JP3509855B2 - 植物のユビキチンプロモーター系 - Google Patents
植物のユビキチンプロモーター系Info
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Description
A技術による植物の遺伝子工学に関する。植物のユビキ
チン遺伝子の上流の転写されない領域由来のDNAセグメ
ントの同定と特徴とについて述べる。このセグメント
は,単子葉植物と双子葉植物の両者由来の組換え体DNA
を有する組織中の,近くの発現可能な植物遺伝子の転写
を開始させ駆動することができる。ここに記載したDNA
セグメントは,植物組織の所望の構造遺伝子を選択して
発現し調節することができる。
ンパクであり,遊離のモノマー状態か,または種々の細
胞質タンパク,核タンパク,もしくは膜タンパクと共有
結合している。このタンパク質は,76個のアミノ酸残基
を有し,そのアミノ酸の配列は,異常に高度に保護され
ている。ユビキチンの配列は,ヒト,ウシ,チチュウカ
イミバエ,アフリカツメガエルおよびニワトリのような
多種類の種の間で同一である〔ユー ボンドおよびエム
シュレジンガー(U.Bond and M.Schlesinger),Mol.C
ell.Biol.5巻,949−956頁,1985年〕。酵母とヒトのユビ
キチンは,3個の異なるアミノ酸だけが違っている〔ケ
イ.オズケイナックら(K.Ozkaynak et al),Nature,31
2巻,663−666頁,1984年〕。
のアミノ酸が異なっている。配列内のこの2個または3
個のアミノ酸の相違によって,動物,植物および酵母の
少なくとも3種のユビキチンがあることは明らかであ
る。
膜,細胞質および核,で見出されている。このタンパク
は,細胞内タンパクのATP依存性分解,つまり,損傷し
たかまたは異常なタンパク,および半減期が短かい正常
なタンパクを細胞から除去する非リソゾーム経路におい
て,必要とされる〔エイ ハーシュコら(A.Hershko et
al),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81巻,1619−1623頁,198
4年;ディ ファインリィら(D.Finley et al),Trends
Biol.Sci.10巻,343−347頁,1985年〕。ユビキチンは,
標的タンパクに結合し,これに分解のための標識をつけ
る。その共有結合は,ユビキチンのカルボキシル末端
(グリシン)と標的タンパク中のリシル側鎖のε−アミ
ノ基とのイソペプチド結合による。
酸塩)の濃度の増大のようなストレスに対する細胞の反
応で1つの役割をはたす〔ディ.ファインレイら(D.Fi
nley et al)前出,1985年〕。ほとんどの生きている細
胞は,ストレス(例えば,正常な生理的温度より数度高
い温度,または重金属,エタノール,オキシダントおよ
びアミノ酸類似体の高濃度への暴露)に反応して,小さ
なセットの遺伝子を活性化して,選択的に,ストレスタ
ンパク(または熱ショックタンパクともよばれる)を合
成する。ほとんどの生物において,このようなストレス
タンパクは,89,70および23kDaの分子量のサブユニット
を有することが見い出されたユー ボンドおよびエム
シュレジンガ,前出,1985年)。ユビキチンは,約8.5kD
aの分子量を有し,これもまたストレスに反応する。そ
の理由は,異なる種(酵母,マウス,アレチネズミおよ
びニワトリの胚線維芽細胞)では,ユビキチンmRNAおよ
びユビキチンタンパクのレベルが,ストレス条件が変化
するために増大するからである。
るDNA配列の領域で誘導される。一般に,プロモーター
は,DNAの一部とみなされ,コドン領域より上流にあり,R
NAポリメラーゼIIの結合部位を有し,そして,DNAの転写
を開始する。プロモーター領域はまた,遺伝子発現の調
節遺伝子として働く多の要素をも含有する。これらは,
約−30の近傍にTATAボックスの共通配列を有し,また転
写開始部位,すなわちキャップ部位に対して5'側の約−
75bpの位置にCAATボックスの共通配列を持っている場合
が多く,これは+1と定義される〔アール ブリースナ
ッハおよびピー チャンボン(R.Breathnach and P.Cha
mbon),Ann.Rev.Biochem.50巻,349−383頁,1981年;ジ
ェイ メシングら(J.Messing et al),Genetic Engine
ering of Plants,ティ コスゲ,シー ピー.メレディ
スおよびエイ ホレンダー(T.Kosuge,C.P.Meredith an
d A.Hollaender)編,211−227頁,1983年〕。植物では,C
AATボックスは,AGGAボックスで置換されることがある
(ジェイ メシングら,1983年,前出)。存在する他の
調節要素は,照明もしくは栄養入手可能性のような環境
刺激,または熱ショック,嫌気生活もしくは重金属の存
在のような不利な条件に応答して遺伝子の発現に影響す
る要素である。さらに,発育中もしくは組織特異的な様
式で,遺伝子発現を制御するDNA配列が存在する。見出
されているその他の調節要素は,エンハンサー(動物系
中)もしくは上流の活性化配列(酵母中)であり,これ
ら調節要素は,近傍の遺伝子の全発現を,その近傍の遺
伝子に対する位置や方向とは無関係に,高める働きを有
する。動物のエンハンサーコアの共通配列,5'−GGTGTGG
AAA(またはTTT)G−3'と相同の配列は,植物について
発表されている。例えば,転写開始部位に対して約−18
0の位置の豆レグミン遺伝子中に見出されており〔ジー
ライセットら(G.Lycett et al),Nucleic Acids Re
s.,12巻,4493−4506頁,1984年〕,そして,転写開始部
位からそれぞれ約−200および−170bpの位置のトウモロ
コシのAdh1およびAdh2の遺伝子にも見出されている。一
般に,プロモーターは,対応する遺伝子のコドン領域の
開始点に対して5'側すなわち上流に見出され,このプロ
モーター領域はすべての補助調節要素を有し,10〜1000
またはそれ以上のヌクレオチドを有し得る。
要素は,おそらく最も広く研究されている要素である。
熱ショックに対して細胞が例外なく反応するということ
は,ほとんど10年前から知られているが,ストレスを与
えられた細胞によって選択的に合成される熱ショックタ
ンパクの機能については,まだほとんど知られていな
い。ストレスタンパク合成の誘発は,転写レベルで起こ
り,その反応は,細菌,真菌,昆虫および哺乳類につい
ては類似していることが知られている〔イー.クレイグ
(E.Craig),CTC Crit.Rev.Biochem.,18巻,239−280頁,
1985年〕。ストレスに応答して,従来の熱ショックタン
パクが合成され蓄積されるのに加えて,ストレスが加え
られた細胞はまた,プロテアーゼ類とユビキチンとを合
成する。イー コリ内では,ATP依存性タンパク加水分解
活性を有する94kDaの酵素が,発現が熱ショックレギュ
ロンの制御下にあるlon(capR)遺伝子でコードされて
いる〔イー オズケイナックら(E.Ozkaynak et al),N
ature,312巻,663〜666頁,1984年〕。ニワトリの胚線維
芽細胞では,ユビキチンmRNAのレベルは,熱ショック後
もしくは50μMの亜ヒ酸塩に暴露後には5倍に増大した
〔ユー ボンドら(U.Bond et al),Mol.Cell.Biol.5
巻,949〜956頁,1985年〕。各mRNAは,縦方向に繰返した
同一のポリペプチドを有し,このmRNAは,ポリユビキチ
ン分子として翻訳する際,多重ユビキチン分子を生じ,
遺伝子情報を増幅する特有の機構を与える。ユビキチン
mRNAの高レベルは熱ショック後の回復時は持続せず,こ
のことは,ストレスに反応している間の遊離ユビキチン
に対する過渡的な役割を示している。
ストレスは,通常の機構で作用するとみなされている
〔ジェイ アナサンら(J.Anathan et al),Science,23
2巻,522−524頁,1986年〕。熱ショック遺伝子を活性化
する代謝ストレスは,細胞内タンパクの変性を起こす
が,異常タンパクが蓄積して,熱ショック遺伝子を活性
化するシグナルとして働く。異常タンパクを分解すべき
標的とするユビキチンの役割と,種々のタンパク分解酵
素の役割とは,熱ショックタンパク遺伝子の調節のこの
ようなモデルと適合する。
ショウジョウバエ(Drosophila)種で行われた。特に,
ショウジョウバエhsp 70遺伝子は組換えの研究に広く使
用された。相同系において,ショウジョウバエhsp 70遺
伝子が,イー コリ β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子
と融合され,その雑種遺伝子の活性が,受容体のショウ
ジョウバエ中の5つの常在性hsp 70熱ショック遺伝子か
ら区別された。ショウジョウバエの熱ショック遺伝子は
また,非相同系,例えばサルCOS細胞およびマウス細胞
