JPH02461A - 細胞の形質転換法 - Google Patents

細胞の形質転換法

Info

Publication number
JPH02461A
JPH02461A JP63154535A JP15453588A JPH02461A JP H02461 A JPH02461 A JP H02461A JP 63154535 A JP63154535 A JP 63154535A JP 15453588 A JP15453588 A JP 15453588A JP H02461 A JPH02461 A JP H02461A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
multifunctional linker
sequence
receptor
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP63154535A
Other languages
English (en)
Inventor
Lafonteyne Jean De
ジャン　ド　ラフォンティヌ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Clovis Matton NV
Solvay SA
Original Assignee
Clovis Matton NV
Solvay SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Clovis Matton NV, Solvay SA filed Critical Clovis Matton NV
Publication of JPH02461A publication Critical patent/JPH02461A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細胞の形質転換法に関するものであり、組換
えＤＮＡ技術の分野に属するものである。
〔従来の技術〕
細胞の遺伝的性質は、この細胞のＤＮＡ中に外来のＤＮ
Ａを組込む、組換えＤＮＡ技術により、人工的に変化さ
せることができる。このＤＮＡは、形質転換をうける生
物と無関係の他の細胞に由来するものでもかまわない。
この遺伝的操作の目的の多くは、ある特異的な望ましい
遺伝的性質を有する細胞から、この性質を持たない他の
細胞へ、その遺伝的性質を伝達することにある。例えば
、特異的毒性産物、例えば除草剤に対する耐性の、耐性
植物種から、同種の非耐性変異種又は、同属内の他の非
耐性種、又は、他の多少関連する属の非耐性種への伝達
がある。
また、薬剤又は他の目的に有用な物質の産生能、例えば
、ある物質を産生ずる植物がら、他の気候で生育する、
その物質を産生できない植物への、伝達もある。さらに
、動物及びヒトの細胞系列さえも、望ましい物質の産生
に使用するため形質転換することもある。遺伝子操作は
、しばしば、大きな問題、例えば、ドナー及びレセプタ
ー細胞、及び特に、それらのゲノムの構造及び組織の不
同性によるものがある。
組換えＤＮＡ技術による細胞の形質転換について、これ
まで報告されてきた方法においては、次に示す操作が一
般的に使われてきた。特に望ましい性質又は、特別の産
物をコードする遺伝子（又は遺伝子群）を同定し、適当
なドナー細胞から単離する。しばしば、この遺伝子は、
そこから転写されるメツセンジャーＲＮＡのコピーＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）から得られる。それからこのＤＮＡを、
適当な微生物中で増巾できるベクターにクローン化する
。しばしば起きる大きな問題に、どのように、望ましい
遺伝子の完全なコピーを含むクローンを得るかというこ
とがある。もし、このことがうまく行っているならば、
その遺伝子は、しばしば、そのドナー細胞の制御要素と
は非常に異なる、レセプター細胞で使用されうる制御要
素が提供される。最後に、その制御要素を含む遺伝子を
、いわゆるシャトルベクター又は、直接形質転換法によ
り、レセプター細胞に伝達される。
〔発明が解決しようとする課題〕
細胞を形質転換するための、これらの従来法は、多（の
欠点を有している。第１に、伝達すべき遺伝子の単離及
び特性化は、手作業で単一の形質転換体を得るまでに、
融資を必要とする非常に高価な研究を必要とする。さら
にその研究には、非常に専門化した実験設備と、非常に
優秀な研究員が必要であり、それらは、計算中でもほん
の僅かな所しか存在していない。
第２に、そのレセプター中で使用できる制御要素及びシ
グナルの非常に一貫した実験が必要とされる。
第３に、ドナー及びレセプターに適したベクタ、及びシ
ャトルベクターの構築が必要である。
多くのレセプター生物に対して、適当なシャトルベクタ
ーは今だに発見もしくは、開発されてきていない。
結論的に、上記の欠点を示さない細胞の形質転換法が必
要である。
従って、本発明の目的は、簡便で、−ｉ的で、安価で、
しかも効果的な細胞の形質転換法を提供することにある
。ここでいう細胞とは、植物又は動物（人も含む）の細
胞起源はおろか、バクテリアのような原核微生物及び菌
類、イースト、藻類等の真核微生物の両方を含む微生物
までも含む、あらゆる種類の細胞を意味する。
〔課題を解決するための手段〕
この目的は、次のバラグラフで説明する本発明の方法に
より達成することができる。この方法は、いくつかの特
別な要素である、本発明の一部を形成している、いわゆ
る多機能リンカ−を含むＤＮＡ分子の使用を含んでいる
。
さらに本発明は、予め種々の組合せで構築できる多機能
リンカ−及びその一部の製造方法を含んでいる。
本発明の方法は、ドナーゲノムの断片の、本発明の多機
能リンカ−への結合及びレセプターへの直接的形質転換
を含んでいる。この形質転換は、本目的のため、多機能
リンカ−中に組込まれた、レセプター由来のＤＮＡ配列
との組換えを通して行なわれる。従って、このステップ
後、形質転換体が使用可能となり、そこから、原則的に
、伝達された性質により有利な変異体が単離されうる。
これらの変異体がここで必要としている伝達されたＤＮ
Ａ配列の詳細な知識なしに、もしくは、それらを単離す
ることなしに、直接応用できるのは、特に有利である。
これらの形質転換体の使用は、さらなる研究の融資を生
ずる可能性がある。
次のフェーズには、その形質転換を受けた細胞から高分
子量のＤＮＡの単離、この断片化及び多機能リンカ−及
びドナーＤＮＡを含む断片の単離が含まれる。これらの
断片を微生物中でクローン化し、限定されたジーン・バ
ンクを得る。これらの遺伝子でレセプターを、そのＤＮ
Ａ配列と表現型的発現が相関をもつよう形質転換する。
本発明の方法及び、多機能リンカ−及びその調製につい
て、次のバラグラフで詳しく説明する。
本発明の方法の第１ステツプには、ドナー細胞からの高
分子ｌＤＮＡのｔＡＩが含まれる。それからこれをその
制御要素を含めた１つの完全な遺伝子を含むのに十分大
きい断片を得るように、エンドヌクレアーゼ（例えば制
限酵素）で断片化する。
生成した断片を、リガーゼにより、本発明の多機能リン
カ−と結合する。この多機能リンカ−は、２つの異なる
形状をした線状ＤＮＡ分子であり、ある多機能リンカ−
はそのドナーＤＮＡ断片を環状化することができ、もし
くは、ある多機能リンカ−はこれら断片の両端にヘアピ
ン構造を提供することができる。結局、ライゲーション
で線状構造、環状構造もしくはヘアピン末端をもつ線状
構造のいずれかの形をした、ドナーＤＮＡ及び多機能リ
ンカ−を含むＤＮＡ分子が生ずる。その構造を図ＩＣ，
ＩＤ及びＩＥに示す。
多機能リンカ−は、次に示す要素の少なくとも１つを含
んでいる。
（Ａ）　　レセプターゲノムと、多機能リンカ−及びド
ナーＤＮＡを含む挿入ＤＮＡとの間で組換えが可能なよ
うに（交差により）、レセプターゲノムの一部と相同的
なＤＮＡ配列。多機能リンカ−の調製に関して、後に述
べるように、この＋ａ同的部分は、通常少なくとも１０
０塩基対から成り、かつレセプターゲノムに由来するも
のである。
（８）オペレーター配列を含むＤＮＡが、対応するリプ
レッサータンパク質との相互作用により、認識及び分離
することを可能とするオペレーター配列。原則として、
リプレッサータンパク質が十分扱いやすいものであるな
ら、ここではどのオペレーター配列でも適切といえる。
適当なオペレーター配列には、例えば、すべて大腸菌の
ｌａｃオペレーター（ラクトース）　、ｇａｌ　オペレ
ーター（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）　　及びｔｒｐオペレー
