA3’(配列番号19)
5’CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA3’(配列番号20)
5’PCTGTCTCTTATACACATCT−(N)x−AGATGTGTATAAGAGACAG3’(配列番号3)
NN
N AGATGTGTATAAGAGACAG 3’
N TCTACACATATTCTCTGTCp5’(配列番号:3)
NN
100mM酢酸マグネシウム
660mM酢酸カリウム
5X TA−DMF反応バッファー: 165mMトリス酢酸、pH7.8
50mM酢酸マグネシウム
330mM酢酸カリウム
50%v/vジメチルホルムアミド
10X TMgCl反応バッファー: 100mMトリスクロリド、pH8.0
50mM塩化マグネシウム
5X TMgCl−DMF反応バッファー: 50mMトリスクロリド、pH8.0
25mM塩化マグネシウム
50%v/vジメチルホルムアミド
10X TMgAc反応バッファー: 100mMトリス酢酸、pH7.6
50mM塩化マグネシウム
5X TMgAc−DMF反応バッファー: 50mMトリス酢酸、pH7.6
25mM塩化マグネシウム
50%v/vジメチルホルムアミド
100mM酢酸マグネシウム
660mM酢酸カリウム
EZ−Tn5(商標)トランスポザーゼ及びEZ−Tn5(商標)トランスポゾン末端を用いたインビトロ転位を介したDNAの断片化及び5’タグ化
以下の反応混合物を混合した。
5マイクロリットル 10X EZ−Tn5(商標)転位バッファー
1マイクログラム 標的DNA1〜40マイクロリットル
2マイクロリットル pMEDS(25マイクロモル)*
2マイクロリットル EZ−Tn5(商標)トランスポザーゼ(10ユニット/マイクロリットル)
50マイクロリットル
種々のEZ−Tn5(商標)Tn5トランスポザーゼ濃度を用いた5’タグ化DNA断片転位産物のサイズ範囲
濃度90ユニット/マイクロリットルのTn5高活性EZ−Tn5(商標)トランスポザーゼ(エピセンター社製)を終濃度45、22.5、11.3、及び9ユニット/マイクロリットルに希釈した。各濃度の酵素2マイクロリットルを、1マイクログラムのファージT7D111標的DNA(サイズ約39Kbp)及び1マイクロモルのpMEDSトランスポゾン末端と共にTAバッファー中で反応混合物の最終体積50マイクロリットルで37℃にて1時間インキュベートした。
種々のpMEDSトランスポゾン末端濃度を用いた5’タグ化DNA断片転位産物のサイズ範囲
25マイクロモルのpMEDSトランスポゾン末端ストックをT10E1バッファーで2倍、4倍、及び8倍に段階希釈した。次いで、2マイクロリットルの各トランスポゾン末端希釈物及びトランスポゾン末端を含まないバッファー対照を、1X TAバッファー、1マイクログラムのファージ7D111標的DNA、及び0.4ユニット/マイクロリットルの高活性Tn5トランスポザーゼを含む50マイクロリットルの反応液中で37℃にて1時間インキュベートした。
種々のトランスポソーム濃度を用いた5’タグ化DNA断片転位産物のサイズ範囲
12.5μMのTSaseを12.5μMのA−MEDSトランスポゾン末端組成物又は12.5μMのB−MEDSトランスポゾン末端組成物と37℃で60分間プレインキュベートすることでそれぞれ「A−MEDSトランスポソーム」及び「B−MEDSトランスポソーム」を形成した。A−MEDS及びB−MEDSトランスポソームを同じ比率で混合して「A/Bトランスポソーム」を形成した。
ジメチルホルムアミド存在下で55℃及び37℃における標的DNAの断片化及び5’タグ化
標的DNAの断片化及び5’タグ化に対するジメチルホルムアミドの影響を調べるために、MEトランスポソーム又はA/Bトランスポソームを用いて以下のようにHeLaゲノムDNAを断片化及びタグ化した
MuAトランスポザーゼを用いた標的DNAの断片化タグ化
終濃度1ユニット/マイクロリットルのHyperMu(商標) MuAトランスポザーゼ(エピセンター社製)、次いで、反応混合物1マイクロリットル当たり約0.01〜約0.5マイクログラムタンパク質の一連の濃度のMuAトランスポザーゼタンパク質を、MuAトランスポザーゼ反応バッファー(エピセンター社製)、1マイクログラムのファージT7D111標的DNA、及び1マイクロモルのpR1R2MuAトランスポゾン末端を含む50マイクロリットルの反応液中で37℃にて1時間インキュベートした。
5’タグ化DNA断片の3’末端のタグ化
A.2つのプライマーによるPCR
転位により生成された5’タグ化DNA断片の3’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、以下の反応を行う。
25マイクロリットル FailSafe(商標)PCR PreMix C
1マイクロリットル FailSafe(商標)DNAポリメラーゼ(エピセンター社製)
2マイクロリットル 2つの異なる転移トランスポゾン末端の5’部分のそれぞれに1つが相補的なそれぞれ5マイクロモルのPCRオリゴヌクレオチドプライマー
50マイクロリットル 全反応体積
94℃、10秒
55℃、10秒
72℃、2分
転位により生成された5’MEタグ化断片の3’末端をME配列でタグ化するために以下の反応を行った。
25マイクロリットル FailSafe(商標)PCR PreMix C
1マイクロリットル FailSafe(商標)DNAポリメラーゼ(エピセンター社製)
1マイクロリットル PCRオリゴヌクレオチドプライマーとして5マイクロモルのpMETS
50マイクロリットル
94℃、10秒
55℃、10秒
72℃、2分
