CN114438174A - 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增 - Google Patents
使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114438174A CN114438174A CN202210117052.1A CN202210117052A CN114438174A CN 114438174 A CN114438174 A CN 114438174A CN 202210117052 A CN202210117052 A CN 202210117052A CN 114438174 A CN114438174 A CN 114438174A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- sequence
- target
- primer
- amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 57
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title abstract description 158
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title abstract description 153
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 278
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 216
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 216
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 139
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 85
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 81
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 81
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 104
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 44
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 25
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 claims description 17
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 15
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 171
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 79
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 65
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 50
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 49
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 36
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 33
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 32
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 32
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 31
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 30
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 25
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 23
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 19
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 19
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 17
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 15
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 14
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 11
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 8
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 7
- 108010012306 Tn5 transposase Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 4
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 4
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000007672 fourth generation sequencing Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 3
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 3
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 3
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 3
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000796533 Arna Species 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000005336 allyloxy group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- PGUYAANYCROBRT-UHFFFAOYSA-N dihydroxy-selanyl-selanylidene-lambda5-phosphane Chemical compound OP(O)([SeH])=[Se] PGUYAANYCROBRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 2
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N isoguanine Chemical compound NC1=NC(=O)NC2=C1NC=N2 DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001805 pentosyl group Chemical class 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- HBCQSNAFLVXVAY-UHFFFAOYSA-N pyrimidine-2-thiol Chemical compound SC1=NC=CC=N1 HBCQSNAFLVXVAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-K selenophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=[Se] JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000007841 sequencing by ligation Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VYEWZWBILJHHCU-OMQUDAQFSA-N (e)-n-[(2s,3r,4r,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5s,6s)-3-acetamido-5-amino-4-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[2-[(2r,3s,4r,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-2-hydroxyethyl]-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]-5-methylhex-2-enamide Chemical compound N1([C@@H]2O[C@@H]([C@H]([C@H]2O)O)C(O)C[C@@H]2[C@H](O)[C@H](O)[C@H]([C@@H](O2)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)C=CC(=O)NC1=O VYEWZWBILJHHCU-OMQUDAQFSA-N 0.000 description 1
- URDCARMUOSMFFI-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(2-hydroxyethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O URDCARMUOSMFFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-hydroxypyrimidine Chemical compound NC1=NC=CC(O)=N1 XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical group CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GMVPRGQOIOIIMI-DODZYUBVSA-N 7-[(1R,2R,3R)-3-hydroxy-2-[(3S)-3-hydroxyoct-1-enyl]-5-oxocyclopentyl]heptanoic acid Chemical compound CCCCC[C@H](O)C=C[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1CCCCCCC(O)=O GMVPRGQOIOIIMI-DODZYUBVSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010001132 DNA Polymerase beta Proteins 0.000 description 1
- 102100022302 DNA polymerase beta Human genes 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 235000014548 Rubus moluccanus Nutrition 0.000 description 1
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229910052771 Terbium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001092905 Thermophis Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J ToTo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2S1 MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- ULHRKLSNHXXJLO-UHFFFAOYSA-L Yo-Pro-1 Chemical class [I-].[I-].C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4O3)C)=CC=[N+](CCC[N+](C)(C)C)C2=C1 ULHRKLSNHXXJLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J YoYo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006397 acrylic thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000007821 culture assay Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011549 displacement method Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 125000002510 isobutoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016470 mariner transposase Human genes 0.000 description 1
- 108060004631 mariner transposase Proteins 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical group 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 108091005763 multidomain proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940048195 n-(hydroxyethyl)ethylenediaminetriacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N phosphite(3-) Chemical class [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N phosphoramidic acid Chemical compound NP(O)(O)=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011505 plaster Substances 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001748 polybutylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000006413 ring segment Chemical group 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 150000003376 silicon Chemical class 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N terbium atom Chemical compound [Tb] GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl prop-2-enoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)C=C ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000005207 tetraalkylammonium group Chemical group 0.000 description 1
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical class CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 125000005208 trialkylammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
- C12Q2521/101—DNA polymerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
- C12Q2521/301—Endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2522/00—Reaction characterised by the use of non-enzymatic proteins
- C12Q2522/10—Nucleic acid binding proteins
- C12Q2522/101—Single or double stranded nucleic acid binding proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/155—Modifications characterised by incorporating/generating a new priming site
