KR102003176B1 - 식물 조절 요소 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물 및 식물 세포에서 유전자 발현을 조정하기 위해 유용한, 그들의 뉴클레오티드 서열을 비롯한 신규한 DNA 분자 및 구축물을 제공한다. 본 발명은 또한 이종성 전사가능 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물, 식물 세포, 식물 부분, 종자, 및 상품을 그들의 사용 방법과 함께 제공한다.

Description

식물 조절 요소 및 그의 용도{PLANT REGULATORY ELEMENTS AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 참조
본원은 그 전부가 본원에 참고로 포함된, 2011년 3월 25일 출원된 미국 특허 가출원 61/467,875을 기초로 한 이익을 주장한다.
서열 목록의 포함
347 킬로바이트 (마이크로소프트 윈도우즈 (Microsoft Windows)®에서 측정할 때)이고 2012년 3월 21일에 생성된 "MONS282WO_seq.txt"로 명명된 파일에 포함된 서열 목록이 본원과 함께 전자 파일로 제출되고, 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 식물 분자 생물학 및 식물 유전 공학 분야, 및 식물에서 유전자 발현의 조절에 유용한 DNA 분자에 관한 것이다.
조절 요소는 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 전사를 조절함으로써 유전자 활성을 조절하는 유전 요소이다. 상기 요소는 프로모터, 리더, 인트론, 및 3' 비번역 영역을 포함하고, 식물 분자 생물학 및 식물 유전 공학 분야에 유용하다.
발명의 개요
본 발명은 식물에서 사용하기 위한 신규한 유전자 조절 요소를 제공한다. 본 발명은 또한 조절 요소를 포함하는 DNA 구축물을 제공한다. 본 발명은 또한 조절 요소를 포함하는 트랜스제닉 (transgenic) 식물 세포, 식물, 및 종자를 제공한다. 서열은 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 상태로 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자는 본원에서 제공되는 조절 서열에 대해 이종성일 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 조절 요소 서열은 따라서 특정 실시양태에서 이종성 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 것으로 규정될 수 있다. 본 발명은 또한 조절 요소의 제조 및 사용 방법, 조절 요소를 포함하는 DNA 구축물, 및 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포, 식물, 및 종자를 제공한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 a) 서열 1-158 및 180-183 중의 서열에 적어도 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열; b) 서열 1-158 및 180-183 중의 서열을 포함하는 서열; 및 c) 서열 1-158 및 180-183 중의 서열의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공하고, 여기서 단편은 유전자-조절 활성을 갖고; 서열은 이종성 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된다. 구체적인 실시양태에서, DNA 분자는 서열 1-158 및 180-183 중의 서열의 DNA 서열에 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 포함한다. DNA 분자의 특정 실시양태에서, DNA 서열은 조절 요소를 포함한다. 몇몇의 실시양태에서, 조절 요소는 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이종성 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자는 농경학적 관심 유전자, 예컨대 식물에서 제초제 내성을 제공할 수 있는 유전자, 또는 식물에서 식물 해충 내성을 제공할 수 있는 유전자를 포함한다.
본 발명은 또한 서열 1-158 및 180-183 중의 서열, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하는, 본 발명에 의해 제공되는 이종성 DNA 구축물을 포함하는 트랜스제닉 식물 세포를 제공하고, 여기서 상기 서열은 이종성 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 트랜스제닉 식물 세포는 단자엽 식물 세포이다. 다른 실시양태에서, 트랜스제닉 식물 세포는 쌍자엽 식물 세포이다.
추가로, a) 서열 1-158 및 180-183 중의 서열에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열; b) 서열 1-158 및 180-183 중의 서열을 포함하는 서열; 및 c) 서열 1-158 및 180-183 중의 서열의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는, 본원에서 제공되는 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물, 또는 그의 일부가 본 발명에 의해 제공되고, 여기서 단편은 유전자-조절 활성을 갖고; 서열은 이종성 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된다. 구체적인 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 DNA 분자를 포함하는 출발 트랜스제닉 식물에 대해 DNA 분자를 포함하는 임의의 세대의 자손체 식물일 수 있다. 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 종자가 추가로 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물 또는 그의 일부를 얻고, 및 그로부터 상품을 생산하는 것을 포함하는, 상품의 생산 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 상품은 단백질 농축물, 단백질 단리물, 곡실 (grain), 전분, 종자, 굵은 곡분 (meal), 고운 곡분 (flour), 바이오매스 (biomass), 또는 종자 오일이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 방법을 사용하여 생산된 상품을 제공한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 a) 서열 1-158 및 180-183 중의 서열에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열; b) 서열 1-158 및 180-183 중의 서열을 포함하는 서열; 및 c) 서열 1-158 및 180-183 중의 서열의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는, 본원에서 제공되는 DNA 분자를 포함하는 상품을 제공하고, 여기서 단편은 유전자-조절 활성을 갖고; 서열은 이종성 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물, 예컨대 본원에서 설명되는 DNA 분자를 포함하는 식물을 얻고, DNA 분자 내의 전사가능 폴리뉴클레오티드가 발현되는 식물을 재배하는 것을 포함하는, 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 발현 방법을 제공한다.
본원 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐서, 문맥상 다른 내용을 필요로 하지 않으면, 단어 "포함하다" 및 그의 변형 표현, 예컨대 "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 조성물, 단계, 및/또는 값, 또는 이들의 조합을 포함함을 시사하지만, 임의의 다른 조성물, 단계, 및/또는 값, 또는 이들의 조합을 배제하지 않음이 이해될 것이다.
도 1a-1h는 목초 (grass) 종 안드로포곤 게라르디이 (Andropogon gerardii)로부터 단리된 프로모터 요소에 대응하는 프로모터 크기 변이체의 정렬을 도시한 것이다. 특히, 도 1a-1h는 P-ANDge.Ubq1-1:1:11의 결실 분석을 통해 유도된 프로모터 서열과 함께 전사 조절 발현 요소 군 EXP-ANDge.Ubq1:1:9 (서열 번호 1)에서 발견되는 2603 bp 프로모터 서열 P-ANDge.Ubq1-1:1:11 (서열 번호 2)의 정렬을 보여준다. 예를 들어 P-ANDge.Ubq1-1:1:11의 5' 단부의 결실은 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5) 내에서 발견되는 2114 bp 서열인 프로모터 P-ANDge.Ubq1-1:1:9 (서열 번호 6)를 생성하였다. 도 1 내의 다른 프로모터 서열은 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8) 내에 포함되는 1644 bp 서열인 P-ANDge.Ubq1-1:1:10 (서열 번호 9); EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10) 내에 포함되는 1472 bp 서열인 P-ANDge.Ubq1-1:1:12 (서열 번호 11); EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12) 내에 포함되는 1114 bp 서열인 P-ANDge.Ubq1-1:1:8 (서열 번호 13); EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14) 내에 포함되는 771 bp 서열인 P-ANDge.Ubq1-1:1:13 (서열 번호 15); 및 EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16) 내에 포함되는 482 bp 서열인 P-ANDge.Ubq1-1:1:14 (서열 번호 17)를 포함한다.
도 2a-2g는 목초 사카룸 라베나에 (Saccharum ravennae) (에리안투스 라베나에 (Erianthus ravennae))로부터 단리된 프로모터 변이체의 정렬을 도시한 것이다. 특히, 도 2a-2g는 P-ERIra.Ubq1-1:1:10의 결실 분석으로부터 유도된 프로머터 서열, 즉 2014 bp 프로모터 서열 P-ERIra.Ubq1-1:1:9 (서열 번호 23); 1525 bp 프로모터 서열 P-ERIra.Ubq1-1:1:11 (서열 번호 26); 1044 bp 프로모터 서열 P-ERIra.Ubq1-1:1:8 (서열 번호 28); 796 bp 서열 P-ERIra.Ubq1-1:1:12 (서열 번호 30); 및 511 bp 서열 P-ERIra.Ubq1-1:1:13 (서열 번호 32)과 함께 2536 bp 프로모터 서열 P-ERIra.Ubq1-1:1:10 (서열 번호 19) (예를 들어, 전사 조절 발현 요소 군 EXP-ERIra.Ubq1 (서열 번호 18) 내에서 발견됨)의 정렬을 보여준다.
도 3a-3c는 목초 종 세타리아 비리디스 (Setaria viridis)로부터 단리된 프로모터 요소에 대응하는 프로모터 크기 변이체의 정렬을 도시한 것이다. 특히, 도 3a-3c는 P-Sv.Ubq1-1:1:1의 5' 단부의 결실 분석으로부터 유도된 프로모터, 즉 1035 bp 크기 프로모터 P-Sv.Ubq1-1:1:2 (서열 번호 38); 및 681 bp 프로모터 서열 P-Sv.Ubq1-1:1:3 (서열 번호 40)과 함께 1493 bp 프로모터 서열인 P-Sv.Ubq1-1:1:1 (서열 번호 34)의 정렬을 보여준다.
도 4a-4e는 목초 제아 메이즈 아종 멕시카나 (Zea mays subsp. mexicana)로부터 유도된 전사 조절 발현 요소 군 변이체의 정렬을 도시한 것이다. 특히, 도 4a-4e는 EXP-Zm.UbqM1:1:2 (서열 번호 49)로 명명된 2005 bp 전사 조절 발현 요소 군과 대립유전자 변이체 EXP-Zm.UbqM1:1:5 (서열 번호 53), 및 길이가 1922 bp인 크기 변이체 EXP-Zm.UbqM1:1:1 (서열 번호 41), 및 길이가 1971 bp인 EXP-Zm.UbqM1:1:4 (서열 번호 45)와 비교한 것이다.
도 5a-5b는 목초 소르굼 비콜로르 (Sorghum bicolor)로부터 단리된 프로모터 크기 변이체의 정렬을 도시한 것이다. 특히, 도 5a-5b는 EXP-Sb.Ubq6:1:1 (서열 번호 63) 내에 포함된 855 bp 프로모터 요소 P-Sb.Ubq6-1:1:1 (서열 번호 64)과 함께 전사 조절 발현 요소 군 EXP-Sb.Ubq6 (서열 번호 59) 내에 포함된 791 bp 크기 프로모터 요소인 P-Sb.Ubq6-1:1:2 (서열 번호 60)의 정렬을 보여준다.
도 6a-6c는 목초 세타리아 이탈리카 (Setaria italica)로부터 단리된 프로모터 요소에 대응하는 프로모터 크기 변이체의 정렬을 도시한 것이다. 특히, 도 6a-6c는 1492 bp 프로모터 변이체 P-SETit.Ubq1-1:1:4 (서열 번호 74), 1034 bp 프로모터 요소 P-SETit.Ubq1-1:1:2 (서열 번호 76), 및 680 bp 프로모터 요소 P-SETit.Ubq1-1:1:3 (서열 번호 78)과 함께 1492 bp 프로모터 변이체 P-SETit.Ubq1-1:1:1 (서열 번호 70)의 정렬을 보여준다.
도 7a-7b는 목초 종 (코익스 라크리마-조비 (Coix lacryma-jobi))로부터 단리된 프로모터 요소에 대응하는 프로모터 크기 변이체 및 인핸서 (ennhancer) 요소의 정렬을 도시한 것이다. 특히, 도 7a 및 7b는 길이가 798 bp인 E-C1.Ubq1:1:1 (서열 번호 89)로 명명된 P-C1.Ubq1-1:1:1로 유도된 인핸서 단편, 및 P-C1.Ubq1-1:1:1의 3개의 5' 단부 결실 변이체, 즉 742 bp 요소 P-C1.Ubq1-1:1:4 (서열 번호 84); 401 bp 요소 P-C1.Ubq1-1:1:3 (서열 번호 86); 및 54 bp 최소 프로모터 요소 P-C1.Ubq1-1:1:5 (서열 번호 88)와 함께 전사 조절 발현 요소 군 EXP-C1.Ubq1:1:1 (서열 번호 79) 내에서 발견되는 837 bp 프로모터 변이체인 P-C1.Ubq1-1:1:1 (서열 번호 80)의 정렬을 보여준다.
도 8은 본 발명의 트랜스진 (transgene) 카세트 (cassette) 입체형태를 도시한 것이다.
서열의 간단한 설명
서열 1, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 45, 49, 53, 55, 59, 63, 65, 69, 73, 75, 77, 79, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 180, 181 및 183은 인트론 서열의 5'에 작동가능하게 연결된 리더 서열의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 전사 조절 발현 요소 군의 서열 또는 EXP 서열이다.
서열 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 및 135는 프로모터 서열이다.
서열 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 및 81은 리더 서열이다.
서열 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 및 182는 인트론 서열이다.
서열 89는 인핸서의 서열이다.
발명의 상세한 설명
본원에 개시된 발명은 식물 종으로부터 유익한 유전자 조절 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드 분자의 설계, 구축 및 용도가 본 발명에서 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열은 서열 1-158 및 180-183에 제시된다. 이들 폴리뉴클레오티드 분자는 예를 들어 식물 조직에서 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 발현에 영향을 주고, 따라서 트랜스제닉 식물에서 유전자 발현, 또는 코딩되는 유전자 산물의 활성을 선택적으로 조절할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 분자의 변형, 생산 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 프로모터 및/또는 다른 개시된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 조성물, 형질전환된 숙주 세포, 트랜스제닉 식물, 및 종자, 및 그의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
다음 정의 및 방법은 본 발명을 보다 잘 규정하고 본 발명의 실행시에 관련 기술 분야의 통상적인 기술을 갖는 자에게 설명하기 위해 제공된다. 달리 언급되지 않으면, 용어는 관련 기술 분야의 통상적인 기술을 갖는 자에게 지침이 되도록 하기 위한 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다.
DNA 분자
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "DNA" 또는 "DNA 분자"는 5' (상류) 말단으로부터 3' (하류) 말단으로 판독되는, 게놈 또는 합성 기원의 이중가닥 DNA 분자, 즉, 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 중합체 또는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "DNA 서열"은 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에서 사용된 명명법은 WIPO 표준 ST.25 (1998)의 표, 부록 2, 표 1 및 3에 개시되고 미국 연방규정집 (United States Code of Federal Regulations) § 1.822의 표제 37에 대응하는 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된 DNA 분자"는 DNA 분자가 그의 천연 상태 또는 자연 상태에서 정상적으로는 결합되는 다른 분자로부터 적어도 부분적으로 분리되는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 용어 "단리된"은 DNA 분자가 그의 천연 상태 또는 자연 상태에서 정상적으로는 DNA 분자의 측면에 위치하는 핵산으로부터 적어도 부분적으로 분리되는 것을 지칭한다. 따라서, 정상적으로는 결합되지 않은 조절 또는 코딩 서열에 (예를 들면 재조합 기술의 결과로서) 융합된 DNA 분자는 본원에서 단리된 것으로 간주된다. 그러한 분자는 숙주 세포의 염색체 내로 통합되거나 또는 다른 DNA 분자를 함유한 핵산 용액 중에 존재할 때도 단리된 것으로 간주되고, 그 이유는 이들이 그의 천연 상태에 존재하지 않기 때문이다.
본 발명에 개시된 DNA 분자, 또는 그의 단편을 단리 및 조작하기 위해 당업자에 공지된 임의의 수의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, PCR (중합효소 연쇄 반응) 기술을 사용하여, 특정 출발 DNA 분자를 증폭하고/하거나 본래의 분자의 변이체를 생성할 수 있다. DNA 분자, 또는 그의 단편은 또한 다른 기술에 의해, 예를 들면 화학적 수단에 의한 단편의 직접 합성으로 수득할 수 있으며, 이는 통상적으로 올리고뉴클레오티드 자동 합성기를 사용하여 실시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 동일성"은 2개의 최적으로 정렬된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 2개의 최적으로 정렬된 폴리펩티드 서열이 동일한 정도를 의미한다. 최적 서열 정렬은 적절한 내부 뉴클레오티드 삽입, 결실, 또는 갭 (gap)을 사용하여 서열 정렬 내의 뉴클레오티드 매치의 수를 최대화하기 위해 2개의 서열, 예를 들어 참조 서열 및 또 다른 서열을 수동으로 정렬함으로써 생성된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "참조 서열"은 서열 1-158 및 180-183의 폴리뉴클레오티드 서열로서 제시되는 서열을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 동일성 비율" 또는 "동일성 비율" 또는 "동일성 %"는 동일성 분율 x 100이다. 참조 서열과 최적으로 정렬된 서열에 대한 "동일성 분율"은 최적 정렬 내의 뉴클레오티드 매치의 수를 참조 서열 내의 뉴클레오티드의 총수, 예를 들어 전체 참조 서열의 전체 길이 내의 뉴클레오티드의 총수로 나눈 값이다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 서열 1-158 및 180-183으로서 본원에서 제공되는 참조 서열에 최적으로 정렬될 때 참조 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98% 동일성, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNA 분자이다. 특정 실시양태에서, 상기 서열은 유전자-조절 활성을 갖는 것으로서 규정될 수 있다.
조절 요소
조절 요소는 유전자 조절 활성을 갖는 DNA 분자, 즉, 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 주는 능력을 갖는 것이다. 용어 "유전자 조절 활성"은 따라서 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 전사 및/또는 번역에 영함을 줌으로써 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 발현 패턴에 영향을 주는 능력을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 전사 조절 발현 요소 군 또는 "EXP" 서열은 작동가능하게 연결된 발현 요소, 예컨대 인핸서, 프로모터, 리더 및 인트론으로 이루어질 수 있다. 따라서 전사 조절 발현 요소 군은 예를 들어 인트론 서열의 5'에 작동가능하게 연결된 리더 서열의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터로 이루어질 수 있다. 인트론 서열은 천연 서열의 제1 인트론/엑손 스플라이스 (splice) 연결 지점에서 시작하는 서열로 이루어질 수 있고, 추가로, 생성되는 전사체의 전사 및 적절한 프로세싱 (processing)을 용이하게 하기 위한 적절한 인트론/엑손 프로세싱을 제공하기 위해 제2 인트론/엑손 스플라이스 연결부를 포함하는 작은 리더 단편으로 이루어질 수 있다. 리더 및 인트론은 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 전사 및 생성되는 전사된 RNA의 번역에 긍정적인 영향을 줄 수 있다. 미리 프로세싱된 RNA 분자는 리더 및 인트론을 포함하고, 이들은 전사된 RNA의 전사후 프로세싱 및/또는 전사된 RNA 분자의 세포 핵으로부터 세포질 내로의 수송에 영향을 줄 수 있다. 전사된 RNA 분자의 전사후 프로세싱 후에, 리더 서열은 최종 메신저 RNA의 일부로서 보유될 수 있고, 메신저 RNA 분자의 번역에 긍정적인 영향을 줄 수 있다.
조절 요소, 예컨대 프로모터, 리더, 인트론, 및 전사 종료 영역 (또는 3' UTR)은 유전자 조절 활성을 갖고 살아있는 세포 내의 유전자의 전체 발현에서 필수적인 기능을 담당하는 DNA 분자이다. 용어 "조절 요소"는 유전자 조절 활성을 갖는 DNA 분자, 즉 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 주는 능력을 갖는 것이다. 식물에서 기능하는 단리된 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 리더는 따라서 유전 공학의 방법을 통한 식물 표현형의 변형에 유용하다.
조절 요소는, 예컨대 그들의 일시적, 공간적, 발생적, 조직, 환경적, 생리학적, 병리학적, 세포 주기, 및/또는 화학적으로 반응하는 발현 패턴, 및 이들의 임의의 조합에 의한 그들의 발현 패턴 효과 (정성적으로 및/또는 정량적으로), 예를 들어 긍정적인 또는 부정적인 효과 및/또는 구성적 또는 다른 효과에 의해 및 정량적 또는 정성적 표시에 의해 특징지을 수 있다. 프로모터는 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조정하기 위한 조절 요소로서 유용하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유전자 발현 패턴"은 작동가능하게 연결된 DNA 분자의 전사된 RNA 분자로의 임의의 전사 패턴이다. 전사된 RNA 분자는 번역되어 단백질 분자를 생성하거나 또는 안티센스 또는 다른 조절 RNA 분자, 예컨대 dsRNA, tRNA, rRNA, miRNA 등을 생성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질 발현"은 전사된 RNA 분자의 단백질 분자로의 임의의 번역 패턴이다. 단백질 발현은 그의 일시적, 공간적, 발생적, 또는 형태학적 질에 의해 및 정량적 또는 정성적 표시에 의해 특징지을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 일반적으로 전사를 개시하기 위해 RNA 중합효소 II 및 다른 단백질 (트랜스 작용 (trans-acting) 전사 인자)의 인식 및 결합에 관련되는 DNA 분자를 의미한다. 프로모터는 유전자의 게놈 카피의 5' 비번역 영역 (5' UTR)로부터 초기에 단리될 수 있다. 별법으로, 프로모터는 합성에 의해 생산되거나 조작된 DNA 분자일 수 있다. 프로모터는 또한 2 이상의 이종성 DNA 분자의 융합을 통해 생성된 프로모터인 키메릭 (chimeric) 프로모터일 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 프로모터는 서열 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 및 135, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시양태에서, 상기 분자 및 본원에서 설명되는 그의 임의의 변이체 또는 유도체가 프로모터 활성을 포함하는, 즉, 숙주 세포, 예컨대 트랜스제닉 식물에서 프로모터로서 작용할 수 있는 것으로서 추가로 규정된다. 추가의 구체적인 실시양태에서, 단편은 그 단편이 유도되는 출발 프로모터 분자가 갖는 프로모터 활성을 보이는 것으로서 규정될 수 있거나, 또는 단편은 기저 전사 수준을 제공하고 전사 개시를 위해 RNA 중합효소 II 복합체의 인식 및 결합을 위한 TATA 박스 또는 이와 동등한 서열로 이루어지는 "최소 프로모터"를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 프로모터 서열의 단편이 제공된다. 프로모터 단편은 상기 설명한 바와 같은 프로모터 활성을 포함할 수 있고, 단독으로 또는 키메릭 프로모터의 구축에서와 같이 다른 프로모터 및 프로모터 단편과 조합되어 유용할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자의 적어도 약 50, 95, 150, 250, 500, 750, 또는 적어도 약 1000개의 연속적인 뉴클레오티드, 또는 그 초과의 뉴클레오티드를 포함하는 프로모터의 단편이 제공된다.
서열 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 및 135로서 제시된 임의의 프로모터로부터 유도된 조성, 예컨대 내부 또는 5' 결실은 예를 들어 발현에 대한 긍정적인 또는 부정적인 효과를 갖는 요소의 제거; 발현에 대한 긍정적인 또는 부정적인 효과를 갖는 요소의 복제; 및/또는 발현에 대한 조직 또는 세포 특이적 효과를 갖는 요소의 복제 또는 제거를 비롯하여 발현을 개선하거나 변경하기 위해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. TATA 박스 요소 또는 그의 동등한 서열 및 하류 서열이 제거된 3' 결실을 포함하는, 서열 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 및 135로서 제시된 임의의 프로모터로부터 유도된 조성이 예를 들어 인핸서 요소를 만들기 위해 사용될 수 있다. 발현에 대한 긍정적인 또는 부정적인; 조직 특이적; 세포 특이적; 또는 타이밍 특이적 (비제한적인 예로서, 일주기성 리듬 (circadian rhythm)) 효과를 갖는 임의의 요소를 제거하기 위해 추가의 결실이 이루어질 수 있다. 서열 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 및 135로서 제시된 임의의 프로모터 및 이로부터 유도된 단편 또는 인핸서는 다른 인핸서 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 및 135로서 제시된 임의의 프로모터 및 이로부터 유도된 단편 또는 인핸서로 이루어진 키메릭 전사 조절 요소 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 특정 트랜스진의 목적하는 발현 측면에 대한 본원에서 설명되는 변형, 복제 또는 결실의 효능은 결과를 입증하기 위해 안정한 및 일시적 식물 검정, 예컨대 본원의 실시예에서 설명되는 것에서 실험에 의해 시험될 수 있고, 상기 시험은 출발 분자에서 시행된 변화 및 변화의 목적에 따라 상이할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리더"는 유전자의 게놈 카피의 비번역 5' 영역 (5' UTR)로부터 단리되고 일반적으로 전사 개시 부위 (TSS)와 단백질 코딩 서열 개시 부위 사이의 뉴클레오티드 분절 (segment)로서 규정된 DNA 분자를 의미한다. 별법으로, 리더는 합성에 의해 생산되거나 조작된 DNA 요소일 수 있다. 리더는 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조정하기 위한 5' 조절 요소로서 사용될 수 있다. 리더 분자는 이종성 프로모터와 함께 또는 그의 천연 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 프로모터 분자는 그의 천연 리더에 작동가능하게 연결될 수 있거나 또는 이종성 리더에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 리더는 서열 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 및 81 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 서열은 예를 들어 트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 숙주 세포에서 리더로서 작용할 수 있는 것으로서 규정되어 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 서열은 리더 활성을 포함하는 것으로서 이해된다.
서열 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 및 81로서 제시된 리더 서열 (5' UTR)은 조절 요소로 이루어질 수 있거나 또는 트랜스진의 전사 또는 번역에 대해 효과를 가질 수 있는 2차 구조를 취할 수 있다. 서열 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 및 81로서 제시된 리더 서열은 트랜스진의 전사 또는 번역에 영향을 주는 키메릭 조절 요소를 만들기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 추가로, 서열 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 및 81로서 제시된 리더 서열은 트랜스진의 전사 또는 번역에 영향을 주는 키메릭 리더 서열을 만들기 위해 사용될 수 있다.
새로운 식물 숙주 내로의 외래 유전자의 도입이 항상 도입되는 유전자의 높은 발현을 유발하는 것은 아니다. 또한, 복합 형질을 다룰 때, 공간적으로 또는 일시적으로 상이한 발현 패턴을 갖는 몇몇 유전자를 조정하는 것이 때로 필요하다. 인트론이 원칙적으로 상기 조정을 제공할 수 있다. 그러나, 한 식물에서 동일한 인트론의 다수 회 사용은 단점을 보이는 것으로 밝혀졌다. 이 경우에, 적절한 재조합 DNA 요소의 구축을 위해 기본적인 일군의 제어 요소를 갖는 것이 필요하다. 발현 향상 특성을 갖는 당업계에 공지된 인트론은 제한적이기 때문에, 대안이 필요하다.
서열 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 및 182로서 제시된 임의의 인트론으로부터 유도된 조성은 시스 조절 요소의 내부 결실 또는 복제를 포함할 수 있고/있거나 인트론/엑손 스플라이스 연결부를 포함하는 5' 및 3' 서열의 변경은 프로모터 + 리더 또는 키메릭 프로모터 + 리더 및 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 때 발현 또는 발현의 특이성을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 인트론/엑손 스플라이스 연결부를 포함하는 5' 및 3' 영역의 변경은 메신저 RNA의 프로세싱 및 스플라이싱 (splicing) 후에 생성되는 전사체에 위 (false) 개시 및 정지 코돈이 도입될 가능성을 감소시키기 위해 시행될 수 있다. 인트론은 트랜스진의 발현에 대한 인트론의 효과를 결정하기 위해 실시예에서 설명되는 바와 같이 실험에 의해 시험될 수 있다.
