CN108368516A - 用于从原生质体生成整个植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从原生质体生成植物的方法，其包括敲除或敲入原生质体的一个或多个内源基因，以及从通过上述方法生成的基因组修饰的原生质体再生的植物。

Description

用于从原生质体生成整个植物的方法
技术领域
本发明涉及用于从原生质体生成植物的方法，其包括敲除或敲入原生肢体的一个或多个内源基因，和从通过上述方法生成的基因修饰的原生质体再生植物。
背景技术
可编程的核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和在细菌和古细菌中由II型成簇的规律间隔的回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)的适应性免疫系统重复利用的RNA指导核酸内切酶(RGEN)已成功用于包括各种植物物种的细胞和生物的基因组编辑，为生物医学研究、医学和生物技术的新应用铺平了道路(Kim,H.etc.,Nat Rev Genet,2014,15:321-334)。在这些核酸酶中，最新的三核酸酶CRISPRRGEN正迅速取代ZFN和TALEN，由于它们易于编程；仅通过替换RNA组分来定制源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9蛋白和指导RNA(gRNA)组成的RGEN，避开了制造新TALEN和ZFN所需的劳动密集和耗时的蛋白质工程改造。可编程的核酸酶经由农杆菌递送到植物细胞中或转染编码它们的质粒，以序列依赖性方式切割染色体靶位点，产生位点特异性DNA双链断裂(DSB)。通过内源系统修复这些DSB导致靶向的基因组修饰。
尚不清楚欧盟和其他国家的基因修饰生物(GMO)法规是否会对所得基因组编辑的植物进行管理(Jones,H.D.,Nature Plants,2015,1:14011)。可编程的核酸酶在染色体目标位点诱导小的插入和缺失(插入/缺失)或取代，这与天然存在的变异无法区分。尽管如此，这些植物可能被某些国家的监管机构认为是GMO，阻碍了植物生物技术和农业中可编程的核酸酶的广泛使用。例如，当使用农杆菌时，基因组编辑的植物会含有外源DNA序列，包括那些编码宿主基因组中的可编程的核酸酶的序列。由于它们的无性繁殖，通过育种去除这些源自农杆菌的DNA序列在某些植物诸如葡萄、马铃薯和香蕉中是不可行的。
或者，编码可编程的核酸酶的非整合型质粒可以转染到植物细胞诸如原生质体中。然而，我们注意到，转染的质粒在细胞中被内源性核酸酶降解，并且所得小DNA片段可以在Cas9靶向位点和脱靶位点插入，如人类细胞中所示(Kim,S,etc.,Genome research,2014,24:1012-1019)。
递送预装配的Cas9蛋白-gRNA核糖核蛋白(RNP)而不是编码这些成分的质粒到植物细胞中可以避免将重组DNA插入宿主基因组的可能性。此外，如培养的人类细胞所示，RGEN RNP在转染后即刻切割染色体靶位点，并且被细胞内的内源性蛋白酶迅速降解，潜在地降低了再生整个植物中的镶嵌现象和脱靶效应。预装配的RGEN RNP可横跨植物物种广泛使用，而无需事先优化密码子使用和启动子以在每个物种中表达Cas9和gRNA。另外，RGENRNP能够在体外预筛选以选择高活性的gRNA并经由限制性片段长度多态性(RFLP)分析将突变克隆基因分型。
然而，尽我们所知，RGEN RNP从未用于任何植物物种。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种用于从原生质体生成植物的方法，其包括敲除或敲入原生质体的一个或多个内源基因。
本发明的另一个目的是提供一种从通过用于从原生质体生成植物的方法生成的基因组编辑的原生质体再生的植物。
本发明的又另一个目的是提供一种用于切割植物细胞中的编码BIN2基因的DNA的组合物，其包含对编码油菜类固醇不敏感蛋白2(BIN2)基因、BKI1基因或它们的同源基因的DNA特异性的指导RNA，或编码指导RNA的DNA；和编码Cas蛋白的核酸，或Cas蛋白。
本发明的又另一个目的是提供一种用于从原生质体生成植物的组合物，其包含对编码油菜类固醇不敏感蛋白2(BIN2)基因、BKI1基因或它们的同源基因的DNA特异性的指导RNA，或编码指导RNA的DNA；和编码Cas蛋白的核酸，或Cas蛋白。
本发明的又另一个目的是提供一种用于从原生质体生成植物的试剂盒，其包含用于从原生质体生成植物的组合物。
技术方案
我们将纯化的Cas9蛋白和指导RNA转染到多个植物原生质体中，其以高达46％的频率诱导在再生的植物中的靶向诱变。Cas9核糖和蛋白递送到原生质体中避免了将外源DNA插入宿主基因组的可能性。所得植物在靶位点含有种系-可传递的、小的插入或删除，这与自然发生的变化无法区分，可能绕过与使用农杆菌或质粒有关的监管要求。
有益效果
在本发明中，我们显示出可将RGEN RNP递送至源自多个植物物种的原生质体中，并且诱导从其再生的整个植物中的靶向基因组修饰。
附图说明
图1.多种植物原生质体中的RGEN RNP介导的基因破坏。(a)通过T7E1测定和靶向深度测序测量的突变频率。(b)通过植物细胞中的RGEN RNP诱导的突变体DNA序列。PAM序列以红色显示。插入的核苷酸以蓝色显示。WT，野生型。(c)拟南芥属(Arabidopsis)原生质体中的基因组编辑的时程分析。(上面)T7E1测定。(下面)野生型(WT)的DNA序列和突变体序列。
图2.大群体中的RGEN RNP介导的基因破坏。(a)BIN2基因的靶序列。PAM序列以红色显示。(b)在大群体中通过T7E1测定和靶向深度测序测量的突变频率。(c)在植物细胞中通过RGEN RNP诱导的突变体DNA序列。PAM以红色显示。插入的核苷酸以蓝色显示。WT，野生型。
图3.源自用RGEN RNP处理的单个原生质体的微愈伤组织的遗传分析。(a)微愈伤组织的基因分型。(上面)RGEN RFLP分析。(下面)微愈伤组织中的突变体DNA序列。(b)在T0世代中BIN2基因的遗传分析的汇总。
图4.在莴苣中使用RGEN RNP的靶向基因敲除。(a)BIN2基因中的靶序列。PAM序列以红色显示。(b)微愈伤组织的基因分型。(上面)RGEN RFLP分析。(下面)微愈伤组织中的突变体DNA序列。(c)从RGEN RNP转染的原生质体再生的整个植物。
图5.脱靶效应的分析。通过靶向深度测序测量PHYB和BRI1基因特异性sgRNA的靶向和潜在脱靶位点的突变频率。获得每个位点约～80,000个配对的末端读段以计算插入/缺失率。
图6.LsBIN2的部分核苷酸和氨基酸序列。下划线和加框的字母分别表示对应于简并引物和sgRNA的序列。
图7.在山莴苣中从RGEN RNP转染的原生质体再生小植物。在莴苣中从RGEN RNP转染的原生质体的原生质体分裂、愈伤组织形成和幼芽再生。(a)原生质体培养5天后的细胞分裂(比例尺＝100μm)。(b)原生质体的多细胞集落(比例尺＝100μm)。(c)原生质体培养4周后琼脂包埋的集落。(d)从源自原生质体的集落形成愈伤组织(e,f)从源自原生质体的愈伤组织器官发生和再生幼芽(比例尺＝5mm)。
图8.突变体愈伤组织的靶向深度测序。通过Illumina Miseq确认突变体愈伤组织的基因型。分析每个等位基因的序列和测序读段的数量。(A1),等位基因1。(A2),等位基因2。
图9.在山莴苣中从RGEN RNP转染的原生质体的植物再生。(a-c)从源自原生质体的愈伤组织的器官发生和再生幼芽；野生型(#28)，双等位基因/杂合(#24)，双等位基因/纯合(#30)。(d)体外幼芽增殖和发育。(e)无PGR的MS培养基中的幼芽的伸长和生长。(f)根诱导到伸长的幼芽。(g)小植物的习服。(h,i)再生的整个植物。
图10.BIN2突变体等位基因的种系传播。(a)再生的植物的抽苔和开花。(b)用于基因分型从称为T0-12的纯合双等位基因突变体获得的种子的RGEN-RFLP分析。(c)野生型的DNA序列，T0-12突变体和源自T0-12系的T1突变体。红色三角标示插入的核苷酸。
进行本发明的具体实施方案
本发明提供了一种用于从原生质体生成植物的方法，其包括敲除或敲入所述原生质体的一个或多个内源基因。
在一个实施方案中，所述植物的内源基因可为能够通过敲除或敲入增加所述植物的胁迫抗性(stress resistance)的基因。
在另一个实施方案中，所述植物的内源基因可为参与植物的油菜类固醇信号转导的基因。
在又另一个实施方案中，(i)在敲除步骤中，所述内源基因可为选自下组的一个或多个基因：BIN2基因、BKI1基因和它们的同源基因；和(ii)在敲入步骤中，敲入的基因为选自下组的一个或多个基因：BRI1基因、BSU基因、BZR1基因、DWF4基因、CYP85A1和它们的同源基因。
在又另一个实施方案中，所述基因的敲除可通过敲除选自下组的基因的一个或两个等位基因进行：BIN2基因、BKI1基因和它们的同源基因。
在又另一个实施方案中，所述基因的敲除可通过基因敲除进行，所述基因的敲入通过基因敲入进行。
