KR101829885B1 - 식물 원형질체로부터 유전체 교정 식물체를 고효율로 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Cas 단백질-가이드 RNA RNP (ribonucleoprotein)를 이용하여 식물 원형질체로부터 재생된 유전체가 교정된 식물체의 제조 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 유전체 교정 식물체의 제조 효율을 증가시키는 방법을 통해 표적 유전자가 변이된 식물체를 효율적으로 생산할 수 있을 뿐 아니라, 식물체 내 외래 DNA의 삽입을 최소화할 수 있다. 따라서 본 발명은 농업, 식품 및 생명공학분야 등 다양한 분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

식물 원형질체로부터 유전체 교정 식물체를 고효율로 제조하는 방법 {A method for preparing a genome-edited plant from protoplasts}
본 발명은 Cas 단백질 및 가이드 RNA를 도입하여 식물 원형질체로부터 재생된 유전체가 교정된 식물체의 제조 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
유전체 교정 식물이 유럽 및 타 국가에서 GMO (genetically-modified organism)로 규정되어 제제를 받을지 여부는 현재까지 불명확한 상태이다 (Jones, H.D., Nature Plants, 2015, 1: 14011). 유전자 가위 (programmable nuclease)는 유전체의 표적 위치에서 자연적으로 발생하는 변이와 구별할 수 없는 작은 규모의 삽입 및 결실 (insertions and deletions, indel), 또는 치환을 유도한다. 이와 같은 유전체 교정 식물은 몇몇 국가에서 GMO로 규정될 수 있어, 식물 생명공학 및 농업 분야에서 유전자 가위의 사용을 제한한다. 예를 들어, 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 사용하는 경우, 이를 통해 제조된 유전체 교정 식물은 유전체 상에 유전자 가위를 코딩하는 유전자를 포함한 외래 DNA 서열을 가지게 된다. 이러한 아그로박테리움 유래 DNA 서열을 육종을 통해 제거하는 것은 포도, 감자 및 바나나와 같이 무성 생식을 하는 식물에서는 불가능하다.
대신에, 유전자 가위를 코딩하는 비-삽입성 플라스미드는 원형질체와 같은 식물 세포에 형질전환시킬 수 있다. 그러나 본 발명자들은, 인간 세포에서 보여진 것과 같이 형질전환된 플라스미드가 세포 내에서 내인성 뉴클레아제에 의해 분해되고, 이로부터 생성된 작은 DNA 단편들이 Cas9의 표적 (on-target) 및 비표적 (off-target) 위치에 삽입될 수 있다는 사실에 주목하였다 (Kim, S, etc., Genome research, 2014, 24: 1012-1019).
Cas9 단백질 및 gRNA를 코딩하는 플라스미드를 식물 세포에 도입하는 방법에 비해, 미리 조립된 Cas9 단백질-gRNA RNP (ribonucleoprotein)를 이용하는 경우 숙주세포의 유전체에 재조합 DNA를 삽입할 가능성을 줄일 수 있다. 나아가, 인간 세포에서 확인된 것과 같이, RGEN (RNA-guided engineered nuclease) RNP는 형질전환 후 바로 염색체 표적 위치를 절단하고, 세포 내에서 내인적 단백질 분해효소에 의해 빠르게 분해되므로, 재생된 식물체에서 모자이크 현상 (mosaicism) 및 비표적 효과 (off-target effect)의 가능성을 감소시킬 수 있다. 미리 조립된 RGEN RNP는 사전 코돈 최적화 과정 및 각 식물 종에서 Cas9 및 gRNA를 발현시키기 위한 프로모터 없이도 광범위한 식물 종에 사용될 수 있다. 게다가, RGEN RNP는 고도의 활성을 가지는 gRNA를 시험관 내에서 미리 스크리닝할 수 있고, RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석을 통해 변이 클론의 유전형질을 확인할 수 있다. 그러나 현재까지 식물 원형질체에 RGEN RNP를 도입하여 유전체 교정을 확인하고, 이로부터 식물체를 재생시켰다는 결과는 보고된바 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 Cas 단백질-gRNA RNP를 식물체에 적용하여 유전체를 교정할 수 있는 기술을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 분리된 식물 원형질체에 Cas 단백질 및 가이드 RNA를 도입하여 상기 식물 원형질체의 유전체를 교정하고 이를 재생시켜, 높은 효율로 유전체가 교정된 식물체를 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (i) 분리된 식물 원형질체에 Cas 단백질 및 가이드 RNA를 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (ii) 상기 식물 원형질체를 재생시켜 유전체 교정 식물체를 제조하는 단계를 포함하는, 식물 원형질체로부터 제조된 유전체 교정 식물체의 제조 효율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 유전체 변형 식물 원형질체로부터 재생된 식물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표적 유전자를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA, 및 Cas 단백질을 포함하는, 식물 원형질체로부터 제조된 유전체 교정 식물체의 제조 효율을 증가시키기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
ZFN (zinc finger nuclease), TALLEN (transcription activator-like effector DNA binding protein) 및 CRISPR (clustered regularly interspced short palindromic repeats)/Cas 시스템과 같은 유전체 교정 (genome editing) 수단은 표적화된 돌연변이를 유도할 수 있는 매우 유용한 수단이나, 식물의 경우 GMO (genetically modified organism)에 관한 논란이 문제되어 그 사용에 제한이 따른다. 이에, 본 발명자들은 외래 유전자의 삽입 우려 없이 유전체 교정 식물체를 제조할 수 있는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, Cas 단백질 및 가이드 RNA를 식물 원형질체에 도입하여 유전체를 교정하는 경우, 상기 유전체가 교정된 원형질체를 재생시켜 제조한 식물체는 표적 유전자와는 관계 없이 현저하게 높은 빈도로 유전체가 교정되어 있는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명은 Cas9 및 가이드 RNA를 원형질체에 도입하여, 식물 원형질체로부터 재생된 유전체가 교정된 식물체의 제조 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, (i) 분리된 식물 원형질체에 Cas 단백질 및 가이드 RNA를 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (ii) 상기 식물 원형질체를 재생시켜 유전체 교정 식물체를 제조하는 단계를 포함하는, 식물 원형질체로부터 제조된 유전체 교정 식물체의 제조 효율을 증가시키는 방법이다.
