JPH0775567A - ヒートショックプロモーターを用いる遺伝子発現方法およびその使用 - Google Patents
ヒートショックプロモーターを用いる遺伝子発現方法およびその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒートショックプロモーターを用いる遺伝子
発現方法およびその使用を提供する。 【構成】 ダイズヒートショック遺伝子プロモーター断
片の制御下で構造遺伝子を発現させる方法であって、
(a)〜(h)の工程を包含する方法。
発現方法およびその使用を提供する。 【構成】 ダイズヒートショック遺伝子プロモーター断
片の制御下で構造遺伝子を発現させる方法であって、
(a)〜(h)の工程を包含する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒートショックプロモ
ーターを用いる遺伝子発現方法およびその使用に関す
る。
ーターを用いる遺伝子発現方法およびその使用に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ヒートショック遺伝子もしくはストレス
遺伝子として知られる類の遺伝子は、細菌からヒトにい
たる全ての生物に存在する。これらの遺伝子の転写は、
ストレス処理（例えば、ヒートショック）に伴って開始
し、そして該転写物の翻訳により蛋白質が生産され、該
蛋白質はおそらく細胞を一時的に保護する。ストレス下
では、正常なポリリボソームは速やかにこわれてモノリ
ボソームとなり、これらはその後ヒートショックｍＲＮ
Ａを翻訳するために利用される。ストレス処理する前に
存在していた正常なｍＲＮＡは、ストレス処理中は何ら
かの方法で保護され、そしてストレス終了に伴ってそれ
らは翻訳に再利用される。ヒートショックｍＲＮＡおよ
び蛋白質の生産は、単に一時的な現象にすぎず、またヒ
ートショック遺伝子の発現は、数時間後には平衡状態に
達し、そしてその後は下降する。もし温度を急激にでは
なくむしろ徐々に上げたならば、生物はその温度が致死
的であるにもかかわらず耐えることができ、すなわち生
物はより高い温度に適応できる。
遺伝子として知られる類の遺伝子は、細菌からヒトにい
たる全ての生物に存在する。これらの遺伝子の転写は、
ストレス処理（例えば、ヒートショック）に伴って開始
し、そして該転写物の翻訳により蛋白質が生産され、該
蛋白質はおそらく細胞を一時的に保護する。ストレス下
では、正常なポリリボソームは速やかにこわれてモノリ
ボソームとなり、これらはその後ヒートショックｍＲＮ
Ａを翻訳するために利用される。ストレス処理する前に
存在していた正常なｍＲＮＡは、ストレス処理中は何ら
かの方法で保護され、そしてストレス終了に伴ってそれ
らは翻訳に再利用される。ヒートショックｍＲＮＡおよ
び蛋白質の生産は、単に一時的な現象にすぎず、またヒ
ートショック遺伝子の発現は、数時間後には平衡状態に
達し、そしてその後は下降する。もし温度を急激にでは
なくむしろ徐々に上げたならば、生物はその温度が致死
的であるにもかかわらず耐えることができ、すなわち生
物はより高い温度に適応できる。
【０００３】20年以上も前に、ドロソフィラ・バスキー
（Drosophila busckii）の多糸染色体において、特異な
パフ形成パターンが短時間の熱処理によって誘導され得
ることが発見された（リトッサ、エフ（1962) エクスペ
リエンティア 18 : 571-573（Ritossa, F.(1962) Exper
ientia 18 : 571-573））。ドロソフィラ（Drosophil
a）種の多糸染色体におけるこのパフ形成部位は、ｍＲ
ＮＡが活発に合成されている場所であり、したがって活
性遺伝子座位であることを示している（ビアマン、ダブ
リュ.（1956）コールド スプリング ハーバー エス
ワイエムピー．キューユーエーエヌティー．ビーアイオ
ーエル．21 : 217-232（Beerman, W. (1956)Cold Sprin
g Harbor Symp. Quant. Biol. 21 : 217-232)）。その
後、様々な因子が、例えば亜砒酸塩もしくは嫌気的条件
が、熱により誘導されるのと似た反応を引き起こし得る
ことが示されてきたため、これらの遺伝子に対するより
適切な名称は「ストレス遺伝子」であるべきだと提唱さ
れた。しかしながら、「ヒートショック」遺伝子という
命名法は今や明らかに確立し以後この命名法を採用す
る。
（Drosophila busckii）の多糸染色体において、特異な
パフ形成パターンが短時間の熱処理によって誘導され得
ることが発見された（リトッサ、エフ（1962) エクスペ
リエンティア 18 : 571-573（Ritossa, F.(1962) Exper
ientia 18 : 571-573））。ドロソフィラ（Drosophil
a）種の多糸染色体におけるこのパフ形成部位は、ｍＲ
ＮＡが活発に合成されている場所であり、したがって活
性遺伝子座位であることを示している（ビアマン、ダブ
リュ.（1956）コールド スプリング ハーバー エス
ワイエムピー．キューユーエーエヌティー．ビーアイオ
ーエル．21 : 217-232（Beerman, W. (1956)Cold Sprin
g Harbor Symp. Quant. Biol. 21 : 217-232)）。その
後、様々な因子が、例えば亜砒酸塩もしくは嫌気的条件
が、熱により誘導されるのと似た反応を引き起こし得る
ことが示されてきたため、これらの遺伝子に対するより
適切な名称は「ストレス遺伝子」であるべきだと提唱さ
れた。しかしながら、「ヒートショック」遺伝子という
命名法は今や明らかに確立し以後この命名法を採用す
る。
【０００４】1950年代の初期以来ディプテラン・ラーバ
ー(Diptcran larvae)の多糸染色体におけるパフのパタ
ーンが発生中に規則性をもって変化することが知られ、
また、これらの変化がエクジステロイドホルモンにより
コントロールされていることが示された（クレバー、ユ
ー．およびピー．カールソン（1960）イーエクスピー．
シーイーエルエル．アールイーエス．20 : 623-626；ベ
ッカー、エイチ．ジェイ．（1962）クロモソマ 13 : 34
1-384 （Clever, U.および P.Karlson (1960)Exp. Cel
l.Res. 20 : 623-626;Becker, H. J. (1962) Chromosom
a 13 : 341-384)）。特に、このパフ形成のパターンが
短時間の熱処理（もしくはある化学薬品を用いた処理）
によって破壊され、そしてその結果として３つの新しい
パフの出現することが示された。これらの新しいパフの
誘導は非常に速やかでありヒートショック処理後数分内
に起こるが、その誘導は一時的なものであった。例え
ば、温度を25℃から37℃に上げたとき、30分以内でパフ
の大きさは最大となりそれからもとに戻った。同時に、
ヒートショック前に活性化していた全てのパフが処理後
もとに戻った。このヒートショックに対するパフ形成反
応は、研究された全ての組織においてそして発生の全て
の段階で起こることもまた見出された。
ー(Diptcran larvae)の多糸染色体におけるパフのパタ
ーンが発生中に規則性をもって変化することが知られ、
また、これらの変化がエクジステロイドホルモンにより
コントロールされていることが示された（クレバー、ユ
ー．およびピー．カールソン（1960）イーエクスピー．
シーイーエルエル．アールイーエス．20 : 623-626；ベ
ッカー、エイチ．ジェイ．（1962）クロモソマ 13 : 34
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短時間の熱処理（もしくはある化学薬品を用いた処理）
によって破壊され、そしてその結果として３つの新しい
パフの出現することが示された。これらの新しいパフの
誘導は非常に速やかでありヒートショック処理後数分内
に起こるが、その誘導は一時的なものであった。例え
ば、温度を25℃から37℃に上げたとき、30分以内でパフ
の大きさは最大となりそれからもとに戻った。同時に、
ヒートショック前に活性化していた全てのパフが処理後
もとに戻った。このヒートショックに対するパフ形成反
応は、研究された全ての組織においてそして発生の全て
の段階で起こることもまた見出された。
【０００５】その後ヒートショック処理は少量のポリペ
プチドの合成を誘導しそして他のほとんどのものの合成
は抑制することがわかり（ティッシーレ、エー．等（19
74）ジェイ．エムオーエル．ビーアイオーエル．84 : 3
89-398（Tissieres, A.等（1974) J. Mol. Biol. 84 :
389-398) ）また新しいヒートショックにより誘導され
たパフで生産されたｍＲＮＡは新しく誘導されたポリペ
プチドをコードすることが示された（ルイス、エム．ジ
ェイ．等（1975）ピーアールオーシー．エヌエーティ
ー．エーシーエーディー．エスシーアイ．ユーエスエー
72 : 3604-3608（Lewis, M. J.等（1975) Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 72 : 3604-3608）。
プチドの合成を誘導しそして他のほとんどのものの合成
は抑制することがわかり（ティッシーレ、エー．等（19
74）ジェイ．エムオーエル．ビーアイオーエル．84 : 3
89-398（Tissieres, A.等（1974) J. Mol. Biol. 84 :
389-398) ）また新しいヒートショックにより誘導され
たパフで生産されたｍＲＮＡは新しく誘導されたポリペ
プチドをコードすることが示された（ルイス、エム．ジ
ェイ．等（1975）ピーアールオーシー．エヌエーティ
ー．エーシーエーディー．エスシーアイ．ユーエスエー
72 : 3604-3608（Lewis, M. J.等（1975) Proc. Nat.
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【０００６】ヒートショック後数分以内で、全てのポリ
リボソームは分解して速やかに新しいポリリボソームピ
ークに置き換わる。この新しいポリリボソームはヒート
ショック蛋白ｍＲＮＡを含む。このｍＲＮＡはヒートシ
ョックにより誘導されたパフに戻ってハイブリダイズさ
れそしてインビトロでヒートショック蛋白質に翻訳され
た（マッケンジー、エス．等（1977）ジェイ．エムオー
エル．ビーアイオーエル．117 : 279-283 ; ミラウル、
エム．イー．等（1978）コールド スプリングエイチエ
ーアールビー．エスワイエムピー．キューユーエーエヌ
ティー．ビーアイオーエル．42 : 819- 827 （McKenzi
e, S.等（1977）J. Mol. Biol. 117 :279-283 ; Miraul
t, M. E.等（1978) ColdSpring Harb. Symp. Quant. Bi
ol. 42: 819-827) ）。
リボソームは分解して速やかに新しいポリリボソームピ
ークに置き換わる。この新しいポリリボソームはヒート
ショック蛋白ｍＲＮＡを含む。このｍＲＮＡはヒートシ
ョックにより誘導されたパフに戻ってハイブリダイズさ
れそしてインビトロでヒートショック蛋白質に翻訳され
た（マッケンジー、エス．等（1977）ジェイ．エムオー
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エム．イー．等（1978）コールド スプリングエイチエ
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e, S.等（1977）J. Mol. Biol. 117 :279-283 ; Miraul
t, M. E.等（1978) ColdSpring Harb. Symp. Quant. Bi
ol. 42: 819-827) ）。
【０００７】全てのポリリボソームが分解してそして新
しく誘導されたhs-ｍＲＮＡが選択的に翻訳されるにも
かかわらず、正常なｍＲＮＡのほとんどがヒートショッ
ク中にも残存することに注目すると興味深い（アシュバ
ーナー、エヌ．およびジェイ．エフ．ボーナー（1979）
セル 17 : 241ff（Ashburner,N.および J. F. Bonner(1
979) Cell 17 : 241ff））。
しく誘導されたhs-ｍＲＮＡが選択的に翻訳されるにも
かかわらず、正常なｍＲＮＡのほとんどがヒートショッ
ク中にも残存することに注目すると興味深い（アシュバ
ーナー、エヌ．およびジェイ．エフ．ボーナー（1979）
セル 17 : 241ff（Ashburner,N.および J. F. Bonner(1
979) Cell 17 : 241ff））。
【０００８】ヒートショック遺伝子に関する初期の研究
の大部分はドロソフィラ（Drosophila）種を用いて行わ
れた。しかし、1978年に、同様のストレス反応がニワト
リの胚繊維芽細胞（ケリィ、ピー．およびエム．ジェ
イ．シュレジンガー（1978）セル 15 : 1277-1286（Ke
lly, P. および M. J. Schlesinger (1978) Cell 15 :1
277-1286））、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（Bo
uche、G.等（1979）Nucleic Acids Research 7 : 1739-
1747）、大腸菌（Lemeaux, P. G.等（1978）Cell 13 :
427-434）、酵母（Miller,M.J.等（1979) Proc. Nat. A
cad. Sci. USA 76 : 5222-5225）、ナエグレリア（Wals
h, C. (1980) J. Biol. Chem. 225 : 2629-2632)、テト
ラヒメナ（Fink, K.および E. Zeutheu (1978) ICN-UCL
A Symp. Mol. Cell.Biol. 12 : 103-115）そして他の多
くの種においても発見された。この中には植物も（Barn
ett, T. 等（1980）Dev. Genet. 1 : 331-340)含まれて
いる。同じようなパターンのヒートショック蛋白合成は
液体培地で生育するタバコおよびダイズ細胞についても
報告され（Barnett, T. 等（1980) supra)ダイズ苗の組
織でも報告されている。脊椎動物の細胞に対する創傷の
影響がヒートショックの効果と類似していることもまた
示された（Hightower, L. E,および F. P. White(1981)
J.Cell. Physiol 108 : 261)。
の大部分はドロソフィラ（Drosophila）種を用いて行わ
れた。しかし、1978年に、同様のストレス反応がニワト
リの胚繊維芽細胞（ケリィ、ピー．およびエム．ジェ
イ．シュレジンガー（1978）セル 15 : 1277-1286（Ke
lly, P. および M. J. Schlesinger (1978) Cell 15 :1
277-1286））、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（Bo
uche、G.等（1979）Nucleic Acids Research 7 : 1739-
1747）、大腸菌（Lemeaux, P. G.等（1978）Cell 13 :
427-434）、酵母（Miller,M.J.等（1979) Proc. Nat. A
cad. Sci. USA 76 : 5222-5225）、ナエグレリア（Wals
h, C. (1980) J. Biol. Chem. 225 : 2629-2632)、テト
ラヒメナ（Fink, K.および E. Zeutheu (1978) ICN-UCL
A Symp. Mol. Cell.Biol. 12 : 103-115）そして他の多
くの種においても発見された。この中には植物も（Barn
ett, T. 等（1980）Dev. Genet. 1 : 331-340)含まれて
いる。同じようなパターンのヒートショック蛋白合成は
液体培地で生育するタバコおよびダイズ細胞についても
報告され（Barnett, T. 等（1980) supra)ダイズ苗の組
織でも報告されている。脊椎動物の細胞に対する創傷の
影響がヒートショックの効果と類似していることもまた
示された（Hightower, L. E,および F. P. White(1981)
J.Cell. Physiol 108 : 261)。
【０００９】ヒートショック遺伝子の転写時および翻訳
時の制御は自己調節であるらしい。このようにこれらの
遺伝子の活性は細胞中に存在するヒートショック蛋白質
の濃度によって制御されるらしい。したがって、ヒート
ショック遺伝子の誘導物質はヒートショック蛋白質を壊
すかまたはそれらを細胞内で効果的に利用できない状態
にする因子、例えば、様々な細胞小器官に結合させて利
用できなくするような因子であろう。
時の制御は自己調節であるらしい。このようにこれらの
遺伝子の活性は細胞中に存在するヒートショック蛋白質
の濃度によって制御されるらしい。したがって、ヒート
ショック遺伝子の誘導物質はヒートショック蛋白質を壊
すかまたはそれらを細胞内で効果的に利用できない状態
にする因子、例えば、様々な細胞小器官に結合させて利
用できなくするような因子であろう。
【００１０】ドロソフィラ（Drosophila）でのヒートシ
ョック遺伝子の活性化およびそれに続く抑制の研究はク
ローン化した小断片をドロソフィラ（Drosophila）細胞
中に導入することにより行われてきた。Ｐ成分を媒体と
した形質転換系が使われ、これによるとクローン化した
ドロソフィラ（Drosophila）遺伝子をドロソフィラ（Dr
osophila）胚細胞（germline）に導入することができた
（Rubin, G. M.およびA.C. Spradling (1982) Science
218 : 348-353)。このようにして構築された遺伝子は安
定した単体コピーとして存在することがよくあり、そし
て染色体の様々な位置でかなり一定した活性を有する
（Scholnick, S. B.等（1983) Cell 34 :37-45 ; Goldb
erg, D.等（1983) Cell 34 : 59-73 ; Spradling, A.
C.および G. M. Rubin (1983) Cell 34 : 47-57)。特に
ドロソフィラ hsp70遺伝子が E.coli β−ガラクトシダ
ーゼ構造遺伝子に融合され、このようにして雑種遺伝子
の活性を感受性ドロソフィラ（Drosophila）における５
つの内在性hsp70ヒートショック遺伝子から区別できる
ようになった。ドロソフィラヒートショック遺伝子はま
た様々な異種系にも導入されそしてそこでの活性が研究
されてきた、そして、特に、サルのＣＯＳ細胞（Pelha
m, H. R. B. (1982) Cell 30 : 517-528 ; Mirault, M.
E. 等（1982) EMBOJ. 1 : 1279-1285）およびマウスの
細胞（Corces, V.等（1981) Proc. Nat. Acad. Sci. 78
: 7038-7042）に導入された。
ョック遺伝子の活性化およびそれに続く抑制の研究はク
ローン化した小断片をドロソフィラ（Drosophila）細胞
中に導入することにより行われてきた。Ｐ成分を媒体と
した形質転換系が使われ、これによるとクローン化した
ドロソフィラ（Drosophila）遺伝子をドロソフィラ（Dr
osophila）胚細胞（germline）に導入することができた
（Rubin, G. M.およびA.C. Spradling (1982) Science
218 : 348-353)。このようにして構築された遺伝子は安
定した単体コピーとして存在することがよくあり、そし
て染色体の様々な位置でかなり一定した活性を有する
（Scholnick, S. B.等（1983) Cell 34 :37-45 ; Goldb
erg, D.等（1983) Cell 34 : 59-73 ; Spradling, A.
C.および G. M. Rubin (1983) Cell 34 : 47-57)。特に
ドロソフィラ hsp70遺伝子が E.coli β−ガラクトシダ
ーゼ構造遺伝子に融合され、このようにして雑種遺伝子
の活性を感受性ドロソフィラ（Drosophila）における５
つの内在性hsp70ヒートショック遺伝子から区別できる
ようになった。ドロソフィラヒートショック遺伝子はま
た様々な異種系にも導入されそしてそこでの活性が研究
されてきた、そして、特に、サルのＣＯＳ細胞（Pelha
m, H. R. B. (1982) Cell 30 : 517-528 ; Mirault, M.
