CN104017821B - 定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种定向编辑颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法，包含以下步骤：在颖壳颜色决定基因OsCHI外显子区选取靶标片段并构建植物CRISPR/Cas9打靶重组载体，将该重组载体导入水稻细胞并再生成苗，在载体中的表达框的作用下对水稻细胞进行剪切，触发水稻细胞DNA的自我修复功能。再通过对再生株系基因组目标片段的测序，获取携带两个等位OsCHI基因同时发生功能缺失突变的株系，经过颖壳颜色鉴定，即为所创制的褐壳水稻材料。实验表明，本方法可利用颖壳颜色决定基因OsCHI快速创制褐壳水稻材料。
Description
技术领域
本发明涉及水稻生物技术育种领域，具体涉及一种定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的育种方法。
背景技术
水稻颖壳颜色是一种在水稻抽穗后就能识别的标记，研究表明颖壳颜色受到多种因素影响，与环境因素、木质素合成以及类黄酮类色素的积累和沉积等有关，其中颖壳中类黄酮色素的积累是造成多种颖壳颜色的主要原因。水稻颖壳颜色受环境因素影响较小，性状较为稳定，是水稻分类、育种和品种区分的重要标记形状。
国内外对颖壳颜色的遗传研究由来已久。水稻颖壳颜色的遗传既有受单基因控制的，也有受2～3对互作基因控制的。OsCHI是一种可单独控制水稻颖壳颜色的基因。OsCHI编码一种查尔酮异构酶，可催化柚皮苷查尔酮异构化形成有生物活性的二羟基黄烷酮，是色素合成途径中将中间体查尔酮转化为最终产物花青素等水溶性色素的关键步骤。已有报道表明，籼稻品种浙辐802的突变体gh1中，OsCHI基因5’非翻译区中，在翻译起始密码子ATG上游12bp处，插入了一个长达7.3kb的反转座子，造成OsCHI基因不表达，从而引起gh1突变体的颖壳颜色变深。进一步的分析表明，OsCHI基因的不表达，仅造成水稻种子颖壳和节间颜色的加深，并不会改变花期、产量、米质等主要水稻农艺形状。
虽然OsCHI在品种区分等方面具有广阔的应用前景，但是其天然的遗传突变资源有限，应用存在一定的技术难度。通过传统的回交导入技术，育种周期漫长，成本较大，且可能导入与突变位点连锁的其他供体基因组片段，对品种选育带来不可预知的风险。因此，人们希望通过找到更好地方式创制褐壳水稻材料。但是目前，还没有研究机构在这方面取得突破。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)，在水稻颖壳颜色决定基因OsCHI(LOC_Os03g60509.1)外显子区选取靶标片段，其中所述靶标片段位于目的基因(水稻颖壳颜色决定基因OsCHI)上，所述靶标片段的一条链具有5’-(N)X-NGG-3’结构，(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1,N2……Nx}，N1,N2……Nx中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N为A、G、C、T中的任意一个；
2)，按照所述靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻OsCHI基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，所述重组载体包括具有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述向导RNA表达框包括CRISPRRNA(crRNA)和sgRNA，CRISPRRNA的序列为所述靶标区段的5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X或与之互补的序列；
3)，将所述重组载体导入水稻细胞，诱导所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在细胞中共同表达，剪切OsCHI基因的双链靶标片段，触发水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内OsCHI基因的功能缺失突变；
4)，用导入所述重组载体的水稻细胞再生若干水稻植株；
5)，通过基因组PCR方法克隆再生植株中OsCHI基因包含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序。
6)，选择两个等位OsCHI基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型鉴定，以筛选出种子变为褐色的再生株系。
所述靶标片段位于OsCHI基因外显子上，优选为OsCHI基因第一外显子和第二外显子。在所述OsCHI基因外显子上，具有所述(N)X-NGG-3’结构的片段可选为靶标的共有71个，优选的，靶标片段选自位于第一外显子的13个或位于第二外显子的15个具有所述(N)X-NGG-3’结构的片段。选择其他外显子的效果不如此二者。
在一种实现方式中，X为19或20。本申请的发明人发现只有当X为19或20时，所得的实验结果才最为理想，其他数值均难以是实现相同效果。
所述功能缺失突变为正常OsCHI编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
在一种实现方式中，所述重组载体包含：能够在水稻细胞内表达的向导RNA表达框，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；能够在水稻细胞内表达的Cas9核酸酶表达框，其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。
在一种实现方式中，所述向导RNA表达框包括：水稻U6启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1至246位所示；结构特征为(N)X的靶标序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第267至350位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第351至358位所示。
在一种实现方式中，所述Cas9核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.2第1至2031位所示；Cas9编码序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.2第6347至6599位所示。
