KR20210109384A - 원형질체를 활용한 식물 유전자 교정 효율 증대 방법 - Google Patents

원형질체를 활용한 식물 유전자 교정 효율 증대 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물의 원형질체를 고순도로 분리하고 이를 이용하여 높은 효율로 식물의 유전자를 교정하는 방법 및 유전자 교정 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

원형질체를 활용한 식물 유전자 교정 효율 증대 방법 {Method for increasing gene editing efficiency in plant using protoplasts}
본 발명은 식물의 원형질체를 고순도로 분리하고 이를 이용하여 높은 효율로 식물의 유전자를 교정하는 방법 및 유전자 교정 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
식물의 유전자 교정은 유전자의 기능을 조사하거나 식물을 유전학적으로 향상시키기 위한 유망한 수단이다. 현재 이용가능한 유전자 교정 기법으로는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 작동자 뉴클레아제 (TALEN), 및 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/Cas (CRISPR-associated sequences) 시스템 등이 있으며, 이들을 서열 특이적인 뉴클레아제 (sequence-specific nuclease: SSN)라고 한다.
이 중에서 CRISPR/Cas 시스템은 박테리아의 고유 면역보호 시스템이 외부 유전물질을 분쇄하는 원리를 이용한 시스템으로, Cas 엔도뉴클레아제 단백질이 가이드 RNA 분자와 복합체를 형성하고, 가이드 RNA:게놈 DNA 염기쌍 형성 규칙을 따라 표적 DNA 배열에 위치하게 되며, Cas 단백질이 표적 DNA 배열에 포함된 PAM (protospacer-adjacent motif) 서열을 인지함으로써 원하는 DNA 서열을 정확하게 잘라낼 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 ZFN 또는 TALEN과 비교하여 유전자 교정의 정확도와 적용가능 범위가 매우 넓다.
유전자 교정의 특징은 특이적인 DNA 서열을 절단하기 위한 엔도뉴클레아제로서 작용하여, DNA 이중 가닥 절단 (double strand break: DSB)을 형성할 수 있다는 것이다. DSB는, DNA 손상을 복구하기 위해, 세포의 고유 복구 기전인 비-상동적인 말단 연결 (non-homologous end joining: NHEJ) 및 상동적인 재조합 (homologous recombination: HR)을 활성화할 수 있으며, 이에 의해 부위-특이적인 돌연변이가 생길 수 있다. 특히, NHEJ은 오류 발생이 쉬운 수리 기전이기 때문에 DSB가 일어난 부위에서 작은 크기의 삽입/결실 (insertion/deletion: indel 돌연변이)이 일어날 수 있으며, 프레임-이동 (frame-shift) 돌연변이를 유발하여 유전자 변이를 일으킬 수 있다. 현재, 유전자 교정 기술들은 식물 유전자를 변형하기 위해 일부 식물들 (예, 벼, 애기장대, 옥수수, 밀)에 적용되고 있으나, 유전자 교정 효율은 낮은 편이다.
현재 유전자 교정 식물은 원형질체 또는 식물 조직(예, 캘러스)을 활용하여 재분화 과정을 통해 생산한다. 종래 식물의 원형질체의 분리는 잎, 뿌리 또는 종자 등 식물의 발달 시기에 관계없이 불특정 조직을 사용하였으며, 셀룰라아제 (cellulase) 또는 마세로자임(macerozyme) 등의 세포벽 분해 효소를 처리하여 세포벽을 분해함으로써 원형질체를 분리하였다. 그러나 이에 의한 원형질체의 분리 효율은 매우 낮거나 원형질체의 크기가 균일하지 않은 문제가 있었다 (Kim, H.　et al., Nat. Commun.　8, 14406 doi: 10.1038/ncomms14406 (2017)).
또한, 식물의 유전자 교정을 위해서는 CRISPR/Cas 시스템과 같은 서열 특이적인 뉴클레아제를 식물에 도입하는 것이 필수적인데, 현재 서열 특이적인 뉴클레아제를 식물에 도입하는 방법으로는, 통상적인 형질전환 방식으로(예, 아그로박테리움-매개 형질전환법, 유전자총, 화학적 전달, 주입 등) 서열 특이적인 뉴클레아제를 발현하는 발현 벡터 또는 DNA 단편을 세포 내로 전달하여 식물 염색체에 통합하는 방법과, 서열 특이적인 뉴클레아제를 일시적 발현을 통해(즉, 염색체에 통합되지 않음) 전달하는 방법과, 미리 조립된 Cas9 단백질-gRNA의 RNP (ribonucleoprotein)를 전달하는 방법 등이 있다. 그러나 이들 중 어떤 방법이 유전자 교정 효율 증대에 효과적인지에 대한 구체적인 비교 연구는 제시된 바 없다.
따라서, 식물의 원형질체를 고순도로 분리하고 이를 식물의 유전자 교정에 사용하여 종국적으로 유전자 교정 효율을 높이고 유전자 교정 식물체를 생산할 수 있는 기술의 개발이 요구된다.
국내특허공개 10-2018-0029092 (2018.03.19 공개)
이에, 본원에서는 발명은 식물의 원형질체를 고순도로 분리하고 이를 이용하여 높은 효율로 식물의 유전자를 교정하는 방법 및 유전자 교정 식물체를 생산하는 방법을 제공한다.
일예로, 본 발명은 식물의 잎에서 원형질체를 분리하는 단계; 상기 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated system) 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 식물의 유전자 교정 효율이 증대된, 식물의 유전자 교정 방법을 제공한다.
다른 예로, 본 발명은 식물의 잎에서 원형질체를 분리하는 단계; 상기 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 유전자 교정 효율이 높은 가이드 RNA를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
다른 예로, 본 발명은 콩으로부터 원형질체를 분리하는 단계; 상기 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 유전자 교정 효율이 증대된, 콩의 유전자 교정 방법을 제공한다.
다른 예로, 본 발명은 콩으로부터 원형질체를 분리하는 단계; 상기 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 식물의 유전자 교정 효율이 증대된, 유전자 교정 효율이 높은 가이드 RNA를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
다른 예로, 본 발명은 유전자 교정 방법을 사용하여, 고효율로 유전자 교정 식물체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 측면에 따라, 식물의 잎에서 원형질체를 분리하는 단계; 상기 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated system) 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 식물의 유전자 교정 효율이 증대된, 식물의 유전자 교정 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 식물의 잎에서 원형질체를 분리하는 단계; 상기 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 유전자 교정 효율이 높은 가이드 RNA를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
일 구현예로, 상기 식물의 잎에서 원형질체를 분리하는 단계는,
(a) 원형질체가 식물의 잎에서 50% 이상의 분리 효율로 분리되거나,
(b) 원형질체가 식물의 잎으로부터 1 X 106/0.1g 이상의 수득량으로 분리되거나,
(c) 원형질체가 식물의 잎으로부터 30 μm 이하의 크기로 분리되거나,
(d) 원형질체가 균일한 크기로 분리되거나,
(e) 원형질체가 식물의 잎의 생육단계 중 V2 단계 또는 V3 단계의 잎으로부터 분리되거나, 또는
(f) 상기 (a) 내지 (e) 중 하나 이상일 수 있다.
일 구현예로, 상기 식물은 콩일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 콩으로부터 원형질체를 분리하는 단계; 상기 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 유전자 교정 효율이 증대된, 콩의 유전자 교정 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 콩으로부터 원형질체를 분리하는 단계; 상기 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함하는, 식물의 유전자 교정 효율이 증대된, 유전자 교정 효율이 높은 가이드 RNA를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
일 구현예로, 상기 콩으로부터 원형질체를 분리하는 단계는,
(a) 원형질체가 콩의 잎에서 분리되거나,
(b) 원형질체가 콩의 잎에서 50% 이상의 분리 효율로 분리되거나,
(c) 원형질체가 콩의 잎으로부터 1 X 106/0.1g 이상의 수득량으로 분리되거나,
(d) 원형질체가 콩의 잎으로부터 30 μm 이하의 크기로 분리되거나,
(e) 원형질체가 균일한 크기로 분리되거나,
(f) 원형질체가 콩의 잎의 생육단계 중 V2 단계 또는 V3 단계의 잎으로부터 분리되거나, 또는
(g) 상기 (a) 내지 (f) 중 하나 이상일 수 있다.
