JP7452884B2 - Dnaが編集された植物細胞を製造する方法、及びそれに用いるためのキット - Google Patents
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-
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
[1]
DNAが編集された植物細胞を製造する方法であり、植物細胞に、Cas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムを導入する工程を含み、かつ、前記Cas9タンパク質がNeisseria meningitidis由来である、方法。
[2]
植物細胞のDNAに連続するn個の塩基を挿入する方法であり、植物細胞に、Cas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムを導入する工程を含み、
前記Cas9タンパク質がNeisseria meningitidis由来であり、
前記ガイドRNAがn個のガイドRNAの組み合わせであり、
nが2以上の自然数であり、
1番目のガイドRNAが、塩基を挿入する標的塩基配列1に対して相同な標的化塩基配列1を含むものであり、かつ、n番目のガイドRNAが、標的塩基配列1にn-1個の塩基が挿入された標的塩基配列nに対して相同な標的化塩基配列nを含むものである、
方法。
[3]
植物細胞のDNAの塩基を置換する方法であり、植物細胞に、Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムと、Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質以外の他のCas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムと、を導入する工程を含み、
前記Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質のガイドRNAが、塩基を挿入する標的塩基配列1に対して相同な標的化塩基配列1を含むものであり、かつ、前記他のCas9タンパク質のガイドRNAが、標的塩基配列1に1個の塩基が挿入された標的塩基配列2に対して相同な標的化塩基配列2を含むものである、
方法。
[4]
前記植物細胞がイネ細胞である、[1]~[3]のうちのいずれか一項に記載の方法。
[5]
DNAが編集された植物細胞の製造に用いるためのキットであり、
以下の(A)及び(B):
(A)Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
(B)前記Cas9タンパク質のガイドRNA、該ガイドRNAをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
を含む、キット。
[6]
前記ガイドRNAがn個のガイドRNAの組み合わせであり、
nが2以上の自然数であり、
1番目のガイドRNAが、塩基を挿入する標的塩基配列1に対して相同な標的化塩基配列1を含むものであり、かつ、n番目のガイドRNAが、標的塩基配列1にn-1個の塩基が挿入された標的塩基配列nに対して相同な標的化塩基配列nを含むものである、
[5]に記載のキット。
[7]
以下の(C)及び(D):
(C)Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質以外の他のCas9タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
(D)前記他のCas9タンパク質のガイドRNA、該ガイドRNAをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
をさらに含み、
前記Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質のガイドRNAが、塩基を挿入する標的塩基配列1に対して相同な標的化塩基配列1を含むものであり、かつ、前記他のCas9タンパク質のガイドRNAが、標的塩基配列1に1個の塩基が挿入された標的塩基配列2に対して相同な標的化塩基配列2を含むものである、
[5]に記載のキット。
[8]
前記植物細胞がイネ細胞である、[5]~[7]のうちのいずれか一項に記載のキット。
本発明は、植物細胞に、Cas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムを導入する工程を含み、かつ、前記Cas9タンパク質がNeisseria meningitidis由来である、DNAが編集された植物細胞を製造する方法(以下、場合により、「DNA編集植物細胞製造方法」という)を提供する。
本発明においてDNAを編集する、すなわち、CRISPR-Cas9システムを導入する「植物細胞」としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類の細胞が挙げられる。「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞が含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂(生長点)、根、塊茎、塊根、種子、カルスが挙げられる。植物の例としては、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションが挙げられる。これらの中でも、好ましくは、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシ等のイネ科植物であり、特に好ましくは、イネである。