DNA断片ライブラリーの増幅及びディープシークエンシング
ライブラリー調製前に増幅することができる非選択的DNA断片ライブラリーを作製するために、DNA断片を作製し、「MEトランスポソーム」を用いて3’末端及び5’末端でタグ化した。
・72℃/2:00*
・98℃/1:00
・(98℃/0:10、55℃/0:10、72℃/1:00)25サイクル
・4℃維持
*−転位により生成された5’タグ化DNA断片の3’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、変性ステップの前に反応産物を鎖置換型のポリメラーゼミックス(FailSafe(商標))及びdNTPとインキュベートした(図7参照)。
アダプターオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより更なる5’及び3’シークエンシングタグ情報を付加することによる、ロシュ/454FLXに適合するバーコード化されたシークエンシングライブラリーの調製
454GS FLXシークエンシングのemPCRに直接使用することができるバーコード化されたDNA断片ライブラリーを作製するために、MEトランスポソームを用いてラムダゲノムDNAを断片化及び5’タグ化した。PCRに非選択的アダプターオリゴヌクレオチドを用いて、DNAライブラリーに、454FLXのemPCR及びシークエンシング用のアダプター並びにバーコード配列を付加した(図10)。
・72℃/5:00*
・98℃/2:00
・(98℃/0:10、37℃/0:30、72℃/3:00)4サイクル
・(98℃/0:10、64℃/3:00)6サイクル
・4℃維持
*−転位により生成された5’タグ化DNA断片の3’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、変性ステップの前に反応産物を鎖置換型のポリメラーゼミックス(FailSafe(商標))及びdNTPとインキュベートした(図7参照)。
50ngのウイルスアンプリコンcDNAから作製したロシュ/454FLX Titaniumに適合するシークエンシングライブラリーのディープシークエンシング
ロシュ/454FLX TitaniumシークエンシングのemPCRに直接使用することができる非選択的DNA断片ライブラリーを作製するために、アンプリコンDNAをMEトランスポソームで断片化及び5’タグ化した。非選択的アダプターオリゴヌクレオチドを用いてDNAライブラリーにロシュ/454FLX TitaniumのemPCR及びシークエンシング用のアダプター配列を付加した(図10)。
・72℃/5:00*
・98℃/2:00
・(98℃/0:10、55℃/0:30、72℃/3:00)4サイクル
・(98℃/0:10、64℃/3:00)6サイクル
・4℃維持
*−転位により生成された5’タグ化DNA断片の3’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、変性ステップの前に反応産物を鎖置換型のポリメラーゼミックス(FailSafe(商標))及びdNTPとインキュベートした(図7参照)。
アダプターオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより更なる5’及び3’シークエンシングタグ情報を付加することによる、イルミナ社のGAIIに適合するバーコード化シークエンシングライブラリーの調製
イルミナGAIIシークエンシングのbPCRに直接使用することができるDNA断片ライブラリーを作製するために、A/Bトランスポソームを用いてラムダゲノムDNAを断片化及び5’タグ化した。非選択的アダプターオリゴヌクレオチドを用いて、DNAライブラリーにイルミナ社のGAIIのbPCRアダプター及びバーコード配列を付加した(図13)。
・72℃/5:00*
・98℃/2:00
・(98℃/0:10、58℃/0:30、72℃/3:00)10サイクル
・4℃維持
*−転位により生成された5’タグ化DNA断片の3’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、変性ステップの前に反応産物を鎖置換型のポリメラーゼミックス(FailSafe(商標))及びdNTPとインキュベートした(図8参照)。
イルミナ社のGAIIに適合するシークエンシングライブラリーのディープシークエンシング
イルミナ社のGAIIシークエンシングのbPCRに直接使用することができる非選択的DNA断片ライブラリーを作製するために、A/Bトランスポソームを用いて大腸菌CC118ゲノムDNAを断片化及び5’タグ化した。非選択的アダプターオリゴヌクレオチドを用いてDNAライブラリーにイルミナ社のGAIIのbPCRアダプターを付加した(図13)。
・72℃/5:00*
・98℃/2:00
・(98℃/0:10、58℃/0:30、72℃/3:00)10サイクル
・4℃維持
*−転位により生成された5’タグ化DNA断片の3’末端を転移トランスポゾン末端配列でタグ化するために、変性ステップの前に反応産物を鎖置換型のポリメラーゼミックス(FailSafe(商標))及びdNTPとインキュベートした(図8参照)。
従来の方法と本発明の実施形態及びキット用プロトコールの比較
本発明の方法によるタグ化DNA断片ライブラリー調製のワークフロー及びタイムラインを、現在一般的に用いられている方法によりそのようなライブラリーを調製するためのワークフロー及びタイムラインと比較する。プロセス工程及び各工程に必要な時間を比較した表を図15に示す。本発明の方法では、工程数、手作業の時間、及び全体の時間が少ない。