在又另一个实施方案中，所述基因的敲除可使用对选自下组的一个或多个基因特异性的工程改造的核酸酶进行：BIN2基因、BKI1基因和它们的同源基因。
在又另一个实施方案中，所述工程改造的核酸酶可选自下组：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和RNA-指导的工程改造的核酸酶(RGEN)。
在又另一个实施方案中，所述RGEN可包含指导RNA，其特异性结合选自下组的一个或多个基因的特定序列：BIN2基因、BKI1基因和它们的同源基因，或编码所述指导RNA的DNA；和编码Cas蛋白的核酸，或Cas蛋白。
在又另一个实施方案中，所述基因的敲除可通过将所述特异性结合选自下组的一个或多个基因的特定序列：BIN2基因、BKI1基因和它们的同源基因的指导RNA，或编码所述指导RNA的DNA；和编码Cas蛋白的核酸，或Cas蛋白引入所述原生质体进行。
在又另一个实施方案中，所述指导RNA可为双RNA或单链指导RNA(sgRNA)的形式，其包含crRNA和tracrRNA。
在又另一个实施方案中，所述单链指导RNA可包含crRNA和tracrRNA的一部分。
在又另一个实施方案中，所述单链指导RNA可为分离的RNA的形式。
在又另一个实施方案中，编码所述指导RNA的DNA可通过载体编码，并且所述载体为病毒载体、质粒载体或农杆菌属(Agrobacterium)载体。
在又另一个实施方案中，所述Cas蛋白可为Cas9蛋白或其变体。
在又另一个实施方案中，所述Cas蛋白可识别NGG三核苷酸。
在又另一个实施方案中，所述Cas蛋白可连接到蛋白转导结构域。
在又另一个实施方案中，所述Cas9蛋白的变体可为Cas9蛋白的突变体形式，其中所述催化天冬氨酸残基被另外的氨基酸取代。
在又另一个实施方案中，所述氨基酸可为丙氨酸。
在又另一个实施方案中，所述编码Cas蛋白的核酸或Cas蛋白可为源自链球菌属(the genus Streptococcus)的微生物。
在又另一个实施方案中，所述链球菌属的微生物可为酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)。
在又另一个实施方案中，所述原生质体源自山莴苣(Lactuca sativa)。
在又另一个实施方案中，所述引入可通过将编码Cas蛋白的核酸或Cas蛋白和所述指导DNA或编码所述指导DNA的DNA共转染或连续转染到原生质体中进行。
在又另一个实施方案中，所述连续转染可通过首先转染Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸，然后其次转染裸指导RNA进行。
在又另一个实施方案中，所述引入可通过选自下组的方法进行：微注射、电穿孔、DEAE-葡聚糖处理、脂转染、纳米颗粒介导的转染、蛋白质转导结构域介导的转染和PEG介导的转染。
在又另一个实施方案中，所述方法可进一步包括再生具有敲除基因的原生质体。
在又另一个实施方案中，所述再生可包括在含有琼脂糖的培养基中培养具有选自下组的一个或多个敲除基因的原生质体以形成愈伤组织：BIN2基因、BKI1基因和它们的同源基因；和在再生培养基中培养所述愈伤组织。
本发明的另一个方面是一种从通过上述方法生成的基因组编辑的原生质体再生的植物。
本发明的另一个方面是一种用于切割植物细胞中的编码BIN2基因的DNA的组合物，其包含：对编码油菜类固醇不敏感蛋白2(BIN2)基因、BKI1基因或它们的同源基因的DNA特异性的指导RNA，或编码所述指导RNA的DNA；和编码Cas蛋白的核酸，或Cas蛋白。
在又另一个实施方案中，所述组合物可诱导植物细胞中的靶向诱变。
本发明的另一个方面是一种用于从原生质体生成植物的组合物，其包含对编码油菜类固醇不敏感蛋白2(BIN2)基因、BKI1基因或它们的同源基因的DNA特异性的指导RNA，或编码所述指导RNA的DNA；和编码Cas蛋白的核酸，或Cas蛋白。
本发明的另一个方面是一种用于从原生质体生成植物的试剂盒，其包含上述组合物。
本发明的具体实施方案
以下，将参考实施例进一步详细描述本发明。然而，理解的是这些实施例仅用作示例说明的作用，并且不意图限制本发明的范围。
方法
Cas9蛋白和指导RNA。从ToolGen,Inc.(South Korea)购买用核定位信号标记的Cas9蛋白。使用Phusion聚合酶通过寡扩展生成指导RNA转录的模板(表1-4)。根据制造商的方案使用T7RNA聚合酶(New England Biolabs)通过失控反应(run-off reaction)体外转绿指导RNA。反应混合物用1X脱氧核糖核酸酶I反应缓冲液中的脱氧核糖核酸酶I(NewEngland Biolabs)处理。用SYBR金染色(Invitrogen)在8％变性脲-聚丙烯酰胺凝胶上分离转录的sgRNA进行质量控制。转录的sgRNA用MGTM PCR Product Purification SV(Macrogen)纯化并通过光谱测定来定量。
[表1]
用于T7E1测定的引物的列表
[表2]
用于靶向深度测序的引物的列表(第一引物)
[表3]
用于靶向深度测序的引物的列表(第二引物)
[表4]
体外转录模板
原生质体培养。如先前所述从拟南芥、稻和莴苣中分离原生质。最初，将拟南芥属(阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana))生态型Columbia-0、稻(水稻L.(Oryza sativa L.)栽培变种Dongjin和莴苣(山莴苣L.(Lactuca sativa L.))栽培变种Cheongchima种子在70％乙醇、0.4％次氯酸盐溶液中灭菌15min，在蒸馏水中洗提三次，并且播种在补充有2％蔗糖的1/2X Murashige and Skoog固体培养基上。幼苗在生长室中在25℃在16h昼(150μmol m- 2s-1)和8h夜循环下生长。为了原生质体分离，14d拟南芥幼苗的叶子、14d稻幼苗的茎和鞘以及7d莴苣幼苗的子叶在温育过程中用酶溶液(1.0％纤维素酶R10,0.5％浸解酶R10,0.45M甘露醇,20mM MES[pH 5.7],CPW溶液)消化，在黑暗中在25℃震荡(40rpm)12h，然后用等体积的W5溶液稀释。混合物通过在圆底管中以100g离心5min收集。通过浮动在CPW 21S(CPW溶液中的21％[w/v]蔗糖,pH 5.8)溶液上纯化重悬的原生质体，然后以80g离心7min。用W5溶液洗涤纯化的原生质体，并且通过以70g离心5min离心沉淀。最终，将原生质体重悬于W5溶液，并且使用血细胞计数器在显微镜下计数。将原生质体稀释至1x106原生质体/ml的MMG溶液(0.4M甘露醇和15mM MgCl2,4mM MES[pH 5.7])的密度。
原生质体转染。如先前所述进行PEG介导的RNP转染，以使用RNP复合物引入DSB，1x105个原生质体细胞用与体外转录的sgRNA(20-120μg)预混合的Cas9蛋白(10-60μg)转染。在转染前，将储存缓冲液(20mM HEPES pH7.5,150mM KCl,1mM DTT和10％甘油)中的Cas9蛋白与1X NEB缓冲液3中的sgRNA混合，并且在室温温育10min。将重悬于200μL MMG溶液的1x105个原生质体(或在莴苣的情况下，5x105个原生质体)的混合物与5-20μL的RNP复合物和210μL的新鲜制备的PEG溶液(40％[w/v]PEG 4000；Sigma号95904,0.2M甘露醇和0.1MCaCl2)轻轻混合，然后在黑暗中在25℃温育10min。在温育后，缓慢添加950μL W5溶液(2mMMES[pH 5.7],154mM NaCl,125mM CaCl2和5mM KCl)。通过翻转试管良好混合所得溶液。通过以100g离心100g离心沉淀原生质体，并且轻轻重悬于1ml WI溶液(0.5M甘露醇,20mMKCl和4mM MES at pH 5.7)。最终，将原生质体转移到多孔板中，并且在25℃在黑暗条件下培养24-48h。转染后一天分析细胞。
原生质体再生。将RNP转染的原生质体重悬于补充有375mg/lCaCl2′2H2O,18.35mg/l NaFe-EDTA,270mg/l琥珀酸钠,103g/l蔗糖,0.2mg/l2,4二氯苯氧乙酸(2,4-D),0.3mg/l6-苄基腺嘌呤(BAP)和0.1g/l MES的1/2XB5培养基。将原生质体与1/2X B5培养基和2.4％琼脂的1：1溶液混合成2.5X105个原生质体/ml的培养浓度。将包埋在琼脂中的原生质体铺板在6孔板上，用2ml的液体1/2X B5培养基覆盖，并在黑暗中在25℃培养。7天后，用新鲜培养基代替液体培养基。将培养物转移至光亮(16h昼[30μmol m-2s-1]和8h夜)并且在25℃培养。在培养3周后，微愈伤组织生长成直径几mm，并将其转移到补充有30g/l蔗糖,0.6％植物琼脂,0.1mg/lα-萘乙酸(NAA),0.5mg/lBAP的MS再生培养基。在再生培养基上约4周后，观察到多个莴苣幼芽的诱导。