ター（トリプトファン）がある。
（Ｃ）そのＤＮＡと結合した多機能リンカ−が宿主中で
増巾されうるように、微生物中での複製を、好ましくは
、ベクター中のインテグレイティブ・’Ｊ　Ｄ　ンヒ、
７−シヨンを介して複製させることができる配列っその
ような配列には、例えば大腸菌中でバクテリオファージ
λの組込みを可能にするａｔｔ　Ｂ配列がある。そのａ
ｔｔＢ配列とは、ＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡであ
る。
（１））その多機能リンカ−を含む形質転換体の同定を
可能にする、微生物中の遺伝子の発現を可能とする配列
。このことは例えば（１）随意に制御可能なブローモー
ターを有する完全な遺伝子を組込むことによって実現さ
れる。また発現も、インテグレイティブ・リコンビネー
ションによって実現されうる。従って、随意に制御可能
なプロモーターをａｔｔ　Ｂ配列の右にクローン化する
と、このプロモーターは、λベクター上のａｔｔＰ配列
の左に位置する遺伝子を発現させる（図２）。最も＃純
な形で、要素（Ｂ）及び（Ｃ）が構造ａｔｔＢプロモー
ター／′オペレーターに限定されうろことは明らかであ
る。
ここで述べた方法は、レセプターに伝達したドナーＤＮ
Ａを、組換え機能をもたない微生物中で選択凌び増巾す
ることができ、これらｍｍえ機能によるドナーＤＮＡ中
での再配列又は欠失を避けることができる。適当な遺伝
子には、バチルス・プチダ（Ｂａｃｃ＋ｌｕｓ　ｐｕｔ
ｉｄａ）のｘｙｌＥ遺伝子があり、これは、−イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオーカ゛ラクトシト（Ｉ　ＰＴＧ）及
びカテコールの存在下、増殖中、ｌａｃオペレータープ
ロモーターの制御下−黄色のコロニーを生ずる。
他の適当な遺伝子には、例えば、ペニシリン耐性を引き
起こす旧ａ遺伝子（β−ラクタマーゼ）、ａｐｈ　［遺
伝子（カナマイシン耐性）、又は、１ａｃＺ遺伝子（β
−ガラクトシダーゼ）等がある。
（ε）一端に多機能リンカ−を連結するための適当な制
限配列と、他端に、巻きほぐされたヘアピン構造の複製
を介してのみ、特別な制限酵素又はエンドヌクレアーゼ
に対する基質となりうる配列を隠し持つヘアピン配列を
含む短いＤＮＡ配列。
ドナーＤ　Ｎ　Ａの端にヘアピン構造を付ける目的には
、＋１）核膜の孔を介する取り込みを可能にする線状構
造を保持すること、（２）細胞中のエキソヌクレアーゼ
からその末端を保護すること、及び（３）核中の組換え
酵素が、線状ＤＮＡを環状ＤＮＡに転換するのを可能に
すること、が含まれている。図ＩＤに示すように、最終
的に線状ドナーＤＮＡが、その末端での直接的繰り返し
として多機能リンカ−を有することは明らからである。
レセプター中での複製に適した、必要とする要素を含む
ドナーＤＮＡ断片を（図１Ｅ）、そのレセプター細胞の
核内で二量体化することもできる。従って、ヘアピン構
造の先端に隠された制限部位を開放し、認識させること
もできる。
その多機能リンカ−は、さらに、交差を促進する配列、
いわゆる“交差ホットスポット・インスチゲーター”又
は、大腸菌Ｋ１２の」旦配列のような“ｃｈｉ　　″配
列：　ＧＣＴＧＧＴＧＧを含むことが望ましい（スミス
（Ｓａ＋ｉｔｈ　）　、Ｇ、　Ｒ，等、セル（Ｃｅｌｌ
）、２４巻、４２９〜４３６頁（１９８１年））。
ｃｈｉ配列の変異体も、活性はしばしば低いけれど有効
である（チェノ（Ｃｈｅｎｇ　）及びスミス（Ｓｍ１ｔ
ｈ　）　、ジャーナル・イブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　１８０巻、３７
１〜３７７頁（１９８４年））。また、ここでは、他の
生物由来、例えばヒト由来の」旦配列を使うことができ
る（シェフリーズ（ＪｅＨｒｅｙｓ　）等、ネイチ−ｔ
ｙ−（Ｎａｔｕｒｅ　）、３１４巻、６７〜７３頁（１
９８５年））。最後に、Ｚ型ＤＮＡとなりうる、組込み
を促進する配列を取り込むことも可能である。さらに、
その多機能リンカ−が、レセプター内での発現を示す遺
伝子を含むならば、本発明の方法には、より都合が良い
。レセプターに伝達される性質は、しばしばその形質転
換体のスクリーニングもしくは、選択のステップで、そ
れ自体利用されるけれども、伝達された性質が直接検出
できない場合は特に、スクリーニングに直接的に適した
性質を含むことは、望ましい場合が多い。
この関係で、細胞の形質転換には、抗生物質耐性遺伝子
は適している。
本発明の多機能リンカ−は、図ＩＡ又はＩＢで示す構造
を持つことが望ましい。
細胞を形質転換するための本発明の方法の次のステップ
は、多機能リンカ−を結合したドナーＤＮＡ分子を、も
し分子量に従った分画が必要なら、それを行った後に、
レセプター細胞に伝達することである。この伝達は、マ
イクロインジェクション、エレクトロポレーション又は
自然取込みのような、直接的形質転換法によって行なわ
れる。
つづいて、そのレセプター細胞を必要ならスクリーニン
グし、多機能リンカ−と結合したドナーＤＮＡを取込ん
だ、これらの細胞を選択する。さらに、高分子量のＤＮ
Ａを、これらのレセプター細胞から単離し、適切な制御
因子及び多機能リンカ−を有する１つの完全な遺伝子を
含むのに十分な大きさの断片となるよう、エンドヌクレ
アーゼで切断する。そのリンカ−が、伝達したＤＮＡか
ら切り離されるのを防ぐため、多機能リンカ−との結合
が、ドナーＤＮＡの断片化に用いるエンドヌクレアーゼ
に対する新しい切断部位を作らないことを、予め確かめ
ておくことが必要であろう。
そのリンカ−のオペレーター配列を含む、これらの断片
は、ここでＤ　Ｎ　Ａ分子混合物の中から単離される。
この単離において、対応するオペレーター配列に対する
そのリプレッサータンパク質の非常に強い親和性が利用
される。Ｄ　Ｎ　Ａ断片を結合したりプレッサータンパ
ク質は、リッグス（Ｒｉｇｇｓ　）等の方法により、フ
ィルター上で単離する（ジャーナル・イブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（ＪｏＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、）、５３
巻、４０１頁（１９７０年））。単離の後、又は、もし
必要ならその前に、そのＤＮＡ分子をリガーゼで環状化
する。
生じたＤＮＡ分子は、使用するのに十分な量にまで、別
々に増巾する。最後に、微生物をこれら適切なＤＮＡ分
子で形質転換する。多機能リンカ−中に、複製及び選択
に必要な要素を含む断片は、その微生物中で増巾されう
る。多機能リンカ−中に、ａｔｔＢブローモーター・オ
ペレーター配列を含む断片は、形質転換及び適当なλベ
クター；例えばλＮＭ５４０　ｘｙｌＥ中へのイン・ビ
ボ（ｉｎシ１シ０）での組込み後、増１了され、及び選
択される。
もし、多機能リンカ−が例えば、バクテリオファージλ
への組込みを可能にするａｔｔ　Ｂ配列を含むならば、
多機能リンカ−を含み、かつ、そのレセプター由来のＤ
ＮＡ配列は、大腸菌ＭＣ１０６１のような溶層性ファー
ジλを含む（λＮＭ４５０ＸｙｌＥ）を含む細菌の株の
ゲノムに組込むことができる。
ファージの誘導及びブレーティングの後、細菌中にその
存在を容易に示すことができる多機能リンカ−上に存在
する遺伝子の発現を示すプラークをスクリーニングする
。例えば、ｘｙｌＥ遺伝子の存在は、そのプレート上に
スプレーしたＩ　ＰＴＧ及びカテコールの存在下での培
養での黄色のプラークの形成で容易に認識されうる。陽
性のプラークは、そのプラークの接種及び単離により、
−度にｑｉ離かつ精製される。低温での培養は、レセプ
ターへ伝達された、λ中の多機能リンカ−及びドナー配
列のクローンである一連の溶層性株を生ずる。従って、
レセプターへ伝達されたドナーＤＮＡの限定されたジー
ンバンクを得ることができる。
再び、レセプターを、直接形質転換法により、１つのク
ローンのＤＮＡでの形質転換すること及び、それを形質
転換体についてスクリーニングすることにより、別のク
ローンに転移したドナーＤＮＡ配列を、レセプター中で
の表現型発現と相関させることができる。
従って、本発明の方法は、特異的遺伝子及び発現的性質
を相関に関する従来の複雑な実験を必要とせずにドナー
からレセプターへの遺伝子の転移を可能とする。−度、
適当な形質転換体が得られれば、それらは、直接使用す
ることができる。このようにして得られた財政上の利点
は、この形質転換体及びより特別な場合には、伝達され
た遺伝子をより詳しく特徴づける研究における次の段階