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本申请涉及使用CRISPR‑CAS系统的多核苷酸扩增。一种用于扩增靶核酸的方法,所述方法包括提供一种系统,所述系统具有crRNA或其衍生物以及Cas蛋白或其变体。所述crRNA或其衍生物包含与所述靶核酸的区域基本上互补的靶特异性核苷酸区域,并使所述靶核酸与所述系统接触以形成复合物。
Description
本申请是申请日为2015年11月10日,申请号为201580072952.7,标题为“使用CRISPR-CAS系统的多核苷酸扩增”的申请的分案申请。
本公开内容大体涉及用于扩增多核苷酸的方法,且更具体地涉及使用CRISPR-Cas系统扩增多核苷酸的方法及其应用。
背景
核酸扩增为许多基于核酸的方法诸如核酸测序的关键步骤。目前,使用的大多数核酸扩增方法,例如在下一代测序中用于簇产生的那些,都需要温度循环和流体交换两者。在另一方面,等温扩增可以通过消除温度斜坡(temperature ramp)和平衡时间而是时间和能量有效的。已经开发了几种等温扩增方法,例如基于重组酶聚合酶扩增(RPA)的等温扩增。这些等温扩增系统通常缺乏理想地适于一些应用的期望的速度和效率。此外,一些系统要求另外的酶和试剂,包括ATP。因此,本领域对方便、快速和有效的等温核酸扩增方法仍存在需求。本公开内容通过提供使用CRISPR-Cas系统扩增核酸的方法来解决该需求。还提供了相关优势。
成簇的规律间隔的短回文重复(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)(CRISPR)牵涉许多细菌和古生菌(archaea)中保护细胞免受噬菌体和结合型质粒(conjugative plasmid)影响的干扰途径(Marraffini和Sontheimer,2010,Nat Rev Genet.11(3):181-190)。CRISPR由通常起源于噬菌体或质粒DNA的相似尺寸的称作间隔子的独特可变DNA序列间隔的短重复序列的阵列组成(Barrangou等,2007,Science315:1709-12;Bolotin等,2005,Microbiology 151:2551-61;Mojica等,2005,J Mol Evol60:174-82)。因此,CRISPR序列提供过去的感染的适应性遗传记录,并且可以被转录为CRISPR RNA(crRNA)-靶向侵入性核酸的小RNA(Marraffini和Sontheimer,2010,Nat RevGenet11(3):181-190)。CRISPR通常与编码与CRISPR相关蛋白的CRISPR相关(Cas)基因缔合。Cas蛋白可以提供破坏被crRNA靶向的入侵外来核酸的机制。CRISPR连同Cas(CRISPR相关)基因一起构成提供针对细菌和古生菌的侵入性外来核酸的获得性耐受性的适应性免疫系统(Barrangou等,2007,Science315:1709-12)。
概述
本公开内容提供了用于扩增多核苷酸的方法,且更具体地涉及使用CRISPR-Cas系统扩增靶DNA序列的方法及其应用。
在一方面,本文提供了一种用于扩增靶双链核酸的方法,所述方法包括:(a)提供一种系统,所述系统具有:成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA)或其衍生物、以及CRISPR相关(Cas)蛋白或其变体,其中crRNA或其衍生物包含与靶双链核酸的第一链的区域互补的靶特异性核苷酸区域;(b)使靶双链核酸与系统接触以形成复合物;(c)使引物与靶双链核酸的第二链杂交,所述引物包含与靶双链核酸的第二链的区域互补的序列,以及(d)使用聚合酶从引物延伸与靶双链核酸的第二链互补的核酸。
在一些实施方案中,本文提供的方法还包括重复步骤(c)至步骤(d)一次或更多次,例如,直至达到期望的扩增程度。在一些实施方案中,本文提供的方法还包括重复步骤(a)至步骤(d)直至达到期望的扩增程度。
在一些实施方案中,本文提供的靶核酸为双链DNA(dsDNA)。在一些实施方案中,靶核酸为双链RNA(dsRNA)。
在一些实施方案中,系统为I型CRISPR-Cas系统或其衍生物。在一些实施方案中,系统为II型CRISPR-Cas系统或其衍生物。在一些实施方案中,系统为III型CRISPR-Cas系统或其衍生物。
在一些实施方案中,系统还包含反式激活crRNA(tracrRNA)或其衍生物。在一些实施方案中,crRNA或其衍生物为包含与tracrRNA多核苷酸融合的crRNA多核苷酸的多核苷酸。
在一些实施方案中,靶双链核酸的第一链包含与5’-NGG前间区(protospacer)相邻基序(PAM)互补的序列。
在一些实施方案中,靶双链核酸的第一链包含通用序列,并且其中crRNA或其衍生物包含与通用序列的区域互补的序列。在一些实施方案中,引物包含通用序列的区域的序列。
在一些实施方案中,通用序列具有SEQ ID No.3的序列。在一些实施方案中,crRNA包含SEQ ID No.7的序列。在一些实施方案中,通用序列具有SEQ ID No.5的序列。
在一些实施方案中,通用序列具有SEQ ID No.4的序列。在一些实施方案中,crRNA包含SEQ ID No.8的序列。在一些实施方案中,通用序列具有SEQ ID No.6的序列。
在一些实施方案中,Cas蛋白或其变体为Cas9蛋白或其变体。在一些实施方案中,Cas9蛋白包含两个失活的核酸酶结构域。在一些实施方案中,两个失活的核酸酶结构域包含切割与crRNA互补的链的结构域中的第一突变以及切割与crRNA不互补的链的结构域中的第二突变。在一些实施方案中,第一突变为D10A,且第二突变为H840A。在一些实施方案中,Cas蛋白或其变体为级联(Cascade)蛋白或其变体。在一些实施方案中,Cas蛋白或其变体为Cas3蛋白或其变体。
在一些实施方案中,聚合酶为链置换聚合酶。在一些实施方案中,聚合酶选自由以下组成的组:Bst、Bsu和Phi29。
在一些实施方案中,本文提供的方法还包括:在靶核酸和包含转移链的至少一种转座子末端组合物经历转座反应的条件下,将至少一种转座酶和转座子末端组合物应用于包含靶核酸的样品以产生混合物,其中靶核酸被片段化以产生多个靶核酸片段,并将通用引物序列掺入到多个靶核酸片段的每一个中,其中crRNA或其衍生物包含与通用引物的区域互补的靶特异性核苷酸区域。
在一些实施方案中,通用引物通过PCR反应被掺入到多个靶核酸片段中。在一些实施方案中,通用引物具有与5’-NGG前间区相邻基序(PAM)互补的序列。
在一些实施方案中,通用序列具有SEQ ID No.3的序列。在一些实施方案中,crRNA包含SEQ ID No.7的序列。在一些实施方案中,通用序列具有SEQ ID No.5的序列。
在一些实施方案中,通用引物具有SEQ ID No.4的序列。在一些实施方案中,crRNA包含SEQ ID No.8的序列。在一些实施方案中,通用序列具有SEQ ID No.6的序列。
在一些实施方案中,两种通用引物被掺入到多个靶核酸片段的每一个的两个末端中。在一些实施方案中,两种通用引物具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的序列。在一些实施方案中,两种通用引物具有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的序列。
在一些实施方案中,靶双链核酸被线性地扩增。在一些实施方案中,靶双链核酸被指数地扩增。
在一些实施方案中,本文提供了一种用于扩增靶双链核酸的方法,所述方法包括:(a)提供第一系统,所述第一系统具有:第一成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA)或其衍生物、以及第一CRISPR相关(Cas)蛋白或其变体,其中所述第一crRNA或其衍生物包含与靶双链核酸的第一链的区域互补的靶特异性核苷酸区域;(b)提供第二系统,所述第二系统具有:
第二成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA)或其衍生物、以及第二CRISPR相关(Cas)蛋白或其变体,其中所述第二crRNA或其衍生物包含与靶双链核酸的第二链的区域互补的靶特异性核苷酸区域;(c)使靶双链核酸与第一系统和第二系统接触;
(d)使第一引物与靶双链核酸的第二链杂交,第一引物包含与靶双链核酸的第二链的区域互补的序列,并使第二引物与靶双链核酸的第一链杂交,第二引物包含与靶双链核酸的第一链的区域互补的序列,以及(e)用一种或更多种聚合酶延伸第一引物和第二引物的3’末端,以产生第一和第二双链靶核酸。在一些实施方案中,本文提供的方法还包括重复步骤(a)和步骤(e)一次或更多次,例如,直至达到期望的扩增程度。
在一些实施方案中,靶核酸为双链DNA(dsDNA)。在一些实施方案中,靶核酸为双链RNA(dsRNA)。
在一些实施方案中,第一系统或第二系统为I型CRISPR-Cas系统或其衍生物。在一些实施方案中,第一系统或第二系统为II型CRISPR-Cas系统或其衍生物。在一些实施方案中,第一系统或第二系统为III型CRISPR-Cas系统或其衍生物。
在一些实施方案中,第一系统或第二系统还包含反式激活crRNA(tracrRNA)或其衍生物。在一些实施方案中,第一系统或第二系统的crRNA或其衍生物为包含与tracrRNA多核苷酸融合的crRNA多核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中,靶双链核酸的第一链和第二链包含与5’-NGG前间区相邻基序(PAM)互补的序列。
在一些实施方案中,靶双链核酸的第一链包含第一通用序列,并且其中第一系统的crRNA或其衍生物包含与第一通用序列的区域互补的序列,并且靶双链核酸的第二链包含第二通用序列,并且其中第二系统的crRNA或其衍生物包含与第二通用序列的区域互补的序列。
在一些实施方案中,第一引物包含第一通用序列的区域的序列,且第二引物包含第二通用序列的区域的序列。在一些实施方案中,第一通用序列(其包含第一引物)具有SEQID No.3的序列,第一系统的crRNA或其衍生物包含SEQ ID No.7的序列,且第一引物包含SEQ ID No.5的序列,并且第二通用序列(其包含第二引物)具有SEQ ID No.4的序列,第二系统的crRNA或其衍生物包含SEQ ID No.8的序列,且第二引物包含SEQ ID No.6的序列。
在一些实施方案中,第一系统或第二系统的Cas蛋白或其变体为Cas9蛋白或其变体。在一些实施方案中,Cas9蛋白包含两个失活的核酸酶结构域。在一些实施方案中,两个失活的核酸酶结构域包含切割与crRNA互补的链的结构域中的第一突变、以及切割与crRNA不互补的链的结构域中的第二突变。在一些实施方案中,第一突变为D10A,且第二突变为H840A。在一些实施方案中,第一系统或第二系统的Cas蛋白或其变体为级联蛋白(cascadeprotein)或其变体。在一些实施方案中,第一系统或第二系统的Cas蛋白或其变体为Cas3蛋白或其变体。
在一些实施方案中,聚合酶为链置换聚合酶。在一些实施方案中,聚合酶选自由以下组成的组:Bst、Bsu和Phi29。
在一些实施方案中,靶核酸为基因组DNA。在一些实施方案中,靶核酸包含染色体DNA或其片段。在一些实施方案中,靶核酸包括基因组或部分基因组。
在一些实施方案中,本文提供的方法还包括对靶核酸或靶核酸片段测序。在一些实施方案中,测序包括使用合成测序、桥式PCR、链终止测序、杂交测序、纳米孔测序和连接测序中的一个或更多个。
附图简述
图1A示出了根据本方法设计的用于扩增DNA片段的引物,该引物包含Illumina通用测序引物衔接子(adaptor)P5和P7的全部或部分。可以使用Nextera(Illumina,Inc.)文库制备方法来添加引物。图1B阐释了使用靶向修饰的P5引物的crRNA的一轮Cas9介导的线性扩增。1B(I)描绘了具有适当引物序列P5和P7的待扩增DNA。与Cas9结合的靶向P5的指导RNA(guide RNA)也显示为P5'。1B(II)示出了在指导RNA与第一链杂交之后由Cas9创建的R环。1B(III)阐释了被固定的P5引物与置换的第二链杂交,随后是聚合酶延伸。1B(IV)示出了所得的被延伸的引物P5。如步骤1B(II)中示出的,所得到的扩增子可以被Cas9+crRNA重新靶向。图1C阐释了使用靶向修饰的P7引物的crRNA的一轮Cas9介导的线性扩增。1C(I)描绘了具有适当引物序列P5和P7的待扩增DNA。与Cas9结合的靶向P7的指导RNA也显示为P7'。1C(II)示出了在指导RNA与第一链杂交之后由Cas9创建的R环。1C(III)阐释了被固定的P7引物与置换的第二链杂交,随后是聚合酶延伸。1C(IV)示出了所得的被延伸的引物P7。如步骤1C(II)中示出的,所得到的扩增子可以被Cas9+crRNA重新靶向。随着扩增子的两侧经历扩增(图1B和1C),可以实现指数扩增。
详细描述
本公开内容提供了使用CRISPR-Cas系统快速且有效扩增靶核酸的方法。
核酸扩增是许多基于核酸的方法诸如下一代测序测序的一个步骤。目前,聚合酶链式反应(PCR)为用于,例如检测和鉴定传染病、遗传性疾患和其他研究目的DNA扩增的最广泛使用的方法。PCR反应通常使用与双链体靶核酸序列的3’末端杂交的两个寡核苷酸引物和可以通过添加脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)来延伸退火的引物以产生双链核酸产物的DNA聚合酶。Gill和Ghaemi,Nucleosides,Nucleotides,和Nucleic Acids,2008,27:224-243。然而,PCR反应需要热循环以分离两条DNA链。类似地,许多目前使用的核酸扩增方法,例如在下一代测序中用于簇产生的那些,都需要温度循环和流体交换两者。
已经开发了几种等温扩增方法,以消除温度斜坡和平衡时间,诸如在Gill和Ghaemi,Nucleosides、Nucleotides、和Nucleic Acids,2008,27:224-243中描述的基于重组酶聚合酶扩增(RPA)的等温扩增、转录介导的扩增、基于核酸序列的扩增、信号介导的RNA扩增、链置换扩增、滚环扩增、环介导的DNA扩增、等温多重置换扩增、解旋酶依赖性扩增、单引物等温扩增和环状解旋酶依赖性扩增(circular helicase-dependentamplification)。
例如,在转录介导的扩增(TMA)中,RNA聚合酶用于由构建在引物区域中的启动子制备RNA,并且然后逆转录酶由该引物合成cDNA。然后,可以使用第三种酶,例如,核糖核酸酶H,以降解来自cDNA的靶RNA而无需热变性步骤。这种扩增技术非常类似于自持续序列复制(Self-Sustained Sequence Replication)(3SR)和基于核酸序列的扩增(NASBA),但采用的酶不同。同上。另举例,解旋酶依赖性扩增(HDA)利用热稳定解旋酶(Tte-UvrD)而不加热来解开dsDNA以创建单链,然后该单链可用于通过聚合酶杂交和延伸引物。已显示,扩增长度为70-120个碱基对的产物的反应时间超过1小时。同上。又另举例,环介导的扩增(LAMP)采用具有链置换能力的热稳定聚合酶和一组四种或更多种特别设计的引物。每一种引物被设计为具有发夹末端,在被置换后扣成发夹(snap into a hairpin)以促进自引发和进一步的聚合酶延伸。在LAMP反应中,尽管反应在等温条件下进行,但双链靶需要初始热变性步骤。另外,扩增产生梯形模式的各种长度的产物。同上。又另举例,链置换扩增(SDA)结合了限制性内切核酸酶使其靶DNA的未修饰的链缺口的能力与外切核酸酶缺陷型DNA聚合酶在切口处延伸3’末端并置换下游DNA链的能力。同上。其他示例性等温扩增方法包括,但不限于,以下中描述的那些:Craw和Balachandran,Lab Chip,2012,12:2469-2486。
然而,这些目前开发的等温扩增系统通常缺乏理想地适于一些应用的期望的速度和效率。此外,一些系统要求另外的酶和试剂,包括ATP。因此,本领域对方便、快速和有效的等温核酸扩增方法仍存在需求。本公开内容通过提供使用CRISPR-Cas系统扩增核酸的方法来解决该需求。例如,本方法提供的一个优势为,Cas蛋白识别靶核酸而不需要消耗ATP或能量投入,并且因此本文中的方法提供了成本和时间上有效的等温扩增方法。
定义
如本文使用的,术语“包括(includes)”、“包括(including)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“包含(contains)”、“包含(containing)”、“具有(have)”、“具有(having)”及其任何词形变化被旨在覆盖非排除性包含对象,以使得包括(includes)、包括(includes)或包含(contains)一个要素或要素列表的所述及的方法(process)、方法(method)、方法限定的产品或组合物不仅包括那些元素,还可包括未明确列出的其他要素或对于所述及的此类方法(process)、方法(method)、方法限定的产品或组合物而言是固有的其他元素。
如本文使用的,除非上下文另外清楚指明,否则单数形式"一(a)"、"一(an)"和"该(the)"包括复数指代物。因此,例如,提及“一种蛋白”包括两种或更多种蛋白的混合物等。
如本文使用的,术语“约”或“大约”意指在给定的值或范围的5%以内。
如本文使用的,术语“核酸”意指核苷酸单体的单链聚合物和双链聚合物,包括通过核苷酸间磷酸二酯键键合或核苷酸间类似物连接的2’-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA),以及缔合的抗衡离子,例如H+、NH4+、三烷基铵、四烷基铵、Mg2+、Na+等。核酸可以为多核苷酸或寡核苷酸。核酸可完全由脱氧核糖核苷酸,完全由核糖核苷酸构成,或可以是其嵌合混合物。核苷酸单体单位可以包括本文描述的任何核苷酸,包括但不限于天然存在的核苷酸和核苷酸类似物。核酸的尺寸范围通常从几个单体单元例如5-40个到几千个单体核苷酸单元。核酸包括但不限于基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片段化的核酸、从亚细胞细胞器诸如线粒体或叶绿体获得的核酸、以及从可能存在于生物样品上或生物样品中的微生物或DNA或RNA病毒获得的核酸。
如本文使用的,术语“靶核酸”被旨在意指为分析或作用的目标物的核酸。分析或作用包括使核酸经历拷贝、扩增、测序和/或用于核酸询问(interrogation)的其他程序。靶核酸可以包括除了待被分析的靶序列以外的核苷酸序列。例如,靶核酸可以包含一个或更多个衔接子(adapter),包括在待被分析的靶核酸序列的侧翼作为引物结合位点发挥作用的衔接子。与捕获寡核苷酸或捕获引物杂交的靶核酸可以包含延伸超过捕获寡核苷酸的5'或3'末端的核苷酸,这种方式使得并不是所有的靶核酸都适于延伸。