莴苣的生根、转移至土壤和锻炼(hardening)。为了再生整个植物，将增殖并伸长的不定芽转移到新鲜的再生培养基并在光亮(16h昼[120μmolm-2s-1]和8h夜)中在25℃培养4-6周。对于根部诱导，切除约3-5cm长小植物并将其转移到品红色容器中不含固体激素的1/2X MS培养基。从不定芽发育的小植物经过习服、移植到盆栽土，并在25℃保持在生长恒温箱中(在具有16-h光周期的冷白荧光灯下100-150μmol m-2s-1)。
T7E1测定。使用DNeasy Plant微型试剂盒DNeasy Plant从原生质体或愈伤组织分离基因组DNA。扩增靶DNA区域并使其经过T7E1测定，如先前所述。简言之，使PCR产物在95℃变性并使用热循环仪将其缓慢冷却至室温。将退火的PCR产物在37℃用T7核酸内切酶I(ToolGen,Inc.)温育20min，并经由琼脂糖凝胶电泳分析。
RGEN–RFLP。RGEN-RFLP测定乳腺前所述进行。简言之，PCR产物与10μl的反应体积的Cas9蛋白(1μg)和sgRNA(750ng)在37℃在1X NEB缓冲液3中温育60min。然后将RNase A(4μg)添加至反应混合物，并且在RNase A(4μg)温育30min以去除sgRNA。通过添加6X停止液(30％甘油,1.2％SDS,250mM EDTA)停止反应。DNA产物使用2.5％琼脂糖凝胶来电泳。
靶向深度测序。从基因组DNA扩增靶向位点和潜在的脱靶位点。通过另外的PCR添加指标和测序衔接子。高通量测序使用Illumina Miseq(v2,300个循环)进行。
结果
将纯化的Cas9蛋白与靶向三种植物物种中的4个基因的2-10倍摩尔过量的gRNA在体外混合以形成预装备的RNP。然后将RGEN RNP与源自拟南芥属(阿拉伯芥(A.thaliana))、烟草的野生型(渐狭叶烟草(N.attenuate))和稻((O.sativa)水稻)的原生质体在聚乙二醇(PEG)的存在下温育。我们使用T7核酸内切酶(T7E1)测定和靶向深度测序测量转染的细胞中的突变频率(图1a、b)。插入/缺失在期望的位置，即NGG前间区序列邻近基序(PAM)的3个核苷酸(nt)上游检测到，频率范围为8.4％至44％。
我们还共转染了在拟南芥属中的另一个基因中通过201个碱基(bp)分开靶位点的两个gRNA，以研究两个共存DSB的修复是否会引起间插序列的靶向缺失，如人类细胞所示。Sanger测序显示出在原生质体中缺失223bp DNA序列(图1C)。值得注意地，在转染后24小时检测到RGEN诱导的突变，这表明在转染后RGEN即刻切割靶位点，并且在细胞分裂的整个循环之前诱导突变。
然后，我们调查了RGEN RNP是否能够在于靶向位点高度同源的位点诱导脱靶突变。我们使用Cas-OFFinder程序研究了拟南芥属基因组中的光敏色素B(PHYB)和油菜类固醇不敏感蛋白1(BRI1)基因特异性sgRNA的潜在的脱靶位点，并使用靶向深度测序测量突变频率(图5)。在与靶向位点有2-5个核苷酸不同的任何这些位点没有检测到插入/缺失，这与我们先前在人类细胞中的结果一致。
我们设计了RGEN靶位点(SEQ ID NO:93)以破坏油菜类固醇不敏感蛋白2(BIN2)基因，其编码油菜类固醇(BR)信号途径中的负调节蛋白(图2a)。我们在聚乙二醇的存在下转染了RGEN RNP，并使用T7核酸内切酶测定(T7E1)和靶向深度测序两者测量了由RGEN引起的靶向基因修饰效率。插入/缺失在期望的位置，即NGG前间区序列邻近基序(PAM)的3个核苷酸(nt)上游检测到，使用T7E1测定的频率范围为8.3％至11％(平均为9.0％)，使用NGS测定的为3.2％至5.7％(平均为4.3％)(图2b、c)。
我们进行了再生过程以产生整个植物，其含有来自RGEN-RNP处理的原生质体的BIN2突变体等位基因。仅一小部分(<0.5％)原生质体可培养形成愈伤组织。在这些当中，使用35个快速生长系进行进一步分析(图3).我们进行了RGEN-RFLP测定和靶向深度测序以基因分型莴苣微愈伤组织。RGEN-RFLP测定区分单等位基因突变体克隆(50％切割)与杂合双等位基因突变体克隆(无切割)，以及纯合双等位基因突变体克隆(无切割)与野生型克隆(100％)切割。值得注意地，这些分析显示出35个愈伤组织中的两个(5.7％)在靶位点含有单等位基因突变，并且35个愈伤组织中的14个在靶位点含有双等位基因突变。因此，再生的愈伤组织中的突变频率为42.9％(＝30个突变体等位基因/70等位基因)，这显示为高达原生质体中情况的10倍增加。注意的是在没有任何选择的情况下，我们已经以43％的频率(与大群体中的突变相比非常高的频率)获得了基因组编辑的莴苣，这表明BIN2基因中RGEN诱导的突变在再生过程中稳定保持并和富集。
BIN2基因破坏没有显示出形态变化，但是在水稻中有一些胁迫抗性的表型。我们提议通过敲除BIN2基因引起的BR信号的上调可促进细胞增殖和生长的总体速率并给予愈伤组织抵御压力再生过程的优势。
最终，我们转染了RGEN RNP以破坏在莴苣原生质体中编码油菜类固醇(BR)信号途径中的负调节蛋白的拟南芥属油菜类固醇不敏感蛋白2(BRI2)基因的莴苣(山莴苣)同源物(图6)，并从RNP转染的细胞获得再生的微愈伤组织(图2-4和图7)。我们在RFLP分析中使用相同的RGEN RNP以基因分型莴苣微愈伤组织。不同于T7测定，该分析区分单等位基因突变克隆(50％切割)与杂合双等位基因突变体克隆(无切割)，以及纯合双等位基因突变体克隆(无切割)与野生型克隆(100％切割)。此外，RGEN-RFLP测定不受核酸酶靶位点附近的序列多态性(可存在于莴苣基因组中)限制。该测定显示出35个愈伤组织中的两个(5.7％)在靶位点含有单等位基因突变，并且35个愈伤组织中的14个(40％)在靶位点含有双等位基因突变(图3、图4b)，这证明，再生后，RGEN诱导的突变被稳定保持。因此，莴苣愈伤组织中的突变频率为46％。我们还使用靶向深度测序来确认16个突变体愈伤组织中的这些基因型。靶位点缺失或插入的碱基对的数量范围为-9至+1，这与在人类细胞中观察到的诱变模式(mutagenic pattern)一致。在这些克隆中没有检测到明显的镶嵌现象(图8)，这表明在细胞分裂前，RGEN RNP在转染和诱导插入/缺失后即刻切割靶位点。
然后我们使用高通量测序确定了BIN2特异性BIN2是否诱导了莴苣基因组中的附带损害(collateral damage)。在3个BIN2突变的小植物中与靶向位点有1-5个核苷酸不同的91个同源位点处没有诱导非脱靶突变，这与我们在人类细胞中的发现一致：通过CRISPRRGEN诱导的脱靶突变在源自单个细胞的克隆中很少发现。
[表5]
莴苣基因组中的潜在脱靶位点的数量。使用Cas-OFFinder(www.regenome.net)在莴苣基因组中鉴定潜在RGEN脱靶位点。我们使用Legassy_V2数据库(Genebank:AFSA00000000.1)作为参考基因组，并鉴定与靶向序列不同高达5nt的同源序列。在该分析中排除几个位点，因为由于参考基因组数据的低质量而不能设计PCR引物，或因为使用PCR没有获得扩增子。
[表6]在三个再生的小植物中靶向位点和91个潜在脱靶位点处的插入/缺失频率。在0％至3.0％范围的频率处观察到由测序误差导致的假阳性插入/缺失。
[表7]
[表8]
随后，整个植物从这些基因编辑的愈伤组织成功再生并在土壤中生长(图4c和图9)。种子从完全生长的纯合双等位基因突变体获得。如所期望的，突变体等位基因传播至种子(图10)。批准进一步的研究以测试BIN2破坏的莴苣是否显示了增强的BR信号。
总之，将RGEN RNP成功递送至植物原生质体中，并且诱导4个不同植物物种种的6个基因的靶向基因修饰。重要地，RGEN诱导的突变在从原生质体再生的整个植物中稳定保持，并传播至种系。由于在该过程中不使用重组DNA，因此，所得基因组编辑的植物可免于目前的GMO法规、为植物生物技术和农业中的RNA指导的基因组编辑的广泛使用铺平了道路。
序列表
<110> 基础科学研究院
首尔大学校产学协力团
次世代融合技术研究院
<120> 用于从原生质体生成整个植物的方法
<130> PF-B2008
<140> PCT/KR2016/011217
<141> 2016-10-06
<150> 10-2015-0140314
<151> 2015-10-06
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<170> PatentIn version 3.5
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<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHYB-deepR
<400> 47
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatcagt gcttaatccg gttga 55
<210> 48
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P450-deepF
<400> 48
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaccccag gccaattcat g 51
<210> 49
