NL8701450A - Werkwijze voor het transformeren van cellen. - Google Patents

Description

\ it 4

S

Nw/8502

Titel: Werkwijze voor het transformeren van cellen.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het transformeren van cellen en ligt op het terrein van de recombinant-DNA-techniek.

Met behulp van recombinant-DNA technieken kan 5 men op kunstmatige wijze de erfelijke eigenschappen van een cel veranderen door in het DNA van deze cel vreemd DNA te integreren. Dit DNA kan afkomstig zijn van andere cellen, welke geen verwantschap met het te transformeren organisme behoeven te bezitten.

10 Doel van deze genetische manipulatie is veelal het overbrengen van genetische eigenschappen van cellen die een bepaalde gewenste erfelijke eigenschap bezitten, op cellen die deze eigenschap niet bezitten. Men kan hier bijvoorbeeld denken aan het overbrengen van resis-15 tentie tegen een bepaald giftig produkt, bijvoorbeeld een onkruidbestrijdingsmiddel, van een resistente plantensoort op een niet resistente variant van dezelfde soort of op een niet resistente andere soort binnen dezelfde familie of zelfs op een niet resistente soort 20 van een andere, meer of minder verwante familie. Ook kan men denken aan het overbrengen van het vermogen om een voor geneesmiddelen of andere doeleinden bruikbare stof te produceren, bijvoorbeeld van planten die de stof produceren op planten die in andere klimaten 25 groeien en niet het vermogen hebben om de stof te produceren. Ook kan men daarbij denken aan het transformeren van dierlijke en zelfs humane cellijnen om deze vervolgens voor de productie van een gewenste stof te gebruiken. Aan genetische manipulatie zijn vaak 30 grote problemen verbonden, bijvoorbeeld ten gevolge van de ongelijksoortigheid van de structuur en organisatie van de donor- en receptorcel, en in het bijzonder ---- -irrf 8701450 ► ·· -2- het genoom daarvan.

Bij de tot nu toe beschreven methoden voor het transformeren van cellen met behulp van recorabinant-DNA-technieken gaat men over het algemeen als volgt 5 te werk. Uit een geschikte donorcel wordt een gen (of groep genen), coderend voor een bepaalde gewenste eigenschap of een bepaald product, geïdentificeerd en geïsoleerd. Vaak wordt dit gen verkregen via kopie-DNA (cDNA) van het ervan afgeschreven boodschapper-RNA 10 (mRNA). Dit DNA wordt vervolgens in een vector gekloneerd, die in een geschikt micro-organisme kan worden vermenigvuldigd. Een groot probleem is hierbij dikwijls het verkrijgen van een kloon die een complete kopie van het gewenste gen bevat. Als dit alles gelukt is, dient men het 15 gen vaak nog te voorzien van geschikte regelelementen voor gebruik in de receptor-cel, welke soms sterk verschillend kunnen zijn van de regelelementen van de donorcel. Tenslotte wordt het gen inclusief de regelelementen, met behulp van zgn. "shuttle" vectoren 20 of met behulp van rechtstreekse transformatiemethoden overgebracht naar de receptorcel.

Aan deze bekende werkwijzen voor het transformeren van cellen kleven een aantal nadelen. In de eerste plaats vereist het isoleren en karakteriseren van 25 het over te brengen gen een grote hoeveelheid kostbaar onderzoek, dat gefinancierd moet worden, alvorens men één enkele transformant in handen heeft. De aard van het onderzoek brengt verder met zich mee, dat men moet kunnen beschikken over zeer gespecialiseerde 30 laboratoriumfaciliteiten en hooggekwalificeerd personeel, zoals deze slechts op weinig plaatsen in de wereld beschikbaar zijn.

In de tweede plaats is een zeer grondig onderzoek vereist van de regelelementen en signalen welke in 35 de receptor van toepassing zijn. In de derde plaats is het noodzakelijk om vectoren en shuttle vectoren 870 U5 0 % «I» -3- te construeren die aangepast zijn aan donor en receptor.

Voor vele receptor-organismen zijn nog geen geschikte shuttle-vectoren gevonden c.q. ontwikkeld.

Er bestaat daarom behoefte aan een werkwijze 5 voor het transformeren van cellen, die de genoemde nadelen niet vertoont.

Doel van de uitvinding is daarom het verschaffen van een eenvoudige, algemene, goedkope en toch doeltreffende werkwijze voor het transformeren van cellen.

10 Onder cellen wordt hier elk soort cellen verstaan, zoals cellen van plantaardige of dierlijke (inclusief humane) oorsprong, maar ook micro-organismen, zowel prokaryotische, zoals bacteriën, als eukaryotische, zoals schimmels, gisten, algen, enz.

15 Dit doel kan worden bereikt door de werkwijze volgens de uitvinding, welke hierna zal worden toegelicht.

Bij de werkwijze wordt gebruik gemaakt van een DNA-mole-cuul dat een aantal bijzondere elementen omvat, de zgn. multifunctionele linker, welke eveneens deel 20 uitmaakt van de uitvinding.

Verder omvat de uitvinding een werkwijze voor de bereiding van de multifunctionele linker en de onderdelen daarvan, die in verschillende combinaties op voorhand kunnen worden geconstrueerd.

25 Bij de werkwijze volgens de uitvinding koppelt men fragmenten van het donorgenoom aan een multifunctionele linker volgens de uitvinding en transformeert direct naar de receptor. De transformatie verloopt via recombinatie met een van de receptor afkomstige 30 DNA-sequentie, die voor dit doel in de multifunctionele linker is opgenomen. Na deze trap heeft men dus reeds de beschikking over transformanten, waaruit men in principe op grond van de overgedragen eigenschappen voordelige varianten kan isoleren. Bijzonder voordelig 35 is, dat deze varianten nu direct kunnen worden toegepast zonder dat men over gedetailleerde kennis behoeft 870 14 50 ψ -4- te beschikken over de overgedragen DNA-sequenties, of deze heeft moeten isoleren. Met de exploitatie van deze transformanten kunnen eventueel de financiële middelen worden verkregen voor verder onderzoek.

5 In een volgende fase isoleert men het hoogmolecu- lair DNA uit de getransformeerde receptorcellen, fragmenteert dit en isoleert de fragmenten die de multifunctionele linker en het donor DNA bevatten. Deze fragmenten worden in een micro-organisme gekloneerd waardoor 10 een beperkte genenbank wordt verkregen. Met deze genen worden weer receptoren getransformeerd, teneinde de DNA-sequenties met de fenotypische expressie te kunnen correleren.

De werkwijze volgens de uitvinding en de multi-15 functionele linker alsmede de bereiding daarvan zullen hieronder meer in detail worden besproken.

Als eerste stap van de werkwijze volgens de uitvinding wordt uit de donorcel het hoogmoleculaire DNA geïsoleerd. Dit wordt vervolgens zodanig met behulp 20 van een endonuclease (bijvoorbeeld een restrictie-enzym) gefragmenteerd, dat fragmenten worden verkregen met voldoende grootte om één volledig gen met zijn regelelementen te kunnen bevatten. De verkregen fragmenten worden nu met behulp van een ligase verbonden met 25 de multifunctionele linker volgens de uitvinding.

De multifunctionele linker is een lineair DNA-molecuul dat in twee vormen kan worden gebruikt: een multifunctionele linker welke de donor DNA fragmenten ringvormig kan sluiten of welke deze fragmenten aan beide uiteinden 30 kan voorzien van een haarspeldstruktuur. Bijgevolg ontstaat door ligatie een DNA molekuul dat het donor DNA en de multifunctionele linker bevat ofwel in de vorm van een lineaire struktuur, in de vorm van een ringvormige struktuur ofwel in de vorm van een lineaire 35 struktuur met haarspelduiteinden. De strukturen zijn weergegeven in figuur 1C en 1D en IE.

