CN102153638A

CN102153638A - 控制水稻不定根伸长和叶片颜色基因OsCHR4及应用

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Publication number: CN102153638A
Application number: CN 201110071225
Authority: CN
Inventors: 吴平; 赵春芳; 毛传澡; 张帆; 王晓飞; 刘绍军
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-03-24
Filing date: 2011-03-24
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2031-03-24
Also published as: CN102153638B

Abstract

本发明公开了一种控制水稻不定根伸长和叶片颜色基因OsCHR4编码的蛋白质，其具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蛋白质的基因，其具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。本发明所述的基因能用于构建转基因水稻。本发明还同时公开了一种包含本发明所述基因的转基因植物细胞。

Description

控制水稻不定根伸长和叶片颜色基因OsCHR4及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种图位克隆技术克隆的水稻OsCHR4(chromatin remodeling 4)基因的CDS序列，该CDS编码的蛋白与人类皮肌炎自身抗原Mi-2同源，属于CHD蛋白家族。转基因功能恢复实验结果确证该基因同时控制不定根伸长和地上部叶肉细胞中叶绿体的形成。

背景技术

水稻属于须根系单子叶植物，主根不发达，早期即停止生长或枯萎，后期生长发育所需要的水分和养分都是靠不断生长的不定根吸收的。不定根(主要指禾本科作物)是胚后发生的器官，水稻节位产生的大量不定根组成了水稻地下部的主要部分。不定根的发育过程可以划分为不定根原基的起始和不定根的伸长(Hochholdinger and Zimmermann，2008)，每个阶段发育受阻都会造成不定根生长发育异常。

大多数双子叶植物的叶片具有栅栏组织和海绵组织的分化，即具有背腹性，被称为两面叶。而禾本科植物的叶肉组织是单一形态的，没有背腹性，这种叶被称为等面叶。近年来植物叶片发育极性方面的研究取得了很大进展，但是主要集中在双子叶模式植物拟南芥的相关突变体展开的(Xu et al.，2003)，而以水稻为模式植物的禾本科植物的叶肉细胞极性发育机制的研究还很少，水稻叶色突变体的研究为探索单子叶植物的叶绿体发育机制和叶肉细胞的极性发育奠定了良好基础。

“染色质重塑”普遍地被用来描述蛋白质-DNA之间相互作用和结构的改变，基因转录也正是通过改变DNA的包装结构、实现调控元件与DNA的可接近性而被调节。Mi-2最早是从皮肌炎患者血清中分离得到的一种自身抗原，体现了皮肌炎患者的一种自身免疫现象(Seelig et al.，1995)。Mi-2属于高度保守的CHD(Chromodomain helicase DNA-binding)蛋白亚家族，该家族含有两个PHD锌指基序；两个chromo结构域，是染色质识别修饰的结构域；一个隶属于SWI2/SNF2家族的ATPase/helicase功能域和一个DNA结合结构域(Seelig et al.，1995；Woodage et al.，1997)，该家族蛋白是一个ATP依赖的染色质调控因子，介导蛋白质与DNA或者蛋白与蛋白之间的相互作用(Brehm et al.，2004)。该家族蛋白在生物进化过程中是非常保守的，Mi-2-like蛋白已经在脊椎动物、果蝇、线虫、酵母和拟南芥中报道了(Delmas et al.，1993；Woodge et al.，1997；Kehle et al.，1998；Eshed et al.，1999；Zelewsky et al.，2000)。另外，Mi-2蛋白是ATP依赖的核小体重塑和组蛋白去乙酰基化复合体NuRD(ATP-dependent Nucleosome Remodeling and histone Deacetylase complex)的一个核心成分，该复合体与组蛋白的去乙酰基化以及基因转录沉默之间可能有联系(Wade et al.，1999)。关于水稻Mi-2like基因还未见报道，该基因突变产生的水稻突变体表型和控制植株发育的机制也是未知的。

参考文献如下：

1、Brehm，A.，Tufteland，K.R.，Aasland，R.and Becker，P.B.(2004).The many colours ofchromodomains.Bioessays，26：133-140(Brehm，A.，Tufteland，K.R.，Aasland，R.and Becker，P.B.(2004).chromo功能域的多种角色.生物学评论，26：133-140)。

2、Delmas，V.，Stokes，D.G.and Perry，R.P.(1993).A mammalian DNA-binding protein that contains a chromodomain and an SNF2/SWI2-like helicase domain.Proceeding of the National Academy of Sciences，90：2414-2418(Delmas，V.，Stokes，D.G.and Perry，R.P.(1993).一种含有chromo功能域和SNF2/SWI2-like解旋酶功能域的哺乳动物DNA结合蛋白.美国科学院院刊，90：2414-2418)。

3、Eshed，Y.，Baum，S.F.and Bowman，J.L.(1999).Distinct mechanisms promote polarity establishment in carpels of Arabidopsis.Cell，15：199-209(Eshed，Y.，Baum，S.F.and Bowman，J.L.(1999).截然不同的机制促进拟南芥心皮的极性建立.细胞，15：199-209)。

4、Hiei，Y.，Ohta，S.，Komari，T.and Kumashiro，T.(1994).Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal，6：271-282(Hiei，Y.，Ohta，S.，Komari，T.and Kumashiro，T.(1994).农杆菌介导的水稻有效转化和T-DNA边界的序列分析.植物学杂志，6：271-282)。

5、Hochholdinger，F.and Zimmermann，R.(2008).Conserved and diverse mechanisms in root development.Current Opinion in Plant Biology，11：70-74(Hochholdinger，F.and Zimmermann，R.(2008).根发育中保守的且多样化的机制.植物生物学当前观点，11：70-74)。

6、Kehle，J.，Beuchle，D.，Treuheit，S.，Christen，B.，Kennison，J.A.，Bienz，M.and Müller，J.(1998).dMi-2，a Hunchback-Interacting Protein That Functions in Polycomb Repression.Science，282(5395)：1897-1900(Kehle，J.，Beuchle，D.，Treuheit，S.，Christen，B.，Kennison，J.A.，Bienz，M.and Müller，J.(1998).dMi-2，一个Hunchback相互作用蛋白，具有阻遏Polycomb的功能.科学，282(5395)：1897-1900)。

7、Seelig，H.P.，Moosbrugger，I.，Ehrfeld，H.，Fink，T.，Renz，M.and Genth，E.(1995).The major dermatomyositis-specific Mi-2 autoantigen is a presumed helicase involved in transcriptional activation.Arthritis & Rheumatism，38：1389-1399(Seelig，H.P.，Moosbrugger，I.，Ehrfeld，H.，Fink，T.，Renz，M.and Genth，E.(1995).皮肌炎特异的Mi-2自身抗原是一种参与转录激活的假定的解旋酶，38：1389-1399)。

8、Wade，P.A.，Gegonne，A.，Jones，P.L.，Ballestar，E.，Aubry，F.and Wolffe，A.P.(1999).Mi-2 complex couples DNA methylation to chromatin remodelling and histone deacetylation.Nature Genetics，23：62-66(Wade，P.A.，Gegonne，A.，Jones，P.L.，Ballestar，E.，Aubry，F.and Wolffe，A.P.(1999).Mi-2复合物将DNA甲基化与染色质重塑和组蛋白去乙酰基化连接起来.自然遗传，23：62-66)。

9、Woodage，T.，Basrai，M.A.，Baxevanis，A.D.，Hieter，P.and Collins，F.S.(1997).Characterization of the CHD family of proteins.Proceeding of the National Academy of Sciences，94：11472-11477(Woodage，T.，Basrai，M.A.，Baxevanis，A.D.，Hieter，P.and Collins，F.S.(1997).CHD家族蛋白的描述.美国科学院院刊，94：11472-11477)。