본 발명에 따르면, 프로모터 또는 프로모터 단편은 공지의 프로모터 요소, 즉 DNA 서열 특징, 예컨대 TATA-박스 및 다른 공지의 전사 인자 결합 부위 모티프의 존재에 대해 분석할 수 있다. 상기 공지의 프로모터 요소의 확인은 본래의 프로모터와 유사한 발현 패턴을 갖는 프로모터의 변이체를 설계하기 위해 당업자에 의해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인핸서" 또는 "인핸서 요소"는 전체 발현 패턴의 측면을 부여하지만 대체로 단독으로 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 유도하기에는 불충분한, 시스-요소로도 알려진 시스-작용 전사 조절 요소를 의미한다. 프로모터와 달리, 인핸서 요소는 대체로 전사 개시 부위 (TSS) 또는 TATA 박스 또는 동등한 서열을 포함하지 않는다. 프로모터는 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 전사에 영향을 주는 하나 이상의 인핸서 요소를 천연적으로 포함할 수 있다. 또한, 단리된 인핸서 요소는 프로모터에 융합되어, 유전자 발현의 전체 조정 측면을 부여하는 키메릭 프로모터 시스-요소를 생성할 수 있다. 프로모터 또는 프로모터 단편은 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 달성하는 하나 이상의 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 많은 프로모터 인핸서 요소는 DNA-결합 단백질에 결합하고/하거나 DNA 토폴로지 (topology)에 영향을 주고, 이에 의해 DNA 주형에 대한 RNA 중합효소의 접근을 선택적으로 허용하거나 제한하거나 또는 전사 개시 부위에서 이중 나선의 선택적인 개방을 용이하게 하는 국소 입체형태를 생성하는 것으로 생각된다. 인핸서 요소는 전사를 조절하는 전사 인자에 결합하는 기능을 수행할 수 있다. 몇몇의 인핸서 요소는 하나 초과의 전사 인자에 결합하고, 전사 인자는 하나 초과의 인핸서 도메인과 상이한 친화도로 상호작용할 수 있다. 인핸서 요소는 결실 분석, 즉 5' 단부 또는 프로모터의 내부로부터 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실; DNase I 풋프린팅 (footprinting), 메틸화 간섭, 전기영동 이동성-전환 검정, 라이게이션-매개 PCR에 의한 생체내 게놈 풋프린팅, 및 다른 통상적인 검정을 사용한 DNA 결합 단백질 분석; 또는 통상적인 DNA 서열 비교 방법, 예컨대 BLAST에 의한, 공지의 시스-요소 모티프 또는 인핸서 요소를 표적 서열 또는 표적 모티프로서 사용하는 DNA 서열 유사성 분석을 포함하는 많은 기술에 의해 확인할 수 있다. 인핸서 도메인의 정밀한 구조는 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이 유발 (또는 치환) 또는 다른 통상적인 방법에 의해 추가로 연구될 수 있다. 인트론 요소는 화학적 합성에 의해 또는 상기 요소를 포함하는 조절 요소로부터의 단리에 의해 얻을 수 있고, 이들은 하위서열 조작을 용이하기에 유용한 제한 효소를 함유하는 추가의 측면에 위치하는 뉴클레오티드를 사용하여 합성될 수 있다. 따라서, 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조정하기 위한, 본원에 개시된 방법에 따른 인핸서 요소의 설계, 구축 및 용도가 본 발명에 의해 포함된다.
식물에서, 몇몇 인트론을 유전자 구축물 내에 포함시키면 인트론이 결여된 구축물에 비해 mRNA 및 단백질 축적이 증가한다.
상기 효과는 유전자 발현의 "인트론 매개 향상" (IME)으로 명명되었다 (Mascarenhas et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920). 식물에서 발현을 자극하는 것으로 알려진 인트론이 옥수수 유전자에서 확인되었다 (예를 들어, tubA1, Adh1, Sh1, Ubi1 ([Jeon et al. (2000) Plant Physiol. 123:1005-1014]; [Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200]; [Vasil et al. (1989) Plant Physiol. 91:1575-1579]; [Christiansen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689]) 및 벼 유전자 (예를 들어 salt, tpi: [McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990)]; [Xu et al., Plant Physiol. 106:459-467 (1994)]). 이와 유사하게, 페튜니아 (예를 들어 rbcS), 감자 (예를 들어 st-ls1) 및 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) (예를 들어 ubq3 및 pat1)로부터의 것과 유사한 쌍자엽 식물 유전자로부터의 인트론은 유전자 발현 속도를 향상시키는 것으로 밝혀졌다 ([Dean et al. (1989) Plant Cell 1:201-208]; [Leon et al. (1991) Plant Physiol. 95:968-972]; [Norris et al. (1993) Plant Mol Biol 21:895-906]; [Rose and Last (1997) Plant J.11:455-464]). 인트론의 스플라이스 부위 내의 결실 또는 돌연변이는 유전자 발현을 감소시키는 것으로 밝혀졌고, 이것은 스플라이싱이 IME를 위해 필요할 수 있음을 나타낼 수 있다 ([Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol Biol. 15:913-920]; [Clancy and Hannah (2002) Plant Physiol. 130:918-929]). 그러나, 스플라이싱 자체가 쌍자엽 식물에서 특정 IME를 위해 필요하지 않다는 것은 에이. 탈리아나의 pat1 유전자의 스플라이스 부위 내의 점 돌연변이에 의해 밝혀졌다 (Rose and Beliakoff (2000) Plant Physiol. 122:535-542).
인트론에 의한 유전자 발현의 향상은 일반적인 현상은 아닌데, 그 이유는 몇몇 인트론의 재조합 발현 카세트 내로의 삽입은 발현을 향상시키지 못하기 때문이다 (예를 들어, 쌍자엽식물 유전자의 인트론 (완두콩의 rbcS 유전자, 콩의 파세올린 유전자 및 솔라리움 투베로섬 (Solarium tuberosum)의 stls-1 유전자) 및 옥수수 유전자의 인트론 (adh1 유전자 제9 인트론, hsp81 유전자 제1 인트론)) ([Chee et al. (1986) Gene 41:47-57]; [Kuhlemeier et al. (1988) Mol Gen Genet 212:405-411]; [Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920]; [Sinibaldi and Mettler (1992) In WE Cohn, K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol 42. Academic Press, New York, pp 229-257]; [Vancanneyt et al. 1990 Mol. Gen. Genet. 220:245-250]). 따라서, 트랜스제닉 식물에서 비-내인성 유전자 또는 내인성 유전자의 유전자 발현 수준을 조작하기 위해서 각각의 인트론이 사용될 수 있는 것은 아니다. 제시된 유전자의 발현 속도를 향상시키기 위해서 어떤 특징 또는 특이적 서열 특징이 인트론 서열에 존재해야 하는지는 선행 기술에서 알려지지 않았고, 따라서 선행 기술로부터 이종성으로 사용될 때 제시된 식물 인트론이 DNA 수준에서 또는 전사체 수준 (IME)에서 발현의 향상을 유발할 것인지를 예측하는 것은 불가능하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키메릭"은 제1 DNA 분자를 제2 DNA 분자에 융합함으로써 생성된 단일 DNA 분자를 의미하고, 여기서 제1 또는 제2 DNA 분자는 정상적으로는 그 입체형태, 즉 서로 융합된 형태로 발견되지 않을 것이다. 키메릭 DNA 분자는 따라서 자연에서는 정상적으로 발견되지 않는 새로운 DNA 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키메릭 프로모터"는 상기 DNA 분자의 조작을 통해 생성된 프로모터를 의미한다. 키메릭 프로모터는 2 이상의 DNA 단편을 조합할 수 있고; 일례는 프로모터의 인핸서 요소에 대한 융합일 것이다. 따라서, 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조정하기 위한 본원에 개시된 방법에 따른 키메릭 프로모터의 설계, 구축 및 용도가 본 발명에 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 제1 DNA 분자와 조성이 유사하고 동일하지는 않지만 제1 DNA 분자의 일반적인 기능성, 즉, 동일한 또는 유사한 발현 패턴을 계속 유지하는 제2 DNA 분자를 나타낸다. 변이체는 제1 DNA 분자의 보다 짧은 또는 말단절단된 형태 및/또는 제1 DNA 분자의 서열의 변경된 형태, 예컨대 상이한 제한 효소 부위 및/또는 내부 결실, 치환, 및/또는 삽입을 갖는 것일 수 있다. 또한, "변이체"는 참조 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 조절 요소를 포함할 수 있고, 여기서 유도체 조절 요소는 상응하는 모 조절 분자보다 크거나, 작거나, 동등한 전사 또는 번역 활성을 갖는다. 또한, 조절 요소 "변이체"는 세균 및 식물 세포 형질전환에서 천연적으로 발생하는 돌연변이로 인한 변이체를 포함할 것이다. 본 발명에서, 서열 1-158 및 180-183로 제시되는 폴리뉴클레오티드 서열은 본래의 조절 요소의 일반적인 기능성, 즉 동일한 또는 유사한 발현 패턴을 계속 유지하면서 본래의 조절 요소의 폴리뉴클레오티드 서열과 유사하지만 동일하지 않은 조성을 갖는 변이체를 생성하기 위해서 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 변이체의 생산은 본 개시내용에 비추어 해당 분야의 통상적인 기술 범위에서 수행할 수 있고, 본 발명의 범위 내에 포함된다. 키메릭 조절 요소 "변이체"는 참조 서열과 동일한 구성 요소를 포함하지만, 키메릭 조절 요소를 포함하는 구성 요소는 당업계에 공지된 다양한 방법, 예컨대, 제한 효소 소화 및 라이게이션, 라이게이션 독립적 클로닝, 증폭 동안 PCR 산물의 모듈식 결합 (modular assembly), 또는 조절 요소의 직접적인 화학적 합성 및 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 작동가능하게 연결될 수 있다. 생성되는 키메릭 조절 요소 "변이체"는 참조 서열의 동일한 구성 요소 또는 동일한 구성 요소의 변이체로 이루어질 수 있지만, 구성 부분들이 작동가능하게 연결되도록 하는 연결 서열 또는 서열들을 포함하는 서열 또는 서열들에서 상이할 수 있다. 본 발명에서, 서열 1-158 및 180-183로서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열은 참조 서열을 제공할 수 있고, 여기서 참조 서열을 포함하는 구성 요소는 당업계에 공지된 방법에 의해 연결될 수 있고 세균 및 식물 세포 형질전환에서 천연적으로 발생하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 및/또는 삽입 또는 돌연변이를 포함할 수 있다.
구축물
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "구축물"은 임의의 공급원으로부터 유래되고 게놈 통합 또는 자가 복제가 가능하고 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 임의의 재조합 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 자가 복제하는 폴리뉴클레오티드 분자, 파지, 또는 선형 또는 환상 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 분자를 의미하고, 여기서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 기능적으로 작동하는 방식으로 연결된, 즉 작동가능하게 연결된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 형질전환의 목적, 즉, 이종성 DNA의 숙주 세포 내로의 도입을 위해 사용될 수 있는 임의의 재조합 폴리뉴클레오티드 구축물을 의미한다. 이 용어는 임의의 상기 언급한 분자로부터 단리된 발현 카세트를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 제1 분자가 제2 분자의 기능에 영향을 주도록 분자가 배열된 상태로, 제1 분자가 제2 분자에 연결됨을 의미한다. 2개의 분자는 하나의 연속적인 분자의 일부이거나 아닐 수 있고, 인접하거나 인접하지 않을 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 세포에서 관심있는 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 전사를 조정할 경우에 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 리더는 코딩 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 리더로서 기증할 수 있을 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다.
본 발명의 구축물은 한 실시양태에서, T-DNA를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)로부터 단리된 Ti 플라스미드의 우측 경계 (RB 또는 AGRtu.RB) 및 좌측 경계 (LB 또는 AGRtu.LB) 영역을 갖고, 에이. 투메파시엔스 세포에 의해 제공되는 전달 분자와 함께 T-DNA의 식물 세포의 게놈 내로의 통합을 허용하는 이중 Ti 플라스미드 경계 DNA 구축물로서 제공될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 6,603,061 참조). 또한, 구축물은 세균 세포에서 복제 기능 및 항생제 선택을 제공하는 플라스미드 골격 DNA 분절, 예를 들어, 에셔리키아 콜라이 (Escherichia coli) 복제 기원, 예컨대 ori322, 광범위한 숙주 범위의 복제 기원, 예컨대 oriV 또는 oriRi, 및 선택가능한 마커의 코딩 영역, 예컨대 스펙티노마이신 또는 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여하는 Tn7 아미노글리코시드 아데닐트랜스퍼라제 (aadA)를 코딩하는 Spec/Strp, 또는 겐타미신 (Gm, Gent) 선택가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 식물 형질전환을 위해, 숙주 세균 균주는 종종 에이. 투메파시엔스 ABI, C58, 또는 LBA4404이지만; 식물 형질전환 기술의 당업자에게 공지된 다른 균주가 본 발명에서 기능할 수 있다.
전사가능 폴리뉴클레오티드 분자가 단백질 생성물로서 번역 및 발현되는 기능성 mRNA 분자로 전사되는 방식으로 구축물을 조립하고 세포 내로 도입하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 실시를 위해, 구축물 및 숙주 세포의 제조 및 사용을 위한 통상적인 조성물 및 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3 (2000) J. Sambrook, D.W. Russell, and N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 참조). 식물 형질전환에 특히 적합한 재조합 벡터의 제조 방법은 그 전체가 미국 특허 4,971,908; 4,940,835; 4,769,061; 및 4,757,011에 기재된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이들 종류의 벡터는 또한 학술 문헌에서 검토되었다 (예를 들어, 문헌 [Rodriguez, et al., Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston, (1988)] 및 [Glick, et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, FL. (1993)] 참조). 고등 식물에서 핵산 발현에 유용한 전형적인 벡터는 당업계에 잘 알려져 있고, 아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유도 (Ti) 플라스미드로부터 유래된 벡터를 포함한다 (Rogers, et al., Methods in Enzymology 153:253-277 (1987)). 또한, pCaMVCN 전달 제어 벡터를 비롯하여 식물 형질전환에 유용한 다른 재조합 벡터가 학술 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Fromm, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828 (1985)] 참조).
본원에서 제공되는 임의의 것을 비롯하여 다양한 조절 요소가 구축물에 포함될 수 있다. 임의의 상기 조절 요소는 다른 조절 요소와 조합되어 제공될 수 있다. 상기 조합은 바람직한 조절 특징을 생성하도록 설계되거나 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 구축물은 3' UTR에 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 조절 요소를 포함한다.
본 발명의 구축물은 본원에서 제공되거나 당업계에 공지된 임의의 프로모터 또는 리더를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 프로모터는 이종성 비-번역 5' 리더, 예컨대 열 충격 단백질 유전자로부터 유래된 것 (예를 들어, 미국 특허 5,659,122 및 5,362,865 참조)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 리더는 이종성 프로모터, 예컨대 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 전사체 프로모터 (미국 특허 5,352,605 참조)에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인트론"은 유전자의 게놈 카피로부터 단리되거나 확인될 수 있고 일반적으로 번역 전에 mRNA 프로세싱 동안 스플라이싱되는 영역으로서 규정될 수 있는 DNA 분자를 의미한다. 별법으로, 인트론은 합성에 의해 생성되거나 조작된 DNA 요소일 수 있다. 인트론은 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 달성하는 인핸서 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조정하기 위한 조절 요소로서 사용될 수 있다. DNA 구축물은 인트론을 포함할 수 있고, 인트론은 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자 서열에 대해 이종성이거나 아닐 수 있다. 당업계의 인트론의 예는 벼 액틴 인트론 (미국 특허 5,641,876) 및 옥수수 HSP70 인트론 (미국 특허 5,859,347)을 포함한다. 본 발명을 실시하는데 유용한 인트론은 서열 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 및 182를 포함한다. 추가로, 인트론/엑손 경계 서열을 변형할 때, 메신저 RNA의 최종 전사체로의 프로세싱 동안 원치 않는 개시 코돈이 형성될 가능성을 제거하기 위해 스플라이스 부위 (GT)의 5' 단부의 바로 앞의 뉴클레오티드 서열 AT 또는 뉴클레오티드 A 및 각각 스플라이스 부위 (AG)의 3' 단부의 바로 다음의 뉴클레오티드 G 또는 뉴클레오티드 서열 TG의 사용을 피하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 인트론의 5' 또는 3' 단부 스플라이스 연결부 부위 주위의 서열은 상기 방식으로 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "3' 전사 종료 분자" 또는 "3' UTR"은 mRNA 분자의 3' 비번역 영역 (3' UTR)을 생성하기 위해 전사 동안 사용되는 DNA 분자를 의미한다. mRNA 분자의 3' 비번역 영역은 특이적 절단 및 폴리A 테일로도 알려진 3' 폴리아데닐화에 의해 생성될 수 있다. 3' UTR은 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결되고 이 분자의 하류에 위치할 수 있고, 폴리아데닐화 신호 및 전사, mRNA 프로세싱, 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리A 테일은 mRNA 안정성 및 번역의 개시에서 기능하는 것으로 생각된다. 당업계에서 3' 전사 종료 분자의 예는 노팔린 합성효소 3' 영역 ([Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4803-4807 (1983)] 참조); 밀 hsp17 3' 영역; 완두콩 루비스코 작은 서브유닛 3' 영역; 목화 E6 3' 영역 (미국 특허 6,096,950); WO0011200A2에 논의된 3' 영역; 및 코익신 3' UTR (미국 특허 6,635,806)이다.
3' UTR은 일반적으로 특이적 유전자의 재조합 발현을 위해 유용하게 사용된다. 동물 시스템에서, 3' UTR의 기구는 잘 규정된 바 있다 (예를 들어, [Zhao et al., Microbiol Mol Biol Rev 63:405-445 (1999)]; [Proudfoot, Nature 322:562-565 (1986)]; [Kim et al., Biotechnology Progress 19:1620-1622 (2003)]; [Yonaha and Proudfoot, EMBO J. 19:3770-3777 (2000)]; [Cramer et al., FEBS Letters 498:179-182 (2001)]; [Kuerstem and Goodwin, Nature Reviews Genetics 4:626-637 (2003)). RNA 전사의 효과적인 종료는 형질 성능을 저해할 수 있는 형질과 무관한 (하류) 서열의 원치 않는 전사를 방지하기 위해 필요하다. 서로 근접하여 위치하는 (예를 들어 하나의 T-DNA 내의) 다중 유전자 발현 카세트의 배열은 서로 독립적인 삽입에 비해 상기 구축물 내의 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 억제를 유발할 수 있다 (Padidam and Cao, BioTechniques 31:328-334 (2001)). 이것은 예를 들어 모든 카세트로부터의 강한 유전자 발현이 요구되는 경우에 적정한 수준의 발현의 달성을 저해할 수 있다.
식물에서, 분명하게 규정된 폴리아데닐화 신호 서열이 공지되어 있지 않다. 문헌 [Hasegawa et al., Plant J. 33: 1063-1072, (2003)]에서는 시험관 내 및 니코티아나 실베스트리스 (Nicotiana sylvestris)의 생체내 시스템 둘 모두에서 보존된 폴리아데닐화 신호 서열을 확인할 수 없고 1차 (비-폴리아데닐화된) 전사체의 실제 길이를 결정할 수 없었다. 약한 3' UTR은 초과 번역 (read-through)을 유발할 가능성을 갖고, 이것은 이웃하는 발현 카세트에 위치하는 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있다 (Padidam and Cao, BioTechniques 31:328-334 (2001)). 적절한 전사 종료 제어는 하류에 위치하는 서열 (예를 들어 다른 발현 카세트)까지의 초과 번역을 방지할 수 있고, 추가로 RNA 중합효소의 효율적인 재순환을 허용하여 유전자 발현을 개선할 수 있다. 효율적인 전사 종료 (DNA로부터 RNA 중합효소 II의 방출)는 전사의 재개시를 위한 전제조건이고, 이것은 전체 전사체 수준에 직접 영향을 준다. 전사 종료 후에, 성숙 mRNA는 합성 부위 및 주형으로부터 세포질로 방출된다. 진핵 mRNA는 폴리(A) 형태로 생체 내에서 축적되기 때문에, 통상적인 방법에 의해 전사 종료 부위를 검출하는 것은 어렵다. 그러나, 생물정보학 (bioinformatics) 방법에 의한 기능성이고 효율적인 3' UTR의 예측은, 효과적인 3' UTR의 쉬운 예측을 허용하는 보존된 서열이 존재하지 않는다는 점에서 어렵다.
실용적인 관점에서, 트랜스진 카세트에 사용된 3' UTR은 다음 특징을 갖는 것이 일반적으로 유익하다. 3' UTR은 트랜스진의 전사를 효율적으로 및 효과적으로 종료하고, 하나의 T-DNA 상에 존재하는 다중 카세트, 또는 T-DNA가 삽입된 이웃하는 염색체 DNA에서처럼 또 다른 트랜스진 카세트에 포함될 수 있는 임의의 이웃하는 DNA 서열까지의 전사체의 초과 번역을 방지하여야 한다. 3' UTR은 트랜스진의 발현을 유도하기 위해 사용된 프로모터, 리더 및 인트론에 의해 부여된 전사 활성의 감소를 야기하지 않아야 한다. 식물 생명공학에서, 3' UTR은 종종 형질전환된 식물로부터 추출된 역전사된 RNA의 증폭 반응의 프라이밍 (priming)을 위해 사용되고, (1) 식물 염색체 내로 통합된 후에 트랜스진 카세트의 전사 활성 또는 발현을 평가하고; (2) 식물 DNA 내의 삽입 카피수를 평가하고; (3) 육종 후에 생성되는 종자의 접합 상태 (zygosity)를 평가하기 위해 사용된다. 3' UTR은 또한 삽입된 카세트의 무손상성의 특징을 결정하기 위해 형질전환된 식물로부터 추출된 DNA의 증폭 반응에 사용된다.
식물에서 트랜스진의 발현을 제공할 때 유용한 3' UTR은 빅 블루스템 (Big bluestem) (안드로포곤 게라르디이), 깃털 목초 (Plume Grass) (사카룸 라베나에 (에리안투스 라베나에)), 강아지풀 (Green bristlegrass) (세타리아 비리디스), 테오신트 (Teosinte) (제아 메이즈 아종 멕시카나), 조 (Foxtail millet) (세타리아 이탈리카), 또는 염주 (코익스 라크리마-조비)로부터 유래된 종자, 꽃 및 다른 조직으로부터 단리된 메신저 RNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리에서 발현된 서열 태그 (EST)의 발현을 기초로 하여 확인될 수 있다. cDNA의 라이브러리는 꽃 조직, 종자, 잎 및 뿌리로부터 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 선택된 식물 종으로부터 단리된 조직으로부터 제조된다. 생성되는 cDNA는 당업계에 공지된 다양한 서열결정 방법을 사용하여 서열결정된다. 생성되는 EST는 생물정보 소프트웨어, 예컨대 clc_ref_assemble_complete 버전 2.01.37139 (씨엘시 바이오 유에스에이 (CLC bio USA, 미국 02142 매사추세츠주 캠브리지))를 사용하여 클러스터 (cluster)로 모은다. 각각의 클러스터의 전사체 풍부도는 각각의 클러스터에 대해 cDNA 판독치의 수를 계수함으로써 결정된다. 확인된 3' UTR은 cDNA 서열로부터 유도된 서열 및 게놈 DNA로부터 유도된 서열로 이루어질 수 있다. cDNA 서열은 프라이머를 설계하기 위해 사용된 후, 프라이머는 보다 긴 종료 서열을 제공하기 위해 상응하는 게놈 DNA 서열의 3' 영역을 클로닝하기 위해 제조자의 프로토콜에 따라 구축된 게놈워커(GenomeWalker)™ (클론테크 래보래토리스, 인크. (Clontech Laboratories, Inc., 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)) 라이브러리와 함께 사용된다. 각각의 조직 라이브러리에 대한 관찰된 서열 판독치의 직접 계수 또는 정규화된 계수에 의한 상대적인 전사체 풍부도의 분석은 발현 패턴의 특성을 추정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 3' UTR은 잎과 달리 뿌리 조직에서 더 높은 풍부도로 관찰되는 전사체에서 발견될 수 있다. 이것은 전사체가 뿌리에서 고도로 발현되고 뿌리 발현의 특성은 프로모터, 리더, 인트론 또는 3' UTR의 전사 조절에 기인할 수 있음을 시사할 수 있다. 특이적 기관, 조직 또는 세포 종류 내에서의 발현 특성에 의해 확인된 3' UTR의 실험에 의한 시험을 통해 특이적 기관, 조직 또는 세포 종류에서 발현을 향상시키는 3' UTR을 확인할 수 있다.
또한, 구축물 및 벡터는 단백질 생성물을 특히 엽록체, 백색체, 또는 다른 색소체 소기관; 미토콘드리아; 과산화소체; 공포 (vacuole); 또는 세포외 위치로 표적화하기에 유용한 연결 펩티드를 발현하는 수송 펩티드 코딩 서열을 포함할 수 있다. 엽록체 수송 펩티드의 사용에 대한 설명은 미국 특허 5,188,642 및 미국 특허 5,728,925를 참조한다. 많은 엽록체에 위치하는 단백질은 핵 유전자로부터 전구체로서 발현되고, 엽록체 수송 펩티드 (CTP)에 의해 엽록체로 표적화된다. 상기 단리된 엽록체 단백질의 예는 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제의 작은 서브유닛 (SSU)과 결합한 것, 페레독신, 페레독신 옥시도리덕타제, 광 포획 (light-harvesting) 복합체 단백질 I 및 단백질 II, 티오레독신 F, 에놀피루빌 시키메이트 포스페이트 합성효소 (EPSPS), 및 미국 특허 7,193,133에 기재된 수송 펩티드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 비-엽록체 단백질은 이종성 CTP와의 단백질 융합에 의해 엽록체로 표적화될 수 있고 CTP가 단백질을 엽록체로 표적화하기에 충분함이 생체 내 및 시험관 내에서 입증되었다. 적합한 엽록체 수송 펩티드, 예컨대 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS CTP (CTP2) ([Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437-442 (1987)] 참조) 또는 페튜니아 하이브리드 (Petunia hybrida) EPSPS CTP (CTP4) ([della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877 (1986)] 참조)의 통합은 트랜스제닉 식물에서 이종성 EPSPS 단백질 서열을 엽록체로 표적화하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 5,627,061; 5,633,435; 및 5,312,910과 EP 0218571; EP 189707; EP 508909; 및 EP 924299 참조).
전사가능 폴리뉴클레오티드 분자
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전사가능 폴리뉴클레오티드 분자"는 RNA 분자로 전사될 수 있는 임의의 DNA 분자를 의미하고, 단백질 코딩 서열을 갖는 것 및 유전자 억제에 유용한 서열을 갖는 RNA 분자를 생산하는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. "트랜스진"은 적어도 게놈 내의 그의 위치에 있어서 숙주 세포에 대해 이종성인 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자 및/또는 세포의 현재 또는 임의의 이전 세대에서 숙주 세포의 게놈 내로 인공적으로 통합된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다.
본 발명의 프로모터는 프로모터 분자에 대해 이종성인 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이종성"은 그 조합이 정상적으로는 자연에서 발견되지 않는, 2 이상의 폴리뉴클레오티드 분자의 조합을 나타낸다. 예를 들어, 2개의 분자는 상이한 종으로부터 유래될 수 있고/있거나, 2개의 분자는 상이한 유전자, 예를 들어 동일한 종으로부터의 상이한 유전자 또는 상이한 종으로부터의 동일한 유전자로부터 유래될 수 있다. 따라서, 프로모터는 상기 조합이 정상적으로는 자연에서 발견되지 않으면, 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 대해 이종성이고, 즉 프로모터 분자와 조합시에 작동가능하게 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자는 천연적으로 발생하지 않는다.
전사가능 폴리뉴클레오티드 분자는 일반적으로 RNA 전사체의 발현이 요구되는 임의의 DNA 분자일 수 있다. RNA 전사체의 그러한 발현은 생성되는 mRNA 분자의 번역 및 따라서 단백질 발현을 유발할 수 있다. 별법으로, 예를 들어, 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자는 궁극적으로 특이적 유전자 또는 단백질의 발현 감소를 유발하도록 설계될 수 있다. 한 실시양태에서, 이것은 안티센스 방향으로 배향된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자를 사용함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 상기 안티센스 기술의 사용에 대해 잘 알고 있다. 간단하게 설명하면, 안티센스 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자가 전사될 때, RNA 생성물은 세포 내의 상보성 RNA 분자와 혼성화하여 격리된다. 상기 이중체 RNA 분자는 세포의 번역 기구에 의해 단백질로 번역될 수 없고, 세포 내에서 분해된다. 임의의 유전자는 상기 방식으로 음성 조절될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 구축물이 식물 세포의 게놈에 통합될 때 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 전사를 목적하는 수준으로 또는 목적하는 패턴으로 조정하기 위해서 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 본 발명의 조절 요소, 예컨대 서열 1-158 및 180-183로서 제시되는 것이다. 한 실시양태에서, 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자는 유전자의 단백질-코딩 영역을 포함하고, 프로모터는 단백질 생성물로서 번역 및 발현되는 RNA 분자의 전사에 영향을 준다. 또 다른 실시양태에서, 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자는 유전자의 안티센스 영역을 포함하고, 프로모터는 표적 숙주 세포 내에서 관심있는 특이적 RNA 분자의 발현을 억제하기 위해 안티센스 RNA 분자, 이중 가닥 RNA 또는 다른 유사한 억제성 RNA 분자의 전사에 영향을 준다.