本発明に係るCRISPR-Cas9システムは、構成要素として、少なくともCas9タンパク質及びそのガイドRNAを含む。ガイドRNAは、標的塩基配列(例えば、欠損させる遺伝子上の配列であり、PAM配列を含む鎖(センス鎖)上にある配列)の相補配列(前記センス鎖のアンチセンス鎖上にある配列)に相補的な塩基配列(すなわち、前記標的塩基配列に対して相同な配列)を有するcrRNA(CRISPR RNA)とtracrRNA(trans-activating crRNA)とからなる。一般に、CRISPR-Cas9システムでは、Cas9タンパク質及びそのガイドRNAを細胞内に導入することによって、ガイドRNAが、ゲノムDNAの標的塩基配列の相補配列に結合し、当該ガイドRNAと複合体を形成するCas9タンパク質による標的DNAの切断を誘導する。切断された標的DNAでは、その修復過程で当該塩基配列における塩基の欠失・挿入が引き起こされ、その結果、遺伝子を編集することが可能となる。
本発明においては、CRISPR-Cas9システムとして、少なくともCas9タンパク質がNeisseria meningitidis由来であるものを用いる。以下、Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質を「NmCas9タンパク質」という。
本発明に係るCRISPR-Cas9システムにおいて、「ガイドRNA」は、crRNA(CRISPR RNA)とtracrRNA(trans-activating crRNA)との組み合わせである。本発明に係るNmCas9タンパク質のガイドRNAは、crRNAに、標的DNA領域の塩基配列(標的塩基配列の相補配列)に対して相補的な塩基配列(以下、場合により「標的化塩基配列」という)を含む。すなわち、本発明に係るNmCas9タンパク質のガイドRNAは、標的塩基配列に対して相同な標的化塩基配列を含む。
本発明において、植物細胞に導入されるCRISPR-Cas9システムとしては、Cas9タンパク質(NmCas9タンパク質及び必要に応じてそれ以外の他のCas9タンパク質)が、タンパク質の形態であっても、当該タンパク質をコードするRNAやDNA(ポリヌクレオチド)の形態であっても、当該ポリヌクレオチドを発現するベクター(発現ベクター)の形態であってもよい。また、これと独立して、ガイドRNAが、RNAの形態であっても、当該RNAをコードするDNA(ポリヌクレオチド)の形態であっても、当該ポリヌクレオチドを発現するベクター(発現ベクター)の形態であってもよい。
本発明のDNA編集植物細胞製造方法によれば、NmCas9タンパク質を利用するCRISPR-Cas9システムにより、従来よりも高頻度で、植物細胞の標的塩基配列に1塩基を挿入することができる。そのため、本発明に係るCRISPR-Cas9システムにおいて、複数のガイドRNAの組み合わせを用いることにより、植物細胞の標的塩基配列に連続する複数の塩基を挿入することも可能である。
前記Cas9タンパク質がNeisseria meningitidis由来であり、
前記ガイドRNAがn個のガイドRNAの組み合わせであり、
nが2以上の自然数であり、
1番目のガイドRNAが、塩基を挿入する標的塩基配列1に対して相同な標的化塩基配列1を含むものであり、かつ、n番目のガイドRNAが、標的塩基配列1にn-1個の塩基が挿入された標的塩基配列nに対して相同な標的化塩基配列nを含むものである、
植物細胞のDNAに連続するn個の塩基を挿入する方法(以下、場合により、「連続塩基挿入方法」という)も提供する。
本発明のDNA編集植物細胞製造方法は、他のCRISPR-Cas9システムと組み合わせてもよい。例えば、本発明に係るNmCas9タンパク質を用いたCRISPR-Cas9システムは、それ以外の他のCas9タンパク質(例えば、他の細菌に由来するCas9タンパク質等)を用いたCRISPR-Cas9システムと組み合わせて用いてもよい。
植物細胞に、NmCas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムと、NmCas9タンパク質以外の他のCas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムと、を導入する工程を含み、
NmCas9タンパク質のガイドRNAが、塩基を挿入する標的塩基配列1に対して相同な標的化塩基配列1を含むものであり、かつ、前記他のCas9タンパク質のガイドRNAが、標的塩基配列1に1個の塩基が挿入された標的塩基配列2に対して相同な標的化塩基配列2を含むものである、
植物細胞のDNAの塩基を置換する方法(以下、場合により、「塩基置換方法」という)も提供する。
また、本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットを提供する。本発明のキットは、(A)NmCas9タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、及び(B)NmCas9タンパク質のガイドRNA、該ガイドRNAをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクターを含む。前記ベクター(A)と(B)とは、互いに別のベクターであっても、同一のベクターであってもよい。