にも導入された〔エイチ ペルハム(H.Pelham),Cell,
30巻,517−528頁,1982年〕。熱ショックによる調節は,
ショウジョウバエ生殖系列に組み込まれた雑種hsp70−l
acZ遺伝子において観察された。この遺伝子には,hsp70
構造遺伝子の中央部に7kbのイー コリ β−ガラクト
シダーゼDNA断片が挿入されている。その形質転換体で
得られたガラクトシダーゼ活性は,熱ショックによって
調節されることがわかった〔ジェイ リスら(J.Lis et
al),Cell 35巻,403〜410頁,1983年〕。
エhsp70熱ショックプロモーターに欠失変異を作って分
析することによって5'−CTGGAAT_TTCTAGA−3'であると
同定された〔エイチ ペルハムら,Heat Shock From Bac
teria to Man,コールドスプリング ハーバー ラボラ
トリー,43−48頁,1982年〕。このDNA配列は遺伝子の−6
6,〜−47の領域,すなわちTATAボックスの約26塩基上流
に位置している。この要素の化学的に合成されたコピー
は,ヘルペスウイルス チミジンキナーゼ遺伝子のTATA
ボックスの上流に,通常の上流のプロモーター要素の代
わりに配置すると,サルCOS細胞とアフリカツメガエル
の卵母細胞のチミジンキナーゼ遺伝子に,充分に,熱誘
発性を与えるということが証明された(チミジンキナー
ゼ遺伝子は,通常,熱誘発性ではない)これらの熱ショ
ック配列は,熱ショックタンパクを誘発させる熱ショッ
ク特異的転写因子と相互作用する〔シー パーカーら
(C.Parker et al),Cell,37巻,273〜283頁,1984年〕。
熱ショック遺伝子の誘発物質は,細胞内の熱ショックタ
ンパクの濃度を変化(減少)させて,熱ショック遺伝子
の転写と翻訳とを制御する因子であり得る。
キビ,トウモロコシ,ヒマワリ,ワタ,および小麦内で
熱ショックに反応してタンパクの合成が増大することに
よって証明された〔ティー バーネットら(T.Barnett
et al),Dev.Genet.1巻,331−340頁,1980年;ジェイ
キイら(J.Key et al)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78巻,3
526〜3530頁,1981年〕。植物の種によって見い出される
熱ショック反応の主な相違は,次のとおりである。
(a)ストレスに反応して合成される全タンパクの量;
(b)合成される各種タンパクの大きさの分布,;(c)
熱ショックタンパクを誘発する最適温度;および(d)
致死(切断点)温度〔lethal(breakpoint)temperatur
e〕である。高分子量のタンパクは,種が異なっても電
気泳動性が類似していることがわかっている。低分子量
(15〜27kDa)の熱ショックタンパクは,種によって,
電気泳動性の非相同性が高分子量のものよりも大きい。
植物においては,高分子量タンパクは,ショウジョウバ
エ内で産生されるタンパクと似ている。しかし,植物お
よびショウジョウバエの低分子量熱ショックタンパクの
複雑性には著しい差がある。22,34,36および27kDaの4
つの熱ショックタンパクがショウジョウバエ内で合成さ
れるが,大豆は,15〜18kDaの範囲の分子量を有する20種
を越える熱ショックタンパクを産生する。大豆の低分子
量タンパクの遺伝子は,熱ショック条件下で,最も活発
に発現され,適切に調節される遺伝子である〔エフショ
ッフルら(F.Schoffl et al),J.Mol.Appl.Genet.,1巻,
301〜314頁,1982年〕。
月12日出願)は,植物の熱ショック遺伝子のプロモータ
ー領域を研究した。4つの大豆熱ショック遺伝子(15〜
18kDaの熱ショックタンパクをコードする3つの遺伝子
および,17.3kDaの熱ショックタンパクをコードする1つ
の遺伝子)がクローン化され配列が決定された。4つの
熱ショック遺伝子のコード配列とそれに隣接する配列が
決定された。これらの4つの遺伝子のプロモーター領域
が,サブクローン化され,T−DNAシャトルベクターに連
結され,アグロバクテリウム ツメファシエンス(Agro
bacterium tumefaciens)に形質転換された。15〜18kD
aのタンパクをコードする大豆熱ショック遺伝子の組換
え体クローンの1つは,462個のヌクレオチドの読取り枠
と,ATG翻訳開始コドンの上流の291個のヌクレオチドの
プロモーター領域とを有していた。このプロモーター
は,TATAボックス,CAATボックス,転写開始部位,および
5'−CT_GAA−TTC_AG−3'の配列を有するATG翻訳開始コ
ドンの上流に熱ショック共通配列131〜144のヌクレオチ
ドを備えている。4つのクローンの内3つだけがこのプ
ロモーター領域内でかなりの相同性を示したが,4つのク
ローン全部の熱ショック共通配列は,著しく類似してい
た。4つの大豆熱ショック遺伝子の,コード配列,上流
のプロモーター領域および下流の隣接領域は,ショウジ
ョウバエ熱ショック遺伝子の対応する領域とはほとんど
類似していなかったことは重要である。ショウジョウバ
エおよび大豆の熱ショック遺伝子のプロモーター領域の
共通配列は類似しているが,大豆熱ショック遺伝子のプ
ロモーター領域は,ショウジョウバエ遺伝子の特徴であ
る逆方向反復塩基配列をもっていない。
伝子と外来遺伝子(大豆中には通常見られない遺伝子)
とを活性化するのに用いられ,ストレスによる反応の調
節が示された〔キイら,特願昭60−79127号,1985年4月
12日出願〕。このプロモーターが,転写開始点から下流
に延びる65kbのDNA断片として大豆SB13熱ショック遺伝
子から単離された。これには翻訳されないリーダー配列
の主要部分が含まれているが,翻訳の開始コドンは含ま
れていない。β−ガラクトシダーゼ遺伝子は,A.ツメフ
ァシエンス内に存在する安定形のTiプラスミドのT−DN
A中の熱ショックプロモーターの制御下におかれてお
り,次いで植物もしくは植物細胞培養物に移入される。
DNA移入が起こったことは,5−ブロモ−4−クロロ−3
−インドリル−β−Dガラクトシダーゼ基質分子を含有
する培地内で熱処理後に青色を呈するβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子の発現によって確識された〔エム ローズら
(M.Rose et al),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78巻,2460
−2464頁,1981年〕。
試験される,交差発現の実験によって,特異的な機能の
理解の範囲が広くなった。これらの実験では,自らのプ
ロモーターの制御下にある遺伝子か,または異なるプロ
モーターもしくは非天然のプロモーターに人工的に融合
させた遺伝子を挿入することが示されている。1983年に
ムライら(Murai et al)は(Science 222巻,476〜482
頁),ヒマワリ(Helianthus)の組織内でファセオラス
ブルガリス L.(Phaseolus vulgaris L.)由来のイ
ンゲン豆遺伝子を,次の2つの条件下で発現させた:
(i)インゲン豆遺伝子がそれ自身のプロモーターの制
御下にある場合;および(ii)該遺伝子がスプライスさ
れ,T−DNAプロモーターの制御下にある場合。その後の
実験で,その天然プロモーターの制御下にあるインゲン
豆の構造遺伝子をタバコ内で発現させることができ,こ
の非相同宿主(heterologous host)(タバコ)内の組
織特異的発現が本来の宿主(マメ)内のそれと類似して
いることがわかった〔シー セングプタ−ゴパレンら
(C.Sengupta−Gopalen et al),Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,82巻,3320〜3324頁,1985年〕。
EMBO J.4巻,2411〜2418頁,1985年〕で,オクトピン シ
ンテターゼ遺伝子(ocs)が,再生された形質転換相同
(homologous)植物(ペチュニア)と非相同(heterolo
gous)植物(タバコ)内で発現することが発表された。
この研究で,osc遺伝子がペチュニアのクロロフィルa/b
結合タンパクのプロモーターに融合された。交差発現
が,ダブリュ ガーリイら(W.Gurley et al),Mol.Cel
l.Biol.6巻,559−565頁,1986年;およびキイら,特願昭
60−79127号(1985年4月12日出願)に記載されてい
る。後者には,それ自身のプロモーターの制御下にある
大豆熱ショック遺伝子のヒマワリの腫瘍組織内での強い
転写が報告されている。この場合においては,機能活性
は,正確な熱誘発反応として測定された。
された転写の最初の情報は,マツケら(Matzke et a
l),EMBOJ.3巻,1525−1531頁,1984年,により刊行され
た。これらの研究者らは,トウモロコシ ゼインZ4遺伝
子をクローン化し,Ti由来のベクターにこれを組み込