で効果を発揮する。それゆえ、第１の形質転換体がなお
、その多機能リンカ−配列を含むことは、特に都合がよ
く、その結果伝達されたＤＮＡはレセプターゲノム中で
認識されうるし、また、多機能リンカ−上のオペレータ
ー配列及び適切なりプレソサータンパク質との間の相互
作用により、再びそこから単離することができる。
レセプターへ伝達された遺伝子を得、特徴づけを行った
後、必要な場合には、多機能リンカ−の一部をレセプタ
ーゲノムから除くこともできる。
そのリンカ−のいくつかの要素は、形質転換後には不必
要であり、また一般的に、レセプターゲノムでの不必要
な変化は避けることが好ましく、特にその種に対して外
来のＤＮＡがほとんどの場合であろうから、このことは
望ましいことである。
この最後の場合においては、多機能リンカ−の短かいも
のが使われる。しかし、レセプターゲノムの一部と相同
的な多機能リンカ−の一部は、通常、ｍｔａえにより再
びレセプターゲノムに、そのＤＮＡを挿入することがで
きるように残存させるべきである。
本発明の方法は、広い応用範囲をもつ。この方法がうま
く応用できる範囲内でこの関連の限界がどこにあるかは
、実際に行ってみればわかるであろう。遺伝的物質の伝
達は、レセプターとドナーの関連が強ければ強い程、疑
いなく容易に進行するであろう。従って、この方法は、
ある種の特異的性質を、同種の他の変異体に、もしくは
、同属の他の種に、もしくは、他の属の種へさえも、伝
達するのには、うまく働くことができる。
実験部分から明白なように、この方法はすでに単子葉植
物の、他の単子葉植物由来のＤＮＡによる形質転換には
、うまくいくことがわかっている。
本発明の基本的部分である多機能リンカ−は、そのリン
カ−の特異的構造に依存して、いくつかの方法で調製す
る。一般的に、約３６００塩基対のオーダーである、リ
ンカ−のサイズの観点から、合成的に全配列を作ること
は、魅力的ではないようだ。しかし、ＤＮＡ配列の合成
の進歩は非常に迅速なので、ルーチンに、合成的に全部
の配列を調製する日も遠くないかもしれない。本発明の
多機能リンカ−及びその変Ｗ体を調製する方法が多く存
在することから、一般原則を与えることはイしい。しか
し、全んどの場合、紺換えＤ　Ｎ　ＡＯ分野の熟練者に
とって、特異的多機能リンカ−をどのように調製するか
は明らかであろう。多機能リンカ−及びその一部は、製
造され、キットの形で市販されている。
説明のため、図１に示した配列をもつ本発明の多機能リ
ンカ−の調製法を以下に述べる。
実施例１ 多機能リンカ−の調製 Ａ９図ＩＡに従って 本発明の多機能リンカ−は、図ＩＡに示す構造をもつも
のを調製する。例として、そのリンカ−を大麦のＤＮＡ
の小麦のＤＮＡによる形質転換に用いると仮定する。
このリンカ−は約３６００塩基対長をもち、次の要素を
含んでいる。
１、大腸菌に１２のａｔｔＢ配列、　ＧＣＴＴＴＴＴＴ
ＡＴＡＣＴＡＡこの配列は、バクテリオファージ・ラム
ダの組込みに十分効果がある（Ｈ，Ａ、ナツシュ（Ｎａ
５ｈ　）、アニュアル・レビュー・イブ・シネティクス
（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）　、　１５
巻１１４３〜１６７頁、１９８１年）。
多機能リンカ−におけるａｔｔ　Ｂの機能は、共有結合
で結合した遺伝情報とともに、そのリンカ−をバクテリ
オファージラムダ中に組込むことである。
その完全な配列は、 ｓｔｌ しＬＬＩＩ　ヒ旦Ｒ１ である。
この配列を、ＤＮＡシンセサイザー・モデル・アプライ
ド・バイオシステムズ３８０Ａで化学的に合成する。
配列」旦！−旦見８−町＋　１１−ＥヨＲ１を、Ｐｓｔ
　Ｉ及びＢｃｏ　Ｒ１で切断したプラスミドｐＢＲ３２
２にクローン化し、大腸菌ＨＢＩＯＩへ形質転換した。
バクテリオファージラムダ熊匹Ｃｌ８５７へのｐＢＲ３
２２の組込みは（Ｒ。
Ｗ、デービス（Ｄａｖｉｓ　）及びＪ、　　Ｓ、パーキ
ンソン（ｐａｒｋｉｎｓｏｎ　）、１９７１年、ジャー
ナル・イブ・モレキエラー・バイオロジー（Ｊ、　　Ｍ
ｏｌ。
Ｂｉｏｌ、）　　５６巻、４０３〜４２３頁）、ファー
ジ・ラムダにより溶原化した大腸菌０６００株における
テトラサイクリン耐性の移行により確配列」旦Ｉ−但Ｂ
−ＢＢ４工ＩＩを、石Ｉ１１及びＰｓＬ［で切断したプ
ラスミドｐＵＣ８にクローン化する。このクローンの構
造及びａｔＬＢの機能は、大腸菌ＪＭ１０９を溶原化し
、かつ、３０℃においてアンピシリン耐性とすることが
可能なファージλｃｌ、８５７中への、ｐＵＣ８のアン
ピシリン耐性マーカーの組込みにより確認される。プラ
スミドｐＵ　Ｃ８（ａｔｔｏ＞は、小型ＩＩ及びシルＩ
末端をもつ、ａｔｔＢ　Ｈ亜里配列の起源となる。
２、　さらに、クローニングをするために、その影徂Ｆ
遺伝子を、ｐＵｃ１９の亜遺伝子で置換えたＰｉＡＮ７
を登場させる。これを行うために、ＰｉＡＮ７をＸｍｎ
１及びＨａｅ　［Ｉで切断し、一方で、ｐＵｃ１９を」
旦１１及び坦徂ＩＩで切断し、その断片を、コンブビー
ンヌクレアーゼでプラントエンド化し、さらにアガロー
スゲル電気泳動によって単離する。２４０ｂｐのＰｉＡ
Ｎ７断片を、１５６０ｂｐのρＵＣ１９断片と連結し、
ＰｉＡＮ７のＭＣ３のＥｃｏ旧部位が保存され、かつ、
Ｈａｅ１１部位が消失したＰｉＡｍｐ７１を作る。
２つの可能な方向性のうちの１つは、Ｃｏ１ＥＩの複製
配列を保持している。ＰｉＡ＋ｎρ７１　（ＭＣ５）の
クローング部位（ＭＣ３）は、 （ａｍｐ）ｆ：ｃｏＲＩ−Ｘａ＋ａｌ−ＢａｍＨＩ−八
ｃｃｌ−Ｐｓｔｌ−Ｂｇｌｌｌ−Ｘｂａｌ−Ｈｉｎｄｌ
ＩＩ　（ｏｒｔ）である。配列０ＣＴＧＧＴＧＧをもつ
、大腸菌の交差ホットスポットインスチゲーター（Ｃｈ
ｉ）は、ＤＮＡシンセサイザー・モデル・アプライド・
バイオシステムズ３８０Ａにより化学合成した。合成し
た完全な配列は、 ＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣ
ＴＡＧＡＧＣ（珈■」旺ＩＩ−Ｃｈｉ−）１赳ＩＩ−珈
Ｉ）である。Ｘｂａｌで切断したこの配列を、ＰｉＡｍ
ρ７１０Ｘｂａｌ　ａ位でクローニングする。２つの可
能な方向性のうち、Ｂｇｌｌｌでの切断と再連結後にｔ
ｌａｅｌｌｌｉ位を失ったものを保存した。生じたプラ
スミドをＰｉ　Ａ＋ｎｐ　７１ｃ　と呼び、これは次の
ような構造 （ａｍｐ旦ｃｏＲＩ−Ｘ＋ｎａｌ−旦旧−Ａｃｃ　Ｉ−
Ｐｓｔ　［−Ｂｇｌ　　ＩＩＸｂａ　　ｌ　　−Ｈａｅ
ｌｌ−Ｃｈｉ−Ｂｇｌｌ［−Ｘｂａｌ−旧ｎｄｌｌｌ（
ｏｒｉ）を持っている。
３、　　Ｐｓｔ　ｌ　−ａｔｔＢ　−ｐ　　ｏｐ　　ｌ
ａｃ　　Ｈａｅｌ［配列を、Ｐｓｔｌ及びＨａｅｌｌ切
断の後、そこにクローニングする。すると、次に示す構
造をもつＰｉ　Ａｍｐ７１　ＡＬＣが得られる。
（ａｍｐ）　ＥｃｏＲＩ−Ｘｍａｌ−Ｄａｍ−旧−Ａｃ
ｃ　［−Ｐｓｔｌ−ａｔｔ　Ｂ−ｐｏｐ　　１ａｃ−）
１ａｅ　ＩＩ　−Ｃｈｉ−Ｂｇｌ　１ｌ−Ｘｂａｌ−担
ｒｌｄｌｌｌ（ｏｒｉ）４、一般に、Ｐｉ　Ａｍｐ　７
１　ＡＬＣは、レセプターによって選択されうる、また
、レセプター由来の配列の遺伝子を取り込むのに有用で
ある。
ここで選ばれた例は、大麦の小麦による形質転換に有用
である。
アグロバクテリウムツメファシェンス （＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｌｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）　Ｃ５８株のツバリン・シンセイス遺伝子の制御要
素を含むクロラムフェニコール・アセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子（Ｍ、デ・ブロック（Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ）
等、ＥＭＢＯジャーナル３巻（１９８４年）１６８１イ
〜１６８９頁）をＰｉ　Ａ霞ｐ　７１　ＡＬＣの」匹１
部位にＣ１ａｌ断片としてクローン化した。従って、プ
ラスミドＰｉ　Ａ＋＊ｐ　７１　ＣＡＴＡＬＣは次のよ
うな構造 （ａｍｐ）　ＥｃｏＲＩ−Ｘａ＋ａｌ−Ｂａｎ＋旧韮５
−ｃａｔ−３’　ｎｏｓＰｓＬＩ　−世Ｂ−２叩　　↓
」１９−μａｅ夏１−Ｃｈｉ−β［ＩｊニューＸｂａ１
１１ｉｎｄｌｌｌ（ｏｒｉ） を持つ。
大麦のレセプターＤＮＡの一部に相同的なＤＮＡ配列は
いわゆる反復配列である。大麦の胚種ＤＮＡをウルトラ
サン（超音波）により、およそ１ｏ００ｂｐ長に断片化
する。変性及び再生の後、１０Ｅ２のＣｏｔ　１／２値
をもつ断片を、Ｓｌヌクレアーゼ処理後、二本鎖ＤＮＡ
としてハイドロキシアパタイト上で単離した。これらの