10、Xu，L.，Xu，Y.，Dong，A.，Sun，Y.，Pi，L.，Xu，Y.and Huang，H.(2003).Novel as 1 and as 2defects in leaf adaxial-abaxial polarity reveal the requirement for ASYMMETRIC LEAVES1 and 2and ERECTA functions in specifying leaf adaxial identity.Development，130：4097-4107(Xu，L.，Xu，Y.，Dong，A.，Sun，Y.，Pi，L.，Xu，Y.and Huang，H.(2003).新突变体as1和as2缺失叶的近轴面-离轴面极性，揭示了ASYMMETRIC LEAVES1、2和ERECTA对于叶的近轴面形态建成是必要的.发育，130：4097-4107)。

11、Zelewsky，T.，Palladino，F.，Brunschwig，K.，Tobler，H.，Haj nal，A.and Müller，F.(2000).The C.elegans Mi-2 chromatin-remodelling proteins function in vulval cell fate determination.Development，127：5277-5284(Zelewsky，T.，Palladino，F.，Brunschwig，K.，Tobler，H.，Hajnal，A.and Müller，F，(2000).线虫的Mi-2染色质重塑蛋白在外阴细胞命运决定中起功能.发育，127：5277-5284)。

12、Yoshida S.，Fomo D.A.，Cock J.H.and Gomez K.A.(1976).Laboratory Manual for Physiological Studies of Rice，Ed 3.The International Rice Research Institute：The Philippines.(Yoshida S.，Fomo D.A.，Cock J.H.and Gomez K.A.(1976).水稻生理研究实验手册，第三版.国际水稻研究所)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种同时控制水稻不定根伸长和叶绿体形成的新基因OsCHR4，如SEQ ID NO：1所示的CDS序列，也包括与SEQ ID NO：1所示的CDS序列至少有80％同源性的基因序列。本发明中的SEQ IDNO：2所示的蛋白质属于CHD家族，包括其中进行一个或几个氨基酸替换、插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID NO：1中取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种控制水稻不定根伸长和叶片颜色基因OsCHR4编码的蛋白质，其特征在于：其具有SEQ ID NO：2(即序列表中的序列2)所示的氨基酸序列。

作为本发明的蛋白质的改进：氨基酸序列还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。

本发明还同时提供编码上述蛋白质的基因，其具有SEQ ID NO：1(即序列表中的序列1)所示的核苷酸序列。

作为本发明的基因的改进：核苷酸序列还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

本发明还同时提供了上述基因的用途：用于构建转基因水稻。

本发明还同时提供了一种转基因植物细胞，为包含本发明所述基因的转基因植物细胞。

本发明的另一个目的是提供一种用OsCHR4基因进行高效的植物转化方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID NO：1所示的序列片段的载体。

本发明的具体实施内容如下：

从本实验室发展的EMS(ethyl methylsulfonate)诱变的粳稻(Oryza Sativa L.ssp japonica)地方品种SSBM突变体库中筛选到一个水稻不定根伸长受抑和叶片上表面白化的突变体Oschr4(命名参照克隆到的突变基因的注释信息，图1A)，不定根长度和叶绿素含量测定结果显示在突变体中都有明显降低(图1B)。叶片的组织学观察和透射电镜分析，发现突变体叶肉上表面细胞中的叶绿体不能正常发育(图1C，D)，这就是叶片上表面白化的原因。在植株生长后期，突变体叶片发生明显的向上卷曲，不定根发育受阻和分蘖数显著减少(图1E)。

本发明采用图位克隆方法获得了突变体表型控制基因OsCHR4。首先创建了一个F₂定位群体，由纯合突变体为母本，籼稻野生型Kasalath为父本杂交获得F₁杂合体，以F₁自交后代F₂中突变体性状的个体作为基因的定位群体。通过对遗传群体分析(F₂中野生型和突变体表型的个体比例约为3∶1)，确定该突变体是一个符合单基因控制的孟德尔遗传规律的隐性突变体。首先，利用实验室通用的SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记进行粗定位，将突变基因定位在第七条染色体长臂上RM1135和RM3404两个标记之间(图2A)。然后对这两个标记之间的BAC序列分析比较，发展新的STS(Sequence Tagged Site)标记将突变基因精细定位于OJ1457_D07和OJ1197_D06上STS3和STS5分子标记之间，即STS4分子标记附近。该区间的物理距离为21kb，根据水稻基因注释信息，该区间包含3个基因。序列分析表明突变体表型是由于LOC_07g31450基因座上一个T碱基缺失造成的，这个缺失突变导致终止密码子前移，产生无功能的蛋白质产物。该基因编码一个染色质重塑因子4(CHROMATINREMODELING 4)，MI-2LIKE蛋白，由此将基因命名为OsCHR4，将突变体命名为Oschr4。通过对该基因cDNA序列(SEQ ID NO：1)和基因组序列比对确定了该基因结构(图2B)，并将T碱基的缺失定位于该基因最后一个外显子上。并且利用pfam网站(http://pfam.sanger.ac.uk)，分析了OsCHR4蛋白(SEQ IDNO：2)的保守结构域(图2B)。

为了确证突变体表型是由OsCHR4基因突变引起的。我们对突变体进行了转基因恢复验证。将由OsCHR4基因自身启动子驱动的完整的CDS序列(SEQ ID NO：1)克隆到双元植物转基因载体pCAMBIA1300-sGFP的多克隆位点BamHI位点，得到P_OsCHR4::OsCHR4::sGFP恢复载体。将构建好的恢复载体通过农杆菌介导的遗传转化系统转化突变体愈伤，经过抗性愈伤诱导进而分化成转基因苗。转化了外源OsCHR4基因的突变体(即转基因阳性株系)的不定根长度恢复到野生型，叶片上表面颜色复绿。图3为两个T₁转基因恢复株系结合野生型和突变体的表型(图3A-C)和相应的生物学统计结果(图3D-E)，叶绿素的含量和不定根的长度都能恢复到野生型的水平。转基因恢复试验确证了突变体表型是由OsCHR4基因突变引起的，表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻。

为了观察OsCHR4蛋白(SEQ ID NO：2)的亚细胞定位功能，将OsCHR4基因的CDS序列(SEQ ID NO：1)构建到35S::sGFP表达载体内，得到35S::OsCHR4::sGFP融合表达载体。用洋葱的瞬时表达系统观察OsCHR4(SEQ ID NO：2)的蛋白表达。首先，提取融合表达载体35S::OsCHR4::sGFP及无基因融合空载体35S::sGFP的质粒，用金粉分别包裹后，基因枪轰击至洋葱表皮细胞。暗环境下培养16小时后，激光共聚焦显微镜下观察。结果表明，无基因融合的对照载体35S::sGFP的绿色荧光均匀地表达于整个洋葱表皮细胞，而35S::OsCHR4::sGFP融合蛋白则特异性地分布于细胞核内(图4)。进一步，对转基因恢复水稻中GFP荧光信号进行了检测，结果也表明OsCHR4(SEQ ID NO：2)是一种核定位蛋白(图5)。

这些结果表明，我们克隆的水稻OsCHR4基因具有一定的应用价值。我们可以通过利用该基因对作物品种进行转基因改造，获得外源基因能正确表达的转基因恢复植株。同时也表明通过基因工程手段，该基因具有改良叶色及根发生能力的潜力。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明，但并非对发明作限定。