유전체 교정 / 유전자 교정 기술은, 인간 세포를 비롯한 동식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, 특정 유전자를 낙아웃 (knock-out) 또는 낙인 (knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 Cas 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물에 변이를 도입하는 것일 수 있다. 본 발명의 방법을 통해 식물 원형질체로부터 제조된 유전체 교정 식물체의 제조 효율이 현저히 증가할 수 있다.
이하 상기 방법의 각 단계에 대해서 상세히 설명한다.
(i) 단계는 분리된 식물 원형질체에 Cas 단백질 및 가이드 RNA를 도입하여 유전체를 교정하는 단계로서, 표적 유전자를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA와 Cas 단백질을 식물 원형질체에 도입하여 외래 DNA의 유전체 내 삽입을 최소화하는 한편, 식물 원형질체를 단시간 내에 형질전환시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "Cas 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제로 작용할 수 있는 단백질로서, RGEN (RNA-guided engineered nuclease)으로 명명되는 유전자 가위에 해당된다. 상기 Cas 단백질은 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 이의 활성을 나타낼 수 있다.
상기 Cas 단백질은 유전체에서 특정 염기서열을 인식해 이중나선절단 (double strand break, DSB)을 일으킨다. 상기 이중나선절단은 DNA의 이중 나선을 잘라 둔단 (blunt end) 또는 점착종단 (cohesive end)을 만드는 것을 모두 포함한다. DSB는 세포 내에서 상동재조합 (homologous recombination) 또는 비상동재접합 (non-homologous end-joining, NHEJ) 기작에 의해 효율적으로 수선되는데 이 과정에 연구자가 원하는 변이를 표적 장소에 도입할 수 있다. 본 발명에서 Cas 단백질은 NGG 트리뉴클레오타이드 (trinucleotide)를 인식하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Cas 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질 또는 이의 변이체일 수 있다. 또한, 상기 Cas 단백질은 이에 제한되는 것은 아니나, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속, 네이세리아 (Neisseria) 속, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캄필로박터 속 (Campylobacter) 속 유래의 Cas 단백질일 수 있고, 보다 구체적으로 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래일 수 있다. 그러나, 상기 기술된 예에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
상기 Cas9 단백질의 변이체는 촉매 아스파라긴산 (aspartate) 잔기가 다른 아미노산, 예컨대 알라닌 (alanine)으로 교체된 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 상기 Cas 단백질은 재조합 단백질일 수 있다. 상기 용어 "재조합"은, 예컨대 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터 등을 언급하며 사용될 때, 이종 (heterologous) 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연형 (native) 핵산 또는 단백질의 변경, 또는 변형된 세포로부터 유래한 세포에 의해 변형된 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터를 나타낸다. 따라서, 예컨대, 재조합 Cas9은 인간 코돈 표 (human codon table)를 이용하여 Cas9 단백질을 암호화하는 서열을 재구성함으로써 만들 수 있다.
상기 Cas 단백질은 상기 단백질이 핵 내에서 작용할 수 있게 하는 형태일 수 있고, 세포 내로 도입되기에 용이한 형태일 수 있다. 그 예로 Cas 단백질은 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌 또는 HIV 유래의 TAT 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달 도메인은 상기 기술된 예 외에도 다양한 종류가 당업계에 공지되어 있으므로, 당업자는 상기 예에 제한되지 않고 다양한 예를 본 발명에 적용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "가이드 RNA (guide RNA)"는 표적 유전자를 암호화하는 DNA 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 서열과 전부 또는 일부 상보적으로 결합하여 Cas 단백질이 표적 서열을 절단할 수 있다.
통상적으로 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 일례로, 상기 가이드 RNA를 Cas9에 적용할 경우에는 crRNA 및 tracrRNA를 구성요소로 포함하는 이중 RNA 형태 또는 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분이 융합된 형태인 단일-사슬 가이드 RNA (single-chain guide RNA; sgRNA) 형태일 수 있다. 상기 sgRNA는 표적 DNA 내 서열과 상보적인 서열을 가지는 부분 (이를 Spacer region, Target DNA recognition sequence, base pairing region 등으로도 명명함) 및 Cas 단백질 결합을 위한 헤어핀 (hairpin) 구조를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 가지는 부분, Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조 및 Terminator 서열을 포함할 수 있다. 상기 기술된 구조는 5' 에서 3' 순으로 순차적으로 존재하는 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 가이드 RNA가 crRNA의 주요 부분 또는 표적 DNA의 전부 또는 일부 상보적인 부분을 포함하는 경우라면 어떠한 형태의 가이드 RNA도 본 발명에서 사용될 수 있다.