断片をターミナルトランスフェラーゼによりその両端に
オ゛リゴｄＣを伸長させ、その末端をターミナルトラン
スフェラーゼによりオリゴＧを伸長したｐＵｃ１９のＰ
ｓｔ　Ｉ　８位にクローン化した。クローン化した断片
の中から、他のクローンのおよそ１％とハイブリダイズ
し、かつ内部に、Ｐｓｔ　ｌ　、Ｂａｍｔ！Ｉ又はＢｇ
ｌｌｌの制御部位を内部にもたない、およそ１０００ｂ
ｐ長のものを選択した。
さらにこのｐＵｃ１９プラスミドは、Ｐｓｔ　［末端を
もつ、レセプター反復配列源の役割を果たす。
もし望むなら、そのクローン化した断片が特異的Ｉ織（
例えば常温菌）中で発現するＤ　Ｎ　Ａ中に生成するか
どうか、フットプリンティング法で確かめてみることも
重要である。このことによって、発現したＤ　Ｎ　Ａ配
列がクロマチンから消失することを意味し、また［）Ｎ
ａｓｅでの処理後にこのことが起こる。
ここで、反復配列をＰｓｔ　Ｉ断片として、Ｐｉ　Ａｍ
ｐ７１ＣＡＴＡＬＣのＰｓＬ　１部位に組込む。二つの
方向が可能であり、両方が保持され、形質転換実験で使
用される。この最終的プラスミドは、ｐａｑｌｌｌ及び
Ｂａ！ＩＩ末端をもつ本発明の完全な多機能リンカ−を
含んでいる。さらに、このプラスミドをＰｉ　Ａｍｐ７
１　ＣＡＴＲＡＬＣと呼ぶ。ヘクターから切り出した後
、このリンカ−は、オスファターゼで処理した、Ｇ　Ａ
　Ｔ　Ｃ末端をもつドナーＤ　Ｎ　Ａ　１ｉＪｉ片を環
状化するのに用いる。
その末端に多機能リンカ−をもつ綿状ドナーＤＮＡの構
築に用いるヘアピン構造は次のような配列をもつ。
この配列を、ＤＮＡシンセサイザー・モデル・アプライ
ド・バ・イオシステムズ３８ＯＡで化学合成し、ｐＵｃ
１９のＢａｎ＋旧部位にクローン化した。
このようにして得たｐＵｃ１９Ｈは、最小のＰＶＩＪＩ
Ｉ断片をＳａν３Ａで切断することにより、ヘアピン構
造源となる。
ヘアピン構造は、このようにして得られた断片の変性と
迅速な再生によって作られ、また、多機能リンカ−のＢ
ａｍ１ｌｌ及び地４１１１末端、及びドナーＤＮＡのＧ
ＡＴＣの両方に連結される。２つのヘアピン構造はその
先端の塩基のみが異なっている、ＡＧＧ又はＣＣＴ、も
のが生ずる。
もしあるなら、巻き戻したヘアピン構造の複製後、Ａｖ
ｒｌｌ及び５ｆｉｌ制限配制限化ずるであろう。
２つの構造の差は、１つのものが他方と３ヌクレオチド
シフトしているＡｖｒ１１部位の正確な位置にある。ヘ
アピン末端をもつ多機能リンカ−の＝ｍ　’９Ａは次の
ように行った。
（１）多機能リンカ−の右側 Ｐｉ　Ａｍｐ７１　ＣＡＴＲＡＬＣをＢｇｌｌｌで切断
し、ヘアピン配列のＢｃｌ　＋末端と連結する。１１１
１１０１株の形質転換後、環状ダイマーを複製により作
り、そのダイマーは、単離とＢａ−旧による切断後、２
つのＭＦＬ間にヘアピン配列を与える。
低濃度での変性及び迅速再生（ｌμｇ／ｍｌ）はＢａｍ
ＨＩ末端をもつ望ましい構造を生ずる。
（２）多機能リンカ−の左側 ヘアピン配列との連結前、Ｐｉ　Ａｍｐ７１ＣＡＴＲＡ
ＬＣのＩｌａｍｌｌｌによる切断及びＨＢ　１０１中で
得られたダイマーのＢａ１ｌｌによる切断により、ＭＦ
Ｌの左側に同様な方法でヘアピン構造を作る。
ヘアピン末端をもつ両多機能リンカ−をここで等遣混合
し、さらにＧＡＴＣ末端をもつドナーＤＮＡ断片と連結
する。住する断片は４種の形状をしている。
得られた分子の約５０％は、その末端にダイレクトリピ
ートの多機能リンカ−をもち、又、他のインバースリピ
ートのリンカ−をもつ。
組換を通じて、前者は１コピーの多機能リンカ−のみを
もつ環状分子を作る。後者は、それらがレセプター中で
複製を可能にするのに必要な要素を含むならば、環状分
子を作ることができる。
Ｂ１図ＩＢに従って、 微生物中での増巾及び選択に通した多機能リンカ−の構
築のためのベクターは、次のようにして作った。
１、１ラスミドｐＵｃ１９を＾ａＬｒｌで切断し、つい
で、ムングビーン・ヌクレアーゼでプラントエンドとし
た。その後それを再びＥｃｏＲＩで切断し、ついでその
末端を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでプラントエンドとし
た。大きい方の断片（３９６〜２６１７）の連結により
、１ａｃＺ遺伝子が消失し、ＭＣ３のＥｃｏＲ１部位は
保存されているｐＵｃ１９１が得られる。
２、珈１−シＢＩＩ　−Ｃｈｉ−１１ａｅｌｌ−Ｘｂａ
ｌ配列をＰｉＡｍｐ７ＩＣから、Ｘｂａ　Ｉで切り出し
、ＰＵＣ１９１中にクローン化して、ｐＵｃ１９１ｃＯ
ＯＬと命名した。
３゜　アグロバクテリウムツメファシェンス（＾ｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）のツ
バリン・シンセース遺伝子の制御要素をもつクロラムフ
Ｌニコール・アセチル・トランスフェラーゼ遺伝子を含
むＣ１ａ　Ｉ断片を、Ｉ）　ＵＣ１９１ｃＯＯＬの３＜
ｃ　１部位にクローン化し、ｐ　ＵＣ１９１ＣＯＯＬＣ
Ａ　’「を得る。
４、　レセプター反復配列をベクターｐＵｃ１９がらＰ
ｓｔｌ　で切り出し、ｐＵｃ１９１ｃＯＯＬＣΔＴのＰ
ｓｔ１部位にクローン化した。できたプラスミドをｐＬ
ＪＣｌ　９１　Ｃ００ＬＣＡＴＲと命名し、これは、事
実、図ＩＢに示した環状の多機能リンカ−である。
５、　　Ｐｉ　Ａｍｐ７１　ＣＡＲＡＬＣで述べたのと
同じ方法でヘアピン構造を付ける。
実施例■ 小麦゛　云　の　　への転 適当なベーキング値をもつ種々の小麦（トリチカム・エ
スチバムカルチハル・レフクー（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅ
ｓＬｉｖｕｍ　ｃｕｌＬｉｖａｒ　ＲｅｋＬｏｒ））を
ドナーとして用いた。そのＤＮＡは小麦胚種油の基本物
質として、ミルによって作られた胚芽のクロマチンがら
単離した。まず胚芽をクロロホルム１５％エタノールで
脱脂し、ついで真空乾燥する。さらにその胚芽を液体窒
素中で細かく砕き、−２０℃でグリースバッハ（Ｇｒｉ
ｅｓｂａｃｈ　）　ハ・）フ７（Ｒ，Ｊ、グリースハフ
　ハ（Ｇｒｉｅｓｂａｃｈ）等、（１９８２年、プラン
ト・サイエンスレター（Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ　Ｌｅｔｔ
　）　、　　２４巻、５５〜６０頁）で抽出し、さらに
Ｑ終濃度５０％となるようにグリセリンを加える。その
混合物をナイロン布で濾過（５０ミクロンゲージ）し、
さらに４０００ｇで遠心する。クロマチンをデンプン層
から分離し、数回グリースバノハハノファで洗浄後、グ
リースバノハバノファ中２．３Ｍのサッカ１コースの充
填物を通して２度遠心する。ＮａＣ１を２Ｍになるまで
加えて、生成したクロマチンからＤＮＡを′ｆＩ離し、
フェノール・クロロホルム及びイソアミルアルコール（
５０，４８，２）の混合物で除タンパクした。そのＤＮ
Ａをエタノールでそこから沈殿させ、ついで、トリス０
．０１Ｍ、ＥＤＴＡｏ、００１Ｍに溶かし、再度０．３
Ｍの酢酸ナトリウム存在下、イソプロパツールで沈殿さ
せた。そのＩ）　Ｎ　Ａを純水に溶かず。このＤＮＡの
一部を全て５’ＧＡＴＣ端を生ずるが、制限配列のメチ
ル化に種々の感受性を示し、それぞれ異なる酵素の混合
物で切断した。その断片の平均サイズは、約１０．００
０ｂｐを維持している。
その生成断片を、ホスファターゼ（ウシ腸ホスファター
ゼ）で末端リン酸基を切りとり、ドナーＤＮＡ−９ン力
−結合部が少なくとも、Ｒａｍ旧、Ｂｇｌ　ＩＩ、又は
Ｂｃｌ　１部位を持たないように、多機能リンカ−と連
結する。
このようにしてドナーＤ　Ｎ　Ａと多機能リンカ−を含
む環状分子が出来あがる。
多機能リンカ−及びヘアピン構造をもつ線状分子を調製
するため。ドナーＤＮＡ断片を、ヘアピン末端を左右に
もつ多機能リンカ−の混合物と連結する。
この多機能リンカ−と結合したドナーＤ　Ｎ　Ａ断片を
、分子量に基づいて（８〜ＩＯＭダルトンに対し、２Ｍ
ダルトン）リンカ−から分離する。
Ｄ　Ｎ　Ａ　川に応じ、これは、ゲル電気泳動、アガロ
ース・スクリーン・クロマトグラフィー又は勾配遠心法
で行なわれる。環状ドナーＤＮＡ及びヘアピン末端をも
つ線状ドナーＤＮＡは、エクソヌクレー？−ゼで処理す
ることにより精製することができる。
大麦のレセプター植物は、温室中の鉢で生育させる。受
精が起こる時に穂を開き、エソペンドルフのマイクロイ
ンジェクターを用いて、精製した、環状もしくは線状の
、多機能リンカ−を結合したトナーＤＮＡを子房の細胞
壁を通して胚種嚢の中に注入する。未処理の子房を切り
とり、籾を再びしめ、そし、て、処理済の穂をパーチメ
ントパウチで保護した。このようにして得た植物の種子