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P450-deepR
<400> 49
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggctct ggtttcaagt tagtaca 57
<210> 50
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DWD1-deepF
<400> 50
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctgccac aaccaacgga tc 52
<210> 51
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DWD1-deepR
<400> 51
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttggatt cagacccacc cg 52
<210> 52
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI1-TS1-deepF
<400> 52
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttgcgga tcttcttcag gct 53
<210> 53
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI1-TS1-deepR
<400> 53
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctcgt ctccaacttt gcaa 54
<210> 54
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI1-TS2-deepF
<400> 54
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttgcaaa gttggagacg agc 53
<210> 55
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI1-TS2-deepR
<400> 55
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatctga aacccgagct tcca 54
<210> 56
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BIN2-deepF
<400> 56
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgtggtt tctttgaagc attgt 55
<210> 57
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BIN2-deepR
<400> 57
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgccac tcacaatcac atgt 54
<210> 58
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHYB-OT1-deepF
<400> 58
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttcatga aggtggctca ggt 53
<210> 59
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHYB-OT1-deepR
<400> 59
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttcat tctcttgccg tggg 54
<210> 60
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHYB-OT2-deepF
<400> 60
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggtgaca atgtggctaa tggt 54
<210> 61
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHYB-OT2-deepR
<400> 61
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctactcgg ccaatgttac tcca 54
<210> 62
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHYB-OT3-deepF
<400> 62
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggcttgt tgggtgatct tga 53
<210> 63
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHYB-OT3-deepR
<400> 63
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaccca cttcacagaa agca 54
<210> 64
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS1-OT1-deepF
<400> 64
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttctgcac gattctacct gaca 54
<210> 65
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS1-OT1-deepR
<400> 65
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttctcct gtcatgtgtt cctaac 56
<210> 66
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS1-OT2-deepF
<400> 66
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttagctat gccggtggaa gtt 53
<210> 67
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS1-OT2-deepR
<400> 67
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacagaa gtagccattc cgaga 55
<210> 68
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS1-OT3-deepF
<400> 68
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcggagac ctttaagctt cgc 53
<210> 69
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS1-OT3-deepR
<400> 69
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgcaaa accatcagca gtgg 54
<210> 70
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS1-OT4-deepF
<400> 70
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtttgaa gaaggtggcc cag 53
<210> 71
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS1-OT4-deepR
<400> 71
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtggg acgatcgagc ttat 54
<210> 72
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS1-OT5-deepF
<400> 72
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgactaa ccgcttgtcc tca 53
<210> 73
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS1-OT5-deepR