如本文使用的术语“靶特异性”当提及指导RNA、crRNA或其衍生物或其他核苷酸使用时,旨在意指这样的多核苷酸,其包含对靶多核苷酸序列特异性的核苷酸序列,即能够选择性退火至靶多核苷酸(例如,靶DNA)的鉴定区域的核苷酸序列。靶特异性核苷酸可以具有单一种类的寡核苷酸,或者靶特异性核苷酸可以包括具有不同序列的两个或更多个种类的寡核苷酸。因此,靶特异性核苷酸可以为两种或更多种序列,包括3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种不同的序列。在一个实施方案中,crRNA或其衍生物包含与靶DNA序列的区域互补的靶特异性核苷酸区域。在一个实施方案中,crRNA或其衍生物可以包含除靶特异性核苷酸区域以外的其他核苷酸序列。在一个实施方案中,其他核苷酸序列可以来自tracrRNA序列。
如本文使用的,当提及多核苷酸使用时,术语“互补”旨在意指包括能够在某些条件下选择性退火至靶多核苷酸的鉴定区域的核苷酸序列的多核苷酸。如本文使用的,术语“基本上互补”和语法等同物旨在意指包括能够在某些条件下特异性退火至靶多核苷酸的鉴定区域的核苷酸序列的多核苷酸。退火指一种核酸与另一种核酸的核苷酸碱基配对相互作用,该相互作用导致形成双链体、三链体或其他更高等级的结构。通过沃森-克里克(Watson-Crick)和Hoogsteen型氢键键合,主要的相互作用通常为核苷酸碱基特异性的,例如,A:T、A:U、和G:C。在某些实施方案中,碱基堆积和疏水相互作用也可以有助于双链体稳定性。多核苷酸与靶核酸的互补或基本上互补的区域退火的条件为本领域熟知的,例如,如在以下中描述的条件:Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,Hames和Higgins,编著,IRL Press,Washington,D.C.(1985)以及Wetmur和Davidson,Mol.Biol.31:349(1968)。退火条件将取决于特定应用,并且可以由本领域技术人员常规地确定,而无需过度的实验。
如本文使用的,术语“杂交”指两个单链多核苷酸非共价结合以形成稳定的双链多核苷酸的过程。所得的双链多核苷酸为“杂交体(hybrid)”或“双链体”。杂交条件通常将包括小于约1M,更通常地小于约500mM,并且可以小于约200mM的盐浓度。杂交缓冲液包括缓冲盐溶液诸如5%SSPE或本领域已知的其他此类缓冲液。杂交温度可以低至5℃,但通常大于22℃,且更通常大于约30℃,且通常超过37℃。杂交通常在严格条件,即探针将与其靶序列杂交,但将不与其他非互补序列杂交的条件下进行。严格条件为序列依赖性的,并且在不同情况下为不同的,并且可以由本领域技术人员常规地确定。
在“多核苷酸”的上下文中,如本文使用的术语“变体”和“衍生物”指这样的多核苷酸,其包含通过引入核苷酸取代、缺失或添加而改变的多核苷酸的核苷酸序列或多核苷酸片段。多核苷酸的变体或衍生物可以为包含多核苷酸的核苷酸序列的一部分的融合多核苷酸。如本文使用的术语“变体”或“衍生物”还指例如,通过任何类型的分子与多核苷酸共价附接而被化学修饰的多核苷酸或其片段。例如,但不限于,多核苷酸或其片段可以化学修饰,例如通过乙酰化、磷酸化、甲基化等等。变体或衍生物被以在附接的分子的类型或位置不同于天然存在的或起始核苷酸或多核苷酸的方式被修饰。变体或衍生物还包括天然存在于核苷酸或多核苷酸上的一个或更多个化学基团的缺失。多核苷酸或多核苷酸片段的变体或衍生物可以使用本领域技术人员已知的技术,包括,但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等等通过化学改变而化学修饰。此外,多核苷酸或多核苷酸片段的变体或衍生物可以包含一个或更多个dNTP或核苷酸类似物。多核苷酸变体或衍生物可以具有与本文描述的多核苷酸或多核苷酸片段相似或相同的功能。与本文描述的多核苷酸或多核苷酸片段相比,多核苷酸变体或衍生物可以具有另外或不同的功能。
如本文使用的,术语“dNTP”指脱氧核苷三磷酸。NTP指核糖核苷三磷酸,诸如用于合成crRNA或tracrRNA的那些。嘌呤碱基(Pu)包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)及其衍生物和类似物。嘧啶碱基(Py)包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)及其衍生物和类似物。通过说明而非限制的方式,此类衍生物或类似物的实例为用报告基团修饰的、生物素化的、胺修饰的、放射性标记的、烷基化等修饰的那些衍生物或类似物,并且还包括硫代磷酸酯、亚磷酸酯、环原子修饰的衍生物等。报告物基团可以为荧光基团诸如荧光素、化学发光基团诸如鲁米诺,铽螯合物诸如能够通过延迟荧光检测的N-(羟乙基)乙二胺三乙酸等。
如本文使用的,术语“核苷酸类似物”指具有修饰的核苷酸碱基部分、修饰的戊糖部分和/或修饰的磷酸部分的合成类似物,并且在多核苷酸的情况下,修饰的核苷酸间键合,如其他地方通常描述的(例如,Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York,1980;Englisch,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.30:613-29,1991;Agarwal,Protocols forPolynucleotides and Analogs,Humana Press,1994;以及S.Verma和F.Eckstein,Ann.Rev.Biochem.67:99-134,1998)。示例性磷酸酯类似物包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、二羟硼基磷酸酯(boronophosphate),包括缔合的抗衡离子,例如H+、NH4 +、Na+(如果存在此类抗衡离子)。示例性修饰的核苷酸碱基部分包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5mC);C-5-丙炔基类似物,包括但不限于C-5丙炔基-C和C-5丙炔基-U;2,6-二氨基嘌呤,也称为2-氨基腺嘌呤或2-氨基-dA);次黄嘌呤,假尿苷,2-硫代嘧啶(2-thiopyrimidine),异胞嘧啶(isoC),5-甲基isoC和异鸟嘌呤(isoG;参见,例如,美国专利号5,432,272)。示例性修饰的戊糖部分包括但不限于,锁核酸类似物包括但不限于Bz-A-LNA、5-Me-Bz-C-LNA、dmf-G-LNA、和T-LNA(参见,例如,The Glen Report,16(2):5,2003;Koshkin等,Tetrahedron 54:3607-30,1998)和2’-或3’-修饰,其中2’-或3’-位为氢、羟基、烷氧基(例如,甲氧基、乙氧基、烯丙氧基(allyloxy)、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基(isobutoxy)和苯氧基)、叠氮基、氨基、烷基氨基、氟代、氯代或溴代。修饰的核苷酸间键合包括磷酸酯类似物,具有非手性和不带电荷的亚基间键合的类似物(例如,Sterchak,E.P.等,Organic Chern.,52:4202,1987)和具有非手性亚基间键合的不带电荷的基于吗啉的聚合物(参见,例如,美国专利号5,034,506)。一些核苷酸间键合类似物包括morpholidate、缩醛和聚酰胺连接的杂环。
如本文使用的术语“聚合酶链式反应”或“PCR”指其中少量核酸例如,RNA和/或DNA被扩增的程序,如例如在属于Mullis的美国专利号4,683,195中描述的。通常,来自感兴趣区域末端或以外的序列信息需要是可获得的,使得可以设计寡核苷酸引物;这些引物在序列上将与待扩增的模板的相对链相同或相似。两个引物的5’末端核苷酸可以与扩增的材料的末端一致。PCR可以用于扩增特定RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列、以及从总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等等。一般参见Mullis等,Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.,51:263(1987);Erlich,编著,PCR Technology,(Stockton Press,NY,1989)。
如本文使用的,术语“连接(ligation)”、“连接(ligating)”及其语法等同物旨在意指通常在模板驱动反应中在两个或更多个核酸(例如,寡核苷酸和/或多核苷酸)的末端之间形成共价键或键合。键或键合的性质可以广泛变化,且连接可以通过酶法或化学法进行。如本文使用的,连接通常通过酶法进行以在一个寡核苷酸的5’碳末端核苷酸与另一个核苷酸的3'碳之间形成磷酸二酯键合。模板驱动的连接反应在以下参考文献中被描述:美国专利号4,883,750;5,476,930;5,593,826;和5,871,921,通过引用以其整体并入本文。术语“连接”还包括磷酸二酯键的非酶促形成、以及寡核苷酸的末端之间的非磷酸二酯共价键的形成,诸如硫代磷酸酯键、二硫键等。
如本文使用的,术语“衔接子”为可以与其他核酸的末端连接的单链或双链核酸分子。在一个实施方案中,衔接子为短的化学合成的可以用于连接两个其他核酸分子的末端的双链核酸分子。在一个实施方案中,衔接子为在5’和/或3’末端包含单链核苷酸突出端的双链核酸(例如寡核苷酸)。在一些实施方案中,单-链突出端为1个、2个或更多个核苷酸。在一些实施方案中,衔接子包含用于克隆或分析“插入物(inserts)”的另外的核酸序列。在一些实施方案中,衔接子包括用于分析或纯化“插入物”的标记物或亲和标签。术语“插入物”指感兴趣的核酸序列。在一些实施方案中,插入物为在5’末端和/或3’末端包含单链核苷酸突出端的双链DNA。在一些实施方案中,单链突出端为1个、2个或更多个核苷酸。
如本文使用的,术语“CRISPR-Cas系统”指包括包含与靶多核苷酸的区域互补或基本上互补的核苷酸序列的指导RNA序列和具有核酸酶活性的蛋白质的酶系统。CRISPR-Cas系统包括I型CRISPR-Cas系统、II型CRISPR-Cas系统、III型CRISPR-Cas系统及其衍生物。CRISPR-Cas系统包括源自天然存在的CRISPR-Cas系统的工程化和/或编程的核酸酶系统。CRISPR-Cas系统可以包含工程化和/或突变的Cas蛋白。CRISPR-Cas系统可以包含工程化和/或编程的指导RNA。
如本文使用的,术语“指导RNA”指包含与靶DNA序列的区域互补或基本上互补的序列的RNA。指导RNA可以包含除了与靶DNA序列的区域互补或基本互补的区域以外的核苷酸序列。指导RNA可以为crRNA或其衍生物,例如,crRNA:tracrRNA嵌合体。
如本文使用的,术语“核酸酶”指能够切割核酸的核苷酸亚基之间的磷酸二酯键的酶;术语“内切核酸酶”指能够切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶;且术语“切口酶”指仅切割DNA双链体的单链的内切核酸酶。术语“Cas9切口酶”指通常通过使Cas9蛋白的一个核酸酶结构域失活的从Cas9蛋白获得的切口酶。
在多肽的上下文中,如本文使用的术语“变体”和“衍生物”指包含已经通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而被改变的多肽或多肽片段的氨基酸序列的多肽。多肽的变体或衍生物可以为包含多肽的氨基酸序列的一部分的融合蛋白。如本文使用的术语“变体”或“衍生物”还指例如,通过任何类型的分子与多肽共价附接而被化学修饰的多肽或多肽片段。例如,但非限制性地,多肽或多肽片段可以被化学修饰,例如,通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化,通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白键合等等。变体或衍生物以在附接的分子的类型或位置上不同于天然存在的或起始的肽或多肽的方式进行修饰。变体或衍生物还包括天然存在于肽或多肽上的一个或更多个化学基团的缺失。多肽或多肽片段的变体或衍生物可以使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰被化学修饰,本领域技术人员已知的技术包括,但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等等。此外,多肽或多肽片段的变体或衍生物可以包含一种或更多种非经典氨基酸。多肽变体或衍生物可以具有与本文描述的多肽或多肽片段相似或相同的功能。与本文描述的多肽或多肽片段相比,多肽变体或衍生物可以具有另外或不同的功能。
如本文使用的,术语“检测”核酸分子或其片段指通常当核酸分子或其片段与样品或组合物的其他组分完全或部分分离时,确定核酸分子的存在,并且还可以包括确定核酸分子或其片段的荷质比(charge-to-mass ratio)、质量、量、吸光度、荧光或其他性质。
如本文使用的,术语“引物”指当被置于引物延伸(不限于延伸碱基的数目)被启动的条件下时能够充当核酸合成的起始点的天然或合成的寡核苷酸引物。引物可以为单链寡脱氧核糖核苷酸。引物的长度范围可以从约10个至50个核苷酸,例如10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50核苷酸。引物不需要反映模板的准确序列,但必须充分互补,以与模板杂交,以便引物延伸发生。如果期望的话,可以通过例如光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段(means)通过掺入可检测的标记物来标记引物。示例性标记物包括,但不限于生物素、胺、放射性标记物(例如,32P)、荧光染料、电子致密试剂、酶(通常用于ELISAS)或生物素。
如本文使用的,术语“线性扩增”指使用多个循环的引物延伸反应扩增靶核酸的扩增过程。随着线性扩增,转录物的丰度随循环数目成比例增加并线性放大。线性扩增程序的实例为LCR、上文的Phillips和Eberwine的aRNA方法、以及本文描述的线性扩增方法。与指数扩增不同,扩增产物的量不呈指数增长。例如,在拷贝比率为2000个拷贝/分钟的理想的4小时线性扩增反应中,2000个拷贝的模板DNA将产生960,000,000个拷贝。
如本文使用的,术语“指数扩增”指其中产物(即,扩增子)随每个反应循环加倍的扩增程序。“指数扩增”为非线性扩增,其导致存在的核酸拷贝数目呈指数增长。例如,当在一个扩增循环中引物延伸起始于扩增子的两端时,指数扩增可以发生。例如,PCR为指数扩增程序。例如,在具有30个循环的理想PCR反应中,2个拷贝的模板DNA将产生2^30或1,073,741,824个拷贝。
如本文使用的,术语“聚合酶”指能够催化核苷酸的特异性掺入以针对核酸靶序列延伸引物分子(诸如,例如,模板寡核苷酸)的3’羟基末端的蛋白。聚合酶可以为例如嗜热的,使得其在升高的反应温度下是有活性的。例如,它也可以具有链置换能力。
扩增多核苷酸的方法
在一方面,本公开内容提供了一种用于CRISPR-Cas系统介导的扩增的方法。本文提供的方法部分地基于指导RNA与靶双链核酸的区域的结合破坏靶核酸的两条链之间的相互作用,并且从而创建环结构(也称为“R-环“),暴露与指导RNA不互补的链。该暴露的链可以经历与引物杂交,以便例如,在核酸扩增过程中通过合适的聚合酶延伸。如图1A-1C中阐释的,由CRISPR-Cas系统(例如包含Cas9或级联蛋白的系统)创建的该环结构可以被其他酶接近。因此,环结构可以进一步用作模板以启动引物杂交并与聚合酶相互作用以用于扩增。
在一些实施方案中,本公开内容提供了一种用于扩增靶双链核酸的方法,所述方法包括提供一种系统,所述系统具有:成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA)或其衍生物、以及CRISPR相关(Cas)蛋白或其变体,其中crRNA或其衍生物包含与靶双链核酸的第一链的区域互补的靶特异性核苷酸区域;使靶双链核酸与系统接触以形成复合物;使引物与靶双链核酸的第二链杂交,所述引物包含与靶双链核酸的第二链的区域互补的序列,以及使用聚合酶从引物延伸与靶双链核酸的第二链互补的核酸。
本文提供的方法可以用于多种扩增方法,包括但不限于,线性核酸扩增和指数核酸扩增。
在一些实施方案中,根据本文提供的方法线性扩增靶核酸。例如,在一些实施方案中,本文提供的方法还包括重复以下一次或更多次,例如直至实现期望的扩增量:使引物与靶双链核酸的第二链杂交,并使用聚合酶从引物延伸与靶双链核酸的第二链互补的核酸。
在其他实施方案中,靶核酸被指数地扩增。在示例性指数核酸扩增中,产物(即,扩增子)随每个反应循环加倍。“指数扩增”为非线性扩增,其导致存在的核酸拷贝数目呈指数增长。通常,在指数扩增中,引物延伸(或拷贝)从扩增子的两端发生。为了确保新创建的链在两个末端具有引物结合位点,在指数扩增中,新合成的核酸的3’末端包含引物的反向互补物,并且模板的末端通常在每一个扩增循环中被拷贝。
根据本方法的反应的循环数目取决于应用和期望的扩增产物量。在一些实施方案中,循环数目为5至100。在一些实施方案中,循环数目为10至90。在一些实施方案中,循环数目为20至80。在一些实施方案中,循环数目为30至70。在一些实施方案中,循环数目为40至60。示例性循环数目包括10、15、20、25、30、35、40、45和50。循环不需要在扩增子之间同步,因为它们处于其中通过改变温度来控制每一个循环的发动的PCR反应中。因此,如本文使用的循环指扩增子经历的扩增轮的平均数目。
在一些实施方案中,初始化步骤包括向靶核酸提供多个CRISPR-Cas系统,以在两个或更多个靶向序列处打开双链核酸结构并形成两个或更多个R环结构。初始化步骤不要求如PCR反应中需要的加热反应,因为该初始化步骤是酶驱动的。根据本方法的下一步骤牵涉提供靶向R环区域的引物并退火引物以形成相对稳定的核酸-核酸相互作用,例如,DNA-DNA杂交体。通常,当引物序列具有模板序列的基本互补性时,形成稳定的核酸-核酸杂交体。然后一种或更多种聚合酶结合引物-模板杂交体,并在延伸(extension)/延长(elongation)步骤中开始核酸合成。在一些实施方案中,该延伸/延长步骤的温度取决于所使用的聚合酶。在该步骤时,通过添加与模板互补的dNTP,聚合酶合成与模板链互补的新的核酸链。在一些实施方案中,当使用DNA聚合酶时,反应将dNTP的5’-磷酸基团与新生(延伸的)DNA链的末端处的3’-羟基基团缩合。延伸时间取决于所使用的聚合酶和待扩增的核酸片段的长度两者。这些步骤的一个或更多个可以重复一次或更多次,例如,直至实现期望的扩增量。