EZ−Tn5(商標)トランスポザーゼ及びヘアピンEZ−Tn5(商標)トランスポゾン末端組成物を用いるインビトロ転位を介したDNAの断片化及びタグ化
以下の成分を混合してヘアピントランスポソーム(商標;すなわち、トランスポザーゼとのヘアピン型トランスポゾン末端組成物複合体)を終濃度25マイクロモルで形成した(図16参照)。
27マイクロリットル EZ−Tn5(商標)トランスポザーゼ(91.4マイクロモル)
63マイクロリットル トランスポザーゼ貯蔵バッファー
100マイクロリットル
5マイクロリットル 10X EZ−Tn5(商標)転位バッファー
1マイクログラム 標的DNA1〜40マイクロリットル
0、1、2、4、又は6マイクロリットル 25マイクロモルのヘアピントランスポソーム(商標)
50マイクロリットル
タグ化環状DNA断片はT5エキソヌクレアーゼに抵抗性である
PCR Clean−up NucleoTraP(登録商標)CR(マッハライ・ナーゲル社(Macherey−Nagel, GmbH)製)をメーカーの取扱説明書に従って用いて、実施例14の5’タグ化DNA断片を単離した。タグ化環状DNA断片を作製するために、回収したDNAを、dNTPS及びβ−NAD存在下で、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有さない非鎖置換型ポリメラーゼ(例えばT4 DNAポリメラーゼ)及び鋳型依存性リガーゼ(例えば大腸菌リガーゼ)とインキュベートした。
2マイクロリットル 10X EZ−Tn5(商標)転位バッファー
1マイクロリットル 2mM β−NAD
1マイクロリットル 4mM dNTP
1マイクロリットル 大腸菌DNAリガーゼ(10U/μl)
1マイクロリットル T4ポリメラーゼ(0.5U/μl)
20マイクロリットル
核酸リガーゼ及びライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを用いた、転位により生成された5’タグ化DNA断片の3’末端のタグ化
上記(実施例1)のサイズ化手順で得られた5’タグ化断片化DNAを、核酸リガーゼ及びライゲーションタグ化用オリゴヌクレオチドを用いた5’タグ化DNA断片の3’末端のタグ化に用いた(図21)。
5マイクロリットル 10X リガーゼ反応バッファー
(0.2M トリス−HCl pH8.3、100mM MgCl2、250mM KCl、5mM β−NAD)
1マイクロモル 4N454Bオリゴヌクレオチド
(5’pNNNNCTGAGCGGGCTGGCAAGGC3’(配列番号6))
1マイクロリットル 大腸菌DNAリガーゼ(10ユニット/マイクロリットル)
1マイクロリットル 二重タグ化5’及び3’タグ化DNA断片
1マイクロリットル 5マイクロモルのPCRプライマー1(pMETS)
1マイクロリットル 5マイクロモルのPCRプライマー2
(5’ATA GGC GCG CCG CCT TGC CAG CCC GCT CAG3’0(配列番号21))
1マイクロリットル FailSafe(商標)DNAポリメラーゼ
25マイクロリットル FailSafe(商標)2X PCR PreMix C
50マイクロリットル
94℃、10秒
55℃、10秒
72℃、2分
p454.1MEDSトランスポゾン末端組成物及びEZ−Tn5(商標)トランスポザーゼを用いるインビトロ転位を介したDNAの断片化及び5’タグ化により得られたタグ化ssDNA断片の環状化
以下の反応液中で、p454MEDS EZ−Tn5(商標)トランスポゾン末端組成物を用いてT7D111ゲノムDNAを5’末端タグ化及び断片化した。
5マイクロリットル 10X EZ−Tn5(商標)転位バッファー
1マイクログラム 標的DNA1〜40マイクロリットル
2マイクロリットル p454.1MEDSトランスポゾン末端組成物(25μM)
2マイクロリットル EZ−Tn5(商標)トランスポザーゼ(10ユニット/マイクロリットル)
50マイクロリットル 最終反応体積
1マイクロリットル 330mMトリス酢酸、pH7.8、660mM KOAc
1マイクロリットル 50mM MnCl2
4マイクロリットル 5Mベタイン
10マイクロリットル 20μg /ml 変性させた5’タグ化断片化DNA
4マイクロリットル 100U/μl CIRCLIGASE(商標)ssDNAリガーゼ(エピセンター社製)
20マイクロリットル 最終反応体積
タグ化環状ssDNAのPCR分析
環状化を実証するために、pMETS及びpc454.1をプライマーとして用いてPCR分析を行った。このPCRでは、ライゲーションした環状ssDNAだけが増幅され、環状ssDNAのサイズに対応する直鎖dsDNA産物が生成される。PCR反応は以下のように行った。
1マイクロリットル エキソヌクレアーゼ処理されたCircLigase反応(1:1000)
1マイクロリットル プライマーとして5μM pMETSオリゴヌクレオチド
1マイクロリットル プライマーとして5μM pc454.1オリゴヌクレオチド
1マイクロリットル FailSafe(商標)DNAポリメラーゼ
25マイクロリットル FailSafe(商標)2X PCR PreMix C
50マイクロリットル 最終反応体積
94℃、10秒
50℃、10秒
72℃、1分
Claims (88)
- 標的DNAのタグ化DNA断片のライブラリーを作製する方法であって、
i)前記標的DNAを、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端又は5’部分にタグドメインを有する転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物と、前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