농경학적 관심 유전자
전사가능 폴리뉴클레오티드 분자는 농경학적 관심 유전자일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "농경학적 관심 유전자"는 특정 식물 조직, 세포, 또는 세포 종류에서 발현될 때, 예컨대 식물 형태, 생리학, 성장, 발달, 수율, 생성물, 영양 프로파일, 질환 또는 해충 내성, 및/또는 환경적 또는 화학적 내성과 연관된 바람직한 특징을 부여하는 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 농경학적 관심 유전자는 수득 단백질, 스트레스 내성 단백질, 발생 제어 단백질, 조직 분화 단백질, 분열 조직 단백질, 환경 반응 단백질, 노화 단백질, 호르몬 반응성 단백질, 이탈 (abscission) 단백질, 공급원 단백질, 싱크 (sink) 단백질, 꽃 제어 단백질, 종자 단백질, 제초제 내성 단백질, 질환 내성 단백질, 지방산 생합성 효소, 토코페롤 생합성 효소, 아미노산 생합성 효소, 살충 단백질, 또는 임의의 다른 작용제, 예컨대 억제를 위한 특정 유전자를 표적화하는 안티센스 또는 RNAi 분자를 코딩하는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 농경학적 관심 유전자의 생성물은 식물 생리학 또는 대사에 대한 효과를 발휘하기 위해 식물 내에서 작용할 수 있거나 또는 식물을 먹는 해충의 먹이 내의 살충제로서 작용할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 프로모터는 프로모터가 농경학적 관심 유전자인 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결되도록 구축물 내에 포함된다. 농경학적 관심 유전자의 발현은 농경학상 유익한 형질을 부여하는 것이 바람직하다. 유익한 농경학적 형질은 예를 들어 제초제 내성, 곤충 방제, 변형된 수율, 진균 질환 내성, 바이러스 내성, 선충 내성, 세균 질환 내성, 식물 성장 및 발달, 전분 생산, 변형된 오일 생산, 높은 오일 생산, 변형된 지방산 함량, 높은 단백질 생산, 과일 숙성, 향상된 동물 및 인간 영양분, 생체중합체, 환경적 스트레스 내성, 제약 펩티드 및 분비가능 펩티드, 개선된 프로세싱 형질, 개선된 소화율, 효소 생산, 풍미, 질소 고정, 잡종 종자 생산, 섬유 생산, 및 생체연료 생산일 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 당업계에 공지된 농경학적 관심 유전자의 예는 제초제 내성 (미국 특허 6,803,501; 6,448,476; 6,248,876; 6,225,114; 6,107,549; 5,866,775; 5,804,425; 5,633,435; 및 5,463,175), 증가된 수득량 (미국 특허 USRE38,446; 6,716,474; 6,663,906; 6,476,295; 6,441,277; 6,423,828; 6,399,330; 6,372,211; 6,235,971; 6,222,098; 및 5,716,837), 곤충 방제 (미국 특허 6,809,078; 6,713,063; 6,686,452; 6,657,046; 6,645,497; 6,642,030; 6,639,054; 6,620,988; 6,593,293; 6,555,655; 6,538,109; 6,537,756; 6,521,442; 6,501,009; 6,468,523; 6,326,351; 6,313,378; 6,284,949; 6,281,016; 6,248,536; 6,242,241; 6,221,649; 6,177,615; 6,156,573; 6,153,814; 6,110,464; 6,093,695; 6,063,756; 6,063,597; 6,023,013; 5,959,091; 5,942,664; 5,942,658, 5,880,275; 5,763,245; 및 5,763,241), 진균 질환 내성 (미국 특허 6,653,280; 6,573,361; 6,506,962; 6,316,407; 6,215,048; 5,516,671; 5,773,696; 6,121,436; 6,316,407; 및 6,506,962), 바이러스 내성 (미국 특허 6,617,496; 6,608,241; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; 및 5,304,730), 선충 내성 (미국 특허 6,228,992), 세균 질환 내성 (미국 특허 5,516,671), 식물 성장 및 발달 (미국 특허 6,723,897 및 6,518,488), 전분 생산 (미국 특허 6,538,181; 6,538,179; 6,538,178; 5,750,876; 6,476,295), 변형된 오일 생산 (미국 특허 6,444,876; 6,426,447; 및 6,380,462), 높은 오일 생산 (미국 특허 6,495,739; 5,608,149; 6,483,008; 및 6,476,295), 변형된 지방산 함량 (미국 특허 6,828,475; 6,822,141; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537,750; 6,489,461; 및 6,459,018), 높은 단백질 생산 (미국 특허 6,380,466), 과일 숙성 (미국 특허 5,512,466), 향상된 동물 및 인간 영양분 (미국 특허 6,723,837; 6,653,530; 6,5412,59; 5,985,605; 및 6,171,640), 생체중합체 (미국 특허 USRE37,543; 6,228,623; 및 5,958,745, 및 6,946,588), 환경적 스트레스 내성 (미국 특허 6,072,103), 제약 펩티드 및 분비가능 펩티드 (미국 특허 6,812,379; 6,774,283; 6,140,075; 및 6,080,560), 개선된 프로세싱 형질 (미국 특허 6,476,295), 개선된 소화율 (미국 특허 6,531,648), 낮은 라피노스 (미국 특허 6,166,292), 산업적 효소 생산 (미국 특허 5,543,576), 개선된 풍미 (미국 특허 6,011,199), 질소 고정 (미국 특허 5,229,114), 잡종 종자 생산 (미국 특허 5,689,041), 섬유 생산 (미국 특허 6,576,818; 6,271,443; 5,981,834; 및 5,869,720) 및 생체연료 생산 (미국 특허 5,998,700)을 위한 것을 포함한다.
별법으로, 농경학적 관심 유전자는 예를 들어 안티센스 (예를 들어 미국 특허 5,107,065 참조); 억제성 RNA ("RNAi", 예를 들어 US 특허 출원 공개 2006/0200878 및 US 2008/0066206, 및 US 특허 출원 11/974,469에서 설명된 바와 같은 miRNA-, siRNA-, 트랜스 작용 siRNA-, 및 페이스드 (phased) sRNA-매개 메카니즘을 통한 유전자 발현의 조정 포함); 또는 동시 억제-매개 메카니즘을 통해 내인성 유전자 발현의 표적화된 조정을 유발하는 RNA 분자를 코딩함으로써 상기 언급된 식물 특징 또는 표현형에 영향을 줄 수 있다. 또한, RNA는 요구되는 내인성 mRNA 생성물을 절단하도록 조작된 촉매적 RNA 분자 (예를 들어 리보자임 (ribozyme) 또는 리보스위치 (riboswitch); 예를 들어 US 2006/0200878 참조)일 수 있다. 따라서, 관심있는 농경학상 중요한 표현형 또는 형태 변화에 영향을 주는 전사된 RNA 분자를 코딩하는 임의의 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자는 본 발명의 실시를 위해 유용할 수 있다. 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자가 유전자 억제를 야기할 수 있는 분자로 전사되는 방식으로 구축물을 제작하고 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 식물 세포 내에서 유전자 발현을 조절하기 위해 안티센스 배향의 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자를 갖는 구축물을 사용한 전사후 유전자 억제는 미국 특허 5,107,065 및 5,759,829에 개시되어 있고, 식물 내에서 유전자 발현을 조절하기 위해 센스 배향의 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자를 갖는 구축물을 사용한 전사후 유전자 억제는 미국 특허 5,283,184 및 5,231,020에 개시되어 있다. 또한, 식물 세포 내에서 전사가능 폴리뉴클레오티드의 발현은 식물 세포를 먹는 식물 해충, 예를 들어 딱정벌레 (coleopteran) 해충으로부터 단리된 조성물 (미국 특허 공개 US20070124836) 및 선충 해충으로부터 단리된 조성물 (미국 특허 공개 US20070250947)을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 식물 해충은 절지동물 해충, 선충 해충, 및 진균 또는 미생물 해충을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 구축물에 포함하기 위한 예시적인 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자는 예를 들어 표적 종과 다른 종으로부터의 DNA 분자 또는 유전자 또는 동일한 종에서 기원하거나 존재하지만 전통적인 재생 또는 육종 기술이 아니라 유전공학 방법에 의해 수여자 세포 내에 통합된 유전자를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 분자의 종류는 식물 세포에 이미 존재하는 폴리뉴클레오티드 분자, 또 다른 식물로부터의 폴리뉴클레오티드 분자, 상이한 유기체로부터의 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 외부에서 생성된 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 유전자의 안티센스 메시지를 함유하는 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 트랜스진의 인공, 합성, 또는 다른 방식으로 변형된 형태를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.
선택가능 마커
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "마커"는 그의 발현, 또는 그의 결여가 몇몇 방식으로 스크리닝되거나 평가될 수 있는 임의의 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 본 발명의 실시에 사용하기 위한 마커 유전자는 β-글루쿠로니다제 (GUS는 미국 특허 5,599,670에 기재되어 있다), 초록 형광 단백질 및 그의 변이체 (GFP는 미국 특허 5,491,084 및 6,146,826에 기재되어 있다), 항생제 내성을 부여하는 단백질, 또는 제초제 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 카나마이신 (nptII), 하이그로마이신 B (aph IV), 스트렙토마이신 또는 스펙티노마이신 (aad, spec/strep) 및 겐타마이신 (aac3 및 aacC4)에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 것을 포함하는 유용한 항생제 내성 마커는 당업계에 공지되어 있다. 그에 대한 트랜스제닉 식물 내성이 입증되고 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 제초제는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 아미노-메틸-포스폰산, 글리포세이트, 글루포시네이트, 술포닐우레아, 이미다졸리논, 브로목시닐, 달라폰, 디캄바, 시클로헥산디온, 프로토포르피리노겐 옥시다제 억제제, 및 이속사스플루톨 제초제. 제초제 내성에 관련된 단백질을 코딩하는 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자는 당업계에 공지되어 있고, 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소를 코딩하는 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자 (글리포세이트 내성에 대한 EPSPS는 미국 특허 5,627,061; 5,633,435; 6,040,497; 및 5,094,945에 기재되어 있다); 글리포세이트 옥시도리덕타제 및 글리포세이트-N-아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자 (GOX는 미국 특허 5,463,175에 기재되어 있고; GAT는 미국 특허 공개 20030083480에 기재되어 있고, 디캄바 모노옥시게나제는 미국 특허 공개 20030135879에 기재되어 있다); 브로목시닐 니트릴라제를 코딩하는 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자 (브로목시닐 내성에 대한 Bxn은 미국 특허 4,810,648에 기재되어 있다); 노르플루라존 내성에 대해 문헌 [Misawa, et al., Plant Journal 4:833-840 (1993)] 및 [Misawa, et al., Plant Journal 6:481-489 (1994)]에 기재된 피토엔 탈포화효소 (crtI)를 코딩하는 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자; 술포닐우레아 제초제 내성에 대해 문헌 [Sathasiivan, et al., Nucl. Acids Res. 18:2188-2193 (1990)]에 기재된 아세토히드록시산 합성효소 (ALS로도 알려진 AHAS)를 코딩하는 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자; 및 글루포시네이트 및 비알라포스 (bialaphos) 내성에 대해 문헌 [DeBlock, et al., EMBO Journal 6:2513-2519 (1987)]에 기재된 bar 유전자. 본 발명의 프로모터 분자는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 글리포세이트 내성 EPSPS, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 히드록시페닐 피루베이트 데히드로게나제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 달라폰 데할로게나제, 브로목시닐 내성 니트릴라제, 안트라닐레이트 합성효소, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제, 아세틸 CoA 카르복실라제, 글리포세이트 옥시도리덕타제, 및 글리포세이트-N-아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 연결된 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자를 발현할 수 있다.
또한, 용어 "선택가능한 마커" 내에는 그 분비가 형질전환된 세포를 확인 또는 선택하는 수단으로서 검출될 수 있는 분비가능 마커를 코딩하는 유전자가 포함된다. 그 예는 항체 상호작용에 의해 확인될 수 있는 분비가능 항원, 또는 심지어 촉매에 의해 검출될 수 있는 분비가능 효소를 코딩하는 마커를 포함한다. 선택가능한 분비된 마커 단백질은 검출가능한 (예를 들어 ELISA에 의해) 작은 확산가능 단백질, 세포외 용액에서 검출가능한 작은 활성 효소 (예를 들어 알파-아밀라제, 베타-락타마제, 포스피노트리신 트랜스퍼라제), 또는 세포벽 내에 삽입되거나 포획되는 단백질 (예컨대 발현 연장 단위에서 발견되는 것과 같은 리더 서열을 포함하는 단백질 또는 담배 PR-S로도 알려진 담배 발병기전 관련 단백질)를 포함하는 많은 클래스로 분류된다. 다른 가능한 선택가능한 마커 유전자는 당업자에게 자명할 것이고, 본 발명에 의해 포함된다.
세포 형질전환
본 발명은 또한 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 형질전환된 세포 및 식물의 생산 방법에 관한 것이다.
용어 "형질전환"은 핵산의 수여자 숙주 내로의 도입을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주"는 임의의 세포, 조직, 기관을 포함하는 세균, 진균, 또는 식물, 또는 세균, 진균, 또는 식물의 자손체를 의미한다. 특히 관심있는 식물 조직 및 세포는 원형질체, 캘러스 (callus), 뿌리, 괴경, 종자, 줄기, 잎, 묘목, 배아, 및 화분을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환된"은 외래 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 구축물이 도입된 세포, 조직, 기관, 또는 유기체를 의미한다. 도입된 폴리뉴클레오티드 분자는 도입된 폴리뉴클레오티드 분자가 후속 자손체에 유전되도록 수여자 세포, 조직, 기관, 또는 유기체의 게놈 DNA 내로 통합될 수 있다. "트랜스제닉" 또는 "형질전환된" 세포 또는 유기체는 또한 세포 또는 유기체의 자손체 및 교배시에 모체로서 상기 트랜스제닉 유기체를 사용하는 육종 프로그램으로부터 생산되고 외래 폴리뉴클레오티드 분자의 존재에 의한 변경된 표현형을 보이는 자손체를 포함한다. 용어 "트랜스제닉"은 하나 이상의 이종성 다중 핵산 분자를 함유하는 세균, 진균, 또는 식물을 의미한다.
다중 핵산 분자를 식물 세포 내로 도입하기 위한 많은 방법이 존재한다. 이 방법은 일반적으로 적합한 숙주 세포를 선택하고, 숙주 세포를 재조합 벡터로 형질전환시키고, 형질전환된 숙주 세포를 얻는 단계를 포함한다. 적합한 방법은 세균 감염 (예를 들어 아그로박테리움), 이원성 세균 인공 염색체 벡터, DNA의 직접 전달 (예를 들어, PEG-매개 형질전환, 건조/억제-매개 DNA 흡수, 전기천공, 탄호규소 섬유를 사용한 교반, 및 DNA 코팅된 입자의 가속을 통한) 등을 포함한다 (문헌 [Potrykus, et al., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205 (1991)]에서 검토됨).
DNA 분자를 세포 내에 도입하기 위한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 실행시에 식물 DNA 구축물을 식물 게놈 내로 도입함으로써 식물 세포를 형질전환시키기 위한 방법 및 물질은 임의의 잘 공지되고 입증된 방법을 포함할 수 있다. 임의의 형질전환 방법이 본 발명의 하나 이상의 프로모터 및/또는 구축물을 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키기 위해 이용될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 세포 또는 유기체, 예컨대 식물 세포, 조류 세포, 조류, 진균 세포, 진균, 세균 세포, 또는 곤충 세포일 수 있다. 바람직한 숙주 및 형질전환된 세포는 식물, 아스페르길루스 (Aspergillus), 효모, 곤충, 세균 및 조류로부터의 세포를 포함한다.
재생된 트랜스제닉 식물은 동형접합성 트랜스제닉 식물을 제공하기 위해 자가수분될 수 있다. 별법으로, 재생된 트랜스제닉 식물로부터 얻은 화분은 비-트랜스제닉 식물, 바람직하게는 농경학상 중요한 종의 순계와 교배될 수 있다. 상이한 형질 및 작물에 통상 사용되는 육종 방법에 대한 설명은 여러 참고 서적 중의 하나에서 볼 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960)]; [Simmonds, Principles of crop improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979)]; [Sneep and Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979)]; [Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249 (1987)]; [Fehr, Principles of variety development, Theory and Technique, (Vol. 1) and Crop Species Soybean (Vol 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987)] 참조). 이와 반대로, 비-트랜스제닉 식물로부터의 화분은 재생된 트랜스제닉 식물을 수분시키기 위해 사용될 수 있다.
관심있는 유전자의 존재 및 본 발명의 조절 요소에 의해 부여된 발현 수준 및/또는 프로파일에 대해 형질전환된 식물을 분석할 수 있다. 당업자는 형질전환된 식물의 분석을 위해 이용가능한 많은 방법을 알고 있다. 예를 들어, 식물 분석 방법은 서던 블롯 (Southern blot) 또는 노던 블롯 (northern blot), PCR-기반 방법, 생화학적 분석, 표현형 스크리닝 방법, 재배지 평가, 및 면역진단 검정을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 발현은 제조자가 설명한 바와 같은 타크만(TaqMan)® (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)) 시약 및 방법 및 타크만® 테스팅 매트릭스 (Testing Matrix)를 이용하여 결정된 PCR 사이클 시간을 사용하여 측정할 수 있다. 별법으로, 제조자가 설명한 바와 같은 인베이더(Invader)® (써드 웨이브 테크놀로지스 (Third Wave Technologies, 미국 위스콘신주 메디슨)) 시약 및 방법이 트랜스진 발현을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 식물의 종자는 수정능력이 있는 트랜스제닉 식물로부터 수확될 수 있고, 본 발명의 구축물을 포함하고 농경학적 관심 유전자를 발현하는 잡종 식물주를 포함하는 본 발명의 형질전환된 식물의 자손체 세대를 성장시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 식물의 부분을 제공한다. 식물 부분은 비제한적으로 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 종자, 배젖, 배주, 및 화분을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 포함하고 이를 제공한다.
트랜스제닉 식물은 트랜스제닉 폴리뉴클레오티드 분자를 그의 자손체에 전할 수 있다. 자손체는 조상 (ancestor) 식물로부터 유래된 트랜스진을 포함하는 임의의 재생가능한 식물 부분 또는 종자를 포함한다. 트랜스제닉 식물은 바람직하게는 형질전환된 폴리뉴클레오티드 분자에 대해 동형접합성이고, 서열을 유성 생식의 결과로서 모든 자손에게 전달한다. 자손체는 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 종자로부터 성장할 수 있다. 이어서, 이들 추가의 식물은 식물의 순계 육종 계통을 생성하기 위해 자가-수정될 수 있다. 이들 식물로부터의 자손체는 다른 것 중에서 유전자 발현에 대해 평가된다. 유전자 발현은 몇몇의 일반적인 방법, 예컨대 웨스턴 블로팅 (western blotting), 노던 블로팅, 면역-침전, 및 ELISA에 의해 검출할 수 있다.
상품
본 발명은 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 상품을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "상품"은 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 식물, 종자, 식물 세포 또는 식물 부분으로부터 유래된 물질로 이루어지는 임의의 조성물 또는 제품을 의미한다. 상품은 소비자에게 판매될 수 있고, 생육성 또는 비생육성 수 있다. 비생육성 상품은 비생육성 종자 및 곡실; 가공된 종자, 종자 부분, 및 식물 부분; 탈수된 식물 조직, 동결된 식물 조직, 및 가공된 식물 조직; 육생 및/또는 수생 동물의 소비를 위한 동물 사료로 가공된 종자 및 식물 부분, 오일, 굵은 곡분, 고운 곡분, 플레이크 (flake), 겨, 섬유, 우유, 치즈, 종이 (paper), 크림, 와인, 및 인간의 소비를 위한 임의의 다른 식품; 및 바이오매스 및 연료 제품을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 생육성 상품은 종자 및 식물 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 식물은 따라서 일반적으로 식물 또는 그의 부분으로부터 얻은 임의의 상품을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
이제 본 발명을 전반적으로 설명하였기 때문에, 본 발명은 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것으로서 달리 특정되지 않으면 본 발명의 제한을 의도하지 않는 다음 실시예를 참고로 하여 쉽게 이해될 것이다. 당업자는 다음 실시예에 개시된 기술이 본 발명의 실행시에 잘 기능하는 것으로 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타냄을 이해하여야 한다. 그러나, 당업자는 본원에 비추어 개시된 구체적인 실시양태에 많은 변화가 이루어지고 본 발명의 취지와 범위로부터 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 계속 얻을 수 있고, 따라서 첨부 도면에 제시되고 도시된 모든 사항은 예시적인 것으로서 제한하는 의미를 갖지 않는 것으로 해석되어야 함을 이해하여야 한다.
실시예
실시예 1: 조절 요소의 확인 및 클로닝.
신규한 유비퀴틴 전사 조절 요소, 또는 전사 조절 발현 요소 군 (EXP) 서열을 단자엽식물 종 빅 블루스템 (안드로포곤 게라르디이), 깃털 목초 (사카룸 라베나에 (에리안투스 라베나에)), 강아지풀 (세타리아 비리디스), 테오신트 (제아 메이즈 아종 멕시카나), 조 (세타리아 이탈리카), 및 염주 (코익스 라크리마-조비)의 게놈 DNA로부터 확인하고 단리하였다.
유비퀴틴 1 전사체 서열은 각각의 상기 종으로부터 단리되었다. 각각의 유비퀴틴 1 전사체의 5' 비번역 영역 (5' UTR)은 작동가능하게 연결된 프로모터, 리더 (5' UTR) 및 제1 인트론을 포함하는 확인된 유비퀴틴 유전자에 대한 상응하는 전사 조절 요소를 증폭하기 위한 프라이머를 설계하기 위해 사용되었다. 프라이머는 상응하는 게놈 DNA 서열의 5' 영역을 클로닝하기 위해 제조자의 프로토콜에 따라 구축된 게놈워커™ (클론테크 래보래토리스, 인크. (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)) 라이브러리와 함께 사용되었다. 유비퀴틴 전사 조절 요소는 또한 제아 메이즈의 유비퀴틴 4, 6 및 7 유전자의 상동체인 공개적으로 이용가능한 서열을 사용하여 단자엽식물 소르굼 비콜로르로부터 단리되었다.
확인된 서열을 이용하여, 증폭된 DNA 내에서 조절 요소를 확인하기 위해 생물정보학 분석을 수행하였다. 상기 분석 결과를 사용하여, 조절 요소가 DNA 서열 내에서 규정되었고, 조절 요소를 증폭하기 위한 프라이머를 설계하였다. 각각의 조절 요소에 상응하는 DNA 분자는 특유한 제한 효소 부위를 함유하는 프라이머 및 에이. 게라르디이, 에스. 라베나에, 에스. 비리디스, 제트. 메이즈 아종 멕시카나, 에스. 이탈리카, 씨. 라크리마-조비, 및 에스. 비콜로르로부터 단리된 게놈 DNA를 사용하여 표준 중합효소 연쇄 반응 조건을 사용하여 증폭하였다. 생성되는 DNA 단편을 기본 식물 발현 벡터 내에 라이게이팅하고, 서열을 결정하였다. 이어서, 조절 요소 TSS 및 인트론/엑손 스플라이스 연결부의 분석을 형질전환된 식물 원형질체를 사용하여 수행하였다. 간단하게 설명하면, 원형질체를 이종성 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 클로닝된 DNA 단편을 포함하는 식물 발현 벡터로 형질전환시키고, 그에 의해 생산된 mRNA 전사체의 서열을 분석함으로써 조절 요소 TSS 및 인트론/엑손 스플라이스 연결부를 확인하기 위해 cDNA 단부의 신속한 증폭을 위한 5' 레이스 시스템 (5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends), 버전 2.0 (인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 92008 칼스바드))을 사용하였다.
확인된 전사 조절 발현 요소 군 ("EXP")의 서열은 아래 표 1에 나열되는 바와 같이 서열 1, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 45, 49, 53, 55, 59, 63, 65, 69, 73, 75, 77, 79, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 180, 181 및 183으로서 본원에서 제공된다. 프로모터 서열은 본원에서 서열 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 및 135로서 제공된다. 리더 서열은 서열 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 및 81로서 본원에서 제공된다. 인트론 서열은 서열 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 및 182로서 본원에서 제공된다. 인핸서 서열은 서열 89로서 제공된다.
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표 1에 제시된 바와 같이, 예를 들어, 에이. 게라르디이로부터 단리된 성분과 함께 EXP-ANDge.Ubq1:1:9 (서열 번호 1)로 지정된 전사 조절 EXP 서열은 리더 요소의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터 요소 P-ANDge.Ubq1-1:1:11 (서열 번호 2), 인트론 요소의 5'에 작동가능하게 연결된 리더 요소 L-ANDge.Ubq1-1:1:2 (서열 번호 3), 인트론 요소 I-ANDge.Ubq1-1:1:3 (서열 번호 4)를 포함한다. 다른 EXP는 표 1에 제시된 바와 같이 이와 유사하게 연결된다.
표 1, 서열 목록 및 도 1-7에 제시된 바와 같이, 예를 들어, P-ANDge.Ubq1-1:1:11 (서열 번호 2), P-ERIra.Ubq1-1:1:10 (서열 번호 19) 또는 다른 종으로부터의 다른 각각의 프로모터의 더 짧은 프로모터 단편을 포함하는 종 에이. 게라르디이, 이. 라베나에, 제트. 메이즈 아종 멕시카나, 에스. 비콜로르, 씨. 라크리마-조비, 에스. 이탈리카, 및 에스. 비리디스로부터의 프로모터 서열의 변이체는 조작되었고, 예를 들어 P-ANDge.Ubq1-1:1:9 (서열 번호 6), P-ERIra.Ubq1-1:1:9 (서열 번호 23), P-C1.Ubq1-1:1:10 (서열 번호 96), P-SETit.Ubq1-1:1:2 (서열 번호 76) 및 P-Sv.Ubq1-1:1:2 (서열 번호 38), 및 다른 프로모터 단편을 생성하였다. P-SETit.Ubq1-1:1:4 (서열 번호 74)는 P-SETit.Ubq1-1:1:1 (서열 번호 70)에 비해 단일 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 이와 비슷하게, P-Sv.Ubq1-1:1:3 (서열 번호 40)은 P-Sv.Ubq1-1:1:4 (서열 번호 135)에 비해 단일 뉴클레오티드 변화를 포함한다.