<400> 73
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacgttg ccagtaaagt tcgc 54
<210> 74
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS1-OT6-deepF
<400> 74
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcgtctct tactcgcctc ctt 53
<210> 75
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS1-OT6-deepR
<400> 75
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcatct gaggttggtt cgaca 55
<210> 76
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS2-OT1-deepF
<400> 76
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttcattca gctttgccaa acca 54
<210> 77
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS2-OT1-deepR
<400> 77
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttccggt ggaattactg ctca 54
<210> 78
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS2-OT2-deepF
<400> 78
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgttcac aattactgcc acca 54
<210> 79
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS2-OT2-deepR
<400> 79
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctactctc tacgatcgca actct 55
<210> 80
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS2-OT3-deepF
<400> 80
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggagatg gaggggatgg aac 53
<210> 81
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS2-OT3-deepR
<400> 81
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcggctc tgaacaggtc taca 54
<210> 82
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS2-OT4-deepF
<400> 82
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgcaatc agatgtccgg tca 53
<210> 83
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI-TS2-OT4-deepR
<400> 83
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtacct cttcagcaac caagt 55
<210> 84
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AOC-sgF
<400> 84
gaaattaata cgactcacta tagcaaaaga ctgtcaattc cctgttttag agctagaaat 60
agcaag 66
<210> 85
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHYB-sgF
<400> 85
gaaattaata cgactcacta taggcactag gagcaacacc caacgtttta gagctagaaa 60
tagcaag 67
<210> 86
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P450-sgF
<400> 86
gaaattaata cgactcacta taggcatata gttgggtcat ggcagtttta gagctagaaa 60
tagcaag 67
<210> 87
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DWD1-TS1-sgF
<400> 87
gaaattaata cgactcacta taggtgcatc gtccaagcgc acaggtttta gagctagaaa 60
tagcaag 67
<210> 88
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DWD1-TS2-sgF
<400> 88
gaaattaata cgactcacta taggctacga cgtcaggttc taccgtttta gagctagaaa 60
tagcaag 67
<210> 89
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI1-TS1-sgF
<400> 89
gaaattaata cgactcacta taggtttgaa agatggaagc gcgggtttta gagctagaaa 60
tagcaag 67
<210> 90
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BRI1-TS2-sgF
<400> 90
gaaattaata cgactcacta taggtgaaac taaactggtc cacagtttta gagctagaaa 60
tagcaag 67
<210> 91
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BIN2-sgF
<400> 91
gaaattaata cgactcacta tagatcacag tgatgctcgt caagttttag agctagaaat 60
agcaag 66
<210> 92
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用的sgR
<400> 92
aaaaaagcac cgactcggtg ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac 60
ttgctatttc tagctctaaa ac 82
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BIN2靶位点
<400> 93
atcacagtga tgctcgtcaa 20
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向
<400> 94
atcacagtga tgctcgtcaa agg 23
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT1
<400> 95
atcacagtgc ggctcgtcaa ggg 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT2
<400> 96
cacacagtga tgttcgtcaa ggg 23
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT3
<400> 97
ataccaggga tgctcgtcaa tgg 23
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT4
<400> 98
atcatagtga tgctcatgaa ggg 23
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT5
<400> 99
atcacattga tgctctacat agg 23
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT6