在步骤2中，按照靶标序列的核酸排列顺序，构建用于水稻OsCHI基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，向导RNA由CRISPRRNA(crRNA)和sgRNA组成(对于不同位点的基因打靶来说，sgRNA是固定不变的，而CrRNA是根据靶位点的不同变化的)。其中所述重组载体中的CRISPRRNA(crRNA)序列为步骤(1)中所述靶标区段5’-(N)X-NGG-3’中的(N)X或与之互补的序列。；
在上述步骤3)中，将步骤2)所获重组载体导入水稻细胞，使细胞同时含有向导RNA表达框(具有所述靶标片段)和Cas9核酸酶表达框；在向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框的共同作用下，OsCHI基因的双链靶标片段被剪切。将重组载体导入水稻细胞的方法为PEG介导的水稻原生质体瞬时转化或农杆菌介导的水稻愈伤组织稳定转化。不管是采用哪种方式，在剪切OsCHI基因的双链靶标片段时，都能够同时带来水稻自身DNA的损伤。从而触发水稻细胞自身的DNA修复功能，最终实现细胞内OsCHI基因靶标片段的随机插入和/或随机缺失。
所述方法中，步骤4)中再生植株的方法为将细胞或组织经过组织培养，获得植株。
步骤5)中所述基因组PCR方法为，针对包含靶标片段的基因组区域，设计位点特异性引物，以再生植株的基因组DNA为模板，扩增所述包含靶标片段的基因组区域。所述扩增产物测序是指，对PCR产物中的目的条带测序。
在步骤6)中所述的两个等位OsCHI基因都出现功能缺失突变是指测序结果在OsCHI基因靶标位点出现两种功能缺失突变序列，且没有出现野生型序列；其中所述功能缺失突变指的是正常OsCHI编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。步骤6)中所获得的种子为褐色的株系，即为所创制的褐壳水稻材料。
在一种优选实现方式中，向导RNA表达框的核苷酸序列如下(SeqIDNo.1)：
ggatcatgaaccaacggcctggctgtatttggtggttgtgtagggagatggggagaagaaaagcccgattctcttcgctgtgatgggctggatgcatgcgggggagcgggaggcccaagtacgtgcacggtgagcggcccacagggcgagtgtgagcgcgagaggcgggaggaacagtttagtaccacattgcccagctaactcgaacgcgaccaacttataaacccgcgcgctgtcgcttgtgtgCGGCGTCGTGTTCCCGCCGGgttttagagctatgctgaaaagcatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttt
在一种优选实现方式中，Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如下(SeqIDNo.2)：
ctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaatgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcagcccgggggatccccaatacttgtatggccgcggccgctctagatggattacaaggaccacgacggggattacaaggaccacgacattgattacaaggatgatgatgacaagatggctccgaagaagaagaggaaggttggcatccacggggtgccagctgctgacaagaagtactcgatcggcctcgatattgggactaactctgttggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgccctcaaagaagttcaaggtcctgggcaacaccgatcggcattccatcaagaagaatctcattggcgctctcctgttcgacagcggcgagacggctgaggctacgcggctcaagcgcaccgcccgcaggcggtacacgcgcaggaagaatcgcatctgctacctgcaggagattttctccaacgagatggcgaaggttgacgattctttcttccacaggctggaggagtcattcctcgtggaggaggataagaagcacgagcggcatccaatcttcggcaacattgtcgacgaggttgcctaccacgagaagtaccctacgatctaccatctgcggaagaagctcgtggactccacagataaggcggacctccgcctgatctacctcgctctggcccacatgattaagttcaggggccatttcctgatcgagggggatctcaacccggacaatagcgatgttgacaagctgttcatccagctcgtgcagacgtacaaccagctcttcgaggagaaccccattaatgcgtcaggcgtcgacgcgaaggctatcctgtccgctaggctctcgaagtctcggcgcctcgagaacctgatcgcccagctgccgggcgagaagaagaacggcctgttcgggaatctcattgcgctcagcctggggctcacgcccaacttcaagtcgaatttcgatctcgctgaggacgccaagctgcagctctccaaggacacatacgacgatgacctggataacctcctggcccagatcggcgatcagtacgcggacctgttcctcgctgccaagaatctgtcggacgccatcctcctgtctgatattctcagggtgaacaccgagattacgaaggctccgctctcagcctccatgatcaagcgctacgacgagcaccatcaggatctgaccctcctgaaggcgctggtcaggcagcagctccccgagaagtacaaggagatcttcttcgatcagtcgaagaacggctacgctgggtacattgacggcggggcctctcaggaggagttctacaagttcatcaagccgattctggagaagatggacggcacggaggagctgctggtgaagctcaatcgcgaggacctcctgaggaagcagcggacattcgataacggcagcatcccacaccagattcatctcggggagctgcacgctatcctgaggaggcaggaggacttctaccctttcctcaaggataaccgcgagaagatcgagaagattctgactttcaggatcccgtactacgtcggcccactcgctaggggcaactcccgcttcgcttggatgacccgcaagtcagaggagacgatcacgccgtggaacttcgaggaggtggtcgacaagggcgctagcgctcagtcgttcatcgagaggatgacgaatttcgacaagaacctgccaaatgagaaggtgctccctaagcactcgctcctgtacgagtacttcacagtctacaacgagctgactaaggtgaagtatgtgaccgagggcatgaggaagccggctttcctgtctggggagcagaagaaggccatcgtggacctcctgttcaagaccaaccggaaggtcacggttaagcagctcaaggaggactacttcaagaagattgagtgcttcgattcggtcgagatctctggcgttgaggaccgcttcaacgcctccctggggacctaccacgatctcctgaagatcattaaggataaggacttcctggacaacgaggagaatgaggatatcctcgaggacattgtgctgacactcactctgttcgaggaccgggagatgatcgaggagcgcctgaagacttacgcccatctcttcgatgacaaggtcatgaagcagctcaagaggaggaggtacaccggctgggggaggctgagcaggaagctcatcaacggcattcgggacaagcagtccgggaagacgatcctcgacttcctgaagagcgatggcttcgcgaaccgcaatttcatgcagctgattcacgatgacagcctcacattcaaggaggatatccagaaggctcaggtgagcggccagggggactcgctgcacgagcatatcgcgaacctcgctggctcgccagctatcaagaaggggattctgcagaccgtgaaggttgtggacgagctggtgaaggtcatgggcaggcacaagcctgagaacatcgtcattgagatggcccgggagaatcagaccacgcagaagggccagaagaactcacgcgagaggatgaagaggatcgaggagggcattaaggagctggggtcccagatcctcaaggagcacccggtggagaacacgcagctgcagaatgagaagctctacctgtactacctccagaatggccgcgatatgtatgtggaccaggagctggatattaacaggctcagcgattacgacgtcgatcatatcgttccacagtcattcctgaaggatgactccattgacaacaaggtcctcaccaggtcggacaagaaccggggcaagtctgataatgttccttcagaggaggtcgttaagaagatgaagaactactggcgccagctcctgaatgccaagctgatcacgcagcggaagttcgataacctcacaaaggctgagaggggcgggctctctgagctggacaaggcgggcttcatcaagaggcagctggtcgagacacggcagatcactaagcacgttgcgcagattctcgactcacggatgaacactaagtacgatgagaatgacaagctgatc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相对于传统育种方法，本发明的方法有以下优点
①，育种周期短，整个材料定向创制过程耗时约7个月，而传统杂交-回交方法至少需要3～5年时间。
②，只改变了受体品种的一个基因，所获材料除颖壳颜色外其他农艺性状不变，而传统回交方法会导入与OsCHI连锁的其他基因，可能影响受体品种的农艺性状。
本发明采用特殊设计的重组载体，结合CRISPR/Cas9打靶技术，实现了高效地定向基因改良，实现颖壳颜色的改变。本发明特别适合用于9311水稻，也可以用于其它水稻品种。
附图说明
1、图1为通过PEG介导原生质体瞬时转化再生9311水稻株系中OsCHI基因定点突变测序检测的部分结果图，其中WT表示为野生型基因，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸数量；
2、图2为所创制褐壳9311水稻材料水稻种子的表型，A为供体品种9311材料，即用于颖壳颜色形状改良的品种，B为供体品种9311经定向改良后具有褐色颖壳的材料；
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
用于水稻OsCHI基因打靶的重组载体的制备。
1.1，选择水稻OsCHI基因(LOC_Os03g60509.1)中自翻译起始密码子ATG后第30-52位的核苷酸序列CGGCGTCGTGTTCCCGCCGGTGG，(下划线部分为所述5’-(N)X-NGG-3’结构中NGG部分)，作为打靶位点。
1.2，按所选择靶位点合成(华大基因公司)正向寡核苷酸链(OsCHIKO1P1)和可与之互补的反向寡核苷酸链(OsCHIKO1P2)，
具体序列为：
OsCHIKO1P1:TGTGCGGCGTCGTGTTCCCGCCGG；
OsCHIKO1P2:AAACCCGGCGGGAACACGACGCCG。
其中未被下划线标注的部分为上述靶位点中去除NGG的序列或互补序列，下划线部分为用于连接载体的粘性末端。
1.3,对OsCHIKO1P1和OsCHIKO1P2进行退火程序，将OsCHIKO1P1和OsCHIKO1P2两链退火形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。
1.4，用BsaI内切酶(NEB公司生产)在37℃酶切包含能够在水稻细胞内表达的向导RNA表达框(核苷酸序列如SeqIDNo.1所示)和能够在水稻细胞内表达的Cas9核酸酶表达框(核苷酸序列如SeqIDNo.2所示)的水稻CRISPR/Cas9基因工程载体。本发明仅仅是设计出了这样的载体，载体结构和构建方法按现有文献(Xuetal,GenetargetingusingtheAgrobacteriumtumefaciens-mediatedCRISPR-Cassysteminrice,RICE,2014)所示，使用BsaI内切酶酶切水稻CRISPR/Cas9基因工程载体2小时，65℃失活酶切体系10分钟，作为构建重组载体的骨架片段。
1.5，用T4连接酶(NEB公司生产)将重组载体骨架片段和插入片段相连，转入大肠杆菌中。经测序验证后，提取其阳性转化子，构成用于水稻OsCHI基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体质粒。
原生质体瞬时转化介导的水稻OsCHI基因打靶和褐壳材料获得。
