NL8901931A - Werkwijze voor het plaatsgericht introduceren van vreemd dna in het genoom van planten. - Google Patents

Description

Werkwi.ize voor het Dlaatsqericht introduceren van vreemd DNA inhet genoom van planten.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor hetplaatsgericht introduceren van vreemd DNA in het genoom vanplanten.

In de afgelopen jaren zijn technieken ontwikkeld voor degenetische manipulatie van plantecellen en de regeneratie ervantot transgene planten. Voor de introductie van het gewenste DNAin plantecellen kan enerzijds gebruik gemaakt worden van zgn.direkte DNA-transformatie van planteprotoplasten. Hiervoor zijnde Ca/PEG-methode (Krens et al., 1982; Negrutiu et al., 1987), deelectroporatie-methode (Shillito et al., 1985) en de micro-injectie-methode (Crossway et al., 1986) beschreven. Met deonlangs ontwikkelde microprojectiel-methode (Klein et al., 1987)kunnen ook intacte planteweefsels met naakt DNA getransformeerdworden. Anderzijds kan met behulp van het natuurlijke DNA-transfer systeem van de bakteriën Aarobacterium tumefaciens enAqrobacterium rhizooenes het gewenste DNA de plantecel binnengebracht worden (voor review zie Klee et al., 1987).

Aqrobacterium tumefaciens en Aqrobacterium rhizooenes zijn instaat na aanhechting aan de plantecelwand een stuk DNA deplantecel binnen te brengen. Dit stuk DNA, het transfer(T)-DNA,maakt als T-regio in de bakterie deel uit van een groot (190-240kbp) plasmide dat het Ti-plasmide genoemd wordt in geval van Ai.tumefaciens en het Ri-plasmide in geval van A. rhizooenes. Het T-DNA wordt geïntegreerd in het kerngenoom van de plantecel (Thomashow et al., 1980; Chilton et al., 1982). Genen gelegen inhet T-DNA komen daar tot expressie en zorgen ervoor, dat deplantecel zich gaat gedragen als een tumorcel (Ooms et al., 1981;Willmitzer et al., 1982a+b)

Naast de genen die verantwoordelijk zijn voor de tumorinductiezijn er genen op het T-DNA aanwezig die zorgen voor de productievan zogenaamde opines. Opines zoals octopine en nopaline kunnenals energie-, stikstof- en/of koolstofbron dienen voor

Aarobacterium. De enzymen die nodig zijn voor het catabolisme vandeze opines worden gecodeerd door genen die op het Ti-(Ri-)plasmide gelegen zijn (o.a. Bomhoff et al., 1976; Kerr enRoberts, 1976; Hooykaas et al., 1977). Afhankelijk van de opine-produktie worden Ti- en Ri-piasmiden onderverdeeld in groepen(b.v. octopine of nopaline Ti-plasmiden).

De T-regio wordt begrensd door twee imperfekte 'direct repeats'van 25 baseparen die ook wel 'borders' worden genoemd (Yadav etal., 1982; Zambryski et al. 1982; Gielen et al., 1984; Slightomet al., 1985). Aanwezigheid van deze borders in cis isnoodzakelijk voor de correcte overdracht van het T-DNA (Wang etal., 1984; Peralta en Ream, 1985). Daarbij is de aanwezigheid vande rechter border noodzakelijk voor efficiënte T-DNA overdracht(Ooms et al., 1982; Shaw et al., 1984b; Wang et al., 1984).Afhankelijk van het testsysteem wordt gevonden dat deletie van delinker border in bepaalde experimenten wel (Bakkeren et al.,1989), echter in andere experimenten niet leidt tot lagerefrequentie van T-DNA overdracht naar de plantecel (Hille et.al.,1983a; Joos et al., 1983;). Naast de rechter border is eensequentie aanwezig, die de efficiëntie van de T-DNA overdrachtsignificant verhoogt (Peralta et al., 1986; Van Haaren et al.,1986, 1987a; Wang et al., 1987). De werking van dit 'enhancer'element is onafhankelijk van positie en oriëntatie ten opzichtevan de rechterborder. Uit experimenten met synthetische bordersis gebleken dat de rechter en linker bordersequentiesuitwisselbaar zijn en dat dus de 'enhancer' bepaalt welkebordersequentie de dominante rechter border is (Peralta et al.,1986; Van Haaren et al., 1987).

Naast het T-DNA zijn er de virulentie genen, die enerzijds op hetchromosoom en anderzijds op het Ti-plasmide (Vir-regio) gelegenzijn. Deze genen zijn betrokken bij de aanhechting van debakterie aan de plantecel en bij het overdrachtsproces van het T-DNA naar de plantecel (voor review zie Melchers en Hooykaas,1987).

Dit natuurlijke systeem is dus in principe te gebruiken voor deintroduktie van vreemd DNA in de plant.

De grootte van de wildtype Ti- en Ri- plasmiden bemoeilijktechter de manipulatie van het T-DNA via recombinant DNAtechnieken. Voor genetische modificatie van planten viaAorobacterium wordt daarom gebruik gemaakt van vectorsystemen,waarbij het te manipuleren piasmide een handelbare grootte heeft.Bij de zgn. coïntegraat vectoren, kan via kleine in E. colireplicerende plasmiden het vreemde DNA (al of niet naast éénborder of tussen twee borders) door middel van homologerecombinatie op het Ti- (of Ri-) plasmide worden gebracht (Hilleet al., 1983b; Barton en Chilton, 1983; Zambryski et al., 1983;Deblaere et al., 1985; Fraley et al., 1985). Bij het zgn. binairevector systeem wordt de T-regio gedragen door de binaire vector,een plasmide dat zowel in E. coli als in A. tumefaciens kanrepliceren, terwijl de Vir-regio gelegen is op een helper Ti-(Ri)plasmide (De Framond et al., 1983; Hoekema et al., 1983; Hoekemaet al., 1984a). De T-regio omvat slechts nog bordersequentieswaartussen in E. coli de te transformeren genen gedoneerd kunnenworden. Het 'enhancer' element is daarbij naast de rechter borderaanwezig. Ook indien een T-DNA gelegen is op het chromosoom vanAorobacterium kan het overgedragen worden naar de plantecel, mitsde virulentie genen in trans in dezelfde bakterie aanwezig zijn(Hoekema et al., 1984b).

Wanneer Ti- of Ri-plasmiden overgebracht worden naar aanAorobacterium gerelateerde bakteriën zoals Rhizobium (Hooykaas etal., 1977) of Phvllobacterium (Van Veen et al., 1988) dan blijktde T-regio van deze plasmiden toch overgedragen te worden naar deplantecel. Uit recent onderzoek is gebleken dat plasmiden die eenorigin of transfer bevatten en zijn mobilisatie genen ook doorhet Aorobacterium virulentiesysteem overgedragen kunnen wordennaar de plant. Dit suggereert dat bakteriën die in staat zijn DNAnaar hun soortgenoten over te brengen ook DNA in plantecellenkunnen introduceren (Buchanan-Wollaston et al., 1987).

Vooral door middel van het Aorobacterium systeem kunnenplantecellen met zeer hoge frequentie worden getransformeerd. Vande calTi die geregenereerd werden uit protoplasten van Nicotianatabacum cv. petit havana SRI, die gedurende 72 uur metAorobacterium gecocultiveerd waren, bleek 20-50% getransformeerd te zijn (van den Elzen et al., 1985a; Depicker et al., 1985). Uitbladschijfjes van tabaksplanten die geïnoculeerd zijn metAqrobacterium. kunnen met een redelijke frequentiegetransformeerde scheuten geregenereerd worden (Horsch et al.,1985). De belangstelling voor het Aqrobacterium systeem is nogeens toegenomen nadat gebleken was, dat naast dicotyle plantenook monocotylen - waaronder bolgewassen, asperges en granen - metAqrobacterium getransformeerd kunnen worden (Hooykaas-vanSlogteren et al., 1984; Hernalsteens et al., 1984; Graves enGoldman, 1986;1987; Grimsley et al., 1987).

Het via Aqrobacterium in de plantecel gebrachte DNA blijkt opwillekeurige plaatsen in het genoom te integreren (Chyi et al.,1986; Wallroth et al., 1986; Spielman en Simpson, 1986). Inbepaalde situaties is het echter wenselijk of zelfs noodzakelijkde integratieplaats van het DNA van te voren te kunnen bepalen.

Zo zou het te introduceren gen gericht kunnen worden naar eenplaats waar de gewenste regulatie van expressie gewaarborgd is.Ook zou het nieuw binnengebrachte DNA gebruikt kunnen worden omeen specifiek plantegen te muteren of te inactiveren.

Homologe recombinatie is een proces dat zeer efficiënt optreedtbij bakteriën en verschillende gistsoorten. Het wordt in dezeorganismen gebruikt voor de gerichte integratie van nieuwbinnenkomend DNA (Ruvkun en Aussubel, 1981; Orr-Weaver et al.,1981). In experimenten met gist (Orr-Weaver et al., 1981) werdtevens aangetoond dat DNA moleculen die in het gebied vanhomologie met het kern DNA gelineariseerd waren 10 tot 1000 maalefficiënter via de homologie geïntegreerd konden worden.

Ook in zoogdiercellen is homologe recombinatie tussen genomischen nieuw geïntroduceerd DNA aangetoond (Smithies et al., 1985;Thomas en Capecchi, 1987; Song et al., 1987; Baker et al., 1988;voor recent review Capecchi, 1989). Ook in deze systemen bleekbij cotransformatie van een tweetal defectieve mutanten datlinearisatie in het gebied van homologie van één van de mutantenresulteerde in een gemiddeld 10 maal hogere frequentie vanrecombinatie (Kucherlapati et al.,1984).

Met een van de direkte DNA transformatie methodes is reedsaangetoond, dat twee gelijktijdig in de plantecel geïntroduceerdeDNA moleculen met elkaar recombineren op plaatsen van homologie(Wirtz et al., 1987). Tevens is gevonden dat via deze methodebinnengebracht DNA kan recombineren met homologe sequenties ophet chromosoom (Paszkowski et al., 1987, 1988).

Tot nu toe zijn geen meldingen gemaakt van experimenten waarbijAorobacterium gebruikt werd om DNA moleculen via homologerecombinatie in het plantegenoom te integreren. Het gebruik vanAgrobacterium ligt ook minder voor de hand aangezien:a) de aanwezigheid van bordersequenties en enhancers,linearisering van het te integreren DNA molecuul in het gebiedvan homologie (resulterend in met de target sequentie homologeuiteinden) onmogelijk maakt, en b) het enkelstrengs T-DNAmolecuul mogelijkerwijze niet beschikbaar zou zijn voor homologerecombinatie door het enkelstrengs karakter en de associatie metvirulentie eiwitten zoals Vir E (Giet! et al., 1987; Das, 1988;Sen et al., 1989; Citovsky et al., 1988, 1989; Christie et al.,1988) en Vir D2. Van Vir D2 is zelfs bekend dat het covalentgebonden is aan het 5'uiteinde van de zgn. T-strand (Young andNester, 1988; Herrera-Estrella et al., 1988; Ward and Barnes,1988).