<400> 100
ataacagaga cgatcgtcaa agg 23
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT7
<400> 101
atcacactga tgccctacaa agg 23
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT8
<400> 102
atcacattga ggcccgacaa agg 23
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT9
<400> 103
atcacactga tgcactacaa agg 23
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT10
<400> 104
cacacagtga tgttcatcaa agg 23
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT11
<400> 105
atgacaatta tgctcttcaa agg 23
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT12
<400> 106
atcaaagtgc tcctcgtgaa agg 23
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT13
<400> 107
tacacaatgt tgctcgtcaa cgg 23
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT14
<400> 108
gccacagtga tgatcgtcga cgg 23
<210> 109
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT15
<400> 109
atatcaggga tgctcgccaa tgg 23
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT16
<400> 110
aaatcagtga tcctcgtcaa cgg 23
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT17
<400> 111
atggcagtga tggtcgtgaa ggg 23
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT18
<400> 112
ctcagagtgt tgctcttcaa tgg 23
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT19
<400> 113
atcacagaga tgctccaaaa tgg 23
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT20
<400> 114
atcaaggtta ttctcgtcaa ggg 23
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT21
<400> 115
agcacagtga ggcttgtcga ggg 23
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT22
<400> 116
atatcaagga tgctcgtcaa tgg 23
<210> 117
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT23
<400> 117
ttcccagaga tgctcttcaa ggg 23
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT24
<400> 118
gtcacattga tgctcatcat ggg 23
<210> 119
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT25
<400> 119
atcacagaga tgttcatcat cgg 23
<210> 120
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT26
<400> 120
atcaaaatga ggctcgacaa cgg 23
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT27
<400> 121
ataacaatga agctcgttaa tgg 23
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT28
<400> 122
atatcaggga tgctcatcaa tgg 23
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT29
<400> 123
atcatattga agcacttcaa agg 23
<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT30
<400> 124
ctcacattga tgcactacaa agg 23
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT31
<400> 125
tccacaatga tgcacttcaa agg 23
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT32
<400> 126
ctcacaatgt tgctctacaa agg 23
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT33
<400> 127
atgacaatga agctcgtaat agg 23
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT34
<400> 128
ctctcagtgg tgctggtcga agg 23
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT35
<400> 129
atcacactta tactcgacag agg 23
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT36
<400> 130
ctcacagtga ggcttttaaa agg 23
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT37
<400> 131
atcactgtga tgttcgggag agg 23
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT38
<400> 132
ctctcggtgg tgctggtcaa agg 23
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT39
<400> 133
gtgacagtca tgcacgtcca agg 23
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT40
<400> 134
atcacactga ttccctacaa agg 23
<210> 135
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT41
<400> 135
atgagagtga ttttcgttaa agg 23
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT42
<400> 136
atcactgtga tgtttaccaa agg 23
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT43
<400> 137
atcacagtga tgcttccaca agg 23
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT44
<400> 138
gtaacagtgg tgttcgacaa agg 23
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT45
<400> 139
atcccaatca ggctcttcaa agg 23
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT46
<400> 140
ctcacactga tgcacttcat agg 23