图1是水稻不定根伸长缺陷和叶色白化突变体Oschr4的表型图；

A为水稻营养液培养8天的植株表型，左边为野生型(SSBM)，右边为突变体(Oschr4)，bar＝2cm；B为SSBM和Oschr4的不定根长度和叶绿素含量测定结果；C为叶片组织学观察结果，bar＝100μm，左边为SSBM的叶片，右边为Oschr4的叶片；D为叶绿体的超微结构，左边为SSBM的叶绿体，中间为Oschr4上表面的叶绿体，右面为Oschr4下表面的叶绿体，bar＝0.5μm；E为SSBM(左边)和Oschr4(右边)植株生长后期表型，突变体Oschr4表现为叶片卷曲、不定根伸长受阻、分蘖数减少，bar＝6cm。

图2是OsCHR4基因在水稻第七条染色体上的图位克隆和基因结构图；

A为OsCHR4基因的定位图；B为OsCHR4基因结构和OsCHR4蛋白结构图。

图3是转基因恢复株系的表型图；

A为SSBM(左一)、Oschr4(左二)和两个转基因恢复株系(左三和左四)在水稻营养液中培养8天的植株表型，bar＝2cm；B和C分别为叶片上表面和叶片下表面表型，叶片顺序排列从左到右为SSBM、Oschr4和两个转基因恢复株系；D和E分别为它们的不定根长度和叶绿素含量测定结果。

图4是35S::OsCHR4::sGFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中瞬时表达结果图；上行为35S::sGFP空载体的定位结果，下行为35S::OsCHR4::sGFP融合载体的定位结果；左边为白光图，中间为GFP荧光图，右边为前二者的融合图。

图5是在T₁转基因恢复植株根部和叶片中的GFP荧光检测结果图；左列为PI染色或者叶绿体自发荧光；中间列为GFP的检测信号；右列为前两者的融合。在转基因植株中OsCHR4表现为细胞核定位，根部图片中bar＝100μm，叶片图片中bar＝50μm。

图6是转基因恢复载体pCAMBIA1300-sGFP的结构示意图。

图7是亚细胞定位载体35S::sGFP的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1、突变体筛选和表型：

以EMS诱变的水稻地方品种SSBM突变体库为突变体筛选对象，M₂种子(诱变处理前为M₀，处理后为M₁，M₂种子为M₁的自交后代)用蒸馏水冲洗干净，0.67％稀HNO₃(质量浓度)破休眠处理18小时，37℃暗处催芽至露白。将露白的种子播于水稻培养液(培养液配方为国际水稻所的标准配方，具体参考Yoshida et al.，1976)上浮着的尼龙网纱上面，在温度为30/22℃(昼/夜)左右、光照12小时条件下培养8天，以不定根构型(包括长度、数量等)的改变为筛选标准进行突变体的筛选，从中筛选到一个不定根缩短的突变体，并且该突变体叶片上表面发生白化而下表面表现正常(图1A)。该突变体不定根长度和叶片叶绿素含量显著降低(图1B)。该突变体的地上部的株高及根部的主根长度、侧根长度和数量与野生型SSBM之间都没有显著性差异(图1A)。为了进一步明确突变体叶片上表面白化的原因，对叶片进行组织学分析，发现突变体上表面2-3层叶肉细胞不能被0.1％的亚甲基蓝染料着色(图1C)；通过叶绿体超微结构观察，发现突变体上表面叶绿体不能进行正常发育，而叶片下表面的叶绿体结构表现是正常的(图1D)。在成熟期阶段，突变体表现出分蘖数和不定根数目显著减少以及叶片内卷特征(图1E)。

上述筛选到的突变体命名为Oschr4。

实施例2、基因定位

F₂定位群体来自于纯合突变体(Oschr4)和籼稻品种Kasalath杂交后代，由杂合子F₁自交获得，共筛选出2850个具有突变表型的F₂个体(其突变表型具体为叶片上表面白化且不定根短小)，从水稻叶片中提取基因组DNA。取大约0.1g水稻幼嫩叶片于1.5ml的离心管中用组织磨样器将叶片打成粉末，提取总DNA，获得的DNA溶解于200μl无菌水中作为DNA样品，每个PCR反应用0.5μl DNA样品作为模板。

在OsCHR4基因的粗定位试验中，用30个具有突变表型的F₂个体进行分析。根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的146个SSR引物，SSR引物来源于Gramene(http://www.gramene.org/)网站提供的已经公知的标记，用到的各染色体上的SSR引物名称如下：

水稻1号染色体(17个)

RM1282，RM1167，RM272，RM243，RM600，RM3412，RM8115，RM329，RM5638，RM6716，RM1349，RM1297，RM3411，RM6547，RM1198，RM165，RM6141

水稻2号染色体(12个)

RM6938，RM279，RM6378，RM174，RM5699，RM1358，RM7426，RM341，RM3688，RM6，RM425，RM5607

水稻3号染色体(13个)

RM523，RM6038，RM1022，RM157A，RM5551，RM1164，RM6881，RM6266，RM347，RM1350，RM5813，RM143，RM148

水稻4号染色体(13个)

RM25054，RM3471，RM2416，RM16604，RM5688，RM1100，RM1359，RM6997，RM3866，RM2441，RM348，RM567，RM3648

水稻5号染色体(9个)

RM3334，RM267，RM3193，RM3381，RM6645，RM1237，RM3573，RM334，RM3170水稻6号染色体(14个)

RM170，RM190，RM584，RM276，RM50，RM3183，RM6536，RM3，RM3187，RM5371，RM7434，RM6458，RM5307，RM5814

水稻7号染色体(13个)

RM5344，RM82，RM125，RM1186，RM3755，RM1135，RM3404，RM346，RM3826，RM7564，RM3589，RM1209，RM3555

水稻8号染色体(12个)

RM1235，RM8018，RM1376，RM310，RM6429，RM3395，RM325A，RM8264，RM556，RM334，RM3120，RM3754

水稻9号染色体(10个)

RM5688，RM2855，RM444，RM7390，RM105，RM409，RM3700，RM257，RM328，RM6174

水稻10号染色体(9个)

RM474，RM7545，RM25185，RM3311，RM25369，RM271，RM1108，RM5666，RM228

水稻11号染色体(13个)

RM286，RM7557，RM1124，RM552，RM3701，RM4862，RM3428，RM6272，RM254，RM144，RM5349，RM4601，RM2191

水稻12号染色体(11个)

RM628，RM3455，RM83，12-9528k，RM7102，RM1261，RM101，RM1246，RM1103，RM3739，RM1296

然后按照引物要求的反应条件进行PCR扩增(反应体系如下)。通过6％的聚丙烯酰胺凝胶(凝胶配置方法如下)电泳分离，通过检测条带的多态性，将基因粗定位到水稻第七条染色体上的分子标记RM1135和RM3404之间。

PCR反应体系：

聚丙烯酰胺凝胶(6％)配方

注：40％Arc-Bis(丙烯酰胺38g和亚甲基双丙烯酰胺2g溶于100ml水所得)聚丙烯酰胺凝胶显色液配方

注：甲醛是临用前现加，其他三个按相应量提前配好。

然后我们扩大F₂个体到200个，继续缩小定位区间至分子标记STS1和STS2(设计的引物序列如下)之间。最后将F₂定位群体扩大到2850个进行精细定位，根据网上公布的Nipponbare BAC末端序列，再设计3个分子标记，分别命名为STS3，STS4，STS5(引物序列如下)。利用这三个分子标记对2850个F₂个体进行连锁分析，将目的基因卡定在STS3和STS5分子标记之间，STS4分子标记附近21kb范围之内。

这5个STS分子标记的引物序列(包括上下游)为：

STS1U-5’GTTCCCATCATTCTAATATGCT 3’；STS1L-5’CGTTCCCACAGGTCTCAAC 3’