み,そしてヒマワリの小茎に導入した。得られたゼイン
mRNAは次いで小麦細胞系内で翻訳することができたが,
形質転換されたヒマワリのカルス内では翻訳できなかっ
た。
をコードする小麦遺伝子whAB 1.6が,T−DNA含有ベクタ
ーにクローン化され,ペチュニアおよびタバコの両方に
形質転換された〔ジー ランパら(G.Lamppa et al)Na
ture,316巻,750〜752頁,1985年〕。上記の単子葉植物と
双子植物の宿主の両方で発現が起こり,光誘導性および
組織特異的であることが決定された。さらに最近の研究
〔ロチェスターら(Rochester et al),EMBO J,5巻,451
−458頁,1986年〕では,遺伝子移入ペチュニア内でトウ
モロコシの熱ショックhsp 70遺伝子が発現された。トウ
モロコシhsp 70 mRNAは,熱ストレスにのみ反応して合
成された。上記の3つの研究が,トランスジェニック双
子葉植物中に単子葉植物の遺伝子を発現させることに成
功したことを記載した報告のすべてである。しかし,ト
ウモロコシのアルコール,デヒドロゲナーゼ遺伝子は,
タバコの宿主内ではごくわずかかまたは全く発現しなか
ったと述べた否定的な報告もあり〔レウエリンら(Llew
ellyn et al),Molecular Form and Function of the P
lant Genome,エルバン ブロテン−ドティング,ジイ
エス グルートおよびティー ホール(L.van Vloten−
Doting,G.S.Groot and T.Hall)編,Plenum Publising C
orp,593〜608頁,1985年;ジェイ ジィー エリスら
(J.G.Ellis et al),EMBO J.6巻,11−16頁,1987年〕,
このことは単子葉植物および双子葉植物のプロモーター
の間には,固有の種に特異的な差が存在する可能性を示
唆している。
に対して熱保護性もしくは耐熱性を与えるものと考えら
れている〔エム シュレジンガーら(M.Schlesinger et
al),Heat Shock from Bacteria to Man,Cold Spring
Harbor Laboratory,米国ニューヨーク州,コールド ス
プリング ハーバー,329頁,1982年〕。容認しうる熱シ
ョック温度は,熱ショック反応を誘発するのに充分高い
温度であるが,死に至る程高い温度ではない。植物の芽
生えの耐熱性は,次のような各種の処理法で得ることが
できる。(a)40℃での連続的熱ショックに1〜2時間
さらした後,45℃で保温する方法;(b)40℃で30分間
熱ショックを与えた後,28℃で2〜3時間処理してから4
5℃に移行する方法;(c)45℃で10分間熱ショックを
与え,次に28℃で約2時間処理し,45℃に移行する方
法;および(d)芽生えを50μMの亜ヒ酸塩で,28℃に
て3時間またはそれ以上処理し,45℃に移行する方法。
枯死に至る可能性のある温度で保温する前に,予備処理
する間に,熱ショックタンパクが合成され,蓄積され
る。さらに植物の芽生えが上記のように予め処理される
と,熱ショックmRNAと熱ショックタンパクの合成が45℃
で起こる。温度が生理学的レベル(例えば,28℃)に戻
されると,正常な転写と翻訳とが再開され,正常温度で
3〜4時間経過すると熱ショックタンパクの検出可能な
合成はもはや認められない〔ジェイ キイら,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,78巻,3256〜3530頁,1981年;エム シ
ュレジンガーら,Trends Biochem.Sci.1巻,222〜225頁,1
982年〕。40℃での熱ショック処理中に合成された熱シ
ョックタンパクは,非常に安定ですぐには分解しない。
応答して調節されるが,ユビキチンの転写調節は,従来
の熱ショックタンパクの転写の調節とは異なっている。
ユビキチンと熱ショックタンパクのmRNAのレベルは細胞
のストレスに反応して増大する。しかし,従来の熱ショ
ックタンパクは,熱ショックを与えている間は蓄積し,
回復期には存続するが,熱ショックを与えている間に蓄
積されたユビキチンmRNAは,ストレス処理後,数時間以
内に急速に分解する。この不安定なmRNAの転写は,熱シ
ョック中におけるユビキチンの特別の過渡的な役割を示
唆し,ユビキチン遺伝子のプロモーター領域における唯
一のDNA配列に関連があり,ストレスに対する細胞の反
応中の特別な調節制御を規定している。
遺伝子を選択的に発現させることができる調節プロモー
ター系からなる新規DNAセグメントおよび構築物とを提
供することにある。上記のプロモーターは,プロモータ
ーの制御下にある遺伝子の転写を開始し調節する,植物
ユビキチン遺伝子の5'側の非転写領域由来のDNA配列を
もっている。その好ましい実施態様では,このプロモー
ターの配列は,トウモロコシのユビキチン遺伝子の上流
領域由来のものである。
節するプロモーターの単離と特徴付けについて,本発明
で開示する。このDNA配列は,トウモロコシのゲノム・
ライブラリィから分離されたユビキチン構造遺伝子の上
流に天然に存在する領域である。S1ヌクレアーゼマッピ
ングで決定された転写開始部位すなわちキャップ部位は
塩基1と呼称され,転写開始部位の5'側の約899の塩基
と5'側の翻訳開始部位を除いたキャップ部位の3'側の約
1093塩基内に包含された配列がユビキチンプロモーター
を構成している。上記のほぼ2kbのプロモーター領域に
は,TATAボックス(−30)2つの重複する熱ショックコ
ンセンサス要素(−204と−214),転写開始部位に隣接
する83ヌクレオチドのリーダー配列,および塩基84から
塩基1093までのびるイントロンか位置している。
ーと植物の発現可能な構造遺伝子とからなる,組替え体
DNA分子を提供することにある。ここで構造遺伝子は,
プロモーターの転写開始要素および転写活性化要素全体
の調節制御下にある。特に,植物のユビキチンのプロモ
ーターは,各種のDNA配列,代表的なものとしては構造
遺伝子と結合することができ,前記DNA配列の転写と翻
訳を調節し,高温でストレスが与えられた際に発現を調
節制御するDNA構築物を提供する。
ロモーター/構造遺伝子の組合せを発現する。この発明
の方法は,単子葉植物と双子葉植物の両者における構造
遺伝子の発現に一般に適用できると考えられる。
含む2kb以下のDNA配列であって,該調節システムは熱シ
ョック要素およびイントロンを含む。
ンサス配列に対して少なくとも75%の相同性を有する。
を含む2kb以下のDNA配列と,植物発現性構造遺伝子とを
有するDNA構築物であって,該調節システムは熱ショッ
ク要素およびイントロンを含み,そして,該構造遺伝子
は該植物ユビキチン調節システムの調節制御下に置かれ
ている。
的に発現させるための,および選択されたストレス誘導
による該構造遺伝子の発現を増強するための方法を提供
する。該方法は,(a)熱ショック要素およびイントロ
ンを含む植物ユビキチン調節システムと,該植物ユビキ
チン調節システムの調節制御下にある植物発現性構造遺
伝子とを含むDNA構築物で該植物細胞を形質転換するこ
と,および(b)該形質転換した植物細胞にストレス状
態を選択的に与え,該構造遺伝子の発現増強を誘導する
こと,を包含する。
いる用語の目的と範囲についてあいまいさを除くために
行うものである。
味する。
子の5'末端に存在するヌクレオチド配列を意味する。プ
ロモーター配列は,下流の遺伝子を発現させるために必
要であるが,必ずしも充分ではない。一般に,真核系の
プロモーターは,転写開始(キャップ)部位の5'側に約
10〜30bpのコンセンサス5'−TATAAT−3'(TATA)ボック
スに相同の特徴的なDNA配列を有する。キャップ部位は
便宜上+1と番号を付してある。キャップ部位に対して
3'側の塩基には正の数字を付け,一方キャップ部位に対
して5'側の塩基には負の数字を付け,その数字は,キャ
ップ部位からの各塩基の距離を表している。もう1つの
プロモーター要素であるCAATボックスは,TATAボックス
の5'側の約30〜70bpの位置に見出されることが多く,標
準形の5'−CCAAT−3'に対して相同である(J.Messingら
(1983),in Genetic Engineering of Plants,T.Kosug
eら(編著),Plenum Press,pp.211−227)。植物中で,C
AATボックスは,AGGAボックスとして知られている配列
で,かつトリプレットG(またはT)NGに対称的に隣接
するアデニン残基を有する領域で置換される場合がある
(R.BreathnachとP.Chambon(1981)Ann.Rev.Biochem.5
0:349−383)。転写に対して調節効果を与える別の配列
が,プロモーター領域内に見出され,キャップ部位か
ら,1000bpもしくはそれ以上延びて存在している。
初に,ただし排他的ではなく,位置するDNA配列要素に
よって誘発される遺伝子発現の変調を意味する。調節に
よって,環境の刺激に対して全てが無かの応答が生じる