상기 가이드 RNA는 이에 제한되지 않으나, 분리된 RNA (naked RNA)의 형태일 수 있다. 가이드 RNA가 분리된 RNA의 형태로 세포 또는 유기체에 형질주입될 때, 당업계에 알려진 임의의 시험관 내 전사 시스템을 사용하여 가이드 RNA를 제조할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하며, sgRNA의 업스트림 부위, 구체적으로 sgRNA의 5' 말단에 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 추가의 뉴클레오티드는 구아닌 (guanine, G)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 벡터 시스템과 같은 세포 내 발현 시스템을 이용하지 않고, Cas 단백질 및 가이드 RNA를 직접 원형질체에 도입하는 것을 특징으로 한다. 이를 통해 외래 DNA가 식물체 내에 도입되는 것을 최소화할 수 있어, GMO에 대한 우려를 막을 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 Cas 단백질 및 가이드 RNA는 원형질체에 도입 전에 미리 조립된 형태, 즉 RNP (ribonucleoprotein) 형태로 제조되어 원형질체에 도입될 수 있다. 본 발명에서 Cas 단백질-가이드 RNA RNP 및 RGEN-RNP는 동일한 의미로 사용되었다.
본 발명에서 사용된 용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미한다. 즉, 원칙적으로 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 논코딩 (non-coding) 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다. 상기 표적 유전자는 예컨대, BIN2 (Brassinosteroid Insensitive 2) 유전자 또는 GSL-ALK (Glucosinolate-oxoglutarate-dependent dioxygenase homolog) 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계에서, Cas 단백질 및 가이드 RNA를 원형질체에 도입하는 것은 미세주입법 (microinjection), 전기천공법 (electroporation), DEAE-덱스트란 처리, 리포펙션 (lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 및 PEG-매개 형질주입 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. Cas 단백질은 가이드 RNA와의 복합체의 형태 또는 독립된 형태로 세포 안으로 전달될 수 있다.
상기 도입은 공동-형질주입 또는 단계적-형질주입 형태로 수행될 수 있다. 단계적-형질주입은 Cas 단백질을 먼저 형질주입한 다음, 네이키드 가이드 RNA를 두 번째 형질주입하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원발명에서 상기 식물 원형질체는 원형질체를 수득할 수 있는 식물이라면 그 유래에 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 상추 (Lactuca sativa) 또는 양배추 (Brassica oleracea) 유래인 것일 수 있다.
(ii) 단계는 상기 (i) 단계를 통해 유전체가 교정된 식물 원형질체를 재생시켜 유전체 교정 식물체를 제조하는 단계로서, 이에 제한되는 것은 아니나 식물 원형질체를 배양하여 캘러스 (callus)를 형성시키는 단계, 및 상기 캘러스를 추가적으로 배양하여 재생된 식물체를 제조하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 캘러스 형성 단계 및 캘러스로부터 재생된 식물체를 제조하는 단계에서 사용되는 배지 조성은 식물의 종류 및 상태에 따라 당업자에 의해 적절하게 수행될 수 있으며, 이러한 배양 조건은 당업계에 공지되어 있다.
구체적으로 유전체 교정된 원형질체로부터 캘러스 형성을 유도하기 위해 MS 염, 6 % 마이오-이노시톨, 0.4 mg/L 티아민-HCl, 2 mg/L 2,4-D, 0.5 mg/L BA 및 30 % 수크로스를 포함하는 캘러스 유도 배지에서 캘러스를 배양할 수 있고, 이로부터 배양된 마이크로-캘리를 MS 염, 0.6 % 마이오-이노시톨, 0.4 mg/L 티아민-HCl, 2 mg/L 2,4-D, 0.5 mg/L BA, 3 mg/L AgNO3, 3 % 수크로스 및 0.4 % 젤라이트 (Gelrite)를 포함하는 캘러스 유도 고형 배지에서 추가적으로 배양하여 녹색 소식물체 (plantlet)를 만들고 이를 MS 기본 배지로 옮겨 뿌리생성을 유도할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 당업자는 식물의 종류 및 상태에 따라 온도 및 명암 조건 등 외부 환경을 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상추에서 분리한 원형질체에서 BIN2 (brassinosteroid intensive 2) 유전자를 표적으로 하여 RNP를 도입한 뒤 상기 유전체 교정된 원형질체를 재생시킨 결과, 완전히 재생된 식물체에서는 원형질체에서의 교정 빈도 대비 무려 10 배 수준인 46 %의 유전체 교정 효율을 보이는 것을 확인하였다 (도 1b 및 도 4b). 또한, 양배추에서 분리한 원형질체에서 GSL-ALK (Glucosinolate-oxoglutarate-dependent dioxygenase homolog) 유전자를 결손시킨 경우에도 상추의 경우와 마찬가지로, RNP가 도입된 원형질체 단계에서는 유전체 교정 효율이 0.0 % 내지 1 % 수준으로 높지 않았으나, 이로부터 재생된 캘러스에서는 24.0 % 내지 100 %의 수준으로 현저하게 효율이 향상되는 것을 확인하였다 (표 2 및 표 3). 상기 결과를 통해, 표적 유전자의 종류에 관계 없이 RNP가 도입된 원형질체는 도입되지 않은 원형질체에 비해 재생 과정에서 세포 증식 및 성장률이 촉진되어 식물체로 재생된다는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 다른 양태는, 상기 방법에 의해 제조된 유전체 교정 식물 원형질체로부터 재생된 식물이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 표적 유전자를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA, 및 Cas 단백질을 포함하는, 식물 원형질체로부터 제조된 유전체 교정 식물체의 제조 효율을 증가시키기 위한 조성물이다.