2.1,利用PEG法将上面获得的用于水稻OsCHI基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体质粒转化至水稻杨稻6号(9311)原生质体，水稻原生质体转化具体过程参考了文献Zhang等人在“Ahighlyefficientricegreentissueprotoplastsystemfortransientgeneexpressionandstudyinglight/chloroplast-relatedprocesses.PlantMethod(2011).”中公开的实验方法。
2.2，利用步骤2.1中转化后的水稻原生质体，并获得再生水稻植株。水稻原生质体转化和植株再生具体过程参考了文献Hayashimoto等人在“APolyethyleneGlycol-MediatedProtoplastTransformationSystemforProductionofFertileTransgenicRicePlants.PlantPhysiology(1990).”中公开的实验方法。
2.3，利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化公司生产)，提取所获14棵再生植株的基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司生产)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为：
OsCHIKO1genomecheckFP:GCCCTTGGATTCAACTACCCCC
OsCHIKO1genomecheckRP:CCTCCTCCAGGTACACGCCGAT
2.4，以OsCHIKO1genomecheckFP为引物对所获PCR扩增片段直接测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，在所测14棵植株中，8棵植株带有OsCHI基因靶标序列上的突变，突变效率为57.1％；突变的形式包括碱基的插入和/或缺失。部分结果如图1所示(图1中第一行的阴影部分为目标靶位)；其中两个等位OsCHI基因都出现功能缺失突变的再生株系为3株，同时出现等位基因效率为21.4％。
2.5，观察两个等位OsCHI基因都出现功能缺失突变的再生株系的种子颜色，所有3株水稻的种子均表现为深褐色(如图2所示)，表明所述3株具有两个等位OsCHI基因都出现功能缺失突变的再生株系为所定向创制褐壳水稻材料。
相对于传统育种方法，本方法有以下优点
①，育种周期短，整个材料定向创制过程耗时约7个月，而传统杂交-回交方法至少需要3～5年时间。
②，只改变了受体品种的一个基因，所获材料除颖壳颜色外其他农艺性状不变，而传统回交方法会导入与OsCHI连锁的其他基因，可能影响受体品种的农艺性状。
虽然上面参照本发明的优选实现方式对具体实施例进行了描述，但是本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是作为示例，而并不对本发明的范围带来限制。
Claims (5)
1.一种定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)，在水稻颖壳颜色决定基因OsCHI外显子区选取靶标片段，所述靶标片段的一条链具有5’-(N)X-NGG-3’结构，其中(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1,N2……Nx}，N1,N2……Nx中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N为碱基A、G、C、T中的任意一个，其中，X为19或20；
2)，按照所述靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻OsCHI基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，所述重组载体包括具有所述靶标片段的向导RNA表达框，以及Cas9核酸酶表达框；
3)，将所述重组载体导入水稻细胞，诱导所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，剪切OsCHI基因的双链的所述靶标片段，触发水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内OsCHI基因的功能缺失突变；
4)，用导入所述重组载体的水稻细胞再生若干水稻植株；
5)，通过基因组PCR方法克隆再生植株中OsCHI基因包含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序；
6)，选择两个等位OsCHI基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型鉴定，以筛选出种子变为褐色的再生株系，
其中，所述向导RNA表达框能够在水稻细胞内表达，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；所述Cas9核酸酶表达框能够在水稻细胞内表达，其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述功能缺失突变为正常OsCHI编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述向导RNA表达框包括：水稻U6启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1至246位所示；结构特征为(N)X的靶标序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第267至350位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第351至358位所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Cas9核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.2第1至2031位所示；Cas9编码序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.2第6347至6599位所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述向导RNA表达框包括CRISPRRNA和sgRNA，所述CRISPRRNA的序列为所述靶标片段的5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X或与之互补的序列。
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