について、耐性遺伝子（例えばクロラムフェニコール）
が挿入されたかどうかの耐性テストを行った。耐性胚芽
を、その季節に応じ、温室又は野外で生育させた。挿入
したドナーＤＮＡの存在テストを一方では、多機能リン
カ−上に存在する機能を用いて、または、その配列がそ
れとともに結合していることを見し）出すことによって
、耐性植物の若葉を用いて行った。全ＤＮＡをレマー（
Ｌｅｍｍｅｒ）等の方法Ｎ１９８０年）、ジャナール・
イブ・モレキュラーバイオロジー（Ｊ、　！Ｊｏ１．Ｂ
ｉｏｌ、　）　、１４４巻３５３〜３７６頁）に従って
抽出し、ついで、挿入したドナーＤＮＡの構築の際に用
いた制限酵素に応じ、Ｒａｍ　Ｈｌ、　Ｂｇｌ　ＩＩ、
　Ｂｃｌ　Ｉ又はＸｈｏ［Ｉを用いて分解する（表１参
照）。その多機能リンカ−配列でのサウザーンハイブリ
ダイゼーションにより、どの（らい多くのドナーＤＮＡ
断片が大麦ゲノムに保持されているかを測定できる。そ
の断片の大きさは、マイクロインジェクションで用い、
かつ同じ制限酵素で処理したドナーＤＮＡと多機能リン
カ−の配列間のサウザーン・ハイブリダイゼーションで
比較することができる。並離れた大きさは挿入ドナーＤ
ＮＡの組込みを意味する。
処理した大麦植物の第１世代の種（ＴＩ）のうち胚乳の
一部は、どの種子が本来の多様性に対し、貯蔵タンパク
質の異なる電気泳動パターンを示し、また使用した大麦
の品種に対応する可能性のあるタンパク質バンドがどれ
かを見い出すためのＳＤＳ　　ＰＡＧＥの間に除かれる
。
小麦のタンパク質を有する大麦の品種を得たことは、本
発明を応用した技術の最初の結果である。
実施例■ この例は、レセプター中で発現し、またレセプター中で
そのドナー遺伝子に基づいて選択又はスクリーニングさ
れるドナー遺伝子を多機能リンカ−を用いて回収する方
法を述べている。この方法は次に示すステップを含んで
いる。
１、　選択したレセプターのクロマチンから、ＤＮＡを
単離する。
２、表１の例に従って、このＤＮＡを制限酵素で切断す
る。
３、　このようにして得たＤＮＡ断片を環状化する。
４、多機能リンカ−を含むＤＮＡを、ｌａｃオペレータ
・リプレッサー結合を用いて分離する。
５、　ベクターを用いて、又は用いることなしに、その
環状ＤＮＡで微生物の形質転換を行う。
６、　多機能リン５カー上に存在する遺伝子の発現に基
づいて微生物をスクリーニング又は選択する。
７、　そのようにして得られた、レセプターに伝達され
たドナーＤＮＡ断片の限定されたジーンバンクを分析す
る。
８、　その断片を、レセプターを選択した性質と相関さ
せるため、レセプターへ個々のドナーＤＮＡ断片を再挿
入する。
上述の方法は、選択したレセプターのどの世代でも応用
することができる。しかし、性的再生産の場合、処理し
た世代から隔れた世代になればなるほど、特定した固体
中にドナー遺伝子が見い出される率は低くなる。異なる
世代における選択により、各固体は、選択されるドナー
の遺伝子のみ保持するものが最終的に得ることができる
。
例■由来の大麦植物のＴ２世代への末法の応用を以下に
記す。
ステップＩ Ｔ１世代に得られた大麦植物の種子につき、多機能リン
カ−中の植物適応したｃａｔ遺伝子によりコードされた
クロラムフェニコール耐性をテストした。耐性植物の若
い葉を規則的に収穫し、液体窒素中で保存した。各植物
の葉を液体窒素で冷やした磁製乳鉢中、砂と乳棒で砕い
た。クロマチンをグリースバッハバッファで単離し、５
０％クリセリンを加えて、−２０℃に冷却した。そのサ
スベンジジンを５０／μｍメツシュのナイロン布で濾過
した。クロマチンを、４０００ｇ、３０分間で沈降させ
、その沈降物質をグリースバッハバッファで懸濁した。
細胞分解産物を、ｌｏｏｇ、１５分間の遠心で除去し、
その上清をグリースバッファ中２．３Ｍのサッカロース
を通して、７０，０００ｇ、２時間の遠心を行った。ク
ロマチンとデンプン粒を含む沈降物を２　ＭＮａＣｊ！
　、　ｐＨ８溶液に懸濁し、ＤＮＡを遊離させる。
そのＤ　Ｎ　Ａ　？ｊＪ液をｐ１１８のフェノールクロ
ロホルム−イソアミルアルコール（５０／４８／２）混
合物と攪拌する。
相分離後、そのＤＮＡを冷（−２０℃）エタノールで沈
殿化し、９６％エタノールと空気流で乾燥させた。この
ＤＮＡをトリス０．　ＯＩ　Ｍ、、ＩＥＤＴＡｏ、００
１Ｍ、ρ１（８の溶液に溶解し、０．３　Ｍの酢酸ナト
リウムの存在下、再度イソプロパツールで沈殿化した。
再び乾燥後、最終的にこのＤＮＡを純水に溶かす。
ステップ２ ［１ａｍｌｌｌ切断したドナーＤＮＡ断片で形質転換し
た植物のレセプターＤＮＡを同様に、ＢａｍＨＩｓ　ｔ
ｅｒ活性が最小となることが分っている製造業者の指示
に従かう条件下でＢａｍ１ｌ［で切断する。このＤＮＡ
切断物を再びフェノール処理し、エタノール沈殿し、最
後に純水に溶かす。
ステップ３ 得られたＤＮＡの一部を３０℃ｇ／ｒａｉｌとなるよう
に希釈し、製造業者の指示に従う条件下でＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで環状化する。環状ＤＮＡの率は電子顕微鏡で測
定した。
ステップ４ ステップ３で得たＤＮＡをリソゲス（Ｒ４ｇｇｓ）等（
ジャーナル・イブ・モレキュラー・バイオロジー　（Ｊ
、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　　５３巻、４０１頁（１９
７０年））により報告されているように、フィルター上
のｌａｃ　リプレッサータンパク質存在下で！ｇ離した
。
ステップ５ もし、微生’Ｉ！！Ｊ中での増１１】に通した多機能リ
ンカ−を、ドナーＤＮＡが含んでいたなら、そのフィル
ターを、ダガ〜ト（Ｄａｇｅｒｔ）及びアーリ、ヒ（Ｅ
ｈｒｌｉｃｈ）による方法（ジーン（Ｇｅｎｅ　）、６
巻、２３〜２９頁、１９７９年）に従ってコンピテント
化した大Ｎ？Ａ菌ＭＣ１０６１ｒｅｃＡ　バクテリアと
ともに３０　”ｃでインキユヘートする。もし、ドナー
ＤＮＡがラムダヘクターへの■込みに通した多Ｊｊｑ能
リンカ−を含んでいるなら、ラムダＮＭ５４０Ａまたは
Ｘに溶層性のあるＭ　Ｃ１０６１ｒｅｃＡ　バクテリア
が使われる（Ｎ、ムレ−（Ｍｕｒｒａｙ）ジャーナル・
イブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｒｉｏｌ、）　９８　Ｓ、５５１ｉ（１９７５年）及び
それ以降の報告参照）。
ファージ・ラムダＮＭ５４０Ａは次のように調製する。
プラスミドｐＫＣ７（ラオ（Ｒａｏ）及びロジャース（
Ｒｏｇａｒｓ）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、７巻、７９〜
８２頁（１９７９年））から、Ａｐｈ　３　’　ＩＩ遺
伝子を、ｐｇ、１−１１及びＨａｍ旧で切り出し、Ｂｅ
１ｌｌで切出したＰｉ　Ａ…ｐ７１にクローン化する。
連結後、それを再びＥｃｏｌ？Ｊ及び旧ｎｄｌ目で切断
し、同ハゲ素で切断したｐＵｃ８にクローン化する。Ｊ
Ｍ１０９中でにａｎ”コロニーを選択する。ラムダＮＭ
５４０ＤＮＡは、ａｔｔＰ配列の左側の、部位２７４７
５に唯一の旧ｎｄｌ＋１　部位をもつ。５ａｌｌ　Ａｐ
ｈ３　’　Ｉ＋１１ｉｎｄｆ１１断片及びファージラム
ダの１−１９３９７のへνａ１部分分解断片をそれに共
に連結し、ついでそのファージを、トランスフェクショ
ン後単層する。
このようにして得たファージラムダＮ　Ｍ　５４０　Ａ
は全て、環状Ｄ　Ｎ　ＡにＡ口Ｂを組込むのに必要な機
能をもち、ｖｅｃＡ株中での増巾及び感染性を示す。そ
のＮＭ５４０ＡＤＮＡは、次のよ−）な欠失を含んでい
る：”１０００ｂｐ（Ａｖａｌから５ａｌｌ、２３００
ｂｐ（ｉｍｍλの代り４．−１ｍｍ　２１）及び２８０
０ｂｐ（ｉｎｉｎ５）　、全部で約１２．０００ｂｐ）
　、このファージはラムダゲノムのわずか７５％しか含
んでおらず、外来ＤＮＡを約２０．　ＯＯｏｂｐまで許
容することができる。
ラムダＮ　Ｍ　５４０　Ｘも同様に得ることができる。
７７一ジｍ　ｌ　３Ｔｇ　４０２（７）ＲＦ　Ｉ（ｌＤ
ｓａｌ［ＸｙｌＥｌｊｉ　ｎｄｊ　Ｉ　Ｉ断片（ヅコウ
スキ（Ｚｕｋｏｗｓｋｉ）等、プロシディング・インナ
ショナル・アカデミ−・イブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　　ＵＳ　Ａ。
ａｏ、２ｘ　ｔｏ　ｌ−１１０５日９８３年））を用い
る。
う１．ダＮＭ５４０Ａ又はＸに溶層性をもつＭＣ１０６
１月氏Ａバクテリアを、多機能リンカ−と結合した環状
ドナーＤＮＡを用い、３０　’Ｃｌ２Ｏ分間で形質転換
させ、ついで、４０　’Ｃ１１５分間で誘導させる。ひ
きつづくファージ１Ｍ製の間、多機能リンカ−上のａｔ