가이드 RNA, Cas 단백질, 식물 원형질체의 유전체 교정 및 이로부터 재생된 식물에 대해서는 상기 설명한 바와 같다. 상기 유전체 교정 식물체는 본 발명의 조성물에 기반한 표적화된 돌연변이에 의해 야기된 돌연변이를 갖는다. 상기 돌연변이는 결실, 삽입, 전좌, 반전 중 어느 하나일 수 있다. 돌연변이의 위치는 상기 조성물의 가이드 RNA의 서열에 의존하는 것일 수 있다.
상기 표적 유전자는 BIN2 (Brassinosteroid Insensitive 2) 유전자 또는 GSL-ALK (Glucosinolate-oxoglutarate-dependent dioxygenase homolog) 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 유전체 교정 식물체의 제조 효율을 증가시키는 방법을 통해 표적 유전자가 변이된 식물체를 효율적으로 생산할 수 있을 뿐 아니라, 식물체 내 외래 DNA의 삽입을 최소화할 수 있다. 따라서 본 발명은 농업, 식품 및 생명공학분야 등 다양한 분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 상추 원형질체에서 Cas9 단백질-가이드 RNA RNP (ribonucleoprotein) 매개 유전자 결실을 확인한 것이다. (a) BIN2 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 2) 유전자의 표적 서열, (b) 대규모 집단에서 T7E1 분석 및 표적화 딥시퀀싱을 통해 측정한 변이 빈도, (c) 상추에서 Cas9 단백질-가이드 RNA RNP (ribonucleoprotein)로 유도된 변이 DNA 서열. PAM (protospacer-adjacent motif) 서열은 빨간색으로 표시하였고, 삽입된 뉴클레오티드는 파란색으로 표시하였다. WT, 야생형.
도 2는 RGEN RNP 직접 도입 방식을 통한 상추 유전자 교정 후 원형질체의 분열과 기내 재분화 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 목표 유전자 (Lsbin2)가 교정된 상추 식물체를 확보하는 재분화 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 Cas9 단백질-가이드 RNA RNP로 처리한 단일 원형질체 유래 상추 마이크로캘리 (microcalli)의 유전형을 분석한 결과이다. (a) 마이크로캘리의 유전형. (상단) RGEN RFLP 분석, (하단) 마이크로캘리에서 변이 DNA 서열. (b) T0 세대에서 BIN2 유전자의 유전형 변이를 정리한 표.
도 5는 유전 분석을 기반으로 유채 (B. napus)에서 글루코시놀레이트 (glucosinolate)의 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 6은 양배추 자엽 유래 원형질체에 Cas9 단백질-가이드 RNA RNP를 형질전환시킨 뒤 캘러스 형성을 확인한 것이다. (A) 양배추 유식물의 자엽, (B) 분리된 원형질체, (C) 원형질체 배양 3 내지 5 일 경과 후 최초 세포 분열, (D) Cas9 단백질-가이드 RNA RNP 형질전환 후 배양 2 내지 3 주째의 원형질체, (E 및 F) 배양 9 내지 11 주 경과 후 마이크로-캘러스 (micro-callus) 형성. 스케일바, 1 cm (A), 10 ㎛ (B 내지 D), 1 mm (E 및 F).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 식물 원형질체의 분리
상추 원형질체를 분리하기 위해, 상추 청치마 (Cheongchima) 종자를 70 % 에탄올, 0.4 % 하이포클로라이트 (hypochlorite) 용액에서 15 분 동안 멸균한 뒤, 증류수로 3 회 세척하고, 2 % 수크로스를 함유하는 1/2X MS 고형 배지에서 배양하였다. 배양은 성장실에서 16 시간 명 (150 μmol/m2s), 8 시간 암 조건으로 25 ℃에서 수행하였다. 배양 7일째의 상추 자엽을 어두운 상태로 25 ℃에서 12 시간 동안 효소 용액 (1.0 % 셀룰라제 R10, 0.5 % 매크로자임 (macerozyme) R10, 0.45 M 마니톨, 20 mM MES [pH 5.7], CPW 용액)과 함께 40 rpm으로 교반하면서 인큐베이션하여 분해한 다음, 동량의 W5 용액으로 희석시켰다. 상기 혼합물을 여과시키고, 원형바닥 튜브에서 100 g로 5 분 동안 원심분리하여 원형질체를 회수하였다. 재현탁된 원형질체를 CPW 21S 용액 (21 % [w/v] 수크로스 함유 CPW 용액, pH 5.8)에 띄워 정제하고, 80 g로 7 분 동안 원심분리하였다. 정제된 원형질체를 W5 용액으로 세척한 뒤 70 g로 5 분 동안 원심분리하여 펠렛을 만들었다. 마지막으로, 원형질체를 W5 용액에 재현탁하고, 헤마사이토미터 (hemacytometer)를 이용하여 현미경으로 수를 세었다.