E. 等（1982) EMBOJ. 1 : 1279-1285）およびマウスの
細胞（Corces, V.等（1981) Proc. Nat. Acad. Sci. 78
: 7038-7042）に導入された。
【００１１】この雑種hsp70-lacZ遺伝子はドロソフィラ
（Drosophila）胚細胞（germ line)中に組み込まれると
正常なヒートショック制御下にあるらしい（Lis. J. T.
等（1983) Cell 35 : 403-410)。組み込まれた３つの異
なる部位はヒートショックに反応して大きなパフを形成
した。パフ形成および退縮の動力学は87Ｃ遺伝子座位の
動力学と全く同じであり、この部位からhsp70遺伝子の
組み込みコピーが単離された。7000塩基対のエセリシア
・コリ（E. coli)β−ガラクトシダーゼＤＮＡ断片をhs
p70構造遺伝子の真中に挿入してもパフ形成反応に対す
る反作用は生じなかったようであった。形質転換体中の
β−ガラクトシダーゼ活性はヒートショックにより調節
された。
（Drosophila）胚細胞（germ line)中に組み込まれると
正常なヒートショック制御下にあるらしい（Lis. J. T.
等（1983) Cell 35 : 403-410)。組み込まれた３つの異
なる部位はヒートショックに反応して大きなパフを形成
した。パフ形成および退縮の動力学は87Ｃ遺伝子座位の
動力学と全く同じであり、この部位からhsp70遺伝子の
組み込みコピーが単離された。7000塩基対のエセリシア
・コリ（E. coli)β−ガラクトシダーゼＤＮＡ断片をhs
p70構造遺伝子の真中に挿入してもパフ形成反応に対す
る反作用は生じなかったようであった。形質転換体中の
β−ガラクトシダーゼ活性はヒートショックにより調節
された。
【００１２】ドロソフィラ hsp70ヒートショックプロモ
ーターの欠失分析によりＴＡＴＡボックスの上流の配列
が同定された。この配列は、ヒートショック誘導に必要
である。この配列は他のヒートショック遺伝子における
ものと相同もしくは類似した配列を含みそして共通配列
CTxGAAxxTTCxAG が構築されていた（Pelham, H. R.B.
および M. Bienz(1982) EMBO J. 1 : 1473-1477)。この
共通配列の塩基配列を基本とする合成オリゴヌクレオチ
ドを構築し、そしてヘルペスウィルスチミジンキナーゼ
遺伝子（tk）のＴＡＴＡボックスの上流に（正常な上流
プロモーター成分の代わりに）配置すると、その結果生
じた組み換え遺伝子はサルのＣＯＳ細胞およびゼノパス
の卵母細胞のいずれにおいてもヒート誘導性であった。
このtk自身はヒート誘導性ではなく、そしておそらくい
かなる進化上の圧迫もtKをヒート誘導性にするようには
かからなかったのであろう。しかし以上の事実からtkが
ヒートショックにより簡単に、すなわち正常な上流プロ
モーター成分に代わってヒートショック遺伝子プロモー
ターと相同な配列を有する短い合成配列を配置すること
によって、誘導し得ることが示唆される。
ーターの欠失分析によりＴＡＴＡボックスの上流の配列
が同定された。この配列は、ヒートショック誘導に必要
である。この配列は他のヒートショック遺伝子における
ものと相同もしくは類似した配列を含みそして共通配列
CTxGAAxxTTCxAG が構築されていた（Pelham, H. R.B.
および M. Bienz(1982) EMBO J. 1 : 1473-1477)。この
共通配列の塩基配列を基本とする合成オリゴヌクレオチ
ドを構築し、そしてヘルペスウィルスチミジンキナーゼ
遺伝子（tk）のＴＡＴＡボックスの上流に（正常な上流
プロモーター成分の代わりに）配置すると、その結果生
じた組み換え遺伝子はサルのＣＯＳ細胞およびゼノパス
の卵母細胞のいずれにおいてもヒート誘導性であった。
このtk自身はヒート誘導性ではなく、そしておそらくい
かなる進化上の圧迫もtKをヒート誘導性にするようには
かからなかったのであろう。しかし以上の事実からtkが
ヒートショックにより簡単に、すなわち正常な上流プロ
モーター成分に代わってヒートショック遺伝子プロモー
ターと相同な配列を有する短い合成配列を配置すること
によって、誘導し得ることが示唆される。
【００１３】ＴＡＴＡボックスの上流の逆反復配列はヒ
ートショックプロモーターの多くに普通に見られる特色
であり研究されてきた（Holmgren, R.等（1981) Proc.
Nat.Acad. Sci. USA 78 : 3775-3778）。７個のドロソ
フィラプロモーターのうち５個において、この逆反復配
列は同一配列の後ろから２番目のＡ残基の５’側に集中
しているが、逆反復自身の配列は保護されていない（Pe
lham, H. R. B.(1982)Cell 30 : 517-528）。しかしな
がら、いくつかの場合では、この逆反復配列がＴＡＴＡ
ボックスの上流に出現しそして共通配列は存在しない。
これらの場合ではヒート誘導可能性はなくしたがって逆
反復が存在しても共通配列の代用とはならない。
ートショックプロモーターの多くに普通に見られる特色
であり研究されてきた（Holmgren, R.等（1981) Proc.
Nat.Acad. Sci. USA 78 : 3775-3778）。７個のドロソ
フィラプロモーターのうち５個において、この逆反復配
列は同一配列の後ろから２番目のＡ残基の５’側に集中
しているが、逆反復自身の配列は保護されていない（Pe
lham, H. R. B.(1982)Cell 30 : 517-528）。しかしな
がら、いくつかの場合では、この逆反復配列がＴＡＴＡ
ボックスの上流に出現しそして共通配列は存在しない。
これらの場合ではヒート誘導可能性はなくしたがって逆
反復が存在しても共通配列の代用とはならない。
【００１４】ヒートショック反応の機能上の意義は知ら
れていない。おそらくそれらは細胞を外界のストレスか
ら保護しそしてストレス状態が終わった後も細胞がその
機能を維持し得るように作用するのであろう。これらの
結論は「獲得された温度耐性」として知られる現象によ
り支持されている。単発ヒートショック、またはいくつ
かの他のストレスにさらされた細胞は、２回目のヒート
ショックの影響に対し、それが致死的なヒートショック
であるにもかかわらず、かなり抵抗性を示す（Li. G.
C. および G. M. Hahn (1978) Nature 274 : 699-701;H
enle, K. J.および L. A. Dethlefsen (1978) Cancer R
es. 38 : 1843-1851 ; Mitchell, H. K.等（1979) Dev.
Genet. 1 : 181-192 ; McAlister,L.および D. B. Fin
kelstein(1980) Biochem.Biophys. Res. Commun. 93 :
819-824）。
れていない。おそらくそれらは細胞を外界のストレスか
ら保護しそしてストレス状態が終わった後も細胞がその
機能を維持し得るように作用するのであろう。これらの
結論は「獲得された温度耐性」として知られる現象によ
り支持されている。単発ヒートショック、またはいくつ
かの他のストレスにさらされた細胞は、２回目のヒート
ショックの影響に対し、それが致死的なヒートショック
であるにもかかわらず、かなり抵抗性を示す（Li. G.
C. および G. M. Hahn (1978) Nature 274 : 699-701;H
enle, K. J.および L. A. Dethlefsen (1978) Cancer R
es. 38 : 1843-1851 ; Mitchell, H. K.等（1979) Dev.
Genet. 1 : 181-192 ; McAlister,L.および D. B. Fin
kelstein(1980) Biochem.Biophys. Res. Commun. 93 :
819-824）。
【００１５】より高等な植物では、ヒートショック（h
s）現象はまず最初にダイズにおける蛋白質合成の段階
で発見された（Key, J. L.等（1981) Proc. Nat.Acad.
Sci. USA 78 : 3526-3530 ; Barnett, T. 等（1980) su
pra)。いくつかの他の植物、例えば、エンドウ豆、キ
ビ、トウモロコシ、ヒマワリ、綿花そして小麦はダイズ
に対し同様に反応し、このダイズにおいてはヒートショ
ック処理により分子量が大体同じである莫大な数の新し
い蛋白質が誘導されている。種間に生じる主な相違とし
ては次のようなものがある。hs蛋白質を誘導する最適温
度、ブレイクポイント温度（すなわち、この温度以上は
致死的であるという温度）、15-20kD のヒートショック
蛋白質の二次元ゲル上の分布、そしてヒートショック中
に生ずる正常な蛋白質合成の相対的な段階。温度を28℃
から40℃に上げるといくつかのhs蛋白質（hsp)メージャ
ー集団が新たに誘導デノボ合成され、この hspの分子量
はドロソフィラ（Drosophila）で発見されたものと類似
していることが示された。しかし、これら２つの生物間
にはhsp の低分子量（１mw）集団の複雑性という点で明
らかな違いがある。ドロソフィラ（Drosophila）は22,
23, 26そして27キロダルトンの４hsp を合成し、ダイズ
は分子量が15〜18キロダルトンの範囲にわたる20以上の
hspを合成する。翻訳時のhs-ｍＲＮＡに対する優先性
は、明らかではあるが、ダイズにおいては（Key, J. L.
等（1981) supra)ドロソフィラ（Drosophila）における
よりも（Storti, R. V. 等（1980) Cell 22:825-834)そ
れほど顕著ではないらしい。ダイズでhsに特異的なｍＲ
ＮＡの新しいセットが誘導されることはpoly(A)+ ＲＮ
Ａのインビトロ翻訳により支持された。ヒート処理され
た植物体中に新奇のＲＮＡが存在することの証拠はさら
に蔗糖密度勾配分析により出され、この分析によりタバ
コおよびササゲの葉のヒート処理中に0.49×106ダルト
ンのＲＮＡが蓄積することが示された（Dawson, W. O.
および G. L. Grantham(1981) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 100 : 23-30）。ドロソフィラ（Drosophila）
では、hs蛋白質合成の転写時の制御が明らかになってい
るが、これらの遺伝子が同調発現するための信号構造を
見つけるための試みがなされた（Holmgren, R.等（198
1) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78 : 3775-3778）。ダ
イズの poly(A)+ ｍＲＮＡに対するhsの影響はｃＤＮＡ
／ poly(A)+ ＲＮＡハイブリダイゼーション分析および
クローン化ｃＤＮＡ／ナザン法（ナザンブロットハイブ
リダイゼーション）分析を用いて評価された（Schoffl,
F. および J. L. Key (1982) J. Mol. Appl. Genet.
1: 301-314）。ダイズでのこのhs反応は以下の２つによ
って特徴づけられる。１つは新しく非常に豊富な種類の
poly(A)+ ＲＮＡが出現することでこれらは平均の長さ
が800〜900ヌクレオチドの約20種の異なる塩基配列から
成る。そしてもう１つは28℃塩基配列の相対的な豊富性
の変化に伴って全体的にpoly(A)+ ＲＮＡの複雑性が減
少することである。この新しい豊富なクラスのpoly(A)+
ＲＮＡは40℃のヒートショック２時間後に細胞あたり
約15,000〜20,000コピー存在する。これら４つのドロソ
フィラhspに対する遺伝子は類似した配列を有する小さ
なhs遺伝子ファミリーを含み、この配列はまたα−クリ
スタリンの配列とも関係している（Ingolia, T. D.およ
びE. A. Craig (1982) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79
: 2360-2364）。そしてこのことはある構造ドメイン
（おそらく機能的な凝集のためのもの）がこれらの蛋白
質により共有されていることを示している。ダイズの１
mw-hspの遺伝子はhs条件下で最も活発に発現されそして
同等に調節された遺伝子である（Schoffl, F. および
J. L Key (1982)J. Mol. Appl. Genet. 1 : 301-31
4）。それらのhspは、普通は高温で精製された核と結合
している。
s）現象はまず最初にダイズにおける蛋白質合成の段階
で発見された（Key, J. L.等（1981) Proc. Nat.Acad.
Sci. USA 78 : 3526-3530 ; Barnett, T. 等（1980) su
pra)。いくつかの他の植物、例えば、エンドウ豆、キ
ビ、トウモロコシ、ヒマワリ、綿花そして小麦はダイズ
に対し同様に反応し、このダイズにおいてはヒートショ
ック処理により分子量が大体同じである莫大な数の新し
い蛋白質が誘導されている。種間に生じる主な相違とし
ては次のようなものがある。hs蛋白質を誘導する最適温
度、ブレイクポイント温度（すなわち、この温度以上は
致死的であるという温度）、15-20kD のヒートショック
蛋白質の二次元ゲル上の分布、そしてヒートショック中
に生ずる正常な蛋白質合成の相対的な段階。温度を28℃
から40℃に上げるといくつかのhs蛋白質（hsp)メージャ
ー集団が新たに誘導デノボ合成され、この hspの分子量
はドロソフィラ（Drosophila）で発見されたものと類似
していることが示された。しかし、これら２つの生物間
にはhsp の低分子量（１mw）集団の複雑性という点で明
らかな違いがある。ドロソフィラ（Drosophila）は22,
23, 26そして27キロダルトンの４hsp を合成し、ダイズ
は分子量が15〜18キロダルトンの範囲にわたる20以上の
hspを合成する。翻訳時のhs-ｍＲＮＡに対する優先性
は、明らかではあるが、ダイズにおいては（Key, J. L.
等（1981) supra)ドロソフィラ（Drosophila）における
よりも（Storti, R. V. 等（1980) Cell 22:825-834)そ
れほど顕著ではないらしい。ダイズでhsに特異的なｍＲ
ＮＡの新しいセットが誘導されることはpoly(A)+ ＲＮ
Ａのインビトロ翻訳により支持された。ヒート処理され
た植物体中に新奇のＲＮＡが存在することの証拠はさら
に蔗糖密度勾配分析により出され、この分析によりタバ
コおよびササゲの葉のヒート処理中に0.49×106ダルト
ンのＲＮＡが蓄積することが示された（Dawson, W. O.
および G. L. Grantham(1981) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 100 : 23-30）。ドロソフィラ（Drosophila）
では、hs蛋白質合成の転写時の制御が明らかになってい
るが、これらの遺伝子が同調発現するための信号構造を
見つけるための試みがなされた（Holmgren, R.等（198
1) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78 : 3775-3778）。ダ
イズの poly(A)+ ｍＲＮＡに対するhsの影響はｃＤＮＡ
／ poly(A)+ ＲＮＡハイブリダイゼーション分析および
クローン化ｃＤＮＡ／ナザン法（ナザンブロットハイブ
リダイゼーション）分析を用いて評価された（Schoffl,
F. および J. L. Key (1982) J. Mol. Appl. Genet.
1: 301-314）。ダイズでのこのhs反応は以下の２つによ
って特徴づけられる。１つは新しく非常に豊富な種類の
poly(A)+ ＲＮＡが出現することでこれらは平均の長さ
が800〜900ヌクレオチドの約20種の異なる塩基配列から
成る。そしてもう１つは28℃塩基配列の相対的な豊富性
の変化に伴って全体的にpoly(A)+ ＲＮＡの複雑性が減
少することである。この新しい豊富なクラスのpoly(A)+
ＲＮＡは40℃のヒートショック２時間後に細胞あたり
約15,000〜20,000コピー存在する。これら４つのドロソ
フィラhspに対する遺伝子は類似した配列を有する小さ
なhs遺伝子ファミリーを含み、この配列はまたα−クリ
スタリンの配列とも関係している（Ingolia, T. D.およ
びE. A. Craig (1982) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79
: 2360-2364）。そしてこのことはある構造ドメイン
（おそらく機能的な凝集のためのもの）がこれらの蛋白
質により共有されていることを示している。ダイズの１
mw-hspの遺伝子はhs条件下で最も活発に発現されそして
同等に調節された遺伝子である（Schoffl, F. および
J. L Key (1982)J. Mol. Appl. Genet. 1 : 301-31
4）。それらのhspは、普通は高温で精製された核と結合
している。
【００１６】しかしながらまた低温では解離する（Key,
J. L.等（1982) in: Schlesinger,M. J.,Ashburner,
M. および A. Tissieres (eds) Heatshock from bacter
ia toman. Cold Spring Harbor Laboratory, pp.329-33
6）。これはhs反応でのこれらの蛋白質に対して一般的
な機能を示唆している。その機能はおそらく蛋白質およ
び遺伝子における一般的な構造上の特徴と関係があるで
あろう。１mw-hsp遺伝子はさらに８種類に分けられ、こ
れらは poly(A)+ ｍＲＮＡ間の配列の相同性によって区
別される。この８種のうち２種は遺伝子発現に関して特
に興味深い。というのはそれらは１mw-hsp遺伝子の末端
成分に相当するからである。これらはクラスＩおよびク
ラスＩＩと命名されている：クラスＩが13の密接に関連
する hsp遺伝子から成るのに対し、クラスＩＩの方は単
に１hsp を有するだけでこの hspについては他のhs遺伝
子との配列の相同性は知られていなかった。後にクラス
ＩＩはクラスＩと同じグループに入り得るという報告が
なされた。２つの種類の区分は根本的にはpE2019の３’
−翻訳末端の末梢部の試験を基にしてなされた。
J. L.等（1982) in: Schlesinger,M. J.,Ashburner,
M. および A. Tissieres (eds) Heatshock from bacter
ia toman. Cold Spring Harbor Laboratory, pp.329-33
6）。これはhs反応でのこれらの蛋白質に対して一般的
な機能を示唆している。その機能はおそらく蛋白質およ
び遺伝子における一般的な構造上の特徴と関係があるで
あろう。１mw-hsp遺伝子はさらに８種類に分けられ、こ
れらは poly(A)+ ｍＲＮＡ間の配列の相同性によって区
別される。この８種のうち２種は遺伝子発現に関して特
に興味深い。というのはそれらは１mw-hsp遺伝子の末端
成分に相当するからである。これらはクラスＩおよびク
ラスＩＩと命名されている：クラスＩが13の密接に関連
する hsp遺伝子から成るのに対し、クラスＩＩの方は単
に１hsp を有するだけでこの hspについては他のhs遺伝
子との配列の相同性は知られていなかった。後にクラス
ＩＩはクラスＩと同じグループに入り得るという報告が
なされた。２つの種類の区分は根本的にはpE2019の３’
−翻訳末端の末梢部の試験を基にしてなされた。
【００１７】広範囲の穀物植物はヒートショック条件の
温度を上げると多量の（30あるいはそれ以上）hs蛋白質
を合成して反応する（Key, J. L.等（1983)Curreut Top
icsin Plant Biochemistry and Physiology eds. D. D.