De uitvinding voorziet nu in een werkwijze voor het producerenvan transgene planten, met het kenmerk, dat men een gen, eengenfragment of andere DNA-sequenties plaatsgericht integreert inhet plantegenoom door cocultivering van plantecellen ofplanteweefsel met Aorobacterium- of daaraan verwante bacteriën,zoals Aorobacterium rhizoqens. Phvllobacterium of Rhizobium.

bevat waarvan de T-regio een recombinant DNA molecuul·; omvattende hette integreren DNA, welk DNA een zodanige mate van homologie aaneen sequentie van het plante-DNA vertoont of door dergelijkehomologe DNA-sequenties wordt geflankeerd, dat bij detransformatie van de plantecellen een plaatsgerichte integratievan het te integreren DNA in het plantegenoom door homologerecombinatie plaats heeft.

De uitvinding voorziet tevens in DNA moleculen of vectoren welkedoor de omschreven methode via Aorobacterium of daaraan verwante bacteriën plaatsgericht geïntegreerd kunnen worden en inAgrobacteriumstammen, of daaraan verwante bacteriën welke dezevectoren bevatten. Ook voorziet de uitvinding in de doorplaatsgerichte integratie gemodificeerde plantecellen, alsmede devan deze gemodificeerde plantecellen afkomstige planten en delenvan planten, inclusief de via asexuele danwel sexuelevoortplanting verkregen nakomelingen.

In onze experimenten is bestudeerd of het T-DNA na overdrachtnaar de plantecel fysisch tot recombinatie in staat is. Voor deexperimenten is een model systeem opgezet waarbij enerzijds tweeverschillende T-DNA's die homologe sequenties bevatten,tegelijkertijd in de plantecel geïntroduceerd zijn. Hierbij zijnT-DNA's geconstrueerd welke zo klein mogelijke rechter- en linkerborder fragmenten bezitten. Bekeken is of deze T-DNA's op degebieden van homologie in de plantecel met elkaar recombineren enmet welke frequentie deze recombinatie plaatsvindt. Anderzijdszijn kopiën van een T-DNA waarvan ook weer de lengte van deborder sequentie geminimaliseerd is geïntroduceerd inplantecellen, die reeds een kopie van een ander homoloog T-DNA inhet genoom geïntegreerd hebben. Uit de experimenten blijkt datrecombinatie tussen twee vanuit verschillende bacterïen in deplantecel geïntroduceerde T-DNA's met een frequentie van 1-4% (van de gecotransformeerde cellen) optreedt. Ook is waargenomendat homologe recombinatie tussen een geïntroduceerd T-DNA en eenhomologe op het plantegenoom gelegen target sequentie in ±0.01%van de getransformeerde cellen optreedt. Dit betekent dat evenalsbij direkte DNA transfer ook bij DNA transformatie viaAarobacterium het getransformeerde DNA (T-DNA) fysisch in staatis tot homologe recombinatie binnen de plantecel.

In een tweede reeks experimenten is aangetoond dat het mogelijkis een T-DNA te laten recombineren met een endogeen plantegenmits er met het plantegen homologe sequenties aanwezig zijn opdit T-DNA. De in het chromosoom gerecombineerde DNA sequentieszijn genetisch overdraagbaar.

De frequenties van recombinatie (ten opzichte van het aantaltransformanten) die wij vinden voor het Aarobacterium systeem zijn vergelijkbaar met de frequenties gevonden door Wirtz et al.(1987) en door Paszkowski et al. (1988) voor een directe DNAtransformatie methode.

Voor het eerst is hiermee aangetoond dat het mogelijk is hetnatuurlijke transformatie systeem van Aarobacterium te gebruikenvoor plaatsgerichte mutagenese van het plantegenoom. Dit isverrassend gezien het beschreven model waarbij het T-DNA als eenenkel strengs lineair molecuul overgedragen wordt naar deplantecel (Stachel et al., 1986; Stachel et al., 1987; Albrightet al., 1987) en waarbij enkelstrengs DNA bindende eiwitten hetDNA mogelijk afschermen van nuclease-werking vóór integratie inhet genoom (Gietl et al., 1987; Citovsky et al., 1988, 1989; Daset al., 1988; Sen et al., 1989; Christie et al., 1988; Young andNester, 1988; Herrera-Estrella et al., 1988; Ward and Barnes,1988).

Het gebruik van het Aarobacterium systeem voor plaatsgerichtemutagenese van het plantegenoom biedt een aantal voordelen bovenhet gebruik van direkte DNA transformatie naar protoplasten: 1) Protoplasten worden door Aarobacterium met een aanzienlijkhogere frequentie getransformeerd dan bij gebruikmaking van direkte DNA transformatie mogelijk is. Gegeven het feit dat degevonden recombinatie frequentie per hoeveelheid getransformeerdecellen bij de hier beschreven methode tenminste gelijk is aan demethode beschreven door Paszkowski, is het aantal plantecel!ennodig om de via homologe recombinatie gemuteerde cel te kunnenverkrijgen, daardoor aanzienlijk kleiner.

2) Regeneratie van protoplasten tot een plant vormt bij veleplantesoorten nog een probleem. Dit beperkt het gebruik van de'naakt' DNA transformatie methoden waarbij met protoplastengewerkt moet worden. Daarnaast verloopt de regeneratie vanprotoplast naar plant via een callus fase. In een dergelijke fasewordt somaclonale variatie veelvuldig waargenomen. Somaclonalevariatie omvat alle chromosomale rearrangements in mitotischdelend weefsel en veroorzaakt chimeer weefsel. Voor het verkrijgen van via Aarobacterium getransformeerde planten is géénregeneratie van protoplasten nodig. Eenvoudig te regenererenweefsels van de plant zoals o.a. bladschijfjes (Horsch et al.,1985), aardappel schijfjes (Sheerman en Bevan, 1988) of meristernen(Ulian et al., 1988) kunnen na cocultivatie met Aarobacteriumgetransformeerde planten opleveren.

3) In tegenstelling tot de integratie van het direktgeïntroduceerde DNA is de integratie van het T-DNA nauwkeurig.Hiermee wordt bedoeld dat T-DNA copiën vaak intact integreren endat 'scrambling' nauwelijks optreedt (Hain et al., 1985;Czernilofsky et al., 1986; Deroles en Gardner, 1988). Wirtz etal. (1987) en Paszkowski et al. (1988) vinden in hunexperimenten, waar zij direkte DNA transformatie gebruiken omhomologe recombinatie in de plantecel aan te tonen, vrij complexeintegratie patronen in het plantegenoom.

4) Bij direkte DNA transformatie moet in sommige methoden gebruikgemaakt worden van zgn. carrier-DNA ter verhoging van detransformatie frequentie. Dit carrier-DNA zal waarschijnlijkstorend werken op de homologe recombinatie gebeurtenis. Tevenswordt dit carrier-DNA min of meer random in het plantegenoomgeïntegreerd (Peerbolte et al., 1985) en kan daardoor eldersongewenste mutaties veroorzaken. Bij het Aarobacterium systeemwordt geen gebruik van carrier-DNA gemaakt.

Voorbeeld

Als vreemd DNA is het NPTII gen gekozen. Het NPTII gen isafkomstig van het bacteriële transposon Tn5 (Beek et al., 1982)en codeert voor het enzym neomycine phosphotransferase. Wanneerhet NPTII gen geplaatst wordt onder de regulatorsignalenafkomstig van plantegenen (of Aarobacterium T-DNA genen), kan hetna introductie in de plantecel tot expressie komen en resistentiegeven tegen het antibioticum kanamycine (Bevan et al., 1983;Herrera-Estrella et al., 1983). Plantecellen zijn zeer gevoeligvoor kanamycine. Het gen is daardoor te gebruiken als selecteerbare merker voor getransformeerde plantecellen ofstukjes weefsel. Dit Kmr gen is gekozen als model/merker gen voorde detectie van homologe recombinatie in protoplasten vanNicotiana tabacum cv. petit havana SRI.

Van het Kmr gen zijn defectieve vormen geconstrueerd. Drie vandeze defectieve genen bezitten een mutatie aan de 5' kant van hetgen en twee een mutatie aan de 3' kant van het gen (zie figuur2).

Homologe recombinatie in tabaksorotoplasten tussen tweeqeli.ikti.idig geïntroduceerde T-DNA's

Voor de transformatie experimenten zijn twee mutanten gekozen nl.een 5' mutant met een deletie in het 5' coderende gebied van hetgen en een 3' deletiemutant die een stuk van het 3' coderendegebied en het transcriptie terminatie signaal mist. De 5' mutantis gedoneerd in een binaire vector tussen borders afkomstig vaneen nopaline Ti piasmide, resulterend in het piasmide pSDM102.Tussen de borders bevindt zich links van het mutante gen een inplanten funktionerend hygromycine resistentie (Hmr) gen (ziefiguur 4). De 3' mutant is gedoneerd in een binaire vectortussen de wildtype rechterborder van het nopaline Ti-plasmide eneen synthetische of wildtype border van het octopine Ti-plasmide,resulterend in de plasmiden pSDM201 en pSDM211 respectievelijk(zie figuur 5). Deze plasmiden zijn overgebracht naarAgrobacterium stammen die reeds een helper Ti-plasmide zonder T-DNA bevatten (b.v. Hoekema et al., 1983; Deblaere et al., 1985).

De Agrobacterium stam met pSDM102 is in combinatie met de stammet pSDM201 (of de stam met p$DM211) gecocultiveerd mettabaksprotoplasten. Na cocultivatie zijn de protoplasten totcallus opgekweekt en is er geselecteerd op kanamycineresistentie. Eén tot vier procent van de gecotransformeerde cal 11bleek Kmr te zijn. Uit de verkregen Kmr cal 1i zijn plantengeregeneerd. In bladextracten van deze planten bleek zoalsverwacht de NPTII aktiviteit aantoonbaar. Met behulp van nietdenaturerende gels (Platt en Yang, 1987) kon na electroforeseNPTII aktiviteit op de juiste positie in de gel worden aangetoond. De planten zijn ook op DNA niveau geanalyseerd.

Bewijs voor de aanwezigheid van een hersteld Kmr gen in hetplantegenoom kon hiermee worden geleverd. In de controleexperimenten waar protoplasten slechts met één van de stammenwaren gecocultiveerd kwam slechts één Kmr cal 1i op. DNA analysewees echter uit dat deze cloon geen intact NPTII gen bevat.

In theorie zou de recombinatie die aanleiding geeft tot hetontstaan van het intacte Kmr gen, in Aarobacterium (in plaats vanin de plantecel) plaatsgevonden kunnen hebben, nadat de binairevectoren tijdens cocultivatie van de éne stam naar de andereovergedragen waren. Dit kon echter uitgesloten worden in(controle) kruisingsexperimenten. Overdracht was nietwaarneembaar in deze experimenten, hetgeen betekent dat deoverdrachtsfrequentie lager is dan 10‘1°. Het aantal bacteriën datin deze experiment getest werd (1010), overschrijdt ruimschootshet aantal dat in de cocultivatie experimenten gebruikt is(2xl08). We kunnen dus concluderen dat herstel van Kmr isopgetreden door een recombinatie gebeurtenis in de planteceltussen de twee homologe T-DNA's.

Recombinatie in tabaksprotoplasten tussen een in dezeprotoplasten geïntroduceerd T-DNA en een homologe T-DNA kooiewelke reeds in het genoom van deze protoplasten aanwezig is.