양배추 원형질체를 분리하기 위해, 양배추 (B. oleraceae) 자엽으로부터 식물 원형질체를 분리하였으며, 그 구체적인 방법은 다음과 같다. 양배추 동복 (Dongbok) 종자를 70 % 에탄올 및 1 % 클로락스 (clorox)로 15 분 동안 멸균시키고 증류수로 3 회 세척한 뒤, MS (Murashige and Skoog) 고형 배지 (3 % 수크로스, 0.8 % 아가, pH 5.8)에 접종하였다. 배양은 25 ℃에서 5 일 동안 수행하였다. 원형질체 분리를 위해, 5 일된 양배추의 자엽을 분리하고, 이를 25 ℃ 암조건에서 효소 용액 (셀룰로스, 펙티나제, 3 mM MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), 및 마니톨 9 %를 함유하는 CPW (Cell and protoplast washing solution) 용액)에 담가 35 rpm으로 16 시간 동안 교반하면서 인큐베이션하여 분해시켰다. 그 다음, 상기 효소 처리된 자엽을 50 ㎛ 매쉬로 여과시키고 14 ㎖ 원형바닥 튜브에서 100 g로 5 분 동안 원심분리하였다. 그 다음 침전된 원형질체를 9 % 마니톨 CPW로 2 회 세척하였다. 세척된 원형질체를 21 % 수크로스를 함유하는 CPW로 정제하고 100 g에서 5 분 동안 원심분리하였다. 정제된 원형질체를 수크로스 중간 층으로부터 분리하고 9 % 마니톨 CPW로 세척한 뒤 50 g로 5 분 동안 원심분리하였다. 원형질체는 형질전환에 사용되기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 2: 원형질체의 유전체 교정
형질전환 전에, Cas9 단백질을 포함하는 저장 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM KCl, 1 mM DTT, 및 10 % 글리세롤)을 sgRNA와 혼합하고 상온에서 10 분 동안 인큐베이션하였다.
상추 에서 RNP 복합체를 이용한 DSB (double strand break)를 유도하기 위해, 5 x 105 개의 원형질체 세포를 시험관 내 전사된 sgRNA (60 ㎍)와 미리 혼합된 Cas9 단백질 (30 ㎍)로 형질전환시켰다. 상기 5 x 105 개의 원형질체 혼합물을 200 ㎕ MMG 용액에 재현탁시키고 20 ㎕ RNP 복합체 및 220 ㎕의 새로 제조한 PEG 용액(40 % [w/v] PEG 4000; Sigma No. 95904, 0.2 M 마니톨 및 0.1 M CaCl2)과 조심스럽게 혼합한 뒤, 어두운 조건에서 25 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 950 ㎕의 W5 용액 (2 mM MES [pH 5.7], 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2 및 5 mM KCl)을 천천히 첨가하였다. 그 다음 튜브를 뒤집으면서 상기 용액을 잘 혼합하였다. 그 다음 100 g에서 3 분 동안 원심분리하여 원형질체의 펠렛을 만들고, 1 ml WI 용액 (0.5 M 마니톨, 20 mM KCl 및 4 mM MES, pH 5.7)에 조심스럽게 재현탁시켰다. 마지막으로, 상기 원형질체를 멀티-웰 플레이트로 옮기고 어두운 조건으로 25 ℃에서 24 내지 48 시간 동안 인큐베이션하고 유전체 교정 분석을 수행하였다. 동시에, 상기 원형질체를 상추 배양 배지로 옮겨 식물체 재생 과정을 수행하였다
양배추의 경우, 시험관 내 전사된 sgRNA (15 ㎍)와 미리 혼합된 Cas9 단백질 (40 ㎍)로 2 x 105 개의 원형질체 세포를 형질전환시켰다. 상기 2 x 105 개의 원형질체 혼합물을 200 ㎕ MMG 용액 (4 mM MES, 0.4 M 마니톨, 15 mM MgCl2 pH 5.7)에 재현탁시키고, RNP 복합체와 220 ㎕의 새로 제조한 PEG 용액(40 % [w/v] PEG 4000; Sigma No. 95904, 0.2 M 마니톨 및 0.1 M CaCl2)을 조심스럽게 혼합한 다음, 25 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 동일 부피의 W5 용액(2 mM MES [pH 5.7], 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2 및 5 mM KCl)을 10 분 간격으로 3 회 첨가하고, 50 g에서 5 분 동안 원심분리한 다음 W5 용액에 재현탁시켰다. 형질전환된 원형질체를 25 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하고 유전체 교정 분석을 수행하였다. 동시에, 상기 원형질체를 배양 배지 (MS, 6% 마이오-이노시톨 (myo-inositol), 0.4 mg/L 티아민-HCl, 2 mg/L 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid), 0.5mg/L BA 및 30 g/L 수크로스, pH 5.8)로 옮겨 25 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션한 다음 재생 과정을 수행하였다.