한편, 상기 방법들에 공통적으로 적용가능한 구현예로, CRISPR/Cas 는 Cas9 및 가이드 RNA 를 포함하되, Cas9 은 DNA, RNA 또는 단백질 형태로 포함되고 가이드RNA는 DNA 또는 RNA 형태로 포함되며, CRISPR/Cas 는 ssODN(Single-strand oligodeoxynucleotide) 을 더욱 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
상기 방법들에 공통적으로 적용가능한 다른 구현예로, CRISPR/Cas 의 도입은, Cas9을 코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 를 포함하는 벡터를 도입하거나, Cas9 단백질과 가이드 RNA가 미리 조립된 Cas 단백질-가이드 RNA RNP (ribonucleoprotein)를 도입하거나, Cas9 RNA 및 가이드 RNA 를 도입하는 것을 포함한다.
상기 방법들에 공통적으로 적용가능한 다른 구현예로, CRISPR/Cas 도입에 이용되는 벡터는 염색체 통합용 벡터 (integration vector) 또는 일시적 발현용 벡터(transient vector)일 수 있다.
상기 방법들에 공통적으로 적용가능한 다른 구현예로, 상기 Cas9 은 야생형 Cas9 또는 효율이 개선된 개량 Cas9일 수 있다.
상기 방법들에 공통적으로 적용가능한 다른 구현예로, 상기 방법은 유전자가 교정된 원형질체를 재생시켜 유전체 교정 식물체를 제조하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
상기 방법들에 공통적으로 적용가능한 다른 구현예로, 상기 가이드 RNA가, crRNA 및 tracrRNA (trans-activating CRISPR-derived RNA) 간의 부분적인 염기-쌍 형성에 의해 형성되는 2차 구조 (secondary structure)를 가진 RNA이거나, sgRNA(single guide RNA) 이거나, 둘 다이며; 상기 crRNA는 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 RNA 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상술한 유전자 교정 방법을 사용하여, 고효율로 유전자 교정 식물체를 생산하는 방법이 제공된다.
이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본원에서, "유전자 교정 (genome editing)"이란, 표적 유전자의 표적 부위에서 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환, 중복, 역위 등에 의해 변이를 도입하거나 유전자 기능을 상실, 변경, 및/또는 회복(수정) 시키는 것을 의미하기 위하여 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 CRISPR/Cas 를 이용하여 표적 유전자의 원하는 위치에서의 절단, 또는 절단 및 변이를 통해 식물체 내 표적 유전자를 교정하는 방법과 관련된다.
또한, 본원의 일 실시예에 따르면, 같은 표적 유전자라 하더라도 sgRNA 의 위치에 따라서 유전자 교정 효율이 달라질 수 있으므로, 본원에서 제공하는, 식물의 원형질체를 고순도로 분리하고 이를 이용하여 식물의 유전자를 교정하는 기술을 적용하여, 유전자 교정 효율이 높은 가이드 RNA (예를 들어, sgRNA)를 효과적으로 스크리닝할 수 있다.
본원에서 제공하는 유전자 교정 방법 또는 유전자 교정 효율이 높은 가이드 RNA를 스크리닝하는 방법은, 식물의 잎에서 원형질체를 분리하는 단계를 포함한다.
본원의 비-제한적인 일 예로, 식물의 잎에서 원형질체를 분리하는 단계에서, 원형질체는 식물의 잎에서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 분리 효율로 분리될 수 있다. 여기에서 백분율(%)은 잎에서 분리된 전체 세포 중의 원형질체의 비율을 의미한다. 본원에 따르면 상기와 같이 원형질체를 고순도로 분리하고 이를 유전자 교정에 적용함으로써 궁극적으로 유전자 교정 효율을 높일 수 있다.
비-제한적인 다른 예로, 원형질체는 식물의 잎으로부터 1 X 106/0.1g 이상의 수득량으로, 또는 1 X 106/0.1g 내지 6 X 106/0.1g 또는 1 X 106/0.1g 내지 5 X 106/0.1g 의 수득량으로 분리될 수 있다.
비-제한적인 다른 예로, 원형질체는 식물의 잎으로부터 30 μm 이하의 크기로, 또는 10 내지 30 μm 의 크기로 분리될 수 있다.
비-제한적인 다른 예로, 상기 원형질체는 균일한 크기로 분리될 수 있다. 예를 들어, 분리된 원형질체의 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상이 균일한 크기를 가지는 것일 수 있다.
비-제한적인 다른 예로, 원형질체는 식물의 잎의 생육단계 중 V2 단계 또는 V3 단계의 잎으로부터 분리될 수 있다.
식물의 잎의 생육단계는 다음과 같다(콩을 예로 들어 설명함):
VE 단계: 종자를 심은 후 1~2주 후 상태, 토양으로부터 떡잎이 올라옴
VC 단계: 떡잎이 활짝 피며, 그 위로 한마디가 자라나고 외엽이 생성됨
V1 단계: 첫번째 외엽으로부터 한마디가 생성 되어 3개의 잎이 생성됨
V2 단계: V1 단계에서 한마디가 더 생성되어 3개의 잎이 생성됨
V3 단계: V2 단계에서 한마디가 더 생성되어 3개의 잎이 생성됨
V4 단계: V3 단계에서 한마디가 더 생성되어 3개의 잎이 생성됨
V5 단계: V4 단계에서 한마디가 더 생성되어 3개의 잎이 생성됨
R1 단계: 꽃이 피기 시작하는 상태
R2 단계: 꽃이 활짝 핀 상태
R3 단계: 콩깍지 생성을 시작하는 상태
R4 단계: 콩깍지 생성이 완료된 상태
R5 단계: 콩깍지 안에 콩이 생성 되기 시작하는 상태
R6 단계: 콩깍지 안에 녹색의 콩이 생성 완료된 상태
R7 단계: 콩깍지와 콩이 성숙하여 노란색으로 변해 가는 상태
R8 단계: 잎 떨어지면서 콩깍지와 콩이 완전히 노란색으로 변한 상태
본원의 일 실시예에 따르면, 식물의 잎의 생육단계 중 V2 단계 또는 V3 단계의 잎으로부터 원형질체를 분리한 경우, 다른 단계의 잎에 비하여 작고 크기가 균일하며 95% 이상의 높은 순도로 원형질체의 분리가 가능하였다.
다른 측면에서, 본원에서 제공하는 유전자 교정 방법 또는 유전자 교정 효율이 높은 가이드 RNA를 스크리닝하는 방법은, 콩으로부터 원형질체를 분리하는 단계를 포함한다.
본원의 비-제한적인 일 예로, 콩의 잎에서 원형질체를 분리하는 단계에서, 원형질체는 콩의 잎에서 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 분리 효율로 분리될 수 있다. 여기에서 백분율(%)은 잎에서 분리된 전체 세포 중의 원형질체의 비율을 의미한다. 현재까지 콩의 잎에서 50% 이상의 높은 분리 효율로 원형질체를 분리한 예는 보고된 바 없으며, 본원에 따르면 상기와 같이 원형질체를 고순도로 분리하고 이를 유전자 교정에 적용함으로써 궁극적으로 유전자 교정 효율을 높일 수 있다.