a)前記標的DNAが断片化されて複数の標的DNA断片が生成され、
b)前記トランスポゾン末端又は前記トランスポゾン末端組成物の転移鎖が前記複数の標的DNA断片のそれぞれの5’末端に連結されて、
複数の5’タグ化標的DNA断片が生成される、工程;及び
ii)前記複数の5’タグ化標的DNA断片を、少なくとも1つの核酸修飾酵素と、3’タグが前記5’タグ化標的DNA断片の3’末端に連結されてジタグ化標的DNA断片を含むが生成される条件下でインキュベートする工程と
を含む、方法。 - 標的DNAの断片をタグ化する方法であって、
i)標的DNAを、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端又は5’部分にタグドメインを含む転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物と、前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
a)前記標的DNAが断片化され;
b)前記トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の前記転移鎖が前記標的DNAの断片の5’末端に連結されて、
5’タグ化標的DNA断片が生成される工程;及び
ii)前記5’タグ化標的DNA断片を、核酸修飾酵素と、前記5’タグ化標的DNAの3’末端に3’タグが連結されてジタグ化標的DNA断片が生成される条件下でインキュベートする工程と
を含む、方法。 - 前記核酸修飾酵素がDNAポリメラーゼであり、前記3’タグが前記5’タグ化標的DNA断片の前記3’末端の伸張により形成され、前記DNAポリメラーゼが鋳型依存性DNAポリメラーゼ及び鋳型非依存性DNAポリメラーゼからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記鋳型依存性DNAポリメラーゼが鎖置換活性及び/又は5’ヌクレアーゼ活性を有する、請求項2に記載の方法。
- 前記核酸修飾酵素がリガーゼであり、前記3’タグが前記5’タグ化標的DNA断片の前記3’末端へのオリゴヌクレオチドのライゲーションにより形成され、前記リガーゼが鋳型依存性リガーゼ及び鋳型非依存性リガーゼからなる群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記転移末端が、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの1又は複数を含むタグドメインを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タグドメインが、ロシュ社の454A及び454Bシークエンシングタグ、イルミナ(商標)社のSOLEXA(商標)シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のSOLID(商標)シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のSMRT(商標)シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグドメインである、請求項6に記載の方法。
- 1又は複数の前記5’タグ化標的DNA断片及び/又は前記ジタグ化標的DNA断片の増幅を更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅が、PCR増幅反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写仲介増幅反応、又はループ仲介増幅反応の1又は複数の使用を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記増幅が、前記DNA断片ライブラリーを含む前記5’タグ化標的DNA断片又は前記DNA断片ライブラリーを含む前記ジタグ化標的DNA断片の非選択的増幅を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記トランスポゾン末端組成物が、核酸配列の少なくとも1つのヌクレオチドが異なる複数の転移鎖を含み、前記増幅が、前記5’末端のタグ又はタグドメインの核酸配列に基づく前記ジタグ化DNA断片の選択的増幅を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記選択的増幅が、少なくとも1つのヌクレオチドが異なる複数の5’末端タグ又はタグドメインを含む前記ジタグ化DNA断片の選択的増幅を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記増幅が、前記ジタグ化標的DNA断片の前記3’タグに相補的な1種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記増幅が、1種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる鎖置換増幅反応を含み、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、リボヌクレオチドのみからなるか、プリンリボヌクレオチドのみからなるか、ピリミジン2’−F−2’−デオキシリボヌクレオチドのみからなり、前記鎖置換増幅反応が鎖置換型DNAポリメラーゼ及びリボヌクレアーゼHを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記増幅が、3’末端部分をそれぞれが含む第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含み、前記第1のPCRプライマーの少なくとも前記3’末端部分が前記ジタグ化標的DNA断片の前記3’タグに相補的であり、前記第2のPCRプライマーの少なくとも前記3’末端部分が前記ジタグ化標的DNA断片の前記5’タグ又はタグドメインの少なくとも一部の配列を示す、請求項8に記載の方法。