STS2U-5’ACGGTGACTCAAACAGCAT 3’；STS2L-5’TGGAGAGGCATAAATGTGCTAT 3’

STS3U-5’CGTGAAAGAGGAATTCATAT 3’；STS3L-5’GGACAGGCTCTATGCTTAGT 3’

STS4U-5’GCTTAAAGCTTCATTAGGA 3’；STS4L-5’GCTTAAAGCTTCATTAGGA 3’

STS5U-5’ATAGAGTTCTCCTGAGTATT 3’；STS5L-5’CTGAAAAATGACTATGTTAG 3’

实施例3、基因预测和序列分析

根据精细定位结果，OsCHR4基因位于BAC克隆OJ1457_D07和OJ1197_D06上STS4分子标记附近21kb范围之内(图2A)。根据TIGR(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)的水稻基因注释信息和EST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，对此染色体区段内的3个基因进行测序分析。这3个基因分别是Os07g31430(phosphate-induced protein 1)；Os07g31440(expressed protein)；Os07g31450(CHR4/MI-2-LIKE)。对这3个候选基因在野生型(SSBM)和突变体(Oschr4)的cDNA模板下进行扩增，经过测序和序列比对分析，发现Os07g31450基因在突变体中的CDS序列(SEQ ID NO：1)起始密码子ATG后5473bp处缺失一个碱基T，导致终止密码子前移，产生无功能的蛋白质。然后通过该基因的cDNA序列(SEQ ID NO：1)和基因组序列比对分析确定了基因结构，利用OsCHR4的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，得到其保守结构域(图2B)。

实施例4、OsCHR4遗传恢复载体的构建

由于OsCHR4基因组序列较大，启动子和OsCHR4基因组融合的PCR扩增很困难，因此构建恢复载体时，选择使用OsCHR4基因的启动子接其全长CDS序列(SEQ ID NO：1)。首先分别构建OsCHR4基因启动子的克隆和OsCHR4基因全长CDS的克隆，测序后确定序列正确的克隆，然后用PrimeSTAR高保真酶(TaKaRa生物公司)和以扩增启动子的上游引物Pro-F(引物序列如下，带恢复载体上的酶切位点BamHI和保护碱基)、以扩增OsCHR4基因全长CDS的下游引物CDS-R(引物序列如下，带恢复载体上的酶切位点BamHI和保护碱基)作为引物对进行两片段融合PCR扩增，PCR反应体系和扩增条件如下。融合片段经过限制性酶切后与同样经过BamHI酶切过的pCAMBIA1300-sGFP载体(终载体)连接，得到恢复载体P_OsCHR4::OsCHR4::sGFP。

PCR反应体系：

PCR条件是：96℃预变性2min后，进入循环反应即98℃10sec，68℃10min，循环数为25，再延伸10min。

根据TIGR注释的OsCHR4信息，从起始密码子ATG前面延伸3096bp的序列的两端设计引物，上游引物加BamHI的酶切位点(方框斜体标示)，因为要与OsCHR4基因全长CDS作两片段融合，故下游引物不加酶切位点。以野生型(SSBM)的基因组为模板，用PrimeSTAR高保真酶扩增出OsCHR4基因的启动子序列。启动子扩增的引物序列为：

Pro-F：5’CCC

TTAAAGAGGCAAACCCTGGATAACTAATTAT 3’，

Pro-R：5’TAGAGTATCAACGTCACATGCTGCTAG3’。

PCR反应体系同上；PCR条件是96℃预变性2min后，进入循环反应即98℃10sec，55℃5sec，72℃3min，循环数为30，再延伸10min。

根据OsCHR4基因的全长CDS序列(SEQ ID NO：1)两端设计分别含KpnI和BamHI酶切识别位点(方框斜体标示)的引物，其中上游引物在ATG前80bp处设计，以便与启动子进行两片段融合；下游引物序列上去掉了终止密码子TAG，酶切位点前加了T碱基(斜体双下划线标示)，防止后面连接的GFP基因发生移码突变，用PrimeSTAR高保真酶扩增出OsCHR4基因的CDS序列(SEQ ID NO：1)。用于扩增的引物序列为：

CDS-F：5’AAA

GGTTGCCTATTTTCCGATTTTGAACT3’；

CDS-R：5’AAA

ATGCTCATCTGTGATCATCTCGTCCACCTTAT 3’

PCR反应体系同上；PCR条件是：96℃预变性2min后，进入循环反应即98℃10s，68℃7min，循环数为30，再延伸10min。

上述两个扩增片段(启动子片段和CDS片段)分别与pUCm-T连接，连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。分别测序确定序列正确后，用相应的限制性内切酶切下两片段，混合后作为模板，以启动子片段的上游引物和CDS片段的下游引物作为引物对进行PCR扩增，扩增体系和扩增条件与实施例4第一段“两片段融合PCR扩增”等同。由于两片段之间有80bp的交叠区，在进行PCR扩增时能把两片段融合。将PCR扩增后的融合片段用BamHI单酶切且完全酶切，琼脂糖电泳后凝胶回收目的片段(约10kb)；同时对pCAMBIA1300-sGFP载体进行BamHI单酶切且完全酶切和载体去磷酸化。然后将目的片段和载体片段连接，热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，抽质粒酶切检测正反向，测序插入片段末端与sGFP基因的连接处序列，序列正确者即为构建好的恢复载体P_OsCHR4::OsCHR4::sGFP。

实施例5、OsCHR4转基因Oschr4突变体后的恢复植株的获得

将测序正确的恢复载体P_OsCHR4::OsCHR4::sGFP通过农杆菌株系EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到纯合突变体Oschr4愈伤中，经过侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、转基因苗分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。转基因阳性植株完全恢复突变体表型到野生型(图3)。该结果证明了OsCHR4基因确实具备“控制水稻不定根伸长和叶片颜色”的功能，并且获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻。

农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994)报道的方法基础上进行优化。

实施例6、OsCHR4蛋白(SEQ ID NO：2)的核定位实验

根据OsCHR4的全长CDS序列(SEQ ID NO：1)设计两端分别含Kpn I和Xba I酶切识别位点(小写斜体)的引物，引物序列为：

OsCHR4::sGFP-F：5’-AAA

ATGATGAAGGAGCGGAGCTCTTTATG-3’

OsCHR4::sGFP-R：5’-ACAATGCTCATCTGTGATCATCTCGTCCACCTTAT-3’

以野生型(SSBM)cDNA为模板，用PrimeSTAR高保真酶扩增出OsCHR4基因的CDS序列(SEQ ID NO：1)，扩增体系和扩增条件与实施例4第3段“扩增OsCHR4基因的CDS序列”等同。扩增产物OsCHR4基因的CDS序列连入pUCm-T，测序验证序列正确后，再用XbaI，Kpn1将OsCHR4基因的CDS切下，进行割胶回收；同时35S::sGFP载体用XbaI，KpnI切开，割胶回收，与OsCHR4基因的CDS连接，得到融合表达载体35S::OsCHR4::sGFP。

提取构建好融合表达载体35S::OsCHR4::sGFP的质粒及无基因融合的35S::sGFP对照质粒分别用金粉包裹，用Bio-rad公司的PDS-1000/He型基因枪在1100psi的氦压下轰击洋葱表皮。轰击后的洋葱表皮至于高渗培养基中暗培养16小时，然后置于荧光显微镜观察，OsCHR4::sGFP融合蛋白定位在细胞核内，而空载体GFP在整个细胞表达(图4)。另外，对恢复转基因植株(由实施案例5中得到)中的GFP信号进行检测，结果表明P_OsCHR4::OsCHR4::sGFP在根部和叶片均有表达，定位在细胞核内(图5)。该结果证明了OsCHR4蛋白(SEQ ID NO：2)的功能，它是一个核定位蛋白。

pCAMBIA1300-sGFP和35S::sGFP均为本实验室的改造载体，载体pCAMBIA1300-sGFP是以pCAMBIA-1300载体为基本骨架，在多克隆位点插入sGFP的编码序列和Nos终止子而得到的无启动子的表达载体(图6)。载体35S::sGFP是以pCAMBIA-1300载体为基本骨架，在多克隆位点的SacI和SalI处引入35S-MCS-sGFP-NOS表达盒所构建的sGFP表达载体(图7)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江大学