为了允许扩增产物的指数生长,在每一个循环中新创建的核酸产物在两个末端包含引物结合位点是有利的。在一些实施方案中,新合成的分子的3’末端为引物的反向补体。在一些实施方案中,各自靶向靶核酸的一个末端的两条引物可以用于指数扩增。在一些实施方案中,引物以这样的方式设计是有益的:其可以被本文提供的CRISPR-Cas系统靶向-即引物可以被CRISPR-Cas系统的指导RNA,例如,crRNA靶向使得CRISPR-Cas系统可被重复地用于结合靶核酸以启动新一轮扩增。
因此,在一些实施方案中,两个或更多个CRISPR-Cas系统用于启动引物在靶核酸两个末端处结合。在一些实施方案中,本文提供了一种用于扩增靶双链核酸的方法,所述方法包括:(a)提供第一系统,所述第一系统具有:第一成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA)或其衍生物,以及第一CRISPR相关(Cas)蛋白或其变体,其中第一crRNA或其衍生物包含与靶双链核酸的第一链的区域互补的靶特异性核苷酸区域;(b)提供第二系统,所述第二系统具有:第二成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA)或其衍生物,以及第二CRISPR相关(Cas)蛋白或其变体,其中第二crRNA或其衍生物包含与靶双链核酸的第二链的区域互补的靶特异性核苷酸区域;(c)使靶双链核酸与第一系统和第二系统接触;(d)使第一引物与靶双链核酸的第二链杂交,第一引物包含与靶双链核酸的第二链的区域互补的序列,并使第二引物与靶双链核酸的第一链杂交,第二引物包含与靶双链核酸的第一链的区域互补的序列,和(e)用一种或更多种聚合酶延伸第一引物和第二引物引物的3’末端,以产生第一和第二双链靶核酸。在一些实施方案中,引物杂交通过聚合酶的延伸步骤被重复一次或更多次,例如,直至达到期望的扩增程度。
在其他实施方案中,本文提供的方法用于多重扩增。如本文使用的,术语“多重扩增”指多于一个感兴趣的核酸的扩增,例如对来自同一样品的多个序列的扩增。术语“多重扩增”还指同时或以逐步扩增的方式扩增存在于多个样品中的一个或多个序列。因此,在一些实施方案中,在扩增反应中扩增两种或更多种靶核酸序列,并且扩增反应包含适当的模板和酶以扩增至少两种靶核酸序列。本文提供的多重扩增的一个应用为检测样品中的两种或更多种靶序列,因为多重扩增能够扩增两种或更多种靶序列。当靶序列中仅一种实际上存在于受试样品中时,多重扩增的结果可能是对存在的仅一种序列的扩增。多重扩增可以利用相同的引物对来扩增一种或更多种间插(intervening)扩增子序列。可选择地,多重扩增可以利用一个或更多个引物对。
在一些实施方案中,本文提供的双链核酸为双链DNA。在其他实施方案中,本文提供的双链核酸为双链RNA。在一些实施方案中,靶核酸为基因组DNA。在其他实施方案中,靶核酸包含染色体DNA或其片段。又在其他实施方案中,靶核酸包括基因组或部分基因组。
在一些实施方案中,本文提供的系统源自CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统通常可以分为三种主要类型(I-III型),其基于核心元件含量和序列被进一步细分为十个亚型(Makarova等,2011,Nat Rev Microbiol 9:467-77)。这些CRISPR-Cas系统的两个关键元件为Cas蛋白和CRISPR RNA(crRNA)。crRNA由散布着源自侵入DNA的间隔区序列的短重复序列组成。Cas蛋白具有多种活性,例如核酸酶活性。因此,CRISPR-Cas系统提供了靶向特定序列以及对该序列的某些酶活性的机制。
典型的I型CRISPR-Cas系统包含具有独立解旋酶和DNA酶活性的Cas3蛋白。例如,在I-E型系统中,将crRNA掺入到称为级联体的多亚基效应复合物(用于抗病毒防御的CRISPR相关复合物)(Brouns等,2008,Science 321:960-4),其结合靶DNA并通过Cas3蛋白触发降解(Sinkunas等,2011,EMBO J 30:1335-1342;Beloglazova等,2011,EMBO J 30:616-627)。
II型CRISPR-Cas系统包括签名Cas9蛋白,一种能够产生crRNA并切割靶DNA的蛋白(约160KDa)。Cas9蛋白通常包含两个核酸酶结构域,氨基末端附近的RuvC样核酸酶结构域和蛋白中间附近的HNH(或McrA样)核酸酶结构域。Cas9蛋白的每一个核酸酶结构域专门用于切割双螺旋的一条链(Jinek等,2012,Science 337(6096):816-821)。
III型CRISPR-Cas系统包含聚合酶和RAMP模块。III型系统可以被进一步分为III-A和III-B亚型。已经显示III-A型CRISPR-Cas系统靶向质粒,且III-A型系统的聚合酶样蛋白牵涉靶DNA的切割(Marraffini和Sontheimer,2008,Science 322:1843–1845)。还显示III-B型CRISPR-Cas系统靶向RNA(Hale等,2009,Cell 139:945–956)。
因此,在一些实施方案中,所述系统为I型CRISPR-Cas系统或其衍生物。在其他实施方案中,所述系统为II型CRISPR-Cas系统或其衍生物。又在其他实施方案中,所述系统为III型CRISPR-Cas系统或其衍生物。
CRISPR-Cas系统的关键要素包括指导RNA,例如crRNA和Cas蛋白。crRNA或其衍生物包含与靶核酸的区域互补或基本上互补的靶特异性核苷酸区域。在一些实施方案中,crRNA或其衍生物包含允许酶特异性靶向互补双链DNA的使用者可选择的RNA序列。在一些实施方案中,使用者可选择的RNA序列包含与靶DNA序列的区域互补或基本上互补的20-50个核苷酸。在一些实施方案中,使用者可选择的RNA序列包含与靶DNA序列的区域互补或基本上互补的小于20个核苷酸。示例性使用者可选择的RNA序列包含与靶DNA序列的区域互补或基本上互补的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、或19个核苷酸。在一些实施方案中,crRNA的靶特异性核苷酸区域具有与靶核酸的区域100%碱基对匹配。在一些实施方案中,crRNA的靶特异性核苷酸区域具有与靶核酸的区域90%-100%、80%-100%、或70%-100%碱基对匹配。在一些实施方案中,在crRNA的靶特异性核苷酸区域和靶核酸的区域之间存在一个碱基对错配。在一些实施方案中,在crRNA的靶特异性核苷酸区域和靶核酸的区域之间存在两个碱基对错配。在一些实施方案中,在crRNA的靶特异性核苷酸区域和靶核酸的区域之间存在三个碱基对错配。在一些实施方案中,在crRNA的靶特异性核苷酸区域和靶核酸的区域之间存在四个碱基对错配。在一些实施方案中,在crRNA的靶特异性核苷酸区域和靶核酸的区域之间存在五个碱基对错配。
在一些实施方案中,本文提供的系统还包括反式激活crRNA(tracrRNA)或其衍生物。
本文提供的CRISPR-Cas系统包括源自天然存在的CRISPR-Cas系统的工程化和/或编程的核酸酶系统。CRISPR-Cas系统可以包括包含工程化和/或突变的Cas蛋白。CRISPR-Cas系统还可以包含工程化和/或编程的指导RNA。在一些实施方案中,本文提供的crRNA或其衍生物为具有与tracrRNA多核苷酸融合的crRNA多核苷酸的多核苷酸。在以其整体并入本文的Jinek等,2012,Science 337,816-821中描述了嵌合的单一指导RNA(sgRNA)。在一个实施方案中,本文提供的Cas蛋白或其变体可以通过嵌合sgRNA被引导至后面是5’-NGG前间区相邻基序(PAM)的任何基因组基因座。例如,在一些实施方案中,使用包含T7启动子的合成双链DNA模板,通过体外转录合成crRNA和tracrRNA。tracrRNA具有固定的序列,而靶序列指示crRNA序列的一部分。将等摩尔浓度的crRNA和tracrRNA混合并在55℃加热30秒。在37℃下以相同的摩尔浓度添加Cas9,并与RNA混合物一起孵育10分钟。然后将10-20倍摩尔过量的Cas9复合物添加至靶DNA中。结合反应可以在15分钟内发生。
在一些实施方案中,Cas蛋白或其变体为Cas9蛋白或其变体。来自嗜热链球菌(S.thermophilus)CRISPR-Cas系统的分离的Cas9-crRNA复合物以及由单独的组分体外组装的复合物证明它与携带与crRNA互补的核苷酸序列的合成的寡脱氧核苷酸和质粒DNA两者结合。已经显示Cas9具有两个核酸酶结构域-RvvC-和HNH-活性位点/核酸酶结构域,并且这两个核酸酶结构域负责切割相对的DNA链。在一些实施方案中,Cas9蛋白源自嗜热链球菌CRISPR-Cas系统的Cas9蛋白。在一些实施方案中,Cas9蛋白为具有约1,409个氨基酸残基的多结构域蛋白。
在一些实施方案中,Cas9蛋白或其变体为Cas9蛋白的无核酸酶变体(nuclease-null variant),其中RuvC-和HNH-活性位点/核酸酶结构域两者都被突变。Cas9蛋白的无核酸酶变体与双链DNA结合,但不切割DNA,并且因此其也可以用于靶特异性DNA富集。在一些实施方案中,Cas9蛋白具有两个失活的核酸酶结构域,所述两个失活的核酸酶结构域具有切割与crRNA互补的链的结构域中的第一突变、以及切割与crRNA不互补的链的结构域中的第二突变。在一些实施方案中,Cas9蛋白具有第一突变D10A和第二突变H840A。
在一些实施方案中,Cas蛋白或其变体为级联蛋白或其变体。大肠杆菌中(E.coli)的级联复合物以序列特异性方式识别双链DNA(dsDNA)靶。大肠杆菌级联复合物为包含五个功能必需的CRISPR相关(Cas)蛋白(CasA1B2C6D1E1,也称为级联蛋白)和61个核苷酸的crRNA的405-kDa复合物。crRNA通过与互补DNA链形成碱基对来将级联复核物指导至dsDNA靶序列,同时置换非互补链以形成R-环。级联体识别靶DNA而不消耗ATP,这表明持续的侵入物DNA监视在没有能量投入的情况下进行。Matthijs等,Nature Structural&MolecularBiology,2011,18,529–536。
在一些实施方案中,Cas蛋白或其变体为Cas3蛋白或其变体。大肠杆菌Cas3可以催化RNA与DNA的ATP非依赖性退火,形成R环以及RNA碱基配对到双链体DNA的杂交体。Cas3蛋白可以使用比Cas9的gRNA长的gRNA。Howard等,Biochem J.,2011,439(1):85-95。此类较长的RNA可以允许其他元件更容易地接近靶DNA,例如,接近待被聚合酶延伸的引物。Cas3蛋白提供的另一个优势为,Cas3蛋白不像Cas9需要PAM序列,因此为靶向期望的序列提供了更多的灵活性。通过Cas3形成R环可能要求镁作为辅助因子。Howard等,Biochem J.,2011,439(1):85-95。因此,在一些实施例中,本文提供的系统还包括镁。
应该理解,可以在本方法中使用能够破坏双链核酸并创建环结构的任何CRISPR-Cas系统。例如,本文提供的Cas蛋白可以包括但不限于,Haft等,PLoS Comput Biol.,2005,1(6):e60,和Zhang等,Nucl.Acids Res.,2013,10.1093/nar/gkt1262中描述的Cas蛋白。这些CRISPR-Cas系统中的一些要求,针对这些CRISPR-Cas系统存在识别和结合靶序列的特异性序列。例如,Cas9要求存在5’-NGG前间区相邻基序(PAM)。因此,在一些实施方案中,将PAM序列或与PAM序列互补的序列工程化到靶核酸中,以用于启动CRISPR-Cas系统与靶核酸的结合。
在一些实施方案中,本文提供的引物为单链寡脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中,引物长度范围为从约10个至约50个核苷酸。本文提供的示例性引物长度为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、或50个核苷酸。
在一些实施方案中,本文提供的引物具有与靶核酸的区域100%碱基对匹配。在一些实施方案中,本文提供的引物具有与靶核酸的区域90%-100%、80%-100%、或70%-100%碱基对匹配。在一些实施方案中,在引物和靶核酸的区域之间存在一个碱基对错配。在一些实施方案中,在引物和靶核酸的区域之间存在两个碱基对错配。在一些实施方案中,在引物和靶核酸的区域之间存在三个碱基对错配。在一些实施方案中,在引物和靶核酸的区域之间存在四个碱基对错配。在一些实施方案中,在引物和靶核酸的区域之间存在五个碱基对错配。
在一些实施方案中,本文提供的引物被标记,例如,用于扩增产物的富集或检测。在一些实施方案中,本文提供的引物被标记以便通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测。在一些实施方案中,引物用生物素、胺、放射性标记物(例如,32P)、荧光染料、电子致密试剂、酶(通常用于ELISAS)或生物素来标记。
在一些实施方案中,本文提供的聚合酶催化核苷酸的掺入以使引物分子的3’羟基末端相对于核酸靶序列延伸。在一些实施方案中,通过本文提供的聚合酶的反应在等温条件下进行。在一些实施方案中,聚合酶为链置换聚合酶。示例性聚合酶包括但不限于BstDNA聚合酶、9°Nm DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、DNA聚合酶I(大肠杆菌)、DNA聚合酶I(大片段(Large))m、(Klenow)片段、Klenow片段(3’-5‘外切-(exo-))、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Deep VentR TM(外切-)DNA聚合酶、Deep VentR TMDNA聚合酶、DyNAzyme TMEXT DNA、DyNAzyme TMII热启动DNA聚合酶、Phusion TM高保真DNA聚合酶、Therminator TMDNA聚合酶、Therminator TM II DNA聚合酶、VentRDNA聚合酶,VentR(外切-)DNA聚合酶、RepliPHITMPhi29 DNA聚合酶、rBst DNA聚合酶、rBst DNA聚合酶(大片段)、Fragment(IsoTherm TMDNA聚合酶)、MasterAmp TMAmpliTherm TM DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、TflDNA聚合酶、Tgo DNA聚合酶、SP6 DNA聚合酶、Tbr DNA聚合酶、DNA聚合酶β和ThermoPhi DNA聚合酶。在一些实施方案中,聚合酶选自由以下组成的组:Bst、Bsu和Phi29。当聚合酶延伸杂交链时,包括单链结合蛋白(SSB)可能是有益的。SSB可以稳定置换(非模板)链。因此,在一些实施方案中,本文提供的方法还可以包括SSB蛋白。
如讨论的,通过本文提供的线性或指数扩增提供的一个优势为,可以在恒定温度或等温条件下进行扩增。如本文使用的,术语“恒定温度”、“等温条件”或“等温地”指在扩增反应过程期间反应温度被保持基本恒定的一组反应条件。然而,不必将温度精确地维持在一个温度。如果用于维持升高温度的设备允许反应混合物的温度变化几度,这对扩增反应无害,并且仍然可被认为是等温反应。在一些实施方案中,扩增反应在20℃至70℃之间的恒定温度下进行。在一些实施方案中,扩增反应在25℃至60℃之间的恒定温度下进行。在一些实施方案中,扩增反应在40℃至55℃之间的恒定温度下进行。在一些实施方案中,扩增反应在30℃至40℃之间的恒定温度下进行。示例性扩增反应温度包括30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃和60℃。在一个实施方案中,扩增反应温度为约37℃。
在一些实施方案中,扩增反应运行的时间可以从例如1分钟至数小时变化,直至实现期望的扩增量。在一些实施方案中,扩增反应的时间为5分钟至1小时。示例性扩增反应时间包括5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟和60分钟。
在一些实施方案中,本方法可以用于期望检测和/或定量扩增的核酸产物的某些应用中。可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法检测扩增的靶序列。
在一些实施方案中,特异性染色双链DNA的染料可以用于检测或定量扩增产物。在一些实施方案中,嵌入染料在结合DNA或RNA后展现出增强的荧光。在一些实施方案中,染料可以为,例如DNA或RNA嵌入荧光团。示例性DNA或RNA嵌入荧光团包括但不限于吖啶橙、溴化乙锭、Hoechst染料、PicoGreen、碘化丙啶、SYBR I(不对称花青染料)、SYBR II,TOTO(噻唑橙二聚体)和YOYO(噁唑黄二聚体)。
在一些实施方案中,可以通过凝胶电泳检测具有特定尺寸的扩增产物。在一些实施方案中,扩增反应中使用的核苷酸可以用例如生物素标记。生物素标记的扩增序列可以使用与信号产生酶,例如过氧化物酶结合的抗生物素蛋白来捕获。
在一些实施方案中,标记的核苷酸可以被直接掺入到靶序列或到包含感兴趣靶的互补序列的引物中。此类标记物本质上可以为放射性的和/或荧光的,并且可以以本文讨论的任何方式来分辨。
检测和/或连续监测核酸产物扩增的方法也为本领域技术人员熟知的。例如,在一些实施方案中,靶核酸和核酸序列的产生或存在可以由分子信标(Molecular Beacon)进行检测和监测。分子信标为包含在一端上的荧光团和在相对端上的猝灭染料的发夹形寡核苷酸。发夹的环包含与靶序列互补的探针序列,而茎通过位于探针序列任一侧上的互补臂序列的退火形成。当分子信标遇到靶分子时,杂交发生;环结构被转化为稳定的更为刚性的构象,引起荧光团和猝灭物分子的分离,产生荧光。Tyagi等,Nature Biotechnology,1996,303-308。因此,荧光的产生表明预期的扩增产物的合成。另举例,在一些实施方案中,靶核酸和核酸序列的产生或存在可以通过荧光共振能量转移(FRET)来检测和监测。例如在DNA-DNA相互作用中,FRET为定量分子动力学的有用工具。为了监测特定产物的产生,探针可以在一个末端上用供体分子而在另一个末端上用受体分子标记。探针-靶杂交导致供体和受体的距离或取向发生变化,并且观察到FRET变化。Lakowicz,“Principles ofFluorescence Spectroscopy,”Plenum Publishing Corporation,第2版(Jul.1,1999)。用于检测和/或连续监测核酸产物扩增的其他示例性方法包括但不限于本领域技术人员已知的质谱、毛细管凝胶电泳、测序和多种表面捕获方法。在一些实施方案中,以不对称量的引物运行扩增反应(即一条引物以比另一条高的浓度存在)将允许以偏向一条链的扩增。过量的单链可以促进通过如检测ssDNA的分子信标的方式的检测。