Randall, D. G. Blevins,R. L. Larsonおよび B. J. R
app. Vol.2, Univ. of Missouri, Columbia, pp107-11
7）。高分子量hs蛋白質は電気泳動分析上では種間で類
似している。低分子量（15〜27kd）hs蛋白質のより複雑
なパターンとして種間で電気泳動的にかなり異質である
ことが示された。確かに特定のダイズhsｃＤＮＡクロー
ンは異なるダイズhs-poly(A)ＲＮＡに対して他の種のい
かなるhsＲＮＡに対するよりもより大きな交叉ハイブリ
ダイゼーションを示し、そしてこのように他の種とのハ
イブリダイゼーションが限定されていることは低分子量
hs蛋白質の電気泳動上の異質性が観察されたことと一致
した。
温度を上げると多量の（30あるいはそれ以上）hs蛋白質
を合成して反応する（Key, J. L.等（1983)Curreut Top
icsin Plant Biochemistry and Physiology eds. D. D.
Randall, D. G. Blevins,R. L. Larsonおよび B. J. R
app. Vol.2, Univ. of Missouri, Columbia, pp107-11
7）。高分子量hs蛋白質は電気泳動分析上では種間で類
似している。低分子量（15〜27kd）hs蛋白質のより複雑
なパターンとして種間で電気泳動的にかなり異質である
ことが示された。確かに特定のダイズhsｃＤＮＡクロー
ンは異なるダイズhs-poly(A)ＲＮＡに対して他の種のい
かなるhsＲＮＡに対するよりもより大きな交叉ハイブリ
ダイゼーションを示し、そしてこのように他の種とのハ
イブリダイゼーションが限定されていることは低分子量
hs蛋白質の電気泳動上の異質性が観察されたことと一致
した。
【００１８】細菌からヒトにいたる範囲の生物にわたっ
てhs蛋白質が進化上保存されてきたことはhs蛋白質に対
する本質的な機能を示唆している。経験的に言うと、１
つの機能は許容範囲をこえたhs温度にもかかわらずそれ
に対し温度上の保護もしくは温度抵抗性を示すことであ
る（Schlesinger, M. 等（1982) Heatshock from bacte
ria to man. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sp
ring Harbor, NY p.329）。明らかに許容範囲のヒート
ショック温度で合成されたようなhs蛋白質は生命体がよ
り高い温度でもhs蛋白質およびhs−ｍＲＮＡを合成し続
けることそして本来なら致死的な温度でも生き残ること
を可能にする（Key, J. L.等（1982) In: Heat Shock f
rom bacteria to man. M. J. Schlesinger, M. Achburn
er および A. Tissieres,eds. Cold Spring Harbor Lab
oratory, Cold Spring Harbor,NY p329）。
てhs蛋白質が進化上保存されてきたことはhs蛋白質に対
する本質的な機能を示唆している。経験的に言うと、１
つの機能は許容範囲をこえたhs温度にもかかわらずそれ
に対し温度上の保護もしくは温度抵抗性を示すことであ
る（Schlesinger, M. 等（1982) Heatshock from bacte
ria to man. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sp
ring Harbor, NY p.329）。明らかに許容範囲のヒート
ショック温度で合成されたようなhs蛋白質は生命体がよ
り高い温度でもhs蛋白質およびhs−ｍＲＮＡを合成し続
けることそして本来なら致死的な温度でも生き残ること
を可能にする（Key, J. L.等（1982) In: Heat Shock f
rom bacteria to man. M. J. Schlesinger, M. Achburn
er および A. Tissieres,eds. Cold Spring Harbor Lab
oratory, Cold Spring Harbor,NY p329）。
【００１９】許容範囲の温度とはここではヒートショッ
ク反応を誘導するのに充分高くしかし致死的ではないよ
うな温度として定義される。ブレイクポイント温度以上
の温度は温度抵抗性を獲得していない植物にとって致死
的である。ダイズではこのブレイクポイント温度は約40
℃である。ダイズ苗は許容範囲のhs温度でインキュベイ
トして前処理しておくと致死的な温度でインキュベイト
しても生き残ることが以前に示されていた（Key, J. L.
等（1983) In : NATO Adranced Studies Workshop on G
enome Organization and Expression in Plants. L. Du
re, ed. PlenumPress)。
ク反応を誘導するのに充分高くしかし致死的ではないよ
うな温度として定義される。ブレイクポイント温度以上
の温度は温度抵抗性を獲得していない植物にとって致死
的である。ダイズではこのブレイクポイント温度は約40
℃である。ダイズ苗は許容範囲のhs温度でインキュベイ
トして前処理しておくと致死的な温度でインキュベイト
しても生き残ることが以前に示されていた（Key, J. L.
等（1983) In : NATO Adranced Studies Workshop on G
enome Organization and Expression in Plants. L. Du
re, ed. PlenumPress)。
【００２０】許容範囲でのヒートショックをいくつかの
異なった処理法で行うとダイズ苗において温度抵抗性の
進展が生じる。これらの処理として以下のものを含む：
(a)40℃で１〜２時間連続ヒートショック後、45℃でイ
ンキュベーション；(b)40℃で30分間ヒートショック
後、28℃で２〜３時間してから45℃にシフト；(c)45℃
で10分間ヒートショック後、28℃で約２時間してから45
℃にシフト；そして(d)苗を28℃で３時間以上50μM 亜
砒酸塩処理後、45℃にシフト。これらの処理が一般的に
有する重要な特徴は可能な致死温度でインキュベーショ
ンする前にヒートショック蛋白質の合成を誘導しそして
蓄積することである。事実上、苗を上記の条件の１つで
前処理しておくとhs-ｍＲＮＡおよびhs蛋白質のいずれ
の合成も45℃で起こることが示されてきた。hs蛋白質の
よく似た役割としてヒートショック中でも致命的な機能
および構造（例えば、転写、翻訳、そしてエネルギー生
産機構）を保護し、そして好適温度に戻ったとき正常な
機能が速やかに回復できるようにすることがあげられ
る。温度を正常（例えば28℃）に戻したとき正常なｍＲ
ＮＡおよび蛋白質合成が速やかに回復することが知られ
ている（Key, J. L.等（1981) Proc. Nat.Acad. Sci. U
SA 78 : 3526-3530 ; Schlesinger,M. J. 等（1982)Tre
nds Biochem. Sci.1 : 222-225)。正常な蛋白合成の回
復には、回復中に新しく合成されたｍＲＮＡと同様にヒ
ートショック中に保存されていたｍＲＮＡも利用され、
そして正常温度に戻した３〜４時間後にはヒートショッ
ク蛋白質の合成は見られない。しかし、40℃のヒートシ
ョック中に合成されたようなヒートショック蛋白質は（
3H−ロイシンの取込みにより認識される）それに続く非
標識ロイシンでの追跡中も非常に安定であり、これは追
跡を28℃または40℃のいずれで行うかには無関係であ
る；すなわち20時間にわたる追跡中ラベルの約80％がヒ
ートショック蛋白質中に保持されている。
異なった処理法で行うとダイズ苗において温度抵抗性の
進展が生じる。これらの処理として以下のものを含む：
(a)40℃で１〜２時間連続ヒートショック後、45℃でイ
ンキュベーション；(b)40℃で30分間ヒートショック
後、28℃で２〜３時間してから45℃にシフト；(c)45℃
で10分間ヒートショック後、28℃で約２時間してから45
℃にシフト；そして(d)苗を28℃で３時間以上50μM 亜
砒酸塩処理後、45℃にシフト。これらの処理が一般的に
有する重要な特徴は可能な致死温度でインキュベーショ
ンする前にヒートショック蛋白質の合成を誘導しそして
蓄積することである。事実上、苗を上記の条件の１つで
前処理しておくとhs-ｍＲＮＡおよびhs蛋白質のいずれ
の合成も45℃で起こることが示されてきた。hs蛋白質の
よく似た役割としてヒートショック中でも致命的な機能
および構造（例えば、転写、翻訳、そしてエネルギー生
産機構）を保護し、そして好適温度に戻ったとき正常な
機能が速やかに回復できるようにすることがあげられ
る。温度を正常（例えば28℃）に戻したとき正常なｍＲ
ＮＡおよび蛋白質合成が速やかに回復することが知られ
ている（Key, J. L.等（1981) Proc. Nat.Acad. Sci. U
SA 78 : 3526-3530 ; Schlesinger,M. J. 等（1982)Tre
nds Biochem. Sci.1 : 222-225)。正常な蛋白合成の回
復には、回復中に新しく合成されたｍＲＮＡと同様にヒ
ートショック中に保存されていたｍＲＮＡも利用され、
そして正常温度に戻した３〜４時間後にはヒートショッ
ク蛋白質の合成は見られない。しかし、40℃のヒートシ
ョック中に合成されたようなヒートショック蛋白質は（
3H−ロイシンの取込みにより認識される）それに続く非
標識ロイシンでの追跡中も非常に安定であり、これは追
跡を28℃または40℃のいずれで行うかには無関係であ
る；すなわち20時間にわたる追跡中ラベルの約80％がヒ
ートショック蛋白質中に保持されている。
【００２１】温度抵抗性の獲得はヒートショック蛋白質
の合成ばかりでなくそれらの細胞内での選択的局在にも
依存するようである。ダイズ苗では、いくつかのhs蛋白
質は選択的に核、ミトコンドリアおよびリボソーム内も
しくはそれらに結合して局在するようになり、この状態
は密度勾配精製されたこれらの細胞内小器官の分画中で
hs蛋白質を単離できるようなものである。特に、15〜18
キロダルトンhs蛋白質の複合体群はダイズ苗のヒートシ
ョック中にこれらの分画に選択的に局在する。hs蛋白質
のこの選択的局在は温度依存性である。hs蛋白質（ミト
コンドリア分画に所属する22-24kdのhs蛋白質を除く）
は28℃４時間のインキュベーション中は細胞内小器官の
分画から離れそしてヒートショック温度での追跡中は細
胞内小器官に結合したままである。さらに、28℃４時間
追跡後の２回目のヒートショックによりhs蛋白質は速や
かに（15分以内に）細胞内小器官と再結合する。ヒート
ショック蛋白質の核とのこの結合はhs蛋白質が「クロマ
チン蛋白質」もしくはおそらくマトリクス構造の一部に
なるということによって説明できた；いずれの示唆とも
その後のドロソフィラ系を用いた局在性の研究を提供し
てきた（Arrigo, A.P. 等（1980) Dev. Biol. 78 : 86-
103）。これらの発見は基本的にはオートラジオグラフ
ィーの結果と一致しており、このオートラジオグラフィ
ーではhs蛋白質は多糸染色体のバンド内領域に局在して
いた（Velazquez, J. 等（1980) Cell20: 679-689 およ
び（1984) Cell 36 : 655-662)。
の合成ばかりでなくそれらの細胞内での選択的局在にも
依存するようである。ダイズ苗では、いくつかのhs蛋白
質は選択的に核、ミトコンドリアおよびリボソーム内も
しくはそれらに結合して局在するようになり、この状態
は密度勾配精製されたこれらの細胞内小器官の分画中で
hs蛋白質を単離できるようなものである。特に、15〜18
キロダルトンhs蛋白質の複合体群はダイズ苗のヒートシ
ョック中にこれらの分画に選択的に局在する。hs蛋白質
のこの選択的局在は温度依存性である。hs蛋白質（ミト
コンドリア分画に所属する22-24kdのhs蛋白質を除く）
は28℃４時間のインキュベーション中は細胞内小器官の
分画から離れそしてヒートショック温度での追跡中は細
胞内小器官に結合したままである。さらに、28℃４時間
追跡後の２回目のヒートショックによりhs蛋白質は速や
かに（15分以内に）細胞内小器官と再結合する。ヒート
ショック蛋白質の核とのこの結合はhs蛋白質が「クロマ
チン蛋白質」もしくはおそらくマトリクス構造の一部に
なるということによって説明できた；いずれの示唆とも
その後のドロソフィラ系を用いた局在性の研究を提供し
てきた（Arrigo, A.P. 等（1980) Dev. Biol. 78 : 86-
103）。これらの発見は基本的にはオートラジオグラフ
ィーの結果と一致しており、このオートラジオグラフィ
ーではhs蛋白質は多糸染色体のバンド内領域に局在して
いた（Velazquez, J. 等（1980) Cell20: 679-689 およ
び（1984) Cell 36 : 655-662)。
【００２２】植物でのヒートショックの研究の大半は主
に操作が簡単であるということから日光を当てないで青
白くした苗を用いて行われてきた。ヒートショック蛋白
質は正常植物の緑色組織において広く分析されてきた
が、緑葉組織と青白い苗とではhs-ｍＲＮＡの蓄積の程
度がほぼ同じことが示された。
に操作が簡単であるということから日光を当てないで青
白くした苗を用いて行われてきた。ヒートショック蛋白
質は正常植物の緑色組織において広く分析されてきた
が、緑葉組織と青白い苗とではhs-ｍＲＮＡの蓄積の程
度がほぼ同じことが示された。
【００２３】さらに、ほとんどの試験的研究は約10℃と
いう大きな温度変化で行われてきた。しかし、このよう
な非生理学的な変化に対する反応は、ダイズの場合では
28℃から47.5℃に徐々に上昇させた場合と、hs-ｍＲＮ
Ａおよびhs蛋白質の合成そして蓄積の両レベルにおいて
よく似ている。したがって、非生理学的な実験と思われ
るようなその結果はより正常な生理学的条件のヒートシ
ョックのもとで、この条件はいかにもおそらく正常な植
物環境でのものだが、青白い苗および緑色植物を用いて
複製できる。
いう大きな温度変化で行われてきた。しかし、このよう
な非生理学的な変化に対する反応は、ダイズの場合では
28℃から47.5℃に徐々に上昇させた場合と、hs-ｍＲＮ
Ａおよびhs蛋白質の合成そして蓄積の両レベルにおいて
よく似ている。したがって、非生理学的な実験と思われ
るようなその結果はより正常な生理学的条件のヒートシ
ョックのもとで、この条件はいかにもおそらく正常な植
物環境でのものだが、青白い苗および緑色植物を用いて
複製できる。
【００２４】
【発明の要旨】ダイズの４つのヒートショック遺伝子を
クローン化しそして配列を決定した。これら４つのヒー
トショック遺伝子のヒートショックプロモーター断片を
サブクローン化しそして遺伝子操作によりこれをＴ−Ｄ
ＮＡシャトルベクターに導入した。そして、これらの組
み換えＤＮＡ断片、すなわち、ダイズヒートショック遺
伝子プロモーターを保持するＴ−ＤＮＡシャトルベクタ
ーに結合したベクターをヘルパープラスミドの助けをか
りてアグロバクテリウム・チューメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens)内に転送させ、この細菌内で組
み換えＤＮＡ断片をTi−プラスミド内に組み込ませる。
そしてこのTi−プラスミドのＴ−ＤＮＡ部分を植物ゲノ
ムへ転送させ、こうして植物の形質転換ができた。
クローン化しそして配列を決定した。これら４つのヒー
トショック遺伝子のヒートショックプロモーター断片を
サブクローン化しそして遺伝子操作によりこれをＴ−Ｄ
ＮＡシャトルベクターに導入した。そして、これらの組
み換えＤＮＡ断片、すなわち、ダイズヒートショック遺
伝子プロモーターを保持するＴ−ＤＮＡシャトルベクタ
ーに結合したベクターをヘルパープラスミドの助けをか
りてアグロバクテリウム・チューメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens)内に転送させ、この細菌内で組
み換えＤＮＡ断片をTi−プラスミド内に組み込ませる。
そしてこのTi−プラスミドのＴ−ＤＮＡ部分を植物ゲノ
ムへ転送させ、こうして植物の形質転換ができた。
【００２５】ヒートショック遺伝子プロモーターは植物
ゲノムに転送されそしてヒートショックもしくはストレ
ス処理後一時的に活性化されるので、外来遺伝子を組み
換えＤＮＡプラスミド内に取り込ませるのに有用であ
る、そして、この取り込ませる場所はヒートショック遺
伝子プロモーターの制御下で発現できるような位置であ
る。このようにして取り込まれた外来遺伝子はＴ−ＤＮ
Ａによって形質転換した植物細胞を認識するのに利用で
きるかもしくは一時的に活性化することが可能である。
このような一時的な活性化はバシラス・チューリンギエ
ンシス（Bacillusthuringiensis）の結晶性毒素の産
生、除草剤抵抗性の産生、または病原菌に対する抵抗性
の誘導において有用である。
ゲノムに転送されそしてヒートショックもしくはストレ
ス処理後一時的に活性化されるので、外来遺伝子を組み
換えＤＮＡプラスミド内に取り込ませるのに有用であ
る、そして、この取り込ませる場所はヒートショック遺
伝子プロモーターの制御下で発現できるような位置であ
る。このようにして取り込まれた外来遺伝子はＴ−ＤＮ
Ａによって形質転換した植物細胞を認識するのに利用で
きるかもしくは一時的に活性化することが可能である。
このような一時的な活性化はバシラス・チューリンギエ
ンシス（Bacillusthuringiensis）の結晶性毒素の産
生、除草剤抵抗性の産生、または病原菌に対する抵抗性
の誘導において有用である。
【００２６】
【発明の構成】本発明の細菌株は、組み換えＤＮＡプラ
スミドを保持しかつ複製するものであり、(a)ベクタ
ー、(b)TiプラスミドのＴ−ＤＮＡ断片に挿入されたア
グロバクテリウム（Agrobacterium)株由来のヒートショ
ック遺伝子の発現を制御する植物ＤＮＡの断片、そして
(c)植物ＤＮＡの前記断片の制御下にある外来遺伝子ま
たはダイズ遺伝子を有する。
スミドを保持しかつ複製するものであり、(a)ベクタ
ー、(b)TiプラスミドのＴ−ＤＮＡ断片に挿入されたア
グロバクテリウム（Agrobacterium)株由来のヒートショ
ック遺伝子の発現を制御する植物ＤＮＡの断片、そして
(c)植物ＤＮＡの前記断片の制御下にある外来遺伝子ま
たはダイズ遺伝子を有する。
【００２７】植物ＤＮＡの前記断片は、ダイズ植物から
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
【００２８】
【化５】
【００２９】植物ＤＮＡの前記断片は、ダイズ植物から
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
【００３０】
【化６】
【００３１】植物ＤＮＡの前記断片は、ダイズ植物から
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
【００３２】
【化７】
【００３３】植物ＤＮＡの前記断片は、ダイズ植物から
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
【００３４】
【化８】
【００３５】本発明の組み換えＤＮＡプラスミドは、
(a)ベクター、そして(b)アグロバクテリウム（Agrobact
erium)株由来のTi−プラスミドのＴ−ＤＮＡ断片に挿入
されるヒートショック遺伝子の発現を制御する植物ＤＮ
Ａの断片を有する。
(a)ベクター、そして(b)アグロバクテリウム（Agrobact
erium)株由来のTi−プラスミドのＴ−ＤＮＡ断片に挿入
されるヒートショック遺伝子の発現を制御する植物ＤＮ
Ａの断片を有する。
【００３６】植物ＤＮＡの前記断片は、ダイズ植物から
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
【００３７】
【化９】
【００３８】植物ＤＮＡの前記断片は、ダイズ植物から
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
【００３９】
【化１０】
【００４０】植物ＤＮＡの前記断片は、ダイズ植物から
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
【００４１】
【化１１】
【００４２】植物ＤＮＡの前記断片は、ダイズ植物から
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
得られ、該断片は次の配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
【００４３】
【化１２】
【００４４】本発明の、アグロバクテリウム(Agrobacte
rium)種のＴ−ＤＮＡにより形質転換した植物細胞を認
識する方法は、ダイズヒートショック遺伝子プロモータ
ーの制御下で形質転換認識遺伝子を発現させることによ
るものであり、次の工程を含む： (a)ダイズヒートショック遺伝子プロモーター配列、ヒ