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT47
<400> 141
aacacactga ggctctgcaa agg 23
<210> 142
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT48
<400> 142
atggcactga tgcacgacaa agg 23
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT49
<400> 143
cacactgtca tgttcgtcaa agg 23
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT50
<400> 144
ttgacagtgt tcctagtcaa agg 23
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT51
<400> 145
atcataggta tgttggtcaa agg 23
<210> 146
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT52
<400> 146
atcacactga tgccctacat agg 23
<210> 147
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT53
<400> 147
atcacactga ttccctgcaa agg 23
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT54
<400> 148
aacatagcgt tgctagtcaa agg 23
<210> 149
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT55
<400> 149
atcacatgga tcctcctgaa agg 23
<210> 150
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT56
<400> 150
ttttcaatga tgctcatcaa agg 23
<210> 151
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT57
<400> 151
ttctctgtca tgttcgtcaa agg 23
<210> 152
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT58
<400> 152
atcacagtat tggtccacaa agg 23
<210> 153
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT59
<400> 153
atgctagaga tgcttgtcaa agg 23
<210> 154
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT60
<400> 154
atcacactga tgcactacag agg 23
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT61
<400> 155
ctcacactga tgcactacaa agg 23
<210> 156
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT62
<400> 156
ttgatagtgt tcctcgtcaa agg 23
<210> 157
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT63
<400> 157
atcacagata tcatggtcaa agg 23
<210> 158
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT64
<400> 158
atcttagtca agctagtcaa agg 23
<210> 159
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT65
<400> 159
atcagattta tgctcattaa agg 23
<210> 160
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT66
<400> 160
atctgagtga tcttcgtcga agg 23
<210> 161
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT67
<400> 161
atggcagtgt tcctagtcaa agg 23
<210> 162
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT68
<400> 162
atcacattta tgcttatcta agg 23
<210> 163
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT69
<400> 163
tccacagtgt tcctagtcaa agg 23
<210> 164
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT70
<400> 164
ttcttaggga tggtcgtcaa agg 23
<210> 165
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT71
<400> 165
aacacagtca tgctcaccag agg 23
<210> 166
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT72
<400> 166
aaaagagtga tgcttatcaa agg 23
<210> 167
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT73
<400> 167
cttccagtga tgatagtcaa agg 23
<210> 168
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT74
<400> 168
atcaaagtga gatacgtcaa agg 23
<210> 169
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT75
<400> 169
atgatattga cgcttgtcaa agg 23
<210> 170
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT76
<400> 170
atcacgctga tgggcctcaa agg 23
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT77
<400> 171
atagatgtga tgcttgtcaa agg 23
<210> 172
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT78
<400> 172
gtcccattga tgcacgacaa agg 23
<210> 173
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT79
<400> 173
ttgacaatta tgctcttcaa agg 23
<210> 174
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT80
<400> 174
attaaaatca tgttcgtcaa agg 23
<210> 175
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT81
<400> 175
cacacagtca tgttcctcaa agg 23
<210> 176
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT82
<400> 176
ttgacaatca tgctcttcaa agg 23
<210> 177
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT83
<400> 177
ttcatagtga tgtttttcaa agg 23
<210> 178
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT84
<400> 178
atcacgctca tgatcctcaa agg 23