[プラスミド構築]
先ず、GeneArt Gene Synthesis(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)により、シロイヌナズナのコドンに最適化し、N末端側にFLAGタグ及びSimian Virus40(SV40)由来核移行シグナルを付加したNmCas9タンパク質遺伝子のDNA(配列番号:3に記載のアミノ酸配列をコードする、配列番号:4に記載の塩基配列)を合成した。次いで、バイナリーベクターpRI-SpCas9(Kaya et al.(2016)Sci.Rep.6:26871)をバックボーンとして、NmCas9タンパク質(NmCas9)の発現ベクターの構築を行った。すなわち、pRI-SpCas9内のカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターとシロイヌナズナのアルコール脱水素酵素遺伝子の5’-UTR部分とを、パセリのユビキチン4-2遺伝子のプロモーター(PcUBI)とイネのアルコール脱水素酵素遺伝子の5’-UTRとに、それぞれ置き換えた。また、pRI-SpCas9内のカナマイシン耐性遺伝子発現カセット(アグロバクテリウムのNOS遺伝子のプロモーターとネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子)を、ハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセット(カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターとハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子)と置換して、pRI-PcUBI-pro::SpCas9ベクターを構築した。次いで、pRI-PcUBI-pro::SpCas9ベクターをSmaIとSacIとで切断し、ベクター内のSpCas9タンパク質遺伝子のDNAを上記で合成したNmCas9タンパク質遺伝子のDNAに置き換え、NmCas9発現ベクターを構築した。
上記のsgRNA-NmCas9発現ベクターを用いて、土岐らの方法(Toki(1997)Plant Mol.Biol.Rep.15:16-21、Toki et al.(2006)Plant J 47:969-976)に従い、アグロバクテリウムによるイネカルスの形質転換を行った。先ず、sgRNA-NmCas9発現ベクターをアグロバクテリウム(菌株:EHA105)に導入し、また、胚盤由来のイネカルス(イネ:Oryza sativa L. 品種:日本晴)を1か月間培養した。次いで、これらアグロバクテリウム及びイネカルスを3日間共存培養した後、25mg/L meropenem(富士フイルム和光純薬株式会社製)溶液でカルスを洗い、50mg/L hygromycin Bと25mg/L meropenemとを含む培地で4~5週間培養した。
形質転換後、4~5週間培養したイネカルス、24個のサンプルについて、簡易DNA抽出法(Kasajima et al.(2004)Plant Mol.Biol.Rep.22:49-52)によりゲノムDNAを抽出した。KOD-FX neo DNA polymerase(東洋紡株式会社製)を用いて、標的塩基配列(target sequenceA corresponding to sgRNA of NmCas9)をPCR法により増幅した。得られたPCR産物を、SacIによる制限酵素処理で一晩切断し、MCE-202 MultiNA with a DNA-500 kit(株式会社島津製作所製)を用いて、CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)法により、前記標的塩基配列に変異が導入されているかを調べた。
CAPS解析で変異導入が確認された系統について、上記のCAPS解析と同様にして得られた標的塩基配列A(target sequenceA corresponding to sgRNA of NmCas9)のPCR産物をpCR-bluntII-TOPO(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にクローニングした。このプラスミドはBigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を利用して塩基配列を解読した。シークエンスデータはSnapGene software(GSL Biotech LLC社製)を用いて解析した。
賀屋らの方法(Kaya et al.(2016)Sci.Rep.6:26871)に従い、sgRNA-SpCas9発現ベクターを構築した。sgRNAにおいて、標的化塩基配列は、イネ標的DNA_Aにおける、SpCas9タンパク質のPAM配列の上流の20ヌクレオチドの標的塩基配列A(target sequenceA corresponding to sgRNA of SpCas9)に対して相同な塩基配列を含む配列とした。また、かかるsgRNA-SpCas9発現ベクターを用いたこと以外は実施例1と同様にしてイネカルスへの形質転換を行い、24個のサンプルについて、CAPS解析及びシークエンス解析を行った。