本文提供的扩增方法可以用于多种应用。例如,在一些实施方案中,本文提供的方法可以用于通过选择性扩增特定的DNA区域来从基因组DNA分离DNA片段。
对于另一个实例,在一些实施方案中,本文提供的扩增方法可以用于基于与特定疾病相关的靶核酸的产生或存在来诊断多种疾病。在一些实施方案中,本文提供的方法可以用于早期诊断恶性疾病例如白血病和淋巴瘤。在其他实施方案中,本文提供的方法可以直接用于基因组DNA样品,以扩增和检测易位特异性恶性细胞。
在其他实施方案中,本文提供的方法可以用于诊断传染病,包括由细菌或病毒引起的传染病。例如,本方法可以用于检测感染原(infectious agent),并通过特异性核酸序列区分非致病菌株与致病菌株。在一些实施方案中,本文提供的扩增方法可以扩增和鉴定来自组织培养测定和动物模型的不可培养或缓慢生长的微生物,例如分枝杆菌(mycobacteria)、厌氧细菌或病毒。在其他实施方案中,本文提供的扩增方法可以扩增和鉴定来自个体的样品中的病毒DNA。
又在其他实施方案中,本扩增方法可以用于产生核酸材料以增强其他程序。例如,在一些实施方案中,本扩增方法可以用来产生用于要求相对较大量的代表特定DNA区域的DNA的DNA杂交或RNA杂交和DNA克隆的杂交探针。又举例,本文提供的方法可以用于核酸测序。
在特定实施方案中,本文提供的CRISPR-Cas介导的核酸扩增方法可以用于扩增例如,使用文库制备方法和/或从Illumina,Inc.(San Diego,CA)购得的试剂盒产生的核酸片段文库。
在一些实施方案中,本文提供的方法可以用于扩增由基因组DNA产生的核酸片段文库。在特定实施方案中,使用标签化(tagmentation)产生核酸片段文库。在特定实施方案中,使用Illumina的Nextera文库制备方法和试剂盒(从Illumina,Inc,San Diego,CA购得)由基因组DNA产生核酸片段文库。
因此,在一些实施方案中,本文提供的方法还包括:在靶核酸和包含转移链的至少一种转座子末端组合物经历转座反应的条件下,将至少一种转座酶和转座子末端组合物应用于包含靶核酸的样品以产生混合物,其中靶核酸被片段化以产生多个靶核酸片段,并因此将通用引物序列掺入到多个靶核酸片段的每一个中,其中crRNA或其衍生物包含与通用引物的区域互补的靶特异性核苷酸区域。
在一些实施方案中,靶核酸经历转座酶介导的标签化,所述标签化导致靶核酸的片段化,以及衔接子与双链DNA片段的两条链的5'末端的连接。任选地,使用美国公布号2010/0120098(其通过引用以其整体并入本文)中描述的标签化或转座可将靶核酸片段化,并将衔接子添加至5’和3’末端。简言之,“转座反应”为其中一个或更多个转座子在随机位点处被插入到靶核酸的反应。转座反应中的基本组分为转座酶和展现转座子的核苷酸序列的DNA寡核苷酸(包括转移的转座子序列及其互补物(即,未转移的转座子末端序列))以及形成功能性转座复合物或转座体复合物需要的其他组分。DNA寡核苷酸还可以根据需要或期望包含另外的序列(例如衔接子或引物序列)。适于在本文提供的方法中使用的示例性转座复合物包括,但不限于,由超活性Tn5转座酶和Tn5型转座子末端形成的那些、或通过MuA转座酶和包含R1和R2末端序列的Mu转座子末端形成的那些(参见,例如,Goryshin andReznikoff,J.Biol.Chem.273:7367,1998;和Mizuuchi,Cell35:785,1983;Savilahti等,EMBO J.14:4893,1995;其通过引用以其整体并入本文)。然而,能够将转座子末端以足够的效率插入至标签靶核酸用于其预期的目的的任何转座系统可以用于所提供的方法中。可以用于所提供的方法中的已知转座系统的其他实例包括,但不限于,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Tn552、Tyl、转座子Tn7、Tn/O和IS10、Mariner转座酶、Tel、P元件、Tn3、细菌插入序列、逆转录病毒和酵母的逆转录转座子(参见,例如,Colegio等,2001,J.Bacteriol.183:2384-8;kirby等,2002,Mol.Microbiol.43:173-86;Devine和Boeke,1994,Nucleic Acids Res.,22:3765-72;国际专利申请号WO 95/23875;Craig,1996,Science 271:1512;Craig,1996,综述于:Curr Top Microbiol Immunol.204:27-48;Kleckner等,1996,Curr Top Microbiol Immunol.204:49-82;Lampe等,1996,EMBO J.15:5470-9;Plasterk,1996,Curr Top Microbiol Immunol 204:125-43;Gloor,2004,MethodsMol.Biol.260:97-114;Ichikawa和Ohtsubo,1990,J Biol.Chem.265:18829-32;Ohtsubo和Sekine,1996,Curr.Top.Microbiol.Immunol.204:1-26;Brown等,1989,Proc Natl AcadSci USA 86:2525-9;Boeke和Corces,1989,Annu Rev Microbiol.43:403-34;其通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中,本公开内容的方法还包括去除转座酶,并通过PCR添加至适合的DNA片段的末端。
如本文使用的术语“标签化(tagmentation)”、“标签化(tagment)”或“标签化(tagmenting)”指在溶液中将核酸(例如,DNA)转化为衔接子修饰的模板,准备用于通过使用转座酶介导的片段化和加标签进行簇形成和测序。该方法通常牵涉通过包含与包含转座子末端序列的衔接子复合的转座酶的转座体复合物来修饰核酸。标签化导致同时的核酸片段化和衔接子与双链体片段的两条链的5’末端的连接。纯化步骤去除转座酶之后,另外的序列通过PCR被添加至衔接的片段的末端。
如本文使用的术语“转座体复合物”指与双链核酸非共价地结合的转座酶。例如,复合物可以是在支持非共价复合物形成的条件下与双链转座子DNA一起预孵育的转座酶。双链转座子DNA可包括但不限于Tn5 DNA、Tn5 DNA的部分、转座子末端组合物、转座子末端组合物或能与转座酶诸如超活性Tn5转座酶相互作用的其他双链DNA的混合物。
“转座酶”意指这样的酶,其能与包含转座子末端的组合物(例如,转座子、转座子末端、转座子末端组合物)形成功能性复合物,且例如能在体外转座反应中催化含转座子末端的组合物插入或转座到与其一起孵育的双链靶核酸。如本文所示的转座酶还可以包括来自逆转录转座子和逆转录病毒的整合酶。转座酶、转座体和转座体复合物通常为本领域技术人员已知的,如由US 2010/0120098的公开内容所示例的,其内容通过引用以其整体并入本文。尽管本文描述的很多实施方案涉及Tn5转座酶和/或超活性Tn5转座酶,但将理解,能够为了其预期的目的以足够的效率将转座子末端插入5’-标签并片段化靶核酸的任何转座系统可以用于本发明。在特定的实施方案中,优选的转座系统能以随机或几乎随机的方式将转座子末端插入至5’-标签并片段化靶核酸。
如本文使用的,术语“转座反应”指其中一个或更多个转座子在例如随机位点或几乎随机位点处被插入到靶核酸中的反应。转座反应中的基本组分为转座酶和展现转座子的核苷酸序列的DNA寡核苷酸(包括转移的转座子序列及其互补物(即,未转移的转座子末端序列))以及形成功能性转座复合物或转座体复合物需要的其他组分。根据需要或期望,DNA寡核苷酸还可包含另外的序列(例如,衔接子或引物序列)。在一些实施方案中,本文提供的方法通过采用通过超活性Tn5转座酶和Tn5型转座子末端形成的转座复合物(Goryshin和Reznikoff,1998,J.Biol.Chem.,273:7367)或通过MuA转座酶和包含R1和R2末端序列的Mu转座子末端(Mizuuchi,1983,Cell,35:785;Savilahti等,1995,EMBO J.,14:4893)来例示。然而,能够将转座子末端以随机或几乎随机的方式以足够的效率插入到靶DNA的5’标签和片段用于其预期的目的的任何转座系统可以用于本发明。可用于本方法的本领域已知的转座系统的实例包括但不限于金黄色葡萄球菌Tn552(Colegio等,2001,J Bacterid.,183:2384-8;Kirby等,2002,MoI Microbiol,43:173-86)、TyI(Devine和Boeke,1994,NucleicAcids Res.,22:3765-72和国际专利申请号WO 95/23875)、转座子Tn7(Craig,1996,Science.271:1512;Craig,1996,综述于:Curr Top Microbiol Immunol,204:27-48)、TnIO和ISlO(Kleckner等,1996,Curr Top Microbiol Immunol,204:49-82)、Mariner转座酶(Lampe等,1996,EMBO J.,15:5470-9)、Tci(Plasterk,1996,Curr Top MicrobiolImmunol,204:125-43)、P Element(Gloor,2004,Methods MoI Biol,260:97-114)、TnJ(Ichikawa and Ohtsubo,1990,J Biol Chem.265:18829-32)、细菌插入序列(Ohtsubo和Sekine,1996,Curr.Top.Microbiol.Immunol.204:1-26)、逆转录病毒(Brown等,1989,ProcNatl Acad Sci USA,86:2525-9)和酵母的逆转录转座子(Boeke和Corces,1989,Annu RevMicrobiol.43:403-34)。用于将转座子末端插入到靶序列中的方法可以使用任何合适的转座子系统在体外进行,对于所述合适的转座子系统存在合适的体外转座系统可用或所述合适的转座子系统可以基于本领域的知识开发。通常,用于本文提供的方法的合适的体外转座系统最少要求:具有足够纯度、足够浓度和足够的体外转座活性的转座酶;转座酶与其一起形成功能性复合物的转座子末端,所述功能性复合物具有各自的能够催化转座反应的转座酶。可以用于本发明的合适的转座酶转座子末端序列包括但不限制于,与转座酶形成复合物的野生型转座子末端序列、衍生的转座子末端序列或突变的转座子末端序列,所述转座酶选自野生型转座酶、衍生形式的转座酶、或突变形式的转座酶中。
术语“转座子末端”(TE)指仅展现对于与在体外转座反应中为功能性的转座酶或整合酶形成复合物为必要的核苷酸序列(“转座子末端序列”)的双链核酸,例如,双链DNA。在一些实施方案中,转座子末端能在转座反应中与转座酶形成功能性的复合物。作为非限制性实例,转座子末端可包括19-bp外末端(“OE”)转座子末端、内末端(“IE”)转座子末端、或被野生型或突变Tn5转座酶识别的“马赛克(mosaic)末端”(“ME”)转座子末端、或如在US2010/0120098的公开内容中描述的R1和R2转座子末端,其内容通过引用将其全部并入本文。转座子末端可以包括适于在体外转座反应中与转座酶或整合酶一起形成功能性复合物的任何核酸或核酸类似物。例如,转座子末端可以包括DNA、RNA、修饰的碱基、非天然碱基、修饰的骨架,并且可在一条或两条链中包含切口。尽管术语“DNA”在本公开内容中有时与转座子末端的组合物相连使用,但应理解任何合适的核酸或核酸类似物可以在转座子末端中被利用。
通过体外转座反应,靶核酸片段被在5'末端加标签。在一些实施方案中,本文提供的方法还包括将3’末端标签掺入至5'加标签的核酸片段以制备加双标签的核酸片段的文库的步骤。添加3’末端标签可以通过多种方法进行,例如如在WO 2010/048605中描述的通过使用DNA聚合酶、末端转移酶和/或连接酶进行,其内容通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中,加双标签的核酸片段通过使用具有链置换或5’核酸酶活性的聚合酶例如DNA聚合酶来产生。在一些实施方案中,本文提供的方法包括:在无热循环且其中退火的5’加标签的核酸片段未变性的条件下,使退火的5’加标签的核酸片段的群体与具有链置换或5’核酸酶活性的DNA聚合酶一起孵育,其中DNA聚合酶使用互补链作为模板延伸退火的5’加标签的核酸片段的每一条链的3’末端,并置换或消化非转移链,从而产生加双标签的双链DNA片段的文库。
在其他实施方案中,,在其中末端转移酶将第二标签连接至5’加标签的核酸片段的3’末端,从而产生加双标签的核酸片段的文库的条件下,将5’加标签的核酸片段与由末端转移酶组成的DNA聚合酶和该末端转移酶的至少一种底物一起孵育并持续足够的时间。在一些实施方案中,构成转座子末端组合物的非转移的转座子末端的3'末端被封闭(例如,通过使用具有双脱氧核苷酸或3'-O-甲基核苷酸作为3'末端核苷酸的非转移的转座子末端)。
又在其他的实施方案中,加双标签的核酸片段通过使用模板依赖性连接酶和连接加标签寡核苷酸来产生。在一些实施方案中,在其中第二标签被连接至退火的5’加标签的DNA片段,从而生成包括退火的加双标签的DNA片段的DNA片段的文库的条件下,使5’加标签的核酸片段与模板依赖性DNA连接酶和具有3’部分和5’部分的连接加标签寡脱氧核苷酸一起孵育并持续足够的时间,其中3’部分展现第二标签,所述第二标签展现被期望连接至5'加标签的DNA片段的3'末端的任何序列,并且5'部分具有5'单磷酸基团并展现随机序列。
在一些实施方案中,产生的核酸片段在核酸片段两个末端处包含通用序列。例如在文库中,在核酸片段两个末端处的通用序列可以根据本文提供的方法被CRISPR-Cas系统靶向,并且如此,这些片段可以例如在簇形式反应中被扩增。
此类通用序列可以通过PCR或Nextera转座子反应被引入到文库中核酸片段的两个末端。在一些实施方案中,在产生加标签的核酸片段的文库之后,可以例如使用有限循环聚合酶链式反应(PCR)扩增加标签的核酸片段,以引入其他的末端序列或衔接子,例如索引物(index)、通用引物以及簇形成和测序所需的其他序列。在特定实施方案中,进行有限循环PCR扩增以将索引物1(P7)和索引物2(P5)(从Illumina,Inc,San Diego,CA购得)添加至核酸片段的两个末端。
在一些实施方案中,对5’加标签的核酸片段的文库进行此类扩增。在一些实施方案中,对加双标签的核酸片段的文库进行此类扩增。示例性扩增方法包括:聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增反应、滚环扩增反应、连接酶链式反应、转录介导的扩增反应和环介导的扩增反应。
在一些实施方案中,本文提供的方法包括使用PCR扩增加双标签核酸片段的文库。在一些实施方案中,本文提供的方法包括使用本文提供的Cas9介导的扩增方法扩增加双标签的核酸片段的文库。在一些实施方案中,本文提供的方法使用单引物PCR扩增加双标签的DNA片段的文库。在一些实施方案中,扩增加双标签的DNA片段的步骤包括使用DNA聚合酶和与第二标签互补的至少一种引物。在一些实施方案中,扩增加双标签的DNA片段的文库的步骤包括通过使用展现转移链的至少一部分的序列的仅一种寡脱氧核糖核苷酸作为PCR引物并使用加双标签的DNA片段作为模板的PCR来扩增加标签的DNA片段的文库。在一些实施方案中,引物包含5'部分,所述5'部分包含另外的序列,例如衔接子序列。
在一些实施方案中,使用两种不同的PCR引物,每一种所述PCR引物展现构成转座子末端组合物的转移的转座子末端的至少一部分的序列。在一些实施方案中,每一种PCR引物包含3’部分和5’部分,其中3’部分展现各个转移的转座子末端序列,并且5’部分展现用于特定目的的各个标签结构域或衔接子(例如,用于下一代测序或扩增的测序标签结构域/衔接子或扩增标签结构域/衔接子,和任选地寻址标签结构域/衔接子)的序列。例如,当在体外转座反应中使用单一转座子末端组合物以使用具有链置换或5’核酸酶活性的DNA聚合酶产生加双标签的DNA片段的文库时,加双标签的DNA片段可以使用两种不同的PCR引物通过PCR来扩增。每种PCR引物包含3’部分和5’部分,其中3’部分展现各个转移的转座子末端序列,并且5’部分展现用于特定目的的各个标签结构域/衔接子(例如,用于下一代测序或扩增的测序标签结构域/衔接子或扩增标签结构域/衔接子,和任选地寻址标签结构域/衔接子)的序列。在一些实施方案中,每一种PCR引物的5’部分与另一种引物的5’部分不同,并且如此PCR产物的两个末端的序列不同。例如,一个末端包含一个索引物和/或通用引物序列,并且另一个末端包含不同的索引物和/或通用引物序列。
在一些实施方案中,加双标签的核酸片段的两个末端源自两个不同的转移链序列。例如,在一些实施方案中,在体外转座反应中可以使用两种不同的转座体,并且两种转座体的每一种包含相同的转座酶但转座子末端组合物不同。在一些实施方案中,使用两种不同的转座体,并且两种不同的转座体各自包含相同的转座酶而转座子末端组合物包含不同的转移链。在一些实施方案中,使用两种不同的转座体,并且两种转座体中的每一种包含不同的转座酶和不同的转座子末端组合物,所述不同的转座子末端组合物中的每一种与各自的转座酶一起形成功能性复合物。在一些实施方案中,其中在体外转座反应中使用两种不同的转座子末端组合物,并且加双标签的单链核酸片段的文库使用具有链置换或5’核酸酶活性的DNA聚合酶来产生,第一标签展现一种转座子末端组合物的转移链的序列并且第二标签展现另一种转座子末端组合物的非转移链的序列。
在以上提及的实施方案和其中两种不同的转移链被连接至双链核酸的每一条相对链的5’末端的其他实施方案中,本文提供的方法还可以包括使用两种不同的PCR引物通过PCR扩增加双标签的核酸片段的步骤。PCR引物中的一条展现构成一种转座子末端组合物的一条转移链的至少一部分的序列,而PCR引物中的另一条展现构成另一种转座子末端组合物的另一条转移链的至少一部分的序列。
在其中使用两条引物的一些实施方案中,每一条PCR引物包含3’部分和5’部分,其中3’部分展现各个转移的转座子末端序列,并且5’部分展现用于特定目的的各个标签结构域/衔接子(例如,用于下一代测序或扩增的测序标签域或扩增标签域,和任选地寻址标签域)的序列。在一些实施方案中,每一种PCR引物的5’部分与另一种引物的5’部分不同,并且如此将不同的序列引入至PCR产物的两个末端。在一些实施方案中,第一PCR引物的5’部分或第二PCR引物的5’部分,或第一PCR引物和第二PCR引物两者的5’部分分别包含第一测序标签/衔接子或第二测序标签/衔接子,用于针对特定的测序平台产生用于下一代测序的模板(例如,用于Illumina Nextera测序平台的测序标签)。在一些实施方案中,第一PCR引物的5’部分或第二PCR引物的5’部分另外包含寻址标签域/衔接子或用于特定目的的另一种标签域/衔接子。