か,または遺伝子発現のレベルが変化する。この発明に
おいて,熱ショック調節要素は,急激な温度上昇に反応
して,下流の遺伝子の発現のレベルを一時的に促進する
作用をする。
伝子を置くということは,遺伝子の発現がこれらの配列
で制御されるように構造遺伝子を位置させることを意味
する。一般にプロモーターは,プロモーターが制御する
遺伝子に対し5'側(上流)に位置することが知られてい
る。したがって,異種のプロモーター/構造遺伝子の組
合わせを構築する際には,プロモーターは,該遺伝子の
上流に位置するのが好ましく,プロモーターの転写開始
部位からの距離は,プロモーターが自然のセッティング
で制御する遺伝子との距離とほぼ等しくする。当該技術
分野で知られているように,プロモーターの機能の損失
がなければ,上記の距離はいくらか変えてもよい。同様
に,その制御下にある異種遺伝子に対する調節要素の好
ましい位置は,調節要素が自然に調節する構造遺伝子に
対するその自然の位置を反映している。当該技術分野で
知られているように,この距離もいくらか変えてもよ
い。
プロモーターの機能は,転写段階では,DNA−RNAハイブ
リダイゼーション検定法(“ノーザン”ブロット法)を
用い,翻訳段階では,合成タンパクに対する特定の機能
検定法を用いて(例えば酵素活性によるかまたは該タン
パクの免疫検定法による)試験をすることができる。
部分をコードするDNAセグメントからなる遺伝子の部分
であり,転写を開始させる5'側の配列を除く。構造遺伝
子は,通常細胞内に見出される遺伝子か,またはそれが
導入される細胞の位置に通常は見出されない遺伝子であ
り,後者の場合,異種遺伝子と呼ばれる。異種遺伝子
は,当該技術分野で公知のあらゆる起源からその全体も
しくは部分を得ることができる。それらの起源には,細
菌のゲノムもしくはエピソーム,真核DNA,核DNA,プラス
ミドDNA,cDNA,ウイルスDNAまたは化学的に合成されたDN
Aが包含される。構造遺伝子は,コーディング領域もし
くは非翻訳領域に1つ以上の修飾部分を持っていてもよ
い。この修飾部分は,発現産物の生物学的活性もしくは
化学的構造,発現速度または発現制御のしかたに影響す
る。かような修飾部分としては,限定はしないが,1つ以
上のヌクレオチドの変異部分,挿入部分,欠失部分およ
び置換部分がある。構造遺伝子は,途切れないコーディ
ング配列を形成するか,または,適当なスプライス接合
で結合された1つ以上のイントロンを有している。構造
遺伝子は,複数の起源由来のセグメントの複合体でもよ
く,また天然に生成したものまたは合成のものでもよ
い。構造遺伝子は,融合タンパクをコードしてもよい。
植物組織に,プロモーター/構造遺伝子/ポリアデニル
化シグナルの複合体を有する組換え体DNA分子を導入す
ることには,構造遺伝子とそのプロモーターが各々異な
る植物種由来のものである構造物を構築することが包含
されると考える。
チン遺伝子の翻訳開始部位の5'側の約1kbのヌクレオチ
ド配列を意味し,転写の開始,転写の調節,発現レベル
の制御,ストレス遺伝子の誘発,およびストレスに応答
した発現の促進とを導く配列で構成されている。調節系
は,プロモーターと調節の両方の機能をもっており,遺
伝子発現の調節制御すなわち変調を行うDNA配列であ
る。植物ユビキチンの調節系の調節制御下に構造遺伝子
があるということは,遺伝子の調節された発現がユビキ
チンの調節系からなる配列によって制御されるような位
置に構造遺伝子があることを意味する。
できる核酸配列を意味し,通常,mRNA前駆体の3'末端に
ポリアデニル酸のからなる領域を付加していることで特
徴付けられる。ポリアデニル化シグナルのDNAセグメン
トは,それ自体,天然生成もしくは合成の数種の起源に
由来するセグメントの複合体であって,ゲノムDNAもし
くはmRNA由来のcDNAを起源とする。ポリアデニル化シグ
ナルは,標準形の5'−AATAA−3'に対する相同性の存在
によって通常認識されるが,距離の変動,部分的な“読
み過し”および多重タンデム標準配列はまれなことでは
ない(J.Messingら,前記文献)。標準の“ポリアデニ
ル化シグナル”は,実際に,転写の終結を起こすが,ポ
リアデニル化反応自体を起さないということは認識され
るべきである(C.Montellら(1983)Nature 305:600−
605)。
種子,腫瘍組織,ならびに培養中の各種形態の細胞,原
形質体,胚およびカルス組織のような単細胞を包含す
る,植物の分化した組織と分化していない組織が含まれ
る。植物組織は,イン・プランタ(in planta)または
器官内の組織もしくは細胞培養物である。
またはアミノ酸配列が同一もしくはほぼ同一であること
を意味する。当該技術分野で理解されているように,ヌ
クレオチドの不整合がコドン内の3番目の塩基すなわち
ゆらぎ塩基に起こることがあるが,最終的なポリペプチ
ド配列においてアミノ酸の置換を起こすことはない。ま
た,遺伝子配列のいくつかの領域における小さなヌクレ
オチドの修飾(例えば置換,挿入もしくは欠失)は,こ
のような修飾によるアミノ酸配列の変化が,最終生成物
の機能を変えない限り,許容することができ,かつ重要
でないと考えられる。遺伝子配列の全体もしくは一部分
の化学的に合成されたコピーが,遺伝子の機能を損なう
ことなく,天然の遺伝子中の対応する領域と置換し得る
ことが分かっている。特定のDNA配列の同族体は,当該
技術分野で周知の厳密の条件下での核酸のクロスハイブ
リダイゼーション試験法を用いて,当業者によって同定
することができる(HamesとHiggens編集(1985)Nuclei
c Acid Hybridisation,IRL Press,英国,オックスフォ
ードに記載されている)。相同性の程度は,比較される
配列間の同一性の百分率によって評価されることが多
い。したがって,本開示では,小さな配列の変動が相同
配列の中に存在し得ることが分かる。
取り出された,得られた,受けとられた,複写された,
複製された,伝来したことを意味している(化学的に,
および/または生物学的に)。誘導物は元の起源の化学
的または生物学的操作(置換,添加,挿入,欠失,抽
出,単離,変異,および複製を含むがこれらに限定はさ
れない)によって調製され得る。
クレオチドがin vitroで組み立てられたことを意味して
いる。手作業的DNA化学合成は既に確立されている方法
(M.Caruthers(1983),Methodology of DNA and RNA S
equencing,Weissman(編著),Praeger Publishers(New
York)第1章)で実施され,また自動化された化学合
成は種々の市販装置の一つを使用して行われ得る。
応じて遺伝子発現を調節するDNA配列を指す。応答は下
流遺伝子の発現レベルの一過性であるが急な上昇として
表れる。熱ショック遺伝子についての最初の研究はショ
ウジョウバエ属(Drosophila)を使用して行われたが,
植物を含む他の多くの種もストレスに対し同様の応答を
示す(T.Barnettら(1980)Dev.Genet.1:331−340)。
熱ショック要素の必須第1成分はショウジョウバエ属で
はコンセンサス配列5'−CTGGAAT−TTCTAGA−3'を有し,
転写開始部位の上流の残基−66から−47bpまでの領域に
位置していると記述されている(H.PelhamとM.Bienz(1
982)前記文献)。このコンセンサス配列の化学合成さ
れたオリゴヌクレオチドのコピーは熱ショック誘導性に
関しては天然配列に取って代わることができる。他の系
ではプロモーター領域内に多重の熱ショック要素がみと
められている。例えば,Rochesterら(1986)前記文献
は,トウモロコシのhsp70の遺伝子に2個の熱ショック
要素を確認している。
位置する約100個のヌクレオチドから成るDNA配列を意味
している。リーダー配列内にはリポソーム結合部位を特
定する領域が包含されている。
ド配列(エキソン)と一緒に転写されるが,その後成熟
mRNAの形成に際して取り除かれるようなDNA配列の領域
を言う。イントロンは転写された配列内のいたる所,つ
まり同じまたは異なる遺伝子のコード配列間,遺伝子の
コード配列内に存在してそのアミノ酸配列を遮断し分断
している,またプロモーター領域内(翻訳開始部位の5'
側)にも存在し得る。イントロンは一次転写の際に切除
され,同時に且つ正確にコード配列が連結され,成熟mR
NAを形成する。イントロンとエキソンの連結部がスプラ
イス部位となる。イントロンの塩基配列はGUで始まり,A
Gで終わる。同じスプライシング信号は高等真核生物の
多くに認められる。
現に有用な組み換えベクターの開発に関する。本発明で
は,ベクターは挿入されたDNAコードセグメントの発現
を制御するのにトウモロコシのユビキチンプロモーター
を採用している。転写調節配列を既定宿主の染色体外複
製系と結合することができる。遺伝子挿入のための制限
部位をもつ他のDNA配列を加えて,該宿主に於て挿入さ
れた遺伝子の転写と翻訳を調節するためのベクターとす