<120> 控制水稻不定根伸长和叶片颜色基因OsCHR4及应用

<160> 2

<210> 1

<211> 6780

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

atgatgaagg agcggagctc tttatgtgaa agtgcggcag atggaagttg ggttttgaaa 60

tacaaaagga aacggagcaa gctaacagtt agtccatcaa gtgagcatga tgcttcctca 120

ccaatactgg attctcaaat gaacaatggc tccatcaaaa agaagatcaa acatgacact 180

aacatttctc catcaaccaa gaagataaga ggacatgacg ggtacttcta cgagtgtgta 240

gaatgtgatc tcggtggcaa tttgctgtgc tgtgatagct gtccacgaac ataccacttg 300

gaatgtctta atcctcctct caagcgtgca ccacctggaa attggcaatg cccaagatgt 360

cgtacaaaaa aagttagctt gaagctctta gacaatgctg atgctgacac ctctaaacgt 420

gaaagaacaa ggagaatgcg cacaagcacc acatcagata gcccatcccc atctccacaa 480

aacaaagcct cttttaacac atcacgtggt gctgcattta gggatgatga accaggtgca 540

aaagacaatg aagttgagaa aaggaaacca ttgatattac atttgaagaa gcgttcaacc 600

aaggaactat ctacagatac cacatcatca aagtcagggt tacttggaaa gtcttcagaa 660

gagaaacagg agaaacacgg aagtgctttg aaagtgaaga aacatctgca tcccatggaa 720

ttatctccaa agaaatataa gaacaagaag caacacaatc acagagacag taagagatcc 780

gaagcaaaaa aggtccaata tttggcatca gatgtggaca gtgattcttc aatggaacca 840

tctacttctc ttgagcacag cgaatcgccg cccccaaaaa gaaaatcgtt ggatggaaga 900

acacctgcat caagtaccaa gaaaggaaaa aagaaagtga aatttgttga taaaaagcac 960

cctgagaatg ctgttcatat aactgaaaag gagcatggtg gtgcaggaga caaaataaca 1020

actcaggggg atctgcaggt tgatcgcatc ctaggctgtc gacttcagac aagccaaatc 1080

atttcacctg cccatgcttc atcagagcag attgatatgg cccctcctag tgcatccggt 1140

gcaccagaac ctagtcaagc ccttttaaaa ggacttcatg aagaaattca gtcttctaat 1200

agtgatacta atgtgacaga ggatgcatgt gctgatgaat tagcaaacga tggtggggaa 1260

aataatttgg attgttctga tgctcaaaag gagagtaatg ttagatccca tggacacaag 1320

gaatcactta acgcaaaaga aatcatgaat acagcatcag catgttccgc tgatcaaatc 1380

gtcactgtta aggatgctgg agcagtacag acatatgtaa cagcttcagt aaatggtgaa 1440

tatgagacag taactgatat tccagaagaa aagaatgaca ccaaacatcc agtttccaaa 1500

gctgacacag aagtccacac taaacaagaa catacacctg atagtaaatt gcatgggaaa 1560

atacaagaaa ctgaattgaa ggagcacgac ggaactactt atgagttttt agttaaatgg 1620

gttggcaaat cgaatatcca taacagctgg atttctgaat ctgagctgaa agcattagca 1680

aaaaggaaac tagaaaacta caaagcaaag tacggaacag gtttgataaa catctgcaaa 1740

gaacaatggt gccaaccgca acgagttatt gctctgcgca cttctttaga tgaaatagaa 1800

gaggctttga tcaaatggtg tgcccttcca tatgacgaat gcacgtggga aagattagat 1860

gaacctacaa tggtgaagta tgcacatttg gtcactcagt tcaaaaaatt tgaatcccag 1920

gctttggata aggataaggg aggtagccat gcaaagccaa gggaacacca agagtttaat 1980

atgctggttg agcagccaaa agaactccag ggaggcatgc tcttccctca tcaactggaa 2040

gcattgaact ggctacgcaa atgctggtac aagtcaaaaa atgttatcct tgctgatgag 2100

atgggtcttg gaaagactgt gtctgcctgt gcttttctat catccctatg ttgtgaatat 2160

aagattaact tgccatgtct tgtcttggtt cctctttcta ctatgcccaa ctggatggct 2220

gaatttgcat catgggcacc tcatttaaat gttgtggagt atcatggttc tgcacgggca 2280

agatctatta ttcgtcaata tgagtggcat gagggtgatg caagccagat gggtaaaatc 2340

aagaaatctc ataagttcaa tgtattgctc actacttatg aaatggtgct tgttgatgct 2400

gcatatcttc ggtctgtgtc atgggaggtt cttatagtcg atgagggtca tcgtctgaag 2460

aattctagca gcaaactttt cagtttactc aatacattat catttcagca tagagttttg 2520

ctgactggaa ctccgttaca gaataacatt ggtgaaatgt ataacttatt gaacttctta 2580

caacctgctt ctttcccttc tctagcttca tttgaggaga aattcaatga ccttacaaca 2640

acagagaaag tggaggagct gaagaacctt gtagctccac atatgcttcg aagactgaaa 2700

aaggatgcaa tgcaaaatat ccctccaaag actgaacgaa tggtgcctgt tgaattgaca 2760

tcaatccagg ctgaatacta ccgtgctatg cttacaaaga actaccaagt attgcgcaat 2820

attgggaaag gtggtgctca ccagtcattg ttgaacatag taatgcaact tcggaaagtc 2880

tgcaatcatc cgtatcttat tcctggaact gaacctgaat caggatcacc agagttcttg 2940

catgaaatgc gaataaaggc ctcagcaaag ttaactttgt tgcactctat gcttaaaatc 3000

ctacacaagg atggtcatcg agttcttatt ttttctcaga tgacaaagct tcttgacatc 3060

cttgaagatt acctgacttg ggagtttggt ccgaaaacat ttgaaagagt ggatggttca 3120

gtatctgtgg cagaacgcca ggcagcaatt gctcgtttta atcaggacaa gagtcgtttt 3180

gtattcctgc tatctacgcg gtcatgtggg cttggaatta atttggcaac tgcagatact 3240

gttatcatat atgattctga tttcaatcca catgctgata tacaggcaat gaacagagca 3300

cacagaattg gacagtcaaa cagactttta gtttacaggc ttgtcgtgcg tgctagtgtt 3360

gaggagcgta tcttgcacct tgcgaagaaa aaattgatgc ttgatcaact ttttgttaac 3420

aaatcagaat cacagaagga agtggaagat atcattcgct ggggaacaga ggaactcttc 3480

aggaatagcg atgttgcagt taaagataat aatgaagctt ctggtgctaa aaatgatgta 3540

gcagaggttg agtttaagca taaaagaaaa actggtggac taggcgatgt ttatgaagac 3600

agatgtgctg atggttctgc taaatttatt tgggatgaaa atgctatcac aaagcttctt 3660

gacagatcca acgttccatc aacagtagct gaaagcactg atggggactt ggacaatgat 3720

atgcttggca ctgtaaagtc aatagattgg aacgatgagc tgaatgatga ccctggtgcc 3780

accgaggaca tcccaaatat tgataatgat ggttgcgagc aggcatctga agcaaagcag 3840