비-제한적인 다른 예로, 원형질체는 콩의 잎으로부터 1 X 106/0.1g 이상의 수득량으로, 또는 1 X 106/0.1g 내지 6 X 106/0.1g 또는 1 X 106/0.1g 내지 5 X 106/0.1g 의 수득량으로 분리될 수 있다.
비-제한적인 다른 예로, 원형질체는 콩의 잎으로부터 30 μm 이하의 크기로, 또는 10 내지 30 μm 의 크기로 분리될 수 있다.
비-제한적인 다른 예로, 상기 원형질체는 균일한 크기로 분리될 수 있다. 예를 들어, 분리된 원형질체의 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상이 균일한 크기를 가지는 것일 수 있다.
비-제한적인 다른 예로, 원형질체는 콩의 잎의 생육단계 중 V2 단계 또는 V3 단계의 잎으로부터 분리될 수 있다.
또한, 비-제한적인 구체예로, 본원에서 제공하는 유전자 교정 방법 또는 유전자 교정 효율이 높은 가이드 RNA를 스크리닝하는 방법은, 식물의 잎에, 비스코자임(viscozyme), 셀루클라스트(celluclast) 및 펜티넥스(pectinEX) 의 혼합용액을 처리하여 원형질체를 분리할 수 있다. 비스코자임은 셀룰라아제, 베타글루카나제 및 자일란라제가 주성분인 상용 효소이고 (예, Viscozyme L, Novozymes Co. 덴마크), 셀루클라스트는 셀룰라아제가 주성분인 상용 효소이며 (예, Celluclast 1.5L, Novozymes Co. 덴마크), 펜티넥스는 펙티나아제가 주성분인 상용 효소이다 (예, PectinEX Ultra Pulp, Novozymes Co. 덴마크). 비스코자임:셀루클라스트:펙티넥스는 약 1:0.5:0.5의 비율로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 구현예로, 식물의 잎은 콩의 잎이거나, V2 또는 V3 단계의 잎이거나, 또는 콩의 V2 또는 V3 단계의 잎일 수 있다.
본원에서 제공하는 유전자 교정 방법 또는 유전자 교정 효율이 높은 가이드 RNA를 스크리닝하는 방법은 또한, 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함한다.
CRISPR/Cas 는 Cas9 및 가이드 RNA 를 포함하되, Cas9 은 DNA, RNA 또는 단백질 형태로 포함되고 가이드RNA는 DNA 또는 RNA 형태로 포함되며, CRISPR/Cas 는 ssODN(Single-strand oligodeoxynucleotide) 을 더욱 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
예를 들어, CRISPR/Cas 의 도입은, Cas9을 코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 를 포함하는 벡터를 도입하거나, Cas9 단백질과 가이드 RNA가 미리 조립된 Cas 단백질-가이드 RNA RNP (ribonucleoprotein)를 도입하거나, Cas9 RNA 및 가이드 RNA 를 도입하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 기술상식에 따라 당업자가 적절한 도입 수단을 선택할 수 있다.
분리된 원형질체에 Cas9 및 가이드 RNA 를 벡터를 이용하여 도입하는 경우, 상기 벡터는 외인성 유전자를 식물 염색체에 통합시킬 수 있는 염색체 통합용 벡터 (integration vector)이거나, 외인성 유전자의 일시적 발현을 유도하는 (즉, 염색체에 통합되지 않음) 일시적 발현용 벡터(transient vector)일 수 있다. 좀더 바람직하게는 일시적 발현용 벡터(transient vector)일 수 있으며, 통상적인 형질전환 방식으로(예, 유전자총, 화학적 전달, 주입 등) 식물 원형질체에 전달될 수 있다. 일시적 발현용 벡터의 경우 염색체 통합에 필요한 구성요소들이 빠져 있으므로 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 염색체 통합이 되지 않으며, 염색체 통합용 벡터에 비해 벡터의 크기가 더 작기 때문에 원형질체로의 도입 및 유전자 교정 효율이 보다 높아지는 장점이 있다. 또한 궁극적으로 원형질체 재분화를 통해 식물체를 생산하는 경우 염색체 통합이 필요하지 않기 때문에 사이즈가 보다 작은 일시적 발현용 벡터 또는 Cas9 RNP 사용이 좀더 바람직한 양태로 제시되나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본원에서는 식물의 표적 유전자에 특이적인 CRISPR/Cas9 뉴클레아제를 발현하기 위하여, Cas9 단백질을 발현하고 가이드 RNA (gRNA)를 전사하기 위한 벡터를 사용할 수 있다.
여기에서 "표적 유전자"란, 유전자 교정의 대상이 되는 식물 유전체 내의 DNA를 말한다. 표적 유전자의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 코딩 영역 및 논코딩 (non-coding) 영역을 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자는 GmFT2a, DDM1, GmPDS, AtBRI1, 또는 AtPDS3 유전자일 수 있으나, 본원의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서의 유전자 교정에 의하여 표적 유전자의 표적 부위에 삽입, 결손 및/또는 치환 등의 부위-특이적 변형이 발생하면서, 유전자의 기능이 상실되거나 또는 기능 획득이나 변경이 발생될 수 있다.
"Cas9" 은 CRISPR/Cas 시스템에서 활성화된 엔도뉴클레아제로서, 가이드 RNA가 인도하는 특정 표적 DNA에 결합함으로써 표적 유전체의 이중 가닥 절단(double strand break: DSB)을 일으킬 수 있다. DSB는 세포 내에서 상동적인 재조합 (homologous recombination) 또는 비-상동적인 말단 연결 (non-homologous end-joining, NHEJ) 기작에 의해 효율적으로 수선되는데 이 과정에 연구자가 원하는 변이를 표적 장소에 도입할 수도 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 표적 유전자의 표적 위치에 이중 가닥 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입/결실(insertion/deletion, indel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ 기작에 의해 유전자를 교정할 수 있다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 DNA의 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM(protospacer adjacent motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 DNA의 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.
Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. Cas9 단백질은 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법으로 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 상기 Cas9 단백질은 진핵세포의 핵 내 전달을 위하여 통상적으로 사용되는 요소 (예컨대, 핵위치신호(nuclear localization signal; NLS) 등)를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속, 네이세리아(Neisseria) 속, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캄필로박터 속 (Campylobacter) 속 유래의 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 Cas9 은 야생형의 Cas9 (wtCas9) 또는 유전자 교정 효율이 개선된 개량된 Cas9일 수 있다. 이러한 개량 Cas9의 비-제한적인 예시로는, 특이성을 증가시킨, enhanced S. pyogenes Cas9 (eSpCas9) 또는 Hi-fidelity S. pyogenes Cas9 (SpCas9-HF) 등을 들 수 있다 [Slaymaker et al., (2016) Science 351(6268): 84-88; 및 Kleinstiver et al., (2016) Nature 529(7587): 490-495 참조]. eSpCas9 로는 SpCas9(K855A), SpCas9(K810A/K1003A/R1060A) (eSpCas9 1.0 라고도 함), 또는 SpCas9(K848A/K1003A/R1060A) (eSPCas9 1.1 라고도 함) 등의 변이체를 예시할 수 있고, SpCas9-HF 로는 SpCas9-HF1 (N497A/R661A/Q695A/Q926A), SpCas9-HF2 (N497A/R661A/Q695A/Q926A/D1135E), SpCas9-HF3 (L169A/N497A/R661A/Q695A/Q926A), 또는 SpCas9-HF4 (Y450A/N497A/R661A/Q695A/Q926A) 등의 변이체를 예시할 수 있다. 이들 eSpCas9와 SpCas9-HF 은 Cas9을 구조적으로 변화시킴으로써 특이성을 증가시켰는데, 야생형 Cas9과 비교하여 원하는 표적 절단의 활성을 유지하거나 활성은 조금 떨어지지만 오프타겟 효과는 현저히 줄어드는 것으로 알려져 있다.