Transgene tabaksplanten zijn verkregen die reeds een kopie vanéén van de T-DNA's in het genoom geïnserteerd hebben.Protoplasten van deze transgene planten zijn gecocultiveerd metAarobacterium stammen die de tweede homologe T-DNA copie naar deplantecel overdragen. Zo zijn cellen van tabaksplanten die de T-regio van het pSDM104-construct (bevat het 3' deletie mutante Kmrgen, figuur 3 en 4) in het genoom geïnserteerd hebben,getransformeerd met de T-regio van het pSDMIOl-construct (bevathet 5' deletie I mutante Kmr gen, figuur3).

Eén op de zeshonderd getransformeerde cellen gaf het resistentefenotype. In één van de vijftien geanalyseerde Kmr lijnen kon het intacte NPTII gen worden teruggevonden, waaruit blijkt datherstel van het Kmr gen is opgetreden via homologe recombinatietussen de in het genoom van de plantecel geïnserteerde T-DNAkopie en de in de plantecel geïntroduceerde T-DNA kopie.

Recombinatie in tabaksprotoplasten tussen een endogeen planteaenen een in deze protoplasten geïntroduceerd T-DNA dat sequentiesdraagt die homoloog zi.in met het betreffende gen.

Gezien de bovenstaande resultaten is bestudeerd of het mogelijkis om via Aorobacterium door middel van plaatsgerichte mutageneseeen endogeen gen in het plantegenoom uit te schakelen. Alsendogeen gen is hiervoor een actief lid van de Rubisco SSUmultigen familie gekozen. Genen van deze familie coderen voor dekleine subeenheid van ribulose-l,5-bifosfaatcarboxylase/oxygenase(rbcSl. een kerngecodeerd maar in de chloroplast gelocaliseerdeiwit, dat betrokken is bij de fotosynthese. Expressie van deSSU-genen is lichtafhankelijk.

Uit een subgenomische lambda-faag bank van Nicotiana tabacum cv.petit havana SRI is een 2.4 Kbp HindlII fragment geïsoleerdwaarop het rbcS-gen gelegen is met drie introns in.de coderenderegio. Sequentie analyse wees uit dat de betreffende kloonovereenkomt met een reeds eerder door Mazur et al. (1984)beschreven rbcS-gen (zie figuur 10). De promoter van dit genvertoont weefsel specifieke transcriptionele aktiveit indiengefuseerd met het coderende gebied van het β-glucuronidase gen(Jefferson et al., 1987). De betreffende cloon is gebruikt voorde constructie van een tweetal trans!ationele fusies tussen hetcoderende gebied van het rbcS-gen, dat uit vier exons bestaat ende coderende regio van het NPTII gen (zie figuur 10). Het enechimaere gen, een translationele fusie in het tweede exon vanrbcS, codeert voor een eiwit waarbij N-terminaal aan het NPTIIhet transportpeptide en de eerste 23 aminozuren van het rijpe SSUeiwit gekoppeld is. Een dergelijk fusie eiwit tussen hettransportpeptide en de eerste 23 aminozuren van het mature eiwitvan een rbcS-gen uit erwt en NPTII is reeds beschreven en functioneel gebleken (Schreier et al., 1985). Het andere fusiegen codeert voor een eiwit waarbij het transportpeptide en 99aminozuren van het rijpe SSU-eiwit aan de N-terminus van hetNPTII enzym gekoppeld zijn. Transformatie van elk van de chimaeregenen afzonderlijk naar de plantecel resulteert in1ichtafhankelijk Kmr transformanten waarbij het SSU-NPTII fusieeiwit naar de chloroplast getransporteerd wordt.

Van beide chimaere genen is het Pstl/Hindl11 fragment dat depromoterregio en de eerste 8 aminozuren van het transportpeptidemist, gedoneerd tussen synthetische linker en rechter border vande binaire vector pSDM14 (figuur 11). Ook de intacte fusie-genenzijn in pSDM14 gebracht. Na introduktie van de verschillendebinaire vectoren in een Aarobacterium helperstam zijnprotoplasten van Nicotiana tabacum cv. petit havana SRIgecocultiveerd met de resulterende Aarobacterium trans-conjuganten. Aarobacterium stammen die de constructen met deintacte fusiegenen bevatten, dienden daarbij ter bepaling van detransformatiefrequentie. T-DNA's met daarop de promoterlozeconstructen geven na transformatie alleen dan lichtgereguleerdekanamycine resistentie en transport van het SSU fusie-eiwit naarde chloroplast, indien de geïntroduceerde constructen op correctewijze via homologe recombinatie in één van de chromosomale genenintegreren. In 0.01% van de transformanten werd inderdaadlichtafhankelijke Kmr gevonden en kon door middel van Southernblotting en PCR (Polymerase Chain Reaction) de plaats gerichtemutagenese van een rbcS-gen via homologe recombinatie bevestigdworden.

Nawerkbare voorbeelden

Constructie van het chimaere Kmr oen en de hiervan afgeleidedefectieve oenen

Voor de constructie van de verschillende vectoren is uitgegaanvan de binaire vector pM0GEN24 (zie figuur 1). Dit plasmide isafgeleid van de vector pROKl (Baulcombe et al., 1986) en bevattussen de borders van het nopaline Ti plasmide pTiT37 de inplanten funktionerende genen voor kanamycine resistentie (Kmr) enhygromycine resistentie (Hmr) in tegengestelde oriëntatie.

De vector pM0GEN24 is via standaard recombinant DNA technieken(Maniatis et al., 1982) uit pROKl verkregen door het coderendegebied van het E. coli hygromycine phosphotransferase (HPT) gen(Gritz et al., 1983) als BamHI fragment te doneren in de BamHIknipplaats op pROKl. De coderende sequentie van het HPT gen,vanaf 19 baseparen voor het translatiestart codon tot 20baseparen achter het translat!estop codon, komt hierdoor tussende 35S CaMV promoter en de transcriptie terminator van hetnopaline synthase gen te liggen.

Vlak voor het eigenlijke translatie startcodon (ATG) is nog eenATG codon aanwezig. Daar dit eerste codon de translatie vanaf heteigenlijke startcodon zou kunnen storen is de sequentie van ditcodon veranderd in ATA via oligonucleotide mutagenese, eenstandaard recombinant DNA techniek. Tevens zijn de BamHIknipplaatsen aan weerszijde van het HPT fragment verwijderd doorin te vullen met behulp van Klenow polymerase (Maniatis et al.,1982).

Het BglII/HindIII fragment uit pM0GEN24 met daarop derechterborder en het Km' gen is overgebracht naar het plasmidepUC12 (Messing, 1983; zie figuur 1) nadat dit was opengeknipt metBamHI en HindlII (Maniatis et al., 1982). Vervolgens is hettranscriptie terminatie signaal van het nopaline synthase genvervangen door het terminatie signaal van het octopine synthase gen. Dit resulteert in het plasmide pSDM2 (figuur 1) waaropachtereenvolgens gelegen zijn: 1)de rechterborder van pïiT37 (RB),z)de promoterregio van het nopaline synthase gen tot en met debase vóór het ATG start codon (5'NOS, Bevan et al., 1983), 3)hetcoderende gebied van het NPTII gen afkomstig van Tn5 vanaf deSau3AI knipplaats +10 baseparen (bp) voor het ATG startcodon totaan de PstI knipplaats die zich ±370 bp achter het TGA stopcodonbevindt (Beek et al., 1982) en 4,een 700 bp PvuII fragment dat hettranscriptie terminatie signaal van het octopine synthasegenbevat (3'0CS, Gielen et al., 1984).

Om het terugbrengen van het Kmr gen van pSDM2 of daarvan afgeleidedefectieve genen naar de binaire vector te vereenvoudigen is opde EcoRI knipplaats een Xhol-linker geïntroduceerd (figuur 1).

Dit resulteert in het plasmide pSDM4. Ook in de binaire vectorpM0GEN24 is een Xhol knipplaats geïntroduceerd door een Sphlfragment te vervangen door een Xhol-linker. Sphl knipt inpM0GEN24 vlak vóór de rechter border en in de coderende regio vanhet Kmr gen. Zo is plasmide pSDM5 verkregen (figuur 3).

Om de in het plantegenoom geïntegreerde en gerecombineerdeconstructen uiteindelijk via een Lambda vector bank (Maniatis etal., 1982) uit het genomische DNA te kunnen isoleren, is het zgn.sudF gen, dat gelegen is op een EcoRI fragment afkomstig van hetplasmide »VX (Seed, 1983), naast het Kmr gen gedoneerd. Metbehulp van het zgn. amber/suppressor systeem, dat ook gebruikt enbeschreven is door Smithies et al. (1985), kan nu de Lambda bankverrijkt worden met de terug te doneren sequenties. De EcoRIknipplaatsen van het sudF fragment zijn met het Klenow polymeraseingevuld, aan het fragment zijn BamHI-linkers geligeerd en er isnageknipt met BamHI. Het BamHI fragment is op het plasmide pSDM4gebracht, resulterend in het plasmide pSDM7 (figuur 1).

Met pSDM7 als basisconstruct zijn vervolgens de defectieve Kmrgenen geconstrueerd (zie figuur 2). Ter illustratie is deconstructie van één van de defectieve genen, nl. die het δ'/^ΙΙconstruct hieronder uitgebreid beschreven. De constructie van deandere defectieve Kmr genen is globaal in figuur 2 aangegeven.

Voor de constructie van 5'ΔΠ is pSDM7 geknipt met derestrictie-enzymen TthIII.1 en XmalII, zijn de uiteinden blunt gemaakt door in te vullen met Klenow polymerase en is er op deplaats van de deletie een EcoRI-linker (10 bp) gebracht. Doordeze modificatie wordt een sequentie die codeert voor een aktieveregio van het NPTII-enzym gedeleteerd (Beek et al., 1982). Desequentie op de plaats van de mutatie is gecontroleerd met behulpvan de dideoxy-sequentiebepalingsmethode van Sanger et al.

(1977). Evenals de andere defectieve Kmr genen is 5'AH alsXhol/Hindl11 fragment gebracht in de vector pSDM5, die van tevoren met Xhol en HindlII geknipt was. Het verkregen plasmidepSDM102 (figuur 3 en figuur 4) is via een driepuntskruising(Figurski en Helinski, 1979) overgebracht naar een Aarobacteriumtumefaciens stam, die reeds een helper Ti-plasmide bevat, zoalspAL4404 of pGV2260, zonder T-DNA waarop de Vir-regio aanwezig is.