실시예 3: 원형질체의 재생
상추 원형질체 재생을 위해, RNP로 형질전환시킨 원형질체를 375 mg/L CaCl2·2H2O,18.35 mg/L NaFe-EDTA, 270 mg/L 소듐 석시네이트 (sodium succinate), 103 g/L 수크로스, 0.2 mg/L 2,4-D, 0.3 mg/L 6-BAP (benzylaminopurine), 및 0.1 g/L MES를 함유하는 1/2X B5 배양 배지에 재현탁시켰다. 그 다음 원형질체를 1/2X B5 배지와 2.4 % 아가로스의 1:1 용액과 함께 혼합하여 2.5 X 105 원형질체/ml의 밀도로 배양하였다. 아가로스에 둘러싸인 원형질체를 6-웰 플레이트로 옮기고, 2 ml의 1/2X B5 배양 배지로 25 ℃의 어두운 조건에서 배양하였다. 7 일 후, 상기 배지를 새로운 배지로 교체하고, 25 ℃의 밝은 조건 (16 시간 명 [30 μmol/m2s] 및 8 시간 암 조건)에서 배양하였다. 배양 3 주 후, 마이크로캘리를 직경 수 mm까지 키우고, 30 g/L 수크로스, 0.6 % 플랜트아가, 0.1 mg/L α-NAA (naphthalaneacetic acid), 0.5 mg/L BAP를 함유하는 MS 재생 배지로 옮겨 배양하였다. 재생 배지에서 약 4 주 경과 후, 다 수의 상추 싹 유도된 것이 관찰되었다.
양배추 원형질체의 재생을 위해, 배양 배지에서 배양된 RNP로 형질전환된 원형질체를 50 g로 5 분 동안 원심분리한 뒤, 침전된 세포를 캘러스 유도 배지(MS 염, 6 % 마이오-이노시톨, 0.4 mg/L 티아민-HCl, 2 mg/L 2,4-D, 0.5 mg/L BA 및 30 % 수크로스, pH 5.8)에 재현탁시키고, 어두운 조건으로 25 ℃에서 3 내지 4 주 배양하였다. 배양된 마이크로-캘리를 캘러스 유도 고형 배지(MS 염, 0.6 % 마이오-이노시톨, 0.4 mg/L 티아민-HCl, 2 mg/L 2,4-D, 0.5 mg/L BA, 3 mg/L AgNO3, 3 % 수크로스 및 0.4 % 젤라이트 (Gelrite), pH 5.8)로 옮기고, 밝은 조건 (약 30 μmol/m2s의 백색 형광등으로 16 시간 광주기)으로 25 ℃에서 배양하였다. 상기 캘러스의 일부는 인델 빈도 (indel frequency)를 평가하는데 사용하였다. 밝은 조건에서 4 주 인큐베이션한 뒤, 유전체 교정된 원형질체로부터 유래된 캘러스로부터 재생된 녹색 소식물체 (plantlet)를 MS 기본 배지로 옮겨 전체 식물체로의 재생을 위해 뿌리 생성을 유도하였다.
실시예 4: 표적화 딥시퀀싱 (Targeted deep sequencing)
RGEN-RNP를 적용한 원형질체 또는 재생된 캘러스의 유전체 DNA에서 표적 위치 (on-target site)를 증폭시켰다. 인덱스와 시퀀싱 어댑터를 추가적인 PCR을 통해 부가하였다. Illumina Miseq (v2, 300-cycle)을 이용하여 고처리량 시퀀싱 (high-throughput sequencing)을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.
LsBin2-deepF TAGAAACGGGGGAAACTGTG (서열번호 1)
LsBin2-deepR CCCAAAAGAAGCTCAGCAAG (서열번호 2)
BoGSL-ALK F1_1-5 GCGAAAAGAATGGGTGCAGA (서열번호 3)
BoGSL-ALK R1_1-5 TGGCATCCAAAACTGACTTCT (서열번호 4)
BoGSL-ALK F2_6-9 TCGAGTTACCAGTTGAGGCT (서열번호 5)
BoGSL-ALK R2_6-9 CGACATGACGTTACCTCATAGTC (서열번호 6)
BoGSL-ALK F3_10-12 CAGCGAAACGATCCAGAAGT (서열번호 7)
BoGSL-ALK R3_10-12 CTGACCGCAACATTAGCATCA (서열번호 8)
BoGSL-ALK F4_13-15 GCGCAGATGATGAGGAGAAG (서열번호 9)
BoGSL-ALK R4_13-15 AGAATCTCCAGCCATAACAACG (서열번호 10)
실시예 5: T7E1 분석
DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 원형질체 또는 캘러스로부터 유전체 DNA를 분리하였다. 표적 DNA 영역을 증폭시키고 T7E1 분석을 수행하였다. 구체적으로, PCR 산물을 95 ℃로 변성시키고, 써멀 사이클러 (thermal cycler)를 이용하여 상온까지 온도를 천천히 낮추었다. 어닐링된 PCR 산물을 37 ℃에서 20 분 동안 T7 엔도뉴클레아제 I (ToolGen, Inc.)와 인큐베이션하고, 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석하였다.