- 前記第1又は第2のオリゴヌクレオチドプライマーが5’末端部分を含み、前記第1のプライマーの少なくとも前記5’末端部分が前記ジタグ化標的DNA断片の前記3’タグに相補的でないか、前記第2のプライマーの前記5’部分が前記ジタグ化標的DNA断片の前記5’タグ又はタグドメインの少なくとも一部の配列を示さない、請求項15に記載の方法。
- 前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーがそれぞれ5’末端部分を含み、前記第1のPCRプライマーの少なくとも前記5’末端部分が前記ジタグ化標的DNA断片の前記3’タグに相補的でなく且つ/又は前記第2のPCRプライマーの前記5’末端部分が前記ジタグ化標的DNA断片の前記5’タグドメインの少なくとも一部の配列を示さない、請求項15に記載の方法。
- 標的DNAからタグ化環状一本鎖DNA断片の集合を作製する方法であって、
i)標的DNAと、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端又は5’部分にタグドメインを有し3’部分にトランスポゾン末端を有する転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とを、前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
a)前記標的DNAが断片化されて複数の標的DNA断片が生成され、
b)前記トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の前記転移鎖が前記複数の前記標的DNA断片のそれぞれの5’末端に連結されて
5’タグ化標的DNA断片の集合が生成される、工程と;
ii)前記5’タグ化標的DNA断片を変性させて一本鎖5’タグ化標的DNA断片を生成する工程と;
iii)前記一本鎖5’タグ化標的DNA断片と核酸リガーゼを、前記一本鎖5’タグ化標的DNA断片が分子内ライゲーションしてそれぞれが前記転移鎖の配列及び前記標的DNAの一部の配列を示すタグ化環状一本鎖DNA断片を形成する条件下でインキュベートする工程と
を含む、方法。 - 前記タグドメインが切断部位の配列を示し、方法が更に、前記タグ化環状一本鎖DNA断片を、切断酵素組成物を含む少なくとも1つの酵素とインキュベートする工程を含み、前記切断酵素組成物により前記タグ化環状一本鎖DNA断片が切断されてジタグ化直鎖一本鎖DNA断片が生成される、請求項18に記載の方法。
- 前記タグドメインが制限部位の配列を示し、方法が更に、
iv)前記タグ化環状一本鎖DNA断片に、前記タグドメインに相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程;
v)前記制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼと前記タグ化環状一本鎖DNA断片をインキュベートする工程であって、
前記制限エンドヌクレアーゼにより前記タグ化環状一本鎖DNA断片が切断されてジタグ化直鎖一本鎖DNA断片が生成される工程
を含む、請求項18に記載の方法。 - 前記タグ化環状一本鎖DNA断片及び/又は前記ジタグ化直鎖一本鎖DNA断片の1又は複数の増幅を更に含む、請求項18〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅が、3’末端をそれぞれが含む第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含み、前記第1のPCRプライマーの少なくとも前記3’末端部分が前記タグ化環状一本鎖DNA断片又は前記ジタグ化直鎖一本鎖DNA断片中の前記転移鎖の前記配列の少なくとも一部に相補的であり、前記第2のPCRプライマーの少なくとも前記3’末端部分が前記タグ化環状一本鎖DNA断片又は前記ジタグ化直鎖一本鎖DNA断片中の前記転移鎖の相補体の少なくとも一部に相補的である、請求項21に記載の方法。
- 前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが5’末端部分を含み、前記第1のPCRプライマーの前記5’末端部分が前記タグ化環状一本鎖DNA断片中又は前記ジタグ化直鎖一本鎖DNA断片中の前記転移鎖の前記配列に相補的でなく、前記第2のPCRプライマーの5’末端部分が前記タグ化環状一本鎖DNA断片中又は前記ジタグ化直鎖一本鎖DNA断片中の前記転移鎖の相補体に相補的でない、請求項22に記載の方法。
- 標的DNAからタグ化環状DNA断片の集合を作製する方法であって、
i)標的DNAと、トランスポザーゼと、5’末端に非転移鎖配列を示し且つ3’末端に転移鎖配列を示し且つタグドメインを含む介在ループ配列を示すオリゴヌクレオチドを含むヘアピントランスポゾン末端組成物とを、前記オリゴヌクレオチドが分子内ステムループを形成でき且つ前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