De constructie van de 3'A mutanten die in het hieronderbeschreven experiment gebruikt zijn is beschreven in figuur 5.Uitgaande van het intacte Kmr gen dat gelegen is op plasmide pSDM4zijn er twee type constructen gemaakt. Het éne type is verkregendoor achter het intacte Kmr gen op pSDM4 een 75 bp HindiII/BamHIfragment, dat de synthetische octopine linker bordersequentiebevat (figuur 6), te brengen resulterend in pSDM8. Door deletievan een EcoRV/BamHI- of een EcoRV/RsrII- fragment wordenrespectievelijk de plasmides pSDM8* en 3'AHa verkregen. Hetdefectieve gen (3'AHa) mist een gedeelte van de coderende regiovan het NPTII-gen en het transcriptie terminatie signaal. Voorhet andere type construct is een HindiII/BglII fragment, dat dewildtype octopine linker bordersequentie bevat en afkomstig isvan het plasmide pRAL3912 (Hoekema et al., 1985), overgebracht inhet met HindlII en BamHI geknipte plasmide pSDM4. Uit het zoverkregen plasmide pSDM9 wordt het AccI/RsrII fragment waarop eengedeelte van de coderende regio van het NPTII gen, hettranscriptie terminatie signaal (3'0CS) en een gedeelte van hetHindlII/BglII fragment uit pRAL3912 gelegen zijn, verwijderd. Ditresulteert in 3'AHb. Een intact Kmr gen met hetzelfdeborderfragment achter de 3'0CS is verkregen door het AccI/BstEIIfragment te deleteren (pSDM9*). De knipplaats voor BstEII isgelegen achter het transcriptie terminatie signaal aan het uiteinde van het 3'0CS gedeelte. Tijdens het transformatieexperiment dienen de T-DNA's die op pSDM8* en pSDM9* gelegen zijnals positieve controle voor de overdracht van de T-DNA's vanrespectievelijk 3'AHa en 3'/\lIb.

De constructen met een intact of een defectief Kmr gen tussenrechter en linker border (respectievelijk pSDM8*, pSDM9*, 3'AHaen 3'Anb) zijn als EcoRI/HindlII fragment overgebracht naar hetplasmide pLM997 (zie figuur 7), dat van te voren geknipt was metEcoRI en HindiII. De resulterende binaire vectoren, pSDM200,pSDM210, pSDM201 en pSDM211 respectievelijk, zijn via eendriepuntskruising (Figurski et al., 1979) overgebracht naar deAarobacterium tumefaciens stam die het helper Ti-piasmide zonderT-DNA bevat. De verschillende Aarobacterium stammen worden voorde eenvoud genoemd naar de binaire vector die ze bevatten(SDM102, 200, 210, 201 en 211)

Cocultivatie van tabaksprotoplasten met twee Aarobacteriumtumefaciens stammen

Cocultivatie is de plantecel-transformatiemethode, waarbijplanteprotoplasten en Aarobacterium samen geïncubee’rd worden enwaarbij vervolgens gedurende de regeneratie van protoplast totcallus geselecteerd wordt op de overdracht van T-DNA (Marton etal., 1979; Fraley et al, 1984). Voor de hieronder beschrevenexperimenten is het volgende protocol voor cocultivatie vantabaksprotoplasten met Aarobacterium tumefaciens gebruikt.Nicotiana tabacum cv. petit havana SRI planten worden sterielgekweekt in potjes van het merk Magenta, die gevuld zijn met 50-60 ml van het met Daichin-agar (0.6%) verharde MS30-medium(Murashige en Skoog, 1962; bevat 30g sucrose/1). Om de 5-8 wekenworden apicale meristernen van de planten overgezet op versmedium. Protoplasten die geïsoleerd zijn uit bladeren van 6-8weken oude planten worden opgenomen in K3-medium (Nagy en Maliga,1976) met glucose (0.4M) waaraan de hormonen naphthaleenacetaat(NAA, lmg/1), 6-benzylaminopurine (BAP, 0.2mg/l) en 2,4-dichloro-phenoxy-acetaat (2,4-D, 0.lmg/1) zijn toegevoegd. De protoplasten (Ixl05/ml, 7ml per petrischaal) worden 1 dag in het donkergepreïncubeerd en vervolgens drie dagen onder laag lichtconditiesgecocultiveerd met Aorobacterium. Per Aorobacteriurn stam wordenbakteriën in een verhouding van +100 bakteriën op 1 protoplastaan de protoplasten toegevoegd. Op dag 4 na protoplastisolatieworden de protoplasten ingebed in agarose (0.4% low-meltingtype[LMT-]agarose) door 5ml protoplasten in een petrischaal (9cm,hoge rand) te mengen met 5ml SlI-medium (Muller, Missianier andCaboche, 1983) met 0.1M sucrose en 0.2M mannitol waaraan lmg/1NAA, 0.2mg/l BAP, 0.lmg/1 2.4D en 0.8% LMT-agarose zijntoegevoegd. Aan het SlI-medium zijn ook de antibiotica cefotaxime(cefo., eindconc. 200mg/l) en vancomycine (vanco., eindconc.100mg/l) toegevoegd om de bacteriegroei te stoppen. Deprotoplasten worden gekweekt onder lage lichtintensiteit.

Ongeveer 15 dagen na de isolatie van protoplasten worden deagaroseblokjes in vier delen gesneden en wordt 15ml vloeibaarSlI-medium met 50mg/l kanamycine of lOmg/ml hygromycine in depetrischaal gebracht. Ter bepaling van het percentageprotoplasten dat tot cal1i kan regenereren wordt van bepaaldeagaroseblokjes éénachtste deel op 7.5ml SII zonder selectiegezet. Zeven dagen later wordt 15ml vers SII medium toegevoegdaan de schalen met selectie (20mg/l hygromycine of 100mg/lkanamycine) en 7.5ml aan schalen zonder selectie. De concentratievan NAA, BAP, 2,4-D, vanco. en cefo. in het SII medium blijfthetzelfde. Gedurende de selectie met hygromycine of kanamycinewordt de helft van het medium iedere week ververst met SIII-medium. Het SlII-medium is identiek aan het SlI-medium metuitzondering van de mannitolconcentratie, die van 0.2M naar 0.1Mis teruggebracht. Daarnaast wordt het hormoon 2,4-D uit het SIII-medium weggelaten. Kanamycineselectiedruk kan omhoog gebrachtworden naar 150mg/l vers medium. Ongeselecteerde, Hmr of Kmr cal 1 iworden overgezet op vast MS-medium (verhard met 0.6% daichin-agar). Voor callusgroei wordt aan het medium 30g/l sucrose,1.0mg/l NAA, 0.2mg/l BAP, 100mg/l cefo. en 50mg/l vanco.toegevoegd. Scheutinductie uit callus vindt plaats op vast MS-medium waaraan 15mg/l sucrose, 1.0mg/l BAP, 0.lmg/1 NAA, 100mg/lcefo. en 50 mg/1 vanco. is toegevoegd. Scheuten worden getest op

Kmr of Hmr door ze te laten wortelen op hormoonloos MS15-mediumwaaraan 20mg/l hygro. of 100mg/l kana. is toegevoegd.

Op bovenstaande wijze zijn uiteindelijk 1,5x10® protoplastengecocultiveerd met de volgende stammen: 1) 1,5x10® protoplasten metalleen SDM102 als negatieve controle, 2) 1,5x10® protoplasten metalleen SDM201 of alleen SDM211 als negatieve controle en 3) 1,5x10®protoplasten met zowel SDM102 als SDM201 of zowel SDM102 alsSDM211. De transformatiefrequentie van de verschillendeconstructen is bepaald in een kleiner experiment. Hierbij zijn5x10® protoplasten gecocultiveerd met zowel SDM102 als SDM200 ofzowel SDM102 als SDM210. Transformatie van plantecellen met het102-construct geeft Hmr terwijl het 200 en het 210 construct naintroductie in de plantecel Kmr veroorzaken.

Ongeveer 5-7% van de protoplasten regenereert tot callus. Vandeze overlevende cal1i blijkt ±20% getransformeerd te zijn methet 102 construct en zowel voor het construct 200 (=201) als voorhet construct 210 (=211) werden transformatiepercentaces van ±15%geobserveerd. Van de cal1i die reeds getransformeerd zijn met hetene construct (Hmr of Kmr) blijkt gemiddeld 30% gecotransformeerdte zijn met het andere construct (Kmr of Hmr).

In het cocultivatie-experiment waarbij protoplastengecotransformeerd zijn met een 5'A construct (102) en een 3'Aconstruct (201 of 211) werd herstel van Kmr gevonden in 1-4% vande gecotransformeerde cal 1i. In de negatieve controles kwamenslechts één Kmr callus op. Een duidelijk verschil tussen het 201construct (3'A met synth. LB) of het 211 construct (3'Δ metwildtype LB) in transformatiefrequentie en herstel frequentie wasniet waarneembaar.

Analyse van de tot planten geregenereerde Kmr cal 1i

Via scheutinductie zijn uit kanamycine resistente cal1i plantenverkregen. Deze planten zijn overgebracht naar de groei kamer,waar bladmateriaal is verzameld voor 1) een NPTII-enzym assay enz) analyse van het chromosomale DNA d.m.v. Southern blotting.

1) NPTII-enzym assay

De planten zijn getest op aanwezigheid van NPTII-aktiviteit inhet bladweefsel volgens een methode, die is beschreven door Plattén Yang (1987). Als positieve controle is een plant genomen, diegetransformeerd is met het intacte Kmr gen. Een nietgetransformeerde tabaksplant en een transgene tabak die het 102-construct bevat zijn als negatieve controle meegenomen.

Ongeveer honderd /tg eiwit uit een ruw bladextract is gescheidenop een niet denaturerende acrylamide (AA-) gel, waarvan detemperatuur continu op 4°C gehouden is. Op deze manier blijfttijdens de scheiding over de gel de aktiviteit van het NPTIIenzym behouden. Na electroforese is over de AA-gel heen eenindicatorgel gelegd, waarin gamma-^P gelabeld ATP en kanamycineaanwezig zijn. Na een incubatie van een half uur bijkamertemperatuur is op de gels achtereenvolgens nitrocellulose,P81-papier (gepreïncubeerd in lOmM Natriumpyrofosfaat), 2xWatmann 3MM en een stapel filtreerpapier gelegd. Er is 2-3 uurgeblot. Eventueel gevormd kanamycine-32? bindt specifiek aan hetP81 papier terwijl eiwit-kinases die in het eiwitextract aanwezigzijn en die ook gefosforyleerd worden achter blijven op hetnitrocellulose filter. Na het blotten is het P81 filter gewassenin kokendheet water en vervolgens 15 minuten in lOmMNatriumpyrofosfaat. Tijdens deze wasstap wordt aspecifiekgebonden radioaktiviteit van het P81 papier verwijderd. Tenslotteis een autoradiogram van het filter gemaakt.

Op deze manier is aangetoond dat NPTII-aktiviteit aanwezig is inde bladeren van planten, die uit cal1i met het herstelde Km'fenotype geregenereerd zijn. De NPTII aktiviteit is daarbij opdezelfde hoogte in de gel aanwezig als de NPTII aktiviteit in depositieve controle. De plant die geregenereerd was uit het ene Km'callus afkomstig uit de negatieve controle vertoonde geen NPTIIenzymaktiviteit.