ることができる。このベクターにはまた原核細胞宿主で
増殖を可能とならしめる原核細胞複製系,選択のための
マーカー,および他のDNA領域が含まれる。これにより
植物および哺乳類宿主を形質変換する以前に,特徴付け
られた細菌系で大量のベクターを増殖させることができ
る。プロモーターと遺伝子配列が互いに適切に位置付け
られているベクターを構築する原理は当業者によく知ら
れている事柄である。ある条件では,所望の構造遺伝子
にプロモーター系を結合し,得られた構造DNAを直接宿
主に導入するのが望ましい。この直接導入法には,これ
らに限定されるものではないが,原形質体形質変換,エ
レクトロポレーション法,DNAの核への直接注入,および
カルシウム沈澱による同時形質転換が包含される。
けに関する最初の報告である。本発明に記載されている
トウモロコシユビキチンプロモーターは,RNAポリメラー
ゼ認識および結合部位,転写開始配列(キャップ部
位),誘発転写を引きおこす調節配列,および転写開始
部位と翻訳開始部位との間の翻訳されない介在配列(イ
ントロン)を包含する。二重の熱ショックコンセンサス
配列が転写開始部位の5'側(−214と−204)に位置す
る。キャップ部位のすぐ隣りには83ヌクレオチドのエキ
ソンが存在し,これに大きいイントロン(約1kb)が続
いている。
はトウモロコシゲノムの2個の約2kb Pst断片上に単離
することができる(図1)。断片全体はmRNAまたはタン
パクの発現を監視することによりプロモーター機能を示
すために用いられ得る。ユビキチン翻訳開始コドンの下
流に異種遺伝子を導入することによって融合タンパクが
発現する。ユビキチンプロモーターと翻訳開始コドンと
の間に異種遺伝子(それ自身の開始コドンと停止コドン
を有する)を挿入すると,挿入された遺伝子に対応する
自然のポリペプチドが発現する。所望の構造遺伝子を挿
入するには遺伝子の末端に平滑末端のリンカーを使用す
ると最も好都合に実施できる。
開始直前の部位,または転写開始部位の前の部位で制限
することもできる。例えば,本発明ではプロモーター断
片を約2kb Pst I断片としてユビキチン遺伝子から誘導
した。プロモーター断片に翻訳開始コドンが欠けている
ことを確実にするため、5'側領域を有する断片を所望の
数のヌクレオチド対を除去する様に制御された条件下で
二本鎖エキソヌクレアーゼで選択的に消化した。好まし
くはユビキチン翻訳開始コドンを取り除き,その結果挿
入された遺伝子の翻訳はそれ自身の開始部位から開始す
る。次にリンカーまたはホモポリマーテーリングを使用
して単離された(かつ,短くなった)プロモーター断片
をベクターに挿入し,ベクターの残余領域と適合する所
望の制限部位を導入する。一般には,プロモーター断片
を特殊制限酵素で開裂し,その結果生じた短いDNA断片
についてプロモーター機能をテストし,無傷プロモータ
ーの機能と比較する。さらに,DNAコドンを加え,および
/または現存の配列に変更を加えて,プロモーター機能
を保持する誘導DNA断片を調製する。
伝子に対するクローニング用の媒体として役に立つもの
である。本発明では,トウモロコシユビキチンプロモー
ターまたはカリフラワーモザイクウイルスプロモーター
の制御下で,CATをコードしている構造遺伝子をオート麦
とタバコ細胞で発現させた。ユビキチンプロモーターを
採用した場合,双子葉宿主より単子葉宿主に於ける方が
発現の度合が大きく,カリフラワーモザイクウイルスプ
ロモーターを使用した場合は単子葉より双子葉宿主で発
現の度合が大きくなった。発現レベルの差異は異なるプ
ロモーターが持つ固有の相違,並びに単子葉類と双子葉
類間の発現調節と過程に於ける基本的な細胞の相違に由
来している。現在までのところ,単子葉類プロモーター
が双子葉類の宿主細胞内でうまく機能するか否かは定常
的でなく不明確で,予測できない。
多くの構造遺伝子が本願のDNAクローニングベクターに
導入され得る。さらに,この型のDNA構成物は特殊な遺
伝子由来のDNAの産生を増加させるために,並びにcDNA
産生に使用することができるmRNAの産生を増加させるた
めに使用することができる。特殊DNA配列を有するこの
ようなベクターは広く応用されており,非常に有用であ
る;例えばこれらは細菌に於ける遺伝子増幅,あるいは
さらに付加的な細胞機能を発揮できる高等細胞に於ける
発現に使用することができる。医用および農業用に有用
なタンパクを商業生産するのに高等真核生物の組み換え
系を利用する利点は原核生物や下等真核生物宿主に於て
は複写することが難しい翻訳後の正確な修飾が確保でき
ることである。
葉類と双子葉類の例としてオート麦とタバコで機能を果
たすことが示され,そしてこのプロモーターが他の細胞
でも同様に機能を果たすと考えられる。このような系に
は,これに限定されるものではないが,例として述べる
と,ユビキチン遺伝子が単離でき,高度に維持されるこ
とが判明している細胞,例えばトウモロコシに加えて他
の単子葉類,タバコ以外の双子葉類,酵母のような下等
真核生物および哺乳類細胞が包含される。トウモロコシ
ユビキチンプロモーターと共に使用するのに適した細胞
系のスクリーニングは,ここに記した方法に従って,実
施され得,過度の実験を必要としない。個々の系に於て
DNAコードセグメントの発現に適したベクターの構築に
ついては既に詳細に論述されている。複数の宿主内で複
製可能なシャトルベクター,例えば酵母と哺乳類細胞の
両方,植物と動物細胞,および植物と細菌細胞に対する
シャトル発現ベクターについても論述されている。さら
に,植物プロモーターとしての機能に関してはトウモロ
コシユビキチン遺伝子と類似している,他の系由来のユ
ビキチン遺伝子がユビキチンプロモーター配列のための
起源として採用できることが理解されるだろう。
の熱ショックプロモーターとしての利用に関する。2個
の熱ショックコンセンサス配列はトウモロコシユビキチ
ン遺伝子の上流,−214と−204の位置に存在する。多く
の真核生物では,熱ショックコンセンサス配列と相同の
天然に存在する配列および化学合成された配列が遺伝子
発現の誘導を調節することが判明している。ユビキチン
プロモーターは熱ショック要素の配列と同一の配列を含
有しているが,このプロモーターは(1)転写開始部位
の3'側に非翻訳イントロンを有し,(2)ユビキチン発
現を構成的並びに誘発的に調節する点で従来の熱ショッ
クプロモーターとは区別される。熱ショック要素とプロ
モーター領域内に存在する大きなイントロン間の機能的
関係は現在までの技術段階では解明されていない。これ
らの特徴的な配列間のヌクレオチドの距離および一方の
要素の他方に対する方向と位置づけは本発明に於ては派
生した調節断片の基本的プロモーター機能が活性に保た
れている限りは,可変であると仮定する。
NA転写物の相対的安定性に関連し,間接的に,合成され
たタンパクのレベルに関連する(Callis et al.(198
7)Genes and Development 1:1183−1200)。構成的に
発現したユビキチンmRNAはニワトリ胎児の線維芽細胞で
は安定レベルに保たれ、一方、ストレスに応答して形成
されたユビキチンmRNAの半減期は約1.5〜2時間である
と報告されている。
が報告されている。構成的に発現されたユビキチンはユ
ビキチン遺伝子の3個のうちの1個以上のものによって
コードされている。3個のうちの2個はコード領域のす
ぐ内側に約400bpのイントロンを含有している。4個目
のユビキチン遺伝子は非翻訳イントロンを欠いているが
多重の熱ショック要素から成っており,主としてストレ
スに応答してユビキチン発現を誘導する働きをする。後
者のユビキチン遺伝子は構成的に機能するのではなく,
むしろ熱ショックやストレス信号に応答して機能する
(E.Ozkaynak et al.(1987)EMBO J.6:1429−143
9)。
よってコードされる。本発明ではユビキチン遺伝子の1
個についてのヌクレオチド配列が記載されている。転写
および翻訳開始部位間の大きなイントロン(約1kb)並
びにコンセンサス熱ショック配列に対応するヌクレオチ
ド配列がトウモロコシユビキチンプロモーター領域内に
みとめられる。これら2つの特殊な領域は多分ユビキチ
ン合成と,外部の影響に対応してユビキチンレベルを調
節するのにかかわっている。ユビキチンプロモーター内
に包含されているイントロンと熱ショック要素との間の
機能上の関係は解明されていない。本発明ではトウモロ
コシユビキチンプロモーターが正常条件下および熱ショ
ック条件下の両方でmRNAの合成を調節すること,および
転写調節の変化が熱ショック後ユビキチン合成が増大し
た理由となっていることについて報告する。
れらは本発明を限定するものではない。
特徴付け A.植物の成長 トウモロコシの近交系B73を,暗所にて25℃で4〜5
日間,湿潤バーミキュライトにおいて成長させた。中茎
節から茎頂までの実生苗の部分を採取し,液体窒素中で
凍結させ,−80℃で保存した。
胞RNAを抽出した。ポリU−セファデックス(Bethesda