a)前記標的DNAが断片化されて複数の標的DNA断片が生成され、
b)前記ヘアピントランスポゾン末端組成物の前記オリゴヌクレオチドが前記複数の標的DNA断片のそれぞれの5’末端に連結され、
5’タグ化標的DNA断片の集合が生成される工程と、
ii)前記5’タグ化標的DNA断片の集合と、鋳型依存性リガーゼと、
a)5’→3’エキソヌクレアーゼ活性、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性、及び鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼ;又は
b)前記トランスポザーゼ及び前記ヘアピントランスポゾン末端組成物を用いた転位反応後に生じる前記5’タグ化DNA断片中の一本鎖ギャップと同じ長さを単独又は組合せで有する1又は複数のサイズのランダム配列オリゴヌクレオチドとを、
前記5’タグ化標的DNA断片中の一本鎖ギャップが埋められ且つ各前記5’タグ化DNA断片の3’末端が前記標的DNAの相補的部分を含む別の前記5’タグ化DNA断片の5’末端に連結される条件下で
インキュベートする工程であって、ループ構造中に前記タグドメインを含み且つ前記標的DNAの一部の両方の鎖を含むタグ化環状DNA断片が形成される工程と
を含む方法。 - 前記ステップii)の連結が、
I)ステップi)で得られた前記5’タグ化DNA断片と前記DNAポリメラーゼを各前記5’タグ化DNA断片の3’末端が伸張されて5’タグ化DNA断片伸張産物の集合が形成される条件下でインキュベートする工程;及び
II)前記5’タグ化DNA断片伸張産物と前記鋳型依存性リガーゼを前記5’タグ化DNA断片伸張産物がライゲーションされる条件下でインキュベートすることで前記タグ化環状DNA断片を作製する工程
を含む、請求項24に記載の方法。 - 前記DNAポリメラーゼ及び前記リガーゼが混合物中に提供され、前記ステップI)及びII)が単一の反応混合物中で行われる、請求項25に記載の方法。
- 前記ステップii)の連結が、前記ステップi)で得られた前記5’タグ化DNA断片と、前記1又は複数のサイズのランダム配列オリゴヌクレオチド及び前記鋳型依存性リガーゼとを、前記ランダム配列オリゴヌクレオチドがアニーリングして一本鎖ギャップを埋め、互いに又は隣接する前記5’タグ化DNA断片の末端にライゲーションされる条件下でインキュベートすることでタグ化環状DNA断片を形成する工程を含む、請求項24に記載の方法。
- 直鎖DNA、ライゲーションされていないランダム配列オリゴヌクレオチド、及び/又は標的DNAに連結されていないヘアピントランスポゾン末端組成物からの前記タグ化環状DNA断片の分離を更に含む、請求項24に記載の方法。
- 前記タグ化環状DNA断片を含む前記反応混合物をT5エキソヌクレアーゼで処理して直鎖DNAを除去する工程を更に含む、請求項26に記載の方法。
- 前記タグ化環状DNA断片を前記ループ構造のそれぞれで切断し、それぞれの鎖が5’末端に前記タグの一部を有し且つ3’末端に前記タグの一部を有する扇形二本鎖DNA断片を作製する工程を更に含む、請求項24〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ループ構造中の前記タグ配列が制限部位を含み、
iv)前記タグ化環状DNA断片に、前記タグ配列中の前記制限部位に相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程;
v)前記タグ化環状DNA断片を、前記制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼとインキュベートする工程;
を更に含み、
前記制限エンドヌクレアーゼにより前記タグ化環状DNA断片が切断されて前記扇形二本鎖DNA断片が生成される
請求項30に記載の方法。 - 前記ループ構造中の前記タグドメインが、切断酵素組成物を用いて切断可能な1又は複数の部位を含み、前記タグ化環状DNA断片と前記切断酵素組成物を、前記タグ化環状DNA断片が前記切断可能な部位で切断されて前記扇形二本鎖DNA断片が生成される条件下でインキュベートする工程を更に含む、請求項30に記載の方法。
- 前記切断酵素組成物がN−グリコシラーゼ及びAPエンドヌクレアーゼを含む、請求項19又は32に記載の方法。
- 前記N−グリコシラーゼが、ウラシル−N−グリコシラーゼ、APエンドヌクレアーゼ、及びFPGタンパク質から選択され、前記APエンドヌクレアーゼが大腸菌エンドヌクレアーゼIII又はエンドヌクレアーゼIVから選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記扇形二本鎖DNA断片を変性させてジタグ化直鎖一本鎖DNA断片を作製することを更に含む、請求項30〜34のいずれか一項に記載の方法。
- DNAシークエンシング法又は増幅反応の鋳型として前記DNA断片を使用することを更に含む、請求項24〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タグ化環状DNA断片、前記扇形二本鎖DNA断片、及び/又は前記ジタグ化直鎖一本鎖DNA断片の増幅を更に含む、請求項36に記載の方法。
- 前記増幅が、PCR増幅反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写仲介増幅反応、又はループ仲介増幅反応の1又は複数の使用を含む、請求項37に記載の方法。