ートショック遺伝子コード配列および該ヒートショック
遺伝子配列の下流塩基配列を有するダイズヒートショッ
ク遺伝子を単離すること、(b)前記形質転換認識遺伝子
を単離しそしてポリリンカーを付着すること、(c)前記
形質転換認識遺伝子を前記ダイズヒートショック遺伝子
に、前記ヒートショック遺伝子コード配列および前記形
質転換認識遺伝子の読み取りの枠を保存するような位置
に挿入して組み換えダイズヒートショック遺伝子を生産
すること、ここで、該組み換えダイズヒートショック遺
伝子内では前記形質転換認識遺伝子は前記ダイズヒート
ショック遺伝子プロモーター配列に対してその制御下で
発現できるような方向で配置される、(d)前記組み換え
ダイズヒートショック遺伝子をＴ−ＤＮＡシャトルベク
ターへクローニングし共に取り込まれた組み換えＤＮＡ
断片を生産すること、(e)前記共に取り込まれた組み換
えＤＮＡ断片を、細菌株へ形質転換すること、ここで該
細菌株は前記共に取り込まれた組み換えＤＮＡ断片の複
製を維持し得る、(f)前記細菌株を、ヘルパープラスミ
ドを有する第２の細菌株と混合すること、ここで該ヘル
パープラスミドは前記共に取り込まれた組み換えＤＮＡ
断片を第３の細菌株に転送することができ、該第３の細
菌株は前記共に取り込まれた組み換えＤＮＡ断片の複製
を維持し得ず、該第３の細菌株は内在性プラスミドを有
する、(g)前記共に取り込まれた組み換えＤＮＡ断片お
よび前記内在性プラスミド間の組み換え体を選択し組み
換え内在性プラスミドを生産すること、(h)前記第３の
細菌株を植物に感染させること、ここで、該第３の細菌
株は前記組み換え内在性プラスミドを保持しかつそこで
複製する、そして、(i)前記組み換えダイズヒートショ
ック遺伝子を保持する植物細胞を有する植物を選択する
ことこのようにして前記植物細胞の形質転換を証明する
こと。
rium)種のＴ−ＤＮＡにより形質転換した植物細胞を認
識する方法は、ダイズヒートショック遺伝子プロモータ
ーの制御下で形質転換認識遺伝子を発現させることによ
るものであり、次の工程を含む： (a)ダイズヒートショック遺伝子プロモーター配列、ヒ
ートショック遺伝子コード配列および該ヒートショック
遺伝子配列の下流塩基配列を有するダイズヒートショッ
ク遺伝子を単離すること、(b)前記形質転換認識遺伝子
を単離しそしてポリリンカーを付着すること、(c)前記
形質転換認識遺伝子を前記ダイズヒートショック遺伝子
に、前記ヒートショック遺伝子コード配列および前記形
質転換認識遺伝子の読み取りの枠を保存するような位置
に挿入して組み換えダイズヒートショック遺伝子を生産
すること、ここで、該組み換えダイズヒートショック遺
伝子内では前記形質転換認識遺伝子は前記ダイズヒート
ショック遺伝子プロモーター配列に対してその制御下で
発現できるような方向で配置される、(d)前記組み換え
ダイズヒートショック遺伝子をＴ−ＤＮＡシャトルベク
ターへクローニングし共に取り込まれた組み換えＤＮＡ
断片を生産すること、(e)前記共に取り込まれた組み換
えＤＮＡ断片を、細菌株へ形質転換すること、ここで該
細菌株は前記共に取り込まれた組み換えＤＮＡ断片の複
製を維持し得る、(f)前記細菌株を、ヘルパープラスミ
ドを有する第２の細菌株と混合すること、ここで該ヘル
パープラスミドは前記共に取り込まれた組み換えＤＮＡ
断片を第３の細菌株に転送することができ、該第３の細
菌株は前記共に取り込まれた組み換えＤＮＡ断片の複製
を維持し得ず、該第３の細菌株は内在性プラスミドを有
する、(g)前記共に取り込まれた組み換えＤＮＡ断片お
よび前記内在性プラスミド間の組み換え体を選択し組み
換え内在性プラスミドを生産すること、(h)前記第３の
細菌株を植物に感染させること、ここで、該第３の細菌
株は前記組み換え内在性プラスミドを保持しかつそこで
複製する、そして、(i)前記組み換えダイズヒートショ
ック遺伝子を保持する植物細胞を有する植物を選択する
ことこのようにして前記植物細胞の形質転換を証明する
こと。
【００４５】前記ヒートショックプロモーター配列は、
配列番号１の次の塩基配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
配列番号１の次の塩基配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である。
【００４６】
【化１３】
【００４７】前記ヒートショックプロモーター配列は、
配列番号２次の塩基配列を有するか、もしくは実質的に
それと相同である。
配列番号２次の塩基配列を有するか、もしくは実質的に
それと相同である。
【００４８】
【化１４】
【００４９】本発明のダイズヒートショック遺伝子プロ
モーターの制御下で構造遺伝子を発現させる方法は、以
下の工程を包含する： (a)前記ダイズヒートショック遺伝子プロモーター断片
を単離すること、(b)前記ダイズヒートショック遺伝子
プロモーター断片をＴ−ＤＮＡシャトルベクターへクロ
ーニングし組み換えＤＮＡプラスミドを生産すること、
(c)外来構造遺伝子もしくはダイズ遺伝子を有するＤＮ
Ａ断片を単離しそして該ＤＮＡ断片を前記組み換えＤＮ
Ａプラスミド中の前記ダイズヒートショック遺伝子プロ
モーターの読み取り鎖３’−側の位置に挿入しヒートシ
ョック発現プラスミドを生産すること、ここで、該ヒー
トショック発現プラスミド内では前記ＤＮＡ断片は前記
ダイズヒートショック遺伝子プロモーターに対してその
制御下で発現できるような方向に配置されている、(d)
前記ヒートショック発現プラスミドを、第１の細菌株へ
形質転換すること、ここで、該細菌株は前記ヒートショ
ック発現プラスミドの複製を、維持し得る、(e)前記ヒ
ートショック発現プラスミドの複製を維持し得る前記細
菌株をヘルパープラスミドを有する第２の細菌株と混合
すること、ここで該ヘルパープラスミドは前記ヒートシ
ョック発現プラスミドを第３の細菌株に転送することが
でき、該第３の細菌株は前記ヒートショック発現プラス
ミドの複製を維持し得ず、該第３の細菌株は内在性プラ
スミドを有する、(f)前記ヒートショック発現プラスミ
ドおよび前記内在性プラスミド間の組み換え体を選択
し、組み換え内在性プラスミドを生産すること、(g)前
記第３の細菌株を植物もしくは植物培養細胞に感染させ
ること、ここで該第３の細菌株は前記組み換え内在性プ
ラスミドを保持しかつそこで複製する、そして、(h)前
記外来構造遺伝子もしくはダイズ遺伝子を保持する植物
細胞を含有する植物体または植物培養細胞を前記ダイズ
ヒートショック遺伝子プロモーターの制御下で選択する
こと、ここで、該ダイズヒートショック遺伝子プロモー
ターは前記組み換え内在性プラスミドから前記植物細胞
へ転送されたものであり、該外来構造遺伝子もしくはダ
イズ遺伝子はヒートショック処理または他のストレス処
理により発現する。
モーターの制御下で構造遺伝子を発現させる方法は、以
下の工程を包含する： (a)前記ダイズヒートショック遺伝子プロモーター断片
を単離すること、(b)前記ダイズヒートショック遺伝子
プロモーター断片をＴ−ＤＮＡシャトルベクターへクロ
ーニングし組み換えＤＮＡプラスミドを生産すること、
(c)外来構造遺伝子もしくはダイズ遺伝子を有するＤＮ
Ａ断片を単離しそして該ＤＮＡ断片を前記組み換えＤＮ
Ａプラスミド中の前記ダイズヒートショック遺伝子プロ
モーターの読み取り鎖３’−側の位置に挿入しヒートシ
ョック発現プラスミドを生産すること、ここで、該ヒー
トショック発現プラスミド内では前記ＤＮＡ断片は前記
ダイズヒートショック遺伝子プロモーターに対してその
制御下で発現できるような方向に配置されている、(d)
前記ヒートショック発現プラスミドを、第１の細菌株へ
形質転換すること、ここで、該細菌株は前記ヒートショ
ック発現プラスミドの複製を、維持し得る、(e)前記ヒ
ートショック発現プラスミドの複製を維持し得る前記細
菌株をヘルパープラスミドを有する第２の細菌株と混合
すること、ここで該ヘルパープラスミドは前記ヒートシ
ョック発現プラスミドを第３の細菌株に転送することが
でき、該第３の細菌株は前記ヒートショック発現プラス
ミドの複製を維持し得ず、該第３の細菌株は内在性プラ
スミドを有する、(f)前記ヒートショック発現プラスミ
ドおよび前記内在性プラスミド間の組み換え体を選択
し、組み換え内在性プラスミドを生産すること、(g)前
記第３の細菌株を植物もしくは植物培養細胞に感染させ
ること、ここで該第３の細菌株は前記組み換え内在性プ
ラスミドを保持しかつそこで複製する、そして、(h)前
記外来構造遺伝子もしくはダイズ遺伝子を保持する植物
細胞を含有する植物体または植物培養細胞を前記ダイズ
ヒートショック遺伝子プロモーターの制御下で選択する
こと、ここで、該ダイズヒートショック遺伝子プロモー
ターは前記組み換え内在性プラスミドから前記植物細胞
へ転送されたものであり、該外来構造遺伝子もしくはダ
イズ遺伝子はヒートショック処理または他のストレス処
理により発現する。
【００５０】前記ヒートショック遺伝子プロモーター断
片は、配列番号３の次の塩基配列を有するか、もしくは
実質的にそれと相同である。
片は、配列番号３の次の塩基配列を有するか、もしくは
実質的にそれと相同である。
【００５１】
【化１５】
【００５２】前記ヒートショック遺伝子プロモーター断
片は、配列番号４の次の塩基配列を有するか、もしくは
実質的にそれと相同である。
片は、配列番号４の次の塩基配列を有するか、もしくは
実質的にそれと相同である。
【００５３】
【化１６】
【００５４】以下に本発明を詳細に説明する。
【００５５】ダイズ精製核から単離した染色体ＤＮＡを
制限酵素分析およびサザン法（サザンブロットハイブリ
ダイゼーション）にかけた、ハイブリダイゼーションプ
ローブとしてクローン化 hs-ｃＤＮＡを用いた。６セッ
トのｃＤＮＡクローンを同定した、これらは15〜27キロ
ダルトンにわたるhs蛋白質に対して（植物にはこの範囲
のサイズのhs蛋白質が少なくとも30はある）「異なる」
複遺伝子族のメンバーを写している。さらに、プローブ
としてｃＤＮＡクローン1968を用いて１つの遺伝子クロ
ーン（hs6871）を単離した。これらのグループは以下の
通りである。
制限酵素分析およびサザン法（サザンブロットハイブリ
ダイゼーション）にかけた、ハイブリダイゼーションプ
ローブとしてクローン化 hs-ｃＤＮＡを用いた。６セッ
トのｃＤＮＡクローンを同定した、これらは15〜27キロ
ダルトンにわたるhs蛋白質に対して（植物にはこの範囲
のサイズのhs蛋白質が少なくとも30はある）「異なる」
複遺伝子族のメンバーを写している。さらに、プローブ
としてｃＤＮＡクローン1968を用いて１つの遺伝子クロ
ーン（hs6871）を単離した。これらのグループは以下の
通りである。
【００５６】
【表１】
【００５７】表１において、*印は、これらのそして他
のいくつかのｃＤＮＡクローンは同じ複遺伝子族のメン
バーを写していることを、**印は、pFS2005およびpCE53
で表されたのと同じ複遺伝子族に対し「特異的」ｃＤＮ
Ａクローンを写す可能性があることを、***印は、これ
らのヒートショック遺伝子族の発現は他の多くのストレ
ス処理、例えば、亜砒酸塩処理によって誘導されること
をそれぞれ表す。
のいくつかのｃＤＮＡクローンは同じ複遺伝子族のメン
バーを写していることを、**印は、pFS2005およびpCE53
で表されたのと同じ複遺伝子族に対し「特異的」ｃＤＮ
Ａクローンを写す可能性があることを、***印は、これ
らのヒートショック遺伝子族の発現は他の多くのストレ
ス処理、例えば、亜砒酸塩処理によって誘導されること
をそれぞれ表す。
【００５８】λ1059ダイズライブラリー（Agrigenetics
Advanced Research Laboratory、Madison、Wisconsin
で構築された）から単離されるゲノムクローンを単離す
ること、制限地図を作ること、サブクローニングするこ
と、そして配列決定を行うこと、および上記のcDNAクロ
ーンのDNA 配列分析に主に努力専念した。
Advanced Research Laboratory、Madison、Wisconsin
で構築された）から単離されるゲノムクローンを単離す
ること、制限地図を作ること、サブクローニングするこ
と、そして配列決定を行うこと、および上記のcDNAクロ
ーンのDNA 配列分析に主に努力専念した。
【００５９】４つのサブクローン、名称はpE2019、pL20
05、pM2005、そしてhs6871をλゲノムクローンから作っ
た。これら４つのサブクローンは３つの異なる遺伝子族
を表している、すなわち、cDNAクローン2005、2019 そ
して1968である。これらゲノムクローン由来のcDNAに相
同であることに基づいてEco RI断片を選択しそしてpUC9
へサブクローン化した。これら挿入物の部分の配列分析
を行った。すなわち、pE2019の856 ヌクレオチド（図１
および図２）、pL2005の971 ヌクレオチド、pM2005 の9
44 ヌクレオチド、そしてhs6871の1536ヌクエオチドそ
れぞれについて行った。配列相同性分析（Sequence hom
ology analysis）によりそれぞれのゲノムサブクローン
配列内で相当するcDNA相同性の位置を探した。交叉相同
性分析（Cross-homology analysis）によりゲノムサブ
クローンにおいて次のような実質的なcDNA相同性がしめ
された：（ａ）pE2019はpFS2019cDNA クローンの340 塩
基について98％以上の相同性に相当する。（ｂ）この20
19相同性の直接上流は、350 塩基のpCE53 cDNAクローン
配列に対して90％以上の相同性を示す領域である。従っ
て配列データおよび雑種選択／翻訳のデータはpCE53 が
pFS2005 遺伝子族のメンバーであることを示唆する。
（ｃ）さらに、pFS2019 は2005遺伝子族のメンバーの
３'-側の翻訳されない領域であることがわかった。
（ｄ）ホモロジーマトリクス分析により交叉相補結合
（クロスハイブリダイズ）しないcDNA（例えば、pCE75
およびpFS2033 ）でさえも40ヌクレオチドにいたる長さ
について70％の相同性とともに50％以上の相同性を示す
長い範囲を含むことが示された。
05、pM2005、そしてhs6871をλゲノムクローンから作っ
た。これら４つのサブクローンは３つの異なる遺伝子族
を表している、すなわち、cDNAクローン2005、2019 そ
して1968である。これらゲノムクローン由来のcDNAに相
同であることに基づいてEco RI断片を選択しそしてpUC9
へサブクローン化した。これら挿入物の部分の配列分析
を行った。すなわち、pE2019の856 ヌクレオチド（図１
および図２）、pL2005の971 ヌクレオチド、pM2005 の9
44 ヌクレオチド、そしてhs6871の1536ヌクエオチドそ
れぞれについて行った。配列相同性分析（Sequence hom
ology analysis）によりそれぞれのゲノムサブクローン
配列内で相当するcDNA相同性の位置を探した。交叉相同
性分析（Cross-homology analysis）によりゲノムサブ
クローンにおいて次のような実質的なcDNA相同性がしめ
された：（ａ）pE2019はpFS2019cDNA クローンの340 塩
基について98％以上の相同性に相当する。（ｂ）この20
19相同性の直接上流は、350 塩基のpCE53 cDNAクローン
配列に対して90％以上の相同性を示す領域である。従っ
て配列データおよび雑種選択／翻訳のデータはpCE53 が
pFS2005 遺伝子族のメンバーであることを示唆する。
（ｃ）さらに、pFS2019 は2005遺伝子族のメンバーの
３'-側の翻訳されない領域であることがわかった。
（ｄ）ホモロジーマトリクス分析により交叉相補結合
（クロスハイブリダイズ）しないcDNA（例えば、pCE75
およびpFS2033 ）でさえも40ヌクレオチドにいたる長さ
について70％の相同性とともに50％以上の相同性を示す
長い範囲を含むことが示された。
【００６０】ｃＤＮＡ2019に相補結合（ハイブリダイ
ズ）するダイズゲノムクローンpE2019の7000塩基HindII
I断片（H2）を同定した（図３）。pE2019遺伝子をH2の
左末端Bam HI小断片（BHと呼ばれる―図３）にマップし
た、というのはこの領域はｃＤＮＡ2019プローブに相補
結合する唯一の部分であることが示されたからである。
この断片を配列決定の研究およびTi−プラスミドへの導
入のために選別した。Ｍ13キロデリージョン戦法（Barn
es、Ｗ. Ｍ．およびBevan（1983）Nucleic AcidsResear
ch 11 ：349 -368）によりBH断片の配列を決定しそして
この小断片を欠失した一連の欠失ファージを構築した、
ドロソフィラヒートショック共通配列（CTxGAAxxTTCxA
G）（図４）について78％の相同性を示す。またSV40反
復塩基対(GGTGTGGAAAG)(図４)について73％の相同性を
示すいくつかの領域は興味深い。
ズ）するダイズゲノムクローンpE2019の7000塩基HindII
I断片（H2）を同定した（図３）。pE2019遺伝子をH2の
左末端Bam HI小断片（BHと呼ばれる―図３）にマップし
た、というのはこの領域はｃＤＮＡ2019プローブに相補
結合する唯一の部分であることが示されたからである。
この断片を配列決定の研究およびTi−プラスミドへの導
入のために選別した。Ｍ13キロデリージョン戦法（Barn
es、Ｗ. Ｍ．およびBevan（1983）Nucleic AcidsResear
ch 11 ：349 -368）によりBH断片の配列を決定しそして
この小断片を欠失した一連の欠失ファージを構築した、
ドロソフィラヒートショック共通配列（CTxGAAxxTTCxA
G）（図４）について78％の相同性を示す。またSV40反
復塩基対(GGTGTGGAAAG)(図４)について73％の相同性を
示すいくつかの領域は興味深い。
【００６１】H2において転写およびcDNA相同性の位置に
極性があること（コード配列は図５、６および７参照）
から遺伝子2019に対するプロモーターがH2上でサブ断片
BHのBam HI部位の右側約190 塩基対の所に位置すること
が証明された。この2019遺伝子の極性はH2の一番左のBa
m HI部位の157 ヌクレオチド上流から左HindIII部位に
向かって５’−から３’−と進む。この結論はM13一本
鎖プローブのハイブリダイゼーションおよびダイズヒー
トショックRNAを用いたS1雑種保存（hybrid protectio
n）の研究をもとにしている。全ての３つの遺伝子の５'
末端は“TATA”モチーフ（TTAAATAC）の最初のT から3
2から28塩基の位置にあり、この領域がプロモーターと
して作用することを示唆している。
極性があること（コード配列は図５、６および７参照）
から遺伝子2019に対するプロモーターがH2上でサブ断片
BHのBam HI部位の右側約190 塩基対の所に位置すること
が証明された。この2019遺伝子の極性はH2の一番左のBa
m HI部位の157 ヌクレオチド上流から左HindIII部位に
向かって５’−から３’−と進む。この結論はM13一本
鎖プローブのハイブリダイゼーションおよびダイズヒー
トショックRNAを用いたS1雑種保存（hybrid protectio
n）の研究をもとにしている。全ての３つの遺伝子の５'
末端は“TATA”モチーフ（TTAAATAC）の最初のT から3
2から28塩基の位置にあり、この領域がプロモーターと
して作用することを示唆している。
【００６２】ナザン法およびヒートショックRNAを用い
たS1雑種保存の結果から転写物は長さが680-900塩基
で、長さ約150塩基と示されているpoly（Ａ）末部を含
まないことが示された。cDNAは全長より短く（約350塩
基）そしてオリゴ−dTをプライマーとして得たので従っ
てそれは転写物の3 '-部分に相当する。従って、BH断片
上のcDNA相同性の位置より、転写物は３'-から５'-方向
に部位590からBam HI部位へそしてそれを越えて伸びて
いるにちがいない。この結論は３'-標識BH断片を用いた
S1雑種保存マッピングにより確実になった。590 ±10塩
基対の保存されたバンドが見られ、これはcDNA相同性の
３' - 末端と一致する、そして５' 末端およびプロモー
ターがBam HI部位の右方に存在することが示された。ク
ローンpE2019のコード配列を完成した（図５、６および
７）。図中の空欄はヌクレオチド配列もしくはアミノ酸
配列と同一であることを示す。図中の*Ｄelはコドンの
削除を示す。それは462塩基対のオープンリーデイング
フレームから成る。さらに、ATG翻訳開始コドンの5'側
（すなわち、上流）の291塩基対の配列を決定した。こ
れら291の塩基対はプロモーター領域の本質的な因子、
すなわち、CAATボックス、TAATAボックスそして転写開
始点の全てを含む。その上、「共通配列」があり（翻訳
開始コドンATG から131-144塩基対上流にあり5'CTxGAAx
xTTCxAG-3'の配列を持つ）これはすべてのヒートショッ
ク遺伝子で見い出されておりしかもヒート誘導に必要と
される（Pelham、H.R.B および M.Bienz（1982）EMBOJ.