如本领域技术人员已知的,很多种酶和试剂盒为可用于通过PCR进行扩增反应,。例如,在一些实施方案中,使用来自EPICENTRE Biotechnologies,Madison,WI的FAILSAFETMPCR系统或MASTERAMPTM Extra-Long PCR系统,如制造商描述的进行PCR扩增。然而,本公开内容不限于使用那些产品或条件用于扩增反应,而可以使用允许在退火至靶序列的引物和退火至转座子的引物之间的序列扩增的任何合适的热稳定DNA聚合酶和反应混合物。
本文提供的方法不限于使用PCR来扩增加标签的核酸片段的文库。扩增同一序列并产生用于预期目的的合适组成和量的扩增产物的任何合适的扩增方法(例如,滚环扩增、riboprimer扩增(例如美国专利号7,413,857)、ICAN、UCAN、ribospia、末端加标签(美国专利申请号20050153333)、Eberwine-type aRNA扩增或链置换扩增)可以用于本发明的实施方案中。例如,可以使用的一些链置换方法在以下中被描述:Takara Shuzo Company,Kyoto,Japan的PCT专利申请号WO 02/16639;WO 00/56877;和AU 00/29742;BectonDickinson and Company的美国专利号5,523,204;5,536,649;5,624,825;5,631,147;5,648,211;5,733,752;5,744,311;5,756,702;和5,916,779;Nanogen/Becton DickinsonPartnership的美国专利号6,238,868;6,309,833;和6,326,173;Bio Merieux的美国专利号5,849,547;5,874,260;和6,218,151;Gen-Probe,Inc.的美国专利号5,786,183;6,087,133;和6,214,587;Wick等的美国专利号6,063,604;Kurn的美国专利号6,251,639;EikenKagaku Kabushiki Kaishi,Tokyo,日本的美国专利号6,410,278;和PCT申请号WO 00/28082;Auerbach的美国专利号5,591,609;5,614,389;5,773,733;5,834,202;和6,448,017;以及Lizardi的美国专利号6,124,120;和6,280,949。在一些实施方案中,本文提供的Cas介导的扩增用于扩增靶核酸片段的文库。
在一些实施方案中,当靶核酸具有例如,如使用以上提供的方法产生的通用引物序列时,指导RNA,例如crRNA可以靶向文库中核酸片段的该通用引物序列,以等温扩增核酸片段的文库。
图1A-图1C阐释了一种根据本公开内容扩增由Nextera文库制品(从Illumina,Inc.,San Diego,CA购得)产生核酸片段的方法。在一些实施方案中,本文提供的Cas蛋白需要PAM序列以识别靶。例如,Cas9蛋白要求与靶序列相邻的基序NGG的序列。可以将与PAM序列互补的序列掺入到被添加至文库插入物的流动池(flowcell)引物(例如,P5和P7)以产生能够靶向包含PAM的序列的PAM修饰的P5和P7引物。标准通用引物P5和P7的序列示于图1A中(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)。PAM修饰的引物P5和P7的序列也示于图1A中(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)。因此,在一些实施方案中,将PAM修饰的引物P5和P7添加至文库中的核酸片段。在特定实施方案中,使用有限循环PCR将PAM修饰的引物P5和P7添加至核酸片段中。
如图1B-图1C中示出的,DNA片段(例如溶液中的Nextera扩增子)在扩增子的末端包含P5和P7引物序列(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)。添加包含靶向P5引物序列的区域的SEQ ID No.7的指导RNA的CRISPR-Cas9系统(参见图1B)和包含靶向P7引物序列的区域的SEQ ID No.8的指导RNA的CRISPR-Cas9系统(参见图1C)。CRISPR-Cas9系统打开双链DNA的一些区域,通过使crRNA与引物序列结合,在DNA片段的两个末端附近创建R-环结构。然后可以使用截短的PAM修饰的P5和P7引物(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)来扩增DNA片段。
因此,在一些实施方案中,靶双链核酸的第一链包含通用序列,并且其中crRNA或其衍生物包含与通用序列的区域互补的序列。在一些实施方案中,引物包含通用序列的区域的序列。
在一些实施方案中,通用引物具有SEQ ID No.3的序列。在一些实施方案中,crRNA包含SEQ ID No.7的序列。在一些实施方案中,引物包含SEQ ID No.5的序列。
在一些实施方案中,通用引物序列具有SEQ ID No.4的序列。在一些实施方案中,crRNA包含SEQ ID No.8的序列。在一些实施方案中,引物包含SEQ ID No.6的序列。
在一些实施方案中,靶双链核酸的第一链包含第一通用序列,并且其中第一系统的crRNA或其衍生物包含与第一通用序列的区域互补的序列,并且靶双链核酸的第二链包含第二通用序列,并且其中第二系统的crRNA或其衍生物包含与第二通用序列的区域互补的序列。在一些实施方案中,第一引物包含第一通用序列的区域的序列,且第二引物包含第二通用序列的区域的序列。在特定实施方案中,第一通用序列具有SEQ ID No.3的序列,第一系统的crRNA或其衍生物包含SEQ ID No.7的序列,且第一引物包含SEQ ID No.5的序列,并且第二通用序列具有SEQ ID No.4的序列,第二系统的crRNA或其衍生物包含SEQ IDNo.8的序列,且第二引物包含SEQ ID No.6的序列。
本文提供的方法可以用于等温扩增以用于例如,在由Illumina,Inc.(San Diego,CA)开发的簇扩增中测序。在一些实施方案中,本方法的靶核酸可以被固定化在表面上以用于扩增。例如,在一些实施方案中,固定化的核酸片段使用簇扩增方法来扩增,如由美国专利号7,985,565和号7,115,400的公开内容所示例的,其每一个的内容均被通过引用以整体并入本文。美国专利号7,985,565和7,115,400的并入的材料描述了固相核酸扩增的方法,其允许扩增产物被固定化在固体支持物上,以形成包括固定的核酸分子的簇或“集群”的阵列。在此类阵列上的每一个簇或集群由多个相同的固定的多核苷酸链和多个相同的固定的互补多核苷酸链形成。如此形成的阵列本文中通常地被称作“成簇的阵列”。固相扩增反应诸如在美国专利号7,985,565和7,115,400中描述的那些反应的产物是通过成对的固定的多核苷酸链和固定的互补的链的退火形成的所谓的“桥式”结构,两条链在5’末端优选地经由共价附接被固定化在固体支持物上。簇扩增方法为其中固定的核酸模板被用来产生固定的扩增子的方法的实例。其他合适的方法也可以被用来从根据本文提供的方法产生的固定的核酸片段产生固定的扩增子。例如,无论每一对扩增引物中的一个或两个引物是否被固定,一个或更多个簇或集群可以经由固相PCR来形成。
如本文使用的,本文中的术语“固体表面”、“固体支持物”和其他语法等同物指适于或可以被修饰以适于附接多核苷酸的任何材料。可能的基底包括但不限于:玻璃和修饰的或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM等等)、多糖、尼龙或硝酸纤维素、陶瓷、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料包括硅和修饰的硅、碳、金属、无机玻璃、塑料、光学纤维束、和很多其他聚合物。在一些实施方案中,固体支持物和固体表面位于流动池装置内。在一些实施方案中,固体支持物包括适于以有序的模式固定分子的模式化的表面。“模式化的表面”指不同区域在固体支持物的暴露层中或暴露层上的排列。在一些实施方案中,固体支持物包括表面中的孔或凹的阵列。固体支持物的组成和几何结构可以随其使用而变化。在一些实施方案中,固体支持物是平面结构,诸如载玻片、芯片、微芯片和/或阵列。如此,基底的表面可以是平面层的形式。在一些实施方案中,固体支持物包括流动池的一个或更多个表面。如本文使用的术语“流动池”指包含固体表面的室,一种或更多种流体试剂可流动穿过所述室。可以在本公开内容的方法中容易地使用的流动池和相关流体系统和检测平台的实例被描述于以下中:例如Bentley等,Nature 456:53-59(2008);WO 04/018497;US 7,057,026;WO 91/06678;WO 07/123744;US 7,329,492;US 7,211,414;US 7,315,019;US 7,405,281和US 2008/0108082,其每一个通过引用并入本文。在一些实施方案中,固体支持物或其表面是非平面的,诸如管或容器的内表面或外表面。在一些实施方案中,固体支持物包括微球或珠。在本文中“微球”、“珠”、“颗粒”或语法等同物被旨在意指由多种材料包括但不限于塑料、陶瓷、玻璃和聚苯乙烯制成的小的分散的颗粒。在某些实施方案中,微球为磁性微球或珠。可选择地或另外地,珠可以为多孔的。珠的尺寸范围从纳米例如,100nm至毫米,例如1mm。
在其他的实施方案中,在溶液中扩增固定的核酸片段。例如,在一些实施方案中,固定的核酸片段被裂解或者以其他方式从固体支持物释放,并且然后扩增引物在溶液中与释放的分子杂交。在其他实施方案中,对于一个或更多个初始扩增步骤,使扩增引物与固定的片段杂交,接着是随后在溶液中的扩增步骤。因此,在一些实施方案中,固定的核酸模板可以用来产生溶液相扩增子。将领会的是,本文描述的任何扩增方法可以通过通用的或靶特异的引物利用以扩增固定的核酸片段。
根据本文提供的方法扩增的核酸可以根据任何合适的测序方法来测序,诸如直接测序,包括合成测序、连接测序、杂交测序、纳米孔测序等。在一些实施方案中,在固体支持物上测序固定的DNA片段。在一些实施方案中,用于测序的固体支持物是与于其上扩增发生的固体支持物相同的固体支持物。
在一些实施方案中,在本文提供的方法中使用的测序方法为合成测序(SBS)。在SBS中,监测核酸引物沿着核酸模板(例如,靶核酸或其扩增子)的延伸以确定模板中核苷酸的序列。潜在的化学过程可以是聚合(例如,如被聚合酶催化)。在特定的基于聚合酶的SBS实施方案中,荧光标记的核苷酸以模板依赖模式被添加至引物(从而延伸引物),以使得检测添加至引物的核苷酸的顺序和类型可被用来确定模板的序列。
可以利用使用循环反应的其他测序程序,诸如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测无机焦磷酸(PPi)随着特定核苷酸被掺入到新生核酸链的释放(Ronaghi,等,1996,AnalyticalBiochemistry 242(1),84-9;Ronaghi,2001,Genome Res.11(1),3-11;Ronaghi等,1998,Science 281(5375),363;US 6,210,891;US 6,258,568和US.6,274,320,其每一个通过引用并入本文)。在焦磷酸测序中,释放的PPi可以通过立即被ATP硫酸化酶转化的腺苷三磷酸(ATP)来检测,并且产生的ATP的水平可以经由荧光素酶产生的质子来检测。因此,测序反应可以经由发光检测系统来监测。用于基于荧光的检测系统的激发放射源对于焦磷酸测序程序不是必需的。可被调整以应用于根据本公开内容产生的扩增子的焦磷酸测序的有用的流体系统、检测器和程序在以下中被描述:例如,WIPO专利申请系列号PCT/US11/57111、US2005/0191698A1、US 7,595,883、和US 7,244,559,其每一个通过引用并入本文。
一些实施方案可以利用牵涉DNA聚合酶活性的实时监测的方法。例如,核苷酸并入可以通过携带荧光团的聚合酶和γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用,或用零模波导(ZMW)来检测。用于基于FRET的测序的技术和试剂在以下中被描述:例如Levene等,2003,Science 299,682–686;Lundquist等,2008,Opt.Lett.33,1026–1028;Korlach等,2008,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176–1181,其公开内容通过引用并入本文。
一些SBS实施方案包括检测将核苷酸掺入到延伸产物后释放的质子。例如,基于检测释放的质子的测序可以使用电子检测器和从Ion Torrent(Guilford,CT,a LifeTechnologies subsidiary)商购的相关技术,或在US 2009/0026082 A1、US 2009/0127589A1、US 2010/0137143 A1或US 2010/0282617 A1中描述的测序方法和系统,其每一个通过引用并入本文。本文列出的使用动力学排除扩增靶核酸的方法可以容易地应用于被用来检测质子的基底。更具体地,本文列出的方法可以用来产生用于检测质子的扩增子的克隆群体。
另一种有用的测序技术为纳米孔测序(参见,例如Deamer等,2000,TrendsBiotechnol.18,147–151;Deamer等,2002,Acc.Chem.Res.35:817-825;Li等,2003,Nat.Mater.2:611–615),其公开内容通过引用并入本文。在一些纳米孔实施方案中,将靶核酸或从靶核酸去除的单个核苷酸通过纳米孔。随着核酸或核苷酸通过纳米孔,每一个核苷酸类型可以通过测量孔的电导率波动来鉴定。(美国专利号7,001,792;Soni等,2007,Clin。Chem.,53,1996–200;Healy,2007,Nanomed.2,459–481;Cockroft等,2008,J.Am.Chem.Soc.,130,818–820,其公开内容通过引用并入本文。在其他纳米孔测序实施方案中,待测序的DNA片段使用γ磷酸修饰的核苷酸创建独特的纳米孔电流特征(signature)。
从前面的描述将明显的是,可以对本文描述的发明进行变化和改变,以使其适应多种用途和条件。此类实施方案也在以下权利要求书的范围内。
在本文的任何的变量的定义中对一列要素的叙述包括那个变量做为任一单个要素或所列要素的组合(或子组合)的定义。本文中对实施方案的叙述包括作为那个实施方案作为任一单独的实施方案与任何其他实施方案或其部分组合。
在该说明书中提到的所有专利和出版物通过引用并入本文,其程度如同每一个单独专利和出版物被特别地和单独地指明通过引用并入的相同程度。
序列表
<110> 伊鲁米那股份有限公司
<120> 使用CRISPR-CAS系统的多核苷酸扩增
<130> 12957-170-228
<140> 待分配
<141> 2015-11-10
<150> 62/078,355
<151> 2014-11-11
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 标准P5序列
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 标准P7序列
<400> 2
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> PAM-修饰的P5序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n是a、c、g或t
<400> 3
ccnaatgata cggcgaccac cgagatctac ac 32
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> PAM-修饰的P7序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n是a、c、g或t
<400> 4
ccncaagcag aagacggcat acgagat 27
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 截短的PAM-修饰的P5序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n是a、c、g或t
<400> 5
ccnaatgata cggcgaccac c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 截短的PAM-修饰的P7序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n是a、c、g或t
<400> 6
ccncaagcag aagacggcat a 21
<210> 7
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 靶向P5的指导RNA
<400> 7
ucgguggucg ccguaucauu 20
<210> 8
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 靶向P7的指导RNA
<400> 8
cguaugccgu cuucugcuug 20
Claims (10)
1.一种用于扩增靶双链核酸的方法,所述方法包括:
(a)提供一种系统,所述系统具有:
成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA),以及
成簇的规律间隔的短回文重复相关(Cas)蛋白,
其中所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA包含与所述靶双链核酸的第一链的区域互补的靶特异性核苷酸区域,
其中所述系统为I型成簇的规律间隔的短回文重复-成簇的规律间隔的短回文重复相关系统,并且所述系统还包含反式激活成簇的规律间隔的短回文重复RNA(tracrRNA);
(b)使所述靶双链核酸与所述系统接触以形成复合物;
(c)使引物与所述靶双链核酸的第二链杂交,所述引物包含与所述靶双链核酸的第二链的区域互补的序列,以及
(d)使用聚合酶从所述引物延伸与所述靶双链核酸的第二链互补的核酸。
2.一种用于扩增靶双链核酸的方法,所述方法包括:
(a)提供一种系统,所述系统具有:
成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA),以及
成簇的规律间隔的短回文重复相关(Cas)蛋白,
其中所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA包含与所述靶双链核酸的第一链的区域互补的靶特异性核苷酸区域,