De multifunctionele linker bevat ten minste 8701450 * * * -5- een van de volgende elementen: (A) Een DNA-sequentie die homoloog is met een gedeelte van het receptorgenoom, teneinde (door crossing-over) 5 recombinatie mogelijk te maken tussen het receptorge noom en het ingebrachte DNA, dat bestaat uit de multifunctionele linker en donor-DNA. Zoals zal worden beschreven bij de bereiding van de multifunctionele linker, zal dit homologe gedeelte doorgaans uit ten minste 100 baseparen bestaan en afkomstig zijn van het receptorgenoom.

(B) Een operatorsequentie die het mogelijk maakt door middel van interactie met het bijbehorende repressor- 15 eiwit, DNA dat de operatorsequentie bevat te herken nen en af te scheiden. In principe is hier elke operatorsequentie geschikt, mits het repressoreiwit voldoende hanteerbaar is. Geschikte operatorsequen-ties zijn b.v. de lac-operator (lactose), de gal-ope-20 rator (galactose) en de trp-operator (tryptofaan), allen van E. coli.

(C) Een sequentie, die replicatie in een micro-organisme, bij voorkeur door integratieve recombinatie in 25 een vector, mogelijk maakt, opdat de multifunctionele linker met het eraan gekoppelde DNA in een gastheer kan worden vermenigvuldigd. Een dergelijke sequentie is bijvoorbeeld de attB-sequentie, die integratie van de bacteriofaag λ in 33. coli mogelijk maakt.

30 De sequentie attB is: GCTTTTTTATACTAA.

(D) Een sequentie die expressie toelaat van een gen in een microörganisme om transformanten die de multifunctionele linker bevatten te kunnen identifies ceren. Dit kan bijvoorbeeld worden gerealiseerd (1) door een volledig gen met al of niet regelbare 8701450 fr V» -6- promotor in te bouwen.

Expressie kan ook worden gerealiseerd (2) door integratieve recombinatie. Hierbij wordt een al of niet regelbare promotor rechts van de attB 5 sequentie gekloneerd zodanig dat deze promotor een gen tot expressie brengt dat links van de attP sequentie is gelegen op de λ vector (figuur 2). Het is duidelijk dat de elementen (B), (C) en (D) in hun eenvoudigste vorm beperkt kunnen 10 blijven tot de struktuur att^ ^romotor/operator.

De hier beschreven werkwijze laat toe om het naar de receptor overgebrachte donor DNA te selecteren en te vermeerderen in een microörganisme dat geen 15 recombinatie functies heeft, bijvoorbeeld J2. coli recA, om te vermijden dat herschikkingen of deleties ontstaan in het donor DNA tengevolge van deze recombinatiefuncties. Een geschikt gen is hier het xylE-gen van Bacillus putida, dat 20 onder controle van de lac operator promotor bij groeien in aanwezigheid van isopropyl-3-D-thio-galac-toside (IPTG) en catechol aanleiding geeft tot het vormen van gele kolonies. Andere geschikte genen zijn b.v. het bla-gen (β-lactamase) dat resistentie tegen 25 penicilline veroorzaakt, het aphll-gen (kanamycine resistentie) of het lacZ-gen (B-galactosidase).

(E) Een korte DNA sequentie die aan één uiteinde een geschikte restrictie sequentie bevat voor verbinding 30 met de multifunctionele linker en aan het andere uiteinde een haarspeld structuur heeft waarin een sequentie zit verborgen die slechts door repli-katie van de ontplooide haarspeldstruktuur een substraat vormt voor een bijzonder restrictie-enzym of endonuclease.

8701450 * -7-

De bedoeling van het aanhechten van haarspeldstruk-turen aan de uiteinden van het donor DNA is (1) het behouden van een lineaire struktuur die de opname via de poriën van het kernmembraan vergemak-5 kelijkt, (2) het beschermen van de uiteinden tegen exonucleasen in de cel en (3) het mogelijk maken dat de recombinatie-enzymen in de kern het lineaire DNA omzetten in cirkelvormig DNA. Het is duidelijk dat het lineaire donor DNA te dien einde de multifunc-10 tionele linker als een direkte repetitie aan de uiteinden draagt zoals getoond in fig.. ID. Donor DNA fragmenten welke de nodige elementen bevatten, dienstig voor replikatie in de receptor (figuur IE), kunnen in de kern van de receptorcel gedimeriseerd 15 worden. Hierdoor komen de restrictiesites, verborgen in de top van de haarspeldstruktuur, vrij en kunnen als dusdanig herkend worden.

Bij voorkeur bevat de multifunctionele linker 20 bovendien een sequentie die de crossing-over stimuleert, een zgn. "crossing-over hot-spot instigator" of "chi"-se-quentie, zoals de chi-sequentie van JE, coli K12: GCTGGTGG.(Zie Smith, G.R. et al., Cell 24, 429-436 (1981)).

Ook varianten van chi-sequenties zijn bruikbaar, 25 hoewel zij soms een lagere werkzaamheid vertonen (Cheng en Smith, J. Mol. Biol. 180, 371-377 (1984)). Men kan hier ook chi·-sequenties van een andere oorsprong toepassen, b.v. van menselijke oorsprong (Jeffreys et al, Nature 314, 67-73 (1985)). Tenslotte kan ook 30 een sequentie worden ingebouwd die in de vorm van Z DNA kan voorkomen teneinde de integratie te bevorderen.

Verder is het voordelig bij de werkwijze volgens de uitvinding als de multifunctionele linker tevens een gen bevat, waarvan de expressie kan worden aangetoond 35 in de receptor. Hoewel soms de op de receptor over te dragen eigenschap zelf dienst kan doen bij het 8701450 w -8- screenen of selecteren van de transformanten is het meestal, vooral als de over te brengen eigenschap niet direct detecteerbaar is, gewenst om over een eigenschap te beschikken die wel direct geschikt is 5 voor de screening. Antibioticum-resistentiegenen zijn in dit verband geschikt als men cellen wil transformeren.

Bij voorkeur heeft de multifunctionele linker volgens de uitvinding de in fig. IA of 1B weergegeven structuur.

10 Als volgende stap van de werkwijze volgens de uitvinding voor het transformeren van cellen worden de met de multifunctionele linker verbonden donor DNA-moleculen, eventueel na een fractionering volgens molekulair gewicht, overgebracht naar de receptorcel.

15 Deze overbrenging kan geschieden door directe transformatiemethoden, zoals micro-injectie, electroporatie of natuurlijke opname.

Vervolgens worden de receptorcellen desgewenst gescreend en worden die cellen geselecteerd die donor-DNA 20 gekoppeld aan de multifunctionele linker hebben opgenomen. Hierna wordt uit deze receptorcellen hoogmoleculair DNA geïsoleerd dat vervolgens zodanig met een endonuclease wordt gefragmenteerd dat fragmenten worden verkregen met voldoende grootte om één volledig gen met de bijbeho-25 rende regelelementen en de multifunctionele linker te kunnen omvatten. Om te voorkomen dat de linker wordt losgeknipt van het overgebrachte DNA zal men er op voorhand voor zorgen dat de verbinding met de multifunctionele linker geen nieuwe restrictiesites 30 creëert voor de endonuclease die gebruikt werd om het donor DNA te fragmenteren.

Uit het mengsel van DNA-moleculen worden nu die fragmenten geïsoleerd die de operatorsequentie van de linker bevatten. Bij deze isolatie maakt men 35 gebruik van de hoge affiniteit die het repressor- eiwit voor de overeenkomstige operatorsequentie bezit.

870 H50 -9- DNA-fragmenten die repressoreiwit binden worden op filters geïsoleerd volgens de methode van Riggs et al., J. Mol. Biol. 53, 401 (1970).

Na de isolatie - of eventueel daaraan voorafgaande 5 - worden de DNA-moleculen ringvormig gesloten met behulp van een ligase.