11：1473-1477）。仮にこの共通配列がプロモーター領
域から欠失したならば、ヒートショックのストレスまた
は他のいかなるストレスによってもヒートショック遺伝
子は誘導されない。翻訳開始コドンから172-185 塩基対
上流に、SV-40エンハンサー配列に高度に相同な別の配
列が生じているが、目下この発見の意義は定かではな
い。保存配列は、はるか上流に存在しそしてこの配列は
また２つのドロソフィラヒートショックプロモーターの
よく似た位置で見つけられている。最後に、停止コドン
TGA の3'側（すなわち、下流）上の731の塩基対の配列
を明らかにした（図８にこの配列の一部を示す）。
たS1雑種保存の結果から転写物は長さが680-900塩基
で、長さ約150塩基と示されているpoly（Ａ）末部を含
まないことが示された。cDNAは全長より短く（約350塩
基）そしてオリゴ−dTをプライマーとして得たので従っ
てそれは転写物の3 '-部分に相当する。従って、BH断片
上のcDNA相同性の位置より、転写物は３'-から５'-方向
に部位590からBam HI部位へそしてそれを越えて伸びて
いるにちがいない。この結論は３'-標識BH断片を用いた
S1雑種保存マッピングにより確実になった。590 ±10塩
基対の保存されたバンドが見られ、これはcDNA相同性の
３' - 末端と一致する、そして５' 末端およびプロモー
ターがBam HI部位の右方に存在することが示された。ク
ローンpE2019のコード配列を完成した（図５、６および
７）。図中の空欄はヌクレオチド配列もしくはアミノ酸
配列と同一であることを示す。図中の*Ｄelはコドンの
削除を示す。それは462塩基対のオープンリーデイング
フレームから成る。さらに、ATG翻訳開始コドンの5'側
（すなわち、上流）の291塩基対の配列を決定した。こ
れら291の塩基対はプロモーター領域の本質的な因子、
すなわち、CAATボックス、TAATAボックスそして転写開
始点の全てを含む。その上、「共通配列」があり（翻訳
開始コドンATG から131-144塩基対上流にあり5'CTxGAAx
xTTCxAG-3'の配列を持つ）これはすべてのヒートショッ
ク遺伝子で見い出されておりしかもヒート誘導に必要と
される（Pelham、H.R.B および M.Bienz（1982）EMBOJ.
11：1473-1477）。仮にこの共通配列がプロモーター領
域から欠失したならば、ヒートショックのストレスまた
は他のいかなるストレスによってもヒートショック遺伝
子は誘導されない。翻訳開始コドンから172-185 塩基対
上流に、SV-40エンハンサー配列に高度に相同な別の配
列が生じているが、目下この発見の意義は定かではな
い。保存配列は、はるか上流に存在しそしてこの配列は
また２つのドロソフィラヒートショックプロモーターの
よく似た位置で見つけられている。最後に、停止コドン
TGA の3'側（すなわち、下流）上の731の塩基対の配列
を明らかにした（図８にこの配列の一部を示す）。
【００６３】他の３つのヒートショック遺伝子（すなわ
ちクローンpM2005、pL2005およびhs6871）のコード配列
およびフランキング配列を決定した。pM2005について
は、423塩基対のオープンリーデングフレームも決定し
た（図５、６および７）。同様に翻訳開始コドンATG か
ら418 塩基対上流（そして前節中でpE2019に対して記載
した全てのプロモーター調節配列を含んでいる）（図
４）、および停止コドンTAAから171塩基対下流（そのう
ち100 塩基対を図８に示す）も決定した。pL2005につい
ては、450塩基対のオープンリーデングフレーム（図
５、６および７）、翻訳開始コドンATG から422 上流
（そして前節中でpE2019に対して記載したすべてのプロ
モーター調節配列を含んでいる）（図４）、および停止
コドンTAA から842 塩基対下流（そのうち100 塩基対を
図８に示す）を決定した。
ちクローンpM2005、pL2005およびhs6871）のコード配列
およびフランキング配列を決定した。pM2005について
は、423塩基対のオープンリーデングフレームも決定し
た（図５、６および７）。同様に翻訳開始コドンATG か
ら418 塩基対上流（そして前節中でpE2019に対して記載
した全てのプロモーター調節配列を含んでいる）（図
４）、および停止コドンTAAから171塩基対下流（そのう
ち100 塩基対を図８に示す）も決定した。pL2005につい
ては、450塩基対のオープンリーデングフレーム（図
５、６および７）、翻訳開始コドンATG から422 上流
（そして前節中でpE2019に対して記載したすべてのプロ
モーター調節配列を含んでいる）（図４）、および停止
コドンTAA から842 塩基対下流（そのうち100 塩基対を
図８に示す）を決定した。
【００６４】hs6871については、459 塩基対のオープン
リーデングフレーム（図５、６および７）、翻訳開始コ
ドンATG から456 上流（そして前節中でpE2019に対して
記載した全てのプロモーター調節配列を含む）（図
４）、および停止コドンTAA から943 塩基対下流（その
うち100 塩基対を図８に示す）を決定した。これら４つ
のヒートショック遺伝子はコード領域中に実質的に相同
な配列を有する（図５、６および７）。上流プロモータ
ー領域（図４）ではクローンpE2019、pM2005 およびpL2
005は実質的に相同な配列を有するが、これら３つのク
ローンの塩基配列とhs6871の塩基配列の間には多くの違
いがある。しかしながら、４つのクローン全ての“ヒー
トショック共通配列”すなわち CTxGAAxxTACxxxの間に
は強い類似性があることは注目すべきである（図４）。
この４つの配列について停止コドンの下流にある100 塩
基対のデータを示す（図８）。非常に小さな配列相同性
が生じていることが明らかである。重要なことに、これ
ら４つのダイズヒートショック遺伝子のコード配列、上
流プロモーター領域（すなわち翻訳開始コドンの５’
側）および下流フランキング領域（すなわち停止コドン
の３’側）はドロソフィラヒートショック遺伝子の対応
する領域とほとんど類似性を持たない（Hacket、R.W.
および J.T.Lis（1983）Nucleic Acids Res.11：7011-7
031 ：Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｔ．Ｄ．およびＥ．Ａ．Ｃｒａ
ｉｇ （1982）Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79：2360-2
364 ；Southgate,R.等（1983）J.Mol.Biol.165：35- 6
7）。ドロソフィラおよびダイズヒートショック遺伝子
由来のプロモーター領域の「共通配列」の間には類似性
はあるが、ダイズヒートショック遺伝子のプロモーター
領域はドロソフィラ遺伝子に特徴的な逆反復配列を持た
ない。
リーデングフレーム（図５、６および７）、翻訳開始コ
ドンATG から456 上流（そして前節中でpE2019に対して
記載した全てのプロモーター調節配列を含む）（図
４）、および停止コドンTAA から943 塩基対下流（その
うち100 塩基対を図８に示す）を決定した。これら４つ
のヒートショック遺伝子はコード領域中に実質的に相同
な配列を有する（図５、６および７）。上流プロモータ
ー領域（図４）ではクローンpE2019、pM2005 およびpL2
005は実質的に相同な配列を有するが、これら３つのク
ローンの塩基配列とhs6871の塩基配列の間には多くの違
いがある。しかしながら、４つのクローン全ての“ヒー
トショック共通配列”すなわち CTxGAAxxTACxxxの間に
は強い類似性があることは注目すべきである（図４）。
この４つの配列について停止コドンの下流にある100 塩
基対のデータを示す（図８）。非常に小さな配列相同性
が生じていることが明らかである。重要なことに、これ
ら４つのダイズヒートショック遺伝子のコード配列、上
流プロモーター領域（すなわち翻訳開始コドンの５’
側）および下流フランキング領域（すなわち停止コドン
の３’側）はドロソフィラヒートショック遺伝子の対応
する領域とほとんど類似性を持たない（Hacket、R.W.
および J.T.Lis（1983）Nucleic Acids Res.11：7011-7
031 ：Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｔ．Ｄ．およびＥ．Ａ．Ｃｒａ
ｉｇ （1982）Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79：2360-2
364 ；Southgate,R.等（1983）J.Mol.Biol.165：35- 6
7）。ドロソフィラおよびダイズヒートショック遺伝子
由来のプロモーター領域の「共通配列」の間には類似性
はあるが、ダイズヒートショック遺伝子のプロモーター
領域はドロソフィラ遺伝子に特徴的な逆反復配列を持た
ない。
【００６５】ダイズヒートショック遺伝子のプロモータ
ー領域は、外来遺伝子もしくはダイズ遺伝子の一時的な
活性化が必要な時はいつでも多くの方法で利用すること
ができる。〔外来遺伝子とはここではダイズ以外のいか
なる種のゲノムにおいても正常に見い出されるあらゆる
遺伝子として定義される。〕例えば、アグロバクテリウ
ム・チューメファシエンス（Agrobacterium tumefacien
s）の野生株Ti- プラスミド由来のＴ−ＤＮＡを植物ゲ
ノム内へ転送した場合、その結果形質転換した植物細胞
は腫瘍である。組織培養中のこれらの形質転換した腫瘍
植物細胞は完全な植物体の再生には利用できない。一
方、仮に“能力を失った”T-DNA 領域を使えば、形質転
換した植物細胞から組織培養により完全な植物体を再生
できるが、しかし形質転換した細胞と形質転換していな
い細胞とを区別することは難しい。本発明ではヒートシ
ョックを誘導できる制御下でエセシリア・コリー（E.co
li）のβ- ガラクトシダーゼ遺伝子をダイズヒートショ
ック遺伝子プロモーターで置き換えることによりこの困
難は除けた。この組み換え構造はダイズヒートショック
プロモーター領域およびヒートショック遺伝子の５' 末
端における２４のコドンをコードとする領域を有する
（実施例５参照）。
ー領域は、外来遺伝子もしくはダイズ遺伝子の一時的な
活性化が必要な時はいつでも多くの方法で利用すること
ができる。〔外来遺伝子とはここではダイズ以外のいか
なる種のゲノムにおいても正常に見い出されるあらゆる
遺伝子として定義される。〕例えば、アグロバクテリウ
ム・チューメファシエンス（Agrobacterium tumefacien
s）の野生株Ti- プラスミド由来のＴ−ＤＮＡを植物ゲ
ノム内へ転送した場合、その結果形質転換した植物細胞
は腫瘍である。組織培養中のこれらの形質転換した腫瘍
植物細胞は完全な植物体の再生には利用できない。一
方、仮に“能力を失った”T-DNA 領域を使えば、形質転
換した植物細胞から組織培養により完全な植物体を再生
できるが、しかし形質転換した細胞と形質転換していな
い細胞とを区別することは難しい。本発明ではヒートシ
ョックを誘導できる制御下でエセシリア・コリー（E.co
li）のβ- ガラクトシダーゼ遺伝子をダイズヒートショ
ック遺伝子プロモーターで置き換えることによりこの困
難は除けた。この組み換え構造はダイズヒートショック
プロモーター領域およびヒートショック遺伝子の５' 末
端における２４のコドンをコードとする領域を有する
（実施例５参照）。
【００６６】この組み換えＤＮＡ断片はその後Ti-プラ
スミドのＴ−DNA 内に組み込まれそして植物細胞を形質
転換するのに使われる。適当な基質存在下では、組織培
養中の形質転換細胞はヒートショック処理により青色に
生育するので形質転換していない細胞と区別できる。こ
のようにβ- ガラクトシダーゼ−ヒートショックプロモ
ーター複合体は形質転換細胞を認識する手段として利用
される。本発明はβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の例に限
らず、そして他の遺伝子も含むであろう。その遺伝子と
は植物ヒートショック遺伝子プロモーターの制御下で置
き換えられたときに特異的な植物細胞の型を認識するの
に利用し得るものである。形質転換細胞の認識に有用で
あるこのような遺伝子を、ここでは形質転換認識遺伝子
と定義する。
スミドのＴ−DNA 内に組み込まれそして植物細胞を形質
転換するのに使われる。適当な基質存在下では、組織培
養中の形質転換細胞はヒートショック処理により青色に
生育するので形質転換していない細胞と区別できる。こ
のようにβ- ガラクトシダーゼ−ヒートショックプロモ
ーター複合体は形質転換細胞を認識する手段として利用
される。本発明はβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の例に限
らず、そして他の遺伝子も含むであろう。その遺伝子と
は植物ヒートショック遺伝子プロモーターの制御下で置
き換えられたときに特異的な植物細胞の型を認識するの
に利用し得るものである。形質転換細胞の認識に有用で
あるこのような遺伝子を、ここでは形質転換認識遺伝子
と定義する。
【００６７】実施例２では一時的な発現を望む遺伝子を
ダイズヒートショックプロモーターの制御下で置き換え
ること以外は上記のプロトコールに従うのが有用であろ
う。この組み換え構造は単にダイズヒートプロモーター
領域を含むだけである、すなわちＡluI 部位（翻訳開始
コドンATG から17塩基対上流）からEco RI部位（翻訳開
始コドンATG から176 塩基対上流）まで伸びている159
塩基対だけを含む（実施例７参照）。
ダイズヒートショックプロモーターの制御下で置き換え
ること以外は上記のプロトコールに従うのが有用であろ
う。この組み換え構造は単にダイズヒートプロモーター
領域を含むだけである、すなわちＡluI 部位（翻訳開始
コドンATG から17塩基対上流）からEco RI部位（翻訳開
始コドンATG から176 塩基対上流）まで伸びている159
塩基対だけを含む（実施例７参照）。
【００６８】仮に殺虫剤蛋白質を（バシラス・チューリ
ンギエンシスの結晶性内毒素と限定はしないがそれを含
む）植物ヒートショック遺伝子プロモーター制御下で置
き換えれば、その日のヒート中に殺虫剤蛋白質の発現を
活性化することができる。この時期は昆虫の幼虫の摂食
時と一致し、従って植物に対する抵抗性が昆虫に与えら
れる。しかしこれは各日々の限定された微妙な時期のみ
である。同様に、除草剤抵抗性を与えるような遺伝子を
ヒートショック遺伝子の制御下で置き換えると、除草剤
抵抗性遺伝子がその日のヒート中に活性化した後除草剤
を野原にまくことができる。
ンギエンシスの結晶性内毒素と限定はしないがそれを含
む）植物ヒートショック遺伝子プロモーター制御下で置
き換えれば、その日のヒート中に殺虫剤蛋白質の発現を
活性化することができる。この時期は昆虫の幼虫の摂食
時と一致し、従って植物に対する抵抗性が昆虫に与えら
れる。しかしこれは各日々の限定された微妙な時期のみ
である。同様に、除草剤抵抗性を与えるような遺伝子を
ヒートショック遺伝子の制御下で置き換えると、除草剤
抵抗性遺伝子がその日のヒート中に活性化した後除草剤
を野原にまくことができる。
【００６９】
（実施例１：用いた植物試料およびヒートショック条
件）ダイズマメ（グリシンマックス変種バイネ）を湿ら
せたバーミキュライト中で暗黒、28℃-30℃のもとに３
日間発芽させた。その後植物体を2×10-3Mの2,4-ジクロ
ルフェノキシ酢酸とともにまき、24時間後成熟した胚軸
組織を収穫した。
件）ダイズマメ（グリシンマックス変種バイネ）を湿ら
せたバーミキュライト中で暗黒、28℃-30℃のもとに３
日間発芽させた。その後植物体を2×10-3Mの2,4-ジクロ
ルフェノキシ酢酸とともにまき、24時間後成熟した胚軸
組織を収穫した。
【００７０】組織を１％ショ糖、1mM K-リン酸塩（pH6.