<210> 179
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT85
<400> 179
atcacactca tggacctcaa agg 23
<210> 180
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT86
<400> 180
atcatattga agcccttcaa agg 23
<210> 181
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT87
<400> 181
atcacaatga tggtcgggga agg 23
<210> 182
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT88
<400> 182
atcataatga agcccttcaa agg 23
<210> 183
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT89
<400> 183
atgaatgtta tgctcttcaa agg 23
<210> 184
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT90
<400> 184
atcacactga taccctacaa agg 23
<210> 185
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT91
<400> 185
aatataatga ttctcgtcaa agg 23
<210> 186
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT92
<400> 186
atgactgtgt tccttgtcaa agg 23
<210> 187
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT93
<400> 187
ctcaaagtca tgatcttcaa agg 23
<210> 188
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT94
<400> 188
ctcaatgaga tgctcgacaa agg 23
<210> 189
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT95
<400> 189
atcacactta agctcttgaa agg 23
<210> 190
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT96
<400> 190
gtgacagtgt tgcttgtcga agg 23
<210> 191
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT97
<400> 191
ataacaacaa tgatcgtcaa agg 23
<210> 192
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT98
<400> 192
aacactgtga tgtttgtcag agg 23
<210> 193
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT99
<400> 193
atcacgctga tagtcctcaa agg 23
<210> 194
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OT100
<400> 194
gtgacaatta tgctcttcaa agg 23

Claims (32)

1.一种用于从原生质体生成植物的方法，其包括敲除或敲入所述原生质体的一个或多个内源基因。
2.权利要求1的方法，其中所述植物的内源基因为能够通过敲除或敲入增加所述植物的胁迫抗性的基因。
3.权利要求1的方法，其中所述植物的内源基因为参与植物的油菜类固醇信号转导的基因。
4.权利要求1的方法，其中：
(i)在所述敲除步骤中，所述内源基因为选自下组的一个或多个基因：BIN2基因、BKI1基因和它们的同源基因；和
(ii)在所述敲入步骤中，敲入的基因为选自下组的一个或多个基因：BRI1基因、BSU基因、BZR1基因、DWF4基因、CYP85A1和它们的同源基因。
5.权利要求1的方法，其中所述基因的敲除通过敲除选自下组的基因的一个或两个等位基因进行：BIN2基因、BKI1基因和它们的同源基因。
6.权利要求1的方法，其中所述基因的敲除通过基因敲除进行，所述基因的敲入通过基因敲入进行。
7.权利要求1的方法，其中所述基因的敲除使用对选自下组的一个或多个基因特异性的工程改造的核酸酶进行：BIN2基因、BKI1基因和它们的同源基因。
8.权利要求7的方法，其中所述工程改造的核酸酶选自下组：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和RNA-指导的工程改造的核酸酶(RGEN)。
9.权利要求8的方法，其中所述RGEN包含特异性结合选自下组的一个或多个基因的特定序列：BIN2基因、BKI1基因和它们的同源基因的指导RNA，或编码所述指导RNA的DNA；和编码Cas蛋白的核酸，或Cas蛋白。
10.权利要求8的方法，其中所述基因的敲除通过将所述特异性结合选自下组的一个或多个基因的特定序列：BIN2基因、BKI1基因和它们的同源基因的指导RNA，或编码所述指导RNA的DNA；和编码Cas蛋白的核酸，或Cas蛋白引入所述原生质体进行。
11.权利要求10的方法，其中所述指导RNA为双RNA或单链指导RNA(sgRNA)的形式，其包含crRNA和tracrRNA。
12.权利要求11的方法，其中所述单链指导RNA包含crRNA和tracrRNA的一部分。
13.权利要求11的方法，其中所述单链指导RNA为分离的RNA的形式。
14.权利要求10的方法，其中编码所述指导RNA的DNA通过载体编码，并且所述载体为病毒载体、质粒载体或农杆菌属(Agrobacterium)载体。
15.权利要求10的方法，其中所述Cas蛋白为Cas9蛋白或其变体。
16.权利要求10的方法，其中所述Cas蛋白识别NGG三核苷酸。
17.权利要求10的方法，其中所述Cas蛋白连接到蛋白转导结构域。
18.权利要求15的方法，其中所述Cas9蛋白的变体为Cas9蛋白的突变体形式，其中所述催化天冬氨酸残基被另外的氨基酸取代。
19.权利要求18的方法，其中所述氨基酸为丙氨酸。
20.权利要求10的方法，其中所述编码Cas蛋白的核酸或Cas蛋白源自链球菌属(thegenus Streptococcus)的微生物。
21.权利要求20的方法，其中所述链球菌属的微生物为酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)。
22.权利要求1的方法，其中所述原生质体源自山莴苣(Lactuca sativa)。
23.权利要求10的方法，其中所述引入通过将编码Cas蛋白的核酸或Cas蛋白和所述指导DNA或编码所述指导DNA的DNA共转染或连续转染到原生质体中进行。
24.权利要求23的方法，其中所述连续转染通过首先转染Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸，然后其次转染裸指导RNA进行。
25.权利要求10的方法，其中所述引入通过选自下组的方法进行：微注射、电穿孔、DEAE-葡聚糖处理、脂转染、纳米颗粒介导的转染、蛋白质转导结构域介导的转染和PEG介导的转染。
26.权利要求1的方法，其进一步包括再生具有敲除基因的原生质体。
27.权利要求26的方法，其中所述再生包括在含有琼脂糖的培养基中培养具有选自下组的一个或多个敲除基因的原生质体以形成愈伤组织：BIN2基因、BKI1基因和它们的同源基因；和在再生培养基中培养所述愈伤组织。
28.一种从通过根据权利要求1至27中任一项的方法生成的基因组编辑的原生质体再生的植物。
29.一种用于切割植物细胞中的编码BIN2基因的DNA的组合物，其包含：对编码油菜类固醇不敏感蛋白2(BIN2)基因、BKI1基因或它们的同源基因的DNA特异性的指导RNA，或编码所述指导RNA的DNA；和编码Cas蛋白的核酸，或Cas蛋白。
30.权利要求29的组合物，其中所述组合物诱导植物细胞中的靶向诱变。
31.一种用于从原生质体生成植物的组合物，其包含对编码油菜类固醇不敏感蛋白2(BIN2)基因、BKI1基因或它们的同源基因的DNA特异性的指导RNA，或编码所述指导RNA的DNA；和编码Cas蛋白的核酸，或Cas蛋白。
32.一种用于从原生质体生成植物的试剂盒，其包含根据权利要求29至31中任一项的组合物。
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