또한 본원의 유전자 교정 관련 기술은 일반적인 CRISPR/Cas 뿐만 아니라, 이를 변형한 다양한 형태의 CRISPR/Cas 에도 적용될 수 있다. 예를 들어, Base Editor (BE 또는 염기교정 유전자가위)는 기존 CRISPR/Cas9의 가이드 RNA를 이용한 시스템은 그대로 이용하면서, DNA의 한 쪽 가닥을 자르는 nCas9 (nickase Cas9) 및 탈아미노효소(deaminase) 를 포함하여, 유전자 삽입/결실(insertion/deletion, indel)을 유도하는 기존 CRISPR/Cas9 시스템과는 달리 단일 염기 치환만이 가능한 특징이 있다. Base Editor (BE)의 예로, Cytosine Base Editor (CBE)는 nCas9와 사이토신을 분해하는 사이티딘 탈아미노효소 (cytitdine deaminase)로 구성되는데, nCas9으로 잘려진 DNA 한 가닥에서 탈아미노효소가 시토신(C)을 우라실(U)로 바꾸면, 우라실(U)로 바뀐 염기는 DNA 복구 과정에 의해 티민(T)이 되는 원리로 작동한다. 그리고 CBE에 UGI (uracil glycosylase inhibitor)를 함께 더하면 DNA에 존재하는 우라실을 교정하기 위한 base-excision repair 작용이 저해되어 교정성공률이 더 향상될 수 있다. Base Editor (BE)의 다른 예로, Adenine Base Editor (ABE)는, nCas9와 아데노신 탈아미노효소 (adenosine deaminase)로 구성되며, 아데닌(A)을 구아닌(G)으로 치환한다. 본원의 일 실시예에 따르면, 유전자 삽입/결실(insertion/deletion, indel)을 유도하는 기존 CRISPR/Cas9 시스템 뿐만 아니라, 단일 염기 치환을 유도하는 Base Editor 역시 본원의 방법에 적용되어 효과적으로 유전자 교정을 달성할 수 있음을 확인하였다 (도 12 참조).
"가이드 RNA(guide RNA)"는, 일반적으로 Cas9 단백질에 결합할 수 있고 Cas9 단백질을 표적 유전자 (예를 들어, DNA)내의 특정 위치에 표적화하는 것을 도울 수 있는 RNA 분자(또는 집합적으로 RNA 분자들의 그룹)를 지칭할 수 있다. 가이드 RNA 는 표적 유전자의 서열의 전부 또는 일부와 혼성화하고, 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하기에 충분한, 표적 유전자 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
가이드 RNA는, crRNA 및 tracrRNA (trans-activating CRISPR-derived RNA) 간의 부분적인 염기-쌍 형성에 의해 형성되는 2차 구조 (secondary structure)를 가진 RNA이거나, sgRNA(single guide RNA)이거나, 둘 다일 수 있으며, 상기 crRNA는 상기 표적 유전자 부위에 상보적으로 결합할 수 있는 RNA 단편을 포함한다. 또한, 상기 가이드 RNA를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터는, crRNA 및 tracrRNA를 각각 전사하기 위한 2종의 벡터를 포함하는 것일 수 있다. 또 sgRNA 는 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분의 융합으로 제조된 것이다. sgRNA는 crRNA의 타겟팅 서열 부위와 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부위와 상기 Cas9의 tracrRNA의 필수적 부위를 포함하는 tracrRNA 부위가 서로 결합된 이중 가닥 RNA 분자에서 crRNA 부위의 3' 말단과 tracrRNA 부위의 5' 말단이 뉴클레오타이드 링커를 통하여 연결된 헤어핀 구조를 갖는 것일 수 있다.
또한, 가이드 RNA를 전사하기 위한 벡터에서, 가이드 RNA의 코딩 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시하기 위한 프로모터로서 U6 프로모터 또는 U3 프로모터를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, Cas9 단백질을 발현하기 위한 유전자와 가이드 RNA를 전사하기 위한 유전자는 하나의 벡터에 존재할 수도 있고, 각각의 벡터에 존재할 수도 있다. 또한, 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA일 수 있으며, 가이드 RNA를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터는, crRNA 를 전사하기 위한 유전자 및 tracrRNA를 전사하기 위한 유전자가 하나의 벡터에 존재할 수도 있고, 각각의 벡터에 존재할 수도 있으며, 또는 sgRNA 를 포함할 수 있다.
본원에서, 벡터는 CRISPR/Cas 시스템이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 벡터는, 해당 유전자가 선택된 숙주 내에서 발현될 수 있도록 하는 전사 및 해독 발현 조절 서열을 포함한다. 발현 조절 서열로는, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및/또는 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 또한 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 그 외에, 인핸서, 목적하는 유전자의 3' 말단의 비번역영역, 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커), 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다.
벡터 내의 각 구성요소는 서로 작동 가능하게 연결되어야 하며, 이들 구성요소 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행될 수 있고, 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하여 수행될 수 있다.
벡터의 도입은 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 이용하여 수행할 수 있고, 예를 들어, 아그로박테리움-매개 형질전환법, 유전자총, 미세주입법 (microinjection), 전기천공법 (electroporation), DEAE-덱스트란 처리, 리포펙션 (lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 및 PEG-매개 형질주입 등을 예시할 수 있다. 바람직하게는, PEG-매개 형질주입을 이용할 수 있다.
한편, 본원에서 제공하는 식물의 유전자 교정 방법에서, Cas9 단백질과 가이드 RNA는 미리 조립된 Cas 단백질-가이드 RNA RNP (ribonucleoprotein)를 도입하여 유전자를 교정할 수 있다. 이와 같이 RNP를 원형질체에 도입하는 것은, 벡터 시스템과 같은 세포 내 발현 시스템을 이용하지 않고, Cas 단백질 및 가이드 RNA를 직접 원형질체에 도입하는 것을 특징으로 한다.
여기에서, Cas 단백질 및 가이드 RNA를 RNP 형태로 원형질체에 도입하는 것은 유전자총, 미세주입법 (microinjection), 전기천공법 (electroporation), DEAE-덱스트란 처리, 리포펙션 (lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 및 PEG-매개 형질주입 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. Cas 단백질은 가이드 RNA와의 복합체의 형태 또는 독립된 형태로 세포 안으로 전달될 수 있다.
본 발명이 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않으며, 단자엽 또는 쌍자엽 식물을 포함한다. 또한 초본 또는 목본 식물을 포함한다. 구체 예로, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 콩을 예시할 수 있다.
일구체예로, 콩은 그 종류에 제한이 없으나, 예를 들어 서리태 (Seoritae, Glycin max MERR), 서목태 (Seomoktae, Rhynchosia Nolubilis), 흑태 (Black soybean, Glycine max(L.) Merr.), 청태 (blue bean, Glycime max MERR ), 황태 (yellow bean, Glycime max MERR), 울타리콩 (field bean, Vicia faba), 강낭콩 (kidney bean, Phaseolus vulgaris), 얼룩강낭콩 (pinto bean, Phaseolus vulgaris L.), 적두 (small red bean, Vigna angularis), 거두 (small black bean, Phaseolus angularis W.F. WIGHT. ), 콩나물콩 (sprouting bean, Glycine max (L.) Merr.) 또는 대두 (soybean, Glycine max)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 유전자 교정 방법 또는 유전자 교정 효율이 높은 가이드 RNA를 스크리닝하는 방법은, 유전자가 교정된 원형질체를 재생시켜 유전체 교정 식물체를 제조하는 단계를 더욱 포함할 수 있으며, 따라서 고효율로 유전자 교정 식물체를 생산하는 방법이 또한 제공될 수 있다.