Research Laboratories,Gaithersburg,MD)カラムを通
過させることにより,全細胞RNAからポリ(A)+RNAを
単離した。全RNAあるいはポリ(A)+RNAを,3%(wt/vo
l)ホルムアルデヒドを含む1.5%アガロースゲルで電気
泳動した。25mMリン酸ナトリウム(pH6.5)を用いた毛
細管ブロッティングにより,RNAをGene ScreenTM(DuPon
t)に移した。
ケDNA,40mMリン酸ナトリウム(pH6.8),0.5%BSA,およ
び1%SDS中でプレハイブリダイズさせた。ブロットは,
50%ホルムアルデビド,5×SSC,100μg/m変性サケDNA,
40mMリン酸ナトリウム(pH6.8),および10%硫酸デキ
ストラン中でハイブリダイズさせた。
5−84の方法の改良法によって,ポリ(A)+RNAから合
成した。二本鎖cDNAのオリゴ(dC)テイリングと,オリ
ゴ(dG)テイルpBR322によるオリゴ(dC)テイルcDNAの
アニーリングとを,標準的技術を用いて実施した。アニ
ールしたDNAを,E.coli HB 101に形質転換し,テトラサ
イクリン(15μg/m)を含むL寒天プレート上のニト
ロセルロースフィルター(Millipore,HATF;0.45μm)
に直接プレートした。
をスクリーニングして,潜在的に光調節されたmRNAを表
現する数多くのcDNAを得た。これらのcDNAの一部を選択
し,RNAブロット分析によってさらにスクリーンして光調
節を確認した。1つのcDNAクローン,p6R7.2b1は,赤色
光調節mRNAを表現しないが,大きさおよび生産量の異な
る3つのポリ(A)+RNAとハイブリダイズしたことから
注目された。ニックトランスレーションしたp6t7.2b1
は,2,100ヌクレオチドおよび1,600ヌクレオチドのmRNA
とは強くハイブリダイズしたが,800ヌクレオチドの転写
物とはわずかしかハイブリダイズしなかった。しかしな
がら,p6T7.2b1のcDNA挿入物をpSP64にサブクローン化し
て構築したプラスミドである線形pCA210のSP6ポリメラ
ーゼ転写により生成される一本鎖32p−標識RNAとのノー
ザンブロットのハイブリダイゼーションは,3つの転写物
全部を容易に検出した。
熱に安定であることが知られているので,ノーザンブロ
ットハイブリダイゼーションにおいては,ニックトラン
スレーションしたDNAプローブではなく一本鎖RNAプロー
ブを使用した。やはり,ブロットがニックトランスレー
ションしたDNAあるいは一本鎖RNAプローブのいずれとハ
イブリダイズしたかにかかわらず,ノーザンブロット法
で測定されるように,1,600塩基の転写物は,2,100塩基の
転写物の約3分の1しか認められなかった。最も少ない
転写物は,RNAプローブとハイブリダイズしたブロットに
おける2,100塩基のmRNAの約半分であった。
ーン化し,ジデオキシヌクレオチド鎖終結法によって配
列決定した。クローンの配列分析は,TAA停止コドンで終
結する818bpの単一の長いオープンリーディングフレー
ムを明らかにした。National Biomedical Research Fou
ndationのライブラリーを,D fast Pプログラムを用い
て,推定アミノ酸配列と相同なタンパク配列について検
索した。トウモロコシcDNAクローンの推定アミノ酸配列
と,ウシおよびヒトのユビキチン配列との間には,95%
以上の相同性が認められた。
生苗から単離した。DNAをSau3Aによって部分的に消化さ
せ,大きさによって分別し,Charon 35(Loenenら(198
3)Gene26:171−179)のBamH I部位にクローン化した。
約2×106pfuのライブラリーを,ユビキチンcDNAクロー
ンをハイブリダイゼーションプローブとして用いて,in
situプラークハイブリダイゼーションにより,ユビキ
チンcDNAクローンと相同の配列を含む組換え体ファージ
についてスクリーニングした。ブロス溶解産物から組換
え体ファージを精製し,標準的技術を用いてファージDN
Aを単離した。制限エンドヌクレアーゼの消化は,製造
業者の指示書に従って実施した。
III,およびSac Iで消化し,0.7%アガロースゲル上で分
画し,これらのDNA断片をGene Screen PlusTM(DuPon
t)に移した。フィルターを,6×SSC(1×SSC=0.15M N
aCl,0.025Mクエン酸ナトリウム),5×デンハート培地,1
00μg/mの音波処理した変性サケDNA,20μg/mポリア
デニル酸,10mM EDTA二ナトリウム,および0.5%SDS中
で,65℃にて6〜8時間プレハイブリダイズさせた。フ
ィルターは,新鮮な緩衝液中で65℃にて,32p−標識プラ
スミドDNA(pCA210)とハイブリダイズさせた。Kodak X
−OMATARフィルムおよびDuPont Cronex Lightning Plus
増感スクリーンを1枚使用して,−80℃でオートラジオ
グラフィーを行った。各消化物において,8〜10の制限断
片が,ニックトランスレーションしたpCA210プローブと
ハイブリダイズした。このことは,ユビキチンが小さな
多重遺伝子群によってコードされることを示唆してい
る。ユビキチンが小さな多重遺伝子群によってコードさ
れるという証拠は,ツメガエル,大麦,および酵母につ
いても報告されている。
ダイズしたが,残りの断片は弱くハイブリダイズした。
ハイブリダイゼーション強度の差は配列相同性の相違を
反映すると考えられ,そのためcDNAプローブはそれが誘
導された遺伝子と優先的にハイブリダイズする。
付けが行われており,それぞれ6個および少なくとも12
個のユビキチンリピートを有している。ノーザンブロッ
トで検出された3つの転写物に相当するトウモロコシ遺
伝子は,2.1kb,1.6kb,および0.8kbのmRNAに,それぞれ7
個,5個,および1または2個のユビキチンリピートを有
しうる。本発明中で述べるトウモロコシ・ユビキチン遺
伝子は7個のリピートをコードする。従って,サザンブ
ロットで観察されたハイブリダイゼーション強度の差
は,制限断片が異なる数のユビキチンリピートを含むこ
との結果である。
部位を含まなかった。しかしながら,トウモロコシのユ
ビキチン遺伝子は,ゲノム消化物において使用される制
限エンドヌクレアーゼによって切断されるイントロンを
含みうる。この結果,ユビキチンのエクソンが異なる断
片に存在することになり,サザンブロットで観察された
ハイブリダイゼーション強度の差が説明される。
ー断片を使用して,ジデオキシヌクレオチド鎖終結法に
よる配列決定を実施した。cDNAクローンp6T7.2b.1に相
同なゲノミッククローン7.2b1(第1図B参照)の1.85k
b Pst I断片と,AC3#9M13RFと命名された直ぐ上流の2k
b Pst I断片とを,両方向でM13mp19にサブクローン化
した。組換え体ファージRF DNAをプラスミドDNAに関し
て調製した。これらのPst I断片の両方の鎖を配列決定
するために,一方向進行性欠失クローンを調製した。エ
キソヌクレアーゼIIIとエキソヌクレアーゼVIIとは,そ
れぞれNew England BiolabsおよびBethesda Research L
aboratoriesより入手した。University of Wisconsin G
enetics Computer Groupより提供されたプログラムを用
いてDNA配列のコンピューター分析を実施した。
5'非翻訳領域のイントロンとエキソンとの3'接合部を,S
1ヌクレアーゼマッピングによって決定した。S1プロー
ブに適した断片は以下のように調製した。ユビキチンDN
AをBq1 IIまたはXho Iのいずれかで消化した。次に,−
32P ATP(6,000 Ci/mmol,New England Nuclear,Bosto
n,MA)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New Englan
d Biolabs)を用いて,これらを32pで標識した。Bq1 II
およびXho I切断部位をキナーゼ処理した断片を,それ
ぞれPst IおよびEcoR Iでさらに消化すると,946bpのPst
I−Bq1 II断片および643bpのEcoR I−Xho I断片が生成
した。5%ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動す
ることにより,これらの断片を他の末端標識断片から分
離した。946bpのPst I−Bq1 II断片および643bpのEcoR
I−Xho I断片を含む切片を,ゲルから切除し,標識DNA
をゲルから溶出した。末端標識DNA断片(10〜20fmol)
を,80%の脱イオン化ホルムアミドを含有する緩衝液30
μ,0.4M塩化ナトリウム,40mM PIPES(pH6.4),およ
び1mM EDTA(pH8.0)中で,2μgのポリ(A)+RNAとハ
イブリダイズさせた。核酸溶液を80℃にて約16時間加熱
した。280mM塩化ナトリウム,50mM酢酸ナトリウム(pH4.