其中所述系统为III型成簇的规律间隔的短回文重复-成簇的规律间隔的短回文重复相关系统,并且所述系统还包含反式激活成簇的规律间隔的短回文重复RNA(tracrRNA);
(b)使所述靶双链核酸与所述系统接触以形成复合物;
(c)使引物与所述靶双链核酸的第二链杂交,所述引物包含与所述靶双链核酸的第二链的区域互补的序列,以及
(d)使用聚合酶从所述引物延伸与所述靶双链核酸的第二链互补的核酸。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法,所述方法还包括重复步骤(a)至步骤(d)一次或更多次。
4.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中所述靶双链核酸被线性地扩增。
5.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中所述靶双链核酸被指数地扩增。
6.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中所述靶双链核酸为双链DNA(dsDNA)。
7.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中所述靶双链核酸为双链RNA(dsRNA)。
8.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA为包含与反式激活成簇的规律间隔的短回文重复RNA多核苷酸融合的成簇的规律间隔的短回文重复RNA多核苷酸的多核苷酸。
9.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中所述靶双链核酸的第一链包含与5’-NGG前间区相邻基序(PAM)互补的序列。
10.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中所述靶双链核酸的第一链包含通用序列,并且其中所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA包含与所述通用序列的区域互补的序列。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462078355P | 2014-11-11 | 2014-11-11 | |
US62/078,355 | 2014-11-11 | ||
PCT/US2015/059959 WO2016077350A1 (en) | 2014-11-11 | 2015-11-10 | Polynucleotide amplification using crispr-cas systems |
CN201580072952.7A CN107109495B (zh) | 2014-11-11 | 2015-11-10 | 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201580072952.7A Division CN107109495B (zh) | 2014-11-11 | 2015-11-10 | 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114438174A true CN114438174A (zh) | 2022-05-06 |
Family
ID=54602072
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210117052.1A Pending CN114438174A (zh) | 2014-11-11 | 2015-11-10 | 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增 |
CN201580072952.7A Active CN107109495B (zh) | 2014-11-11 | 2015-11-10 | 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201580072952.7A Active CN107109495B (zh) | 2014-11-11 | 2015-11-10 | 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10577649B2 (zh) |
EP (1) | EP3218513B1 (zh) |
CN (2) | CN114438174A (zh) |
AU (3) | AU2015346514B2 (zh) |
CA (1) | CA2967351A1 (zh) |
DK (1) | DK3218513T3 (zh) |
ES (1) | ES2706531T3 (zh) |
HK (1) | HK1243464B (zh) |
SG (1) | SG11201703779VA (zh) |
WO (1) | WO2016077350A1 (zh) |
Families Citing this family (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2012333134B2 (en) | 2011-07-22 | 2017-05-25 | John Paul Guilinger | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
US20150166982A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting pi3k point mutations |
US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
ES2706531T3 (es) * | 2014-11-11 | 2019-03-29 | Illumina Inc | Amplificación de polinucleótidos empleando sistemas CRISPR-Cas |
AU2016342380B2 (en) | 2015-10-23 | 2022-04-07 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
US11542544B2 (en) | 2016-05-11 | 2023-01-03 | Illumina, Inc. | Polynucleotide enrichment and amplification using CRISPR-Cas or Argonaute systems |
US11371081B2 (en) | 2016-05-25 | 2022-06-28 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Portable, low-cost pathogen detection and strain identification platform |
WO2017218512A1 (en) * | 2016-06-13 | 2017-12-21 | Grail, Inc. | Enrichment of mutated cell free nucleic acids for cancer detection |
AU2017306676B2 (en) | 2016-08-03 | 2024-02-22 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
CN109804066A (zh) | 2016-08-09 | 2019-05-24 | 哈佛大学的校长及成员们 | 可编程cas9-重组酶融合蛋白及其用途 |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
WO2018165629A1 (en) | 2017-03-10 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
SG11201908658TA (en) | 2017-03-23 | 2019-10-30 | Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
CN111094565B (zh) * | 2017-06-07 | 2024-02-06 | 阿克生物公司 | 指导核酸的产生和用途 |
JP2020534795A (ja) | 2017-07-28 | 2020-12-03 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ファージによって支援される連続的進化(pace)を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物 |
EP3676376A2 (en) | 2017-08-30 | 2020-07-08 | President and Fellows of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
CA3082251A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
US10227576B1 (en) | 2018-06-13 | 2019-03-12 | Caribou Biosciences, Inc. | Engineered cascade components and cascade complexes |
MX2020013461A (es) * | 2018-06-26 | 2021-04-28 | Broad Inst Inc | Composiciones, sistemas y métodos de amplificación basados en la doble nicasa crispr. |
CA3102163A1 (en) * | 2018-06-26 | 2020-01-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Crispr effector system based amplification methods, systems, and diagnostics |
US11680261B2 (en) | 2018-11-15 | 2023-06-20 | Grail, Inc. | Needle-based devices and methods for in vivo diagnostics of disease conditions |
CN114729365A (zh) | 2019-03-19 | 2022-07-08 | 布罗德研究所股份有限公司 | 用于编辑核苷酸序列的方法和组合物 |
EP4146804A1 (en) | 2020-05-08 | 2023-03-15 | The Broad Institute Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
CN111662968A (zh) * | 2020-06-23 | 2020-09-15 | 南方科技大学 | 一种基于crispr的无pam序列dna的检测方法及其应用 |
US20240076712A1 (en) * | 2021-01-08 | 2024-03-07 | Wuhan University | Compositions and methods for instant nucleic acid detection |
CN113201586B (zh) * | 2021-04-22 | 2024-03-26 | 苏州淦江生物技术有限公司 | 一种基于Cas蛋白的检测方法 |
WO2024187091A1 (en) * | 2023-03-08 | 2024-09-12 | Seek Labs, Inc. | Compositions and methods of isothermal nucleic acid amplification |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6251639B1 (en) * | 1999-09-13 | 2001-06-26 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences, using a RNA-DNA composite primer |
WO2014125668A1 (ja) * | 2013-02-14 | 2014-08-21 | 国立大学法人大阪大学 | 内在性dna配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法 |
CN107109495A (zh) * | 2014-11-11 | 2017-08-29 | 伊鲁米那股份有限公司 | 使用crispr‑cas系统的多核苷酸扩增 |
Family Cites Families (63)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4883750A (en) | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
CA2044616A1 (en) | 1989-10-26 | 1991-04-27 | Roger Y. Tsien | Dna sequencing |
US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
US5614389A (en) | 1992-08-04 | 1997-03-25 | Replicon, Inc. | Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules |
WO1994003624A1 (en) | 1992-08-04 | 1994-02-17 | Auerbach Jeffrey I | Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules |
US6261808B1 (en) | 1992-08-04 | 2001-07-17 | Replicon, Inc. | Amplification of nucleic acid molecules via circular replicons |
US5834202A (en) | 1992-08-04 | 1998-11-10 | Replicon, Inc. | Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules |
US5593826A (en) | 1993-03-22 | 1997-01-14 | Perkin-Elmer Corporation, Applied Biosystems, Inc. | Enzymatic ligation of 3'amino-substituted oligonucleotides |
WO1994024143A1 (en) | 1993-04-12 | 1994-10-27 | Northwestern University | Method of forming oligonucleotides |
US5422252A (en) | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
CA2122203C (en) | 1993-05-11 | 2001-12-18 | Melinda S. Fraiser | Decontamination of nucleic acid amplification reactions |
WO1995003430A1 (en) | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Gen-Probe Incorporated | Methods for enhancing nucleic acid amplification |
FR2708288B1 (fr) | 1993-07-26 | 1995-09-01 | Bio Merieux | Procédé d'amplification d'acides nucléiques par transcription utilisant le déplacement, réactifs et nécessaire pour la mise en Óoeuvre de ce procédé. |
US5523204A (en) | 1993-12-10 | 1996-06-04 | Becton Dickinson And Company | Detection of nucleic acids in cells by strand displacement amplification |
SE9400522D0 (sv) | 1994-02-16 | 1994-02-16 | Ulf Landegren | Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences |
US5677170A (en) | 1994-03-02 | 1997-10-14 | The Johns Hopkins University | In vitro transposition of artificial transposons |
CA2185239C (en) | 1994-03-16 | 2002-12-17 | Nanibhushan Dattagupta | Isothermal strand displacement nucleic acid amplification |
US5648211A (en) | 1994-04-18 | 1997-07-15 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification using thermophilic enzymes |
FR2726277B1 (fr) | 1994-10-28 | 1996-12-27 | Bio Merieux | Oligonucleotide utilisable comme amorce dans une methode d'amplification basee sur une replication avec deplacement de brin |