ｔ８部位のため、そのドナーＤＮＡは、ファージラムダ
のインチブレース（ｉｎｋ）により推進されるインチク
レイ壬イブ・リコンビネーションによりファージＤＮＡ
中に組込まれる。
このプロセスにより、ｎハｃ　（Ｉ些Ｚ遺伝子のプロモ
ーター・オペレータ）は、ｘｙ−ｊＥ又は展３′■１遺
伝子の前に存在するようになる。この配列は、１ａｃＺ
の読み枠で′ｒＡＡ終止コドンとつづいて、ＡυＥ又は
Ａｐｈ３’ｌｌ遺伝子のＡＴＧ開始コ］ンを含んでいる
（図２参照）。λｉｍｍ　２１　Ｎ遺伝子産物の存在に
より、大腸菌のＲＮＡボレメラーゼによる読み取りは続
行される。ドナーＤＮＡ及び多機能リンカ−をそのＤＮ
Ａ中に組込んなファージは、それらの宿主バクテリア中
、Ｉ　Ｐ　Ｔ　Ｇ存在下でカテコールを酸化する性質又
は、３０　’Ｃでバクテリアにカナマイシン耐性を授け
る性質により識別することができる。
ひきつづく操作は、使用した多機能リンカ−及びそのド
ナーＤＮＡがファージに組込まれ、もしくは１つのプラ
スミドとして扱いうるかどうかという点に依存している
。
Ａ、　　ＦナーＤＮＡをう１、ダＮＭ５４０Ａ又はＸに
組込む。そのファージを４２℃で増巾し、その分解液を
ギ酸セシウム勾配遠心にかける。親ファージよりも低い
密度をもつ、ファージを含む、従って、よりＤＮＡを含
む勾配の両分を３０℃でＭＣ１０６１ｖｅｅＡを溶原化
するのに用いる。このようにして、それらの分子量に応
じ、すでに約３０の百分に別けられたドナーＤＮＡ断片
の限定ＤＮＡバンクを得る。可Ｅ°又はＫａｎＲコロニ
ーの率を測定し、その一部は２０％グリセリン添加添加
体液素中で保存した。
図２から明らかなように、ＢＰ’部位での虱ＭｉＩＡえ
を通して、ラムダベクターを取込んだ、これらの溶加性
バクテリアのみ、ｘｙｌＢ”又はハリコロニーを生ずる
ことができる。ラムダベクターがそのＰＢ’部位に組込
まれたバクテリアにおいては、ｌａｃプロモーター・オ
ペレータは９佳Ｅ又はＫａｎＲ遺伝子は分離している。
実際上の理由で、その湿作は最初に述べた溶加性バクテ
リアについてのみ続けられた。
これら溶加性バクテリアの誘導により、２０分後３つの
環状ＤＮＡ分子がそのバクテリアで得られた：ＮＭ５４
０Ａ又はＸＤＮＡ、多機能リンカ−が結合したドナーＤ
ＮＡ　；及びそれら双方を組込んだもの。これらの分子
は大きさに従かいアガロースゲル電気泳動又は、サッカ
ロース勾配遠心により分離した：各々３６５００ｂｐ、
１４０００＋／−６０００ｂρ及び５０５００　＋、”
−６０００ｂｐ　（図２参照）。
Ｂ、多機能リンカ−によりそのドナーＤＮＡを大腸菌中
、プラスミドとして増巾及び選択することができる。個
々の倶咀Ｒコロニーについて、バーンボイム（Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ）及びドリー（Ｄｏｌｙ）　（ヌクレイツク・
アシソズ・リサーチ（Ｎｕｃ、八ｃ、　Ｒｅｓ、）　７
巻１５１３〜１５２３頁（１９７９年））の方法に従か
いドナーＤＮＡの大きさをテストした。もし多機能リン
カ−及びヘアピン末端をドナーＤＮＡの調製で用いる場
合は、レセプターゲノムへの組込みの前、そのドナーＤ
ＮＡの複製で形成されるヘアピン構造中の制限部位を制
限酵素で切断する；Ａｖｒ［Ｉ及び５ｆｉｌ。例えば、
珈■とハリ■、及びＸｂａｌ　と５ｆｉ１等で、プラス
ミドとしての生成したドナーＤＮＡを切断することによ
り、同断片が生成したがどうかを試験することができる
。レセプター中での複製に適した配列を含むドナーＤＮ
Ａの発見はここで述べた本発明の明確な応用例である。
組込みに対する相同的範囲として、そのレセプターの配
列の代りに、多機能リンカ−中のこの配列を用いること
は、本発明をさらに展開するためのステップとなる。
レセプターへの伝達されたドナーＤＮＡ断片の単離のた
めの最近報告された２つの方法には、長所と短所がある
：両方法の使用でレセプター内での継代後多機能リンカ
−及びヘアピン末端をもつドナーＤＮＡ構築物をうまく
特徴づけることができる。Ａで述べたようにファージ誘
導後単離した環状ＤＮＡ分子及びＢで単離したプラスミ
ドは両方とも、例えば小麦のドナーＤＮＡの貯蔵タンパ
ク質との相関が得られるように、新しいレセプター大麦
植物の直接形質転換のために別々にもしくは組合せて用
いられる。
実施例■ シザフィス（トクトプテラ）グラニウムに対する耐性の
、耐性大麦品種から、感受性小麦品種への伝達。
使用するドナーは大麦のトクトプテラ耐性品種である。
その品種はより多くのベンジルアルコールを産生ずるこ
とが知られている（Ｐ、Ｓ、　ジュネジャ（Ｊｕｎｃｊ
ａ）等、１９７２年、アナルズオプエントモロジー・ソ
サイアテー・イン・アメリカ（＾ｎｎ、　Ｆｎｔｏｍｏ
ｌ、　Ｓｏｃ、　Ａｍ、）　　６５巻、９６１〜９６４
頁）。耐性大麦系列の胚芽からクロマチンを単離する。
最後に、その大麦の粒をまず手短かに砕き、その胚芽を
１ｍｍメソシュのスクリーンで選別する。液体窒素温度
で、その胚芽を、乳鉢と乳棒を使い砂を用いて均一化す
る。この均一化物をグリースバッファに入れ、さらに−
２０°Ｃで最終濃度が５０％となるようにグリセリンを
加える（Ｒ，Ｊ、グリースバッハ等、１９８２年、プラ
ント・サイエンスレター（Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、　Ｌｅ
ｔＬ、）２４巻、５５〜６０頁）。そのサスベンジクン
を、ガーゼ、ミラクロス及び６０μｍボアのナイロン布
で順次濾過する。その濾液を、１０．０００ｇで１５分
間遠心し、その沈殿物を０．１５Ｍ（ｐＨ７）の溶液で
３回洗浄する。それからそのクロマチンを、Ｏ，ｌ　５
　ＭＮａＣ７！（ｐＨ７）の存在下２．３Ｍのサッカ［
］−スを通して遠心する。クロマチン及びデンプン粒を
、２ＭＮａ（Ｊ存在下、フェノール／クロ１１ホルム／
イソアミルアルコール（５０／４８７／２）の混合物で
抽出する。デンプン及び有機層を遠心して除き、Ｉ）　
Ｎ　Ａは、水冷エタ、ノールで沈殿させる。その沈殿を
０．０１１−リス、０．００１ＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８）
に溶かした後０．３　Ｍとなるよう酢Ｍすトリウムを加
えてからイソプロパツールで再度Ｉ）　Ｎ　Ａを沈殿化
し、さらにその沈殿を、純水に溶かず。そのＤＮＡの一
部をＩ（ａｍｌｌｌで、別の一部をＩ（ｇｉｌｌで、ま
た別の一部をＸｂｏｌｌで消化する。
これら制限酵素は、ＤＮＡのメチル化には非感受的であ
り、平均長５０００ｂｐの断片を与える。環状分子を作
るため、この断片の一部をおよそ１０μｇ　／　ｔａ　
ｌ　９Ｑ度の多機能リンカ−と連結し、またその一部は
１．線状分子を作るため、およそ２μｇ／ｌ　濃度のヘ
アピン末端をもつ多機能リンカ−と連結する。両調製物
ともそれぞれ、非環状ＤＮＡ及びヘアピン構造をもたな
い線状ＤＮＡを除くため、エクソヌクレアーゼＶで精製
した。フェノール処理、沈殿化及び純水への再溶解して
、そのドナーＤＮＡの注入準備が完了する。
小麦し・セブター植物を温室で生育させる。受精が起こ
ったとき、その穂を開き、工、ベントルフ・マイクロ・
インジェクターを使い、約５００μコ、７ｍ（！Ｑ農度
のＤＮＡ；容液２０ｐ１を子房の細胞壁を通して、胚嚢
に注射する。注射後、その籾を再び閉し、処理した穂を
パーチメント・パウチで封じる。
）４−熟の種子を収穫し、２日間にわたり、何度か低温
と高温（４０°Ｃと４５℃）にさらし、種子の休止状態
をやふる。つづいて、耐性遺伝子が多機能リンカ−上に
乗っていることから、その種子を２５ｐｇ／ｍｅのクロ
ラムフェニコール存在化発芽するかどうか、テストした
。さらに、その耐性種子を季節に応じて、温度又は野外
で生育させる。
これら植物の穀物の熟成の間、その葉はトクトプテラグ
ラニウム（Ｔｏｘｏｐｔｅｒａ　ｇｒａｎｉｕｉ）に占
有されている。その集団は毎日観察され、さらにもはや
虫をよせつけない植物体は再びそれらで占有される。４
週間後、あったとしても、非常にわずかな虫しかよせつ
ＨＪない植物は耐性と考えてよい。
耐性植物の種子は穂に並んでおり、そして、その植物を
、本来の品種と異なる形態学的な性状を注意７業＜観察
した。ヘンシルアルコールの含１ｔを、Ｐ、Ｓ、ジュネ
ジャ（Ｊｕｎｅｊａ）の方法（１９７５年、プラント、
フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）　５
６を、３８５〜３８９〔Ｉ）に従って測定した。
ヘンシルアルコールの生産を増加させたＤＮＡ断片は例
■に示したものと同じ方法で同定した。