De verkregen DNA-moleculen dienen nu elk afzonderlijk vermenigvuldigd te worden om ze in voldoende hoeveelheid ter beschikking te krijgen. Hiertoe worden 10 micro-organismen met de desbetreffende DNA-moleculen getransformeerd. Fragmenten die in de multifunctionele linker de nodige elementen bevatten voor replikatie en selektie kunnen als dusdanig vermenigvuldigd worden in het microorganisme. Fragmenten die in de multifunctio-15 nele linker de sequentie attB promotor operator bezitten kunnen na transformatie en in vivo integratie in een geschikte λ vector vermenigvuldigd en geselekteerd worden: bijvoorbeeld λΝΜ540 xylE. Als de multifunctionele linker bijvoorbeeld de attB-sequentie bevat die integra-20 tie in bacteriofaag λ mogelijk maakt, kan men de uit de receptor geïsoleerde DNA-sequenties die de multifunctionele linker bevatten integreren in het genoom van een bacteriestam die een lysogene faag λ bevat, zoals b.v. E. coli MC 1061 (XNM450 XylE). Na inductie van de 25 faag en uitplaten kan men screenen op plaques die expressie vertonen van het op de multi-functionele linker aanwezige gen, waarvan de aanwezigheid in micro-organismen gemakkelijk kan worden aangetoond.

De aanwezigheid van bijvoorbeeld het xylE-gen kan 30 men gemakkelijk herkennen aan de vorming van gele plaques wanneer men kweekt in aanwezigheid van IPTG en catechol op de platen verstuift. De positieve plaques worden geïsoleerd en een maal gezuiverd door overenten en isoleren van plaques. Door bij lage temperatuur 35 te kweken verkrijgt men een reeks lysogene stammen die klonen zijn in λ van de multifunctionele linker en op de receptor overgedragen donor-sequenties. Hiermee 870 1 45 0 -10- heeft men de beschikking over een beperkte genenbank van donor-DNA dat op de receptor is overgedragen.

Door nu met het DNA van een kloon met behulp van directe transformatiemethoden weer een receptor 5 te transformeren en te screenen op transformanten kan men de in de verschillende kloons overgedragen donor-DNA-sequenties correleren met de fenotypische expressie in de receptor.

De werkwijze volgens de uitvinding maakt het 10 derhalve mogelijk, genen van een donor op een receptor over te brengen, zonder dat men vooraf een uitgebreid onderzoek behoeft te verrichten naar de correlatie tussen bepaalde genen en een fenotypisch kenmerk.

Als men eenmaal geschikte transformanten heeft verkre-15 gen, kunnen deze direct worden toegepast. De hierbij gemaakte geldelijke winst kan in een volgend stadium worden geïnvesteerd in verder onderzoek ter nadere karakterisering van de transformanten, en meer in het bijzonder van de overgedragen genen. Bijzonder 20 voordelig is hierbij, dat de eerste transformanten nog de multifunctionele linker-sequentie bevatten, zodat het overgedragen DNA in het receptorgenoom kan worden herkend en daaruit weer kan worden geïsoleerd met behulp van de interactie tussen de op de multi-25 functionele linker gelegen operator-sequentie en het bijbehorende repressoreiwit.

Na verkrijging en karakterisering van de op de receptor overgedragen genen kan men eventueel een deel van de multifunctionele linker-sequentie uit 30 het receptorgenoom verwijderen. Dit kan gewenst zijn, omdat sommige elementen van de linker na de transformatie overbodig zijn en het in het algemeen de voorkeur verdient overbodige veranderingen in het receptorgenoom te vermijden, vooral aangezien het hier in de meeste 35 gevallen om soort-vreemd DNA zal gaan. In dit laatste geval wordt een korte versie van de multifunctionele 870 1 450 -11- linker gebruikt. Het gedeelte van de multifunctionele linker dat homoloog is met een deel van het receptor-genoom dient normaal echter aanwezig te blijven om het DNA weer door middel van recombinatie in het receptor-5 genoom te kunnen inbrengen.

De werkwijze volgens de uitvinding heeft een breed toepassingsgebied. De praktijk zal leren, waar de grenzen van verwantschap liggen, waarbinnen de werkwijze nog met succes kan worden toegepast. Ongetwij-10 feld zal het overbrengen van genetisch materiaal gemakkelijker verlopen naarmate de verwantschap tussen receptor en donor groter is. De werkwijze kan zo met succes gebruikt worden om bepaalde kenmerken van een soort over te brengen op een andere variëteit van 15 dezelfde soort, of op een andere soort van dezelfde familie, of zelfs op een soort van een andere familie.

Zoals uit het experimentele gedeelte zal blijken is de werkwijze reeds succesvol gebleken voor het transformeren van monocotyle planten met van andere 20 monocotyle planten afkomstig DNA.

De multifunctionele linker, die een wezenlijk onderdeel van de uitvinding vormt, kan op verschillende manieren worden bereid, afhankelijk van de specifieke opbouw van de linker. Gezien de grootte van de linker, 25 die in het algemeen in de orde van grootte van ca.

3600 baseparen zal liggen, lijkt het onaantrekkelijk de totale sequentie langs synthetische weg te bereiden.

De vooruitgang op het gebied van de synthese van DNA-se-quenties gaat echter zo snel dat het wellicht binnenkort 30 routinematig mogelijk zal zijn dergelijke sequenties geheel synthetisch te bereiden. Gedeelten van de sequentie kunnen echter in ieder geval wel synthetisch bereid worden. Gezien het grote aantal manieren waarop de multifunctionele linker volgens de uitvinding en al 35 zijn varianten bereid kunnen worden, is het niet mogelijk een algemeen bereidingsvoorschrift te geven. Voor 8701450 r -12- de deskundige op het gebied van de recombinant-DNA-techniek zal het echter in de meeste gevallen duidelijk zijn, hoe een bepaalde multifunctionele linker bereid kan worden. De multifunctionele linker en onderdelen 5 daarvan kunnen geproduceerd en verkocht worden in de vorm van een kit. Ter verduidelijking zal hierna de bereiding van de multifunctionele linker volgens de uitvinding met de in fig. 1 weergegeven sequentie worden beschreven.

10

Voorbeeld X

Bereiding van een multifunctionele linker 15 A. volgens figuur IA.

Er wordt een multifunctionele linker volgens de uitvinding bereid met de in fig. IA weergegeven 20 opbouw. Als voorbeeld wordt hier aangenomen, dat de linker gebruikt zal worden voor het transformeren van DNA van een gerstvariëteit met het DNA van een tarwevariëteit.

De linker heeft een lengte van ongeveer 3600 25 baseparen en bevat de volgende elementen: 1. De sequentie attB van Escherichia coli K12: GCTTTTTTATACTAA Deze sequentie is voldoende voor de integratie van bacteriofaag lambda (H.A. Nash, Ann.Rev.Genetics 30 15, 143-167, 1981).

De functie van attB op de multifunctionele linker is de integratie van de linker, te samen met de genetische informatie die er covalent aan gebonden is, in bacteriofaag lambda. De volledige sequentie 35 is: 870 1 <i 5 0 u -13- I-1 T-1 (-1

GCTGCAGCTTTTTTATACTAAGATCTGAATTC

PstI Bglll EcoRI

Deze sequentie wordt chemisch gesynthetiseerd 5 in een DNA synthesizer model Applied Biosystems 380 A.

De sequentie PstI - attB - Bglll - EcoRI wordt gekloneerd in het plasmide pBR322, dat is opengeknipt 10 met PstI en EcoRI en getransformeerd naar 13. coli HB 101. De integratie van pBR322 in bacteriofaag lambda b506 cI857 (R.W. Davis & J.S.Parkinson 1971.

J.Mol.Biol. 56/ 403-423) wordt bewezen door de overdracht van de tetracycline resistentie in de 15 stam JE. coli C 600/ lysogeen gemaakt door faag lambda.pBR322 (attB) is de bron van de attB sequentie met PstI en Bglll uiteinden.