유전체가 교정된 식물 원형질체를 재생(재분화)시켜 유전체 교정 식물체를 제조하는 것은, 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나 식물 원형질체를 배양하여 캘러스 (callus)를 형성시키는 단계, 및 상기 캘러스를 추가적으로 배양하여 재생된 식물체를 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다
캘러스 형성 단계 및 캘러스로부터 재생된 식물체를 제조하는 단계에서 사용되는 배지 조성은 식물의 종류 및 상태에 따라 당업자에 의해 적절하게 수행될 수 있으며, 이러한 배양 조건은 당업계에 공지된 기술을 이용할 수 있다.
본 발명은 식물의 원형질체를 고순도로 분리하고 이를 식물의 유전자 교정에 사용하여 유전자 교정 효율을 높일 수 있으며, 종국적으로 유전자 교정 식물 생산의 효율을 증대시킬 수 있다.
도 1은 본원의 일 실시예에서 콩의 조직별 원형질체 분리 결과를 나타낸다.
도 2는 본원의 일 실시예에서 콩 잎의 발달 단계별 원형질체 분리 결과를 나타낸다.
도 3은 본원의 일 실시예에서 콩 잎의 발달 단계별 원형질체 분리 효율을 나타낸다.
도 4은 본원의 일 실시예에서 콩 잎의 발달 단계별 원형질체의 수득량을 나타낸다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른, 벡터 크기별 원형질체로의 형질전환 효율을 나타낸다.
도 6는 본원의 일 실시예에 따른, 벡터 종류별 유전자 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7는 본원의 일 실시예에 따른, RNP 유전자가위 도입을 통한 유전자 교정효율을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른, 개량 유전자가위를 활용한 식물 유전자 교정 효율 증대를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9은 본원의 일 실시예에 따른, sgRNA 길이 및 scaffold 에 따른 식물 유전자 교정 효율 증대를 확인한 결과를 나타낸다.
도 10는 본원의 일 실시예에 따른, sgRNA 염기서열에 따른 식물 유전자 교정 효율 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따른, RNP 유전자가위 도입을 통한 애기장대 유전자 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸다.
도 12은 본원의 일 실시예에 따른, Base editor를 활용한 단일 염기 치환 유전자 교정 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 콩 원형질체의 분리
콩 조직에서 분리되는 원형질체의 형태를 비교하기 위해 잎과 미성숙 종자에서 각각 원형질체 분리하였다. 잎 조직을 얻기 위해 콩 종자를 원예용 상토 (100 mg 상토 + 0.1 g 오스모코트/1 화분)에 심은 후 식물 생장 챔버 (빛 조건 8시간, 광도 250 umolm-2s-1, 온도 25℃, 상대습도 50%)에서 발아 및 생육하였다. 잎을 발달 단계별로 (VC, V1, V2, V3 단계) 채취하여 락스로 20분 동안 소독한 후 3차 증류수로 5회 세척하였다. 잎은 양끝을 잘라내고 칼집을 내어주었다. 칼집낸 잎은 효소용액(1% 비스코자임(viscozyme), 0.5% 셀루클라스트(celluclast), 0.5% 펜티넥스(pectinEX), 1X CPW A, 1X CPW B, 9% Mannitol, 5mM MES, pH5.8)에 넣고 30분동안 진공처리 후, 25℃에서 IKA 3D rocker를 이용하여 30rpm 으로 교반하였다. 상기 혼합 용액을 40 ㎛ nylon mesh로 여과하고, W5 용액(154mM NaCl, 125mM CaCl2.2H2O, 5mM KCl, 5mM glucose, 1.5mM MES, pH5.8)을 첨가하였다. 여과된 용액은 700 rpm으로 7분 동안 원심분리하고, W5 용액을 넣어 동일한 방식으로 한번 더 세척하였다. W5 용액에 원형질체를 재현탁한 후, 4℃에서 1 시간 이상 보관하였다. 원형질체 용액은 700 rpm으로 7분 동안 원심분리하고, W5 용액에 재현탁한 후 세포 수를 측정하여 수득량을 계산하였다.
미성숙 종자(immature seed)는 인공생육실 (16시간 빛 조건, 광도 600 umolm-2s-1, 온도 25℃, 상대습도 50%)에서 재배된 콩 종자 중 발달 시기 R5~R6 단계의 미성숙 꼬투리(bean pod)로부터 미성숙 종자를 채취하였다. 이후 원형질체 분리 방법은 상술한 잎 조직에서 원형질체를 분리하는 방법과 동일하다. 원형질체는 형질전환에 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 2. 유전자 교정용 벡터의 제작
유전자 교정용 벡터는 Merck사의 p53와 p61을 사용하였으며 sgRNA 발현을 위해 애기장대 U6-26 promoter하에 AarI site와 sgRNA 염기서열을 EcoRI 과 HindIII 위치에 삽입하였다. 염색체 통합용 벡터 (integration vector)는 XbaI과 EcoRI site 사이에 PCR로 증폭한 LB-Nos terminator-Phosphothiothricin 저항성 유전자-Nos promoter를 삽입하였다.
Cytosine Base Editor (CBE) 발현용 벡터는 Cas9 발현용 벡터의 NheI과 AgeI 위치 사이에 PCR로 증폭한 Cas9 D10A 돌연변이를 도입한 후, NheI으로 선형화하여 사이티딘 탈아미노효소 (cytidine deaminase)를 Gibson assembly로 삽입하였다. 그 후 BE3와 BE4를 만들기 위하여 BglII로 선형화하여 한 개 또는 두 개의 UGI (uracil glycosylase inhibitor) 유전자를 Gibson assembly로 삽입하였다. Adenine Base Editor (ABE) 발현용 벡터는 Cas9 발현용 벡터의 NheI과 AgeI 위치 사이에 PCR로 증폭한 Cas9 D10A 돌연변이를 도입한 후, NheI으로 선형화하여 아데노신 탈아미노효소 (adenosine deaminase)를 Gibson assembly로 삽입하였다.
일시적 발현용 벡터(transient vector)로서 Transient-GFP 벡터(10.3 kb)는 T2A를 활용하여 Cas9과 GFP를 연결하였다. T2A는 프라이머 주문 후 ligase chain reaction을 통해 합성하였고, GFP는 PCR을 통해 확보하였으며 벡터는 XmaI과 BglII로 선형화한 후 EZ-fusion cloning core kit(엔지노믹스)를 사용하여 연결하였다. 표적 특이적인 유전자 교정 벡터는 AarI위치에 타겟 시퀀스를 가진 sgRNA 올리고(표 1 참고)를 삽입하여 제작하였다. Cas9 단백질 정제용 벡터는 PX458(GenScript)의 Cas9을 증폭하고 pET28a(+)를 NcoI 과 NheI으로 선형화하여 Gibson assembly로 제작하였다.