6),4.5mM硫酸亜鉛,および20μg/mの一本鎖DNAを含
む氷冷S1消化緩衝液(300μ)を添加し,DNAを250単位
/mのS1ヌクレアーゼ(New England Nuclear)で消化
した。2.5M酢酸アンモニウムおよび50mM EDTAを含むS1
終結混合物75μで反応を停止させた。次に,S1ヌクレ
アーゼ消化産物を6%ポリアクリルアミド/8M尿素ゲル
上で分離し,オートラジオグラフィーにより可視化し
た。ユビキチン配列中のS1保護断片の終点は,S1プロー
ブとして使用した末端標識断片にマクサム/ギルバート
塩基修飾−切断反応を実施して生成した梯子形配列と比
較することによって決定された。
列を第2図に示す。この配列は,翻訳開始部位の上流に
ある899塩基,5'非翻訳配列およびイントロン配列の1992
塩基,3'配列の249塩基に先行する7個のユビキチンタン
パクリピートをコードする1999塩基とを有する「TATA」
ボックスは,−30位に位置し,2個の重複する熱ショック
要素は,−214位と−204位とに位置する。トウモロコシ
に由来するユビキチン−1遺伝子,7.2b1のコーディング
および3'領域のDNA配列を第3図に示す。トウモロコ
シ,ユビキチンの誘導されたアミノ酸配列は上方に示さ
れ,7個のユビキチンリピートのヌクレオチド配列はその
下に並べられている。ゲノミックDNA中の7個の完全な
ユビキチン単位の構成の概要を第1図Cに示す。
列は同じである(第3図)。末端(7番目)のユビキチ
ンリピートは,TAA停止コドンの前に,付加的な77番目の
アミノ酸であるグルタミンを含む。この付加的なアミノ
酸は成熟ユビキチンには見られず,明らかにプロセッシ
ングの間に除去される。ヒト遺伝子における最終リピー
トの77番目のアミノ酸はバリンであり,2つのニワトリ遺
伝子においてはチロシンおよびアスパラギンである。酵
母ならびに大麦も,それぞれ余分なアミノ酸,アスパラ
ギンおよびリジンを持っている;しかしながら,ツメガ
エル遺伝子では余分なアミノ酸は見られなかった。この
余分なアミノ酸は,未処理のポリユビキチンの標的タン
パクへの接合に対するブロックとして機能すると言われ
ている。ポリアデニル化シグナル(AATAAT)は,停止コ
ドンから113bpの3'非翻訳配列に存在する。
るが,これらのリピートのヌクレオチド配列は39個もの
ヌクレオチドが変化している。これは,ユビキチン遺伝
子間のヌクレオチド配列の相同性について報告されてい
るのと同様である。ユビキチンリピート間におけるヌク
レオチド不整合の約80%は,コドンの第3(ゆらぎ)塩
基におけるものである。残りのヌクレオチドミス不整合
は,ロイシン(5コドン),セリン(3コドン)およ
び,アルギニン(3コドン)に対する代替コドンの使用
によって説明される。
つのより高等な植物である燕麦および大麦に関して決定
されたものと同じである。この配列は,酵母に関して報
告された配列とは2個のアミノ酸が異なっている;28位
および57位のセリンがアラニンに置換されている。ま
た,トウモロコシの配列は,すべての動物由来のユビキ
チンについて報告されている配列ともわずかに異なる;1
9位のプロリンがセリンに,24位のグルタミン酸がアスパ
ラギン酸に,57位のセリンがアラニンに置換されてい
る。従って,配列に基づけば,3種類のユビキチンが存在
すると思われる:植物,動物,および酵母。
構造遺伝子を有するプラスミドpUB−CATの構築 A.プロモーターの単離およびpUB−CATの構築 ユビキチン遺伝子上流領域−クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子融合物の構築
に使用した手順の概略を第4図に示す。CAT遺伝子と,
ノパリンシンターゼ(NOS)の3'非翻訳領域と,pNOS−CA
Tのポリアデニル化シグナル(Frommら(1985)Proc.Nat
l.Acad.Sci.82:5824−5828)とを含むBamH I−Hind III
制限断片を,BamH IおよびHind IIIで消化したpUC18にサ
ブクローン化した。この構築物をpUB−CATと命名した。
ポリタンパクコード領域の直ぐ上流にある約2.0kb Pst
I切断を,M13mp19にサブクローン化した。このDNAセグメ
ントは,第2図に示したトウモロコシ・ユビキチン配列
のヌクレオチド−899〜1092に及ぶ。この組換え体DNAは
AC3#9M13RFと命名され,ユビキチンプロモーターと,5'
非翻訳リーダー配列と,第4図でUBI−5'と名付けられ
た約1kbのイントロンとを含む。
物を,T4DNAポリメラーゼでAC3#9M13RFの2.0kb Pst I
断片を平滑末端化し,この断片をSma I消化のpUC18−CA
Tにクローン化することによって構築した。この構築物
をpUB−CATと命名した。
の導入 5〜6日齢の黄化した燕麦実生苗の葉(2g)をカミソ
リの刃で細かく切り刻んだ。この組織を消化培地(3mM
MES,pH5.7,10mM塩化カルシウム,0.5Mマンニトール,お
よび2mg/mアルギニン)で数回洗浄し,次いで2%セ
ルラーゼを含む20mの消化培地とともに室温で4時間
インキュベートした。この組織を時々攪拌してプロトプ
ラストを放出させた。この材料を63μmのメッシュで濾
過し,50×gで5分間遠心分離した。上澄み液を取り除
き,プロトプラストを消化培地で2回洗浄し,次いでエ
レクトロポレーション緩衝液中に懸濁して,各エレクト
ロポレーションにつき0.5mのプロトプラスト懸濁液を
調製した。エレクトロポレーション緩衝液は次のものか
ら構成されていた:10mM HEPES,pH7.2,150mM塩化ナトリ
ウム,4mM塩化カルシウム,および0.5Mマンニトール。
(0.5m)を氷上で,40μgのプラスミドDNAと,100μg
の音波処理したサケDNAとを含む0.5mのエレクトロポ
レーション緩衝液と混合した。これらのプロトプラスト
を,350V,70msecパルスにより,氷上でエレクトロポレー
ションした。これらのプロトプラストを氷上でさらに10
分間インキュベートし,10mのムラシゲ−スクーグ(M
S)培地中に希釈して,室温で24時間インキュベートし
た。
ト化した。上澄み液を取り除き,これらのプロトプラス
トをMS培地で1回洗浄した。このプロトプラストペレッ
トを200μの緩衝液A(0.25M Tris,pH7.8,1mM EDTA,1
mM β−メルカプトエタノール)中に懸濁し,微小遠心
分離管に移した。最低出力で5〜10秒間音波処理してプ
ロトプラストを粉砕した。プロトプラストの破片を4℃
で5分間遠心分離してペレット化した。上澄み液を取り
除き,10分間65℃に加熱し,−20℃で保存した。
(組換え体DNAで形質転換した細胞の抽出物)のアリク
ォット(100μ)を,80μの緩衝液Aと,20μ14C−
クロラムフェニコール(40〜60mCi/mM),2mgアセチルCo
A,および230μ緩衝液Aの混合物20μとに添加し
た。この反応物を37℃で90分間インキュベートした。反
応生産物を600μの酢酸エチルで抽出し,この酢酸エ
チルを蒸発させ,10μの酢酸エチルに再懸濁すること
により濃縮した。クロロホルム:メタノール(95:5,v/
v)溶媒を使用して薄層クロマトグラフィーにより反応
生産物を分離し,オートラジオグラフィーによって検出
した。
伝子により発現される酵素活性の量を測定することによ
り,宿主細胞の形質転換を測定した。本実施例では,DNA
構築物において,クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼをコードする構造遺伝子を使用した。組換
え体DNA融合構築物において使用したプロモーターの効
力を試験するために,トウモロコシ・ユビキチンプロモ
ーター−CAT遺伝子融合物pUC−CATと,V.Walbot,Stanfor
d Universityより入手したカリフラワーモザイクウイル
ス35Sプロモーター−CAT遺伝子融合物pCaMV−CAT(From
mら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5824−5828)と
のいずれかを使用して,平行エレクトロポレーションを
実施した。第5図に示すように,燕麦のプロトプラスト
においては,発現される酵素活性の量から判定すると,
ユビキチンプロモーターはCaMVプロモーターよりも「強
力」である。
苗を42℃のインキュベーターに移し,1,3,および8時間
後に採取した。全RNA(7μg)を単離し,変性し,1.5
%アガロース3%ホルムアルデヒドゲルに通して電気泳
動した。このRNAをGene Screenに移し,SP6 RNAポリメラ
ーゼを用いて線状pCA210から転写された一本鎖RNAをプ
ローブとして調べた。(組換え体プラスミドpCA210は,S
P6 RNAポリメラーゼがユビキチンmRNAとのハイブリダイ
ゼーションに特異的なRNAプローブを合成するように,p6
R7.2b1の975bp挿入物をpSP64(Promega)にサブクロー
ン化することによって構築した。)オートラジオグラフ
ィーを実施した後,バンドを切断し,フィルターに結合
した放射能の量を液体シンチレーションによって測定し
た。ノーザンブロットの分析から,3つのユビキチン転写
物のレベルを決定した。
は,2.5〜3倍に上昇した。1.6kb転写物については約2
倍の上昇が見られたが,0.8kb転写物では上昇が見られな
かった。実生苗を高温に移してから3時間後までに,大
きい方の2つのユビキチン転写物のレベルは,ショック
を与えていない組織で見い出されたレベルに戻ってお
り,少なくともさらに5時間は,そのレベルのままであ
った。トウモロコシでの熱ショック反応におけるユビキ
チンの一過性の性質は,ユビキチンが熱ショックにおい
て特殊な役割を持ち,短期間だけのユビキチンレベルの
上昇が必要であることを示している。
を第2図に示す。プロモーター領域内では,ヌクレオチ
ド配列は,異種プロモーターの上流に位置する場合にス
トレス誘発性を与えることが示されている(Pelham(19
82)前出)コンセンサス熱ショック配列と相同である。
ショウジョウバエの熱ショック要素に対するコンセンサ
ス配列は, 5'−CTGGAAT_TTCTAGA−3' であり,一般に転写開始部位より約26塩基上流に見い出
される。
位に対して5'側の900塩基内に位置するのは,2つの重複
する熱ショック配列である: −214位のヌクレオチドに始まる5'−CTGGA CCCCTCTCG
A−3',および −204位のヌクレオチドに始まる5'−CTCGA GAGTTCCGC
T−3'。
ーも,2つの重複する熱ショックコンセンサスプロモータ
ー配列を含むことが見い出された: −369位のヌクレオチドに始まる5'−CTCGA ATCTTCCAG