表　　　　　ｌ Ｂａｍ１ｌｌ　　　　　Ｂｇｌｌｌ ｈｌｌｌ　　　　　Ｂａｍ１ｌｌ Ｂｅｌｌ　　　　　　ＢｇＩＩｌ １（ｃ　ｌ　Ｉ　　　　　　　Ｂａｍ１ｌ　１Ｘｈｏｌ
ｌ　　　　　Ｂｇｌ［１ Ｘｈｏｌｌ　　　　Ｒａｍ旧 十／ ＋／ ＋ 十ト ド ＋１− バクテリア ＭＣ］０６１　　カサダハン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）　
Ｍ、　Ｊ、、　コーエン（Ｃｏｈｅｎ）　ＳＮ　、ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー　１３８ 巻、１７９〜２０７．１９８０年。
アップルヤード（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ）　Ｒ，ジエネテ
ィクス３９巻４２９頁、１９５４ 年。
ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ）　Ｈ，Ｗ。ローランド（Ｒｏ目
ａｎｄ）デュソイソクス（Ｄｕｓｓｏｉｘ）Ｄ。
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ イオロジー、４１巻、４５９〜４７２ 頁、１９６９年。
ヤニソシーベラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）　
Ｃ。
ヴイエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）、Ｊ、、メシング（門ｅｓ
ｓｉｎｇ）　Ｊ、、ジーン３３巻、１０３〜１１９頁、
１９８５年。
ｎ１ｏｉ ファージ ２８Ｍ５４０クローニングベクター、Ｉ’、Ｍ、ボーウ
ェルス（Ｐｏｕｗｅｌｓ）　、エルスビエルハクテリア
、ファ−ジ及びプラスミド （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）　１９８５年。
λｂ５０６ｃＩ　８５７　　　デービス（［１ａｖｉｓ
）とパーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）　１９７１年
。
λＣＴ　８５７　　サスマン（Ｓｕｓｓｍａｎ）　Ｒ，
＋ヤコフ（Ｊａｃｏｂ）Ｆ、コンブト・レンド・アカデ
ミ−・サイエンス・パリ　（Ｃｏｍｐｔ、Ｒｅｎｄ。
Δｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｐａｒｉｓ）、　　２５４　ｆｔ
、１４１７頁、１９６２年。
プラスミド ＰｉＡＮ７　　カタログニューイングランドバイオラプ
ス（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）１９８６／１９８７年。
【図面の簡単な説明】
図ＩＡは、ファージラムダベクターにおける組込みに適
した多機能リンカ−（ＭＦＬ）を示している。 図ＩＢは、ベクターを含まない、微生物における増１１
】及び選択に適した多機能リンカ−を示している。 図１Ｃは、環状化したドナーＤＮへを示している。 図ＩＤは、ヘアピン末端をもつ線状ドナーＤＮＡを示し
ている。 図ＩＥは、レセプターの複製機能及びヘアピン末端を含
む線状ドナーＤＮＡを示している。 使用した記号は、次に示す意味をもっている。 ａｔＬＢ　　：　ファージラムダの組込み部位。 Ｃｈｉ　　：交差ホットスボントインスチゲークー配列
。 ＭＳＧ　　：微生物において選択可能な遺伝子。 ｏｒｉＭ　　：微生物において必要とされる複製機能ｏ
ｒｉＲ：　レセプターにおいて必要とされる複製機能。 ｌ　　並１ａｃ　：　　大腸菌１ａｃ遺伝子のブローモ
ーター・オペレーター Ｒ５：レセプター配列と相同的配列。 は顛　：　レセプターにおいて選択可能な遺伝子。 矢印は方向を示す。 図２は、インテグレイティブ・リコンビネーションによ
り発現される場合の展開を図式的に示したものである。 この図において、釘住は大腸菌のガラクトース・オペロ
ンであり、ｂｉｏは大腸菌のビオチンオペロンである。

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）細胞の形質転換に適し、かつ少なくとも次に示す
    要素（Ａ）〜（Ｃ）を含む、多機能リンカー。 （Ａ）レセプター・ゲノムの一部に相同的なＤＮＡ配列
    、 （Ｂ）オペレータ配列、及び （Ｃ）微生物内での複製を可能とする配列又はベクター
    内でのインテグレイティブ・リコンビネーションを可能
    とする配列。
  2. （２）微生物中で発現されうる遺伝子も含むことを特徴
    とする、請求項（１）記載の多機能リンカー。
  3. （３）組換えを促進する配列も含むことを特徴とする、
    請求項（１）又は（２）記載の多機能リンカー。
  4. （４）組換えを促進する配列がＺ型のＤＮＡを含むこと
    を特徴とする、請求項（３）記載の多機能リンカー。
  5. （５）組換えを促進する配列が“交差ホットスポット・
    インスチゲーター”（￥ｃｈｉ￥）配列を含むことを特
    徴とする、請求項（３）記載の多機能リンカー。
  6. （６）レセプター内での発現を容易に示すことができる
    遺伝子も含むことを特徴とする、請求項（１）乃至（５
    ）記載の多機能リンカー。
  7. （７）一端もしくは両端にヘアピン構造も含むことを特
    徴とする、請求項（１）乃至（６）記載の多機能リンカ
    ー。
  8. （８）レセプターゲノムに相同的な配列が少なくとも１
    ００塩基対を含むことを特徴とする、請求項（１）乃至
    （７）記載の多機能リンカー。
  9. （９）オペレーター配列が大腸菌のｌａｃオペレーター
    であることを特徴とする、請求項（１）乃至（８）記載
    の多機能リンカー。
  10. （１０）微生物内での発現を示すことができる遺伝子が
    トランスポゾン５の￥ａｐｈ￥３′II遺伝子、トランス
    ポゾン１の￥ａｍｐ￥遺伝子又は、バチルス・プチダ（
    Ｂａｃｉｌｕｓ　ｐｕｔｉｄａ）のｘｙｌＥ遺伝子であ
    ることを特徴とする、請求項（１）乃至（９）記載の多
    機能リンカー。
  11. （１１）連続的に、 （ａ）ドナーから、高分子量のＤＮＡを単離すること、 （ｂ）上記ＤＮＡを、エンドヌクレアーゼにより、その
    制御要素を含む、少なくとも１つの完全な遺伝子を含む
    断片に分解すること、 （ｃ）請求項（１）乃至（６）及び（８）乃至（１０）
    記載の多機能リンカーを組込むと同時に、生成した断片
    を環状化すること、もしくは、 （ｄ）請求項（１）乃至（１０）記載の、場合によって
    は、末端にヘアピン構造をもつ、多機能リンカー末端を
    、その生成した断片に提供すること、 （ｅ）その多機能リンカーに結合した、ドナーＤＮＡ断
    片を、直接形質転換法により、レセプターに伝達させる
    こと、 （ｆ）伝達した情報に基づいて、レセプターをスクリー
    ニングすること、 を特徴とする、細胞の形質転換法。
  12. （１２）（ａ）全てのレセプター、もしくは、選択され
    たレセプターから、高分子量のＤＮＡを単離すること、 （ｂ）上記ＤＮＡを、エンドヌクレアーゼにより、伝達
    された遺伝情報の順序もしくは量を有する長さの断片に
    分解すること、 （ｃ）その断片混合物から、対応するリプレッサータン
    パク質の結合力を用いて、多機能リンカー上に存在する
    オペレーター配列を含む断片を単離すること、 （ｄ）単離した断片を環状化すること、 （ｅ）微生物中で、その環状化断片を増巾すること、又
    は、微生物中、その断片を組込んだベクターにより、そ
    れらを増巾することにより、レセプターに伝達された配
    列の限定されたジーンバンクを得ること、 （ｆ）再び、レセプターに直接形質転換により、別の配
    列を伝達すること、及び、その配列を、レセプター中で
    のその発現と相関させることができるように、伝達され
    た遺伝情報に基づいてその形質転換体を選択すること、 を特徴とする、請求項（１１）記載の方法。
JP63154535A 1987-06-22 1988-06-22 細胞の形質転換法 Pending JPH02461A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8701450A NL8701450A (nl) 1987-06-22 1987-06-22 Werkwijze voor het transformeren van cellen.