타겟 유전자별 sgRNA 서열(밑줄은 PAM 서열을 나타냄)
GmFT2a-SP1 GTAGGGATCCTCTCGTTGTTGGG (서열번호 1)
GmFT2a-sg2-1 ACAAGTTGTCAACCAACCAAGG (서열번호 2)
GmFT2a-SP2 CACAAGTTGTCAACCAACCAAGG (서열번호 3)
11gDDM1 GGAAGAGGAGGTACAGTGTGAGG (서열번호 4)
GmPDS-D7 GAAGCAAGAGACGTTCTAGGTGG (서열번호 5)
AtBRI1-1 TTTGAAAGATGGAAGCGCGGTGG (서열번호 6)
AtPDS3 GAACAACGAGATGCTGACATGG (서열번호 7)
GmFT2a-sg3 ACCAACCAAGGGTAAATATCGG (서열번호 8)
GmFT2a-sg4 ACCGATATTTACCCTTGGTTGG (서열번호 9)
GmFT2a-sg5 AACCAAGGGTAAATATCGGTGG (서열번호 10)
GmFT2a-sg6 CACCACCGATATTTACCCTTGG (서열번호 11)
GmBE1 AGCTTCTCGAGCCAGGGGTAGG (서열번호 12)
GmBE2 GATAATGCAATCCAATGTAAGG (서열번호 13)
실시예 3. Cas9 단백질의 분리
Escherichia coli BL21(DE3) STAR (ThermoFisher)에 His 태그가 결합된 Cas9 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 형질전환한 후, 1mM IPTG를 첨가하여 Cas9 단백질을 발현하였다. 위 배양액은 원심분리하여 세포를 회수한 후 용해 완충액(50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 20 % glycerol, 1 % Triton x-100, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM Lysozyme(pH 8.0))으로 재현탁시키고, 음파 파쇄하여 용해시켰다. 분리된 상층액은 니켈 레진을 이용한 친화성 크로마토그래피 방법(Histrap HP column, GE Healthcare)을 이용하여 저장용 완충액(20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 50 % glycerol, 0.1 mM EDTA 및 1 mM DTT (pH 7.5))으로 버퍼 교체 후, 원심 여과기(Millipore, UFC905024)를 이용해 농축했다.
실시예 4. 가이드 RNA의 합성
atBRI1와 GmPDS-D7유전자를 타겟팅하는 sgRNA는 in vitro transcription (T7 promoter)를 이용하여 제작하였다. In vitro transcription을 위해 template는 Q5 polymerase (NEB)를 사용하여 각 RNA에 대응하는 올리고머(표2 참조)를 annealing 및 extension 하여 준비하였다. 이 후 준비된 template를 T7 RNA polymerase (NEB) reaction 혼합물에 넣어 sgRNA를 제작하였다. 제작된 sgRNA는 RNA Mini kit (Qiagen)을 이용하여 정제하였다.
atBRI1-1_F GAAATTAATACGACTCACTATAgTTTGAAAGATGGAAGCGCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG (서열번호 14)
GmPDS-D7_F GAAATTAATACGACTCACTATAGAAGCAAGAGACGTTCTAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG (서열번호 15)
sgRNA_R AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC (서열번호 16)
실시예 5. 원형질체로의 형질전환
분리 후 4℃ 에 보관된 원형질체는 700 rpm으로 7분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 MMG 용액 (0.4M Mannitol, 15mM MgCl2, 4mM MES, pH5.7)으로 재현탁한 후 1X105개의 원형질체 세포에 벡터(10㎍)를 혼합하였다. 동일 부피의 40% PEG용액(40% PEG4000, 0.2M Mannitol, 0.1M CaCl2)을 넣어 혼합한 뒤, 20분 동안 상온에서 인큐베이션 하였다. 혼합 용액의 2배 부피 W5 용액을 첨가하여 혼합한 후 700 rpm에서 7분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 마지막으로 1 m W5용액을 넣어 재현탁시켰다. 상기 원형질체를 암상태로 만들고, 25℃ 에서 24시간 에서 72시간 동안 인큐베이션 후 유전체 교정효율 및 GFP 발현을 확인하였다.
원형질체 내 RNP를 형질전환을 위해서는 Cas9 단백질이 포함된 저장용 완충액에 sgRNA를 1 : 3의 몰비율로 혼합한 다음, 저온에서 1시간 동안 보관 후 위와 동일한 방법으로 형질전환 하였다.
실시예 6. 식물 원형질체의 유전자 도입 및 유전자 교정 효율 분석
식물 원형질체로의 유전자 도입 효율을 확인하기 위해 형질전환된 원형질체를 700 rpm에서 7분 동안 원심분리한 후 Confocal을 이용하여 형광 및 원형질체 개수를 확인하여 유전자 도입 효율을 확인하였다.
식물 원형질체의 유전자 교정 효율 확인을 위해 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)을 이용하여 원형질체로부터 유전체 DNA를 분리하였다. 표적 위치의 유전자 교정을 확인하기 위해 앰플리콘 시퀀싱용 프라이머를 제작하였다. 1차 프라이머는 해당 chromosome만을 선택적으로 증폭시킬 수 있도록 제작하고 2차와 3차 프라이머는 5'말단에 인덱스와 어댑터 서열을 추가하여 제작하여 PCR 증폭으로 타겟 특이적인 앰플리콘 시퀀싱용 library를 제작하였다. 이후 Illumina miseq (V2, 300-cycle) 장비로 확보한 염기서열을 Cas Analyzer S/W로 Indel(Insertion and deletion)서열을 분석했다. 사용된 프라이머는 표 3에 나타내었다.
GmFT2a-SP1_F1 CACAATGGAATCGAGGCTA (서열번호 17)
GmFT2a-SP1_R1 GTCCACTTGAGAGGGTACT (서열번호18)
GmFT2a-SP1_F2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNGAGTATATAAGAAAG
CATAAGCC (서열번호 19)
GmFT2a-SP1_R2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNGTAGGTAACCCTCA
TAGGAAT (서열번호 20)
GmFT2a- SP2_F1 TGCACACTATCCCATGCCTA (서열번호 21)
GmFT2a- SP2_R1 TGAGATTGTTTGAATACAAAGTTAAAAG (서열번호 22)
GmFT2a- SP2_F2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNCTCTCGTTGTTGGGGGAGTA (서열번호 23)
GmFT2a- SP2_R2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNCAACAAAAAGAGTACTTGGACAAAA (서열번호 24)
11gDDM1_F1 CGATGATTCTACAGCGGA (서열번호25)
11gDDM1_R1 GTCATGTTCGTATCCTCAGT (서열번호 26)
11gDDM1_F2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNGAAGTGACTGCAGACATCA (서열번호 27)
11gDDM1_R2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNCTCCAGCAGAAACTCAGA (서열번호 28)
GmPDS-D7_18g_F1 AGACGCCACAATTTCGTTT (서열번호 29)
GmPDS-D7_18g_R1 GGCCTGTCTCGTACCAGT (서열번호 30)
GmPDS-D7_18g_F2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNTCAAATTATCGCAGGATTGG (서열번호 31)
GmPDS-D7_18g_R2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNTGAAAAGAAGGCGCACTAA (서열번호 32)
GmPDS-D7_11g_F1 CCAAATTCAGTTCTTCGGATG (서열번호 33)
GmPDS-D7_11g_R1 CGGGAAGGACATCGGGAA (서열번호 34)
GmPDS-D7_11g_F2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNGCATGTTTCATTATTGCAGGA (서열번호 35)
GmPDS-D7_11g_R2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNGCTAAAATAATGAGCAGAATGCA (서열번호 36)
AtBRI1-1_F1 ATTTGGGCTGATCCTTGTTG (서열번호 37)
AtBRI1-1_R1 TGTTGAACACCTGAAACTTT (서열번호 38)
AtBRI1-1_F2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNTCAATCTTGCTGCTTTCGAG (서열번호 39)
AtBRI1-1_R2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNTTCCCAATGGTTTCCATCTC (서열번호 40)
AtPDS3_F1 AACTGAACTCCGTTGTAGCA (서열번호 41)
AtPDS3_R1 AGCTCATCAACATGCTTACGAGA (서열번호 42)
AtPDS3_F2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNCGCTGAAATGTTCTGTGGTTGA (서열번호 43)
AtPDS3_R2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNCTTGCCTGCTTTTCCATCCA (서열번호 44)
GmBE1_F1 CTCAGTATATCACCCTCCTCA (서열번호 45)
GmBE1_R1 ATCCGGCTCCTGATAATCCG (서열번호 46)
GmBE1_F2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNGTCACCGTCAAGGGCAAG (서열번호 47)
GmBE1_R2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNGCACTTGGAGACGACGAC (서열번호 48)
GmBE2_F1 CTTTGCTGCACCTGCCAT (서열번호 49)
GmBE2_R1 GAAGTGCGGCCACCAACA (서열번호 50)
GmBE2_F2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNCAGGGAATTGACAGGGTATGA (서열번호 51)
GmBE2_R2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNACAAGAGCCTCATCCTGCAC (서열번호 52)
실험결과
1. 콩의 조직별 원형질체 분리 결과 (도 1)
상술한 실시예 1에 기재된 방법에 따라 콩의 미성숙 종자와 잎 조직에서 각각 원형질체를 분리하여 원형질체의 형태를 현미경으로 확인한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 종자 발달 R5~R6 단계의 미성숙 종자에서는 10~100 ㎛ 이하의 다양한 크기의 원형질체가 분리되었다 (도 1의 왼쪽 사진). 잎 발달 V3 단계 잎에서는 균일한 크기의 원형질체가 분리되었다 (도 1의 중간 사진). 잎에서 분리된 원형질체를 확대하여 관찰한 결과 대체로 30 ㎛ 이하의 크기였다 (도 1의 오른쪽 사진). 잎에서 분리된 원형질체는 미성숙 종자와 비교하여 크기가 작고 균일하여 이후 원형질체 형질전환 실험에 사용하였다.