De sequentie Pstl-attB-Bglll wordt gekloneerd in 20 het pUC8 plasmide dat is opengeknipt met BamHI

en PstI. De struktuur van de kloon en de attB functie worden bewezen door integratie van de ampicillinere-sistentie merker van pUC8 in faag Xcly857 die vervolgens E. coli JM109 lysogeen en ampicilline resistent 25 kan maken bij 30°C. Het plasmide pUC8 (attB) is de bron van de attB p op lac sequentie met Haell en PstI uiteinden.

30 2. Voor verdere klonering wordt een beroep gedaan op het plasmide Pi AN7, waarvan het supF gen vervangen is door bet amp gen van pUCl9. Om dit te bereiken wordt Pi AN7 geknipt met XmnI en Hae II en pUC19 met Aat II en Hae II, de fragmenten worden blunt 35 end gemaakt met mung bean nuclease en geïsoleerd door agarosegelelectroforese. Het 240 bp grote 8701450 -14- piAN7 fragment wordt geligeerd met het 1560 Bp grote pUC19 fragment ter vorming van Pi Amp 71 waarbij de Eco RI site van de MCS van Pi AN7 terug ontstaat en de Haell site verdwenen is. Van de 5 twee mogelijke oriëntaties wordt deze behouden die de replicatiesequentie van Col El herstelt.

De kloneringsite (MCS) van Pi Amp7l(MCS) ziet er uit als volgt: (amp) EcoRI-Xmal-BamHI-AccI-Pstl-BglII-Xbal-HindlII 10 (ori). De crossing-over hot-spot instigator (Chi) van E. coli (G.R. Smith et al. 1981, Cell 24: 429-436) waarvan de sequentie is: GCTGGTGG, wordt met behulp van een DNA synthesizer model Applied Biosystems 380A chemisch gesynthetiseerd. De volledige gesynthe-15 tiseerde sequentie is als volgt: CTCTAGAGATCTGCTGGTGGCGCTCTAGAGC (Xbal-BglII-Chi-HaelI-Xbal). Deze sequentie, geknipt met Xbal, wordt gekloneerd in de Xbal site van Pi Amp71. Van de twee mogelijke oriëntaties wordt degene behouden die na openknippen 20 met BglII en terug sluiten de Haell site verliest.

Het verkregen plasmide wordt verder genoemd Pi Amp 71 C en heeft de struktuur (amp) EcoRI-Xmal-BamHI-AccI-PstI-BgllI-Xbal-HaelI-Ch i -25 BglII-Xbal-HindlII(ori)♦ 3. Hierin wordt nu de Pstl-attB-p op lac Haell sequentie gekloneerd na openknippen met PstI en Haell. Aldus wordt een plasmide Pi Amp71 ALC met de volgende 30 structuur verkregen: (amp) EcoRI-Xmal-BamHI-AccI-Pstl-attB-p op lac-HaelI-Chi-BgllI-Xbal-HindIII (ori) 4. Pi Amp71 ALC is algemeen bruikbaar voor het inbouwen 35 van genen, welke in de receptor kunnen worden geselec teerd, en van een sequentie, ontleend aan de receptor.

8701450 -15-

Het hier gekozen voorbeeld is dienstig in de transformatie van gerst met tarwe DNA.

Het chloramphenicol acetyltransferase gen met de regelelementen van het nopalinesynthase gen 5 van Agrobacterium tumefaciens stam C58 (M. De Block et al. EMBO J 3_ (1984) 1681-1689) wordt als een Clal fragment gekloneerd in de AccI site van Pi Amp71 ALC. Aldus wordt een plasmide Pi Amp71 CATALC verkregen met de struktuur: 10 (amp) EeoRI-Xmal-BamHI-pnos-cat-S'nos-Pstl-attB-p 0£ lac-HaelI-Chi-BglII-Xbal-HindlII(ori) 5. De DNA sequentie, die homoloog is aan een gedeelte 15 van het gerst receptor DNA, is een zogenaamde repeat-se- quentie. Gerstkiem DNA wordt met behulp van ultrageluid (sonicatie) gefragmenteerd tot stukken met een lengte van ongeveer 1000 bp. Na denaturatie en renaturatie worden de fragmenten met een Cot 1/2 20 waarde van 10E2 na behandeling met SI nuclease op hydroxyapatiet als dubbelstrengs DNA geïsoleerd.

Deze fragmenten worden aan de uiteinden met behulp van terminaal transferase verlengd met oligo dC en gekloneerd in de PstI site van pUCl9, waarvan 25 de uiteinden met behulp van terminaal transferase verlengd zijn met oligo dG. Van de gekloneerde fragmenten wordt er één gekozen met een lengte van ongeveer 1000 bp, dat hybridiseert met ongeveer 1% van de andere kloons en geen inwendige restrictie-30 sites bevat voor PstI, BamHI of BglII. Dit pUC19 plasmide dient verder als bron voor receptor repeat DNA met PstI uiteinden. Opmerking verdient nog dat desgewenst kan worden nagegaan of de gekloneerde fragmenten voorkomen in DNA dat tot expressie komt 35 in een bepaald weefsel (bv bladmoes) door gebruik te maken van de footprinting techniek. Hiermee 8701450 -16- word t gedoeld op het verdwijnen uit chromatine van die DNA sequenties die tot expressie komen en dit na behandeling met DNAase.

De repeat sequentie wordt nu als PstI fragment 5 ingebouwd in de PstI site van Pi Amp71 CATALC. Er zijn twee oriëntaties mogelijk en beide worden behouden en gebruikt in transformatie experimenten.

Dit uiteindelijke plasmide bevat een volledige multifunctionele linker volgens de uitvinding met 10 BamHI en BglII uiteinden. Hierna wordt dit plasmide aangeduid met Pi Amp71 CATRALC. Na uitknippen uit de vector kan deze linker nu gebruikt worden om donor DNA fragmenten met GATC uiteinden, behandeld met phosphatase, ringvormig te sluiten.

15 6. De haarspeld struktuur, die gebruikt wordt voor de constructie van lineair donor DNA met multifunctionele linkers aan de uiteinden, heeft de volgende sequentie: Ncol AvrII Ncol 20 gatc^cca^g^cctagSagJcc^tg^pgatc

Bell Sfil Bell

Deze sequentie wordt chemisch gesynthetiseerd in een DNA synthesizer model Applied Biosystems 380A en gekloneerd in de BamHI site van pUC 19. Het 25 aldus bekomen pUC 19H is de bron van de haarspeldse- quentie door knippen met Sau3A van het kleinste PvuII fragment.

De haarspeldstruktuur ontstaat door denaturatie en snelle renaturatie van het aldus verkregen fragment 30 en kan zowel met de BamHI als de BglII uiteinden van de multifunctionele linker als met de GATC uiteinden van het donor DNA worden geligeerd. Er worden twee haarspeldstrukturen gevormd die slechts verschillen in de basen aan de top: AGG of CCT.

35 Na eventuele replikatie van de ontplooide haarspeld struktuur zal een AvrII en een Sfil restrictiesequen-

S701A5O

-17- tie ontstaan. Het verschil tussen de twee strukturen ligt in de exacte lokalisatie van de AvrII site die drie nucleotiden verplaatst is in één van beide ten opzichte van de andere. Het bereiden van multifunc-5 tionele linker met haarspelduiteinden gebeurt als volgt: 1) rechts van de multifunctionele linker.

Pi Amp71 CATRALC wordt geknipt met Bgl II en geligeerd 10 net het Bel 1 uiteinde van de haarspeldsequentie.

Na transformatie van de stam HB101 ontstaat door replikatie een cirkelvormig dimeer dat na isolatie en knippen met BamHI de haarspeldsequentie tussen twee MFL's levert.Door denaturatie en snelle renaturatie 15 aan lage concentratie (I yugfml) ontstaat hieruit de gevraagde structuur met BamHI uiteinden.

2) links van de multifunctionele linker.

Door Pi Amp 71 CATRALC te knippen met BamHI voor 20 het ligeren met de haarspeldsequenties en door het in HB101 verkregen dimeer te knippen met BglII ontstaat door eenzelfde werkwijze de haarspeldstructuur links van de MFL.