−3',および −359位のヌクレオチドに始まる5'−CCAGA GCTTTCTTT
T−3'。
前出)の5'隣接領域は,翻訳開始部位から365塩基上流
にある18kbの回転対称(回文対構造)配列,5'−TTCTAGA
ACGTTCTAGAA−3'を有する。この18bp配列の中央の14塩
基(下線部)は,推定される転写開始部位の約284ヌク
レオチド上流から始まる回転対称コンセンサス「熱ショ
ックボックス」ヌクレオチド配列に対する厳密な相同性
を有する。
置,および熱ショックや他のストレスに対する誘発反応
の程度への最終的な影響は,大部分が不明のままである
が,熱ショック要素が転写開始部位から5'側へ遠く位置
すればするほど,ストレスに対する反応の誘発レベルは
より小さいことが示唆されている。(U.Bondら(1986)
前出)。
モーター内の異なる位置に任意に配置されうること,お
よび改変されたプロモーター配列がストレス条件下およ
び非ストレス条件下での転写の開始,方向づけ,および
調節を含むユビキチンプロモーター機能を保持する限
り,配列を化学的に変化させるか,あるいは合成相同配
列で置き換えうることを仮定する。ヌクレオチドを挿入
および/あるいは欠失し,得られたDNA断片を操作する
のに必要な生化学的技術は,遺伝子再設計に関する当業
者には周知である。
よび大型イントロンの存在 トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターは,転写
開始部位より約200bp上流の2つの重複する熱ショック
配列の存在と,転写開始部位および翻訳開始コドンの間
の大型(約1kb)イントロンの存在とにより構造的に特
徴付けられる。このプロモーター構造は,ニワトリ胚線
維芽細胞由来のユビキチンプロモーターについて報告さ
れているもの(U.Bondら(1986)前出)と非常に類似し
ている。ニワトリ胚線維芽細胞では,2つの重複する熱シ
ョック配列が転写開始部位の約350bp上流に位置し,674b
pのイントロンが転写開始コドンと翻訳開始コドンとの
間に含まれている。最近(E.Ozkaynakら(1987)前
出),酵母ユビキチンUB14遺伝子由来のプロモーター領
域のヌクレオチド配列が決定され,転写開始部位の約28
0bp上流に熱ショック配列を含むことが明らかになった
が,この酵母ユビキチンプロモーターは,転写開始部位
と翻訳開始部位との間に大型イントロンを有さなかっ
た。しかしながら,イントロンを含む他の2つの酵母ユ
ビキチン遺伝子は,Pelhamの「熱ショックボックス」配
列と相同な配列を欠いていることが見い出された。
細胞,およびトウモロコシにおいて,熱ショックに応答
してユビキチンの発現を上昇調節することが示されてい
る。3つの系全部において,ユビキチンmRNAのレベル
は,熱ショック処理後に上昇し,トウモロコシおよびニ
ワトリ胚線維芽細胞ではユビキチンレベルの上昇は約3
倍と測定された。この熱ショック応答したユビキチン発
現の増強は,他の熱ショック遺伝子で得られるものより
も有意に低い。ニワトリ胚線維芽細胞では,45℃に曝露
した細胞中のユビキチンmRNAのレベルは,2.5時間にわた
って2.5倍に上昇するが,HSP70 mRNAのレベルは同じ熱シ
ョック条件下で10倍に上昇することが見い出された。さ
らに,3時間の熱ショックから細胞が回復する間(半減
期:約1.5〜2時間)におけるユビキチンmRNAの相対的
な不安定性は,安定であると見い出されたHSP70 mRNAの
不安定性とは有意に異なることが判明した。
転写開始コドンと翻訳開始コドンとの間に大型イントロ
ンを含まないのは興味深いことである。ユビキチンプロ
モーターと他の熱ショックプロモーターとの間のもう1
つの相違点は,ユビキチンが構成的かつ誘導的に発現さ
れるのに対して,従来の熱ショックタンパクの発現は,
主として熱ショックあるいは他のストレスに応答して起
こることである。本発明によれば,当業者は,ユビキチ
ンの構成的および/あるいは誘導的発現を変化させるた
めに,イントロン配列および熱ショック配列の両方の組
成配列ならびに位置を改変することができる。また,得
られた改変DNAのプロモーター機能を保持または向上さ
せるように,トウモロコシのユビキチンプロモーター領
域内のヌクレオチド配列を再配置したり,化学的に変化
させたりするためには,標準的な組換え技術が使用でき
る。ユビキチンプロモーター機能に関する試験は,実施
例2で述べたように実施できる。
来のDNAセグメントが開示されている。このユビキチン
プロモーター領域は,熱ショックコンセンサス要素を含
み,該プロモーターの制御下に置かれている遺伝子の転
写の開始および調節を行なう。また,高温のストレスを
受けた場合に,構造遺伝子の発現の調節および発現の調
節制御を行なうために,ユビキチンプロモーターが植物
発現可能な構造遺伝子と結合されているような組換えDN
A分子について述べられている。このような組換えDNA分
子が植物組織中に導入され,プロモーター/構造遺伝子
の組分せが発現される。
の分析図である。すなわち(A)はユビキチン遺伝子7.
2b1の制限地図;(B)はユビキチン遺伝子1の2つの
サブクローン化されたPst I断片の制限地図;(C)は
トウモロコシのユビキチン遺伝子1の構成の概略図であ
る。5'側の非翻訳エキソンは白4角で,縦列のユビキチ
ンをコードする領域は,番号を付けた4角でそれぞれ示
してある。
ノ酸配列を示す。S1ヌクレアーゼマッピングで決定され
た転写開始点は,塩基1と表示されている。推定の“TA
TA"ボックス(−30)を示す配列と,2つの重複する熱シ
ョックコンセンサス配列(−214と−204)には下線を付
けてある。イントロンは塩基84から塩基1093へと延び,
ポリユビキチンタンパクをコードする配列は,塩基1094
から塩基2693へと延びている。
が,同じアミノ酸配列をコードすることを示す。上記の
7つの反復部分のヌクレオチド配列を,誘導されたアミ
ノ酸配列の下に並べて示してある。追加の77番のアミノ
酸,グルタミンが,終止コドンの前の7番目の反復部分
内に存在している。ポリアデニル化シグナル,AATAAT
は,終止コドンから113bpの位置の3'側非翻訳領域内に
存在している。
域とクロラムフェニコールアセチントランスフェラーゼ
(CAT)遺伝子との融合体を構築するのに用いられた手
順の概略図である。
CaMV−CATは,カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモ
ーターとCAT遺伝子の融合体;UBQ−CATは,トウモロコシ
ユビキチンプロモーターとCAT遺伝子の融合体を示す。
Claims (10)
- 【請求項1】植物ユビキチン調節システムを含む1kb以
上2.1kb以下のDNAであって、 該調節システムが熱ショック要素およびイントロンを含
み、 該熱ショック要素が、以下の熱ショックコンセンサス配
列: (i) 5'−CTGGA CCCCT CTCGA−3'; (ii) 5'−CTCGA GAGTT CCGCT−3';および (iii) 5'−CTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCT−3'、 からなる群より選択される配列を含み、そして 該熱ショック要素が、転写開始部位の上流に位置し、前
記イントロンが該転写開始部位の下流に位置する、 DNA。 - 【請求項2】前記熱ショック要素の5'末端が、転写開始
部位の5'側約214ヌクレオチド以内に位置する、請求項
1に記載のDNA。 - 【請求項3】前記熱ショック要素が、以下の2つの熱シ
ョックコンセンサス配列: (i) 5'−CTGGA CCCCT CTCGA−3';および (ii) 5'−CTCGA GAGTT CCGCT−3'、を含む、請求項
2に記載のDNA。 - 【請求項4】前記熱ショック要素が、以下の熱ショック
コンセンサス配列: (iii) 5'−CTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCT−3'を含む、
請求項3に記載のDNA。 - 【請求項5】前記イントロンが約1kbの長さである、請
求項1に記載のDNA。 - 【請求項6】前記イントロンがトウモロコシユビキチン
プロモーターのイントロンである、請求項5に記載のDN
A。 - 【請求項7】前記イントロンの5'末端が、転写開始部位
の3'側84ヌクレオチド以内に位置する、請求項5に記載
のDNA。 - 【請求項8】植物ユビキチン調節システムを含む1kb以
上2.1kb以下のDNAと、植物発現性構造遺伝子とを有する
DNA構築物であって、 該調節システムが熱ショック要素およびイントロンを含
み、 該熱ショック要素が、以下の熱ショックコンセンサス配
列: (i) 5'−CTGGA CCCCT CTCGA−3'; (ii) 5'−CTCGA GAGTT CCGCT−3';および (iii) 5'−CTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCT−3'、 からなる群より選択される配列を含み、 該熱ショック要素が、転写開始部位の上流に位置し、前
記イントロンが該転写開始部位の下流に位置し、そして 該構造遺伝子が該植物ユビキチン調節システムの調節制
御下に置かれている、 DNA構築物。 - 【請求項9】前記構造遺伝子が、本来は熱ショック制御
下に置かれていない遺伝子をコードする、請求項8に記
載のDNA構築物。 - 【請求項10】植物細胞において構造遺伝子を構成的に
発現させるための、および選択されたストレス誘導によ
る該構造遺伝子の発現を増強するための方法であって、 (a)DNA構築物で該植物細胞を形質転換する工程であ
って、 該DNA構築物が、植物ユビキチン調節システムを含む1kb
以上2.1kb以下のDNAと、植物発現性構造遺伝子とを有
し、 該調節システムが熱ショック要素およびイントロンを含
み、 該熱ショック要素が、以下の熱ショックコンセンサス配
列: (i) 5'−CTGGA CCCCT CTCGA−3'; (ii) 5'−CTCGA GAGTT CCGCT−3';および (iii) 5'−CTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCT−3'、 からなる群より選択される配列を含み、 該熱ショック要素が、転写開始部位の上流に位置し、前
記イントロンが該転写開始部位の下流に位置し、そし
て、 該構造遺伝子が該植物ユビキチン調節システムの調節制
御下に置かれている、工程、ならびに (b)該形質転換した植物細胞にストレス状態を選択的
に与え、該構造遺伝子の発現増強を誘導する工程、 を包含する方法。
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