0）、50μg/mlクロラムフェニコール、10μg/ml 2,4-ジ
クロルフェノキシ酢酸を含む緩衝液中で、28℃（コント
ロール）または40℃および42.5℃（ヒートショック）で
それぞれ、別に指定がなけれは２時間インキュベイトし
た。
0）、50μg/mlクロラムフェニコール、10μg/ml 2,4-ジ
クロルフェノキシ酢酸を含む緩衝液中で、28℃（コント
ロール）または40℃および42.5℃（ヒートショック）で
それぞれ、別に指定がなけれは２時間インキュベイトし
た。
【００７１】（実施例２：poly（Ａ）+ ＲＮＡの単離お
よびcＤＮＡ組換体クローンの構築）インキベーション
後（実施例１参照）胚軸組織から全ＲＮＡを抽出し、そ
してpoly（Ａ）+ ＲＮＡを従来の方法（Silflow,C.D.等
（1979）Biochemistry 13：2725-2731）に従って変法
（Key,J.L.等（1981）Proc.NaT.Acad.Sci.USA 78：3526
-3530）を用いて単離した。hsダイズ胚軸由来のPoly
（Ａ）+ ＲＮＡをオリゴ−（dT）−プライマー二重鎖ｃ
ＤＮＡ合成の鋳型として用いた。（Wickens,M.P.等（19
78）J.Biol.Chem.253；2485- 2495；Baulcombe,D.C.お
よびJ.L.Key（1980）J.Biol.Chem.255：8907-8913 によ
る変法）。
よびcＤＮＡ組換体クローンの構築）インキベーション
後（実施例１参照）胚軸組織から全ＲＮＡを抽出し、そ
してpoly（Ａ）+ ＲＮＡを従来の方法（Silflow,C.D.等
（1979）Biochemistry 13：2725-2731）に従って変法
（Key,J.L.等（1981）Proc.NaT.Acad.Sci.USA 78：3526
-3530）を用いて単離した。hsダイズ胚軸由来のPoly
（Ａ）+ ＲＮＡをオリゴ−（dT）−プライマー二重鎖ｃ
ＤＮＡ合成の鋳型として用いた。（Wickens,M.P.等（19
78）J.Biol.Chem.253；2485- 2495；Baulcombe,D.C.お
よびJ.L.Key（1980）J.Biol.Chem.255：8907-8913 によ
る変法）。
【００７２】さらなる変法として、第１鎖の合成は標識
せずそして20μM〔32Ｐ〕dCTP（400Ci／mM、Amersham）
をＤＮＡポリメラーゼＩ（Boehringer Mannheim）によ
る第２鎖合成に対するトレーサーとして用いた。Ｓ１−
断片化二重鎖ｃＤＮＡをショ糖密度勾配法でサイズ分画
した、ショ糖の濃度は10〜30％、緩衝液は10mM Tris-HC
l PH7.5、1mM EDTAおよび100mM NaClを含み、遠心はベ
ックマンSW50、１ローターを用いて20℃のもとで50,000
rpm ６時間行った。約0.5μg の二重鎖ｃＤＮＡ（長さ
は500 bp以上）にホモポリマーをテイリングした、末端
トランスフェラーゼ（Bethesda Research laboratorie
s）を用いて断片の3'末端にpoly（dC）を付加した（Roy
choudhury, R.およびR.Wu（1980）In：Grossman,L.,Mol
dave,K.,編集. Methods in Enzymol.Vol.65；New Yor
k：Academic Press、pp.43-62）。平均の長さ30ヌクレ
オチド／末端が合成された。
せずそして20μM〔32Ｐ〕dCTP（400Ci／mM、Amersham）
をＤＮＡポリメラーゼＩ（Boehringer Mannheim）によ
る第２鎖合成に対するトレーサーとして用いた。Ｓ１−
断片化二重鎖ｃＤＮＡをショ糖密度勾配法でサイズ分画
した、ショ糖の濃度は10〜30％、緩衝液は10mM Tris-HC
l PH7.5、1mM EDTAおよび100mM NaClを含み、遠心はベ
ックマンSW50、１ローターを用いて20℃のもとで50,000
rpm ６時間行った。約0.5μg の二重鎖ｃＤＮＡ（長さ
は500 bp以上）にホモポリマーをテイリングした、末端
トランスフェラーゼ（Bethesda Research laboratorie
s）を用いて断片の3'末端にpoly（dC）を付加した（Roy
choudhury, R.およびR.Wu（1980）In：Grossman,L.,Mol
dave,K.,編集. Methods in Enzymol.Vol.65；New Yor
k：Academic Press、pp.43-62）。平均の長さ30ヌクレ
オチド／末端が合成された。
【００７３】同様の反応により1 μgのPst I切断pBR322
にpoly（dG）を同程度テイリングした。0.7μg の（d
G）- 尾部pBR322および0.14μg の（dC）- 尾部ｃＤＮ
Ａをアニーリイング反応に用いた。アリール化した分子
を用いてエセリシア・コリー（Escherichia coli）SK15
90を形質転換させた（Kushner,S.R.（1978）In：Boyer,
H. W., Nicosia,S.編集、Genetic Engineering、Amster
dam：Elsevier／NorthHolland Biomedical Press、pp 1
7-23 ）。形質転換体をテトラサイクリン含有培地で選
択し、そのうち99％がTcR ApS表現型で示されるような
組み換えプラスミドを有していた。
にpoly（dG）を同程度テイリングした。0.7μg の（d
G）- 尾部pBR322および0.14μg の（dC）- 尾部ｃＤＮ
Ａをアニーリイング反応に用いた。アリール化した分子
を用いてエセリシア・コリー（Escherichia coli）SK15
90を形質転換させた（Kushner,S.R.（1978）In：Boyer,
H. W., Nicosia,S.編集、Genetic Engineering、Amster
dam：Elsevier／NorthHolland Biomedical Press、pp 1
7-23 ）。形質転換体をテトラサイクリン含有培地で選
択し、そのうち99％がTcR ApS表現型で示されるような
組み換えプラスミドを有していた。
【００７４】（実施例３：ダイズゲノムＤＮＡライブラ
リーの選別）本質的には従来の方法で（Nagao,R.等（19
81）ＤＮＡ 2:1-9）精製核から高分子量ＤＮＡを単離し
た。ダイズゲノムＤＮＡライブラリーの選別、λシャロ
ン4AベクターのEco RI部位へのクローン化を従来の方法
（Nagao,R.T.等（1981）DNA1:1-9）に基づいて行った。
このときｃＤＮＡクローンの放射活性標識挿入プローグ
を用いたｃＤＮＡクローンはヒートショック処理したダ
イズ胚軸のpoly（Ａ）+ ＲＮＡから合成されたものであ
る（Schoffl,F.およびJ.Key （1982）J.Mol.Appl.Gene
t. 1：301-314 ）。
リーの選別）本質的には従来の方法で（Nagao,R.等（19
81）ＤＮＡ 2:1-9）精製核から高分子量ＤＮＡを単離し
た。ダイズゲノムＤＮＡライブラリーの選別、λシャロ
ン4AベクターのEco RI部位へのクローン化を従来の方法
（Nagao,R.T.等（1981）DNA1:1-9）に基づいて行った。
このときｃＤＮＡクローンの放射活性標識挿入プローグ
を用いたｃＤＮＡクローンはヒートショック処理したダ
イズ胚軸のpoly（Ａ）+ ＲＮＡから合成されたものであ
る（Schoffl,F.およびJ.Key （1982）J.Mol.Appl.Gene
t. 1：301-314 ）。
【００７５】（実施例４：制限エンドヌクレアーゼ切断
およびｐＢＲ322 でのＤＮＡ断片のサブクローニング）
制限エンドヌクレアーゼEco RI、Hind IIIおよびPst I
によるＤＮＡ切断の分析条件は従来の方法（Maniatis,
T. 等.(1982) Molecular cloning、a Laboratory Manua
l、Cold Spring Harbor Laboratory）に基づきそして１
％アガロースゲル上でのＤＮＡ断片の標準的な電気泳動
もまた従来の方法（Schoffl,F.およびA.Puhler（1979）
Genet.Res.Camb. 34：287-301）に依った。ダイズ染色
体ＤＮＡの切断には10μg ／レーンそしてプラスミドも
しくはλ-ＤＮＡの切断には約0.5μg ／レーン使用し
た。ダイズｒＤＮＡプローブ（Dr. R.Nagao、Universit
y ofGeorgiaから親切にも頂いた）を用いたサザンブロ
ットハイブリダイゼーションによって、ダイズ染色体Ｄ
ＮＡの切断が完全であるかどうか調べた。
およびｐＢＲ322 でのＤＮＡ断片のサブクローニング）
制限エンドヌクレアーゼEco RI、Hind IIIおよびPst I
によるＤＮＡ切断の分析条件は従来の方法（Maniatis,
T. 等.(1982) Molecular cloning、a Laboratory Manua
l、Cold Spring Harbor Laboratory）に基づきそして１
％アガロースゲル上でのＤＮＡ断片の標準的な電気泳動
もまた従来の方法（Schoffl,F.およびA.Puhler（1979）
Genet.Res.Camb. 34：287-301）に依った。ダイズ染色
体ＤＮＡの切断には10μg ／レーンそしてプラスミドも
しくはλ-ＤＮＡの切断には約0.5μg ／レーン使用し
た。ダイズｒＤＮＡプローブ（Dr. R.Nagao、Universit
y ofGeorgiaから親切にも頂いた）を用いたサザンブロ
ットハイブリダイゼーションによって、ダイズ染色体Ｄ
ＮＡの切断が完全であるかどうか調べた。
【００７６】断片の大きさは一般に、λ-ＤＮＡ断片（E
co RI、HindIII、 Eco RI／HindIII）と同じゲルに流し
てこれと比較することにより決定した。ダイズゲノムＤ
ＮＡのEco RI／HindIII断片をpBR322の各部位にサブク
ローニングするのは従来の方法（Maniatis、T. 等（198
2）前出）に基づいて行った。潜在性組み換えクローン
の選別は、クローン化ＤＮＡ断片のサイズをp70参考に
用いて測定することにより行った。特異的クローンの固
定は、クローン1968のｃＤＮＡプローブを用いた、サザ
ンブロットハイブリダイゼーションにより行った（Scho
ffl,F.およびJ.L.Key（1982）J.Mol.Appl.Genet. 1：30
1-314 ）。
co RI、HindIII、 Eco RI／HindIII）と同じゲルに流し
てこれと比較することにより決定した。ダイズゲノムＤ
ＮＡのEco RI／HindIII断片をpBR322の各部位にサブク
ローニングするのは従来の方法（Maniatis、T. 等（198
2）前出）に基づいて行った。潜在性組み換えクローン
の選別は、クローン化ＤＮＡ断片のサイズをp70参考に
用いて測定することにより行った。特異的クローンの固
定は、クローン1968のｃＤＮＡプローブを用いた、サザ
ンブロットハイブリダイゼーションにより行った（Scho
ffl,F.およびJ.L.Key（1982）J.Mol.Appl.Genet. 1：30
1-314 ）。
【００７７】（実施例５：組み換えプラスミドの構築、
このプラスミドは、ダイズヒートショック遺伝子2019の
コード領域に挿入されたβ- ガラクトシダーゼ遺伝子を
保持する）この構築の出発材料（ここでは組み換えダイ
ズヒートショック遺伝子と定義する）は、ヒートショッ
ク遺伝子2019のプロモーターを保持する７キロベース
（kb）のHindIII断片（H2）、同じヒートショック遺伝
子のコード配列およびこのコード配列の読み取り鎖の
３’側上のフランキング配列である（以後、hs2019と記
す）（図９）。このＨ２配列を制限エンドヌクレアーゼ
Eco RIで切断し、そしてその産物をアガロースゲル電気
泳動により分離する。それからヒートショック遺伝子20
19の全構成要素を含むような1.78kbのHindIII―Eco RI
を、前もってHindIIIおよびEco RIで切断したプラスミ
ドpBR322内へ挿入する。この組み換えプラスミド（pBR3
22-hs2019）をE.coli JM101へ形質転換し、ここで増幅
させる。増幅させた後、pBR322-hs2019をBam HIで部分
切断し、そしてＺ遺伝子（β―ガラクトシダーゼをコー
ドする）をhs2019 Bam HI部位に挿入する。このＺ遺伝
子は両末端にポリリンカーを有している（Casadaban,M.
J.等（1983）Methods Enzymol.100 ：293-308）。Ｚ遺
伝子の各末端上のポリリンカーを前もってBam HIで切断
しておく。Ｚ遺伝子がpBR322のBam HI部位にも挿入する
可能性があることに注意すべきである。この２部位にお
ける挿入は制限マッピングにより識別できる。hs2019
遺伝子のBam HI部位はhs2019コード領域のコドン24に位
置し、従ってこの構築物はhs2019遺伝子の最初の24コド
ンに続いてＺ遺伝子インフレームのコード領域を保持す
ることになる。pBR322に挿入されたこの組み換えダイズ
ヒートショック遺伝子は以下pBR322／SB13と呼ぶ（すな
わちhs2019プロモーター−hs2019コード配列の24コドン
-Ｚ遺伝子−hs2019コード配列−３' フランキング配列
を有するpBR322）。SB13（以下、組み換えダイズヒート
ショック遺伝子と記す）はHindIIIおよびEco RIで切断
してpBR322／SB13から回収し続いてその産物をアガロー
スゲル電気泳動で分離することが可能である。
このプラスミドは、ダイズヒートショック遺伝子2019の
コード領域に挿入されたβ- ガラクトシダーゼ遺伝子を
保持する）この構築の出発材料（ここでは組み換えダイ
ズヒートショック遺伝子と定義する）は、ヒートショッ
ク遺伝子2019のプロモーターを保持する７キロベース
（kb）のHindIII断片（H2）、同じヒートショック遺伝
子のコード配列およびこのコード配列の読み取り鎖の
３’側上のフランキング配列である（以後、hs2019と記
す）（図９）。このＨ２配列を制限エンドヌクレアーゼ
Eco RIで切断し、そしてその産物をアガロースゲル電気
泳動により分離する。それからヒートショック遺伝子20
19の全構成要素を含むような1.78kbのHindIII―Eco RI
を、前もってHindIIIおよびEco RIで切断したプラスミ
ドpBR322内へ挿入する。この組み換えプラスミド（pBR3
22-hs2019）をE.coli JM101へ形質転換し、ここで増幅
させる。増幅させた後、pBR322-hs2019をBam HIで部分
切断し、そしてＺ遺伝子（β―ガラクトシダーゼをコー
ドする）をhs2019 Bam HI部位に挿入する。このＺ遺伝
子は両末端にポリリンカーを有している（Casadaban,M.
J.等（1983）Methods Enzymol.100 ：293-308）。Ｚ遺
伝子の各末端上のポリリンカーを前もってBam HIで切断
しておく。Ｚ遺伝子がpBR322のBam HI部位にも挿入する
可能性があることに注意すべきである。この２部位にお
ける挿入は制限マッピングにより識別できる。hs2019
遺伝子のBam HI部位はhs2019コード領域のコドン24に位
置し、従ってこの構築物はhs2019遺伝子の最初の24コド
ンに続いてＺ遺伝子インフレームのコード領域を保持す
ることになる。pBR322に挿入されたこの組み換えダイズ
ヒートショック遺伝子は以下pBR322／SB13と呼ぶ（すな
わちhs2019プロモーター−hs2019コード配列の24コドン
-Ｚ遺伝子−hs2019コード配列−３' フランキング配列
を有するpBR322）。SB13（以下、組み換えダイズヒート
ショック遺伝子と記す）はHindIIIおよびEco RIで切断
してpBR322／SB13から回収し続いてその産物をアガロー
スゲル電気泳動で分離することが可能である。
【００７８】（実施例６：ダイズhs-プロモーター−β-
ガラクトシダーゼ−hsコード−hs3'−尾部（すなわ
ち、SB13）の、アグロバクテリウム・チューメファシエ
ンス（Agrobacterium tumefaciens）Ti-プラスミドへの
取り込み）pBR322およびアグロバクテリウム・チューメ
ファシエンス（A.tumefaciens）のTi-プラスミドのＴL
−ＤＮＡを保持するＴ−ＤＮＡシャトルベクターp233Ｇ
をアグリジェネテイクスアドバンストリサーチラボラト
リー、マジソン、ウイスコンシン（the Agrigenetics A
dvanced Research Laboratory、Madison、Wisconsin）
から得た。このＴ−ＤＮＡシャトルベクター（p233Ｇ）
は E. coli JM101 へ形質転換されていた。pBR322はア
ンピシリン（ampr）およびテトラサイクリン(tetr）の
いずれにも抵抗性であるが、p233G はamprにのみ抵抗性
である。というのはtetr遺伝子中にＴL−ＤＮＡが挿入
されてしまっており、従ってその活性を破壊するからで
ある（図１０）。増殖させた後、p233Ｇを単離し、そし
てアグロバクテリウム・チューメファシエンス（A.tume
faciens）株15955由来のT-ＤＮＡの転写体10番中のSma
I 制限エンドヌクレアーゼ部位で切断する（Barker,R.