몇몇 예에서, 특이적 인트론의 변이체는 3' 인트론 스플라이스 연결부의 서열 5'-AG-3' 다음의 각각의 인트론의 마지막 3개의 뉴클레오티드를 변경함으로써 생성되었다. 이들 인트론 변이체를 아래 표 2에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00012
또한, 제트. 메이즈 아종 멕시카나로부터의 게놈 DNA의 증폭을 위해 설계된 동일한 프라이머 세트를 사용하여 단리된 3개의 대립유전자 변이체가 표 1에 제시된다. EXP 서열의 대립유전자 변이체는 다른 서열의 다양한 영역 내에 일부 동일성을 공유하는 서열로 이루어지지만, 또한 삽입, 결실 및 뉴클레오티드 미스매치가 각각의 EXP 서열의 각각의 프로모터, 리더 및/또는 인트론 내에 존재할 수 있다. EXP-Zm.UbqM1:1:1 (서열 번호 41)로 지정된 EXP 서열은 제트. 메이즈 아종 멕시카나 Ubq1 유전자 전사 조절 발현 요소 군의 제1 대립유전자 (대립유전자-1)를 나타낸다. EXP-Zm.UbqM1:1:6 (서열 번호 137) 및 EXP-Zm.UbqM1:1:10 (서열 번호 139)으로 지정된 EXP 서열은 제1 대립유전자 (대립유전자-1)를 나타내고, 2개의 EXP 사이의 유일한 차이는 3' 인트론 스플라이스 연결부의 서열 5'-AG-3' 다음의 각각의 인트론의 마지막 3' 뉴클레오티드에서 발생한다. EXP-Zm.UbqM1:1:4 (서열 번호 45)로 지정된 EXP 서열은 제트. 메이즈 아종 멕시카나 Ubq1 유전자 전사 조절 발현 요소 군의 제2 대립유전자 (대립유전자-2)를 나타낸다. EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141) 및 EXP-Zm.UbqM1:1:12 (서열 번호 143)로 지정된 EXP 서열은 제2 대립유전자 (대립유전자-2)를 나타내고, 2개의 EXP 사이의 유일한 차이는 3' 인트론 스플라이스 연결부의 서열 5'-AG-3' 다음의 각각의 인트론의 마지막 3' 뉴클레오티드에서 발생한다. EXP 서열 EXP-Zm.UbqM1:1:2 (서열 번호 49) 및 EXP-Zm.UbqM1:1:5 (서열 번호 53)는 제트. 메이즈 아종 멕시카나 Ubq1 유전자 전사 조절 발현 요소 군의 제3 대립유전자 (대립유전자-3)를 나타내고, 그 각각의 인트론 내의 위치 1034에 단일 뉴클레오티드 차이를 포함한다 (I-Zm.UbqM1-1:1:11에 대한 G, 서열 52 및 I-Zm.UbqM1-1:1:12에 대한 T, 서열 54). EXP-Zm.UbqM1:1:8 (서열 번호 145), EXP-Zm.UbqM1:1:9 (서열 번호 147), EXP-Zm.UbqM1:1:11 (서열 번호 149) 및 EXP-Zm.UbqM1:1:13 (서열 번호 181)으로 지정된 EXP 서열은 또한 제3 대립유전자 (대립유전자-3)를 나타낸다. EXP-Zm.UbqM1:1:9의 인트론 I-Zm.UbqM1-1:1:16 (서열 번호 148)은 위치 1034에 티민 잔기를 포함하는 반면, EXP-Zm.UbqM1:1:8, EXP-Zm.UbqM1:1:11 및 EXP-Zm.UbqM1:1:13의 인트론 (I-Zm.UbqM1-1:1:15, 서열 146; I-Zm.UbqM1-1:1:18, 서열 11 및 I-Zm.UbqM1-1:1:20, 서열 182)은 각각 위치 1034에 구아닌 잔기를 포함한다. 추가로, EXP-Zm.UbqM1:1:8 (서열 번호 145) 및 EXP-Zm.UbqM1:1:9 (서열 번호 147)의 마지막 3개의 3' 단부 뉴클레오티드는 EXP-Zm.UbqM1:1:11 (서열 번호 149) 및 EXP-Zm.UbqM1:1:13 (서열 번호 181)의 것과 상이하다.
실시예 2: 옥수수 원형질체에서 GUS를 유도하는 조절 요소의 분석.
옥수수 잎 원형질체를 β-글루쿠로니다제 (GUS) 트랜스진의 발현을 유도하는 EXP 서열을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시키고, GUS의 발현이 공지의 구성적 프로모터에 의해 유도되는 잎 원형질체에서의 GUS 발현과 비교하였다.
EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22) 또는 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)에 의해 유도되는 트랜스진의 발현을 공지의 구성적 프로모터로부터의 발현과 비교하였다. 상기한 EXP 서열을 아래 표 3에 제시된 바와 같이 식물 발현 벡터 내로 클로닝하여, 에이. 투메파시엔스 노팔린 합성효소 유전자 (T-AGRtu.nos-1:1:13, 서열 161) 또는 밀 Hsp17 유전자 (T-Ta.Hsp17-1:1:1, 서열 162)로부터 유래된 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된, 감자 광 유도성 조직-특이적 ST-LS1 유전자 (젠뱅크 (GenBank) 기탁 번호: X04753)로부터 유래된 프로세싱가능한 인트론을 함유하는 β-글루쿠로니다제 (GUS) 리포터 (GUS-2로 언급됨, 서열 160) 또는 연속적인 GUS 코딩 서열 (GUS-1, 서열 159)의 5'에 EXP 서열이 작동가능하게 연결된 벡터를 얻었다.
Figure 112018103689224-pat00013
비교를 위해 사용된 대조군 플라스미드 (pMON19469, pMON65328, pMON25455 및 pMON122605)는 상기 설명된 바와 같이 제작하였고, GUS 코딩 서열 및 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된 공지의 EXP 서열인 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170), EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (서열 번호 163), EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179), 또는 EXP-Os.TubA-3:1:1 (서열 번호 165)을 각각 함유한다. 배경 GUS 및 루시퍼라제 발현을 평가하기 위해 다음과 같은 3개의 추가의 대조군을 제공하였다: DNA 미함유 대조군, 트랜스진 발현을 위해 설계되지 않은 빈 벡터, 및 초록 형광 단백질 (GFP)을 발현하기 위해 사용된 발현 벡터.
데이터의 동시 형질전환 및 정규화에서 사용하기 위한 2개의 플라스미드를 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제작하였다. 각각의 플라스미드는 구성적 EXP 서열에 의해 유도된 특이적 루시퍼라제 코딩 서열을 함유하였다. 식물 벡터 pMON19437은 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성효소 유전자 (T-AGRtu.nos-1:1:13, 서열 161)로부터의 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된 반딧불이 (포티누스 피랄리스 (Photinus pyralis)) 루시퍼라제 코딩 서열 (LUCIFERASE:1:3, 서열 166)의 5'에 작동가능하게 연결된 인트론 (EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1, 서열 170)의 5'에 작동가능하게 연결된 구성적 프로모터를 갖는 트랜스진 카세트를 포함한다. 식물 벡터 pMON63934는 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성효소 유전자 (T-AGRtu.nos-1:1:13, 서열 161)로부터 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된 씨 팬지 (sea pansy; 레닐라 레니포르미스 (Renilla reniformis)) 루시퍼라제 코딩 서열 (CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1, 서열 167)의 5'에 작동가능하게 연결된 구성적 EXP 서열 (EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1, 서열 168)을 갖는 트랜스진 카세트를 포함한다.
옥수수 잎 원형질체를 당업계에 잘 공지된 바와 같이 PEG-기반 형질전환 방법을 이용하여 형질전환시켰다. 원형질체 세포를 pMON19437 플라스미드 DNA, pMON63934 플라스미드 DNA, 및 표 3에 제시된 등몰량의 플라스미드 중의 하나로 형질전환시키고, 완전한 어둠 속에서 밤새 인큐베이팅하였다. GUS 및 루시퍼라제 둘 모두의 측정은 상기한 바와 같이 형질전환된 세포의 용해된 제제의 분취액을 2개의 상이한 작은-웰 트레이 내로 넣음으로써 수행하였다. 하나의 트레이는 GUS 측정을 위해 사용하고, 제2 트레이는 이중 루시퍼라제 리포터 검정 시스템 (프로메가 코프. (Promega Corp., 미국 위스콘신주 메디슨); 예를 들어, 문헌 [Promega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02] 참조)을 사용하여 이중 루시퍼라제 검정을 수행하기 위해 사용하였다. 각각의 EXP 서열에 대한 1 또는 2개의 형질전환을 수행하고, 각각의 EXP 서열에 대한 평균 발현 값을 각각의 형질전환 실험으로부터의 몇몇 샘플로부터 결정하였다. 샘플 측정은 각각의 EXP 서열 구축물 형질전환의 4회 반복, 또는 별법으로, 두 형질전환 실험 중의 하나당 각각의 EXP 서열 구축물의 3회 반복을 사용하여 이루어졌다. 평균 GUS 및 루시퍼라제 발현 수준을 표 4에 제공한다. 이 표에서, 반딧불이 루시퍼라제 값 (예를 들어 pMON19437의 발현으로부터)은 "FLuc"로 표시된 행에 제시되고, 레닐라 루시퍼라제 값은 "RLuc"로 표시된 행에 제시된다.
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각각의 EXP 서열의 상대적인 활성을 비교하기 위해서, GUS 값을 GUS 대 루시퍼라제 활성의 비로 표현하고, EXP 서열 EXP-Os.TubA-3:1:1 (서열 번호 165)에서 관찰된 발현 수준에 대해 정규화하였다. 아래 표 5는 옥수수 원형질체 내의 EXP-Os.TubA-3:1:1 발현에 대해 정규화된 GUS/RLuc의 발현비를 보여준다.
표 5에서 알 수 있는 바와 같이, EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22) 또는 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)에 의해 유도되는 GUS 발현은 EXP-Os.TubA-3:1:1 (서열 번호 165)에 의해 유도되는 GUS 발현보다 4.51 내지 9.42배 더 높았다. EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22) 또는 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)에 의해 유도되는 GUS 발현은 또한 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170), EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (서열 번호 163), 또는 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179)에 의해 유도되는 GUS 발현보다 더 높았다.
Figure 112018103689224-pat00015
아래 표 6은 옥수수 원형질체 내의 EXP-Os.TubA-3:1:1 발현에 대해 정규화된 GUS/FLuc의 발현비를 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00016
표 6에서 알 수 있는 바와 같이, EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22) 또는 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)에 의해 유도된 GUS 발현은 GUS/FLuc의 비율 값으로서 표현되고 EXP-Os.TubA-3:1:1 (서열 번호 165)에 대해 정규화될 때 동일한 일반적인 경향을 보였다. 발현은 EXP-Os.TubA-3:1:1 (서열 번호 165)에 의해 유도된 GUS 발현보다 12.69 내지 32.86배 더 높았다. 또한, EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22) 또는 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)에 의해 유도된 GUS 발현은 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170), EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os. Act1:1:1 (서열 번호 163), 또는 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179)의 것보다 특정 비교에 더 높았다.
실시예 3: GUS 트랜스진 카세트 앰플리콘을 사용하여 옥수수 원형질체에서 GUS를 유도하는 조절 요소의 분석.
옥수수 잎 원형질체를 β-글루쿠로니다제 (GUS) 트랜스진의 발현을 유도하는 EXP 서열을 함유하는 식물 발현 벡터로부터 유래된 DNA 앰플리콘으로 형질전환시키고, GUS의 발현이 아래 제시되는 일련의 실험에서 공지의 구성적 프로모터에 의해 유도되는 잎 원형질체와 비교하였다.
제1 세트의 실험에서, 잎 조직으로부터 유래된 옥수수 원형질체 세포를 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (서열 번호 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (서열 번호 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (서열 번호 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (서열 번호 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (서열 번호 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (서열 번호 134), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (서열 번호 137), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (서열 번호 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (서열 번호 153) 및 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98) 중의 하나에 의해 유도된 트랜스진 (GUS)의 발현을 공지의 구성적 프로모터의 것과 비교하기 위해서 식물 발현 벡터에 포함되는 GUS 트랜스진 카세트의 증폭으로부터 생산된 앰플리콘으로 상기한 바와 같이 형질전환시켰다. 트랜스진 카세트 앰플리콘이 그로부터 생성되는 증폭 주형을 포함하는 각각의 EXP 서열을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 "앰플리콘 주형"의 표제 하에 아래 표 7에 제시된 식물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 생성되는 식물 발현 벡터는 또한 상기한 바와 같이 3' UTR T-AGRtu.nos-1:1:13 또는 T-Ta.Hsp17-1:1:1의 5'에 작동가능하게 연결된, 프로세싱가능한 인트론 (상기 실시예 2에 논의된 바와 같은 "GUS-2"), 또는 연속적인 GUS 코딩 서열 (상기 논의한 바와 같은 "GUS-1")을 함유하는 β-글루쿠로니다제 (GUS) 코딩 서열의 5'에 작동가능하게 연결된 EXP 서열을 포함하는 트랜스진 카세트를 포함한다. 앰플리콘은 아래 표 7에 제시된 플라스미드 구축물 주형을 사용하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 생산하였다. 간단하게 설명하면, 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프로모터 서열에 어닐링하도록 설계되었고, 3' UTR의 3' 단부에서 어닐링하는 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각각의 트랜스진 카세트의 증폭을 위해 사용되었다. 각각의 앰플리콘 주형을 포함하는 프로모터 서열 내의 상이한 위치에서 어닐링하도록 설계된 상이한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용에 의해 연속적인 5' 결실을 트랜스진 카세트를 포함하는 프로모터 서열 내로 도입하여 상이한 EXP 서열을 생성하였다.
Figure 112018103689224-pat00017
Figure 112018103689224-pat00018
표 7에서 앰플리콘 주형으로서 제시된 플라스미드 구축물은 표 7의 나열된 EXP 서열을 포함하는 트랜스진 발현 카세트의 증폭을 위한 주형으로서 사용되었다. 비교를 위한 GUS 트랜스진 앰플리콘을 생성하기 위해 사용된 대조군 플라스미드를 실시예 2에 기재된 공지의 구성적 EXP 서열로 앞서 설명한 바와 같이 제작하였다. GUS 및 루시퍼라제 배경의 결정을 위한 음성 대조군, DNA 미함유 대조군, 및 2개의 루시퍼라제 플라스미드가 코딩 서열을 발현하지 않는 플라스미드 DNA와 함께 형질전환에 사용되는 대조 샘플도 사용하였다. 실시예 2에 논의된 바와 같은 플라스미드 pMON19437 및 pMON63934도 동시-형질전환 및 데이터의 정규화를 위해 사용되었다.
옥수수 잎 원형질체를 상기 실시예 2에 기재된 바와 같은 PEG-기반 형질전환 방법을 이용하여 형질전환시켰다. 아래 표 8은 각각의 트랜스진 카세트에 대해 결정된 평균 GUS 및 루시퍼라제 발현 값을 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00019
각각의 EXP 서열의 상대적인 활성을 비교하기 위해서, GUS 값을 GUS 대 루시퍼라제 활성의 비로서 표현하고, EXP-Os.Act1:1:1 및 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1에서 관찰된 발현 수준에 대해 정규화하였다. 아래 표 9는 옥수수 원형질체에서 EXP-Os.Act1:1:1 및 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 유도 발현에 대해 정규화된 GUS/RLuc 발현 비를 보여준다. 아래 표 10은 옥수수 원형질체에서 EXP-Os.Act1:1:1 및 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 유도 발현에 대해 정규화된 GUS/FLuc 발현 비를 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00020
Figure 112018103689224-pat00021
표 9 및 10에서 알 수 있는 바와 같이, 거의 모든 EXP 서열은 옥수수 세포에서 GUS 트랜스진 발현을 유도할 수 있었다. 평균 GUS 발현은 EXP-Os.Act1:1:1 또는 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1에 의해 유도된 GUS 발현에 비교할 때 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (서열 번호 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (서열 번호 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (서열 번호 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (서열 번호 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (서열 번호 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (서열 번호 134), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (서열 번호 137), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (서열 번호 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (서열 번호 153) 및 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98)에서 더 높았다.
제2 실험 세트에서, EXP 서열 EXP-Zm.UbqM1:1:8 (서열 번호 145)을 포함하는 GUS 카세트 앰플리콘을 GUS 발현에 대해 대조 앰플리콘 PCR0145942 (EXP-Os.Act1:1:9, 서열 179) 및 PCR0145944 (EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1, 서열 170)과 비교하였다. EXP 서열 EXP-Zm.UbqM1:1:8에 의해 유도된 GUS 발현은 2개의 대조군의 것보다 더 높았다. 아래 표 11은 각각의 앰플리콘에 대해 결정된 평균 GUS 및 루시퍼라제 값을 보여준다. 아래 표 12는 옥수수 원형질체에서 EXP-Os.Act1:1:9 및 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 유도 발현에 대해 정규화된 GUS/RLuc 및 GUS/FLuc 발현 비를 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00022
Figure 112018103689224-pat00023
제3 실험 세트에서, 앰플리콘 GUS 트랜스진 카세트를 상기 설명된 바와 같이 제조하고, EXP 서열인 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115) 및 EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)에 의해 유도된 발현에 대해 검정하였다. 앰플리콘은 T-AGRtu.nos-1:1:13 3' UTR에 작동가능하게 연결된 GUS-1 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 EXP 서열을 포함하였다. 발현을 대조 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179) 및 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170)과 비교하였다. 아래 표 13은 각각의 앰플리콘에 대해 결정된 평균 GUS 및 루시퍼라제 값을 보여준다. 아래 표 14는 옥수수 원형질체에서 EXP-Os.Act1:1:9 및 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 유도 발현에 대해 정규화된 GUS/RLuc 발현 비를 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00024
Figure 112018103689224-pat00025
상기 표 14에서 알 수 있는 바와 같이, EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115) 및 EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)는 트랜스진 발현을 유도할 수 있다. EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114) 및 EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115)에 의해 유도되는 발현은 두 대조군의 것보다 더 높았다. EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)에 의해 유도되는 발현은 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170)보다 낮았지만, 대조군 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179)보다 높았다.
제4 실험 세트에서, 앰플리콘 GUS 트랜스진 카세트를 상기 설명된 바와 같이 제조하고, EXP 서열 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:16 (서열 번호 93) 및 EXP-C1.Ubq1:1:17 (서열 번호 97)에 의해 유도된 발현에 대해 검정하였다. 발현을 대조군 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179) 및 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170)과 비교하였다. 아래 표 15는 각각의 앰플리콘에 대해 결정된 평균 GUS 및 루시퍼라제 값을 보여준다. 아래 표 16은 옥수수 원형질체에서 EXP-Os.Act1:1:9 및 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 유도 발현에 대해 정규화된 GUS/RLuc 및 GUS/FLuc 발현 비를 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00026
Figure 112018103689224-pat00027
표 16에서 알 수 있는 바와 같이, EXP 서열 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:16 (서열 번호 93) 및 EXP-C1.Ubq1:1:17 (서열 번호 97)은 트랜스진 발현을 유도할 수 있었다. 각각의 EXP 서열에 의해 유도된 발현은 두 대조군의 것보다 더 높았다.
제5 실험 세트에서, 앰플리콘 GUS 트랜스진 카세트를 상기 설명된 바와 같이 제조하고, EXP 서열 EXP-Zm.UbqM1:1:11 (서열 번호 149) 및 EXP-C1.Ubq1:1:23 (서열 번호 108)에 의해 유도된 발현에 대해 검정하였다. 발현을 대조군 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179) 및 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (서열 번호 163)과 비교하였다. 아래 표 17은 각각의 앰플리콘에 대해 결정된 평균 GUS 및 루시퍼라제 값을 보여준다. 아래 표 18은 옥수수 원형질체에서 EXP-Os.Act1:1:9 및 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 유도 발현에 대해 정규화된 GUS/RLuc 발현 비를 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00028
Figure 112018103689224-pat00029
상기 표 18에서 알 수 있는 바와 같이, EXP 서열 EXP-Zm.UbqM1:1:11 (서열 번호 149) 및 EXP-C1.Ubq1:1:23 (서열 번호 108)은 옥수수 잎 원형질체에서 GUS 발현을 유도할 수 있었다. 발현은 대조군 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179)와 유사하였고, EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (서열 번호 163)의 것보다 더 낮았다.
앰플리콘으로부터 GUS 발현을 유도하는 조절 요소의 효능은 유사하게 사탕수수 잎 원형질체에서 연구될 수 있다. 예를 들어, 사탕수수 원형질체를 EXP 서열을 함유하는 식물 발현 벡터로부터 유래된 DNA 앰플리콘으로 형질전환시키고, β-글루쿠로니다제 (GUS) 트랜스진의 발현을 유도하고, GUS의 발현이 공지의 구성적 프로모터에 의해 유도되는 잎 원형질체와 비교할 수 있다. 이와 비슷하게, 옥수수 또는 밀 원형질체에서 앰플리콘으로부터 CP4 발현을 유도하는 조절 요소를 유사하게 연구할 수 있다.
실시예 4: GUS 트랜스진 카세트 앰플리콘을 사용하여 밀 원형질체에서 GUS를 유도하는 조절 요소의 분석.
밀 잎 원형질체를 EXP 서열을 함유하는 식물 발현 벡터로부터 유래된 DNA 앰플리콘으로 형질전환시키고, β-글루쿠로니다제 (GUS) 트랜스진의 발현을 유도하고, GUS의 발현이 공지의 구성적 프로모터에 의해 유도된 잎 원형질체와 비교하였다.
잎 조직으로부터 유래된 밀 원형질체 세포를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 식물 발현 벡터에 포함되는 GUS 트랜스진 카세트의 증폭으로부터 생성된 앰플리콘으로 형질전환시켜, 상기 실시예 3에서 옥수수에서의 검정에서 사용된 바와 동일한 GUS 카세트 앰플리콘을 사용하여 선행 실시예 (실시예 3)에 기재된 바와 같은 방법으로 표 10-11에 제시된 EXP 서열에 의해 유도된 트랜스진 (GUS)의 발현을 공지의 구성적 프로모터의 것과 비교하였다. 또한, 밀 원형질체 형질전환에 사용된 대조군 GUS 카세트 앰플리콘 및 루시퍼라제 플라스미드도 선행 실시예에서 제시되고 실시예 3에서 상기 표 7에 제공된 것과 동일하였고, 한다. 이와 비슷하게, 상기 설명된 바와 같이 GUS 및 루시퍼라제 배경의 결정을 위해 음성 대조군을 사용하였다. 밀 잎 원형질체를 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 PEG-기반 형질전환 방법을 이용하여 형질전환시켰다. 표 19는 형질전환된 밀 잎 원형질체 세포에서 관찰된 평균 GUS 및 LUC 활성을 나열하고, 표 20은 밀 원형질체에서 정규화된 GUS/RLuc 발현 비를 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00030
Figure 112018103689224-pat00031
상기 표 20에서 알 수 있는 바와 같이, 거의 모든 EXP 서열이 밀 세포에서 GUS 트랜스진 발현을 유도할 수 있었다. EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (서열 번호 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (서열 번호 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (서열 번호 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (서열 번호 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (서열 번호 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (서열 번호 134), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (서열 번호 137), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (서열 번호 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (서열 번호 153) 및 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98)에 의해 유도된 GUS 트랜스진 발현은 EXP-Os.Act1:1:9에 의해 유도된 GUS 발현보다 훨씬 더 높았다. EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1에 비해 밀 잎 원형질체 세포에서 앰플리콘의 GUS 발현은 옥수수 원형질체 세포에서 관찰된 발현과 약간 상이하였다. 각각의 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (서열 번호 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (서열 번호 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (서열 번호 124), EXP-Sv.Ubq1:1:7 (서열 번호 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (서열 번호 132), EXP-Sv.Ubq1:1:10 (서열 번호 134), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (서열 137), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141) 및 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98)은 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1에 비해 더 높은 수준의 GUS 발현을 나타냈다. EXP 서열 EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (서열 번호 151) 및 EXP-Sb.Ubq6:1:2 (서열 번호 153)은 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1에 비해 더 낮은 수준의 GUS 발현을 나타냈다.
제2 실험 세트에서, 앰플리콘 GUS 트랜스진 카세트를 상기 설명된 바와 같이 제조하고, EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115) 및 EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)에 의해 유도된 발현에 대해 검정하였다. 앰플리콘은 T-AGRtu.nos-1:1:13 3' UTR에 작동가능하게 연결된 GUS-1 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 EXP 서열로 이루어졌다. 발현을 대조군 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179) 및 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170)에 비교하였다. 아래 표 21은 각각의 앰플리콘에 대해 결정된 평균 GUS 및 루시퍼라제 값을 보여준다. 아래 표 22는 옥수수 원형질체에서 EXP-Os.Act1:1:9 및 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 유도 발현에 대해 정규화된 GUS/RLuc 발현 비를 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00032
Figure 112018103689224-pat00033
상기 표 22에서 알 수 있는 바와 같이, EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115) 및 EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)는 트랜스진 발현을 유도할 수 있다. EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114) 및 EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115)에 의해 유도된 발현은 두 대조군의 것보다 더 높았다. EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)에 의해 유도된 발현은 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170)보다 더 낮았지만, 대조군인 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179)보다는 더 높았다.
제3 실험 세트에서, EXP 서열 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:16 (서열 번호 93) 및 EXP-C1.Ubq1:1:17 (서열 번호 97)에 의해 유도된 발현을 검정하기 위해 앰플리콘 GUS 트랜스진 카세트를 상기 설명된 바와 같이 제조하였다. 발현을 대조군 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179) 및 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170)에 비교하였다. 아래 표 23은 각각의 앰플리콘에 대해 결정된 평균 GUS 및 루시퍼라제 값을 보여준다. 아래 표 24는 옥수수 원형질체에서 EXP-Os.Act1:1:9 및 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 유도 발현에 대해 정규화된 GUS/RLuc 및 GUS/FLuc 발현 비를 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00034
Figure 112018103689224-pat00035
상기 표 24에서 알 수 있는 바와 같이, EXP 서열 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:16 (서열 번호 93) 및 EXP-C1.Ubq1:1:17 (서열 번호 97)은 트랜스진 발현을 유도할 수 있었다. 각각의 EXP 서열에 의해 유도된 발현은 두 대조군의 것보다 더 높았다.
제4 실험 세트에서, EXP 서열 EXP-Zm.UbqM1:1:11 (서열 번호 149) 및 EXP-C1.Ubq1:1:23 (서열 번호 108)에 의해 유도된 발현을 검정하기 위해 앰플리콘 GUS 트랜스진 카세트를 상기 설명된 바와 같이 제조하였다. 발현을 대조군 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179) 및 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (서열 번호 163)과 비교하였다. 아래 표 25는 각각의 앰플리콘에 대해 결정된 평균 GUS 및 루시퍼라제 값을 보여준다. 아래 표 26은 옥수수 원형질체에서 EXP-Os.Act1:1:9 및 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 유도 발현에 대해 정규화된 GUS/RLuc 발현 비를 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00036
Figure 112018103689224-pat00037
상기 표 26에서 알 수 있는 바와 같이, EXP 서열 EXP-Zm.UbqM1:1:11 (서열 번호 149) 및 EXP-C1.Ubq1:1:23 (서열 번호 108)은 밀 잎 원형질체에서 GUS 발현을 유도할 수 있었다. 발현은 대조군인 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179)의 것과 유사하였지만, EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (서열 번호 163)의 것보다는 더 낮았다.
실시예 5: GUS 트랜스진 카세트 앰플리콘을 사용하여 사탕수수 원형질체에서 GUS를 유도하는 조절 요소의 분석.
사탕수수 잎 원형질체를 β-글루쿠로니다제 (GUS) 트랜스진의 발현을 유도하는 EXP 서열을 함유하는 식물 발현 벡터로부터 유래된 DNA 앰플리콘으로 형질전환시키고, GUS의 발현이 공지의 구성적 프로모터에 의해 유도되는 잎 원형질체에 비교하였다.
EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115) 및 EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116) 중 하나에 의해 유도되고 아래 표 27에 제시된 트랜스진 (GUS)의 발현을 공지의 구성적 프로모터의 것과 비교하기 위해 잎 조직으로부터 유래된 사탕수수 원형질체 세포를 GUS 트랜스진 카세트를 포함하는 식물 발현 벡터의 증폭으로부터 생산된 앰플리콘으로, 상기 실시예 3에 기재된 바와 같은 PEG-기반 형질전환 방법을 이용하여 형질전환시켰다.