2. 콩 잎의 발달 단계별 원형질체 분리 결과 (도 2, 도 3)
전술한 실시예 1에 기재된 방법에 따라 콩의 잎을 발달 단계 중 VC 단계와 V3 단계 잎을 채취하여 원형질체를 분리하여 원형질체의 형태를 현미경으로 확인한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, VC 단계 잎에서는 잎 조직에서 분리된 엽육세포가 대부분 분리되었다. 엽육세포는 잎을 구성하는 세포로 세포벽을 가지고 있어 타원형의 형태를 보여주었다 (도 2의 왼쪽 사진). V3 단계 잎에서는 엽육세포의 세포벽이 분해되어 세포막으로 구성된 원형질체가 분리되었다 (도 2의 오른쪽 사진).
또한, 잎 발달 단계별로 분리된 전체 세포 중 원형질체의 수를 측정하여 분리 효율을 관찰하였다. VC 단계 잎에서 30% 이하로 원형질체가 분리되었다. V1 단계 잎에서 40% 이하로 원형질체가 분리되었다. V2 단계 및 V3 단계 잎에서는 95% 이상으로 원형질체가 분리되었다 (도 3). 따라서, 잎의 발달 단계 중, V2 단계 내지 V3 단계의 잎으로부터 원형질체를 고순도로 분리할 수 있음을 알 수 있었다.
3. 콩 잎의 발달 단계별 원형질체의 수득량 비교 결과(도 4)
전술한 실시예 1에 기재된 방법에 따라 콩의 잎을 발달 단계별로 채취하여 원형질체를 분리하여 원형질체의 수득량을 확인한 결과를 도 4에 나타내었다. 우선, VC 및 V1 단계의 잎의 경우 엽육세포와 원형질체가 혼재되어 분리되었으며, 잎에서는 0.1g 당 1x106개 이하의 원형질체가 분리되었다. V2 단계의 잎에서 약 1.5x106개의 원형질체가 분리되었다. V3 단계의 잎에서는 5x106개의 원형질체가 분리되었다. 따라서, 이상의 결과를 종합하여, 잎의 발달 단계 중, V2 단계 내지 V3 단계의 잎으로부터 원형질체를 고효율로 분리할 수 있음을 알 수 있었다.
4. 벡터 크기별 원형질체로의 형질전환 효율 (도 5)
4.5 kb와 10.3 kb 크기의 두 종류의 벡터를 사용하여 원형질체에서의 형질전환 효율을 비교하였다. 전술한 실시예 2에 기재된 것처럼, Transient-GFP 벡터(10.3 kb)는 Merck사의 p61 벡터를 기반으로 한 것으로, Cas9, sgRNA 스캐폴드 및 GFP를 포함한다. GFP 벡터(4.5 kb)는 GFP만을 포함하고 있다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 도입된 벡터의 크기가 4.5 kb 인 경우 형질전환 효율이 약 93.2%이고, 벡터의 크기가 10.3 kb 인 경우 형질전환 효율이 약 88.8%로서, 매우 높은 형질전환 효율을 나타내었다. 따라서, 위 결과를 종합하여, 4kbp~11kb의 벡터 크기 모두 높은 효율로 원형질체에 형질전환될 수 있음을 알 수 있었다.
5. 벡터 종류별 유전자 교정 효율 (도 6)
전술한 실시예 2에 기재된 바와 같이 염색체 통합용 벡터 (integration vector)와 일시적 발현용 벡터(transient vector)를 제조한 후, 분리된 원형질체에 각각의 벡터를 도입한 경우의 유전자 교정 효율을 확인하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 두 벡터 모두 유전자 교정 효과를 나타내었으며, 특히, 일시적 발현용 벡터 (transient vector)의 유전자 교정 효율이 염색체 통합용 벡터 (integration vector)보다 높은 것을 알 수 있었다. 또한, 도 5의 그래프 아래에 기재한 서열들은, 유전자 교정 후 원형질체에서 gDNA를 분리하여 표적 위치의 유전자 염기서열을 분석한 결과로서, 야생형(WT) 서열과 비교하여 가장 빈도가 높은 교정 서열을 순서대로 기재한 것이다. 예를 들어, "-3" 은 3 염기쌍의 결실을 나타낸다. 이와 같이, 두 벡터를 사용한 경우 모두 유전자 교정에 의한 염기서열 결실을 확인할 수 있었다.
6. RNP 유전자가위 도입을 통한 유전자 교정 효율 (도 7)
분리된 식물 원형질체에 Cas9 단백질과 가이드 RNA가 미리 조립된 Cas9 단백질-가이드 RNA RNP(ribonucleoprotein)를 도입한 경우와 일시적 발현용 벡터(transient vector) 형태의 유전자가위를 도입한 경우를 비교한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 모두 높은 효율로 유전자 교정을 일으킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 도 7의 그래프 아래에 기재한 서열들은, 유전자 교정 후 원형질체에서 gDNA를 분리하여 표적 위치의 유전자 염기서열을 분석한 결과로서, 야생형(WT) 서열과 비교하여 가장 빈도가 높은 교정 서열을 순서대로 기재한 것이다. 예를 들어, "-3" 은 3 염기쌍의 결실을 나타낸다. 이와 같이, RNP 를 도입한 경우와 벡터를 도입한 경우 모두 유전자 교정에 의한 2~7bp 의 염기서열 결실이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
7. 개량 유전자가위를 활용한 식물 유전자 교정 효율 (도 8)
전술한 실시예 2에 기재된 바와 같이 GmFT2a, DDM1 및 GmPDS를 표적하는 각 가이드RNA를 가진 일시적 발현용 유전자 교정 벡터(Merck사의 p61를 변형하여 사용)를 각각 원형질체 도입하였다. 결과적으로 도 8과 같이 개량 Cas9 (Merck)이 야생형 Cas9 대비 평균 2.3배 유전자 교정 효율을 증대할 수 있음을 확인하였다.
8. sgRNA 길이 및 scaffold에 따른 식물 유전자 교정 효율 (도 9)
GmFT2a 를 표적으로 하는 sgRNA의 첫번째 염기서열을 g로 고정한 후 각각 19bp (gx19), 20bp (gx20)로 디자인하여 일시적 발현용 벡터(transient vector)에 삽입하였다.
gx19 gACAAGTTGTCAACCAACCAAGG (서열번호 53)
gx20 gCACAAGTTGTCAACCAACCAAGG (서열번호 54)
분리된 식물 원형질체에 각각의 벡터를 도입하여 식물 유전자 교정 효율을 비교하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, gx19 형태의 sgRNA를 사용한 경우 유전자 교정 효율이 33.4%로서, gx20와 비교하여 유전자 교정 효율이 높음을 확인할 수 있었다.