De beide multifunctionele linkers met haarspelduitein-25 den worden nu gemengd in gelijke hoeveelheid en met donor DNA fragmenten met GATC uiteinden geligeerd.

Het is duidelijk dat één bepaald fragment in vier verschillende vormen kan voorkomen: L-----------------ΪΓ inverse repeat R-----------------Rj T ___________T> direkte repeat

R------------------DJ

870 1^50 -18-

Ongeveer 50% van de verkregen molekulen zal de multifunctionele linker als direkte repeat op de uiteinden dragen, de andere molekulen dragen de linker als inverse repeat.

5 De eersten kunnen via recombinatie cirkelvormige molekulen vormen die slechts één kopie van de multifunctionele linker bevatten. De laatsten kunnen slechts cirkelvormige molekulen vormen indien zij de nodige elementen bevatten die replikatie in 10 de receptor mogelijk maken.

B. Volgens figuur 1B.

De vector voor de constructie van de multifunctio- 15 nele linker geschikt voor vermenigvuldiging en selectie in een microörganisme wordt als volgt bereid: 1. Het plasmide pUC19 wordt geknipt met Aatll en blunt end gemaakt met mung bean nuclease. Hierna wordt 20 opnieuw geknipt met EcoRI en de uiteinden blunt end gemaakt met T4 DNA polyerase. Door ligatie van het grote fragment (396-2617) wordt een pUCl91 verkregen waaruit het lacZ gen is verdwenen en de EcoRI site van de MCS is hersteld.

25 2. De Xbal-BglII-Chi-HaelI-Xbal sequentie wordt met Xbal uit Pi Amp71C geknipt en gedoneerd in pUC191, verder aangeduid als pUC191C00L.

30 3. Het Clal fragment met het chloramphenicol acetyltrans- ferase gen met de regelelementen van het nopaline synthasegen van Agrobacterium tumefaciens stam C58 wordt gedoneerd in de AccI site van pUC191COOL. Aldus wordt het plasmide pUC191COOLCAT verkregen.

4. De receptor repeat sequentie wordt uit de vector pUC19 geknipt met PstI en gedoneerd in de PstI

35 8701450 a -19- site van pUC19lC00LCAT. Dit laatste plasmide wordt nu verder aangeduid als pUC191C00LCATR en is in feite een cirkelvorm van de multifunctionele linker volgens figuur 1B.

5 5. De haarspeldstructuren worden op dezelfde manier aangeheeht als beschreven voor Pi Amp71 CATRALC.

Voorbeeld II

10

Transfer van tarwegenen naar gerst

Als donor wordt een variëteit van tarwe gebruikt met een goede bakwaarde (Triticum aestivum cultivar ^5 Rektor). Het DNA wordt geïsoleerd uit chromatine van embryo's, geproduceerd door molens als basismateriaal voor tarwekiemolie. De embryo's worden eerst ontvet met chloroform 15% ethanol en vervolgens gedroogd onder vacuum. De embryo's worden vervolgens fijngemalen 20 in vloeibare stikstof en geëxtraheerd bij -20°C met Griesbach buffer (R.J. Griesbach et al. 1982 Plant Sci Lett 24:55-60) waaraan glycerol is toegevoegd tot een eindconcentratie van 50%. Het mengsel wordt gefiltreerd door nylon doek (50 micron gaas) en daarna 25 afgecentrifugeerd bij 4000 g. Het chromatine wordt van de zetmeellaag gescheiden, verschillende malen gewassen met Griesbach buffer en tweemaal door een kussen van 2,3M saccharose in Griesbach buffer gecentrifugeerd.

Uit het aldus verkregen chromatine wordt het DNA vrijgemaakt 30 door toevoeging van NaCl tot een concentratie van 2 M en gedeproteïniseerd met een mengsel van fenol, chloroform en isoamylalcohol (50,48,2). Hieruit wordt het DNA neergeslagen met ethanol, opgelost in Tris 0,01 M, EDTA 0,001 M en nogmaals neergeslagen met 35 isopropanol in aanwezigheid van 0,3 M natriumace- taat. Hierna wordt het DNA opgelost in zuiver water.

8701450

A

-20-

Gedeelteti van dit DNA worden geknipt met BamHI, Bglll,

XhoII, Sau3A, Bell of Hbol of een mengsel van deze restrictie enzymen, die alle een 5'GATC uiteinde geven, maar een verschillende gevoeligheid hebben voor methylatie 5 van de restrictiesequentie en verschillende restrictiesites knippen. De gemiddelde grootte van de fragmenten wordt op ongeveer 10.000 bp gehouden.

De verkregen fragmenten worden met fosfatase (kalfdarmfosfatase) ontdaan van de eindfosfaatgroepen 10 en geligeerd met de multifunctionele linker op zodanige manier dat de verbinding donor DNA-linker ten minste geen BamHI. Bglll of Bell site bevat (zie tabel 1).

Op deze wijze worden ringvormige moleculen gevormd die donor DNA en multifunctionele linker bevatten.

15 Voor het bereiden van lineaire moleculen met multifunctionele linker en haarspeldstructuren worden de donor DNA fragmenten geligeerd met een mengsel van linkse en rechtse multifunctionele linker moleculen met haarspelduiteinden.

20 De verkregen donor DNA fragmenten, gekoppeld aan multifunctionele linker, worden gescheiden van de linker op grond van hun moleculair gewicht (2 Mdal tov 8 a 10 Mdal). Naargelang de hoeveelheid DNA kan dit gebeuren op een agarosegel door electroforese 25 door agarose zeefchromatografie of door gradiëntcen-trifugatie. Het ringvormig gesloten donor DNA en het lineair donor DNA met haarspelduiteinden kan gezuiverd worden door behandeling met exonuclease.

De gerst receptor planten worden opgegroeid 30 in potten in de kas. Ongeveer rond het ogenblik dat de bevruchting plaatsgrijpt, worden de aartjes opengemaakt en met behulp van een Eppendorf microïnjector wordt ongeveer 10 pL gezuiverd donor DNA gekoppeld aan multifunctionele linker, ringvormig of lineair, ingespoten in de embryozak, 35 dwars door de wand van het ovarium. De niet behandelde ovaria worden weggeknipt, de kafjes worden terug dichtgemaakt 8701450 5 -21- en de behandelde aren afgeschermd met een perkamentenzakje. De zaden van de aldus verkregen planten worden getest voor resistentie tegen het antibioticum waarvoor het resistentiegen werd ingebracht (bv chloramphenicol).

5 De resistente kiemlingen worden verder opgegroeid in kas of in open veld naargelang het seizoen. Er kan nu getest worden op jonge bladeren van de resistente planten voor de aanwezigheid van het ingebrachte donor DNA, door gebruik te maken van de functies gelegen 10 op de multifunctionele linker enerzijds en door na te gaan welke sequenties ermee verbonden zijn. Totaal DNA wordt geëxtraheerd volgens de methode van Lemmers et al. (1980) J. Mol. Biol. 144; (353-376) en afgebroken met BamHI, BglII, Bell of XhoII afhankelijk van de 15 gebruikte restrictieënzymen bij de constructie van het ingebrachte donor DNA (zie tabel 1). Door Southern hybridisatie met de sequentie van de multifunctionele linker kan nagegaan worden hoeveel fragmenten van donor DNA zijn behouden in het gerstgenoom. De grootte 20 van de fragmenten wordt vergeleken met een Southern hybridisatie tussen het voor de microinjectie gebruikte donor DNA en behandeld met hetzelfde restrictieënzym en de sequentie van de multifunctionele linker. Afwijkende grootten kunnen duiden op integratie van het ingebrachte 25 donor DNA.