2) Analyse van chromosomaal DNA

Chromosomaal plante-DNA is geïsoleerd uit topbladeren van de tabaksplanten volgens de methode beschreven door Mettler et al.,(1987). De concentratie van het DNA-isolaat is geschat door 2 en20 μ! van het isolaat op een 0.8% agarose gel te electroforeren,waarbij een standaard hoeveelheid lambda DNA als referentiegebruikt is. Ongeveer tien Mg chromosomaal DNA is geknipt metEcoRI en Bell enerzijds en met HindlII anderzijds. Digesties zijnop een 0.8% agarose gel gebracht en overnacht geëlectroforeerdbij 1,5 Volt/cm. Het DNA is overgebracht naar een Hybond-Nmembraan (Amersham) met behulp van een blotprocedure beschrevendoor Southern et al. (1975). Het membraan is 5 minuten met υν¬ί icht bestraald en ± 6 uur geprehybridiseerd bij 65°C in 40ml6xSSC, 5xDenhardt's, 0.5%SDS en 20 Mg/ml zalmsperma DNA.Hybridizatie met de probe heeft daarna overnacht plaatsgevondenbij 65°C in verse hybridisatievloestof (zie prehybridisatie-mix).Probes zijn verkregen door fragmenten te labelen (^P-a-dCTP) metbehulp van de Random Primer DNA labeling Kit (BoehringerMannheim, Cat.No. 1004 760). Membranen zijn gehybridiseerd in +40ml hybridisatiemix, waaraan O.lMg gelabeld DNA toegevoegd is(Specifieke activiteit ± 5xl08 dpm/ Mg).

Na hybridisatie is aspecifiek gebonden label verwijderd door tweekeer te wassen in 3xSSC, 0.1%SDS en uiteindelijk twee maal in0.3xS$C, 0.1%SDS. Het wassen heeft plaatsgevonden bij 65°C.Tenslotte zijn van de membranen autoradiogrammen gemaakt.

Op bovenstaande wijze is het chromosomale DNA van uit kanamycineresistente cal 1i geregenereerde planten geanalyseerd.

Chromosomaal DNA preparaten van 2 transgene planten die elk eenenkele copie van het 102 construct geïntegreerd hebben, van eenplant die een copie van het 100-construct bevat en van een nietgetransformeerde N. tabacum cv. petit havana SRI zijn gebruiktals reconstructie en controle.

In figuur 8 staat weergegeven welke interne banden te verwachtenzijn na digestie met EcoRI en Bell. Het 5'deletie construct (102)geeft een interne band van 1560bp terwijl het intacte (correctherstelde) Kmr gen een band moet opleveren van 2140bp. Indiengeknipt wordt met HindlII dan worden er geen interne fragmentenverwacht maar grensfragmenten. Met behulp van deze laatsteanalyse kan het aantal geïntegreerde copiën van het 102-construct en het herstelde Kmr gen bepaald worden. Wanneer de probe alleenhet 3' deel van het Kmr omvat (bijv. het 700 bp PvuII fragment metde 3'0CS, Gielen et al., 1983) worden geïntegreerde copiën van de3'deletie mutant niet op de blot waargenomen, hetgeen deinterpretatie vereenvoudigt.

Met gebruikmaking van bovengenoemde probe wordt inderdaad invrijwel alle Kmr planten keurig het verwachte 2140 bp bandjegevonden, dat correspondeert met de aanwezigheid van een hersteldKmr gen (figuur 8).

De Kmr plant afkomstig uit de negatieve controle van hetcocultivatie-experiment bevat niet het intacte NPTII gen.

Het controle kruisinosexperiment

De Aorobacterium stam die het helperplasmide (Vir-regio; Deblaereet al., 1985; Hoekema et al., 1983) en de binaire vector pSDM102bevat is gebruikt als donor stam in kruisingsexperimenten. Dedonorstam heeft een chromosomaal gecodeerde rifampicineresistentie en is daarnaast kanamycine resistent door deaanwezigheid van een bacterieel Kmr gen op de binaire vector. Alsacceptor stam is LBA285 (Hooykaas et al., 1980) gebruikt, eenlege Agrobacterium stam met een chromosomaal gecodeerdespectinomycine resistentie. De stammen SDM102 en LBA285 wordenovernacht opgegroeid in LB-medium (Maniatis et al., 1982) waaraanrespectievelijk de antibiotica rifampicine (20mg/l) + kanamycine(50mg/l) of alleen spectinomycine (250mg/l) zijn toegevoegd.

Eén ml van de ene voorkweek (± 1010 bakteriën) is samen met 1 mlvan de andere voorkweek gecentrifugeerd. Het bakteriepellet isgeresuspendeerd en is vervolgens op een nitrocellulose filterliggend op een LB-agar plaat gebracht. Daarnaast werd van beidestammen in exponentiële groei fase 1 ml gemengd, gecentrifugeerden geresuspendeerd in een gelijk volume. Van dezebacteriesuspensie is 0,1 ml gebracht op een nitrocellulosefilterdat op een feeder layer van tabakscellen geplaatst was. In beidegevallen is overnacht bij 28°C geïncubeerd. Vervolgens zijn alleop het filter aanwezige bakteriën uitgeplaat op LB-agar platen met 250mg/l speetinomycine en 50mg/l kanamycine. De platen zijngeïncubeerd gedurende 3 dagen bij 28°C. Er zijn geen pSDM102bevattende Agrobacteria van de stam LBA285 gevonden, hetgeenbewijst dat conjugatieve overdracht van de in de boven beschrevenexperimenten gebruikte binaire vectoren niet optreedt.

Transformatie van de 101 tot en met de 105 constructen naarNicotiana tabacum cv. petit havana SRI; Isolatie van transgeneplanten met goed gekarakteriseerde T-DNA inserts in hetplanteqenoom.

Transgene planten zijn verkregen door bladschijfjes van sterielgekweekte tabaksplanten te cocultiveren met de bacteriestammenSDM101, SDM102, SDM103, SDM104 en SDM105 (Horsch et al., 1985).

Na cocultivatie zijn de schijfjes geplaatst op vast MS30-mediummet callus inducerende hormonen (1.0 mg/1 NAA en 0.2 mg/1 BAP) ende antibiotica cefotaxime (200 mg/1) en vancomycine (100mg/l). Naeen week zijn de bladschijfjes overgezet op medium waar 20 mg/1hygromycine aan toe is gevoegd. Resistente cal1i zijn afgesnedenen overgezet op scheutinducerend medium (MS15, lmg/1 BAP, 0.1mg/lNAA, 100mg/l cefotaxime en 50mg/l vancomycine). Scheuten zijnafgesneden en getest op Hmr door ze te laten wortelen ophormoonvrij MS30-medium met 20mg/l hygromycine.

De op bovenbeschreven wijze verkregen transgene planten zijn opDNA niveau geanalyseerd (zie voor methode-beschrijving analysevan chromosomaal DNA). Daarbij is gezocht naar planten met eensimpel T-DNA integratiepatroon. De plant 104.1.6 diegetransformeerd is met het 104-construct is geselecteerd voorgebruik in de transformatie experimenten.

Transformatie van protoplasten afkomstig van een transgenetabaksplant die reeds één T-DNA kopie geïntegreerd heeft met eenander homoloog T-DNA.

Protoplasten van de transgene plant 104.1.6 zijn gecocultiveerd met de Aarobacterium stam SDM101. De cocultivaties zijnuitgevoerd met 2,5xl07 protoplasten. Ter bepaling van detransformatiefrequentie zijn in een positieve controle 1x10®protoplasten gecocultiveerd met Aorobacteriurn stam SDM100. Decocultivaties zijn uitgevoerd op de hierboven beschreven wijze.Van het begin aantal protoplasten regenereerde ±3% tot callus.Ongeveer 25% van deze calli bleek getransformeerd te zijn en in 1op de 600 getransformeerde calli werd herstel van Kmr gevonden.

Uit de Kmr calli zijn planten verkregen. Tot nu toe zijn van heteerste experiment 15 planten geanalyseerd op aanwezigheid vanNPTII enzymaktiviteit (zie boven). In drie planten kon NPTIIaktiviteit worden aangetoond. Daarbij was in één plant deaktiviteit op juiste hoogte in de gel aanwezig terwijl bij tweeandere planten het enzym hoger in de gel liep.

De vijftien planten zijn ook op DNA niveau ganalyseerd doormiddel van PCR-analyse (Saiki et al., 1988) en Southern blots(zie boven). In recente artikelen over homologe recombinatie indierlijke cellen wordt de PCR techniek gebruikt voor snelledetectie van een homologe recombinatie gebeurtenis (Kim enSmithies, 1988; Zimmer en Gruss, 1989). Het principe van de PCRanalyse wordt geïllustreerd in figuur 9. Er zijn tweeoligonucleotiden van 20 bp gesynthetiseerd, PCR1 en PCR2, diehybridiseren met de deletiegebieden van het 5' deletie construct101 en het 3' deletie construct 104 respectievelijk. Alleenindien een intact Kmr gen aanwezig is in het plantegenoom danwordt een fragment van 941 bp geamplificeerd. In de plant welkekanamycine resistent is en die ook wildtype (waarbij het enzym opde juiste plaats in de gel migreerde) NPTII enzymaktiviteitvertoonde kon een dergelijk fragment gamplificeerd worden.

Hiermee is de aanwezigheid van een hersteld Kmr gen aantoond.Daarnaast is het chromosomaal DNA van de betreffende regenerantmet behulp de van Southern blot methode geanalyseerd (voormethode zie hierboven). DNA is geknipt met de restrictie enzymenEcoRI/BclI en HindiII, de fragmenten zijn op gel gescheiden envervolgens overgebracht naar een Hybond-N membraan. Er isgehybridiseerd met een interne NPTII probe (het 610 bpXmalII/RsrII fragment, zie figuur 8). In de betreffende recombinant kon na EcoRI/BclI digestie naast het 960 bp fragmentafkomstig van de 3' deletiemutant een 2140 bp fragment datcorrespondeert met het intacte Kmr gen (zie figuur 8) aangetoondworden. Beide gen copiën bleken gelegen te zijn op één HindiIIfragment. Hieruit is geconcludeerd dat één van de 3'deletiemutant copiën die reeds op één locus in de plantgeïnserteerd waren door het inkomend T-DNA met daarop de 5'deletiemutant via homologe recombinatie moet zijn hersteld.

Constructie van de SSU-NPTII fusie genen.

Voor de isolatie van een actief lid van de SSU multigen familieis een subgenomische bank van N. tabacum SRI in lambda faag PDJ11geconstrueerd (Maniatis, 1982). Uit deze bank is m.b.v. een probespecifiek voor een SSU cDNA kloon van N. tabacum cv. petit havanaSRI, een kloon geïsoleerd van het SSU-gen dat drie introns bevat(Mazur et al., 1984). Dit actieve gen is gelegen op een 2400baseparen lang HindiII fragment. Zowel de restrictie kaart als deDNA sequentie van de door ons geïsoleerde kloon komen overeen metde gepubliceerde gegevens (Mazur et al., 1984). Het HindlIIfragment is gekloneerd in pIC19H (Marsh et al,, 1984) resulterendin plasmide pSICl. Dit gen is gebruikt voor de constructie vaneen tweetal chimaere SSU-NPTII genen (figuuur 10).