ガイドRNA(sgRNA)の標的化塩基配列を、NmCas9タンパク質のPAM配列及びSpCas9タンパク質のPAM配列を含むイネ内在遺伝子配列(配列番号:6に記載の塩基配列を含む配列、遺伝子ID(「RAP-DB」、https://rapdb.dna.affrc.go.jp/):Os07g0583800のプロモーター配列(イネ標的DNA_B))における、NmCas9タンパク質のPAM配列の上流の22ヌクレオチドの標的塩基配列B(target sequenceB corresponding to sgRNA of NmCas9)に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例1と同様にして、sgRNA-NmCas9発現ベクターを構築した。
ガイドRNA(sgRNA)の標的化塩基配列を、イネ標的DNA_Bにおける、SpCas9タンパク質のPAM配列の上流の20ヌクレオチドの標的塩基配列B(target sequenceB corresponding to sgRNA of SpCas9)に対して相同な塩基配列としたこと以外は比較例1と同様にして、sgRNA-SpCas9発現ベクターを構築した。また、かかるsgRNA-SpCas9発現ベクターを用いたこと以外は実施例2と同様にしてイネカルスへの形質転換を行い、24個のサンプルについて、CAPS解析及びシークエンス解析を行った。
ガイドRNA(sgRNA)の標的化塩基配列を、NmCas9タンパク質のPAM配列を含むイネ内在遺伝子配列(配列番号:7に記載の塩基配列を含む配列、遺伝子ID(「RAP-DB」、https://rapdb.dna.affrc.go.jp/):Os12g0224000のイントロン(イネ標的DNA_C))における、NmCas9タンパク質のPAM配列の上流の22ヌクレオチドの標的塩基配列1(target sequence1 corresponding to sgRNA1 of NmCas9)に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例1と同様にして、ガイドRNA1(sgRNA1)発現カセットを構築した。また、ガイドRNAの標的化塩基配列を、標的塩基配列1の2~22ヌクレオチドの配列の3’末から3塩基目と4塩基目との間にTが挿入された標的塩基配列2(配列番号:8に記載の塩基配列)に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例1と同様にして、ガイドRNA2(sgRNA2)発現カセットを構築した。さらに、ガイドRNAの標的化塩基配列を、標的塩基配列2の2~22ヌクレオチドの配列の3’末から3塩基目と4塩基目との間にAが挿入された標的塩基配列3(配列番号:9に記載の塩基配列)に対して相同な塩基配列としたこと以外は実施例1と同様にして、ガイドRNA3(sgRNA3)発現カセットを構築した。次いで、これらをいずれも用いたこと以外は実施例1と同様にして、sgRNA1-sgRNA2-sgRNA3-NmCas9発現ベクターを構築した。
[プラスミド構築]
・NmCas9発現ベクター:実施例1で構築したsgRNA-NmCas9発現ベクター[sgRNA for NmCas9(標的化塩基配列:イネ標的DNA_Aにおける標的塩基配列A(図2では標的塩基配列1)に対して相同な塩基配列)+NmCas9]を用いた。
上記のNmCas9発現ベクター及びSpCas9発現ベクターを用い、カルス選抜のための培養を、35mg/L G418と25mg/L meropenemとを含む培地において2週間培養としたこと以外は実施例1と同様にして、イネカルスの形質転換を行った。
形質転換後、2週間培養したイネカルス24個のサンプルについて、実施例1と同様にして標的塩基配列をPCR法により増幅した。得られたPCR産物について、ダイレクトシークエンス法によって直接シークエンス解析を行った。
<223> Neisseria meningitidis Cas9の改変配列
配列番号:4
<223> Neisseria meningitidis Cas9の改変配列
配列番号:5
<223> NmCas9タンパク質のガイドRNAに対応する標的塩基配列A
<223> SpCas9タンパク質のガイドRNAに対応する標的塩基配列A
配列番号:6
<223> NmCas9タンパク質のガイドRNAに対応する標的塩基配列B
<223> SpCas9タンパク質のガイドRNAに対応する標的塩基配列B
配列番号:7
<223> NmCas9タンパク質のガイドRNA1に対応する標的塩基配列1
配列番号:8
<223> NmCas9タンパク質のガイドRNA2に対応する標的塩基配列2
配列番号:9
<223> NmCas9タンパク質のガイドRNA3に対応する標的塩基配列3
配列番号:10
<223> TAAが挿入された標的DNA
配列番号:11
<223> NmCas9タンパク質のガイドRNAに対応する標的塩基配列1
配列番号:12
<223> SpCas9タンパク質のガイドRNAに対応する標的塩基配列2
配列番号:13
<223> CがAに置換された標的DNA
配列番号:14
<223> F-プライマー
配列番号:15
<224> R-プライマー
Claims (8)
- DNAに連続するn個の塩基が挿入された植物細胞を製造する方法であり、植物細胞に、Cas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムを導入する工程を含み、
前記Cas9タンパク質がNeisseria meningitidis由来であり、
前記ガイドRNAがn個のガイドRNAの組み合わせであり、
nが2以上の自然数であり、