US5631147A (en) | 1995-09-21 | 1997-05-20 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acids in cells by thermophilic strand displacement amplification |
US5916779A (en) | 1995-09-21 | 1999-06-29 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification of RNA targets |
EP0914462A4 (en) | 1996-03-18 | 2002-05-22 | Molecular Biology Resources | Amplification of target nucleic acid sequences |
US5773733A (en) | 1996-04-12 | 1998-06-30 | National Science Council | Alumina-aluminum nitride-nickel composites |
GB9620209D0 (en) | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
GB9626815D0 (en) | 1996-12-23 | 1997-02-12 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
ES2563643T3 (es) | 1997-04-01 | 2016-03-15 | Illumina Cambridge Limited | Método de secuenciación de ácido nucleico |
US6124120A (en) | 1997-10-08 | 2000-09-26 | Yale University | Multiple displacement amplification |
AR021833A1 (es) | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
DE69940623D1 (de) | 1998-11-09 | 2009-04-30 | Eiken Chemical | Prozess zur Synthetisierung von Nukleinsäure |
WO2000056877A1 (fr) | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Procede d'amplification d'une sequence d'acide nucleique |
US6238868B1 (en) | 1999-04-12 | 2001-05-29 | Nanogen/Becton Dickinson Partnership | Multiplex amplification and separation of nucleic acid sequences using ligation-dependant strand displacement amplification and bioelectronic chip technology |
US6309833B1 (en) | 1999-04-12 | 2001-10-30 | Nanogen/Becton Dickinson Partnership | Multiplex amplification and separation of nucleic acid sequences on a bioelectronic microchip using asymmetric structures |
US6326173B1 (en) | 1999-04-12 | 2001-12-04 | Nanogen/Becton Dickinson Partnership | Electronically mediated nucleic acid amplification in NASBA |
US20050191698A1 (en) | 1999-04-20 | 2005-09-01 | Illumina, Inc. | Nucleic acid sequencing using microsphere arrays |
US6274320B1 (en) | 1999-09-16 | 2001-08-14 | Curagen Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
US7244559B2 (en) | 1999-09-16 | 2007-07-17 | 454 Life Sciences Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
US7001792B2 (en) | 2000-04-24 | 2006-02-21 | Eagle Research & Development, Llc | Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same |
CA2415897A1 (en) | 2000-07-07 | 2002-01-17 | Susan H. Hardin | Real-time sequence determination |
AU7878301A (en) | 2000-08-23 | 2002-03-04 | Takara Shuzo Co | Method of amplifying nucleic acid |
WO2002044425A2 (en) | 2000-12-01 | 2002-06-06 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
US7057026B2 (en) | 2001-12-04 | 2006-06-06 | Solexa Limited | Labelled nucleotides |
US7541444B2 (en) | 2002-08-23 | 2009-06-02 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleotides |
US7595883B1 (en) | 2002-09-16 | 2009-09-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Biological analysis arrangement and approach therefor |
AU2003294447A1 (en) | 2002-11-21 | 2004-06-18 | Epicentre Technologies | Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences |
US20050153333A1 (en) | 2003-12-02 | 2005-07-14 | Sooknanan Roy R. | Selective terminal tagging of nucleic acids |
CN101914620B (zh) | 2004-09-17 | 2014-02-12 | 加利福尼亚太平洋生命科学公司 | 核酸测序的方法 |
US7405281B2 (en) | 2005-09-29 | 2008-07-29 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor |
EP2018622B1 (en) | 2006-03-31 | 2018-04-25 | Illumina, Inc. | Systems for sequence by synthesis analysis |
US7754429B2 (en) * | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
EP2089517A4 (en) | 2006-10-23 | 2010-10-20 | Pacific Biosciences California | POLYMERASEENZYME AND REAGENTS FOR ADVANCED NUCKIC ACID SEQUENCING |
EP2677309B9 (en) | 2006-12-14 | 2014-11-19 | Life Technologies Corporation | Methods for sequencing a nucleic acid using large scale FET arrays, configured to measure a limited pH range |
US8349167B2 (en) | 2006-12-14 | 2013-01-08 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays |
US8262900B2 (en) | 2006-12-14 | 2012-09-11 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
US20100137143A1 (en) | 2008-10-22 | 2010-06-03 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods and apparatus for measuring analytes |
PT2787565E (pt) | 2008-10-24 | 2015-11-17 | Epict Technologies Corp | Composições de extremidade de transposão e métodos de modificação de ácidos nucleicos |
US9080211B2 (en) | 2008-10-24 | 2015-07-14 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
EP2632593B1 (en) | 2010-10-27 | 2021-09-29 | Illumina, Inc. | Flow cells for biological or chemical analysis |
CN103233028B (zh) * | 2013-01-25 | 2015-05-13 | 南京徇齐生物技术有限公司 | 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列 |
US11414695B2 (en) * | 2013-05-29 | 2022-08-16 | Agilent Technologies, Inc. | Nucleic acid enrichment using Cas9 |
CN104017821B (zh) | 2014-05-16 | 2016-07-06 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法 |
CA3176503A1 (en) * | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Illumina, Inc | Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems |
-
2015
- 2015-11-10 ES ES15797569T patent/ES2706531T3/es active Active
- 2015-11-10 CN CN202210117052.1A patent/CN114438174A/zh active Pending
- 2015-11-10 EP EP15797569.9A patent/EP3218513B1/en active Active
- 2015-11-10 AU AU2015346514A patent/AU2015346514B2/en active Active
- 2015-11-10 CA CA2967351A patent/CA2967351A1/en active Pending
- 2015-11-10 CN CN201580072952.7A patent/CN107109495B/zh active Active
- 2015-11-10 DK DK15797569.9T patent/DK3218513T3/en active
- 2015-11-10 WO PCT/US2015/059959 patent/WO2016077350A1/en active Application Filing
- 2015-11-10 US US15/524,962 patent/US10577649B2/en active Active
- 2015-11-10 SG SG11201703779VA patent/SG11201703779VA/en unknown
-
2018
- 2018-02-28 HK HK18102911.2A patent/HK1243464B/zh unknown
-
2020
- 2020-01-06 US US16/735,372 patent/US12065695B2/en active Active
-
2021
- 2021-07-05 AU AU2021204700A patent/AU2021204700B2/en active Active
-
2023
- 2023-03-27 AU AU2023201867A patent/AU2023201867A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6251639B1 (en) * | 1999-09-13 | 2001-06-26 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences, using a RNA-DNA composite primer |
WO2014125668A1 (ja) * | 2013-02-14 | 2014-08-21 | 国立大学法人大阪大学 | 内在性dna配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法 |
CN107109495A (zh) * | 2014-11-11 | 2017-08-29 | 伊鲁米那股份有限公司 | 使用crispr‑cas系统的多核苷酸扩增 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20170342474A1 (en) | 2017-11-30 |
US12065695B2 (en) | 2024-08-20 |
AU2023201867A1 (en) | 2023-05-04 |
AU2015346514B2 (en) | 2021-04-08 |
AU2015346514A1 (en) | 2017-05-25 |
AU2021204700A1 (en) | 2021-07-29 |
DK3218513T3 (en) | 2019-02-04 |
EP3218513A1 (en) | 2017-09-20 |
US10577649B2 (en) | 2020-03-03 |
CA2967351A1 (en) | 2016-05-19 |
EP3218513B1 (en) | 2018-10-31 |
HK1243464B (zh) | 2019-08-16 |
SG11201703779VA (en) | 2017-06-29 |
WO2016077350A1 (en) | 2016-05-19 |
ES2706531T3 (es) | 2019-03-29 |
US20200199664A1 (en) | 2020-06-25 |
CN107109495A (zh) | 2017-08-29 |
AU2021204700B2 (en) | 2023-02-23 |
CN107109495B (zh) | 2021-12-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2021204700B2 (en) | Polynucleotide Amplification Using CRISPR-Cas Systems | |
CN109477137B (zh) | 使用argonaute系统的多核苷酸富集和扩增 | |
CN107109401B (zh) | 使用crispr-cas系统的多核苷酸富集 | |
CA2750054C (en) | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids | |
EP3842545A1 (en) | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries | |
US20220259587A1 (en) | Methods for generating, and sequencing from, asymmetric adaptors on the ends of polynucleotide templates comprising hairpin loops | |
WO2014081511A1 (en) | Method for preventing carry-over contamination in nucleic acid amplification reactions | |
US20210230689A1 (en) | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries | |
US20240124921A1 (en) | Detection of analytes using targeted epigenetic assays, proximity-induced tagmentation, strand invasion, restriction, or ligation | |
CN109153698B (zh) | miRNA转录组方法和组合物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40073664 Country of ref document: HK |