Hiertoe is een NPTII insertiemodule geconstrueerd (kloon pSDM53)door: a) het EcoRI/XmalII fragment van pSDM4 (zie figuur 1) met daaropde nopaline synthase promoter en het begin van de coderende regiote vervangen door een 51 baseparen lang synthetisch EcoRI/XmalIIfragmentje (zie figuur 10B) waarop een unieke BamHI en een uniekeBglII knipplaats gelegen zijn.

b) beide PstI knipplaatsen uit de NPTII sequentie (Beek et al.,1982) te verwijderen. De PstI knipplaats in het coderende gebiedis verwijderd door met behulp van M13/oligonucleotide mutagenese(mutagenese kit van BioRad) op positie 1733 in de Tn5 sequentie(Beek et al., 1982) een G in een A te veranderen. Hierdoor zijngeen veranderingen geïntroduceerd in de aminozuurvolgorde van het NPTII eiwit. De andere PstI knipplaats is buiten de coderenderegio gelegen en is verwijderd door te knippen met PstI, blunt temaken met Klenow in aanwezigheid van dCTP, na te knippen met Smalen dicht te ligeren. Op deze wijze wordt het fragment van de 3'niet coderende regio gedeleteerd dat loopt van base 2519 tot base2656 in de Tn5 sequentie (Beek et al., 1982).

Voor de constructie van het éne fusiegen is het 1690 baseparenlange BamHI fragment met het promoterloze NPTII en de 3' OCSterminator geinserteerd in een BamHI site van het rbcS-gen oppSICl. Het resulterende plasmide pNTSSl bevat een translationelefusie tussen rbcS en NPTII in het vierde exon van het rbcS-aen(zie figuur 10A).

Voor de constructie van de andere SSU-NPTII fusie in het tweedeexon is in pSICl de BamHI knipplaats uit het vierde exonverwijderd door in te vullen met Klenow-polymerase, waardoor hetplasmide pSIC2 ontstaat. Vervolgens is in het tweede exon vanpSIC2 een nieuwe BamHI knipplaats geïntroduceerd met behulp vanM13/oligonucleotide mutagenese (mutagenese kit van BioRad).Daarbij is een G veranderd in een T en een A in een C oprespectievelijk de posities 1383 en 1385 in de sequentie vanMazur et al. (1984). In het resulterende plasmide pSIC3 is het1690 baseparen lange BglIΙ/BamHI fragment van pSDM53 in de nieuweBamHI knipplaats gekloneerd. De zo verkregen kloon pNTSS2 bevateen translationele fusie tussen rbcS en NPTII in het tweede exonvan het rbcS-gen (zie figuur 10A).

Constructie van de binaire vector oSDM14

Het plasmide pSDMIO (zie figuur 7) is als basis genomen voor deconstructie van de binaire vector pSDM14. Op de volgende wijzezijn in pSDMIO synthetische borders en een fragment dat deoverdrive sequentie bevat gebracht. De overdrive sequentie vanpTiAch5 is gelegen op een BclI/SacI fragment (14087 - 14710,Barker et al., 1983). Dit frament is gekloneerd in pIC20R (Marshet al., 1984) geknipt met SacI en BamHI. Vanuit pIC20R is de'overdrive' als SacI/EcoRI fragment overgekloneerd naar pUC19 (xSacIxEcoRI). Er is geknipt met SacI en Kpnl en vervolgens is indit plasmide een synthetisch Sacl/Kpnl fragment gekloneerd waaropeen rechter bordersequentie van het octopine type (zie figuurll)gelegen is. Het resulterende plasmide is opengeknipt met HindlIIen Kpnl en vervolgens is hierin een synthetisch fragment metdaarop een linker bordersequentie van het octopine typegekloneerd. Het resulterende plasmide pBINSB2 bevat tussen deEcoRI en de HindlII knipplaatsen respectievelijk de 'overdrive',de rechter border, een regio met enkele unieke kniplaatsen voorrestrictie enzymen en de linker border. Het EcoRI/Hindl11fragment van pBINSB2 is vervolgens gekloneerd in de BglIIkniplaats van pSDMIO door de uiteinden van het fragment op tevullen met Klenow polymerase, BglII linkers eraan te ligeren, nate knippen met BglII en te ligeren in pSDMIO. Zo wordtuiteindelijk pSDM14 verkregen.

Clonering van de rbcS-NPTII fusie genen in PSDM14

Van pNTSSl en pNTSS2 zijn de HindlII fragmenten met de intactefusie genen en de Pstl/HindlII fragmenten met de promoterlozerbcS-NPTII fusies overgekloneerd naar pIC20R (Marsh et al., 1984). Van daaruit zijn de fusie genen als Sall/Xhol fragmentengeligeerd in de binaire vector pSDM14 (figuurll) die was gekniptmet Sall/Xhol.

De resulterende plasmiden pNTSSll, pNTSS12, pNTSS21 en pNTSS22bevatten tussen synthetische rechter en linker border van hetoctopine Ti plasmide respectievelijk het intacte 4e exon fusiegen,het promoterloze 4e exon fusiegen, het intacte 2e exon fusiegen enhet promoterloze 2e exon fusiegen. De binaire plasmiden zijnovergekruist naar een Aarobacterium helperstam die de Vir regioop een helper Ti plasmide bevat, wat vervolgens resulteert in destammen NTSS11, NTSS12, NTSS21 en NTSS22.

Plaatsgerichte mutaaenese van een van de rbcS-qenen viacocultivatie van protoplasten van Nicotiana tabacum cv. petithavana SRI met Aqrobacterium

In aparte transformatie experimenten zijn 107 tabaksprotoplastengecocultiveerd met de Aqrobacterium stam NTSS12 en met de stamNTSS22. Deze stammen bevatten respectievelijk het promoterloze 4eexon rbcS-NPTII fusiegen en het promoterloze 2e exon rbcS-NPTIIfusiegen tussen de borders van het T-DNA dat op de binaire vectorgelegen is. Als positieve controles zijn de stammen NTSS11 enNTSS21 gecocultiveerd met 10e tabaksprotoplasten. De gebruiktecocultivatiemethode is hierboven uitgebreid beschreven. Vijfprocent van de protoplasten regenereerde tot callus en uit depositieve controle bleek dat 15% van de calli getransformeerdwas. In de cocultivatie experimenten met NTSS12 en NTSS22 kwamenmet lage frequentie Kmr calli op. Na PCR analyse op chromosomaalDNA van enkele van deze calli (voor methode zie Lassner et al.,1989) kon geconcludeerd worden dat in deze calli hetgetransformeerde T-DNA met daarop het promoterloze fusieconstructvia homologe recombinatie in een van de genomische rbcS-gencopiëngeïnserteerd is. Uit de calli zijn planten geregenereerd. DeNPTII activiteit in deze planten bleek lichtafhankelijk enbladspecifiek te zijn.

Deponerinq.

Ten behoeve van de nawerkbaarheid zijn de volgende E. coli (stamDh5«; genotype: F', endAl. hsdR17(r'k m+k) supE44, thi-1, lambda',recAl, gvrA96. relAl. /\ (argF-laczya)U169, phi80dlacz/\M15)stammen gedeponeerd bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures(CBS) in Baarn, Nederland.

E. coli stam DH5« (Datum van (Depot Te gebruiken voor met plasmied Deponering) Nummer) constructie van pSDMIOO 21 juli 1989 CBS 348.89 - pSDM4, pSDMIO, pSDM201 - pSDM7, pSDMIOl,PSDM102 en pSDM104 pSDM9 21 juli 1989 CBS 346.89 - pSDM211 pSDM14 21 juli 1989 CBS 347.89 - pNTSSll, pNTSS12, PNTSS21, pNTSS22 pSICl 21 juli 1989 CBS 349.89 - pNTSSll, pNTSS12, pNTSS21, pNTSS22

De Agrobacterium stam LBA4404, welke een goede acceptorstam isvoor alle binaire plantetransformatievectoren, is reeds eerdergedeponeerd (24 febr., 1983) en verkrijgbaar via het CentraalBureau voor Schimmelcultures (CBS) in Baarn, Nederland ondernummer CBS 191.83.

Figuur 1:

Constructie van de plasmiden pSDM4 en pSDM7, die het intacte inplanten funktionerende Kmr gen bevatten. Deze plasmiden dienen alsbasis voor de constructie van de verschillende defectieve genen(figuren 2, 3 en 4). De volgende cloneringsstappen zijn hierweergegeven: 1) het overbrengen van het BglII/HindlII fragmentuit pM0GEN24 naar pUC12(xBamHIxHindl11), 2) het vervangen van detranscriptie terminator van het nopaline synthase gen (3'NOS)voor die van het octopine synthase gen (3'OCS), 3) de introductievan een 8 bp synthetisch DNA fragmentje (linker) met daarop eenXhol knipplaats op de EcoRI knipplaats en 4) het overbrengen vanhet supF bevattende EcoRI fragment van π VX naar de BamHIknipplaats van pSDM4. Voor verklaring van afkortingen en tekenswordt verwezen naar de legenda.

Figuur 2:

Constructie van de defectieve Kmr genen 5'Al> 5'AJI> 5'FS, 3'/\ïen 3'FS uitgaande van het plasmide pSDM7. Het intacte Kmr islineair weergegeven, zoals het aanwezig is op pSDM7. Daaronderzijn de mutante genen door middel van lijnen weergegeven. Delijnen geven aan welke DNA sequenties van het inacte Kmr gen uitpSDM7 nog aanwezig zijn in de defectieve genen.

De 5'ΔΙ is verkregen door het XmalII/BclI fragment na opvullenvan de uiteinden met Klenow-polymerase te vervangen door eenoligonucleotide van 10 baseparen waarop een EcoRI knipplaatsgelegen is (EcoRI-linker). Vervanging van het TthlII.1/XmaIIIfragment na opvullen van de uiteinden met Klenow door een EcoRI-linker (10 basen) geeft de 5'AH. Bij de 5'FS is na knippen metTthlII.1 en opvullen van de uiteinden met Klenow-polymerase eenBglII-linker (10 basen) geïntroduceerd. Bij de Z'/\l is het3'gedeelte van het Kmr gen tot aan de RsrII knipplaats verwijderd.Het supF gen is distaai van het mutante Kmr gen gedoneerd. De3'FS is verkregen door met Ncol te knippen, op te vullen metKlenow en dicht te ligeren. Hierdoor ontstaat een Nsil knipplaats. Voor verklaring van afkortingen en tekens wordtverwezen naar de legenda.

Figuur 3:

Het overbrengen van de defectieve Kmr genen (zie figuur 2) alsXhoI/HindlII fragment naar de binaire vector pSDM5 (x Xhol xHindlII). Op deze wijze komen de defectieve genen rechts van hetHmr gen tussen de bordersequenties te liggen (zie figuur 4). Hetpiasmide pSDM5 is verkegen uit pM0GEN24 door het Sphl fragmentvan pM0GEN24, na blunt maken van de uiteinden met Klenowpolymerase, te vervangen door een Xhol-linker (10 bp synthetischDNA fragmentje dat een Xhol knipplaats bevat). Zie ook legenda.

Figuur 4;

Overzicht van de T-regio van plasmide pSDMIOO, waarop het intacteKmr gen gelegen is. Daaronder is met zwarte lijnen weergegevenwelke DNAsequenties van de T-regio van pSDMIOO ook aanwezig zijnin de T-regio van pSDM102 en die van pSDM104. Zie ook legenda.