Van het zaad van deze eerste generatie van behandelde gerstplanten (Tl) wordt een gedeelte van het endosperm verwijderd voor SDS PAGE om na te gaan welke zaden een verschillend electroforesepatroon 30 van reserveëiwitten vertonen ten opzichte van de oorspronkelijke variëteit en welke eiwitbanden er eventueel overeenkomen met deze van de gebruikte tarwevariëteit (Rektor).

Het verkrijgen van een gerstvariëteit met tarweëiwit-ten is een eerste resultaat van de techniek toegepast 35 in deze uitvinding.

870 1 ή5 0 -22-

Voorbeeld III

Hierin wordt een methode beschreven om genen van een donor, die tot expressie zijn gebracht in een receptor 5 en welke op grond hiervan in de receptor zijn gescreend of geselecteerd, terug te vinden door gebruik te maken van de multifunctionele linker. De methode omvat de volgende stappen: 10 1. Het isoleren van DNA uit het chromatine van de geselecteerde receptor.

2. Het knippen van dit DNA met een restrictieënzym, overeenkomstig de voorbeelden in tabel 1.

3. Het ringvormig sluiten van de aldus verkregen DNA

15 fragmenten.

4. Het afzonderen van DNA dat de multifunctionele linker bevat door gebruik te maken van de lac operator-re-pressor binding.

5. Het transformeren van microörganismen met het ringvor-20 mig DNA, waarbij al of niet gebruik wordt gemaakt van een vector.

6. Het screenen of selecteren van microörganismen op basis van expressie van het op de multifunctionele linker gelegen gen.

25 7. Het analyseren van de hierdoor verkregen beperkte genenbank van donor DNA fragmenten overgebracht naar de receptor.

8. Het opnieuw inbrengen van individuele donor DNA fragmenten in een receptor teneinde de fragmenten 30 te correleren met de geselecteerde eigenschappen van de receptor.

De hierboven beschreven methode kan toegepast worden in gelijk welke generatie van geselecteerde 35 receptoren. Het is echter duidelijk dat, in geval van sexuele voortplanting, hoe meer generaties men 8701450 * -23- verwijderd is van de behandelde generatie hoe minder donorgenen men terugvindt bij een bepaald individu.

Door selecteren gedurende verschillende generaties kan men uiteindelijk individuen verkrijgen welke alleen 5 nog die genen van de donor hebben overgehouden waarvoor geselecteerd wordt.

In hetgeen volgt wordt een toepassing beschreven van de methode op de T2 generatie van gerstplanten uit voorbeeld II.

10

Stap 1

De zaden van de gerstplanten verkregen op de Tl generatie worden getest voor resistentie tegen 15 chloramfenlcol (5 /ug/ml), gecodeerd door het plant-aan-gepaste cat gen in de multifunctionele linker. Jonge bladeren van de resistente planten worden regelmatig geoogst en bewaard in vloeibare stikstof. De bladeren van elke plant worden fijngemalen in een porceleinen 20 mortier met behulp van zand en een stamper, gekoeld met vloeibare stikstof. Chromatine wordt geïsoleerd met de Griesbach buffer waaraan 50% glycerol is toegevoegd en gekoeld op -20°C. De suspensie wordt gefiltreerd door nylondoek met 50 /um mazen. Het chromatine wordt 25 gesedimenteerd bij 4000 g gedurende 30 minuten en het sediment in suspensie gebracht in Griesbach buffer. Celafbraakprodukten worden verwijderd door centrifugatie bij 100 g gedurende 15 minuten. De bovenstaande vloeistof wordt gecentrifugeerd boven een kussen van 2,3M saccharose 30 in Griesbach buffer bij 70.000 g gedurende 2 uur.

Het sediment dat chromatine en zetmeelkorrels bevat wordt in 2M NaCl pH8 in suspensie gebracht waarbij het DNA wordt vrijgemaakt.

De DNA oplossing wordt geschud met een mengsel 35 van fenol-chloroform-isoamylalcohol (50/48/2) bij pH8. Na scheiding van de fasen wordt het DNA neergeslagen &701450 -24- met koude (-20°C) ethanol, gedroogd met 96% ethanol en dan met een luchtstroom. Het DNA wordt nu opgelost In Tris 0,01M, EDTA Ο,ΟΟΙΜ pH8 en opnieuw neergeslagen met isopropanol in aanwezigheid van 0,3 M Na acetaat.

5 Na opnieuw drogen wordt het DNA uiteindelijk opgelost in zuiver water.

Stap 2 10 Receptor DNA van planten die door BamHI geknipte donor DNA fragmenten werden getransformeerd, wordt in deze stap eveneens met BamHI geknipt onder condities opgegeven door de verkoper, met dien verstande dat BamHI ster activiteit tot een minimum beperkt blijft.

15 Het geknipt DNA wordt opnieuw gefenoliseerd, neergeslagen met ethanol en opgelost in zuiver water.

Stap 3 20 Een gedeelte van het verkregen DNA wordt verdund tot een concentratie van 30 /ug/ml en ringvormig gesloten met behulp van T4 DNA ligase onder de condities opgegeven door de verkoper. Het percentage ringvormig DNA wordt bepaald door electronenmicroscopie.

25

Stap 4

Het in step 3 verkregen DNA wordt in aanwezigheid van lac repressoreiwit op een filter afgezonderd zoals 30 beschreven door Riggs et al. in J. Mol. Biol. 53:401 (1970).

Stap 5 35 Indien het donor DNA een multifunctionele linker bevatte geschikt voor vermenigvuldiging in een microörga- 870 U50 * -25- nisme wordt het filter bij 30°C geïncubeerd met JS. coli MC1061 recA bacteriën, competent gemaakt volgens de methode van Dagert en Ehrlich (Gene _6: 23-29, 1979).

Indien het donor DNA een multifunctionele linker bevatte 5 geschikt voor integratie in een lambda vector wordt gebruik gemaakt van MC1061 reeA bacteriën lysogeen voor lambda NM540 A of X (N Murray J.Mol. Biol. 98:551 (1975 en zie verder).

Faag lambda NM540 A wordt als volgt bereid: 10 Uit het plasmide pKC7 (Rao en Rogers Gene Jj 79-82 (1979)) wordt het Aph31II gen geknipt met BglII en BamHI en gedoneerd in PiAmp71 geknipt met BglII.

Na ligatie wordt opnieuw geknipt met EcoRI en HindlII en gedoneerd in pUC8 geknipt met dezelfde enzymen.

15 Geselecteerd worden kanR colonies in JM109. Lambda NM540 DNA heeft een unieke HindlII site op positie 27475 links van de attP sequentie. Het Sail Aph3'II HindlII fragment en een partieel Aval fragment van 1 tot 19397 bp van faag lambda worden hiermee tesamen 20 geligeerd en de faag na transfectie geïsoleerd. De aldus verkregen faag lambda NM540 A heeft alle nodige functies voor het integreren van ringvormig DNA met de attB sequentie en kan instaan voor zijn vermeerdering en infectiviteit in een recA stam. Het NM540 A DNA 25 heeft de volgende deleties: 7000 bp (van Aval tot Sail), 2300 bp (imm21 ipv ImmX) en 2800 bp (nin5), een totaal van ongeveer 12.000 bp. Deze faag heeft slechts 75% van het lambdagenoom en kan tot 20.000 bp vreemd DNA opnemen.

30 Lambda NM540 X wordt op een soortgelijke wijze verkregen. Daarbij wordt het Sail XylE HindlII fragment van RFI DNA van faag m!3 Tg 402 (Zukowski et al. Proc Nat Acad Sci USA 80:1101-1105, 1983) gebruikt.

De MC1061 recA bacteriën lysogeen voor lambda 35 NM540 A of X worden getransformeerd bij 30°C gedurende 20 minuten met het ringvormig donor DNA gekoppeld 8707450 -26- aan multifunctionele linker en daarna geïnduceerd bij 42°C gedurende 15 minuten. Tijdens de daaropvolgende faagreplicatie wordt het donor DNA dankzij de attB site op de multifunctionele linker opgenomen in het 5 faag DNA door integratieve recombinatie gepromoveerd door de integrase (int) van faag lambda. Door dit process komt de oji> lac (promotor operator van het lacZ gen) te liggen vóór het XylE of het Aph3'II gen.