Figure 112018103689224-pat00038
또한, 사탕수수 원형질체 형질전환에 사용된 대조군 GUS 카세트 앰플리콘 및 루시퍼라제 플라스미드도 실시예 2 내지 4에 제시되고 실시예 3에서 상기 표 7에 제공된 것과 동일하였다. 이와 비슷하게, 음성 대조군을 상기 설명된 바와 같이 GUS 및 루시퍼라제 배경의 결정을 위해 사용하였다. 표 28에서는 형질전환된 사탕수수 잎 원형질체 세포에서 관찰된 평균 GUS 및 Luc 활성을 열거하고, 표 29는 사탕수수 잎 원형질체에서 정규화된 GUS/RLuc 발현 비를 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00039
Figure 112018103689224-pat00040
상기 표 29에서 알 수 있는 바와 같이, EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115) 및 EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)는 모두 사탕수수 원형질체에서 트랜스진 발현을 유도할 수 있었다. EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114) 및 EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115)는 본 실험에서 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170)보다 더 높은 GUS를 발현하였다.
실시예 6: 옥수수 원형질체에서 CP4를 유도하는 조절 요소의 분석.
본 실시예는 EXP-Sv.Ubq1:1:7 (서열 번호 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (서열 번호 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (서열 번호 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (서열 번호 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (서열 번호 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (서열 번호 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (서열 번호 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (서열 번호 124), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (서열 번호 151) 및 EXP-Sb.Ubq6:1:2 (서열 번호 153)의 옥수수 원형질체에서 글리포세이트 내성 유전자 CP4의 발현을 유도하는 능력을 입증한다. 이들 EXP 서열을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 식물 이원성 형질전환 플라스미드 구축물 내로 클로닝하였다. 생성되는 식물 발현 벡터는 에이. 투메파시엔스로부터의 우측 경계 영역, T-AGRtu.nos-1:1:13 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된 색소체 표적화된 글리포세이트 내성 EPSPS 코딩 서열 (CP4, US RE39247)의 5'에 작동가능하게 연결된 유비퀴틴 EXP 서열; 및 에이. 투메파시엔스로부터의 좌측 경계 영역 (B-AGRtu.좌측 경계)을 함유하였다. 생성되는 플라스미드 구축물은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 옥수수 잎 원형질체 세포를 형질전환시키기 위해 사용되었다.
표 1에 규정된 바와 같은 EXP 서열을 갖는 표 30에 나열된 플라스미드 구축물을 사용하였다. CP4 또는 GFP를 유도하는 공지의 구성적 조절 요소를 갖는 3개의 대조군 플라스미드 (pMON30098, pMON42410, 및 pMON30167)를 제작하고, 이들 EXP 서열에 의해 유도된 상대적인 CP4 발현 수준을 공지의 구성적 발현 요소에 의해 유도된 CP4 발현과 비교하기 위해 사용하였다. 다른 2개의 플라스미드 (pMON19437 및 pMON63934)를 또한 상기 설명된 바와 같이 형질전환 효율 및 생육성을 평가하기 위해 사용하였다. 각각의 플라스미드는 구성적 EXP 서열에 의해 유도되는 특이적 루시퍼라제 코딩 서열을 함유한다.
옥수수 잎 원형질체를 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 PEG-기반 형질전환 방법을 이용하여 형질전환시켰다. CP4 및 루시퍼라제 둘 모두의 측정은 상기 실시예 2와 유사하게 수행하였다. 백만분율 (ppm)로서 표현된 CP4 단백질 발현의 평균 수준을 아래 표 30에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00041
표 30에서 알 수 있는 바와 같이, EXP-Sv.Ubq1:1:7 (서열 번호 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (서열 번호 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (서열 번호 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (서열 번호 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (서열 번호 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (서열 번호 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (서열 번호 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (서열 번호 124) 및 EXP-Sb.Ubq6:1:2 (서열 번호 153)은 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 및 EXP-Os.Act1:1:1에 의해 유도된 CP4 발현 수준에 근접하거나 이보다 더 높은 수준으로 CP4 트랜스진의 발현을 유도하였다. EXP 서열 EXP-Sb.Ubq4:1:2 (서열 번호 151)은 CP4의 발현을 유도하는 능력을 나타냈지만, 발현 수준은 구성적 대조군의 것보다 더 낮았다.
또한, 상기한 바와 유사한 데이터를 상기 설명된 플라스미드 구축물로 안정하게 형질전환된 식물, 예를 들어, 자손체 세대(들) R0, R1 또는 F1 또는 그 이후의 식물로부터 얻을 수 있다. 이와 비슷하게, 다른 플라스미드 구축물로부터의 발현을 연구할 수 있다. 예를 들어, pMON141619는 EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:8을 포함하지만, pMON142862는 EXP 서열 EXP-ERIra.Ubq1:1:8를 포함하였다. 이들 및 다른 구축물을 상기 방식으로 분석할 수 있다.
실시예 7: CP4 트랜스진 카세트 앰플리콘을 사용하여 옥수수 원형질체에서 CP4를 유도하는 조절 요소의 분석.
본 실시예는 옥수수 원형질체에서 글리포세이트 내성 유전자 CP4의 발현을 유도하는 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115), EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116), EXP-C1.Ubq1:1:16 (서열 번호 93) 및 EXP-C1.Ubq1:1:17 (서열 번호 97)의 능력을 예시한다. 이들 EXP 서열을 식물 이원성 형질전환 플라스미드 구축물 내로 클로닝하였다. 생성되는 식물 발현 벡터를 증폭 주형으로서 사용하여, T-AGRtu.nos-1:1:13 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된 색소체 표적화된 글리포세이트 내성 EPSPS 코딩 서열 (CP4, US RE39247)의 5'에 작동가능하게 연결된 유비퀴틴 EXP 서열 및 에이. 투메파시엔스로부터의 좌측 경계 영역을 포함하는 트랜스진 카세트 앰플리콘을 생산하였다. 생성되는 앰플리콘은 옥수수 잎 원형질체 세포를 형질전환시키기 위해 사용되었다.
옥수수 잎 원형질체를 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이, PEG-기반 형질전환 방법을 이용하여 형질전환시켰다. 두 CP4의 측정은 ELISA-기반 검정을 이용하여 수행하였다. 백만분율 (ppm)로서 표현된 CP4 단백질 발현의 평균 수준을 아래 표 31 및 32에 제시한다.
제1 실험 시리즈에서, EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115) 및 EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)을 포함하는 앰플리콘에 의해 유도된 CP4의 발현을 형질전환된 옥수수 잎 원형질체에서 검정하고, 구성적 대조군 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170) 및 EXP-Os.Act1:1:1 (서열 번호 164)에 의해 유도된 CP4 발현 수준과 비교하였다. 백만분율 (ppm)로서 표현된 CP4 단백질 발현의 평균 수준을 아래 표 31에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00042
상기 표 31에서 알 수 있는 바와 같이, EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115) 및 EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)는 CP4 발현을 유도할 수 있었다. EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)를 제외하고 모든 EXP 서열은 구성적 대조군 EXP-Os.Act1:1:1 (서열 번호 164)보다 훨씬 더 높은 수준으로 CP4 발현 수준을 유도하였다. 발현 수준은 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170)의 것보다 더 낮았다.
제2 실험 시리즈에서, EXP 서열 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:16 (서열 번호 93) 및 EXP-C1.Ubq1:1:17 (서열 번호 97)을 포함하는 앰플리콘에 의해 유도된 CP4의 발현을 형질전환된 옥수수 잎 원형질체에서 검정하고, 구성적 대조군 EXP-Os.Act1:1:1 (서열 번호 164)에 의해 유도된 CP4 발현 수준과 비교하였다. 백만분율 (ppm)로서 표현된 CP4 단백질 발현의 평균 수준을 아래 표 32에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00043
상기 표 32에 볼 수 있는 바와 같이, EXP 서열 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:16 (서열 번호 93) 및 EXP-C1.Ubq1:1:17 (서열 번호 97)은 CP4 발현을 유도할 수 있었다. 3개의 모든 EXP 서열에 의해 유도된 발현 수준은 구성적 대조군 EXP-Os.Act1:1:1 (서열 번호 164)보다 더 높았다.
실시예 8: 밀 원형질체에서 CP4를 유도하는 조절 요소의 분석.
본 실시예는 밀 잎 원형질체에서 CP4 발현을 유도하는 EXP-Sv.Ubq1:1:7 (서열 번호 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (서열 번호 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (서열 번호 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (서열 번호 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (서열 번호 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (서열 번호 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (서열 번호 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (서열 번호 124), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (서열 번호 151) 및 EXP-Sb.Ubq6:1:2 (서열 번호 153)의 능력을 예시한다. 이들 EXP 서열을 당업계에 공지된 방법을 이용하고 상기 실시예 2 및 5에 기재된 바와 같이 식물 이원성 형질전환 플라스미드 구축물 내로 클로닝하였다.
3개의 대조군 플라스미드 (앞서 설명된 바와 같은 pMON30098, pMON42410, 및 T-AGRtu.nos-1:1:13의 5'에 작동가능하게 연결된 색소체 표적화된 글리포세이트 내성 코딩 서열 (CP4, US RE39247)의 5'에 작동가능하게 연결된 EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1-B3+Os.Act1:1:1 (서열 번호 138)을 갖는 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 우측 경계 영역; 및 CP4 또는 GFP를 유도하는 공지의 구성적 조절 요소를 갖는 좌측 경계 영역 (B-AGRtu.좌측 경계)을 포함하는 pMON43647)를 실시예 5에 개략된 바와 같이 제작하였다.
밀 잎 원형질체를 검정당 1.5 X 105 원형질체 세포를 사용한 것을 제외하고 선행 실시예에서 설명된 바와 같이 PEG-기반 형질전환 방법을 이용하여 형질전환시켰다. 루시퍼라제 및 CP4 트랜스진 발현의 검정을 상기 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다. CP4 ELISA에 의해 결정된 평균 CP4 발현 수준을 아래 표 34에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00044
EXP 서열 및 공지의 구성적 EXP 서열 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1에 의해 유도된 밀 원형질체에서 CP4 발현의 총량은 옥수수 원형질체와 비교할 때 밀 원형질체에서 상이한 수준의 CP4 발현을 입증하였다.
몇몇 EXP 서열은 밀 원형질체 내에서 CP4 발현을 공지의 구성적 EXP 서열 EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1-B3+Os.Act1:1:1 및 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1보다 더 낮은 수준으로 유도하였다. 2개의 EXP 서열, 즉 EXP-Zm.UbqM1:1:6 (서열 번호 137) 및 EXP-SETit.Ubq1:1:5 (서열 번호 117)은 본 검정에서 밀 원형질체에서 공지의 구성적 EXP 서열보다 더 높은 수준의 CP4 발현을 제공한다. EXP-Zm.UbqM1:1:2는 CP4의 발현을 최고 수준으로 유도하였고, 여기서 발현 수준은 각각 EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1-B3+Os.Act1:1:1 및 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1보다 2.2 내지 3.4배 더 높았다. 검정된 모든 EXP 서열은 밀 세포에서 CP4의 발현을 유도하는 능력을 나타냈다.
실시예 9: CP4 트랜스진 카세트 앰플리콘을 사용하여 밀 원형질체에서 CP4를 유도하는 조절 요소의 분석.
본 실시예는 밀 원형질체에서 글리포세이트 내성 유전자 CP4의 발현을 유도하는 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115), EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116), EXP-C1.Ubq1:1:16 (서열 번호 93) 및 EXP-C1.Ubq1:1:17 (서열 번호 97)의 능력을 예시한다. 이들 EXP 서열을 식물 이원성 형질전환 플라스미드 구축물 내로 클로닝하였다. 생성되는 식물 발현 벡터를 증폭 주형으로서 사용하여, T-AGRtu.nos-1:1:13 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된 색소체 표적화된 글리포세이트 내성 EPSPS 코딩 서열 (CP4, US RE39247)의 5'에 작동가능하게 연결된 유비퀴틴 EXP 서열, 및 에이. 투메파시엔스로부터의 좌측 경계 영역을 포함하는 트랜스진 카세트 앰플리콘을 생산하였다. 생성되는 앰플리콘은 옥수수 잎 원형질체 세포를 형질전환시키기 위해 사용되었다.
밀 잎 원형질체를 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 PEG-기반 형질전환 방법을 이용하여 형질전환시켰다. 두 CP4의 측정은 ELISA-기반 검정을 이용하여 수행하였다. 백만분율 (ppm)로서 표현된 CP4 단백질 발현의 평균 수준을 아래 표 35 및 36에 제시한다.
제1 실험 시리즈에서, EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115) 및 EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)를 포함하는 앰플리콘에 의해 유도된 CP4의 발현을 형질전환된 밀 잎 원형질체에서 검정하고, 구성적 대조군 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170) 및 EXP-Os.Act1:1:1 (서열 번호 164)에 의해 유도된 CP4 발현 수준과 비교하였다. 백만분율 (ppm)로서 표현된 CP4 단백질 발현의 평균 수준을 아래 표 35에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00045
상기 표 31에서 볼 수 있는 바와 같이, EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115) 및 EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)는 CP4 발현을 유도할 수 있었다. EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116) 하나만을 제외하고 모든 EXP 서열은 구성적 대조군 EXP-Os.Act1:1:1 (서열 번호 164)보다 훨씬 더 높은 수준에서 CP4 발현 수준을 유도하였다. 발현 수준은 대부분의 EXP 서열에 대해 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170)의 것과 대략 동일하거나 이보다 더 낮았다.
제2 실험 시리즈에서, EXP 서열 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:16 (서열 번호 93) 및 EXP-C1.Ubq1:1:17 (서열 번호 97)을 포함하는 앰플리콘에 의해 유도된 CP4의 발현을 형질전환된 밀 잎 원형질체에서 검정하고, 구성적 대조군 EXP-Os.Act1:1:1 (서열 번호 164)에 의해 유도된 CP4 발현 수준과 비교하였다. 백만분율 (ppm)로서 표현된 CP4 단백질 발현의 평균 수준을 아래 표 36에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00046
상기 표 36에 볼 수 있는 바와 같이, EXP 서열 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:16 (서열 번호 93) 및 EXP-C1.Ubq1:1:17 (서열 번호 97)은 CP4 발현을 유도할 수 있었다. 3개의 모든 EXP 서열에 의해 유도된 발현 수준은 구성적 대조군 EXP-Os.Act1:1:1 (서열 번호 164)보다 훨씬 더 높았다.
실시예 10: 사탕수수 원형질체에서 CP4를 유도하는 조절 요소의 분석.
본 실시예는 사탕수수 잎 원형질체에서 CP4의 발현을 유도하는 EXP-Sv.Ubq1:1:7 (서열 번호 128), EXP-Sv.Ubq1:1:8 (서열 번호 132), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (서열 번호 133), EXP-Zm.UbqM1:1:6 (서열 번호 137), EXP-Zm.UbqM1:1:8 (서열 번호 145), EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141), EXP-SETit.Ubq1:1:5 (서열 번호 117), EXP-SETit.Ubq1:1:7 (서열 번호 123), EXP-SETit.Ubq1:1:6 (서열 번호 124), EXP-Sb.Ubq4:1:2 (서열 번호 151), EXP-Sb.Ubq6:1:2 (서열 번호 153) 및 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98)의 능력을 예시한다. EXP 서열을 식물 이원성 형질전환 플라스미드 구축물 내로 클로닝하였다. 생성되는 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스로부터 우측 경계 영역; T-AGRtu.nos-1:1:13 (서열 번호 127) 또는 T-CaMV.35S-1:1:1 (서열 번호 140) 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된 색소체 표적화된 글리포세이트 내성 EPSPS 코딩 서열 (CP4, US RE39247)의 5'에 작동가능하게 연결된 유비퀴틴 EXP 서열; 및 에이. 투메파시엔스로부터 좌측 경계 영역 (B-AGRtu.좌측 경계)을 함유하였다. 생성되는 플라스미드 구축물은 PEG 형질전환 방법을 이용하여 사탕수수 잎 원형질체 세포를 형질전환시키기 위해 사용되었다.
플라스미드 구축물 pMON129203, pMON12904, pMON12905, pMON129210, pMON129211, pMON129212, pMON129200, pMON129201, pMON129202, pMON129219, 및 pMON129218은 상기 표 12에 기재된 바와 같다.
CP4를 유도하는 공지의 구성적 조절 요소로 3개의 대조군 플라스미드 (상기 설명된 pMON30167; 또한 EXP-Os.Act1:1:1 (서열 번호 164)를 포함하는 pMON130803; 및 EXP-P-CaMV.35S-enh-1:1:13/L-CaMV.35S-1:1:2/I-Os.Act1-1:1:19 (서열 번호 139)를 포함하는 pMON132804)를 제작하고, 아래 표 37에 나열된 유비퀴틴 EXP 서열에 의해 유도된 상대적인 CP4 발현 수준을 비교하기 위해 사용하였다.
사탕수수 잎 원형질체를 PEG-기반 형질전환 방법을 이용하여 형질전환시켰다. CP4 ELISA에 의해 결정된 평균 CP4 발현 수준을 아래 표 37에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00047
상기 표 37에서 알 수 있는 바와 같이, EXP 서열은 사탕수수 원형질체에서 CP4 발현을 유도하는 능력을 나타냈다. 발현의 수준은 EXP-Os.Act1:1:1 (서열 번호 164)에 의해 유도된 CP4 발현과 유사하거나 그보다 더 컸다. 1개의 EXP 서열 EXP-Zm.UbqM1:1:8 (서열 번호 145)은 사탕수수 원형질체에서 EXP-P-CaMV.35S-enh-1:1:13/L-CaMV.35S-1:1:2/I-Os.Act1-1:1:19 (서열 번호 139)에 비해 더 높은 수준의 발현을 나타냈다.
실시예 11: CP4 트랜스진 카세트 앰플리콘을 사용하여 사탕수수 원형질체에서 CP4를 유도하는 조절 요소의 분석.
본 실시예는 사탕수수 원형질체에서 글리포세이트 내성 유전자 CP4의 발현을 유도하는 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115) 및 EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)의 능력을 예시한다. 이들 EXP 서열을 식물 이원성 형질전환 플라스미드 구축물 내로 클로닝하였다. 생성되는 식물 발현 벡터를 증폭 주형으로서 사용하여, T-AGRtu.nos-1:1:13 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된 색소체 표적화된 글리포세이트 내성 EPSPS 코딩 서열 (CP4, US RE39247)의 5'에 작동가능하게 연결된 유비퀴틴 EXP 서열; 및 에이. 투메파시엔스로부터 좌측 경계 영역을 포함하는 트랜스진 카세트 앰플리콘을 생산하였다. 생성되는 앰플리콘은 사탕수수 잎 원형질체 세포를 형질전환시키기 위해 사용되었다.
사탕수수 잎 원형질체를 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 PEG-기반 형질전환 방법을 이용하여 형질전환시켰다. 두 CP4의 측정은 ELISA-기반 검정을 이용하여 수행하였다.
EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114), EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115) 및 EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)를 포함하는 앰플리콘에 의해 유도된 CP4의 발현을 형질전환된 밀 잎 원형질체에서 검정하고, 구성적 대조군 EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 (서열 번호 170) 및 EXP-Os.Act1:1:1 (서열 번호 164)에 의해 유도된 CP4 발현 수준과 비교하였다. 백만분율 (ppm)로서 표현된 CP4 단백질 발현의 평균 수준을 아래 표 38에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00048
상기 표 38에서 알 수 있는 바와 같이, EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:7 (서열 번호 5), EXP-ANDge.Ubq1 1:8 (서열 번호 8), EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (서열 번호 10), EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (서열 번호 12), EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (서열 번호 14), EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (서열 번호 16), EXP-ERIra.Ubq1:1:9 (서열 번호 22), EXP-ERIra.Ubq1:1:10 (서열 번호 25), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-ERIra.Ubq1:1:11 (서열 번호 29), EXP-ERIra.Ubq1:1:12 (서열 번호 31), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-C1.Ubq1:1:13 (서열 번호 114) 및 EXP-C1.Ubq1:1:14 (서열 번호 115)는 CP4 발현을 유도할 수 있었다. EXP-C1.Ubq1:1:15 (서열 번호 116)은 본 검정에서 CP4 발현을 유도하는 것으로 보이지 않았다.
실시예 12: 트랜스제닉 옥수수에서 GUS를 유도하는 조절 요소의 분석.
옥수수 식물을 β-글루쿠로니다제 (GUS) 트랜스진의 발현을 유도하는 EXP 서열을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시키고, 생성되는 식물을 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다. 유비퀴틴 EXP 서열을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 식물 이원성 형질전환 플라스미드 구축물 내로 클로닝하였다.
생성되는 식물 발현 벡터는 에이. 투메파시엔스로부터 우측 경계 영역; 벼 액체 전달 단백질 유전자 (T-Os.LTP-1:1:1, 서열 141)로부터 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된 상기 설명된 프로세싱가능한 인트론 GUS-2를 갖는 β-글루쿠로니다제 (GUS)에 대한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 EXP 서열을 검정하기 위한 제1 트랜스진 카세트; 제초제 글리포세이트 (벼 액틴 1 프로모터에 의해 유도된)에 대한 내성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선택을 위해 사용된 제2 트랜스진 선택 카세트; 및 에이. 투메파시엔스로부터 좌측 경계 영역을 함유한다. 생성되는 플라스미드는 옥수수 식물을 형질전환시키기 위해 사용되었다. 표 39는 플라스미드 지정, EXP 서열 및 서열 번호를 나열하고, 이는 또한 표 1에 기재되어 있다.
Figure 112018103689224-pat00049
식물을 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 20090138985에 설명된 바와 같이 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용하여 형질전환시켰다.
형질전환된 식물의 정성적 발현 분석을 위해 조직화학적 GUS 분석을 이용하였다. 전체 조직 절편을 GUS 염색 용액 X-Gluc (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-글루쿠로나이드) (1 mg/ml)와 함께 적절한 시간 동안 인큐베이팅하고, 세정하고, 청색 착색에 대해 시각적으로 검사하였다. GUS 활성은 선택된 식물 기관 및 조직을 이용하여 직접 시각 검사에 의해 또는 현미경 하 검사에 의해 정성적으로 결정하였다. R0 식물을 뿌리 및 잎뿐만 아니라 꽃밥 (anther), 견사 (silk) 및 발생하는 종자와 수분 21일 후 (21 DAP) 배에서 발현에 대해 검사하였다.
정량적 분석을 위해, 형질전환된 옥수수 식물의 선택된 조직으로부터 총 단백질을 추출하였다. 1 ㎍의 총 단백질을 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로나이드 (MUG)와 함께 50 ㎕의 총 반응 부피로 사용하였다. 반응 생성물 4-메틸움벨리페론 (4-MU)은 히드록실기가 이온화되는 높은 pH에서 최대로 형광성이다. 탄산나트륨의 염기성 용액을 동시에 첨가하여 검정을 중지시키고 형광 생성물을 정량하기 위해 pH를 조정하였다. 형광을 여기 2 nm 및 방출 3 nm로 설정된 슬릿 (slit) 폭을 갖는, 마이크로맥스 판독기 (Micromax Reader)로 플루오로맥스 (Fluoromax)-3 (호리바 (Horiba; 일본 교또))을 사용하여 365 nm에서 여기 및 445 nm에서 방출로 측정하였다.
각각의 형질전환에 대해 관찰된 평균 R0 GUS 발현을 아래 표 40 및 41에 제시한다. pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, 서열 125)로 형질전환된 형질전환체에 대해 수행된 R0 GUS 검정은 품질 표준을 통과하지 않았다. 이들 형질전환체를 F1 세대에서 검정하였고, 본 실시예에서 아래에 추가로 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00050
Figure 112018103689224-pat00051
R0 옥수수 식물에서, 잎 및 뿌리에서 GUS 발현 수준은 유비퀴틴 EXP 서열들 사이에서 상이하였다. 모든 EXP 서열은 안정하게 형질전환된 식물에서 GUS 트랜스진 발현을 유도하는 능력을 보인 한편, 각각의 EXP 서열은 다른 것들에 비해 독특한 발현 패턴을 보였다. 예를 들어, EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8) 및 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)에 대해 뿌리 발달의 초기 기 (V4 및 V7)에 높은 수준의 GUS 발현이 관찰되었지만 VT 기에 감소하였다. EXP-Zm.UbqM1:1:10 (서열 번호 139)에 의해 유도된 뿌리 발현은 V3에서 발현을 보이지 않았지만 V7 기에 높고 그 후 VT 기에 하강하였다. EXP-Zm.UbqM1:1:11 (서열 번호 149)에 의해 유도된 뿌리 발현은 V3 기, V7 기로부터 VT 기까지 발달 전체를 통해 유사한 수준으로 유지되었다. 뿌리 발현은 EXP-C1.Ubq1:1:12 (서열 번호 90), EXP-C1.Ubq1:1:11 (서열 번호 95) 및 EXP-C1.Ubq1:1:23 (서열 번호 108)로 형질전환된 식물에서 초기 발달 (V3/V4)로부터 V7 기까지 증가한 후 V7 기로부터 V8 기까지 하강하는 것으로 관찰되었다. GUS 발현 수준은 잎 조직에서 또한 극적인 차이를 보여주었다. 최고 수준의 잎 발현은 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8) 및 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)을 사용하여 초기 발달 (V3/V4)에서 부여되었고, 이것은 V7 기 내지 VT 기에서 감소하였다. GUS 발현은 EXP-Zm.UbqM1:1:10 (서열 번호 139), EXP-Zm.UbqM1:1:11 (서열 번호 149), EXP-Zm.UbqM1:1:12 (서열 번호 143) 및 EXP-C1.Ubq1:1:23 (서열 번호 108)을 사용할 때 V3 기 내지 VT 기까지 보유되었고; EXP-SETit.Ubq1:1:10 (서열 번호 119) 및 EXP-Sb.Ubq6:1:3 (서열 번호 155)을 사용할 때 더 낮은 정도였다. 잎에서 발현은 EXP-C1.Ubq1:1:12 (서열 번호 90), EXP-C1.Ubq1:1:11 (서열 번호 95) 및 EXP-C1.Ubq1:1:23 (서열 번호 108)을 사용할 때 V3 기 내지 V7 기에서 VT 기까지 증가한 한편, EXP-Sv.Ubq1:1:12 (서열 번호 136) 및 EXP-Sb.Ubq4:1:2 (서열 번호 151)을 사용할 때 발현은 V3 기로부터 VT 기까지 감소하였다.
이와 비슷하게, 생식 조직 (꽃밥 및 견사) 및 발생하는 종자 (21DAP 배 및 배젖)에 관하여, 상이한 발현이 패턴이 각각의 EXP 서열에 독특하게 관찰되었다. 예를 들어, EXP-Zm.UbqM1:1:10 (서열 번호 139), EXP-Zm.UbqM1:1:11 (서열 번호 149), EXP-Zm.UbqM1:1:12 (서열 번호 143) 및 EXP-C1.Ubq1:1:23 (서열 번호 108)을 사용할 때 꽃밥 및 견사뿐만 아니라 발생하는 종자에서 높은 수준의 발현이 관찰되었다. EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8) 및 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)을 사용할 때 발현은 꽃밥 및 견사에서 높지만 발생하는 종자에서 낮았다. EXP-Sb.Ubq7:1:2 (서열 번호 157)에 의해 유도된 발현은 생식 조직에서 높고 발생하는 배에서 높지만, 발생하는 배젖에서 더 낮았다. EXP 서열 EXP-Sb.Ubq4:1:2 (서열 번호 151)은 단지 꽃밥에서 발현을 보였지만 견사에서 그렇지 않았고, 발생하는 종자에서 훨씬 더 낮게 발현되었다. EXP-Sv.Ubq1:1:11 (서열 번호 130)은 생식 조직 및 발생하는 종자에 대해서는 EXP-Sb.Ubq4:1:2 (서열 번호 151)과 유사한 패턴을 보였지만, EXP-Sb.Ubq4:1:2 (서열 번호 151)은 뿌리 및 잎 조직에서 발현을 보인 반면 EXP-Sv.Ubq1:1:11 (서열 번호 130)은 이들 동일한 조직에서 훨씬 더 낮게 발현되었다.