- 前記増幅が、3’末端部分をそれぞれが含む第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含み、前記第1のPCRプライマーの少なくとも前記3’末端部分が前記タグドメインの少なくとも一部に相補的であり、前記第2のPCRプライマーの少なくとも前記3’末端部分が前記タグドメインの少なくとも一部の配列を示す、請求項38に記載の方法。
- 前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが5’末端部分を含み、前記第1のPCRプライマーの前記5’末端部分が前記タグ配列に相補的でなく、前記第2のPCRプライマーの前記5’末端部分が前記タグドメインの配列を示さない、請求項39に記載の方法。
- 前記第1及び/又は前記第2のPCRプライマーの前記5’末端部分がタグドメインを示す、請求項16、17、23、又は40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タグドメインが、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの1又は複数を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記タグドメインが、ロシュ社の454A及び454Bシークエンシングタグ、イルミナ(商標)社のSOLEXA(商標)シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のSOLID(商標)シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のSMRT(商標)シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグドメインである、請求項20に記載の方法。
- 標的DNAをタグ化及び断片化する方法であって、
i)標的DNAと、トランスポザーゼと、5’部分にトランスポゾン末端ではないタグドメインの配列を示し且つ3’部分に転移トランスポゾン末端の配列を示す転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とをインキュベートする工程であって、
a)前記標的DNAが断片化され、
b)前記トランスポゾン末端組成物の前記転移鎖が前記標的DNAの断片の5’末端に連結される
工程
を含み、5’タグ化標的DNA断片が生成される、方法。 - 標的DNAの5’タグ化断片のライブラリーを作製する方法であって、
i)標的DNAと、トランスポザーゼと、特定の目的のための1又は複数のタグドメインの配列を5’部分に示し且つ転移トランスポゾン末端の配列を3’部分に示す転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とを、前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
a)前記標的DNAが断片化され、
b)前記トランスポゾン末端組成物の前記転移鎖が前記標的DNAの断片の5’末端に連結されて5’タグ化標的DNA断片が生成される
工程を
含み、前記転位反応により、前記標的DNAに由来するDNA断片ライブラリーを含む複数の5’タグ化標的DNA断片が生成される、方法。 - タグドメインを含む5’部分及びトランスポゾン末端の転移鎖を含む3’部分を有する合成核酸分子を含む組成物。
- 複数の合成核酸分子を含む組成物であって、前記核酸分子が、少なくとも1つのヌクレオチドが異なるタグドメインを含む5’部分及びトランスポゾン末端の転移鎖を含む3’部分を含む、組成物。
- 少なくとも前記3’部分が二本鎖DNAである、請求項46に記載の組成物。
- 前記トランスポゾン末端がTn5トランスポゾン末端である、請求項46に記載の組成物。
- 前記トランスポゾン末端がMuトランスポゾン末端である、請求項46に記載の組成物。
- 前記タグドメインが、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの1又は複数を含む、請求項46又は47に記載の組成物。
- 前記タグドメインが、ロシュ社の454A及び454Bシークエンシングタグ、イルミナ(商標)社のSOLEXA(商標)シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のSOLID(商標)シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のSMRT(商標)シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグを含む、請求項55に記載の組成物。
- 精製されたトランスポザーゼを含む、請求項46に記載の組成物。
- 前記トランスポザーゼがTn5トランスポザーゼ及びMuトランスポザーゼから選択される、請求項46に記載の組成物。
- 前記核酸分子及び前記トランスポザーゼが混合物中に提供される、請求項53に記載の組成物。
- 非イオン性界面活性剤を更に含む、請求項55に記載の組成物。
- 前記非イオン性界面活性剤がNonidet P−40及び/又はTween−20を含む、請求項46に記載の組成物。
- 請求項46〜61のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
- DNAリガーゼを更に含む、請求項58に記載のキット。
- DNAポリメラーゼを更に含む、請求項58に記載のキット。
- 増幅反応のための試薬を更に含む、請求項58に記載のキット。