gatgcagcta atcgtgttga agaaaatgaa tgggataaac tcttacgtgt cagatgggag 3900

cagtatcaaa ctgaggagga agcatctctt ggtcgaggta agcgtttaag gaaggctgtt 3960

tcttacaggg aaacatttgc aaccattcct aatgaagctt taagcgagga ctctgatgag 4020

gaggatgaac caaagcgaga atacactgca gctggactgg ctttgaagga aaaatatgaa 4080

aaactccgag ctagacaaaa ggaaaggatt gctcagcgcc atgtgattaa gaattatgct 4140

gatgacagac ttgaagaatt catgaaacta tatgattcca gtgcaaatcc cttgagaatt 4200

gtagaagatc ccaatcctgt gcagccatct ggggctaaac gtctcggtga atcaactgca 4260

gaaatgaagc aatcctcgaa gaaaaccaag agatatcctg aaattcctca agagctttat 4320

gccaagctta ctggcaatgc tgcttcatca aaacatcacc caaaggcagc agatatctcc 4380

aattcaggaa ctccacatca ccttttacct gttcttggcc tttgtgctcc aaatgctgat 4440

cagatgaact catataaagg gtcagtttgt gggccaagca caaaggagca aaaaagagct 4500

agtggtgaac tagccaacaa accgctgttg actcctgctg ttgatcattc tagcgaacaa 4560

aaacatgatg gccaaccaac tccttgtaag cctatgtttc ctggttcctc cgaggagact 4620

ttgcgaaggc tgaataatat cattccagac agttacttcc ccttccaacc tattcctcct 4680

atatccggga aggggattgg tgatcatgta gaaaatcctg tatcgtccat tccttcattt 4740

caagggaaac tgggtcttcc taattttagt ctggaagaca gtattccact taagcatttg 4800

aagtcagtac cggatctatt tcccaacttg tctttgggca ctagcaatga atatcttcgt 4860

aattgtgtcc cagaattgcc aaatagttca tttctaccaa gctttatggc agatattgct 4920

ggaacttcaa agcagaagaa caagttcatg gcagatatgt ctggccttct tccaggtttg 4980

gcaatcaacc cagttcaaca aatccattcg tccatgcctg aaaatcataa gaaggtcttg 5040

gacaaattaa tgatgcgtgc tcagtactcc tcaagcaagt tcttgaagaa tgcctcaaat 5100

aaattcctga agaagagttt aaaaccagac tattggtcag aagatgaact cgatgctttg 5160

tggattgggg ttcgcaggca tggaagagga aattgggagg ccatgcttag agatccaaag 5220

ctgaagtttt tgagccaccg atctcatgaa gagctggcct caagatggat tttggaggag 5280

cagaaaatta tagaggaacc aatgcctaca gccaccagaa gctccaactc tacatcattt 5340

cctggcatat cggatgcaat gatgtctcgg gcacttaatg gaagtagctt ttccaaactg 5400

aggatggagc cgccaaagtt gcagtcccac ctaactgaca ttcagttagg ttgcaatgat 5460

ataccaacca gattttctca tgttgagccc actaattaca tgaatttaag tgagggtggt 5520

ccatcactga caccgtggca ggatttcaaa aatagatcag gacacagtgg agattttcct 5580

ggcccacttg acaagtggga gaaacctgat atggggttga tcccaccatt tatgccgaat 5640

ccttttatga aggaaagcat tgggtcactg cccataaaca gacacagcag taattccatt 5700

cagcagaatg aagttggatc aagttctcat gagagcatac ttcatggttt ttcggacgga 5760

caggccaaat tattccatga gatgcaacgg cgtgtgaagt tagggaaatt acccattgag 5820

atgaatctga atcacacaaa gctgtcagat cctctagctg agaactctgg tgattttgaa 5880

agttcaaaac cgaacaagct accgcactgg cttcaggagg ctgtgcgtgc acctccatcc 5940

aagccacctg aatgtgagct accagcaact gtttcagcta ttgctcagtc tgtgtgccta 6000

ctacttggag agcaaaaacc agcaatacct ccattcccga ttccaggacc tcgtctctct 6060

ctccccaagg acccaaggag tgctccaaag aagaggagag ttcacaaagt tcagcaagct 6120

tcctccctgg tagatcattc caaaactaca gttgggcaag gtgaccacaa ctctactccg 6180

tcagcaccac tatccatgga agccgcacct gcctctcctg cagttattaa aagcagtgat 6240

accccctcgc tcaacttgaa ctcaccatct tcatcatcag ctggcagtcg ggggcaggat 6300

gcgtcaaccc cttccacttt tgaagaacca gaaagaacca tggaagtttc agaacctgct 6360

tctgtcgctg ctgccacttg cccgtccagg ccagagcctc ctgagactgg tactcacaga 6420

atcgagttct ccgcggtaga tgacatggat actggatctt gtagatcacc tgtgagggat 6480

actcctgacc ctgacaatca gaagagcgaa ttgtctggat caggtaatac acctactgaa 6540

ctttctgtat taccgttggt tgatgcacct gggacgagca gcgaacctgc tgtagtgccc 6600

gtatccagcg acgaggagtc aacccaagag ggtgtaccag gcaaagccgt aagcaccggc 6660

gaccaggaga aacggacgcc ccctgatgag agcgaaaatt caggtgcggc aaatccagtt 6720

tcggcagctc agacagctga cgaagataag gtggacgaga tgatcacaga tgagcattag 6780

<210> 2

<211> 2259

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

Met Met Lys Glu Arg Ser Ser Leu Cys Glu Ser Ala Ala Asp Gly

1 5 10 15

Ser Trp Val Leu Lys Tyr Lys Arg Lys Arg Ser Lys Leu Thr Val

20 25 30

Ser Pro Ser Ser Glu His Asp Ala Ser Ser Pro Ile Leu Asp Ser

35 40 45

Gln Met Asn Asn Gly Ser Ile Lys Lys Lys Ile Lys His Asp Thr

50 55 60

Asn Ile Ser Pro Ser Thr Lys Lys Ile Arg Gly His Asp Gly Tyr

65 70 75

Phe Tyr Glu Cys Val Glu Cys Asp Leu Gly Gly Asn Leu Leu Cys

80 85 90

Cys Asp Ser Cys Pro Arg Thr Tyr His Leu Glu Cys Leu Asn Pro

95 100 105

Pro Leu Lys Arg Ala Pro Pro Gly Asn Trp Gln Cys Pro Arg Cys

110 115 120

Arg Thr Lys Lys Val Ser Leu Lys Leu Leu Asp Asn Ala Asp Ala

125 130 135

Asp Thr Ser Lys Arg Glu Arg Thr Arg Arg Met Arg Thr Ser Thr

140 145 150

Thr Ser Asp Ser Pro Ser Pro Ser Pro Gln Asn Lys Ala Ser Phe

155 160 165

Asn Thr Ser Arg Gly Ala Ala Phe Arg Asp Asp Glu Pro Gly Ala

170 175 180

Lys Asp Asn Glu Val Glu Lys Arg Lys Pro Leu Ile Leu His Leu

185 190 195

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Glu Leu Ser Thr Asp Thr Thr Ser Ser