9. sgRNA 염기서열에 따른 식물 유전자 교정 효율 변화 (도 10)
동일한 표적 유전자에 대한 4개의 서로 다른 sgRNA를 디자인하여 일시적 발현용 벡터 (transient vector)에 삽입하였다. 분리된 식물 원형질체에 각각 다른 sgRNA 염기서열을 가진 벡터를 도입하여 식물 유전자 교정 효율을 비교하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 하나의 표적 유전자 내에서 sgRNA 염기서열에 따라 식물 유전자 교정 효율이 달라지는 것을 확인할 수 있었다.
10. RNP 유전자가위 도입을 통한 애기장대 유전자 교정 효율 (도 11)
분리된 애기장대 원형질체에 Cas9 단백질과 가이드 RNA가 미리 조립된 Cas9 단백질-가이드 RNA RNP(ribonucleoprotein)를 도입한 경우와 일시적 발현용 벡터(transient vector) 형태의 유전자가위를 도입한 경우를 비교한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 교정 효율의 큰 차이가 없음을 확인했다. 표적 부위의 유전자 교정을 확인하기 위해 염기서열을 분석한 결과 1 bp 삽입 또는 2 bp 이하의 결실이 나타난 것을 확인했다. 또한, 도 11의 그래프 아래에 기재한 서열들은, 유전자 교정 후 원형질체에서 gDNA를 분리하여 표적 위치의 유전자 염기서열을 분석한 결과로서, 야생형(WT) 서열과 비교하여 가장 빈도가 높은 교정 서열을 순서대로 기재한 것이다. 예를 들어, "-1" 은 1 염기쌍의 결실을 나타낸다. 이와 같이, RNP 를 도입한 경우와 벡터를 도입한 경우 모두 유전자 교정에 의해 1 bp 삽입 또는 2 bp 이하의 결실이 나타난 것을 확인했다. 따라서, 콩에서 뿐만 아니라 다른 식물(예, 애기장대)에서도 본원의 기술이 적용 가능함을 확인할 수 있었다.
11. Base Editor를 활용한 식물의 단일 염기 치환(도 12)
분리된 콩 원형질체에 CBE(BE3, BE4) 및 ABE 발현용 벡터를 제작하여 각각의 벡터를 도입한 경우의 유전자 교정 효율을 확인하였다. 그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 3종류의 벡터 모두 효율적으로 단일 염기 치환 변이를 도입하는 것을 알 수 있었다. 도 12의 그래프 아래에 기재한 서열은 각각의 BE 벡터 도입 후 원형질체에서 gDNA를 분리하여 표적 위치의 유전자 염기서열을 분석한 결과로 야생형 (WT) 서열과 비교하여 빈도가 높은 대표 교정 서열을 기재한 것이다. 소문자로 표기된 서열은 단일 염기 치환 변이가 일어났음을 나타낸다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> LG CHEM, LTD. <120> Method for increasing gene editing efficiency in plant using protoplasts <130> DPP20192982KR <160> 54 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA for GmFT2a-SP1 <400> 1 gtagggatcc tctcgttgtt ggg 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA for GmFT2a-sg2-1 <400> 2 acaagttgtc aaccaaccaa gg 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA for GmFT2a-SP2 <400> 3 cacaagttgt caaccaacca agg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA for 11gDDM1 <400> 4 ggaagaggag gtacagtgtg agg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA for GmPDS-D7 <400> 5 gaagcaagag acgttctagg tgg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA for AtBRI1-1 <400> 6 tttgaaagat ggaagcgcgg tgg 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA for AtPDS3 <400> 7 gaacaacgag atgctgacat gg 22 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Claims (14)

  1. 식물의 잎에서 원형질체를 분리하는 단계;
    상기 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated system) 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함하는,
    식물의 유전자 교정 효율이 증대된, 식물의 유전자 교정 방법.
  2. 식물의 잎에서 원형질체를 분리하는 단계;
    상기 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated system) 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함하는,
    유전자 교정 효율이 높은 가이드 RNA를 스크리닝하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 식물의 잎에서 원형질체를 분리하는 단계는,
    (a) 원형질체가 식물의 잎에서 50% 이상의 분리 효율로 분리되거나,
    (b) 원형질체가 식물의 잎으로부터 1 X 106/0.1g 이상의 수득량으로 분리되거나,
    (c) 원형질체가 식물의 잎으로부터 30 μm 이하의 크기로 분리되거나,
    (d) 원형질체가 균일한 크기로 분리되거나,
    (e) 원형질체가 식물의 잎의 생육단계 중 V2 단계 또는 V3 단계의 잎으로부터 분리되거나, 또는
    (f) 상기 (a) 내지 (e) 중 하나 이상인, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 식물이 콩인, 방법.
  5. 콩으로부터 원형질체를 분리하는 단계;
    상기 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated system) 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함하는,
    유전자 교정 효율이 증대된, 콩의 유전자 교정 방법.
  6. 콩으로부터 원형질체를 분리하는 단계;
    상기 분리된 원형질체에 CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated system) 를 도입하여 유전자를 교정하는 단계를 포함하는,
    유전자 교정 효율이 높은 가이드 RNA를 스크리닝하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 콩으로부터 원형질체를 분리하는 단계는,
    (a) 원형질체가 콩의 잎에서 분리되거나,
    (b) 원형질체가 콩의 잎에서 50% 이상의 분리 효율로 분리되거나,
    (c) 원형질체가 콩의 잎으로부터 1 X 106/0.1g 이상의 수득량으로 분리되거나,
    (d) 원형질체가 콩의 잎으로부터 30 μm 이하의 크기로 분리되거나,
    (e) 원형질체가 균일한 크기로 분리되거나,
    (f) 원형질체가 콩의 잎의 생육단계 중 V2 단계 또는 V3 단계의 잎으로부터 분리되거나, 또는
    (g) 상기 (a) 내지 (f) 중 하나 이상인, 방법.
  8. 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    CRISPR/Cas 는 Cas9 및 가이드 RNA 를 포함하되, Cas9 은 DNA, RNA 또는 단백질 형태로 포함되고 가이드RNA는 DNA 또는 RNA 형태로 포함되며,
    CRISPR/Cas 는 ssODN(Single-strand oligodeoxynucleotide) 을 더욱 포함하거나 포함하지 않는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    CRISPR/Cas 의 도입은, Cas9을 코딩하는 DNA 및 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 를 포함하는 벡터를 도입하거나, Cas9 단백질과 가이드 RNA가 미리 조립된 Cas 단백질-가이드 RNA RNP (ribonucleoprotein)를 도입하거나, Cas9 RNA 및 가이드 RNA 를 도입하는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 CRISPR/Cas 도입에 이용되는 벡터는 염색체 통합용 벡터 (integration vector) 또는 일시적 발현용 벡터(transient vector)인, 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 Cas9 은 야생형 Cas9 또는 개량 Cas9인, 방법.
  12. 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자가 교정된 원형질체를 재생시켜 유전체 교정 식물체를 제조하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 가이드 RNA가, crRNA 및 tracrRNA (trans-activating CRISPR-derived RNA) 간의 부분적인 염기-쌍 형성에 의해 형성되는 2차 구조 (secondary structure)를 가진 RNA이거나, sgRNA(single guide RNA) 이거나, 둘 다이며; 상기 crRNA는 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 RNA 단편을 포함하는, 방법.
  14. 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여, 고효율로 유전자 교정 식물체를 생산하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20180029092A (ko) 2012-10-23 2018-03-19 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도

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