단일 카피 삽입을 위해 선택된 R0 세대 형질전환체를 F1 또는 R1 집단의 종자를 생산하기 위해 비-트랜스제닉 LH244 주 (F1을 생산함)와 교배하거나 자가-수분시켰다 (R1을 생산함). 두 경우 모두에, 이형접합성 F1 또는 R1 식물을 연구를 위해 선택하였다. GUS 발현 수준을 선택된 조직에서 앞서 설명된 바와 같이 발생 과정에 걸쳐 측정하였다. 본 연구를 위해 사용된 F1 또는 R1 조직은 다음을 포함하였다: 발아 4일 후 (DAG) 흡수한 (imbibed) 종자 배, 흡수한 종자 배젖, 뿌리 및 자엽초; V3 기에 잎 및 뿌리; V8 기에 뿌리 및 성숙한 잎; 뿌리, 성숙한 잎, VT 기 (수염형성 (tasseling)에서, 생식 전의) 꽃밥, 화분, 잎 및 노화한 잎; R1 옥수수속, 견사, 뿌리 및 마디사이; 수분 12일 후 (DAP) 낟알 (kernel) 및 21 및 38 DAP에 배 및 배젖. 선택된 조직 샘플을 또한 pMON132037 (EXP-SETit.Ubq1:1:10, 서열 119), pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, 서열 125), pMON131958 (EXP-Sv.Ubq1:1:11, 서열 130) 및 pMON132974 (EXP-Sb.Ubq7:1:2, 서열 157)을 포함하는 형질전환체에 대해 가뭄 (drought) 및 한랭 스트레스 조건에 노출된 F1 식물에 대해 분석하였다. V3 뿌리 및 잎 조직을 한랭 및 가뭄 노출 후 샘플링하였다.
pMON132037 (EXP-SETit.Ubq1:1:10, 서열 119), pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, 서열 125), pMON131958 (EXP-Sv.Ubq1:1:11, 서열 130) 및 pMON132974 (EXP-Sb.Ubq7:1:2, 서열 157)로 형질전환된 F1 V3 식물에서 물 함량이 충분히 급수한 식물의 원래 물 함량의 적어도 50% 감소하도록 4일 동안 급수하지 않음으로써 가뭄 스트레스를 유도하였다. 가뭄 프로토콜은 본질적으로 다음 단계들로 이루어졌다. V3 기 식물에 물을 고갈시켰다. 옥수수 식물이 가뭄을 겪을 때, 잎의 형태는 통상의 건강하고 접히지 않은 외형에서 중앙맥 관다발에서 접힘을 보이고 잎 끝에서 줄기 쪽을 볼 때 V자형으로 보이는 잎으로 변할 것이다. 형태의 상기 변화는 대체로 급수 중단 약 2일 후에 일어나기 시작하고, 앞선 실험에서 급수 중단 전 화분의 중량 및 잎 말림 형태가 급수하지 않은 식물에서 관찰될 때 화분의 중량에 의해 측정할 때 약 50%의 물 손실과 연관된 것으로 보였다. 식물은 잎이 잎의 내측 말림 (V자형)에 의해 입증되는 시듦을 보일 때 가뭄 조건 하에 있는 것으로 간주하였다. 상기 수준의 스트레스는 치사-미만 (sub-lethal) 스트레스의 형태인 것으로 간주된다. 일단 각각의 식물이 상기 규정된 바와 같이 가뭄 유도를 보이면, 뿌리 및 잎 샘플을 모두 얻기 위해 식물을 파괴하였다.
가뭄에 추가로, pMON132037 (EXP-SETit.Ubq1:1:10, 서열 119), pMON131957 (EXP-SETit.Ubq1:1:11, 서열 125), pMON131958 (EXP-Sv.Ubq1:1:11, 서열 130) 및 pMON132974 (EXP-Sb.Ubq7:1:2, 서열 157)로 형질전환된 F1 V3 기 식물을 또한 조절 요소가 GUS의 한랭-유도된 발현을 나타내는지 결정하기 위해 한랭의 조건에 노출시켰다. 전체 식물을 V3 기에서 한랭 스트레스 하에 GUS 발현의 유도에 대해 검정하였다. V3 기 옥수수 식물을 성장 챔버에서 24시간 동안 12℃의 온도에 노출시켰다. 성장 챔버에서 식물을 10시간의 백색광 및 14시간의 어둠의 광 주기로 800 마이크로몰/m2/초의 백색광 영향 하에 성장시켰다. 한랭 노출 후에, 정량적 GUS 발현을 위해 잎 및 뿌리 조직을 샘플링하였다.
GUS 발현을 상기 설명된 바와 같이 측정하였다. 각각의 조직 샘플에 대해 결정된 평균 F1 GUS 발현을 아래 표 42 및 43에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00052
Figure 112018103689224-pat00053
F1 옥수수 식물에서, 샘플링된 다양한 조직에서 GUS 발현 수준은 유비퀴틴 EXP 서열 사이에서 상이하였다. 모든 EXP 서열은 안정하게 형질전환된 F1 옥수수 식물에서 GUS 트랜스진 발현을 유도하는 능력을 나타냈지만, 각각의 EXP 서열은 다른 것들에 비해 독특한 발현 패턴을 보였다. 예를 들어, R1 뿌리 발현은 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8)보다 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)에 대해 약 2배이었다. 38 DAP에서 발생하는 종자 배에서 GUS 발현은 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8)보다 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)에 대해 거의 3배 더 높았다. 이와 반대로, V3 및 V8 기에서 잎 및 뿌리 발현은 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8)에 비해 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)에 대해 대략 동일하였다.
흡수한 종자 (배 및 배젖 조직)에서 F1 GUS 발현은 EXP-SETit.Ubq1:1:10 (서열 번호 119), EXP-SETit.Ubq1:1:11 (서열 번호 125) 및 EXP-Sv.Ubq1:1:11 (서열 번호 130)로 형질전환된 식물에서보다 EXP-Sb.Ubq7:1:2 (서열 번호 157)로 형질전환된 식물에서 훨씬 더 높았다. 가뭄은 EXP-SETit.Ubq1:1:10 (서열 번호 119), EXP-SETit.Ubq1:1:11 (서열 번호 125), EXP-Sv.Ubq1:1:11 (서열 번호 130) 및 EXP-Sb.Ubq7:1:2 (서열 번호 157)로 형질전환된 식물에서 V3 뿌리 발현의 증가를 일으켰지만, EXP-SETit.Ubq1:1:11 (서열 번호 125), EXP-Sv.Ubq1:1:11 (서열 번호 130) 및 EXP-Sb.Ubq7:1:2 (서열 번호 157)로 형질전환된 식물에서 잎 발현만을 증가시켰다. 가뭄에 의해 향상된 V3 발현은 EXP-SETit.Ubq1:1:11 (서열 번호 125)를 사용할 때 가장 컸다. 화분 발현은 또한 EXP-SETit.Ubq1:1:10 (서열 번호 119), EXP-SETit.Ubq1:1:11 (서열 번호 125) 및 EXP-Sv.Ubq1:1:11 (서열 번호 130)로 형질전환된 식물보다 EXP-Sb.Ubq7:1:2 (서열 번호 157)로 형질전환된 식물에서 훨씬 더 컸다. R1 마디사이에서 발현은 EXP-SETit.Ubq1:1:10 (서열 번호 119) 및 EXP-Sv.Ubq1:1:11 (서열 번호 130)에서 가장 크고, EXP-SETit.Ubq1:1:11 (서열 번호 125)로 형질전환된 식물에서 가장 작았다.
각각의 EXP 서열은 안정하게 형질전환된 옥수수 식물에서 트랜스진 발현을 유도하는 능력을 나타냈다. 그러나, 각각의 EXP 서열은 독특한 각각의 조직에 대한 발현 패턴을 가졌고, 목적하는 결과를 달성하기 위해 필요한 조직 발현 전략에 따라 특이적 트랜스진의 발현을 가장 잘 제공할 EXP 서열을 선택하는 기회를 제공한다. 본 실시예는 상동성 유전자로부터 단리된 EXP 서열이 형질전환된 식물에서 반드시 동등하게 거동하지는 않고, 발현은 각각의 EXP 서열에 대한 특성의 실험에 의한 조사를 통해서만 결정될 수 있고 그로부터 프로모터가 유래하는 유전자 상동성에 기반하여 예측될 수 없음을 입증한다.
실시예 13: 트랜스제닉 옥수수에서 CP4를 유도하는 조절 요소의 분석.
옥수수 식물을 CP4 트랜스진의 발현을 유도하는 EXP 서열을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시키고, 생성되는 식물을 CP4 단백질 발현에 대해 분석하였다.
EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (서열 번호 133) 및 EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141)을 식물 이원성 형질전환 플라스미드 구축물 내로 클로닝하였다. 생성되는 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스로부터 우측 경계 영역; T-AGRtu.nos-1:1:13 (서열 번호 127) 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된 색소체 표적화된 글리포세이트 내성 EPSPS 코딩 서열 (CP4, US RE39247)의 5'에 작동가능하게 연결된 유비퀴틴 EXP 서열; 및 에이. 투메파시엔스로부터 좌측 경계 영역을 함유하였다. 아래 표 44는 옥수수를 형질전환시키기 위해 사용된 플라스미드 구축물 및 상응하는 EXP 서열을 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00054
생성되는 플라스미드를 사용하여 옥수수 식물을 형질전환시켰다. 형질전환된 식물을 삽입된 T-DNA의 1 또는 2개의 카피에 대해 선택하고, 온실에서 성장시켰다. 선택된 조직은 R0 형질전환된 식물로부터 발달의 특이적 기에서 샘플링하고, CP4 ELISA 검정을 이용하여 이들 조직에서 CP4 단백질 수준을 측정하였다. 각각의 형질전환에 대해 관찰된 평균 CP4 발현을 아래 표 45 및 46과 도 7의 그래프에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00055
Figure 112018103689224-pat00056
표 45 및 46에서 알 수 있는 바와 같이, 각각의 EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (서열 번호 133) 및 EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141)은 R0 형질전환된 식물로부터 샘플링된 모든 조직에서 CP4 발현을 유도할 수 있었다. CP4를 유도하는 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98)보다 CP4를 유도하는 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8) 및 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)를 포함하는 형질전환체의 뿌리 및 잎에서 CP4의 보다 높은 발현은 이들 형질전환체 집단에 대해 관찰할 때 글리포세이트 도포에 대한 영양 (vegetative) 내성의 수준에 관련될 수 있다 (아래 실시예 14 참조).
각각의 EXP 서열은 샘플링된 각각의 조직에 대한 발현 수준에 관하여 독특한 발현 패턴을 보였다. 예를 들어, 잎, 뿌리 및 수염에서 CP4 발현은 EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8) 및 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)에 대해 유사한 반면, EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8)을 사용한 견사에서 발현은 ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 21)에 의해 유도된 발현의 절반이었다. 이것은 구성적 발현이 요구되지만 견사 조직에서 더 적은 발현이 바람직할 것인 트랜스진의 발현을 위해 유리할 것이다. EXP 서열은 R0 형질전환된 옥수수 식물에서 CP4 구성적 발현의 독특한 패턴을 나타낸다.
R0 형질전환된 옥수수 식물을 비-트랜스제닉 LH244 품종과 교배하여 F1 종자를 생산하였다. 생성되는 F1 세대 종자를 트랜스진 카세트의 분리에 대해 분석하였고, CP4 발현의 분석을 위해 CP4 카세트에 대해 이형접합성인 식물을 선택하였다. 종자를 온실에서 성장시키고, 2군의 식물을 생산하였고, 여기서, 하나의 군에는 글리포세이트를 분무한 반면, 다른 군에는 분무하지 않고 두었다. 선택된 조직에서 CP4의 발현을 표준 ELISA 기반 검정을 이용하여 분석하였다. 평균 CP4 발현을 아래 표 47 및 48에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00057
상기 표 47에서 알 수 있는 바와 같이, 잎 및 뿌리에서 CP4 발현은 pMON129221 (EXP-C1.Ubq1:1:10, 서열 98)로 형질전환된 것보다 pMON141619 (EXP-ANDge.Ubq1:1:8, 서열 5) 및 pMON142862 (EXP-ERIra.Ubq1:1:8, 서열 27)로 형질전환된 F1 형질전환체에서 더 높았다. 꽃밥 조직에서 발현은 3개의 모든 EXP 서열에 대해 유사한 반면, 견사에서 발현은 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)을 사용할 때 최고였다. 발생하는 배 (21 DAP)에서 발현은 CP4를 유도하는 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27) 및 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98)을 포함하는 형질전환체에서 최고였다. 발생하는 배젖에서 발현은 CP4를 유도하는 EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98)을 포함하는 형질전환체에서 더 높았다.
Figure 112018103689224-pat00058
상기 표 47-48에서 알 수 있는 바와 같이, CP4 발현은 pMON141619 (EXP-ANDge.Ubq1:1:8, 서열 8), pMON142862 (EXP-ERIra.Ubq1:1:8, 서열 27) 및 pMON129221 (EXP-C1.Ubq1:1:10, 서열 98)로 형질전환된 것보다 pMON129205 (EXP-Sv.Ubq1:1:9, 서열 133)로 형질전환된 F1 형질전환체의 모든 조직에서 더 낮았다.
검정된 각각의 EXP 서열에 의해 부여된 독특한 발현 패턴은 최적 성능 또는 유효성을 위한 트랜스진 발현에서 작은 조정을 이루도록 발현이 미세-조정될 수 있는 트랜스제닉 식물을 생산하는 기회를 제공한다. 추가로, 상이한 트랜스진 발현을 유도하는 이들 EXP 서열의 실험에 의한 시험은 하나의 특정 EXP 서열이 특이적 트랜스진 또는 트랜스진의 클래스의 발현을 위해 가장 적합한 반면, 또 다른 EXP 서열은 상이한 트랜스진 또는 트랜스진의 클래스에 대해 최상인 것으로 밝혀진 결과를 생성할 수 있다.
실시예 14: R 0 트랜스제닉 옥수수 식물에서 영양 글리포세이트 내성의 분석.
옥수수 식물을 CP4 트랜스진의 발현을 유도하는 EXP 서열을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시키고, 생성되는 식물을 글리포세이트 도포에 대한 영양 및 생식 내성에 대해 평가하였다.
CP4를 유도하는 EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27), EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98), EXP-Sv.Ubq1:1:9 (서열 번호 133) 및 EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141)을 각각 포함하는, pMON141619, pMON142862, pMON129221, pMON129205 및 pMON129212로 형질전환된 상기 실시예 13에 기재된 F1 형질전환된 옥수수 식물을 글리포세이트를 분무할 때 영양 및 생식 내성 모두에 대해 평가하였다. 각각의 이벤트 (event)에 대한 10주의 F1 식물을 2개의 군으로 나누었다: 제1군은 발달의 V4 및 V8 기의 글리포세이트를 분무한 5주의 식물로 이루어지고; 제2군은 분무하지 않고 둔 5주의 식물로 이루어졌다 (즉, 대조군). 글리포세이트를 1.5 a.e./acre의 도포율 (a.e. 산 당량)로 라운드업 웨더맥스(Roundup WeatherMax)®를 사용하는 전면 엽면 (broadcast foliar) 분무 도포에 의해 도포하였다. 7 내지 10일 후에, 각각의 식물의 잎을 손상에 대해 평가하였다. 영양 내성 (표 49에서 Veg Tol)은 각각의 이벤트에 대해 분무하지 않은 식물 및 분무한 식물을 비교하여 평가하였고, 영양 내성에 대한 최종 등급결정을 제공하기 위해 손상 등급결정 척도를 사용하였다 (T = 내성, NT = 내성이 아님). 추가로, 각각의 이벤트에서 모든 식물에 대해 종자 세트를 검정하였다. 대조 식물 및 분무한 식물 사이의 종자 세트 측정치를 비교하고, 생식 내성의 배정 (표 49에서 Repro Tol)을 대조군에 비해 분무한 식물의 % 종자 세트에 기반하여 각각의 이벤트에 대해 제시하였다 (T = 내성, NT = 내성이 아님). 아래 표 49는 V4 및 V8 기에 분무한 각각의 이벤트에 대한 영양 및 생식 내성 등급결정을 보여준다. 문자 "T"는 내성을 나타내고, "NT"는 내성이 아님을 나타낸다.
Figure 112018103689224-pat00059
상기 표 49로부터, EXP 서열 EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8), EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27) 및 EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141)을 포함하는 CP4 트랜스진 카세트를 포함하는 검정된 모든 형질전환된 이벤트는 점수 10을 초과하지 않는 손상 등급결정에 기반하여 충분한 영양 내성을 나타냈다. EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (서열 번호 8)을 포함한 9개 중 4개의 이벤트, 및 EXP-ERIra.Ubq1:1:8 (서열 번호 27)을 포함한 9개 중 6개의 이벤트는 글리포세이트 도포에 대해 영양 및 생식 내성이었다. 이와 반대로, EXP-C1.Ubq1:1:10 (서열 번호 98)을 포함하는 이벤트는 영양 내성이거나 생식 내성이지만, 둘 모두 내성은 아니었다. EXP-Sv.Ubq1:1:9 (서열 번호 133)을 포함한 단지 1개의 이벤트가 영양 내성을 나타냈고, 시험한 이벤트 중 어느 것도 생식 내성은 아니었다. EXP-Zm.UbqM1:1:7 (서열 번호 141)을 포함한 모든 이벤트는 영양 내성을 나타냈지만, 생식 내성의 평가는 여전히 진행중이다.
실시예 15: 상이한 3' 단부 인트론/엑손 스플라이스 연결부 서열을 사용한 발현의 분석.
옥수수 및 밀 잎 원형질체 세포를 발현이 서열의 근소한 변화에 의해 영향을 받는지 살펴보기 위해 동일한 프로모터 및 리더를 포함하지만 인트론/엑손 스플라이스 연결부 서열 5'-AG-3' 다음에 상이한 3' 단부 뉴클레오티드를 갖는, GUS 발현을 유도하는 EXP 서열을 포함하는 식물 발현 구축물을 사용하여 형질전환시켰다. 발현을 또한 2개의 구성적 대조 플라스미드에 비교하였다.
GUS 발현 카세트를 포함하는 식물 발현 구축물을 제작하였다. 생성되는 벡터는 T-AGRtu.nos-1:1:13 (서열 번호 127) 3' UTR의 5'에 작동가능하게 연결된 GUS 코딩 서열의 5'에 작동가능하게 연결된, 각각 인트론/엑손 스플라이스 연결부 5'-AG-3' 서열 바로 다음의 바로 3' 단부에서 상이한 뉴클레오티드를 포함하는 아래 표 50에 제시된 인트론 요소의 5'에 작동가능하게 연결된 리더 서열 L-C1.Ubq1-1:1:1 (서열 번호 81)의 5'에 작동가능하게 연결된 코익스 라크리마-조비 유비퀴틴 프로모터 P-C1.Ubq1-1:1:1 (서열 번호 80)을 포함하였다. 아래 표 50은 식물 발현 구축물 및 상응하는 3' 단부 서열을 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00060
옥수수 및 밀 원형질체를 앞서 설명된 바와 같이 형질전환시키고, GUS 및 루시퍼라제 발현에 대해 검정하였다. 아래 표 51은 옥수수 및 밀 원형질체 발현 모두에 대한 평균 GUS 및 RLuc 값을 보여준다.
Figure 112018103689224-pat00061
상기 표 46의 각각의 코익스 라크리마-조비 유비퀴틴 EXP 서열에 대한 GUS/RLuc 값을 2개의 구성적 대조군 EXP-Os.Act1:1:9 (서열 번호 179) 및 EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1:1:1 (서열 번호 163)에 비해 발현을 정규화하기 위해 사용하였고, 아래 표 52에 제시한다.
Figure 112018103689224-pat00062
상기 표 52에 제시된 바와 같이, 각각의 코익스 라크리마-조비 유비퀴틴 EXP 서열은 옥수수 및 밀 모두에서 구성적 대조군보다 더 큰 발현을 제공하였다. 옥수수 원형질체에서 발현은 모든 코익스 유비퀴틴 EXP 서열과 비교적 유사하였다. 밀에서 발현은 약간 더 가변적이었다. 인트론/엑손 스플라이스 연결부 서열 5'-AG-3' 다음의 상이한 3' 단부 뉴클레오티드의 사용은 EXP-C1.Ubq1:1:20 (서열 번호 102)에 의해 유도된 GUS를 제외하고는 GUS의 발현에 극적으로 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다. EXP-C1.Ubq1:1:20은 인트론/엑손 스플라이스 연결부 5'-AG-3' 서열 다음에 3' 단부 뉴클레오티드 서열, 5'-GAC-3'을 포함하고, 발현을 다른 코익스 유비퀴틴 EXP 서열에 비해 약간 하락시켰다. 생성되는 스플라이싱된 메신저 RNA의 평가는 GUS 발현을 유도하기 위해 EXP-C1.Ubq1:1:20 (서열 번호 102)을 사용하여 발현된 mRNA의 약 10%가 부적절하게 스플라이싱되었음을 보여주었다. 다른 코익스 유비퀴틴 EXP 서열을 사용하여 GUS 발현으로부터 생성되는 mRNA는 적절하게 프로세싱되는 것으로 보였다. 본 실험은 단지 인트론 요소 I-C1.Ubq1-1:1:9 (서열 번호 103)와 회합되어 발견되는 3' 단부 서열 5'-GAC-3'을 제외한, 실시예 1의 표 2에 제시된 임의의 인트론 변이체에 대한 임의의 3' 단부 뉴클레오티드가 프로세싱 및 활성의 유의한 손실 없이 트랜스진 발현 카세트에서 사용하기 위해 적합할 것이라는 증거를 제공한다.
실시예 16: 조절 요소로부터 유래된 인핸서.
인핸서는 본원에 제공되는 프로모터 요소, 예컨대 서열 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 및 135로서 제시된 것으로부터 유래된다. 인핸서 요소는 프로모터 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결될 때, 또는 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 인핸서 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결될 때, 특이적 세포 종류 또는 식물 기관 내에서 또는 발달 또는 일주기성 리듬의 특정 시점에서 트랜스진의 발현을 향상 또는 조정하거나 트랜스진의 발현을 제공할 수 있는 하나 이상의 시스 조절 요소로 구성될 수 있다. 인핸서는 그의 단편을 비롯한 상기 설명된 바와 같이 본원에 제공된 프로모터로부터 전사가 개시되도록 허용하는 프로모터로부터 TATA 박스 또는 기능상 유사한 요소 및 임의의 하류 서열을 제거함으로써 제조하였고, 여기서 TATA 박스 또는 기능상 유사한 요소 및 TATA 박스의 하류의 서열이 제거된다. 프로모터 요소로부터 유래된 인핸서를 입증하기 위해 프로모터 요소 P-C1.Ubq1-1:1:1로부터 유래된 인핸서 요소 E-C1.Ubq1-1:1:1 (서열 번호 89)을 본원에서 제공한다.
인핸서 요소는 본원에 제공된 프로모터 요소로부터 유래되고, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 프로모터 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결되거나 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 인핸서 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결되도록 클로닝될 수 있다. 별법으로, 인핸서 요소를 당업계에 공지된 방법을 이용하여 프로모터 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결된, 또는 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 인핸서 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결된 인핸서 요소의 하나 이상의 카피에 작동가능하게 연결되도록 클로닝하였다. 인핸서 요소는 또한 상이한 속의 유기체로부터 유래된 프로모터 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결되거나, 또는 동일한 또는 상이한 유기체로부터 유래된 프로모터에 작동가능하게 연결된 다른 속의 유기체 또는 동일한 속의 유기체로부터 유래된 추가의 인핸서 요소의 5' 또는 3'에 작동가능하게 연결되어 키메릭 조절 요소를 생성하도록 클로닝될 수 있다. GUS 발현 식물 형질전환 벡터를 선행 실시예에 설명된 구축물과 유사한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제작하였고, 여기서 생성되는 식물 발현 벡터는 에이. 투메파시엔스로부터 우측 경계 영역; 에이. 투메파시엔스로부터 노팔린 합성효소 3' UTR (T-AGRtu.nos-1:1:13, 서열 161) 또는 벼 액체 전달 단백질 유전자 (T-Os.LTP-1:1:1, 서열 175)로부터 3' UTR에 작동가능하게 연결된, 프로세싱가능한 인트론 (GUS-2, 서열 160)을 갖거나 인트론을 갖지 않는 (GUS-1, 서열 159) β-글루쿠로니다제 (GUS)에 대한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된, 제트. 메이즈의 HSP70 열 충격 단백질 (I-Zm.DnaK-1:1:1, 서열 144)로부터 유래된 인트론 또는 본원에 제시된 임의의 인트론 또는 임의의 다른 인트론에 작동가능하게 연결된, 조절 또는 키메릭 조절 요소를 포함하는 조절 또는 키메릭 조절 요소를 시험하기 위한 제1 트랜스진 카세트; 제초제 글리포세이트 (벼 액틴 1 프로모터에 의해 유도된), 또는 별법으로 항생제 카나마이신 (벼 액틴 1 프로모터에 의해 유도된)에 대한 내성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선택을 위해 사용되는 제2 트랜스진 선택 카세트, 및 에이. 투메파시엔스로부터 좌측 경계 영역을 함유한다. 생성되는 플라스미드는 상기 설명된 방법에 의해 또는 당업계에 공지된 다른 아그로박테리움-매개 또는 입자 충격 (bombardment) 방법에 의해 옥수수 식물 또는 다른 속의 식물을 형질전환시키기 위해 사용된다. 별법으로, 옥수수 또는 다른 속의 식물로부터 유래된 원형질체 세포는 일시적 검정을 수행하기 위해 당업계에 공지된 방법을 이용하여 형질전환된다.
하나 이상의 인핸서를 포함하는 조절 요소에 의해 유도된 GUS 발현을, 트랜스진의 발현에 대한 인핸서 요소의 영향을 결정하기 위해 안정한 또는 일시적 식물 검정에서 평가하였다. 하나 이상의 인핸서 요소에 대한 변형 또는 하나 이상의 인핸서 요소의 복제를 경험적 실험에 기반하여 수행하고, 생성되는 유전자 발현 조절을 각각의 조절 요소 조성물을 사용하여 관찰하였다. 생성되는 조절 또는 키메릭 조절 요소 내에서 하나 이상의 인핸서의 상대적인 위치를 변경시키면 조절 또는 키메릭 조절 요소의 전사 활성 또는 특이성에 영향을 미칠 수 있고, 옥수수 식물 또는 다른 속의 식물 내에서 목적하는 트랜스진 발현 프로파일을 위한 최상의 인핸서를 확인하기 위해 실험에 의해 결정하였다.
실시예 17: 식물 유래된 원형질체를 사용하는 GUS 활성의 인트론 향상의 분석.
인트론은 트랜스진의 최적 발현을 위한 벡터 T-DNA 요소 배열 내에서 인트론 및 입체형태를 실험에 의해 선택하기 위해 인트론이 없는 발현 벡터 대조군과의 비교 및 실험에 기반하여 선택하였다. 예를 들어, 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 CP4와 같은 제초제 내성 유전자의 발현에서, 제초제를 도포할 때 수확량의 손실을 방지하기 위해 생식 조직뿐만 아니라 영양 조직 내에서 트랜스진 발현을 갖는 것이 바람직하다. 이 경우에, 인트론은 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결될 때, 특히 트랜스제닉 식물의 생식 세포 및 조직 내에서 제초제 내성 부여 트랜스진의 발현을 향상시키는, 및 따라서 제초제를 분무할 때 트랜스제닉 식물에 영양 및 생식 내성을 모두 제공하는 그의 능력에 따라 선택될 것이다. 대부분의 유비퀴틴 유전자 내에서, 5' UTR은 그 내부에 인트론 서열이 묻혀 있는 리더를 포함한다. 따라서, 그러한 유전자로부터 유래된 발현 요소는 프로모터, 리더, 및 인트론을 포함하는 전체 5' UTR을 사용하여 검정하였다. 상이한 발현 프로파일을 달성하기 위해 또는 트랜스진 발현의 수준을 조정하기 위해, 그러한 발현 요소로부터의 인트론을 제거하거나 이종성 인트론으로 치환시킬 수 있다.