De sequentie bevat een TAA stopcodon in het leesraam 10 van lacZ gevolgd door een ATG startcodon van het XylE of Aph31II gen (zie figuur 2).

Dankzij de aanwezigheid van het ximm21 N gen product wordt door de RNA polymerase van 12. coli doorgelezen.

15 Fagen die het donor DNA en de multifunctionele linker in hun DNA hebben opgenomen worden herkend aan hun eigenschap om in aanwezigheid van IPTG catechol te oxideren in hun gastheer bacterie of aan de bacterie resistentie tegen kanamycine te geven en dit bij 30°C.

20 De verdere procedure is afhankelijk van de gebruikte multifunctionele linker en of het donor DNA aldus is opgenomen in een faag of als een plasmide kan worden behandeld.

25 A. Het donor DNA is opgenomen in lambda NM540 A of X. De fagen worden vermenigvuldigd bij 42°C en het lysaat onderworpen aan een cesiumformiaat gradiënt-centrifuga-tie. De fracties van het gradië’nt die fagen bevatten met een lagere densiteit dan de parentale faag en 30 dus meer DNA bevatten, worden gebruikt om MC1061 recA bacteriën te lysogeniseren bij 30°C. Aldus wordt een beperkte DNA bank verkregen van donor DNA fragmenten die reeds in een dertigtal fracties zijn gescheiden naar hun molecuulgewicht. Het percentage xylE* of 35 kanR kolonies wordt bepaald en een gedeelte bewaard in vloeibare stikstof na toevoeging van 20% glycerol.

9701450 -27-

Zoals duidelijk blijkt uit het schema van figuur 2 zijn alleen die lysogene bacteriën die de lambda vector hebben opgenomen via int recombinatie in de BP’ site nog in staat om xylE* of kanR kolonies te 5 geven. In die bacteriën waar de lambda vector geïntegreerd is in de PB' site is de lac promotor operator gescheiden van het xylE of het kanR gen.

Om praktische redenen wordt alleen verder gewerkt met de eerstgenoemde lysogene bacteriën.

10 Door inductie van deze lysogene bacteriën worden na 20 minuten in de bacteriën drie ringvormige DNA molekulen verkregen: het NM540A of X DNA; het donor DNA verbonden aan multifunctionele linker en het coïntegraat van beiden. Deze moleculen kunnen gescheiden worden 15 door agarose gelelectroforese of door saccharose gradiënt-centrifugatie op grond van hun grootte: respectievelijk 36500bp, 14000 +/-6000bp en 50500+/-6000 bp. (zie fig.2) 20 B. Het donor DNA kan dankzij de multifunctionele linker als plasmide in 12. coli worden vermeerderd en geselecteerd. Individuele ampR kolonies worden getest voor de grootte Van het donor DNA volgens de methode van Birnboim en Doly (Nuc Ac Res 7^1313-1523 (1979)). Indien multi-25 functionele linker en haarspelduiteinden werden gebruikt bij het bereiden van het donor DNA, wordt geknipt met de restrictie-enzymen voor deze sites in de haarspeld structuur die slechts door replicatie van het donor DNA, vóór zijn integratie in het genoom van de receptor, 30 ontstaan : AvrII en Sfil. Door het verkregen donor DNA als plasmide te knippen met bv Xbal en AvrII en door Xbal en Sfil kan men nagaan of dezelfde fragmenten ontstaan. Het vinden van donor DNA fragmenten die een sequentie bezitten dienstig voor replicatie in 35 de receptor is een duidelijke toepassing van de hier beschreven uitvinding.

Het gebruik van deze sequentie in de multifunc- 8701450 -28- tionele linker in de plaats van de sequentie van de receptor als homologiegebied voor integratie is een verdere stap in de ontwikkeling van deze uitvinding.

De twee hier beschreven methoden van isolatie 5 van donor DNA fragmenten overgebracht naar de receptor hebben beide voor- en nadelen; een gebruik van beide methoden laat toe om de donor DNA constructies met multifunctionele linker en haarspelduiteinden na hun passage in de receptor zo goed mogelijk te karakte-10 riseren.

Zowel de cirkelvormige DNA molekulen geïsoleerd na faaginduktie zoals beschreven onder A als de plasmiden geïsoleerd onder B worden individueel of in combinaties gebruikt voor rechtstreekse transformatie van nieuwe 15 receptor gerstplanten teneinde de correlatie te maken met bijvoorbeeld reserveëiwitten van het tarwe donor DNA.

Voorbeeld IV

20

Overdracht van resistentie tegen Scizaphis (Toxoptera) granium van een resistente gerstvariëteit op een gevoelige tarwevariëteit.

25 Als donor wordt een Toxoptera-resistente variëteit van gerst gebruikt. Het is bekend dat de resistente variëteiten meer benzylalcohol produceren (P.S. Juneja et al., 1972 Ann Entomol Soc Am65, 961-964). Uit de kiemen van een resistente gerstlijn wordt chromatine 30 geïsoleerd. Hiervoor worden de gerstkorrels eerst kortstondig gemalen en de kiemen met een zeef van 1 mm mazen uitgezeefd. De kiemen worden gehomogeniseerd met zand in een mortier met stamper bij de temperatuur van vloeibare stikstof. Het homogenisaat wordt opgenomen 35 in Griesbach buffer waaraan glycerol is toegevoegd tot een eind concentratie van 507> bij -20°C (R.J.

Griesbach et al.; 1982, Plant Sci.Lett. 24^ 55-60).

8701450 s -29-

De verkregen suspensie wordt achtereenvolgens gefilterd door drie lagen gaas, een laag Miracloth en een nylon doek met 60 /um poriën. Het filtraat wordt bij 10.000 g gedurende 15 min. afgecentrifugeerd en het sediment 5 nog 3 maal gewassen met 0,15M NaCl pH 7. Het chromatine wordt vervolgens door een kussen van 2,3M saccharose gecentrifugeerd, steeds in aanwezigheid van 0,15M NaCl pH7. Chromatine en zetmeelkorrels worden vervolgens bij 2M NaCl geëxtraheerd met een mengsel fenol/chloro-10 form/isoamylalcohol (50/48/2). Het zetmeel en de organische fase worden afgecentrifugeerd en het DNA neergeslagen met ijskoude ethanol. Na oplossen van het neerslag in Tris 0,01M, EDTA 0,001M pH 8 wordt het DNA na toevoeging van Na-acetaat tot 0,3M opnieuw neergeslagen 15 met isopropanol en het neerslag opgelost in zuiver water. Een gedeelte van het DNA wordt afgebroken met BamHI, een ander gedeelte met BglII en nog een ander gedeelte met XhoII. Deze restrictie-enzymen zijn ongevoelig voor methylatie van het DNA en leveren fragmenten 20 met een gemiddelde lengte van 5000 bp. Een gedeelte van de fragmenten wordt geligeerd met de multifunctionele linker in een concentratie van ongeveer 10 /ug/ml voor de bereiding van cirkelvormige molekulen en een gedeelte wordt geligeerd met multifunctionele linker 25 met haarspelduiteinden in een concentratie van ongeveer 2 /ug/ml voor het bereiden van lineaire molekulen.

Beide bereidingen worden gezuiverd van respectievelijk niet-cirkelvormig DNA en lineair DNA zonder haarspelduiteinden door behandeling met exonuclease V. Na fenolisatie, 30 precipitatie en heroplossen in zuiver water is het donor DNA klaar voor injectie.

De tarwereceptor planten worden opgegroeid in de kas. Ongeveer rond het ogenblik waarop de bevruchting plaatsgrijpt worden de aartjes opengemaakt en met 35 behulp van een Eppendorf microtnjector wordt ongeveer 20 pl DNA oplossing met een concentratie van ongeveer 8701450 « -30- 500 /ug/ml in de embryozak ingespoten, dwars door de wand van het ovarium. Na de injectie worden de kafjes weer dichtgemaakt en de behandelde aren afgeschermd met een perkamenten zakje.