Figuur 5:

Constructie van de 3' deletiemutanten van het Kmr gen uitgaandevan het plasmide pSDM4. Hiertoe wordt achter het intacte Kmr genop pSDM4 een 75 bp HindiII/BamHI fragmentje met een synthetischeoctopine type linker border sequentie gebracht resulterend inpSDM8. Door deletie van een EcoRV/BamHI- of een EcoRV/RsrlI-fragment worden respectievelijk de plasmides pSDM8* en 3'AHaverkregen. De sequentie van de synthetische linker border gelegenop het HindlII/BamHI fragment is gegeven in figuurö. Op dezemanier komt het al of niet mutante Kmr gen tussen bordersequenties in te liggen. In pSDM9 is het 1100 baseparenHindlII/BglII fragment van het plasmide pRAL3912 (hoekema et al.,1985) achter het Kmr-gen gebracht. Dit fragment bevat de wildtype octopine linker bordersequentie. De plasmides pSDM9* en 3'/XIIbzijn uit pSDM9 verkregen door respectievelijk het AccI/BstEIIfragment of het AccI/RsrII fragment te deleteren. De T-regio'svan de plasmiden pSDM8*, pSDM9*, 3'Ana en 3'AHb zijn alsEcoRI/HindlII fragment overgebracht naar de binaire vector pLM997(zie figuur 7), wat resulteert in respectievelijk de vectorenpSDM200, pSDM210, pSDM201 en pSDM211.

Figuur 6:

De sequentie van het synthetische HindiII/BamHI fragment waaropde linker border sequentie van het octopine type gelegen is. Deknipplaatsen van de verschillende restrictieenzymen zijn boven enonder de sequentie aangegeven.

Figuur 7:

Het piasmi de pLM997 is afgeleid van pM0GEN24 door het T-DNA vanpM0GEN24 als BglII fragment te deleteren en vervolgens op deBglII knipplaats een zgn. poly-cloningsite (een synthetisch DNAfragment dat meerdere knipplaatsen voor restrictie enzymen bevat)te introduceren. In de met pijlen aangegeven knipplaatsen voorEcoRI en HindlII zijn de EcoRI/HindlII fragmenten van deplasmiden pSDM8*, pSDM9*, 3'AHa en 3'AHb gebracht.

Fiouur 8:

Analyse van chromosomaal plante DNA. In de figuur zijn deEcoRI/BclI en de HindlII fragmenten weergegeven, die verwachtworden wanneer een 102 construct of een intact (hersteld) Kmr genin het plantegenoom geïnserteerd zijn. De fragmenten kunnenworden gedetecteerd d.m.v. de 3'OCS- of de interne Nptll probe.Wordt planteDNA geknipt met EcoRI/BclI dan wordt een 1560bpfragment gevonden wanneer de 5' deletiemutant in het genoomaanwezig is. In geval van een intact Kmrgen wordt een 2140bpfragment verwacht. Alleen met de interne Nptll probe kan ook het960bp fragment van de 3' deletiemutant worden gedetecteerd (niet weergegeven). Bij de HindiII digestie worden border fragmentengevonden. Het aantal border fragmenten wordt bepaald door hetaantal T-DNA inserts in het plantegenoom.

Figuur 9. Analyse van recombinanten met behulo van de Dolvmerasekettingreactie iPCRl:

In het bovenste deel van de figuur is weergegeven het NPTII-genmet daarboven de verschillende mutaties. De 5'A I omvat eendeletie van de nucleotiden 205 tot 560, de 5'A II mutant omvateen deletie van de nucleotiden 560 tot 775, de 5'FS heeft eenframeshift mutatie op positie 775, de 3'FS mutatie heeft eenframeshift mutatie op positie 1085 en de 3'A mutant omvat eendeletie van de nucleotiden 1160 tot 2580.

Onder het NPTII-gen staan de posities van de PCR primers p,, p2 enp3 aangegeven waarbij de pijl wijst van 5' naar 3'. Gebruik van deprimer p1? die hybridiseert in het gebied van 5'A I» en primerp2, die hybridiseert in het gebied van 3'A resulteert in deamplificatie van een 941 bp fragment. Bij gebruik van de primersp2 en p3, die hybridiseert in het gebied van 5'A II wordt eenfragment van 554 bp geamplificeerd.

De nucleotiden volgorde van de primers p15 p2 en p3 staat in hetonderste deel van de figuur weergegeven.

Figuur 10; A. De SSU-NPTII fusiegenen.

Weergegeven zijn de plasmiden pNTSSl en pNTSS2. pNTSSl bevat hetfusiegen coderend voor de SSU-NPTII fusie in het 4® exon. Dit genis verkregen door het 1690 bp lange BamHl fragment uit pSDM53 inde BamHl knipplaats van het 4® exon van het op pSICI gelegen rbcSgen te kloneren. pNTS$2 bevat het fusiegen coderend voor de SSU-NPTII fusie in het 2® exon. Dit gen is verkregen door het 1690 bplange BglII-BamHl fragment uit pSDM53 in de geïntroduceerde BamHlknipplaats van het 2® exon van het op pSIC3 gelegen rbcS gen te kloneren.

Knipplaatsen: H3=HindIII, B2=BglII, P1=PSTI, Sl=SphI, El=EcoRl,Bl=BamHl.

B.

De sequentie van het 51 baseparen lange synthetische EcoRI/XmalIIfragment met daarop een unieke BamHl en BglII knipplaats. Deknipplaatsen zijn aangegeven boven de sequentie, onder desequentie staan de aminozuren behorend bij de codons weergegeven.Vanaf de IIe op positie 2 is het NPTII coderende sequentie.

Figuur 11:

Constructie van de binaire vector pSDM14. Vanuit de aangegevenpIC20R vector is de overdrive sequentie van pTiAch5 alsEcoRI/SacI fragment gekloneerd in puC19 (EcoRI x SacI). Deklonering van de linker naast de overdrive is in twee stappenuitgevoerd. Het plasmide is geknipt met SacI en Kpnl waarna hetlinkerfragment dat de RB bevat als Sacl/Kpnl fragment gekloneerdis. Door het resulterende plasmide open te knippen met HindiII enKpnl kon het linker fragment dat de LB bevat gekloneerd worden.Vanuit dit plasmide pBINSB2 is het EcoRI/HindIII fragmentgekloneerd in de BglII knipplaats van pSDMIO door de uiteindenvan het fragment op te vullen met klenow polymerase, BglIIlinkers eraan te ligeren, na te knippen met BglII en te ligerenin pSDMIO. Zo is pSDM14 verkregen.

Legenda:

Lijst van in de figuren gebruikte afkortingen en tekens.

: De coderende regio van het Kmr en hetHmr wordt aangegeven door een dubbelelijn. Een enkele lijn geeft de nietcoderende regio's aan.

: Promoterregio van het nopaline synthasegen met aan de rechter kant de rechterborder sequentie van het nopalineTi plasmide.

: Polyadenylerings signaal/transcriptieterminator van het nopaline synthase gen(3'NOS).

: Polyadenylering signaal/transcriptieterminator van het octopine synthase gen(3'0CS).

: Promoterregio van het 35S transcript vanCaMV.

: 210 baseparen EcoRI fragment dat het supFgen uit E.coli bevat.

RB : Rechter border sequentie LB : Linker border sequentie

Hmr : Plantegen voor hygromycine resistentie

Kmr : Plantegen voor kanamycine resistentie

KanlII : Bacterieele kanamycine resistentie merker afkomstig uit Streptococcus faecalis.

Ampr : Bacterieel gen coderend voor ampicillineresistentie

LITERATUUR

Albright, L.M. et al. J. Bacteriol., 169, 1046-1055. (1987)

Baker, M.D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6432-6436.

(1988)

Bakkeren, G. et al. Cell, 57, 847-857. (1989)

Barker, R.F. Plant Mol. Biol., 2, 335-350. (1983)

Barton, K.A. et al. Methods Enzymol., 101, 527-539. (1983)Baulcombe, D.C. et al. Nature, 321, 446-449. (1986)

Beek, E. et al. Gene, 19, 327-336. (1982)

Bevan, M.W. et al. Nature, 304» 184-187. (1983)

Bevan, M.W. et al. Nucleic Acids Res., 11 #2. 369-385. (1983b)

Bomhoff, G. et al. Mol. Gen. Genet., 145, 177-181. (1976)

Buchanan-Wollaston, U. et al. Nature, 328, 172-173. (1987)Capecchi, M.R. Science 244, 1288-1292. (1989)

Chiltion, M.D. et al. Nature, 295, 432-434. (1982)

Christie, P.J., J. Bacteriol., 170, 2659-2667. (1988)

Chyi, Y-S. et al. Mol. Gen. Genet., 204, 64-69. (1986)

Citovsky, V. et al. Science, 240, 501-504. (1988)

Citovsky, V. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86, 1193-1197. (1989)Crossway, A. et al. Mol. Gen. Genet., 202, 179-185. (1986)Czerniflofsky, A.P. et al. DNA, 5 #6. 473-482. (1986)

Das, A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2909-2913. (1988)

Deroles, S.C. en Gardner, R.C. Plant Mol. Biol., 11, 355-364.(1988)

De Framond, A.J. et al. Bio/Technology, 1, 262-269. (1983)Deblaere, R. et al. Nucleic Acids Res., 13 #13. 4777-4788. (1985)Depicker, A. et al. Mol. Gen. Genet., 201, 477-484. (1985)

Elzen, P.J.M. van den. Plant Mol. Biol., 5, 149-154. (1985a)Elzen, P.J.M. van den, et al. Plant Mol. Biol., 5, 149-154.

(1983)

Elzen, P.J.M. van den, et al. Plant Mol. Biol., 5, 299-302.

(1985)

Figurski, D.H. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76, 1648-1652.(1979)

Fraley, R.T. et al. Plant Mol. Biol., 3, 371-378. (1984)

Fraley, R.T. et al. Bio/Technology, 3, 629-635. (1985)

Gielen, J. et al. EMBO J., 3, 835-846. (1984)

Gietl, C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84» 9006-9010.(1987)

Graves, A.C.F. et al. J. Bacteriol., 169, 1745-1746. (1987)Graves, A.C.F. et al. Plant Mol. Biol., 7, 43-50. (1986)Grimsley, N. et al. Nature, 325, 177-179. (1987)

Gritz, L. et al. Gene, 25, 179-188. (1983)

Haaren, M.J.J. van, et al. Plant Mol. Biol., 8, 95-104. (1987)Haaren, M.J.J. van, et al. Nucleic Acids Res., 15, 8983-8997.

(1986)

Hain, R. et al. Mol. Gen. Genet., 199, 101-168. (1985)

Hernalsteen, J.P. EMBO J. 3, 3039-3041. (1984)

Herrera-Estrella, L. et al. Nature, 303» 203-213. (1983)Herrera-Estrella, A.C. EMBO 0., 7, 4055-4062. (1988)

Hille, J. et al. J. Bacteriol., 154 #2. 693-701. (1983)

Hille, J. et al. Plant Mol. Biol., 2, 155-163. (1983)

Hoekenia, A. et al. Plant Mol. Biol., 5, 85-89. (1985)

Hoekema, A. et al. Nature, 303, 179-180. (1983)

Hoekema, A. et al. J. Bacteriol., 158, 383-385. (1984)

Hoekema, A. et al. EMBO J., 3, 2485-2490. (1984b)

Hooykaas, P.J.J. et al. J. Gen. Microb., 98, 477-484. (1977)Hooykaas-Van Slogteren, G.M.S. et al. Nature, 311, 763-764.