200 205 210

Lys Ser Gly Leu Leu Gly Lys Ser Ser Glu Glu Lys Gln Glu Lys

215 220 225

His Gly Ser Ala Leu Lys Val Lys Lys His Leu His Pro Met Glu

230 235 240

Leu Ser Pro Lys Lys Tyr Lys Asn Lys Lys Gln His Asn His Arg

245 250 255

Asp Ser Lys Arg Ser Glu Ala Lys Lys Val Gln Tyr Leu Ala Ser

260 265 270

Asp Val Asp Ser Asp Ser Ser Met Glu Pro Ser Thr Ser Leu Glu

275 280 285

His Ser Glu Ser Pro Pro Pro Lys Arg Lys Ser Leu Asp Gly Arg

290 295 300

Thr Pro Ala Ser Ser Thr Lys Lys Gly Lys Lys Lys Val Lys Phe

305 310 315

Val Asp Lys Lys His Pro Glu Asn Ala Val His Ile Thr Glu Lys

320 325 330

Glu His Gly Gly Ala Gly Asp Lys Ile Thr Thr Gln Gly Asp Leu

335 340 345

Gln Val Asp Arg Ile Leu Gly Cys Arg Leu Gln Thr Ser Gln Ile

350 355 360

Ile Ser Pro Ala His Ala Ser Ser Glu Gln Ile Asp Met Ala Pro

365 370 375

Pro Ser Ala Ser Gly Ala Pro Glu Pro Ser Gln Ala Leu Leu Lys

380 385 390

Gly Leu His Glu Glu Ile Gln Ser Ser Asn Ser Asp Thr Asn Val

395 400 405

Thr Glu Asp Ala Cys Ala Asp Glu Leu Ala Asn Asp Gly Gly Glu

410 415 420

Asn Asn Leu Asp Cys Ser Asp Ala Gln Lys Glu Ser Asn Val Arg

425 430 435

Ser His Gly His Lys Glu Ser Leu Asn Ala Lys Glu Ile Met Asn

440 445 450

Thr Ala Ser Ala Cys Ser Ala Asp Gln Ile Val Thr Val Lys Asp

455 460 465

Ala Gly Ala Val Gln Thr Tyr Val Thr Ala Ser Val Asn Gly Glu

470 475 480

Tyr Glu Thr Val Thr Asp Ile Pro Glu Glu Lys Asn Asp Thr Lys

485 490 495

His Pro Val Ser Lys Ala Asp Thr Glu Val His Thr Lys Gln Glu

500 505 510

His Thr Pro Asp Ser Lys Leu His Gly Lys Ile Gln Glu Thr Glu

515 520 525

Leu Lys Glu His Asp Gly Thr Thr Tyr Glu Phe Leu Val Lys Trp

530 535 540

Val Gly Lys Ser Asn Ile His Asn Ser Trp Ile Ser Glu Ser Glu

545 550 555

Leu Lys Ala Leu Ala Lys Arg Lys Leu Glu Asn Tyr Lys Ala Lys

560 565 570

Tyr Gly Thr Gly Leu Ile Asn Ile Cys Lys Glu Gln Trp Cys Gln

575 580 585

Pro Gln Arg Val Ile Ala Leu Arg Thr Ser Leu Asp Glu Ile Glu

590 595 600

Glu Ala Leu Ile Lys Trp Cys Ala Leu Pro Tyr Asp Glu Cys Thr

605 610 615

Trp Glu Arg Leu Asp Glu Pro Thr Met Val Lys Tyr Ala His Leu

620 625 630

Val Thr Gln Phe Lys Lys Phe Glu Ser Gln Ala Leu Asp Lys Asp

635 640 645

Lys Gly Gly Ser His Ala Lys Pro Arg Glu His Gln Glu Phe Asn

650 655 660

Met Leu Val Glu Gln Pro Lys Glu Leu Gln Gly Gly Met Leu Phe

665 670 675

Pro His Gln Leu Glu Ala Leu Asn Trp Leu Arg Lys Cys Trp Tyr

680 685 690

Lys Ser Lys Asn Val Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys

695 700 705

Thr Val Ser Ala Cys Ala Phe Leu Ser Ser Leu Cys Cys Glu Tyr

710 715 720

Lys Ile Asn Leu Pro Cys Leu Val Leu Val Pro Leu Ser Thr Met

725 730 735

Pro Asn Trp Met Ala Glu Phe Ala Ser Trp Ala Pro His Leu Asn

740 745 750

Val Val Glu Tyr His Gly Ser Ala Arg Ala Arg Ser Ile Ile Arg

755 760 765

Gln Tyr Glu Trp His Glu Gly Asp Ala Ser Gln Met Gly Lys Ile

770 775 780

Lys Lys Ser His Lys Phe Asn Val Leu Leu Thr Thr Tyr Glu Met

785 790 795

Val Leu Val Asp Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Val Ser Trp Glu Val