실시예 6: RGEN - RFLP 분석
1X NEB 완충액 3에서 PCR 산물 (300 - 400 ng)과 Cas9 단백질 (1 ㎍) 및 sgRNA (750 ng)를 반응 부피 10 ㎕로, 37 ℃에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 상기 반응 혼합물에 RNase A (4 ㎍)를 첨가하고 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하여 sgRNA를 제거하였다. 그 다음 6X 정지 용액 (30 % 글리세롤, 1.2 % SDS 및 250 mM EDTA)을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 2.5 % 아가로스 겔을 이용하여 DNA 산물을 전기영동하였다.
실험예 1: BIN2 ( BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 2) 유전자가 결손된 상추 원형질체로부터 식물체의 재생
본 발명자들은 상추에서 BR (brassinosteroid) 신호전달 경로에서 음성 조절자를 암호화하는 BIN2 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 2) 유전자를 결손시키기 위한 RGEN (RNA-guided engineered nuclease) 표적 위치를 설계하였다 (도 1의 a, 서열번호 11). 그 다음 PEG (polyethylene glycol) 존재 하에 상추에서 분리한 원형질체에 RGEN RNP (ribonucleoprotein)를 형질전환시키고, T7E1 (T7 endonuclease 1) 분석 및 표적화된 딥시퀀싱 (targeted deep sequencing)을 이용하여 RGEN에 의해 야기된 유전자 변이를 측정하였다. 그 결과 인델 (insertion and deletion, indel)은 예상된 위치, 즉 NGG PAM (protospacer-adjacent motif)의 상류 3 nt (nucleotide) 위치에서 T7E1 분석으로 8.3 % 내지 11 %, NGS 분석으로 3.2 % 내지 5.7 %의 빈도로 나타났다 (도 1의 b 및 c).
다음으로 본 발명자들은 재생 과정을 수행하여, 상기 RGEN-RNP를 처리한 상추 원형질체로부터 BIN2 변이 형질을 가지는 식물체를 제조하였다. 그 결과 상기 원형질체 중 극히 일부 (< 0.5 %)만이 캘러스를 거쳐 완전한 식물체로 배양되었다 (도 2 및 도 3). 이 중, 35 개의 원형질체 라인에 대하여 추가적인 분석을 수행하였다 (도 4). 구체적으로, 본 발명자들은 상추 마이크로캘리의 유전형에 대하여 RGEN-RFLP 분석 및 표적화된 딥시퀀싱을 수행하였다. RGEN-RFLP 분석은 이형접합 이-형질 (bi-allelic) 변이 클론 (비절단)과 단일-형질 변이 클론 (50 % 절단), 그리고 야생형 클론 (100 % 절단)과 동형접합 이-형질 변이 클론 (비절단)을 구별할 수 있다. 분석 결과, 상기 35 개 중 2 개의 캘러스 (5.75 %)의 표적위치가 단일-형질 변이이고, 14 개의 캘러스 (40 %)의 표적위치가 이-형질 변이인 것을 확인하였다. 상기 결과는 어떠한 선별 과정도 없이 46 %의 빈도로 유전체 교정 상추를 수득한 것으로, 이는 대규모 집단에서의 RGEN-RNP를 이용한 변이 빈도를 고려하였을 때 극히 높은 빈도이다. 이는, 재생 과정에서 RGEN으로 유도되는 변이가 안정적으로 유지되어 축적된다는 것을 의미하는 것이다.
실험예 2: GSL - ALK ( Glucosinolate - oxoglutarate -dependent dioxygenase homolog) 유전자가 결손된 양배추 원형질체로부터 식물체의 재생
실험적 오류를 배제하고 실험예 1의 현상을 확인하기 위해, 본 발명자들은 양배추 (Brassica oleracea)에서 추가적으로 독립적인 실험을 수행하였다. 실험예 1에서 표적으로 이용된 BIN2 유전자의 결손이 원형질체의 재생 과정에서 성장 및 생존성에 영향을 미쳤을 가능성을 배재할 수 없으므로, 본 발명자들은 원형질체 또는 캘러스의 성장 및 생존성과는 무관한 유전자를 선별하고자 하였다. 이에, 글루코시놀레이트 (glucosinolate) 경로에서 곁사슬 변이에 영향을 미치는 단백질을 코딩하는 양배추 (B. oleraceae)의 GSL - ALK (Glucosinolate-oxoglutarate-dependent dioxygenase homolog) 유전자를 표적으로 하여 이를 결손시키기 위해 7 개의 sgRNA 서열을 설계하였다 (표 2).
Name sgRNA sequence Mutant reads #/
Total reads #		 Indel frequency (%)
BoGSL-ALK 1 ACTTCCAGTCATCTATCTCT
(서열번호 12)		 0/27157 0
BoGSL-ALK 2 TGGTCCGAGAGATAGATGAC
(서열번호 13)		 2/30038 0
BoGSL-ALK 7 CTGCTACGCCCTGATTGTGA
(서열번호 14)		 261/61752 0.4
BoGSL-ALK 9 GTCTTGTTACCCTCACAATC
(서열번호 15)		 67/33545 0.2
BoGSL-ALK 12 AGAATGGTCATAGAGAGCTT
(서열번호 16)		 164/62330 0.3
BoGSL-ALK 13 ATATGAGATTGAAGGTTTGG
(서열번호 17)		 480/82376 0.6
BoGSL-ALK 15 ACAACGAAAGAGTTATGAGA
(서열번호 18)		 55/85835 0.1
상기 GSL-ALK 유전자는 세포의 생존이나 스트레스 저항성과는 전혀 관련성이 없는 유전자로, 상기 실험예 1에서와는 다른 결과, 즉 상대적으로 더 낮은 효율이 나타날 것으로 예상되었다.