F,等（1983）Plant Mol.Biol. 2：335-350）。このSma
I部位にBgl IIリンカーを結合してBgl IIで切断する。
ガラクトシダーゼ−hsコード−hs3'−尾部（すなわ
ち、SB13）の、アグロバクテリウム・チューメファシエ
ンス（Agrobacterium tumefaciens）Ti-プラスミドへの
取り込み）pBR322およびアグロバクテリウム・チューメ
ファシエンス（A.tumefaciens）のTi-プラスミドのＴL
−ＤＮＡを保持するＴ−ＤＮＡシャトルベクターp233Ｇ
をアグリジェネテイクスアドバンストリサーチラボラト
リー、マジソン、ウイスコンシン（the Agrigenetics A
dvanced Research Laboratory、Madison、Wisconsin）
から得た。このＴ−ＤＮＡシャトルベクター（p233Ｇ）
は E. coli JM101 へ形質転換されていた。pBR322はア
ンピシリン（ampr）およびテトラサイクリン(tetr）の
いずれにも抵抗性であるが、p233G はamprにのみ抵抗性
である。というのはtetr遺伝子中にＴL−ＤＮＡが挿入
されてしまっており、従ってその活性を破壊するからで
ある（図１０）。増殖させた後、p233Ｇを単離し、そし
てアグロバクテリウム・チューメファシエンス（A.tume
faciens）株15955由来のT-ＤＮＡの転写体10番中のSma
I 制限エンドヌクレアーゼ部位で切断する（Barker,R.
F,等（1983）Plant Mol.Biol. 2：335-350）。このSma
I部位にBgl IIリンカーを結合してBgl IIで切断する。
【００７９】SB13、Hind IIIおよびEco RIでpBR322／SB
13を切断して前もって回収したものには体鎖末端が突き
出ており、これはこれら制限エンドヌクレアーゼの作用
で生じたものである。これらの重なりをＤＮＡポリメラ
ーゼI （クレノー断片）を用いてふさぎ、そしてBgl II
リンカーをブラント末端に結合する（図１０）。
13を切断して前もって回収したものには体鎖末端が突き
出ており、これはこれら制限エンドヌクレアーゼの作用
で生じたものである。これらの重なりをＤＮＡポリメラ
ーゼI （クレノー断片）を用いてふさぎ、そしてBgl II
リンカーをブラント末端に結合する（図１０）。
【００８０】その後SB13をBgl II制限エンドヌクレアー
ゼで切断し、 そしてBgl II断片をアガロースゲル電気
泳動で分離する。Bgl II制限部位がhs2019 mＲＮＡの
３' 末端から39塩基対で生じること（図３）、従ってこ
のBgl II部位はBgl II断片の一端に相当することが注目
されるであろう。この理由から、SB13断片の名称はSB1
3'と変わる。Bgl II断片はその後線状化p233Ｇ、すなわ
ちT-ＤＮＡシャトルベクター内へ挿入し、その結果プラ
スミドp233Ｇ／SB13'（ここでは共にとりこまれた組み
換えＤＮＡ断片と定義する）ができる、そしてこれをE.
coli株JM101へ形質転換する。増幅させた後、以下
（１）、（２）および（３）を用いてトリプルマッチン
グを行う、（１）E.coli株のヘルパープラスミド（pRK2
013）、（２）E.coli JM101のプラスミドp233Ｇ／SB1
3'、（３）Ti- プラスミドを含むアグロバクテリウムチ
ューメファシエンス（A.tumefaciens）株15955（図１
１）。15955株はストレプトマイシン抵抗性である（str
r）。pRK2013 および組み換えシャトルベクターp233Ｇ
／SB13' は複製開始点を有するが、これらはE.coli株で
は機能するがアグロバクテリウム・チューメファシエン
ス（A.tumefaciens）では機能しない。従ってヘルパー
プラスミドは、正常では転送することができないような
第２のプラスミドをある細菌株から他へ転送するのを促
進するプラスミドとして定義することができる。しか
し、pBR322は動員部位（mob）を有しこれはpRK2013の転
送遺伝子（tra）によって認識されるので従って組み換
えシャトルベクターp233Ｇ／SB13' は、アグロバクテリ
ウム・チューメファシエンス（A.tumefaciens）に転送
され得る。
ゼで切断し、 そしてBgl II断片をアガロースゲル電気
泳動で分離する。Bgl II制限部位がhs2019 mＲＮＡの
３' 末端から39塩基対で生じること（図３）、従ってこ
のBgl II部位はBgl II断片の一端に相当することが注目
されるであろう。この理由から、SB13断片の名称はSB1
3'と変わる。Bgl II断片はその後線状化p233Ｇ、すなわ
ちT-ＤＮＡシャトルベクター内へ挿入し、その結果プラ
スミドp233Ｇ／SB13'（ここでは共にとりこまれた組み
換えＤＮＡ断片と定義する）ができる、そしてこれをE.
coli株JM101へ形質転換する。増幅させた後、以下
（１）、（２）および（３）を用いてトリプルマッチン
グを行う、（１）E.coli株のヘルパープラスミド（pRK2
013）、（２）E.coli JM101のプラスミドp233Ｇ／SB1
3'、（３）Ti- プラスミドを含むアグロバクテリウムチ
ューメファシエンス（A.tumefaciens）株15955（図１
１）。15955株はストレプトマイシン抵抗性である（str
r）。pRK2013 および組み換えシャトルベクターp233Ｇ
／SB13' は複製開始点を有するが、これらはE.coli株で
は機能するがアグロバクテリウム・チューメファシエン
ス（A.tumefaciens）では機能しない。従ってヘルパー
プラスミドは、正常では転送することができないような
第２のプラスミドをある細菌株から他へ転送するのを促
進するプラスミドとして定義することができる。しか
し、pBR322は動員部位（mob）を有しこれはpRK2013の転
送遺伝子（tra）によって認識されるので従って組み換
えシャトルベクターp233Ｇ／SB13' は、アグロバクテリ
ウム・チューメファシエンス（A.tumefaciens）に転送
され得る。
【００８１】しかしながら、p233Ｇ／SB13' はアグロバ
クテリウム・チューメファシエンス（A.tumefaciens）
では複製できず、よってその存在は内在性Ti- プラスミ
ドを用いた組み換え（１回の交叉もしくは２重逆交叉）
によって安定化されるにすぎない。これら３株を混合そ
して16時間インキュベイトした後組み換え内在性Ti-プ
ラスミド（すなわちTi-p233Ｇ／SB13'）をストレプトマ
イシンおよびカーベニシリンを含む培地に72時間プレー
トして選択する。ストレプトマイシンはアグロバクテリ
ウム（Agrobacterium)を選択しそしてカーベニシリンは
pBR322を選択する。アグロバクテリウムチューメファシ
エンス（A.tumefaciens）株15955内の組み換えTi-p233
Ｇ／SB13'プロモータープラスミドは今や利用可能であ
る。
クテリウム・チューメファシエンス（A.tumefaciens）
では複製できず、よってその存在は内在性Ti- プラスミ
ドを用いた組み換え（１回の交叉もしくは２重逆交叉）
によって安定化されるにすぎない。これら３株を混合そ
して16時間インキュベイトした後組み換え内在性Ti-プ
ラスミド（すなわちTi-p233Ｇ／SB13'）をストレプトマ
イシンおよびカーベニシリンを含む培地に72時間プレー
トして選択する。ストレプトマイシンはアグロバクテリ
ウム（Agrobacterium)を選択しそしてカーベニシリンは
pBR322を選択する。アグロバクテリウムチューメファシ
エンス（A.tumefaciens）株15955内の組み換えTi-p233
Ｇ／SB13'プロモータープラスミドは今や利用可能であ
る。
【００８２】今、組み換えTi- p233Ｇ／SB13' 内在性プ
ラスミドはβ- ガラクトシダーゼ誘導遺伝子（すなわ
ち、Ｚ遺伝子）を保持し、この遺伝子はTi- プラスミド
のＴ-ＤＮＡ内のhs2019ヒートショックプクロモーター
の制御下にありまたアグロバクテリテリム・チューメフ
ァシエンス（A.tumefaciens）株15955で安定な形で存在
する。この細菌を植物または植物培養細胞に感染させる
とＴ-ＤＮＡは植物ゲノムへと転送され得る。このよう
にして形質転換した植物組織または植物細胞はＺ遺伝子
（ここでは形質転換認識遺伝子と定義する）の発現によ
り認識することが可能である、すなわちＺ遺伝子が発現
すると５−ブロモ―４―クロル−３−インドリル−β-
Ｄ- ガラクトシダーゼ（Ｘ−gal)を含む培地で熱処理し
た後青色に生育する（Miller, J.M.（ed.）（1975）Exp
eriments in Molecular Genetics.Cold Spring Harb.La
b.、Cold SpringHarbor、New York）。最も重要なのは
この青色の発現が単に一時的であることである。
ラスミドはβ- ガラクトシダーゼ誘導遺伝子（すなわ
ち、Ｚ遺伝子）を保持し、この遺伝子はTi- プラスミド
のＴ-ＤＮＡ内のhs2019ヒートショックプクロモーター
の制御下にありまたアグロバクテリテリム・チューメフ
ァシエンス（A.tumefaciens）株15955で安定な形で存在
する。この細菌を植物または植物培養細胞に感染させる
とＴ-ＤＮＡは植物ゲノムへと転送され得る。このよう
にして形質転換した植物組織または植物細胞はＺ遺伝子
（ここでは形質転換認識遺伝子と定義する）の発現によ
り認識することが可能である、すなわちＺ遺伝子が発現
すると５−ブロモ―４―クロル−３−インドリル−β-
Ｄ- ガラクトシダーゼ（Ｘ−gal)を含む培地で熱処理し
た後青色に生育する（Miller, J.M.（ed.）（1975）Exp
eriments in Molecular Genetics.Cold Spring Harb.La
b.、Cold SpringHarbor、New York）。最も重要なのは
この青色の発現が単に一時的であることである。
【００８３】（実施例７：ダイズのヒートショック遺伝
子2019からのヒートショックプロモーターの単離および
このヒートショックプロモーターのプラスミドp233Ｇ内
ＴL−ＤＮＡへの挿入）遺伝子2019ヒートショックプロ
モーター単離の出発材料はpUC８由来クローンBE250であ
る（図３）。プラスミドpUC８―BE250はH2のBam HI-Eco
RI小断片を保持し、このBam HI-Eco RI小断片はヒート
ショック遺伝子2019のプロモーターおよびコード領域の
一部を含む。このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼ
Alu Iで切断しそしてプロモーター含有断片を単離する
（図１１）。この断片は転写開始点の下流65塩基対に広
がりその結果翻訳されない先導配列の主要部分を含む、
しかし翻訳開始コドンは含まない。
子2019からのヒートショックプロモーターの単離および
このヒートショックプロモーターのプラスミドp233Ｇ内
ＴL−ＤＮＡへの挿入）遺伝子2019ヒートショックプロ
モーター単離の出発材料はpUC８由来クローンBE250であ
る（図３）。プラスミドpUC８―BE250はH2のBam HI-Eco
RI小断片を保持し、このBam HI-Eco RI小断片はヒート
ショック遺伝子2019のプロモーターおよびコード領域の
一部を含む。このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼ
Alu Iで切断しそしてプロモーター含有断片を単離する
（図１１）。この断片は転写開始点の下流65塩基対に広
がりその結果翻訳されない先導配列の主要部分を含む、
しかし翻訳開始コドンは含まない。
【００８４】HindIIIリンカーをこの断片のブラント末
端に結合しそしてこの結合産物をHindIIIおよびBam HI
で再切断して同様に切断されたpUC８へクローン化す
る。単離された３遺伝子（Ｅ2019、Ｍ2005、Ｌ2005）全
てに由来するヒートショックプロモーターを同様にクロ
ーン化してそれぞれhsprE2019、hsprM2005、およびhspr
L2005と呼ぶ。プラスミドp233ＧをBgl IIで切断しその
結果生じた１本鎖末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ー断片を用いてふさぐ。合成ポリリンカー（５’-GAGAT
CTAAGCTTCTAGAC- ３'、二本鎖）を、p233Ｇのこのふさ
がれたBgl II部位に結合する。このポリリンカーはBgl
II、Hind IIIおよびXba I エンドヌクレアーゼの制限部
位を有し、そしてBam HI／HindIIIを両端に有するプロ
モーター断片およびHindIII／XbaI が両端のコード領域
断片いづれもの挿入に利用される。コード領域断片は、
この断片が翻訳開始コドン以外の上流ＡＴＧ配列を含
まない限りいかなる遺伝子からも得ることができる。コ
ード断片はmＲＮＡの正確なプロセシングのためにpolyA
付着部位をともなう翻訳されない３’−尾部（AATAA
A）を有するに違いない。
端に結合しそしてこの結合産物をHindIIIおよびBam HI
で再切断して同様に切断されたpUC８へクローン化す
る。単離された３遺伝子（Ｅ2019、Ｍ2005、Ｌ2005）全
てに由来するヒートショックプロモーターを同様にクロ
ーン化してそれぞれhsprE2019、hsprM2005、およびhspr
L2005と呼ぶ。プラスミドp233ＧをBgl IIで切断しその
結果生じた１本鎖末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ー断片を用いてふさぐ。合成ポリリンカー（５’-GAGAT
CTAAGCTTCTAGAC- ３'、二本鎖）を、p233Ｇのこのふさ
がれたBgl II部位に結合する。このポリリンカーはBgl
II、Hind IIIおよびXba I エンドヌクレアーゼの制限部
位を有し、そしてBam HI／HindIIIを両端に有するプロ
モーター断片およびHindIII／XbaI が両端のコード領域
断片いづれもの挿入に利用される。コード領域断片は、
この断片が翻訳開始コドン以外の上流ＡＴＧ配列を含
まない限りいかなる遺伝子からも得ることができる。コ
ード断片はmＲＮＡの正確なプロセシングのためにpolyA
付着部位をともなう翻訳されない３’−尾部（AATAA
A）を有するに違いない。
【００８５】このようなヒートショック発現プラスミド
はその後E.coli株、例えば、JM101もしくはJM103へ形質
転換し、そしてこれは複製可能である。このような宿主
株内で増幅させた後、ヒートショック発現プラミスドを
アグロバクテリウム株へ転送し、これは実施例６で記述
済の植物細胞を形質転換するのに利用できる。
はその後E.coli株、例えば、JM101もしくはJM103へ形質
転換し、そしてこれは複製可能である。このような宿主
株内で増幅させた後、ヒートショック発現プラミスドを
アグロバクテリウム株へ転送し、これは実施例６で記述
済の植物細胞を形質転換するのに利用できる。
【００８６】（実施例８：ヒートショック遺伝子クロー
ンphs6871 からのヒートショックプロモーター配列の構
築および単離）組み換えプラスミドphs6871を作るため
のダイズヒートショック遺伝子の単離およびこの遺伝子
のpBR322への挿入の方法は報告されている（Schoffl,F.
およびJ.L.Key（1983）Plant Mol.Biol.2：269-278）。
E.coli株K12内で増殖させた後、組み換えプラスミドを
単離しそして制限エンドヌクレアーゼCfrI およびAccI
の混合物で切断する。翻訳開始コドンＡＴＧの最初のヌ
クレオチドＡに＋１の番号をつけると、これら２つの制
限エンドヌクレアーゼを用いた切断によりヌクレオチド
―314（すなわち、上記Ａの「上流」314 個のヌクレオ
チド）にわたる断片ができる（図１１）。上流とはここ
ではＤＮＡの読み取り鎖上の翻訳開始コドンＡＴＧのＡ
ヌクレオチドから５’−方向そして下流は３’−方向と
定義する。その後この断片を単離しそして制限酵素によ
り出来た１本鎖の突出部分を当業者に周知な方法（Mani
atis,T.等.1982）Molecular cloning-a laboratory man
ual.Cold Spring Harbor Laboratory）でブラントエン
ドする。そしてEco RIリンカーをこの断片の両端に付着
してＭ13mp９のEco RI部位へクローン化する。E.coliJM
103へ形質転換した後、クローン化断片を増幅させそし
てヒートショック遺伝子の読み取り鎖に相当する１本鎖
鋳型をまとめて培地へ溶出する。これら１本鎖鋳型を上
流から回収して宿主菌を除く。
ンphs6871 からのヒートショックプロモーター配列の構
築および単離）組み換えプラスミドphs6871を作るため
のダイズヒートショック遺伝子の単離およびこの遺伝子
のpBR322への挿入の方法は報告されている（Schoffl,F.