800 805 810

Leu Ile Val Asp Glu Gly His Arg Leu Lys Asn Ser Ser Ser Lys

815 820 825

Leu Phe Ser Leu Leu Asn Thr Leu Ser Phe Gln His Arg Val Leu

830 835 840

Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Asn Ile Gly Glu Met Tyr Asn

845 850 855

Leu Leu Asn Phe Leu Gln Pro Ala Ser Phe Pro Ser Leu Ala Ser

860 865 870

Phe Glu Glu Lys Phe Asn Asp Leu Thr Thr Thr Glu Lys Val Glu

875 880 885

Glu Leu Lys Asn Leu Val Ala Pro His Met Leu Arg Arg Leu Lys

890 895 900

Lys Asp Ala Met Gln Asn Ile Pro Pro Lys Thr Glu Arg Met Val

905 910 915

Pro Val Glu Leu Thr Ser Ile Gln Ala Glu Tyr Tyr Arg Ala Met

920 925 930

Leu Thr Lys Asn Tyr Gln Val Leu Arg Asn Ile Gly Lys Gly Gly

935 940 945

Ala His Gln Ser Leu Leu Asn Ile Val Met Gln Leu Arg Lys Val

950 955 960

Cys Asn His Pro Tyr Leu Ile Pro Gly Thr Glu Pro Glu Ser Gly

965 970 975

Ser Pro Glu Phe Leu His Glu Met Arg Ile Lys Ala Ser Ala Lys

980 985 990

Leu Thr Leu Leu His Ser Met Leu Lys Ile Leu His Lys Asp Gly

995 1000 1005

His Arg Val Leu Ile Phe Ser Gln Met Thr Lys Leu Leu Asp Ile

1010 1015 1020

Leu Glu Asp Tyr Leu Thr Trp Glu Phe Gly Pro Lys Thr Phe Glu

1025 1030 1035

Arg Val Asp Gly Ser Val Ser Val Ala Glu Arg Gln Ala Ala Ile

1040 1045 1050

Ala Arg Phe Asn Gln Asp Lys Ser Arg Phe Val Phe Leu Leu Ser

1055 1060 1065

Thr Arg Ser Cys Gly Leu Gly Ile Asn Leu Ala Thr Ala Asp Thr

1070 1075 1080

Val Ile Ile Tyr Asp Ser Asp Phe Asn Pro His Ala Asp Ile Gln

1085 1090 1095

Ala Met Asn Arg Ala His Arg Ile Gly Gln Ser Asn Arg Leu Leu

1100 1105 1110

Val Tyr Arg Leu Val Val Arg Ala Ser Val Glu Glu Arg Ile Leu

1115 1120 1125

His Leu Ala Lys Lys Lys Leu Met Leu Asp Gln Leu Phe Val Asn

1130 1135 1140

Lys Ser Glu Ser Gln Lys Glu Val Glu Asp Ile Ile Arg Trp Gly

1145 1150 1155

Thr Glu Glu Leu Phe Arg Asn Ser Asp Val Ala Val Lys Asp Asn

1160 1165 1170

Asn Glu Ala Ser Gly Ala Lys Asn Asp Val Ala Glu Val Glu Phe

1175 1180 1185

Lys His Lys Arg Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Tyr Glu Asp

1190 1195 1200

Arg Cys Ala Asp Gly Ser Ala Lys Phe Ile Trp Asp Glu Asn Ala

1205 1210 1215

Ile Thr Lys Leu Leu Asp Arg Ser Asn Val Pro Ser Thr Val Ala

1220 1225 1230

Glu Ser Thr Asp Gly Asp Leu Asp Asn Asp Met Leu Gly Thr Val

1235 1240 1245

Lys Ser Ile Asp Trp Asn Asp Glu Leu Asn Asp Asp Pro Gly Ala

1250 1255 1260

Thr Glu Asp Ile Pro Asn Ile Asp Asn Asp Gly Cys Glu Gln Ala

1265 1270 1275

Ser Glu Ala Lys Gln Asp Ala Ala Asn Arg Val Glu Glu Asn Glu

1280 1285 1290

Trp Asp Lys Leu Leu Arg Val Arg Trp Glu Gln Tyr Gln Thr Glu

1295 1300 1305

Glu Glu Ala Ser Leu Gly Arg Gly Lys Arg Leu Arg Lys Ala Val

1310 1315 1320

Ser Tyr Arg Glu Thr Phe Ala Thr Ile Pro Asn Glu Ala Leu Ser

1325 1330 1335

Glu Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu Pro Lys Arg Glu Tyr Thr Ala

1340 1345 1350

Ala Gly Leu Ala Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Leu Arg Ala Arg

1355 1360 1365

Gln Lys Glu Arg Ile Ala Gln Arg His Val Ile Lys Asn Tyr Ala

1370 1375 1380

Asp Asp Arg Leu Glu Glu Phe Met Lys Leu Tyr Asp Ser Ser Ala

1385 1390 1395

Asn Pro Leu Arg Ile Val Glu Asp Pro Asn Pro Val Gln Pro Ser

1400 1405 1410

Gly Ala Lys Arg Leu Gly Glu Ser Thr Ala Glu Met Lys Gln Ser

1415 1420 1425

Ser Lys Lys Thr Lys Arg Tyr Pro Glu Ile Pro Gln Glu Leu Tyr

1430 1435 1440

Ala Lys Leu Thr Gly Asn Ala Ala Ser Ser Lys His His Pro Lys

1445 1450 1455

Ala Ala Asp Ile Ser Asn Ser Gly Thr Pro His His Leu Leu Pro

1460 1465 1470

Val Leu Gly Leu Cys Ala Pro Asn Ala Asp Gln Met Asn Ser Tyr

1475 1480 1485

Lys Gly Ser Val Cys Gly Pro Ser Thr Lys Glu Gln Lys Arg Ala

1490 1495 1500

Ser Gly Glu Leu Ala Asn Lys Pro Leu Leu Thr Pro Ala Val Asp

1505 1510 1515

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1520 1525 1530

Pro Met Phe Pro Gly Ser Ser Glu Glu Thr Leu Arg Arg Leu Asn

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Asn Ile Ile Pro Asp Ser Tyr Phe Pro Phe Gln Pro Ile Pro Pro

1550 1555 1560

Ile Ser Gly Lys Gly Ile Gly Asp His Val Glu Asn Pro Val Ser

1565 1570 1575

Ser Ile Pro Ser Phe Gln Gly Lys Leu Gly Leu Pro Asn Phe Ser

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Leu Phe Pro Asn Leu Ser Leu Gly Thr Ser Asn Glu Tyr Leu Arg

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Asn Cys Val Pro Glu Leu Pro Asn Ser Ser Phe Leu Pro Ser Phe

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Asp Lys Leu Met Met Arg Ala Gln Tyr Ser Ser Ser Lys Phe Leu

1685 1690 1695

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1700 1705 1710

Tyr Trp Ser Glu Asp Glu Leu Asp Ala Leu Trp Ile Gly Val Arg

1715 1720 1725

Arg His Gly Arg Gly Asn Trp Glu Ala Met Leu Arg Asp Pro Lys

1730 1735 1740

Leu Lys Phe Leu Ser His Arg Ser His Glu Glu Leu Ala Ser Arg

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Trp Ile Leu Glu Glu Gln Lys Ile Ile Glu Glu Pro Met Pro Thr

1760 1765 1770

Ala Thr Arg Ser Ser Asn Ser Thr Ser Phe Pro Gly Ile Ser Asp

1775 1780 1785

Ala Met Met Ser Arg Ala Leu Asn Gly Ser Ser Phe Ser Lys Leu

1790 1795 1800

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1805 1810 1815

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1880 1885 1890

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Gly Ser Ser Ser His Glu Ser Ile Leu His Gly Phe Ser Asp Gly

1910 1915 1920

Gln Ala Lys Leu Phe His Glu Met Gln Arg Arg Val Lys Leu Gly

1925 1930 1935

Lys Leu Pro Ile Glu Met Asn Leu Asn His Thr Lys Leu Ser Asp

1940 1945 1950

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Lys Leu Pro His Trp Leu Gln Glu Ala Val Arg Ala Pro Pro Ser

1970 1975 1980

Lys Pro Pro Glu Cys Glu Leu Pro Ala Thr Val Ser Ala Ile Ala

1985 1990 1995

Gln Ser Val Cys Leu Leu Leu Gly Glu Gln Lys Pro Ala Ile Pro

2000 2005 2010

Pro Phe Pro Ile Pro Gly Pro Arg Leu Ser Leu Pro Lys Asp Pro

2015 2020 2025

Arg Ser Ala Pro Lys Lys Arg Arg Val His Lys Val Gln Gln Ala

2030 2035 2040

Ser Ser Leu Val Asp His Ser Lys Thr Thr Val Gly Gln Gly Asp

2045 2050 2055

His Asn Ser Thr Pro Ser Ala Pro Leu Ser Met Glu Ala Ala Pro

2060 2065 2070

Ala Ser Pro Ala Val Ile Lys Ser Ser Asp Thr Pro Ser Leu Asn

2075 2080 2085

Leu Asn Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ala Gly Ser Arg Gly Gln Asp

2090 2095 2100

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Val Ser Glu Pro Ala Ser Val Ala Ala Ala Thr Cys Pro Ser Arg

2120 2125 2130

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Val Asp Asp Met Asp Thr Gly Ser Cys Arg Ser Pro Val Arg Asp

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2165 2170 2175

Asn Thr Pro Thr Glu Leu Ser Val Leu Pro Leu Val Asp Ala Pro

2180 2185 2190

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2195 2200 2205

Glu Ser Thr Gln Glu Gly Val Pro Gly Lys Ala Val Ser Thr Gly

2210 2215 2220

Asp Gln Glu Lys Arg Thr Pro Pro Asp Glu Ser Glu Asn Ser Gly

2225 2230 2235

Ala Ala Asn Pro Val Ser Ala Ala Gln Thr Ala Asp Glu Asp Lys

2240 2245 2250

Val Asp Glu Met Ile Thr Asp Glu His

2255

Claims

1.一种控制水稻不定根伸长和叶片颜色基因OsCHR4编码的蛋白质，其特征在于：其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的控制水稻不定根伸长和叶片颜色基因OsCHR4编码的蛋白质，其特征在于：所述氨基酸序列还包括在SEQ ID NO：2 所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。

3.一种编码权利要求1或2所述的蛋白质的基因，其特征在于：其具有SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述核苷酸序列还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

5.如权利要求3或4所述基因的用途：用于构建转基因水稻。

6.一种转基因植物细胞，其特征在于：包含权利要求3或4所述基因的转基因植物细胞。