서열 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 및 182로서 본원에 제시된 인트론은 발현된 서열 태그 클러스터에 비교하여 게놈 DNA 콘티그 (contig) 또는 게놈 DNA 내에서 엑손 및 인트론 서열을 확인하기 위해 cDNA 콘티그를 사용하여 확인되었다. 추가로, 5' UTR 또는 리더 서열은 또한 유전자 서열이 하나 이상의 인트론이 개재된 리더 서열을 코딩하는 조건 하에 하나 이상의 인트론의 인트론/엑손 스플라이스 연결부를 규정하기 위해 사용되었다. 인트론을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 예를 들어 도 1에 제시된 2개의 트랜스진 카세트에 됴시된 바와 같이, 전사 조절 요소 및 리더 단편의 3'에 작동가능하게 연결되고 제2 리더 단편 또는 코딩 서열의 5'에 작동가능하게 연결되도록 식물 형질전환 벡터 내로 클로닝하였다.
따라서, 예를 들어, 제1의 가능한 트랜스진 카세트 (도 8에서 트랜스진 카세트 입체형태 1)는 3' UTR 요소 [E]에 작동가능하게 연결된 코딩 영역 [D]에 작동가능하게 연결된 시험 인트론 요소 [C]의 5'에 작동가능하게 연결된 리더 요소 [B]의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터 또는 키메릭 프로모터 요소 [A]를 포함한다. 별법으로, 제2의 가능한 트랜스진 카세트 (도 8에서 트랜스진 카세트 입체형태 2)는 3' UTR 요소 [K]에 작동가능하게 연결된 코딩 영역 [J]에 작동가능하게 연결된 제2 리더 요소 또는 제1 리더 요소 제2 단편 [I]의 5'에 작동가능하게 연결된 시험 인트론 요소 [H]의 5'에 작동가능하게 연결된 제1 리더 요소 또는 제1 리더 요소 단편 [G]의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터 또는 키메릭 프로모터 요소 [F]를 포함한다. 추가로, 제3의 가능한 트랜스진 카세트 (도 8에서 트랜스진 카세트 입체형태 3)는 3' UTR 요소 [Q]에 작동가능하게 연결된 코딩 서열 요소의 제2 단편 [P]의 5'에 작동가능하게 연결된 인트론 요소 [O] 요소의 5'에 작동가능하게 연결된 코딩 서열 요소의 제1 단편 [N]의 5'에 작동가능하게 연결된 리더 요소 [M]의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터 또는 키메릭 프로모터 요소 [L]을 포함한다. 트랜스진 카세트 입체형태 3은 코딩 서열의 제1 및 제2 단편 사이의 프레임 이동 없이 완전한 개방 판독 프레임을 생산하는 방식으로 인트론의 스플라이싱을 허용하도록 설계된다.
서열 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 및 182로서 제시된 인트론의 5' 단부 상의 처음 6개의 뉴클레오티드 및 3' 단부 상의 마지막 6 뉴클레오티드는 각각 인트론/엑손 스플라이스 연결부 전후의 뉴클레오티드를 나타낸다. 이들 짧은 6 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 서열 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 및 182의 5' 단부로부터 제1 및 제2 뉴클레오티드 (GT) 및 3' 단부로부터 제4 및 제5 뉴클레오티드 (AG)가 보존되어, 인트론의 인트론/엑손 스플라이스 연결부를 보존하는 한, 식물 형질전환 벡터 내로 인트론의 클로닝을 촉진하기 위해 첨부된 추가의 서열 (즉, 천연 또는 인공)을 가짐으로써 변형될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이 메신저 RNA의 최종 전사체로의 프로세싱 동안 원치 않는 개시 코돈이 형성될 가능성을 제거하기 위해, 스플라이스 부위의 5' 단부 (GT) 바로 앞의 뉴클레오티드 서열 AT 또는 뉴클레오티드 A, 및 스플라이스 부위의 3' 단부 (AG)의 바로 다음의 각각 뉴클레오티드 G 또는 뉴클레오티드 서열 TG의 사용을 피하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 인트론의 5' 또는 3' 단부 스플라이스 연결부 부위 주위의 서열은 변형될 수 있다.
인트론을 일시적 검정 또는 안정한 식물 검정에서 발현을 향상시키는 능력을 통한 향상 효과에 대해 검정한다. 인트론 향상의 일시적 검정을 위해, 기본 식물 벡터를 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제작하였다. 인트론을 에이. 투메파시엔스로부터 노팔린 합성효소 3' UTR (T-AGRtu.nos-1:1:13, 서열 161)에 작동가능하게 연결된 프로세싱가능한 인트론 (GUS-2, 서열 160)을 갖거나 인트론을 갖지 않는 (GUS-1, 서열 159) β-글루쿠로니다제 (GUS)에 대한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 시험 인트론 요소 (예를 들어, 서열 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 및 182 중 하나)의 5'에 작동가능하게 연결된 리더 요소, L-CaMV.35S-1:1:15 (서열 번호 177)의 5'에 작동가능하게 연결된 꽃양배추 모자이크 바이러스 프로모터 P-CaMV.35S-enh-1:1:9 (서열 번호 176)와 같은 구성적 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 기본 식물 벡터 내로 클로닝하였다. 옥수수 또는 다른 속의 식물 조직으로부터 유래된 원형질체 세포를 상기 실시예 2에서 앞서 설명된 바와 같이 기본 식물 벡터 및 루시퍼라제 대조군 벡터로 형질전환시키고, 활성에 대해 검정하였다. 발현을 향상시키는 인트론의 상대적인 능력을 비교하기 위해, GUS 값을 GUS 대 루시퍼라제 활성의 비로서 표현하고, 공지의 인트론 표준물에 작동가능하게 연결된 구성적 프로모터를 포함하는 구축물, 예컨대 제아 메이즈의 HSP70 열 충격 단백질로부터 유래된 인트론, I-Zm.DnaK-1:1:1 (서열 번호 178)뿐만 아니라 구성적 프로모터를 포함하지만 프로모터에 작동가능하게 연결된 인트론이 없는 구축물에 의해 부여된 수준과 비교하였다.
서열 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 및 182로서 제시된 인트론의 안정한 식물 검정을 위해, 선행 실시예에 설명된 구축물과 유사한 GUS 발현 식물 형질전환 벡터를 제작하고, 여기서 생성되는 식물 발현 벡터는 에이. 투메파시엔스로부터 우측 경계 영역; 에이. 투메파시엔스로부터 노팔린 합성효소 3' UTR (T-AGRtu.nos-1:1:13, 서열 161)에 작동가능하게 연결된 프로세싱가능한 인트론 (GUS-2, 서열 160)을 갖거나 인트론을 갖지 않는 (GUS-1, 서열 158) β-글루쿠로니다제 (GUS)에 대한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 제공되는 시험 인트론 요소의 5'에 작동가능하게 연결된 리더 요소, L-CaMV.35S-1:1:15 (서열 번호 177)의 5'에 작동가능하게 연결된 꽃양배추 모자이크 바이러스 프로모터 P-CaMV.35S-enh-1:1:9 (서열 번호 176)와 같은 구성적 프로모터를 포함하는 인트론을 시험하기 위한 제1 트랜스진 카세트; 글리포세이트 (벼 액틴 1 프로모터에 의해 유도된), 또는 별법으로, 항생제 카나마이신 (벼 액틴 1 프로모터에 의해 유도된)에 대한 내성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선택을 위해 사용된 제2 트랜스진 선택 카세트, 및 에이. 투메파시엔스로부터 좌측 경계 영역을 함유한다. 생성되는 플라스미드는 상기 설명된 방법에 의해 또는 당업계에 공지된 아그로박테리움-매개된 방법에 의해 옥수수 식물 또는 다른 속의 식물을 형질전환시키기 위해 사용된다. 단일 카피 또는 낮은 카피수 형질전환체는 시험 인트론이 인트론 매개된 향상 효과를 제공하는지 결정하기 위해 시험 벡터와 동일한 식물 형질전환 벡터를 사용하지만 시험 인트론이 없이 형질전환된, 단일 카피 또는 낮은 카피수 형질전환된 식물에 비교하기 위해 선택된다.
서열 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 및 182로서 제시된 임의의 인트론은 인트론 서열 내에서 단편을 결실시키는 것과 같은 많은 방식으로 변형될 수 있고, 이것은 발현을 향상시킬 수 있는, 인트론 내의 단편의 발현 또는 복제를 감소시킬 수 있다. 추가로, 특정 세포 종류 또는 조직 및 기관에 대해 발현의 특이성에 영향을 미칠 수 있는 인트론 내의 서열은 트랜스진의 발현 및 발현의 패턴에 영향을 미치도록 복제되거나 변경되거나 결실될 수 있다. 추가로, 본원에 제공되는 인트론은 임의의 잠재적인 개시 코돈 (ATG)을 제거하도록 변형될 수 있고, 이것은 비의도적인 전사체가 부적절하게 스플라이싱된 인트론으로부터 상이한, 보다 긴 또는 말단절단된 단백질로서 발현되도록 할 수 있다. 일단 인트론이 실험에 의해 시험되거나 실험에 기반하여 변경된 후, 인트론은 인트론이 트랜스진의 향상을 제공하는 한 임의의 속의 단자엽식물 또는 쌍자엽 식물일 수 있는 안정하게 형질전환된 식물 내에서 트랜스진의 발현을 향상시키기 위해 사용된다. 인트론은 또한 인트론이 그에 작동가능하게 연결된 트랜스진의 발현의 향상 또는 감쇠 또는 특이성을 제공하는 한 다른 유기체, 예컨대 조류, 진균 또는 동물 세포에서 발현을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 원리를 예시하고 설명하였지만, 본 발명이 상기 원리를 벗어나지 않으면서 배열 및 상세한 내용에서 변형될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명자들은 특허청구범위의 취지와 범위 내에 있는 모든 변형을 특허청구한다. 본원에 인용한 모든 공개문 및 공개된 특허 문헌은 각각의 개별 공개문 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> FLASINSKI, STANISLAW <120> PLANT REGULATORY ELEMENTS AND USES THEREOF <130> MONS:282WO <140> Unknown <141> 2012-03-21 <150> 61467875 <151> 2011-03-25 <160> 183 <210> 1 <211> 3741 <212> DNA <213> Andropogon gerardii <400> 1 agcagactcg cattatcgat ggaggggtgg gtttagaacc ctgaaaactg gtactgtttc 60 gaactgaaaa acactgtagc acttttcgtt tgtttgtggt aaatattatc ttactatggt 120 ctaactaggc tcaaaagaat cgtctcgcaa tgtacatcta aattatgcaa ttagttattt 180 tgtttacctg catttcatac tccgagcatg cgtcttttgg tacatttaat gcttcgatgt 240 gatgggaatt ttaaaaattt tggagaaaag ttggtttcta aacacccccg aggacgaaat 300 tggattcggt ctttgacgcg gatgcagcaa ctgcagtgcg caggatacca tcttagccgt 360 tgcgtcgaag ttcgctttgc taacgttttg agaaaattaa accagctttg accaacgtga 420 gacgagcgcc ttacgtggca gtgtaatgga accgggcacg gcaagtttga cgctgtagtg 480 ttagccggtc tcgttacgtt tggcacaact tagttgaatc cggcttccgg caaactatat 540 ggcaagttag acccaagtgt gagccggcca ccgcaagtta ttgggacatt atacgtagga 600 agcaagtgta taataagaat atgagataat gtaagcagct atatgaatca 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1500 tgtcaccgtc atgcttggat ccttttatgg taaagcttca ccttctataa tctaacaata 1560 gagaaatcag ggaaaaatca tgttttggtt gtttttattt ctaacctcca caataacttt 1620 ggtttaccat tttttgtttg attttagttt tagagaagcg tttataacag gacctaaaat 1680 cttttttcag tacacagtac aacgcagacg ctcatacacg cacgcacact cacctctatg 1740 aacacacgta agaaaaccct acaccttgag caccttcgaa ggactgagcc ggtaaatata 1800 gagattctcg aagtcactat tagcgcctcg ttgtcaacgg gaatgtcgct taccacttaa 1860 agcataacgc cgagaaatcc cgtaataaat ccagtaaaat acgagcaccc gtgccaagtt 1920 gaatatttga acccgagtgg gtagattcca ccgcaaagga cctaaccaga tcatttcgca 1980 aacaggaact aaaatcggta gagagcccag acaaaagcct ttcctaagag ccactccagt 2040 ggaagcccct actttaggta taaaatgcaa tactagtggg gctcctaaat aaacttctat 2100 ttttcatggc cttctaaaat tcactcccaa acccctagct atagaagtct cttatccatc 2160 ctctaaataa aaatgggagt ctattttatt tcaccagagt tgatcgtaaa tttagtctct 2220 caaattttat aagttgaggg tagaggatga ctggagttgc tctaaacgga cctatcttca 2280 agtgacctca gtgagcccgt ttaacggcgt cgacaagttt aatctaacgg acaccaacca 2340 gagaagagaa ccaccgccag cgccgagcca agcgacgttg acatcttggc gcggcacggc 2400 atctccctgg cgtctggccc cctctcgaga cttccgctcc acctcccacc ggtggcggtt 2460 tccaagtccg ttccgcctcc tctcacacgg cacgaaaccg tgacgggcac cggcagcacg 2520 gggggattcc tttcccaccg ctccttccct ttcccttcct ctcccgccgc tataaatagc 2580 cagccccatc cccagcttct ttccccaacc tcatcttctc tcgtgttgtt cggcacaacc 2640 cgatcgatcc ccaactccct cgtcgtctct cctcgcgagc ctcgtcgatc ccccgcttca 2700 aggtacggcg atcgattatc ttccctctct ctaccttctc tctcttatag ggcctgctag 2760 ctctgttcct gtttttccat ggctgcgagg tacaatagat cggcgatcca tggttagggc 2820 ctgctagttg tgttcctgtt tttccatggc tgcgaggcac aatagatctg atggcgttat 2880 gatggttaac ttgtcatact cttgcgatct atggtccctt taggagttta ggacatctat 2940 ttaatttcgg atagttcgag atctgtgatc catggttagt accctaggca gtggggttag 3000 atccgtgctg ttatggttcg tagatggatt ctgattgctc agtaactggg aatcctggga 3060 tggttctagc tggttcgcag ataagatcga tttcatgata tgctatatct tgtttggttg 3120 ccgtggttcc gttaaatctg tctgttatga tcttagtctt tgataaggtt cggtcgtgct 3180 agctacgtcc tgtgcagcac ttaattgtca ggtcataatt tttagcatgc ctttttttta 3240 ttggtttggt tttgtctgac tgggctgtag atagtttcaa tctttgtctg actgggctgt 3300 agatagtttc aatctacctg tcggtttatt ttattaaatt tggatctgta tgtgtgtcat 3360 atatcttcat cttttagata tatcgatagg tttatatgtt gctgtcggtt ttttactgtt 3420 cctttatgag atatattcat gcttagatac atgaaacaac gtgctgttac agtttaatag 3480 ttcttgttta tctaataaac aaataaggat aggtatatgc tgcagttagt tttactggta 3540 ctttttttga catgaaccta cggcttaata attagtcttc atcaaataaa aagcatattt 3600 tttaattatt tcgatatact tgaatgatgt catatgcagc atctgtgtga atttttggcc 3660 ctgtcttcat atgctgttta tttgtttggg actgtttctt tggttgataa ctcatcctgt 3720 tgtttggtga tccttttgca g 3741 <210> 2 <211> 2603 <212> DNA <213> Andropogon gerardii <400> 2 agcagactcg cattatcgat ggaggggtgg gtttagaacc ctgaaaactg gtactgtttc 60 gaactgaaaa acactgtagc acttttcgtt tgtttgtggt aaatattatc ttactatggt 120 ctaactaggc tcaaaagaat cgtctcgcaa tgtacatcta aattatgcaa ttagttattt 180 tgtttacctg catttcatac tccgagcatg cgtcttttgg tacatttaat gcttcgatgt 240 gatgggaatt ttaaaaattt tggagaaaag ttggtttcta aacacccccg aggacgaaat 300 tggattcggt ctttgacgcg gatgcagcaa ctgcagtgcg caggatacca tcttagccgt 360 tgcgtcgaag ttcgctttgc taacgttttg agaaaattaa accagctttg accaacgtga 420 gacgagcgcc ttacgtggca gtgtaatgga accgggcacg gcaagtttga cgctgtagtg 480 ttagccggtc tcgttacgtt tggcacaact tagttgaatc cggcttccgg caaactatat 540 ggcaagttag acccaagtgt gagccggcca ccgcaagtta ttgggacatt atacgtagga 600 agcaagtgta taataagaat atgagataat gtaagcagct atatgaatca tcacgtcata 660 tttatgttaa gatgaagagg atagaataaa cggtatgtaa atttatagcg agtgatagac 720 gggcacaagg cctcctagct atttccataa atcggatttt gtaagaacaa aaaagaggac 780 ttattataag agaatgtggt aagtaagtat actctctccg tttcaaatta taagttgttt 840 tgattttttt ggtacatcta ttttactatg cattagatat aataatgtgt ctagatacat 900 aacaaaatgg atgaatcaaa aaagtcaaag tgatttacaa tttggaacgg agagagtaag 960 ttcaagccgt caaggcactt ctatgcaacc acagtcaact tgaatgccgc ttgagtgcct 1020 tctcaagttt ttttttcttg caaaaatcat ttcttttttt taaaaaaagt ataatttgga 1080 tcgtgcaaat ttctctctag gtgtgtgtgt gactgtgtga gtaacaattt ctctagttgt 1140 gcgcgactgc tgcttacttt ggagattaca atatctttct aaaatgcttc gattacttat 1200 ttataaaccg tctctaaggc caattgctca agattcattc aacaattgaa acgtctcaca 1260 tgattaaatc atataaagtt tctaagtctt gtttgacaag atttttttag attttcatct 1320 aaattggatg aaactatcaa acactaattt taaaaaatat aagagaagct ccggagataa 1380 aaggtcgtct atgttattat aagagtaaag tcgtctattc tcttcgtccc aacatatata 1440 attctaagca tgaattgctt tctttttgga caaaaggagc atgccacaac acaagaatga 1500 tgtcaccgtc atgcttggat ccttttatgg taaagcttca ccttctataa tctaacaata 1560 gagaaatcag ggaaaaatca tgttttggtt gtttttattt ctaacctcca caataacttt 1620 ggtttaccat tttttgtttg attttagttt tagagaagcg tttataacag gacctaaaat 1680 cttttttcag tacacagtac aacgcagacg ctcatacacg cacgcacact cacctctatg 1740 aacacacgta agaaaaccct acaccttgag caccttcgaa ggactgagcc ggtaaatata 1800 gagattctcg aagtcactat tagcgcctcg ttgtcaacgg gaatgtcgct taccacttaa 1860 agcataacgc cgagaaatcc cgtaataaat ccagtaaaat acgagcaccc gtgccaagtt 1920 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Mexicana <400> 45 gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca 60 tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa 120 ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc 180 atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc 240 tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt tttttgcaaa tagcttcacc 300 tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt 360 tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa 420 ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa 480 gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc 540 ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa 600 ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg 660 ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca 720 tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc 780 ctctcacggc accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc 840 ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccttc tttccccaac ctcgtgttgt 900 tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt 960 caaggtacgc cgctcatcct cccccccccc tctctacctt ctctagatcg gcgttccggt 1020 ccatggttag ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg 1080 ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga 1140 ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg aatcctggga tggctctagc cgttccgcag 1200 acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc 1260 tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt 1320 cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagaa gaattctgtt 1380 tcaaactacc tggtggattt attaattttg gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat 1440 agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg 1500 cgggttttac tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt 1560 ctggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga atactgtttc aaactacctg 1620 gtgtatttat taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt 1680 aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg 1740 catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta 1800 ttataataaa caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg atgatggcat 1860 atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc cctgccttca tacgctattt atttgcttgg 1920 tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtga tacttctgca g 1971 <210> 46 <211> 887 <212> DNA <213> Zea mays subsp. Mexicana <400> 46 gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca 60 tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa 120 ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc 180 atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc 240 tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt tttttgcaaa tagcttcacc 300 tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt 360 tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa 420 ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa 480 gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc 540 ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa 600 ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg 660 ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca 720 tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc 780 ctctcacggc accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc 840 ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccttc tttcccc 887 <210> 47 <211> 77 <212> DNA <213> Zea mays subsp. Mexicana <400> 47 aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc 60 ggcacctccg cttcaag 77 <210> 48 <211> 1007 <212> DNA <213> Zea mays subsp. Mexicana <400> 48 gtacgccgct catcctcccc cccccctctc taccttctct agatcggcgt tccggtccat 60 ggttagggcc cggtagttct acttctgttc atgtttgtgt tagatccgtg tttgtgttag 120 atccgtgctg ctagcgttcg tacacggatg cgacctgtac gtcagacacg ttctgattgc 180 taacttgcca gtgtttctct ttggggaatc ctgggatggc tctagccgtt ccgcagacgg 240 gatcgatttc atgatttttt ttgtttcgtt gcatagggtt tggtttgccc ttttccttta 300 tttcaatata tgccgtgcac ttgtttgtcg ggtcatcttt tcatgctttt ttttgtcttg 360 gttgtgatga tgtggtctgg ttgggcggtc gttctagatc ggagaagaat tctgtttcaa 420 actacctggt ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg tgccatacat attcatagtt 480 acgaattgaa gatgatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg 540 ttttactgat gcatatacag agatgctttt tgttcgcttg gttgtgatga tgtggtctgg 600 ttgggcggtc gttcattcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgt 660 atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct tcatagttac gagtttaaga 720 tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata 780 tacatgatgg catatgcagc atctattcat atgctctaac cttgagtacc tatctattat 840 aataaacaag tatgttttat aattattttg atcttgatat acttggatga tggcatatgc 900 agcagctata tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg ctatttattt gcttggtact 960 gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt tggtgatact tctgcag 1007 <210> 49 <211> 2005 <212> DNA <213> Zea mays subsp. Mexicana <400> 49 gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta aagtataaaa aattaccaca 60 tatttttttg tcacacttat ttgaagtgta gtttatctat ctctatacat atatttaaac 120 ttcactctac aaataatata gtctataata ctaaaataat attagtgttt tagaggatca 180 tataaataaa ctgctagaca tggtctaaag gataattgaa tattttgaca atctacagtt 240 ttatcttttt agtgtgcatg tgatctctct gttttttttg caaatagctt gacctatata 300 atacttcatc cattttatta gtacatccat ttaggattta gggttgatgg tttctataga 360 ctaattttta gtacatccat tttattcttt ttagtctcta aattttttaa aactaaaact 420 ctattttagt tttttattta ataatttaga tataaaatga aataaaataa attgactaca 480 aataaaacaa atacccttta agaaataaaa aaactaagca aacatttttc ttgtttcgag 540 tagataatga caggctgttc aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 600 agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtag ctgcctctgg 660 acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 720 gcgtggcgga gcggcagacg tgaggcggca cggcaggcgg cctcttcctc ctctcacggc 780 accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 840 gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttcg ttcggagcgc 900 acacacacgc aaccagatct cccccaaatc cagccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 960 ccgctcatcc tccccccccc cctctctcta ccttctctag atcggcgatc cggtccatgg 1020 ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gagcaaacat gttcatgttc 1080 atgtttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag gatactgttt 1140 caagctacct ggtggattta ttaattttgt atctgtatgt gtgtgccata catcttcata 1200 gttacgagtt taagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc 1260 gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttttctcg cttggttgtg atgatatggt 1320 ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtggattt 1380 attaaaggat aaagggtcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgg 1440 atttattaaa ggatctgtat gtatgtgcct acatcttcat agttacgagt ttaagatgat 1500 ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat 1560 acagagatgc tttttttcgc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 1620 atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgt atctttatgt 1680 gtgtgccata catcttcata gttacgagtt taagatgatg gatggaaata ttgatctagg 1740 ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcggcat 1800 ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860 ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920 agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcc gatgctcacc 1980 ctgttgttgg gtgatacttc tgcag 2005 <210> 50 <211> 877 <212> DNA <213> Zea mays subsp. 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Mexicana <400> 53 gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta aagtataaaa aattaccaca 60 tatttttttg tcacacttat ttgaagtgta gtttatctat ctctatacat atatttaaac 120 ttcactctac aaataatata gtctataata ctaaaataat attagtgttt tagaggatca 180 tataaataaa ctgctagaca tggtctaaag gataattgaa tattttgaca atctacagtt 240 ttatcttttt agtgtgcatg tgatctctct gttttttttg caaatagctt gacctatata 300 atacttcatc cattttatta gtacatccat ttaggattta gggttgatgg tttctataga 360 ctaattttta gtacatccat tttattcttt ttagtctcta aattttttaa aactaaaact 420 ctattttagt tttttattta ataatttaga tataaaatga aataaaataa attgactaca 480 aataaaacaa atacccttta agaaataaaa aaactaagca aacatttttc ttgtttcgag 540 tagataatga caggctgttc aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 600 agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtag ctgcctctgg 660 acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 720 gcgtggcgga gcggcagacg tgaggcggca cggcaggcgg cctcttcctc ctctcacggc 780 accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 840 gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttcg ttcggagcgc 900 acacacacgc aaccagatct cccccaaatc cagccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 960 ccgctcatcc tccccccccc cctctctcta ccttctctag atcggcgatc cggtccatgg 1020 ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gagcaaacat gttcatgttc 1080 atgtttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag gatactgttt 1140 caagctacct ggtggattta ttaattttgt atctgtatgt gtgtgccata catcttcata 1200 gttacgagtt taagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc 1260 gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttttctcg cttggttgtg atgatatggt 1320 ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtggattt 1380 attaaaggat aaagggtcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgg 1440 atttattaaa ggatctgtat gtatgtgcct acatcttcat agttacgagt ttaagatgat 1500 ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat 1560 acagagatgc tttttttcgc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 1620 atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgt atctttatgt 1680 gtgtgccata catcttcata gttacgagtt taagatgatg gatggaaata ttgatctagg 1740 ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcggcat 1800 ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860 ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920 agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcc gatgctcacc 1980 ctgttgtttg gtgatacttc tgcag 2005 <210> 54 <211> 1050 <212> DNA <213> Zea mays subsp. 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ggcatctatt catatgctct aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt 900 tataattatt ttgatcttga tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat 960 tttttagccc tgccttcata cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt tgtccgatgc 1020 tcaccctgtt gtttggtgat acttctgcag 1050 <210> 55 <211> 1632 <212> DNA <213> Sorghum bicolor <400> 55 ccaagtccaa atgtcaattc ccttgaagat gatctatttt tatcttttgc attttgttat 60 ggaagtttgc aaatagcaac aaatgctaag tcaatttgcc aaagtctttg gagatgctct 120 tagtctataa ttgaacaata tttgtaaaat acaaaaaaaa atagtactat ttttatttta 180 aaaaattttt ggaagtaaac aaggccgagg atggggaaac ggaagtccaa cacgtcgttt 240 tctaagttgg gctcaaaagc ccatcacgga actgacctgc tatgggtcgg aggagagcgc 300 gtccagatgg ttccagaggc tggtggtggt gggccaaacg cggaactccg ccaccgccac 360 ggcctcgtgc gcaagcgcag cgcgttgccg tgagccgtga cgtaaccctc cgttgcccac 420 gataaaagct ccacccccga ccccggcccc ccgatttccc ctacggacca gtctcccccc 480 gatcgcaatc gcgaattcgt cgcaccatcg gcacgcagac gaacgaagca aggctctccc 540 catcggctcg tcaaggtatg cgttccctag atttgttccc ttcctctctc 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cttccccaat caccttgtgg tctctcgtgt cgcggttccc agggacgcct ccggctcgtc 780 gctcgacagc gatctccgcc ccagcaaggt atagattcag ttccttgctc cgatcccaat 840 ctggttgaga tgttgctccg atgcgacttg attatgtcat atatctgcgg tttgcaccga 900 tctgaagcct agggtttctc gagcgaccca gttgtttgca atttgcgatt tgctcgtttg 960 ttgcgcatcg tagtttatgt ttggagtaat cgaggatttg tatgcggcgt cggcgctacc 1020 tgcttaatca cgccatgtga cgcggttact tgcagaggct gggttagtgg gttctgttat 1080 gtcgtgatct aagaatctag attaggctca gtcgttcttg ctgtcgacta gtttgttttg 1140 atatccatgt agtacaagtt acttaaaatt taggtccaat atattttgca tgcttttggc 1200 ctgttattct tgccaacaag ttgtcctggt aaaaagtaga tgtgaaagtc acgtattggg 1260 acaaattgat ggttaagtgc tatagttcta tagttctgtg atacatctat ctgatttttt 1320 ttggtctatt ggtgcctaac ttatctgaaa atcatggaac atgaggctag tttgatcatg 1380 gtttagttca ttgtgattaa taatgtatga tttagtagct attttggtga tcgtgtcatt 1440 ttatttgtga atggaatcat tgtatgtaaa tgaagctagt tcaggggtta tgatgtagct 1500 ggctttgtat tctaaaggct gctattattc atccatcgat ttcacctata tgtaatccag 1560 agctttcgat 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tctaaaggct gctattattc atccatcgat ttcacctata tgtaatccag 1560 agctttcgat gtgaaatttg tctgatcctt cactaggaag gacagaacat tgttaatatt 1620 ttggcacatc tgtcttattc tcatcctttg tttgaacatg ttagcctgtt caaacagata 1680 ctgttgtaat gtcctagtta tataggtaca tatgtgttct ctattgagtt tatggacttt 1740 tgtgtgtgaa gttatatttc attttgctca aaactcatgt ttgcaagctt tctgacatta 1800 ttctattgtt ctgaaacagg gt 1822 <210> 137 <211> 1925 <212> DNA <213> Zea mays subsp. Mexicana <400> 137 gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca 60 tatttttttt tgtcacactt gtgtttgaag tgcagtttat ctatctctat acatatattt 120 aaacttcact atatgaataa tatagtctat agtattaaaa taatatcaat gttttagatg 180 attatataac tgaactgcta gacatggtct aaaggacaac cgagtatttt gacaacatga 240 ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg tgttcttttt acttttgcaa atagcttcac 300 ctatataata cttcatccat tttattagta catccattta ctaaattttt agtacatcta 360 ttttattcta ttttagcctc taaattaaga aaacttaaac tctattttag ttttttattt 420 aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa aaaataacta aatacctttt 480 aagaaataaa aaaactaagg aaccattttt cttgttccga gtagataatg acagcctgtt 540 caacgccgtc gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc 600 aagcgaagca gacggcacgg catctctgta gctgcctctg gacccctctc gagagttccg 660 ctccaccgtt ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac 720 gtgagccggc acggcaggcg gcctcctctc acggcaccgg cagctacggg ggattccttt 780 cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc ccgccgtaat aaatagaccc cctccacacc 840 ctctttcccc aacctcgtgt tcgttcggag cgcgcacaca cacaaccaga tctcccccaa 900 atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctca tcctcctccc ccccctctct 960 ctaccttctc tagatcggcg tttcggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt 1020 catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagatttc gtacacggat 1080 gcgacctgta catcagacat gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat 1140 cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgaatttt ttttgtttcg 1200 ttgcataggg tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc acttgtttgt 1260 cgggtcatct tttcatgttt tttttggctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt 1320 cgttctagat cggagtagaa tactgtttca aactacctgg tggatttatt aaaggatctg 1380 tatgtatgtg ccatacatct tcatagttac gagtttaaga tgatggatgg aaatatcgat 1440 ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttt 1500 ttcgcttggt tgtgatgatg tggtctggtc gggcggtcgt tctagatcgg agtagaatac 1560 tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtc atacatcttc 1620 atagttacga gtttaagatc gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt 1680 gggttttact gatgcatata catggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga 1740 gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt gatatacttg 1800 gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt 1860 tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg atacttctgc 1920 aggtc 1925 <210> 138 <211> 997 <212> DNA <213> Zea mays subsp. Mexicana <400> 138 gtacgccgct catcctcctc ccccccctct ctctaccttc tctagatcgg cgtttcggtc 60 catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt 120 tagatccgtg ctgctagatt tcgtacacgg atgcgacctg tacatcagac atgttctgat 180 tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga 240 cgggatcgat ttcatgaatt ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc 300 tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgt tttttttggc 360 ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag aatactgttt 420 caaactacct ggtggattta ttaaaggatc tgtatgtatg tgccatacat cttcatagtt 480 acgagtttaa gatgatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg 540 ttttactgat gcatatacag agatgctttt ttttcgcttg gttgtgatga tgtggtctgg 600 tcgggcggtc gttctagatc ggagtagaat actgtttcaa actacctggt ggatttatta 660 attttggatc tgtatgtgtg tcatacatct tcatagttac gagtttaaga tcgatggaaa 720 tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata tacatggcat 780 atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat 840 gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt 900 ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg 960 atgctcaccc tgttgtttgg tgatacttct gcaggtc 997 <210> 139 <211> 1925 <212> DNA <213> Zea mays subsp. 