およびJ.L.Key（1983）Plant Mol.Biol.2：269-278）。
E.coli株K12内で増殖させた後、組み換えプラスミドを
単離しそして制限エンドヌクレアーゼCfrI およびAccI
の混合物で切断する。翻訳開始コドンＡＴＧの最初のヌ
クレオチドＡに＋１の番号をつけると、これら２つの制
限エンドヌクレアーゼを用いた切断によりヌクレオチド
―314（すなわち、上記Ａの「上流」314 個のヌクレオ
チド）にわたる断片ができる（図１１）。上流とはここ
ではＤＮＡの読み取り鎖上の翻訳開始コドンＡＴＧのＡ
ヌクレオチドから５’−方向そして下流は３’−方向と
定義する。その後この断片を単離しそして制限酵素によ
り出来た１本鎖の突出部分を当業者に周知な方法（Mani
atis,T.等.1982）Molecular cloning-a laboratory man
ual.Cold Spring Harbor Laboratory）でブラントエン
ドする。そしてEco RIリンカーをこの断片の両端に付着
してＭ13mp９のEco RI部位へクローン化する。E.coliJM
103へ形質転換した後、クローン化断片を増幅させそし
てヒートショック遺伝子の読み取り鎖に相当する１本鎖
鋳型をまとめて培地へ溶出する。これら１本鎖鋳型を上
流から回収して宿主菌を除く。
【００８７】４種のデオキシヌクレオチド３リン酸（う
ち１つは放射活性を有する）存在下で、４塩基対でミス
マッチがあるような合成ＤＮＡプライマー（５’−TTTC
CCGGGTCAGTCTTGTG−３’）を10倍量前もって構築してお
きこれとＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用い
て修飾された２本鎖ＤＮＡを作る。４つのミスマッチヌ
クレオチドCCGGGは下線で示してある。混合物を37℃で
十分な時間インキュベイトして複製全２周期を行わせ
る。
ち１つは放射活性を有する）存在下で、４塩基対でミス
マッチがあるような合成ＤＮＡプライマー（５’−TTTC
CCGGGTCAGTCTTGTG−３’）を10倍量前もって構築してお
きこれとＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用い
て修飾された２本鎖ＤＮＡを作る。４つのミスマッチヌ
クレオチドCCGGGは下線で示してある。混合物を37℃で
十分な時間インキュベイトして複製全２周期を行わせ
る。
【００８８】それからhs6871プロモーター領域を含む断
片を単離精製し制限エンドヌクレアーゼEco RIおよびSm
a Iで混合切断する。Eco RI混合切断する。Eco RI切断
でできた突出部をブラントエンドしこの断片（両末端と
もブラントである）をp233ＧのSma I部位へブラントエ
ンド結合させそしてこの組み換えＤＮＡプラスミドを増
幅させ適当な宿主へ形質転換する。ミスマッチ合成ＤＮ
Ａプライマーから開始した全２周期のＤＮＡ複製により
Sma I制限部位が生じることが注目されるhs6871プロモ
ーターを含む断片をp233ＧのSma I部位に両方向性で挿
入するが、この両方向性の場合hs6871プロモーター配列
の下流にSma I部位が再生されこれは外来遺伝子もしく
は興味深いことにダイズ遺伝子の挿入に利用できる。特
に、hs6871プロモーター領域の上流にはSma I部位は全
くできないことに注意すべきである。実施例７で記述し
たように、挿入ヒートショックプロモーターhs6871を有
するp233Ｇ構築物は組み換えＤＮＡプラスミドと定義す
る。
片を単離精製し制限エンドヌクレアーゼEco RIおよびSm
a Iで混合切断する。Eco RI混合切断する。Eco RI切断
でできた突出部をブラントエンドしこの断片（両末端と
もブラントである）をp233ＧのSma I部位へブラントエ
ンド結合させそしてこの組み換えＤＮＡプラスミドを増
幅させ適当な宿主へ形質転換する。ミスマッチ合成ＤＮ
Ａプライマーから開始した全２周期のＤＮＡ複製により
Sma I制限部位が生じることが注目されるhs6871プロモ
ーターを含む断片をp233ＧのSma I部位に両方向性で挿
入するが、この両方向性の場合hs6871プロモーター配列
の下流にSma I部位が再生されこれは外来遺伝子もしく
は興味深いことにダイズ遺伝子の挿入に利用できる。特
に、hs6871プロモーター領域の上流にはSma I部位は全
くできないことに注意すべきである。実施例７で記述し
たように、挿入ヒートショックプロモーターhs6871を有
するp233Ｇ構築物は組み換えＤＮＡプラスミドと定義す
る。
【００８９】外来遺伝子もしくはダイズ遺伝子が挿入さ
れたこれら組み換えＤＮＡプラスミドを（実施例７と同
様に）ヒートショック発現プラスミドと命名する。ヒー
トショック発現プラスミドの植物ゲノムへの転送を実施
例７の記述に従い完了する。
れたこれら組み換えＤＮＡプラスミドを（実施例７と同
様に）ヒートショック発現プラスミドと命名する。ヒー
トショック発現プラスミドの植物ゲノムへの転送を実施
例７の記述に従い完了する。
【００９０】
配列番号：１ 配列の長さ：２６２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：ダイズマメ 株名：グリシンマックス変種バイネ 配列の特徴 特徴を表わす記号：promoter 存在位置：1..262 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００９１】
【化１７】
【００９２】配列番号：２ 配列の長さ：３８６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：ダイズマメ 株名：グリシンマックス変種バイネ 配列の特徴 特徴を表わす記号：promoter 存在位置：1..386 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００９３】
【化１８】
【００９４】配列番号：３ 配列の長さ：１７３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ダイズマメ 株名：グリシンマックス変種バイネ 配列の特徴 特徴を表わす記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 存在位置：1..173 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００９５】
【化１９】
【００９６】配列番号：４ 配列の長さ：３０８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：ダイズマメ 株名：グリシンマックス変種バイネ 配列の特徴 特徴を表わす記号：promoter 存在位置：1..308 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００９７】
【化２０】
【図１】pE2019の制限部位および塩基配列の一部を示す
図である。
図である。
【図２】pE2019の制限部位および塩基配列の一部を示す
図である。図１と図２とでpE2019の制限部位および塩基
配列を表わす。
図である。図１と図２とでpE2019の制限部位および塩基
配列を表わす。
【図３】Ｈ2（2019）のマップを示す。
【図４】pE2019、pM2005、pL2005およびhs6871ヒートシ
ョック遺伝子プロモーターの塩基配列を示す図である。
ョック遺伝子プロモーターの塩基配列を示す図である。
【図５】pE2019、pM2005、pL2005およびhs6871ヒートシ
ョック遺伝子コード配列の塩基配列を示す図である。
ョック遺伝子コード配列の塩基配列を示す図である。
【図６】pE2019、pM2005、pL2005およびhs6871ヒートシ
ョック遺伝子コード配列の塩基配列を示す図である。
ョック遺伝子コード配列の塩基配列を示す図である。
【図７】pE2019、pM2005、pL2005およびhs6871ヒートシ
ョック遺伝子コード配列の塩基配列を示す図である。
ョック遺伝子コード配列の塩基配列を示す図である。
【図８】pE2019、pM2005、pL2005およびhs6871のコード
配列の下流領域（すなわち、停止コドンの３'側）の塩
基配列を示す図である。
配列の下流領域（すなわち、停止コドンの３'側）の塩
基配列を示す図である。
【図９】ダイズヒートショック遺伝子2019のコード領域
に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保持する組
み換えプラスミドの作成手順を示す工程図である。
に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保持する組
み換えプラスミドの作成手順を示す工程図である。
【図１０】ダイズhs−プロモーター−β−ガラクトシダ
ーゼ−hsコード−hs３’−尾部（すなわち、ＳＢ13）を
アグロバクテリウム・チューメファシエンスに組み込む
手順を示す工程図である。
ーゼ−hsコード−hs３’−尾部（すなわち、ＳＢ13）を
アグロバクテリウム・チューメファシエンスに組み込む
手順を示す工程図である。
【図１１】ダイズヒートショック遺伝子2019からのヒー
トショックプロモーターの単離およびこのヒートショッ
クプロモーターのプラスミドp233ＧのＴL−ＤＮＡへの
挿入手順を示す工程図である。
トショックプロモーターの単離およびこのヒートショッ
クプロモーターのプラスミドp233ＧのＴL−ＤＮＡへの
挿入手順を示す工程図である。
【図９】hs6871の配列および制限部位を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年８月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＥ２０１９の制限部位および塩基配列の一部
を示す図である。
を示す図である。
【図２】ｐＥ２０１９の制限部位および塩基配列の一部
を示す図である。図１と図２とでｐＥ２０１９の制限部
位および塩基配列を表わす。
を示す図である。図１と図２とでｐＥ２０１９の制限部
位および塩基配列を表わす。
【図３】Ｈ２（２０１９）のマップを示す。
【図４】ｐＥ２０１９、ｐＭ２００５、ｐＬ２００５お
よびｈｓ６８７１ヒートショック遺伝子プロモーターの
塩基配列を示す図である。
よびｈｓ６８７１ヒートショック遺伝子プロモーターの
塩基配列を示す図である。
【図５】ｐＥ２０１９、ｐＭ２００５、ｐＬ２００５お
よびｈｓ６８７１ヒートショック遺伝子コード配列の塩
基配列を示す図である。
よびｈｓ６８７１ヒートショック遺伝子コード配列の塩
基配列を示す図である。
【図６】ｐＥ２０１９、ｐＭ２００５、ｐＬ２００５お
よびｈｓ６８７１ヒートショック遺伝子コード配列の塩
基配列を示す図である。
よびｈｓ６８７１ヒートショック遺伝子コード配列の塩
基配列を示す図である。
【図７】ｐＥ２０１９、ｐＭ２００５、ｐＬ２００５お
よびｈｓ６８７１ヒートショック遺伝子コード配列の塩
基配列を示す図である。
よびｈｓ６８７１ヒートショック遺伝子コード配列の塩
基配列を示す図である。
【図８】ｐＥ２０１９、ｐＭ２００５、ｐＬ２００５お
よびｈｓ６８７１のコード配列の下流領域（すなわち、
停止コドン０３’側）の塩基配列を示す図である。
よびｈｓ６８７１のコード配列の下流領域（すなわち、
停止コドン０３’側）の塩基配列を示す図である。
【図９】ダイズヒートショック遺伝子２０１９のコード
領域に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保持す
る組み換えプラスミドの作成手順を示す工程図である。
領域に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保持す
る組み換えプラスミドの作成手順を示す工程図である。
【図１０】ダイズｈｓ−プロモーター−β−ガラクトシ
ダーゼ−ｈｓコード−ｈｓ３’−尾部（すなわち、ＳＢ
１３）をアグロバクテリウム・チューメファシエンスに
組み込む手順を示す工程図である。
ダーゼ−ｈｓコード−ｈｓ３’−尾部（すなわち、ＳＢ
１３）をアグロバクテリウム・チューメファシエンスに
組み込む手順を示す工程図である。
【図１１】ダイズヒートショック遺伝子２０１９からの
ヒートショックプロモーターの単離およびこのヒートシ
ョックプロモーターのプラスミドｐ２３３ＧのＴＬ−Ｄ
ＮＡへの挿入手順を示す工程図である。
ヒートショックプロモーターの単離およびこのヒートシ
ョックプロモーターのプラスミドｐ２３３ＧのＴＬ−Ｄ
ＮＡへの挿入手順を示す工程図である。
【図１２】ｈｓ６８７１の配列および制限部位を示す図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ (71)出願人 594063186 ザ ユニバーシティ オブ フロリダ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ Ｆ ＬＯＲＩＤＡ アメリカ合衆国 フロリダ 32611 ゲイ ンズビル，グリンター ホール 223，ザ グラジュエート スクール エンド ザ ディビジョン オブ スポンサード リ サーチ（番地なし) (71)出願人 594063197 ザ ユニバーシティ オブ ジョージア リサーチ ファウンデーション ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ Ｇ ＥＯＲＧＩＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵ ＮＤＡＴＩＯＮ アメリカ合衆国 ジョージア 30602 ア センズ，ボイド グラジュエート スタデ ィーズ リサーチ センター 612 (72)発明者 ジョー エル． キー アメリカ合衆国 コロラド 80020 ボー ルダー，テンス ストリート 3068 (72)発明者 ウィリアム ビー．ガーレィ アメリカ合衆国 フロリダ 32608 ゲイ ンズビル，サウスウェスト サーティセカ ンド プレイス ＃５ 2307 (72)発明者 ロナルド ティ．ナガオ アメリカ合衆国 ジョージア 30605 ア シンズ，ブルックウッド ドライブ 185 (72)発明者 フリードリッヒ ショエフル ドイツ連邦共和国 ディ−4800 ビーレフ ェルド 15 イン ベルクジーク 35 (72)発明者 エバ チャルネッカ アメリカ合衆国 フロリダ 32608 ゲイ ンズビル，サウスウェスト サーティセカ ンド プレイス ＃５ 2307
Claims (18)
- 【請求項１】 ダイズヒートショック遺伝子プロモータ
ーの制御下で形質転換認識遺伝子を発現させることによ
りアグロバクテリウム（Agrobacterium)種のＴ−ＤＮＡ
により形質転換した植物細胞を認識する方法であって、
次の工程を含む： (a)ダイズヒートショック遺伝子プロモーター配列、ヒ
ートショック遺伝子コード配列および該ヒートショック
遺伝子配列の下流塩基配列を有するダイズヒートショッ
ク遺伝子を単離すること、 (b)前記形質転換認識遺伝子を単離し、そしてポリリン
カーを付着すること、 (c)前記形質転換認識遺伝子を前記ダイズヒートショッ
ク遺伝子に、前記ヒートショック遺伝子コード配列およ
び前記形質転換認識遺伝子の読み取りの枠を保存するよ
うな位置に挿入して組み換えダイズヒートショック遺伝
子を生産すること、ここで、該組み換えダイズヒートシ
ョック遺伝子内では前記形質転換認識遺伝子は前記ダイ
ズヒートショック遺伝子プロモーター配列に対してその
制御下で発現できるような方向で配置されている、 (d)前記組み換えダイズヒートショック遺伝子をＴ−Ｄ
ＮＡシャトルベクターへクローニングし共に取り込まれ
た組み換えＤＮＡ断片を生産すること、 (e)前記共に取り込まれた組み換えＤＮＡ断片を細菌株
へ形質転換すること、該細菌株は前記共に取り込まれた
組み換えＤＮＡ断片の複製を維持し得る、 (f)前記細菌株をヘルパープラスミドを有する第２の細
菌株と混合すること、ここで、該ヘルパープラスミドは
前記共に取り込まれた組み換えＤＮＡ断片を第３の細菌
株に転送することができ、該第３の細菌株は前記共に取
り込まれた組み換えＤＮＡ断片の複製を維持し得ず、該
第３の細菌株は内在性プラスミドを有する、 (g)前記共に取り込まれた組み換えＤＮＡ断片および前
記内在性プラスミド間の組み換え体を選択し組み換え内
在性プラスミドを生産すること、 (h)前記第３の細菌株を植物に感染させること、ここ
で、該第３の細菌株は前記組み換え内在性プラスミドを
保持しかつそこで複製する、そして (i)前記組み換えダイズヒートショック遺伝子を保持す
る植物細胞を選択し、このようにして前記植物細胞の形
質転換を証明すること。 - 【請求項２】 前記アグロバクテリウム（Agrobacteriu
m)種がアグロバクテリウム・チユーメファシエンス（Ag
robacterium tumefaciens)である、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 前記アグロバクテリウム（Agrobacteriu
m)種がアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacteriu
m rhizogenes）である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記ダイズヒートショック遺伝子がpE20
19またはpM2005またはpL2005である、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項５】 前記ヒートショックプロモーター配列が
配列番号１の次の塩基配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である、請求項１に記載の方法。 【化１】 - 【請求項６】 前記ヒートショックプロモーター配列が
配列番号２の次の塩基配列を有するか、もしくは実質的
にそれと相同である請求項１に記載の方法。 【化２】 - 【請求項７】 前記形質転換認識配列がβ−ガラクトシ
ダーゼをコードするＺ−遺伝子である、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項８】 前記Ｔ−ＤＮＡシャトルベクターがp233
Gである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 前記第３の細菌株中の前記内在性プラス
ミドがアグロバクテリウム・チユーメファシエンス（Ag
robacterium tumefaciens)株15955のTi−プラスミドで
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 ダイズヒートショック遺伝子プロモー
ター断片の制御下で構造遺伝子を発現させる方法であっ
て、以下の工程を包含する； (a)前記ダイズヒートショック遺伝子プロモーター断片
を単離すること、 (b)前記ダイズヒートショック遺伝子プロモーター断片
をＴ−ＤＮＡシャトルベクターへクローニングし組み換
えＤＮＡプラスミドを生産すること、 (c)外来構造遺伝子もしくはダイズ遺伝子を有するＤＮ
Ａ断片を単離しそして該ＤＮＡ断片を前記組み換えＤＮ
Ａプラスミド中の前記ダイズヒートショック遺伝子プロ
モーターの読み取り鎖３’−側の位置に挿入しヒートシ
ョック発現プラスミドを生産すること、ここで、該ヒー
トショック発現プラスミド内では前記ＤＮＡ断片は前記
ダイズヒートショック遺伝子プロモーターに対してその
制御下で発現できるような方向に配置されている、 (d)前記ヒートショック発現プラスミドを第１の細菌株
へ形質転換すること、ここで、該細菌株は前記ヒートシ
ョック発現プラスミドの複製を維持し得る、 (e)前記ヒートショック発現プラスミドの複製を維持し
得る前記細菌株をヘルパープラスミドを有する第２の細
菌株と混合すること、ここで、該ヘルパープラスミドは
前記ヒートショック発現プラスミドを第３の細菌株に転
送することができ、該第３の細菌株は前記ヒートショッ
ク発現プラスミドの複製を維持し得ず、該第３の細菌株
は内在性プラスミドを有する、 (f)前記ヒートショック発現プラスミドおよび前記内在
性プラスミド間の組み換え体を選択し、組み換え内在性
プラスミドを生産すること、 (g)前記第３の細菌株を植物もしくは植物培養細胞に感
染させること、ここで該第３の細菌株は前記組み換え内
在性プラスミドを保持しかつそこで複製する、そして (h)前記外来構造遺伝子もしくはダイズ遺伝子を保持す
る植物培養細胞を前記ダイズヒートショック遺伝子プロ
モーターの制御下で選択すること、ここで、該ダイズヒ
ートショック遺伝子プロモーターは前記組み換え内在性
プラスミドから前記植物細胞へ転送されたものであり、
該外来構造遺伝子もしくはダイズ遺伝子はヒートショッ
ク処理または他のストレス処理により発現する。 - 【請求項１１】 前記ヒートショック遺伝子プロモータ
ー断片が配列番号３の次の塩基配列を有するか、もしく
は実質的にそれと相同である、請求項１０に記載の方
法。 【化３】 - 【請求項１２】 前記ヒートショック遺伝子プロモータ
ー断片が配列番号４の次の塩基配列を有するか、もしく
は実質的にそれと相同である、請求項１０に記載の方
法。 【化４】 - 【請求項１３】 前記Ｔ−ＤＮＡシャトルベクターがp2
33Gである、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記ダイズヒートショック遺伝子プロ
モーター断片がhsprE2019もしくはhsprM2005である、請
求項１０に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記組み換えＤＮＡプラスミドがp233
G/hs13Aもしくはp233G/hs13Bである、請求１０項に記載
の方法。 - 【請求項１６】 前記外来構造遺伝子が、バシラス・チ
ューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）の結晶
性毒性蛋白質である、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記外来構造遺伝子が除草剤耐性遺伝
子である、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記第３の細菌株の前記内在性プラス
ミドがアグロバクテリウム・チユーメファシエンス（Ag
robacterium tumefaciens)株15955のTi−プラスミドで
ある、請求項１０に記載の方法。
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| A02 | Decision of refusal |
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