NL87.01450 1987-06-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH02461A true JPH02461A (ja) 1990-01-05

Family

ID=19850181

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63154535A Pending JPH02461A (ja) 1987-06-22 1988-06-22 細胞の形質転換法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US5364779A (ja)
EP (1) EP0299552B1 (ja)
JP (1) JPH02461A (ja)
AT (1) ATE104346T1 (ja)
DE (1) DE3889021T2 (ja)
DK (1) DK338788A (ja)
NL (1) NL8701450A (ja)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0317509A3 (de) * 1987-11-16 1990-01-31 Ciba-Geigy Ag Gezielter Einbau von Genen ins pflanzliche Genom
CA1341467C (en) * 1988-07-29 2004-12-07 John C. Rogers Producing commercially valuable polypeptides with genetically transformed endosperm tissue
WO1990001551A1 (en) * 1988-07-29 1990-02-22 Washington University School Of Medicine Producing commercially valuable polypeptides with genetically transformed endosperm tissue
NL8901931A (nl) * 1989-07-26 1991-02-18 Mogen International N V En Rij Werkwijze voor het plaatsgericht introduceren van vreemd dna in het genoom van planten.
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6803499B1 (en) 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
JPH05501352A (ja) * 1989-08-09 1993-03-18 ディカルブ　ジェネティクス　コーポレイション 安定な形質転換稔性単子葉植物およびそれらの細胞を製造するための方法および組成物
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6946587B1 (en) 1990-01-22 2005-09-20 Dekalb Genetics Corporation Method for preparing fertile transgenic corn plants
JP3209744B2 (ja) * 1990-01-22 2001-09-17 デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション 結実能力のある遺伝子変換コーン
US6777589B1 (en) * 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6329574B1 (en) 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
US5484956A (en) * 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
FR2665711B1 (fr) * 1990-08-08 1993-08-13 Centre Nat Rech Scient Integron de corynebacterie, procede de transformation d'une corynebacterie par ledit integron et corynebacterie obtenue.
US6395966B1 (en) 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
AU4539593A (en) * 1992-06-23 1994-01-24 South Dakota State University Transformation of plants by direct injection of dna
US6118047A (en) * 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US5780709A (en) * 1993-08-25 1998-07-14 Dekalb Genetics Corporation Transgenic maize with increased mannitol content
US6326527B1 (en) 1993-08-25 2001-12-04 Dekalb Genetics Corporation Method for altering the nutritional content of plant seed
US5470727A (en) * 1993-12-21 1995-11-28 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Chromosomal expression of non-bacterial genes in bacterial cells
US7045679B1 (en) * 1998-08-26 2006-05-16 Stine Biotechnology, Inc. Transgenic plants
GB9921937D0 (en) * 1999-09-17 1999-11-17 Univ Leeds Targeted gens removal
WO2002008368A1 (en) * 2000-07-21 2002-01-31 Cargill, Incorporated Method for removing contaminants from vegetable oil and lecithin
EP1564289A1 (en) * 2004-02-10 2005-08-17 Roche Diagnostics GmbH Stabilization of linear double-stranded DNA in the presence of exonucleases

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4506013A (en) * 1980-10-03 1985-03-19 Eli Lilly And Company Stabilizing and selecting recombinant DNA host cells
WO1983001176A1 (en) * 1981-10-01 1983-04-14 Int Plant Research Inst Process for the genetic modification of cereals with transformation vectors
US4650761A (en) * 1981-11-27 1987-03-17 Eli Lilly And Company Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cell
IL69382A (en) * 1982-08-05 1991-01-31 Carter William Alvin Method of protecting plants against viral pathogens by inserting into plant cells genes encoding polypeptides containing interferon domains
IL75210A0 (en) * 1984-05-22 1985-09-29 Bioteknika International Yeast vector

Also Published As

Publication number Publication date
EP0299552A1 (en) 1989-01-18
US5364779A (en) 1994-11-15
EP0299552B1 (en) 1994-04-13
ATE104346T1 (de) 1994-04-15
DK338788A (da) 1989-02-08
NL8701450A (nl) 1989-01-16
DK338788D0 (da) 1988-06-21
DE3889021D1 (de) 1994-05-19
DE3889021T2 (de) 1994-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH02461A (ja) 細胞の形質転換法
EP0938569B1 (de) Blattspezifische expression von genen in transgenen pflanzen
JP3038479B2 (ja) 植物のプロトプラストの形質転換法
US6911541B2 (en) Promoter fragment that is recognized by the product of the tobacco Nic gene
DK175510B1 (da) Fremgangsmåde til transformation af plantearveanlæg
JPS61502725A (ja) 外来性ｄｎａを含む全植物の生産方法
JPH0775567A (ja) ヒートショックプロモーターを用いる遺伝子発現方法およびその使用
EP0513054B1 (de) Virus/herbizidresistenz-gene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
CN116926088B (zh) 大丽轮枝菌VdNRPS6基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用
JPH06500237A (ja) β―１，３―グルカナーゼ活性を有する新規蛋白質をコードする組換えＤＮＡ、このＤＮＡを含む細菌、形質転換植物細胞および植物
DE69433238T2 (de) Pflanzenpromoter, microorganismen und pflanzenzellen mit einer expressionseinheit für ein gewünschtes protein, das besagten promoter enthält
EP0754757B1 (en) A plant promoter and an application thereof
JP4741994B2 (ja) 蛍光タンパク質の園芸植物への応用
Barthel et al. One-shot generation of duodecuple (12x) mutant Arabidopsis: Highly efficient routine editing in model species
EP0789773A1 (de) Verfahren zur veränderung des blühverhaltens bei pflanzen
Gendel et al. A novel shuttle cloning vector for the cyanobacterium Anacystis nidulans
DE102023134327A1 (de) Vermehrung von Plasmiden, die mindestens einen Inverted Repeat enthalten
Xu et al. Cloning and functional analysis of the promoter of the sesquiterpene synthase gene ASS1 in Aquilaria sinensis
CA2299615A1 (en) Expression of antimicrobial peptide genes in plants, and their use in creating resistance to multiple plant pathogens
CN101864440A (zh) 根特异启动子与抗病基因chi培育抗青枯病烟草的方法
DE69927645T2 (de) In einer Pflanzenzelle funktioneller Promotor
CN107513532B (zh) 一个梨组成型表达启动子PbTMT4P及其应用
KR101120503B1 (ko) 도관 특이적 발현 유도용 카로티노이드 절단효소 7 프로모터 및 이를 포함하는 발현벡터
WO1998012321A1 (en) Recombinant plant cells expressing heterochromatin 1 (hp1) of drosophila melanogaster
CN116769789A (zh) 一种促进种子发育的青蒿AaSER1基因及其编码的蛋白与应用