먼저, PEG (polyethylene glycol) 매개 형질전환을 통해 양배추 자엽-유래 원형질체에 RGEN-RNP를 도입하고, NGS 분석을 이용하여 표적 유전자의 교정 빈도를 측정한 결과 0.0 % 내지 1 %의 범위의 빈도로 확인되었다 (표 2).
그 다음, 본 발명자들은 재생 과정을 수행하여 RGEN-RNP로 형질전환된 원형질체로부터 GSL-ALK 유전자가 교정된 형질을 가지는 전체 식물체를 유도하였다 (도 6). 그 결과, 양배추 유래 원형질체 중 오직 일부 (< 0.1 %)만이 배양되어 캘러스를 형성하였다. 상기 재생된 캘러스에 대해 표적화된 딥시퀀싱을 수행하여 양배추 캘러스의 유전형을 확인한 결과, BIN2 유전자를 결손시킨 상추에서와 마찬가지로, 상기 분석된 캘러스에서는 원형질체 집단에서의 유전체 교정 빈도 대비 극도로 높은 빈도 (24 내지 100 %)로 유전체 교정된 캘러스가 존재하는 것을 확인할 수 있었다 (표 3).
Name The total number of analyzed calluses The number of target gene edited calluses The frequency of edited calluses (%)
BoGSL-ALK 1 3 1 33.3
BoGSL-ALK 2 10 4 40.0
BoGSL-ALK 7 1 1 100.0
BoGSL-ALK 9 7 4 57.1
BoGSL-ALK 12 25 6 24.0
BoGSL-ALK 13 14 4 28.5
BoGSL-ALK 15 15 4 26.7
상기 결과를 종합하면, 식물 원형질체의 재생 과정에 있어서 표적 유전자의 종류에 관계 없이 RGEN-RNP가 적용되어 유전체가 교정된 원형질체가 안정적으로 유지되어 축적된다는 것을 의미한다. 즉, 본 발명자들은 RGEN-RNP를 원형질체에 처리하는 경우, 세포 증식 및 성장률이 촉진되어 고효율로 식물체를 재생시킬 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (22)

  1. (i) 분리된 식물 원형질체에 Cas 단백질과 가이드 RNA가 미리 조립된 Cas 단백질-가이드 RNA RNP (ribonucleoprotein)를 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
    (ii) 상기 식물 원형질체를 재생시켜 유전체 교정 식물체를 제조하는 단계를 포함하는, 식물 원형질체로부터 제조된 유전체 교정 식물체의 제조 효율을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 표적 유전자를 암호화하는 DNA에 특이적인 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 표적 유전자는 BIN2 (Brassinosteroid Insensitive 2) 유전자 또는 GSL-ALK (Glucosinolate-oxoglutarate-dependent dioxygenase homolog) 유전자인 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유전체 교정은 유전자 제거 (knock-out) 또는 유전자 낙인 (knock-in)을 통해 수행되는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA (dual RNA) 또는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA) 형태인 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단일-사슬 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하는 것인, 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질의 촉매 아스파라긴산 (aspartate) 잔기가 다른 아미노산으로 교체된 변이체인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 NGG 트리뉴클레오타이드 (trinucleotide)를 인식하는 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain)에 연결되어 있는 것인, 방법.
  11. 삭제
  12. 제8항에 있어서, 상기 다른 아미노산은 알라닌 (alanine)인 것인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 스트렙토코커스 속 (genus Streptococcus) 유래인 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 속은 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes)인 것인, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 식물 원형질체는 상추 (Lactuca sativa) 또는 양배추 (Brassica oleracea) 유래인 것인, 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제1항에 있어서, 상기 도입은 미세주입법, 전기천공법, DEAE-덱스트란 처리, 리포펙션, 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 및 PEG-매개 형질주입으로 구성된 군으로부터 선택된 방법으로 수행되는 것인, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 재생시키는 단계는 유전자가 교정된 식물 원형질체를 배양하여 캘러스 (callus)를 형성시키는 단계, 및 상기 캘러스를 추가적으로 배양하여 재생된 식물체를 제조하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  20. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항, 제12항 내지 제15항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 유전체 교정 식물 원형질체로부터 재생된 식물.
  21. 표적 유전자를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA, 및 Cas 단백질이 미리 조립된 Cas 단백질-가이드 RNA RNP (ribonucleoprotein)을 포함하는, 식물 원형질체로부터 제조된 유전체 교정 식물체의 제조 효율을 증가시키기 위한 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 표적 유전자는 BIN2 (Brassinosteroid Insensitive 2) 유전자 또는 GSL-ALK (Glucosinolate-oxoglutarate-dependent dioxygenase homolog) 유전자인 것인, 조성물.
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