(1984)

Hooykaas, P.J.J. et al. J. Bacteriol., 143» 1295-1306. (1980)Horsch, R.B. et al. Science, 277, 1229-1231. (1985)

Jefferson, R.A. EMBO J., 4, 25-32. (1987)

Joos, H. et al. EMBO J., 2, 2151-2160. (1983)

Kerr, A. et al. Physiol. Plant Pathol., 9, 205-221. (1976)

Kim, H.S. en Smithies. Nucleic Acids Res., 8887-8903. (1988)Klee, H. et al. Ann. Rev. Plant Phys., 38, 467-486. (1987)

Klein et al. Nature, 321, 70-73. (1987).

Krens, F.A. et al. Nature, 296, 72-74. (1982)

Kucherlapati, R.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81» 3153-3157. (1984)

Lassner, M.W. Plant Mol. Biol., Z, 116-128. (1989)

Maniatis, T. et al. Mol. Cloning, a laboratory manual. (1982)

Fraley, R.T. et al. Bio/Technology, 3, 629-635. (1985)

Gielen, J. et al. EMBO J., 3, 835-846. (1984)

Gietl, €, et al = Pree. Natl. Acad. Sci, USA, M» 9006-9010, (1987)

Graves, A.C.F. et al. 0. Bacteriol., 169» 1745-1746. (1987)Graves, A.C.F. et al. Plant Mol. Biol., 7, 43-50. (1986)Grimsley, N. et al. Nature, 325, 177-179. (1987)

Gritz, L. et al. Gene, 25, 179-188. (1983)

Haaren, M.J.J. van, et al. Plant Mei. Biol., 8, 95-104. (1987)Haaren, M.J.J. van, et al. Nucleic Acids Res., 15, 8983-8997.(1986)

Hain, R. et al. Mol. Gen. Genet., 199. 101-168. (1985)

Hernalsteen, 3.P. EMBO 0. 3, 3039-3041. (1984)

Herrera-Estrella, L. et al. Nature, 303, 203-213. (1983)Herrera-Estrella, A.C. EMBO J., 7, 4055-4062. (1988)

Hille, J. et al. J. Bacteriol., 154 #2, 693-701. (1983)

Hille, J. et al. Plant Mol. Bisl., 1, 155-163. (.1983)

Hoekema, A, et el. Plaat Mei. Bic1,, L 85 89 (1985)

Hoekema, A. et al. Nature, 303. 179-180. (1983)

Hoekema, A. et al. J. Bacteriol.. 158, 383-385. (1984)

Hoekema, A. et al. EMBO J., 3, 2485-2490. (1984b)

Hooykaas, P.J.J. et al. 0. Gen. Microb., 98, 477-484. (1977)Hooykaas-Van Slogteren, G.M.S. et al. Nature, 311, 763-764.(1984)

Hooykaas, et al. J. Bacteriol., 143. 1295-1306 (1980)

Horsch, R.B. et al. Science, 277, 1229-1231. (1985)

Jefferson, R.A. EMBO J., 4, 25-32. (1987)

Joos, H. et al. EMBO J., 2, 2151-2160. (1983)

Kerr, A. et al. Physiol. Plant Pathol., 9, 205-221. (1976)

Kim, H.S. en Smithies. Nucleic Acids Res., 8887-8903. (1988)Klee, H. et al. Ann. Rev. Plant Phys., 38» 467-486. (1987)

Klein et al. Nature, 327» 70-73. (1987).

Krens, F.A. et al. Nature, 296, 72-74. (1982)

Kucherlapati, R.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3153-3157. (1984)

Lassner, M.W. Plant Mol. Biol., 7, 116-128. (1989)

Maniatis, T. et al. Mol. Cloning, a laboratory manual. (1982)

Marsh, J.L. Gene, 32, 481-485. (1984)

Marton, L. et al. Nature, 277, 129-131. (1979)

Mazur, B. et al. Nucleic Acids Res., 13, 2373-2386. (1985)Melchers, L.S. et al. Oxford Surveys of Plant Mol. and CellBiol., 4, 167-220. (1987)

Messing, J. et al. Methods Enzymol., 101, 20-79. (1983)

Mettler, I.J. Plant Mol. Biol., 5, 346-349. (1987)

Muller, J.F. et al. Physiol. Plant, 57, 37-41. (1983)

Murashige, T. et al. Physiol. Plant, 15, 473-497. (1962)

Nagy, J.I. et al. Pflanzenphysiol., 78, 453-455. (1976)

Negrutiu, I. et al. Plant Mol. Biol., 8, 363-373. (1987)

Ooms, G. et al. Gene, 14, 33-50. (1981)

Ooms, G. et al. Plasmid, 7, 15-29. (1982)

Orr-Weaver, T.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6354-6358. (1981)

Paszkowski, J. et al. Plant Mol. Biol., juni, 10-19. (1987)Paszkowski, J. ΕΜΒ0 J., 7, 4021-4026. (1988)

Peerbolte, R. et al. Plant Mol. Biol., 5, 234-246. (1985)Peralta, E.G. et al. ΕΜΒ0 J., 5, 1137-1142. (1986)

Peralta, E.G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5112-5116.

(1985)

Platt, S.G. et al. Analytical Biochem., 162, 529-535. (1987)Ruvkun, G.B. et al. Nature, 286, 85-88. (1981)

Saiki, R.K. Science, 239, 487-491. (1988)

Sanger, F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 #12. 5463-5467.(1977)

Schreier, P.H. et al. ΕΜΒ0 J., 4, 25-32. (1985)

Seed, B. Nucleic Acids Res., 8, 2427-2445. (1983)

Sen, P. et al. J. Bacteriol., 2573-2580. (1989)

Shaw, C.H. et al. Nucleic Acids Res., 12, 6031-6041. (1984)Sheerman, S. et al. Plant Cell Reports, 7, 13-16. (1988)Shillito, R.D. et al. Bio/Technology, 3, 1099-1102. (1985)Slightom, J.L. et al. ΕΜΒ0 J., 4, 3069-3077. (1985)

Smithies, 0. et al. Nature, 317, 230-234. (1985)

Song, K-Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, M, 6820-6824.(1987)

Southern, E., J. Mol. Biol., 98, 503. (1975)

Spielmann, A. et al. MGG, 205, 34-41. (1986)

Stachel, S.E. et al. Nature, 322, 706-711. (1986)

Stachel, S.E. et al. EMBO J. 6, 857-863. (1987)

Thomas, K.R. et al. Cell, 51, 503-512. (1987)

Thomashow, M.F. et al. Cell, 19, 729-739. (1980)

Ulian, E.C. et al. In vitro Cel lui ar and Developmental Biology,24, 951-954. (1988)

Veen, R.J.N. van, et al. Thesis: Strategies of Bacteria in theirinteraction with plants; Analogies and Specialization., 79-91.(Leiden, The Netherlands, 1988)

Wallroth, M. et al. Mol. Gen. Genet., 202, 6-15. (1986)

Wang, K. et al. Mol. Gen. Genet., 2JU), 236-346. (1987)

Wang, K. et al. Cell, 38, 455-462. (1984)

Ward, E.R. Science, 242, 927-930. (1988)

Willmitzer, L. et al. Mol. Gen. Genet., 186, 16-22. (1982)Willmitzer, L. et al. EMBO J., 1, 139-146. (1982)

Wirtz, U. et al. DNA, 6, 245-255. (1987)

Yadav, N.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6322-6326.(1982)

Young, C. J. Bacteriol., 170, 3367-3374. (1988)

Zembryski, P. et al. J. Mol. App. Genet., I, 361-370. (1982)Zembryski, P. et al. EMBO J., 2, 2143-2150. (1983)

Zimmer, A. en Guss. Nature, 338, 150-153. (1989)

Claims (14)

1. Recombinant DNA molecuul, dat een plaatsgerichte integratievan genen, genfragmenten of andere DNA-sequenties in hetgenoom van planten mogelijk maakt door cocultivering vanplantecellen of planteweefsel met Agrobacteri urn- of daaraanverwante bacteriën, zoals Agrobacteriurn rhizoaenes.Phvllobacterium of Rhizobium. omvattende het te integrerenDNA, welk DNA een zodanige mate van homologie aan eensequentie van het plante-DNA vertoont of door dergelijkehomologe DNA-sequenties wordt geflankeerd, dat bij detransformatie van de plantecellen een plaatsgerichteintegratie van het te integreren DNA in het plantegenoom doorhomologe recombinatie plaats heeft.

2. Recombinant DNA molecuul volgens conclusie 1, met het kenmerk,dat het te integreren DNA covalent verbonden is aanflankerende DNA-fragmenten, welke homologie aan een sequentievan het plante-DNA vertonen.

3. Recombinant DNA molecuul volgens conclusie 2, met het kenmerk,dat de flankerende DNA-sequenties homologie vertonen aangenen, genfragmenten of andere DNA-sequenties, welke tevorendoor genetische manipulatie in het plantegenoom zijngeïntroduceerd.

4. Recombinant DNA molecuul volgens conclusie 2 of 3, met hetkenmerk, dat het flankerende DNA en de homologe sequentie inhet plantegenoom complementerende DNA-sequenties zijn, die nahomologe recombinatie voor een fenotypische marker of anderegemakkelijk detecteerbare proteineprodukten coderen.

5. Werkwijze voor het produceren van transgene planten, met hetkenmerk, dat men een gen, een genfragment of andere DNA-sequenties plaatsgericht integreert in het plantegenoom doorcocultivering van plantecellen of planteweefsel metAgrobacteriurn - of daaraan verwante bacteriën, zoalsAgrobacteriurn rhizoaens. Phvllobacterium of Rhizobium. waarvande T-regio een recombinant DNA molecuul volgens één van deconclusies 1-4 bevat.

6. Werkwijze voor het introduceren van vreemd DNA in het genoomvan planten waarbij men twee homologe stukken DNA in deplantecellen introduceert, welke stukken met elkaarrecombineren op plaatsen van homologie onder vorming van hetvreemde DNA, met het kenmerk, dat metn de plantecellen cocultiveert met twee verschillende Aorobacterium- of daaraanverwante bacteriestammen die in de T-regio respectievelijk detwee homologe stukken DNA bevatten.

7. Werkwijze volgens conclusie 5 of 6, met het kenmerk, dat meneen Aorobacteriurn tumefaciens-stam toepast.

8. Plante-transformatievector, met het kenmerk, dat deze eenrecombinant DNA molecuul volgens één van de conclusies 1-4bevat.

9. Aarobacterium of daaraan verwante bacterie, met het kenmerk,dat deze een plante-transformatievector volgens conclusie 8bevat.

10. Plantecel, verkregen met de wijkwijze volgens één van deconclusies 5-7.

11. Plantaardig materiaal bestaande uit een plant, daarvanafkomstige delen, zaad of nakomelingen uit sexuele danwelasexuele voortplanting en oorspronkelijk verkregen doorregeneratie van een plantecel volgens conclusie 10.

12. Plantaardig materiaal volgens conclusie 11, zijnde eendicotyle plant of daarvan afkomstige delen of zaad.

13. Plantaardig materiaal volgens conclusie 12, zijnde een plantgekozen uit Solanaceae of daarvan afkomstige delen of zaad.

14. Plantaardig materiaal volgens conclusie 13, zijnde eentabaksplant of daarvan afkomstige delen of zaad.