- 前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項61に記載のキット。
- 前記増幅反応のための前記試薬が少なくとも1つのプライマーを含む、請求項62に記載のキット。
- 前記少なくとも1つのプライマーが、前記核酸分子の前記5’部分の前記タグドメインの相補体に相補的な3’部分を含むプライマーを含む、請求項63に記載のキット。
- 前記タグドメインが、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの1又は複数を含む、請求項58に記載のキット。
- 前記タグドメインが、ロシュ社の454A及び454Bシークエンシングタグ、イルミナ(商標)社のSOLEXA(商標)シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のSOLID(商標)シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のSMRT(商標)シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグドメインを含む、請求項69に記載のキット。
- DNAシークエンシング反応のための試薬を更に含む、請求項65に記載のキット。
- 二本鎖標的DNA及び請求項46〜57のいずれか一項に記載の組成物を含む反応混合物。
- 精製されたトランスポザーゼ及び複数の合成トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物を含む組成物。
- 前記トランスポゾン末端組成物がヘアピントランスポゾン末端を含む、請求項70に記載の組成物。
- 前記合成トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物が転移鎖及び非転移鎖を含む、請求項70に記載の組成物。
- 前記転移鎖が5’タグドメインを含む、請求項70に記載の組成物。
- 前記タグドメインが、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの1又は複数を含む、請求項72に記載の組成物。
- 前記タグドメインが、ロシュ社の454A及び454Bシークエンシングタグ、イルミナ(商標)社のSOLEXA(商標)シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のSOLID(商標)シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のSMRT(商標)シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグを含む、請求項73に記載の組成物。
- 前記複数の合成トランスポゾン末端が、少なくとも1つのヌクレオチドが互いに異なる少なくとも2つの転移鎖を含む、請求項71に記載の組成物。
- 前記転移鎖が5’部分及び3’部分を含み、前記転移鎖の前記5’部分の少なくとも2つが、少なくとも1つのヌクレオチドが互いに異なるタグを含み、前記転移鎖の前記3’部分が同じトランスポゾン末端配列を含む、請求項71に記載の組成物。
- 前記トランスポゾン末端がMuトランスポゾン末端を含み、前記トランスポザーゼがMuトランスポザーゼである、請求項69に記載の組成物。
- 前記転移鎖の前記3’部分がMuトランスポゾン末端由来の配列を含み、前記転移鎖の前記5’部分がMuトランスポゾンに由来しない、請求項75に記載の組成物。
- 前記トランスポゾン末端がTn5トランスポゾン末端を含み、前記トランスポザーゼがTn5トランスポザーゼである、請求項69に記載の組成物。
- 前記転移鎖の前記3’部分がTn5トランスポゾン末端由来の配列を含み、前記転移鎖の前記5’部分がTn5トランスポゾンに由来しない、請求項75に記載の組成物。
- DNA断片ライブラリーを含む組成物であって、前記DNA断片ライブラリーが、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の転移鎖に由来する配列を含む5’末端を有する前記標的DNAの断片を含む、組成物。
- 前記転移鎖に由来する前記配列が5’タグドメインを含む、請求項81に記載の組成物。
- 前記DNA断片ライブラリーが前記標的DNAの二本鎖断片を含む、請求項82に記載の組成物。
- 前記DNA断片ライブラリーが、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の転移鎖に相補的な3’タグを含む標的DNAの断片を含む、請求項81に記載の組成物。
- 標的DNAのタグ化環状DNA断片を含む組成物であって、前記タグ化環状DNA断片に含まれる部分が、前記部分の5’末端に非転移鎖配列と、前記部分の3’末端に転移鎖配列と、タグ配列を含む介在ループ配列と、標的DNAの一部の両方の鎖の配列とを含む、組成物。
- 標的DNAのタグ化環状一本鎖DNA断片を含む組成物であって、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物に由来する転移鎖配列及び標的DNAの一本鎖部分を含む、組成物。
- 前記転移鎖配列がタグドメインを含む、請求項86に記載の組成物。
- 標的DNAの扇形二本鎖DNA断片を含む組成物であって、標的DNAの二本鎖部分を含み、各鎖が、転移鎖配列の少なくとも一部を含む5’末端及び非転移鎖配列の少なくとも一部を含む3’末端を有する、組成物。
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