5 Het halfrijpe zaad wordt geoogst en enkele malen blootgesteld aan koude en warmte gedurende een paar dagen (4°C en 45°C), om de kiemrust te doorbreken. Vervolgens worden de zaden getest voor kieming in aanwezigheid van 25 /ug/ml chloramphenicol, waarvoor 10 het resistentiegen gelegen is op de multifunctionele linker. De resistente zaden worden naargelang het seizoen verder opgegroeid in de kas of in open veld.

Tijdens het rijpen van de graankorrels op deze planten worden de bladeren bezet met Toxoptera granium.

15 De populatie wordt dagelijks gevolgd en de planten die geen insekten meer huisvesten worden er opnieuw mee bezet. Planten die na vier weken weinig of geen insekten huisvesten worden als resistent beschouwd.

Het zaad van de resistente planten wordt op aarlijnen 20 uitgezaaid en de planten zorgvuldig geöbserveerd voor morfologische kenmerken die afwijken van die van de oorspronkelijke variëteit. Het gehalte aan benzylalcohol wordt bepaald zoals beschreven door P.S. Juneja et al., 1975, Plant Physiol : 385-389.

25 Het DNA fragment dat aanleiding geeft tot een verhoogde produktie van benzylalcohol kan vervolgens geïdentificeerd worden op dezelfde manier als besproken in voorbeeld III.

30 Figuurbeschrijving

Fig. IA toont een multifunctionele linker (MFL) welke geschikt is voor integratie in een faag lambda vector.

35 Fig. 1B toont een multifunctionele linker die geschikt is voor vermenigvuldiging en selectie in 8701450 $ -31- een microörganisme zonder vector.

Fig. 1C toont ringvormig gemaakt donor DNA.

Fig. 1D toont lineair donor DNA met haarspelduit- einden.

5 Fig.lE toont lineair donor DNA met replicatiefunc- ties van de receptor en haarspelduiteinden.

De gebruikte aanduidingen hebben de volgende betekenissen: 10 attB : integratiesite van faag lambda

Chi : crossing-over hot-spot instigatorsequentie MSG : gen selecteerbaar in een microörganisme oriM : replicatiefuncties nodig in een microörganisme oriR : replicatiefuncties nodig in de receptor 15 £. 0£ lac : promotor operator van het £. coli lac gen RS : sequentie homoloog met een receptorsequentie RSG : gen selecteerbaar in de receptor.

De pijlen duiden de oriëntatie aan.

20 Fig. 2 toont schematisch het verloop in geval van expressie door integratie recombinatie.

Hierin is gal : het galactose operon van 15. coli, en bio: het biotine operon van jE. coli.

TABEL 1 donorDNA linker verbinding kan teruggeknipt geknipt met uiteinde worden door

BamHI BglII Bell XhoII Sau3A

BamHI BglII - - - +

BglII BamHI - + +

Bell BglII - - - - +

Bell BamHI +

XhoII BglII - +/- + +

XhoII BamHI +/- + + 8701450 -32-

Bacteria, fagen en plasmiden Bacteria MC 1061 Casadaban MJ Cohen SN J. Mol. Biol. 138, 179-207, 1980 C600 Appleyard R. Genetics 39, 429, 1954 MB 101 Boyer, H.W., Rolland Dussoix D. J. Mol. Biol. 41, 459-472, 1969 J Ml 09 . Yanisch-Perron, C., Vieira, J., Messing, J.

Gene 33, 103-119, 1985

Fagen ANM540 Cloning Vectors P.M. Pauwels, Elsevier 1985 Ab506 Cl,857 Davis & Parkinson, 1971

Ad,857 Sussman, R., Jacob, F., Compt. Rend. Acad. Sci Paris 254, 1417, 1962 PIasmiden pB R322 p U C 9 Cloning’Vectors P.M. Pauwels, Elsevier 1985 pUCl 9

PiAN7 Catalogue New England Biolabs 1986/1987 870 1 450

Claims (13)

1. Multifunctionele linker, geschikt voor het trans formeren van cellen en ten minste de volgende elementen bevattend : (A) een DNA-sequentie die homoloog is aan een gedeelte van 5 het receptorgenoom, (B) een operatorseguentie, en (C) een sequentie die replicatie in een micro-organisme toelaat of een sequentie die integratieve recombinatie in een vector mogelijk maakt.

2. Multifunctionele linker volgens conclusie 1, met het kenmerk dat deze tevens een gen bevat waarvan de expressie kan worden aangetoond in een micro-organisme.

3. Multifunctionele linker volgens conclusies 1 en 2 met het kenmerk deze tevens een recombinatie bevordende 15 sequentie bevat.

4. Multifunctionele linker volgens conclusie 3 met het kenmerk dat de recombinatie bevordende sequentie DNA in de vorm van Z DNA bevat.

5. Multifunctionele linker volgens conclusie 3, met 20 het kenmerk, dat de recombinatie bevordende sequentie een "crossing-over hot-spot instigator" (chi)-sequentie bevat.

6. Multifunctionele linker volgens conclusie 1-5, met het kenmerk, dat deze tevens een gen bevat, waarvan de expressie gemakkelijk kan worden aangetoond in de receptor.

7. Multifunctionele linker volgens conclusies 1-6, met het kenmerk, dat deze tevens aan één of beide uiteinden een haarspeldstruktuur bezit.

8. Multifunctionele linker volgens conclusies 1-7, met het kenmerk, dat de sequentie die homoloog is aan het 30 receptorgenoom ten minste 100 baseparen omvat. 870 1450 -* -34-

9. Multifunctionele linker volgens conclusies 1-8, met het kenmerk, dat de operatorsequentie de lac-operator van E.coli is.

10. Multifunctionele linker volgens conclusies 1-9, met het kenmerk, dat het gen, waarvan de expressie kan worden aangetoond in een micro-organisme, het aph31II gen van transposon 5, het amp gen van transposon 1 of het xylE gen van Bacillus putida is.

11. Werkwijze voor het transformeren van cellen, met het kenmerk, dat men achtereenvolgens: - hoogmoleculair DNA uit een donor isoleert, - dit DNA met behulp van een endonuclease afbreekt tot fragmenten die ten minste één volledig gen inclusief zijn regelelementen bevatten, - de verkregen fragmenten ringvormig sluit onder opname van de multifunctionele linker volgens conclusies 1-6 en 8-10, ofwel de verkregen fragmenten voorziet van multifunctionele linker uiteinde, al dan niet met terminale haar-speldstructuren volgens de conclusies 1-10, de donor DNA fragmenten gekoppeld aan de multifunctionele linker door middel van direkte transformatie methoden naar de receptor overdraagt, de receptoren screent op basis van de overgebrachte informatie.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat men - hoogmoleculair DNA uit hetzij alle, hetzij geselecteerde receptoren isoleert, - dit DNA met behulp van een endonuclease afbreekt tot fragmenten ter grootte van de overgebrachte genetische informatie, - uit het mengsel van fragmenten die fragmenten isoleert die de op de multifunctionele linker gelegen operator-sequent ie bevatten, door gebruik te maken van de

87. H50 -35- bindingskracht van het overeenkomstige repressor-eiwit, de geïsoleerde fragmenten ringvormig sluit, de ringvormige gesloten fragmenten vermenigvuldigt in een microorganisme of met behulp van een vector waarin de fragmenten kunnen integreren vermenigvuldigt in een microorganisme, waarbij men een beperkte genenbank van de op de receptor overgedragen sequenties verkrijgt, en - de verschillende sequenties opnieuw door directe transformatie naar een receptor overbrengt en de transformanten selecteert op basis van de overgebrachte genetische informatie, teneinde de sequenties te kunnen correleren met de expressie daarvan in de receptor. &70H5 0