1番目のガイドRNAが、塩基を挿入する標的塩基配列1に対して相同な標的化塩基配列1を含むものであり、かつ、n番目のガイドRNAが、標的塩基配列1にn-1個の塩基が挿入された標的塩基配列nに対して相同な標的化塩基配列nを含むものである、
方法。 - DNAの塩基が置換された植物細胞を製造する方法であり、植物細胞に、Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムと、Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質以外の他のCas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムと、を導入する工程を含み、
前記Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質のガイドRNAが、塩基を挿入する標的塩基配列1に対して相同な標的化塩基配列1を含むものであり、かつ、前記他のCas9タンパク質のガイドRNAが、標的塩基配列1に1個の塩基が挿入された標的塩基配列2に対して相同な標的化塩基配列2を含むものである、
方法。 - 植物細胞のDNAに連続するn個の塩基を挿入する方法であり、植物細胞に、Cas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムを導入する工程を含み、
前記Cas9タンパク質がNeisseria meningitidis由来であり、
前記ガイドRNAがn個のガイドRNAの組み合わせであり、
nが2以上の自然数であり、
1番目のガイドRNAが、塩基を挿入する標的塩基配列1に対して相同な標的化塩基配列1を含むものであり、かつ、n番目のガイドRNAが、標的塩基配列1にn-1個の塩基が挿入された標的塩基配列nに対して相同な標的化塩基配列nを含むものである、
方法。 - 植物細胞のDNAの塩基を置換する方法であり、植物細胞に、Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムと、Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質以外の他のCas9タンパク質及びそのガイドRNAを構成要素とするCRISPR-Cas9システムと、を導入する工程を含み、
前記Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質のガイドRNAが、塩基を挿入する標的塩基配列1に対して相同な標的化塩基配列1を含むものであり、かつ、前記他のCas9タンパク質のガイドRNAが、標的塩基配列1に1個の塩基が挿入された標的塩基配列2に対して相同な標的化塩基配列2を含むものである、
方法。 - 前記植物細胞がイネ細胞である、請求項1~4のうちのいずれか一項に記載の方法。
- DNAに連続するn個の塩基が挿入された植物細胞の製造に用いるためのキットであり、
以下の(A)及び(B):
(A)Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
(B)前記Cas9タンパク質のガイドRNA、該ガイドRNAをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
を含み、
前記ガイドRNAがn個のガイドRNAの組み合わせであり、
nが2以上の自然数であり、
1番目のガイドRNAが、塩基を挿入する標的塩基配列1に対して相同な標的化塩基配列1を含むものであり、かつ、n番目のガイドRNAが、標的塩基配列1にn-1個の塩基が挿入された標的塩基配列nに対して相同な標的化塩基配列nを含むものである、
キット。 - DNAの塩基が置換された植物細胞の製造に用いるためのキットであり、
以下の(A)及び(B):
(A)Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
(B)前記Cas9タンパク質のガイドRNA、該ガイドRNAをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
を含み、
以下の(C)及び(D):
(C)Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質以外の他のCas9タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
(D)前記他のCas9タンパク質のガイドRNA、該ガイドRNAをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを発現するベクター、
をさらに含み、
前記Neisseria meningitidis由来のCas9タンパク質のガイドRNAが、塩基を挿入する標的塩基配列1に対して相同な標的化塩基配列1を含むものであり、かつ、前記他のCas9タンパク質のガイドRNAが、標的塩基配列1に1個の塩基が挿入された標的塩基配列2に対して相同な標的化塩基配列2を含むものである、
キット。 - 前記植物細胞がイネ細胞である、請求項6又は7に記載のキット。
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Molecular Cell,2019年02月,Vol.73,p.714-726 |
刑部 敬史,人工制限酵素を用いた高効率イネ葉緑体ゲノム編集の確立,科学研究費助成事業 研究成果報告書,2016年 |
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