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Mexicana <400> 140 gtacgccgct catcctcctc ccccccctct ctctaccttc tctagatcgg cgtttcggtc 60 catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt 120 tagatccgtg ctgctagatt tcgtacacgg atgcgacctg tacatcagac atgttctgat 180 tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga 240 cgggatcgat ttcatgaatt ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc 300 tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgt tttttttggc 360 ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag aatactgttt 420 caaactacct ggtggattta ttaaaggatc tgtatgtatg tgccatacat cttcatagtt 480 acgagtttaa gatgatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg 540 ttttactgat gcatatacag agatgctttt ttttcgcttg gttgtgatga tgtggtctgg 600 tcgggcggtc gttctagatc ggagtagaat actgtttcaa actacctggt ggatttatta 660 attttggatc tgtatgtgtg tcatacatct tcatagttac gagtttaaga tcgatggaaa 720 tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata tacatggcat 780 atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat 840 gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt 900 ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg 960 atgctcaccc tgttgtttgg tgatacttct gcagggt 997 <210> 141 <211> 1974 <212> DNA <213> Zea mays subsp. Mexicana <400> 141 gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca 60 tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa 120 ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc 180 atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc 240 tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt tttttgcaaa tagcttcacc 300 tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt 360 tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa 420 ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa 480 gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc 540 ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa 600 ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg 660 ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca 720 tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc 780 ctctcacggc accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc 840 ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccttc tttccccaac ctcgtgttgt 900 tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt 960 caaggtacgc cgctcatcct cccccccccc tctctacctt ctctagatcg gcgttccggt 1020 ccatggttag ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg 1080 ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga 1140 ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg aatcctggga tggctctagc cgttccgcag 1200 acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc 1260 tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt 1320 cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagaa gaattctgtt 1380 tcaaactacc tggtggattt attaattttg gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat 1440 agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg 1500 cgggttttac tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt 1560 ctggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga atactgtttc aaactacctg 1620 gtgtatttat taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt 1680 aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg 1740 catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta 1800 ttataataaa caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg atgatggcat 1860 atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc cctgccttca tacgctattt atttgcttgg 1920 tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtga tacttctgca ggtc 1974 <210> 142 <211> 1010 <212> DNA <213> Zea mays subsp. Mexicana <400> 142 gtacgccgct catcctcccc cccccctctc taccttctct agatcggcgt tccggtccat 60 ggttagggcc cggtagttct acttctgttc atgtttgtgt tagatccgtg tttgtgttag 120 atccgtgctg ctagcgttcg tacacggatg cgacctgtac gtcagacacg ttctgattgc 180 taacttgcca gtgtttctct ttggggaatc ctgggatggc tctagccgtt ccgcagacgg 240 gatcgatttc atgatttttt ttgtttcgtt gcatagggtt tggtttgccc ttttccttta 300 tttcaatata tgccgtgcac ttgtttgtcg ggtcatcttt tcatgctttt ttttgtcttg 360 gttgtgatga tgtggtctgg ttgggcggtc gttctagatc ggagaagaat tctgtttcaa 420 actacctggt ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg tgccatacat attcatagtt 480 acgaattgaa gatgatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg 540 ttttactgat gcatatacag agatgctttt tgttcgcttg gttgtgatga tgtggtctgg 600 ttgggcggtc gttcattcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgt 660 atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct tcatagttac gagtttaaga 720 tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata 780 tacatgatgg catatgcagc atctattcat atgctctaac cttgagtacc tatctattat 840 aataaacaag tatgttttat aattattttg atcttgatat acttggatga tggcatatgc 900 agcagctata tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg ctatttattt gcttggtact 960 gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt tggtgatact tctgcaggtc 1010 <210> 143 <211> 1974 <212> DNA <213> Zea mays subsp. Mexicana <400> 143 gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca 60 tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa 120 ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc 180 atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc 240 tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt tttttgcaaa tagcttcacc 300 tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt 360 tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa 420 ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa 480 gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc 540 ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa 600 ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg 660 ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca 720 tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc 780 ctctcacggc accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc 840 ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccttc tttccccaac ctcgtgttgt 900 tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt 960 caaggtacgc cgctcatcct cccccccccc tctctacctt ctctagatcg gcgttccggt 1020 ccatggttag ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg 1080 ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga 1140 ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg aatcctggga tggctctagc cgttccgcag 1200 acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc 1260 tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt 1320 cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagaa gaattctgtt 1380 tcaaactacc tggtggattt attaattttg gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat 1440 agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg 1500 cgggttttac tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt 1560 ctggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga atactgtttc aaactacctg 1620 gtgtatttat taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt 1680 aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg 1740 catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta 1800 ttataataaa caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg atgatggcat 1860 atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc cctgccttca tacgctattt atttgcttgg 1920 tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtga tacttctgca gggt 1974 <210> 144 <211> 1010 <212> DNA <213> Zea mays subsp. 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Mexicana <400> 145 gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta aagtataaaa aattaccaca 60 tatttttttg tcacacttat ttgaagtgta gtttatctat ctctatacat atatttaaac 120 ttcactctac aaataatata gtctataata ctaaaataat attagtgttt tagaggatca 180 tataaataaa ctgctagaca tggtctaaag gataattgaa tattttgaca atctacagtt 240 ttatcttttt agtgtgcatg tgatctctct gttttttttg caaatagctt gacctatata 300 atacttcatc cattttatta gtacatccat ttaggattta gggttgatgg tttctataga 360 ctaattttta gtacatccat tttattcttt ttagtctcta aattttttaa aactaaaact 420 ctattttagt tttttattta ataatttaga tataaaatga aataaaataa attgactaca 480 aataaaacaa atacccttta agaaataaaa aaactaagca aacatttttc ttgtttcgag 540 tagataatga caggctgttc aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 600 agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtag ctgcctctgg 660 acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 720 gcgtggcgga gcggcagacg tgaggcggca cggcaggcgg cctcttcctc ctctcacggc 780 accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 840 gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttcg ttcggagcgc 900 acacacacgc aaccagatct cccccaaatc cagccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 960 ccgctcatcc tccccccccc cctctctcta ccttctctag atcggcgatc cggtccatgg 1020 ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gagcaaacat gttcatgttc 1080 atgtttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag gatactgttt 1140 caagctacct ggtggattta ttaattttgt atctgtatgt gtgtgccata catcttcata 1200 gttacgagtt taagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc 1260 gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttttctcg cttggttgtg atgatatggt 1320 ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtggattt 1380 attaaaggat aaagggtcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgg 1440 atttattaaa ggatctgtat gtatgtgcct acatcttcat agttacgagt ttaagatgat 1500 ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat 1560 acagagatgc tttttttcgc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 1620 atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgt atctttatgt 1680 gtgtgccata catcttcata gttacgagtt taagatgatg gatggaaata ttgatctagg 1740 ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcggcat 1800 ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860 ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920 agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcc gatgctcacc 1980 ctgttgttgg gtgatacttc tgcaggtc 2008 <210> 146 <211> 1053 <212> DNA <213> Zea mays subsp. 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Mexicana <400> 148 gtacgccgct catcctcccc ccccccctct ctctaccttc tctagatcgg cgatccggtc 60 catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagagca aacatgttca 120 tgttcatgtt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtaggatac 180 tgtttcaagc tacctggtgg atttattaat tttgtatctg tatgtgtgtg ccatacatct 240 tcatagttac gagtttaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 300 gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttt tctcgcttgg ttgtgatgat 360 atggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg 420 gatttattaa aggataaagg gtcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct 480 ggtggattta ttaaaggatc tgtatgtatg tgcctacatc ttcatagtta cgagtttaag 540 atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg 600 catatacaga gatgcttttt ttcgcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt 660 tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttgtatctt 720 tatgtgtgtg ccatacatct tcatagttac gagtttaaga tgatggatgg aaatattgat 780 ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc 840 ggcatctatt catatgctct aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt 900 tataattatt ttgatcttga tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat 960 tttttagccc tgccttcata cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt tgtccgatgc 1020 tcaccctgtt gtttggtgat acttctgcag gtc 1053 <210> 149 <211> 2008 <212> DNA <213> Zea mays subsp. Mexicana <400> 149 gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta aagtataaaa aattaccaca 60 tatttttttg tcacacttat ttgaagtgta gtttatctat ctctatacat atatttaaac 120 ttcactctac aaataatata gtctataata ctaaaataat attagtgttt tagaggatca 180 tataaataaa ctgctagaca tggtctaaag gataattgaa tattttgaca atctacagtt 240 ttatcttttt agtgtgcatg tgatctctct gttttttttg caaatagctt gacctatata 300 atacttcatc cattttatta gtacatccat ttaggattta gggttgatgg tttctataga 360 ctaattttta gtacatccat tttattcttt ttagtctcta aattttttaa aactaaaact 420 ctattttagt tttttattta ataatttaga tataaaatga aataaaataa attgactaca 480 aataaaacaa atacccttta agaaataaaa aaactaagca aacatttttc ttgtttcgag 540 tagataatga caggctgttc aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 600 agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtag ctgcctctgg 660 acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 720 gcgtggcgga gcggcagacg tgaggcggca cggcaggcgg cctcttcctc ctctcacggc 780 accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 840 gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttcg ttcggagcgc 900 acacacacgc aaccagatct cccccaaatc cagccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 960 ccgctcatcc tccccccccc cctctctcta ccttctctag atcggcgatc cggtccatgg 1020 ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gagcaaacat gttcatgttc 1080 atgtttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag gatactgttt 1140 caagctacct ggtggattta ttaattttgt atctgtatgt gtgtgccata catcttcata 1200 gttacgagtt taagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc 1260 gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttttctcg cttggttgtg atgatatggt 1320 ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtggattt 1380 attaaaggat aaagggtcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgg 1440 atttattaaa ggatctgtat gtatgtgcct acatcttcat agttacgagt ttaagatgat 1500 ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat 1560 acagagatgc tttttttcgc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 1620 atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgt atctttatgt 1680 gtgtgccata catcttcata gttacgagtt taagatgatg gatggaaata ttgatctagg 1740 ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcggcat 1800 ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860 ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920 agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcc gatgctcacc 1980 ctgttgttgg gtgatacttc tgcagggt 2008 <210> 150 <211> 1053 <212> DNA <213> Zea mays subsp. 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cctagattca taataattca ttattctact tgaaaatgat 780 cttaggcctt tttatgcggt cctacgcatc cttccacagg acttgctgtt tgtttgtttt 840 ttgtaatccc tcgctgggac gcagaatggt tcatctgtgc taataatttt tttgcatata 900 taagtttata gttctcatta ttcatgtggc tatggtagcc tgtaaaatct attgtaataa 960 catattagtc agccatacat ctgttccaac ttgctcaatt gcaaatcata tctccactta 1020 aagcacatgt ttgcaagctt tctgacaagt ttctttgtgt ttgattgaaa caggtg 1076 <210> 155 <211> 2067 <212> DNA <213> Sorghum bicolor <400> 155 cattaaaagt cattatgtgc atgcgtcgta actaacatgg atatgttgct gcactatctc 60 ctcgcactag ctgcgcatga taaagccaca agccaaaatt aattattatg ggtgagaata 120 aatacgtacc agcaccggcc atagaaaaag tacattatta aaggtctaat ttggaaacag 180 tctgaaaacg acgtgcgctg cagaggtaaa tgtaattttc ggcactaaaa ccattatcaa 240 ctaattcatt caataacagt tatttagaaa atgtatagct cgctctaaaa aaacagttta 300 gaaaaacagt caaaataatt cgaccaacaa acagttaata aggttcatta aatatataat 360 gcacggtgct atttgatctt ttaaaggaaa aagaggaata gtcgtgggcg ccaggcggga 420 attggggcgc gggagtctgc cggacgacgc gttccgtccg aacggccgga cccgacgagg 480 cccccccgcc gccccacgtc gcagaaccgt ccgtgggtgg taatctggcc gggtacacca 540 gccgtcccct tgggcggcct cacagcactg ggctcacacg tgagttttgt tctgggcttc 600 ggatcgcacc atatgggcct cggcatcaga aagacggggc ccgtctggga tagaagagac 660 aggaacctcc tcgtggattc cagaagccag ccacgagcga ccaccgacgc ggaggatact 720 cgtcgtccaa gtccaacacg gcgggcgggc gggcggacgc gtgggctggg ctaactgcct 780 aaccttaacc tccaaggcac gccaaggccc gcttctccca cccgacataa atatcccccc 840 atccaggcaa ggcgcagagc ctcagaccag attccgatca atcacccata agctcccccc 900 aaatctgttc ctcgtctccc gtctcgcggt ttcctacttc cctcggacgc ctccggcaag 960 tcgctcgacc gcgcgattcc gcccgctcaa ggtatcaact cggttcacca ctccaatcta 1020 cgtctgattt agatgttact tccatctatg tctaatttag atgttactcc gatgcgattg 1080 gattatgttt atgcggtttg cactgctctg gaaactggaa tctagggttt cgagtgattt 1140 gatcgatcgc gatctgtgat ttcgttgcgc cttgtgtatg cttggagtga tctaggcttg 1200 tatatgcggc atcgcgatct gacgcggttg ctttgtagag gctgggggtc taggctgtga 1260 ttttagaatc aaataaagct gttccttacc gtagatgttt cctacatgtt ctgtccagta 1320 ctccagtgct atattcacat tgtttgaggc ttgagttttg tcgatcagtg gtcatgagaa 1380 aaatatatct catgatttta gaggcaccta ttgggaaagg tagatggttc cgttttacat 1440 gttttataga ccttgtggca tggctccttt gttctatggg tgctttattt tcctgaataa 1500 cagtaatgcg agactggtct atgggtgctt tgaccagtaa tgcgagacta gttatttgat 1560 catggtgcag ttcctagtga ttacgaacaa caatttggta gctcagttca ttcagcattg 1620 gtttctacga tccttatcat tttacttctg aatgaattta tttatttaag atattacagt 1680 gcaataaact gctgtataat atcagtaaca aactgctatt actagtaaat gcctagattc 1740 ataataattc attattctac ttgaaaatga tcttaggcct ttttatgcgg tcctacgcat 1800 ccttccacag gacttgctgt ttgtttgttt tttgtaatcc ctcgctggga cgcagaatgg 1860 ttcatctgtg ctaataattt ttttgcatat ataagtttat agttctcatt attcatgtgg 1920 ctatggtagc ctgtaaaatc tattgtaata acatattagt cagccataca tctgttccaa 1980 cttgctcaat tgcaaatcat atctccactt aaagcacatg tttgcaagct ttctgacaag 2040 tttctttgtg tttgattgaa acagggt 2067 <210> 156 <211> 1076 <212> DNA <213> Sorghum bicolor <400> 156 gtatcaactc ggttcaccac tccaatctac gtctgattta gatgttactt ccatctatgt 60 ctaatttaga tgttactccg atgcgattgg attatgttta tgcggtttgc actgctctgg 120 aaactggaat ctagggtttc gagtgatttg atcgatcgcg atctgtgatt tcgttgcgcc 180 ttgtgtatgc ttggagtgat ctaggcttgt atatgcggca tcgcgatctg acgcggttgc 240 tttgtagagg ctgggggtct aggctgtgat tttagaatca aataaagctg ttccttaccg 300 tagatgtttc ctacatgttc tgtccagtac tccagtgcta tattcacatt gtttgaggct 360 tgagttttgt cgatcagtgg tcatgagaaa aatatatctc atgattttag aggcacctat 420 tgggaaaggt agatggttcc gttttacatg ttttatagac cttgtggcat ggctcctttg 480 ttctatgggt gctttatttt cctgaataac agtaatgcga gactggtcta tgggtgcttt 540 gaccagtaat gcgagactag ttatttgatc atggtgcagt tcctagtgat tacgaacaac 600 aatttggtag ctcagttcat tcagcattgg tttctacgat ccttatcatt ttacttctga 660 atgaatttat ttatttaaga tattacagtg caataaactg ctgtataata tcagtaacaa 720 actgctatta ctagtaaatg cctagattca taataattca ttattctact tgaaaatgat 780 cttaggcctt tttatgcggt cctacgcatc cttccacagg acttgctgtt tgtttgtttt 840 ttgtaatccc tcgctgggac gcagaatggt tcatctgtgc taataatttt 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gaagcgaagc gaatcctccc gatcctctca aggtacgcga gttttcgaat 660 cccctccaga cccctcgtat gctttccctg ttcgttttcg tcgtagcgtt tgattaggta 720 tgctttccct gttcgtgttc gtcgtagggt tcgattaggt cgtgtgaggc catggcctgc 780 tgtgataaat ttatttgttg ttatatcgga tctgtagtcg atttgggggt cgtggtgtag 840 atccgcgggc tgtgatgaag ttatttggtg tgattgtgct cgcgtgattc tgcgcgttga 900 gctcgagtag atctgatggt tggacgaccg attggttcgt tggctggctg cgctaaggtt 960 gggctgggct catgttgcgt tcgctgttgc gcgtgattcc gcggatggac ttgcgcttga 1020 ttgccgccag atcacgttac gattatgtga tttcgtttgg aactttttag atttgtagct 1080 tctgcttatt atatgacaga tgcgcctact gctcatatgc ctgtggtaaa taatggatgg 1140 ctgtgggtca aactagttga ttgtcgagtc atgtatcata tacaggtgta tagacttgcg 1200 tctaattgtt tgcatgttgc agttatatga tttgttttag attgtttgtt ccactcatct 1260 aggctgtaaa agggacacta cttattagct tgttgtttaa tctttttatt agtagattat 1320 attggtaatg ttttactaat tattattatg ttatatgtga cttctgctca tgcctgatta 1380 taatcataga tcactgtagt tgattgttga atcatgtgtc aaatacccgt atacataaca 1440 ctacacattt gcttagttgt ttccttaact catgcaaatt gaacaccatg tatgatttgc 1500 atggtgctgt aatgttaaat actacagtcc tgttggtact tgtttagtaa gaatctgctt 1560 catacaacta tatgctatgc ctgatgataa tcatatatct ttgtgtaatt aataattagt 1620 tgactgttga ataatgtatc gagtacatac catggcacaa ttgcttagtc acttccttaa 1680 ccatgcatat tgaactgacc ccttcatgtt ctgctgaatt gttctattct gattagacca 1740 tacatcatgt attgcaatct ttatttgcaa ttgtaatgta atggttcggt tctcaaatgt 1800 taaatgctat agttgtgcta ctttctaatg ttaaatgcta tagctgtgct acttgtaaga 1860 tctgcttcat agtttagtta aattaggatg atgagctttg atgctgtaac tttgtttgat 1920 tatgttcata gttgatcagt ttttgttaga ctcacagtaa cttatggtct cactcttctt 1980 ctggtctttg atgtttgcag cgg 2003 <210> 158 <211> 1361 <212> DNA <213> Sorghum bicolor <400> 158 gtacgcgagt tttcgaatcc cctccagacc cctcgtatgc tttccctgtt cgttttcgtc 60 gtagcgtttg attaggtatg ctttccctgt tcgtgttcgt cgtagggttc gattaggtcg 120 tgtgaggcca tggcctgctg tgataaattt atttgttgtt atatcggatc tgtagtcgat 180 ttgggggtcg tggtgtagat ccgcgggctg tgatgaagtt atttggtgtg attgtgctcg 240 cgtgattctg cgcgttgagc tcgagtagat ctgatggttg gacgaccgat tggttcgttg 300 gctggctgcg ctaaggttgg gctgggctca tgttgcgttc gctgttgcgc gtgattccgc 360 ggatggactt gcgcttgatt gccgccagat cacgttacga ttatgtgatt tcgtttggaa 420 ctttttagat ttgtagcttc tgcttattat atgacagatg cgcctactgc tcatatgcct 480 gtggtaaata atggatggct gtgggtcaaa ctagttgatt gtcgagtcat gtatcatata 540 caggtgtata gacttgcgtc taattgtttg catgttgcag ttatatgatt tgttttagat 600 tgtttgttcc actcatctag gctgtaaaag ggacactact tattagcttg ttgtttaatc 660 tttttattag tagattatat tggtaatgtt ttactaatta ttattatgtt atatgtgact 720 tctgctcatg cctgattata atcatagatc actgtagttg attgttgaat catgtgtcaa 780 atacccgtat acataacact acacatttgc ttagttgttt ccttaactca tgcaaattga 840 acaccatgta tgatttgcat ggtgctgtaa tgttaaatac tacagtcctg ttggtacttg 900 tttagtaaga atctgcttca tacaactata tgctatgcct gatgataatc atatatcttt 960 gtgtaattaa taattagttg actgttgaat aatgtatcga gtacatacca tggcacaatt 1020 gcttagtcac ttccttaacc atgcatattg aactgacccc ttcatgttct gctgaattgt 1080 tctattctga ttagaccata catcatgtat tgcaatcttt atttgcaatt gtaatgtaat 1140 ggttcggttc tcaaatgtta aatgctatag ttgtgctact ttctaatgtt aaatgctata 1200 gctgtgctac ttgtaagatc tgcttcatag tttagttaaa ttaggatgat gagctttgat 1260 gctgtaactt tgtttgatta tgttcatagt tgatcagttt ttgttagact cacagtaact 1320 tatggtctca ctcttcttct ggtctttgat gtttgcagcg g 1361 <210> 159 <211> 1812 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1812) <223> Codon redesigned coding sequence. <400> 159 atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60 ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120 gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180 cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240 ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300 aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360 tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 420 cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 480 ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 540 aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 600 tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat 660 caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac 720 ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca 780 gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag 840 ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac 900 ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg 960 attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg 1020 gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct 1080 ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc 1140 aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa 1200 aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt 1260 gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg 1320 atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt 1380 gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg 1440 gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt 1500 atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg 1560 tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc 1620 agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata 1680 ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg 1740 gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga 1800 ggcaaacaat ga 1812 <210> 160 <211> 2001 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2001) <223> Codon redesigned coding sequence. <400> 160 atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60 ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120 gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180 cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240 ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300 aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360 tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtaag tttctgcttc tacctttgat atatatataa 420 taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa ataaaagaat 480 gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa tttataactt 540 ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtatca ccgtttgtgt gaacaacgaa 600 ctgaactggc agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg caagaaaaag 660 cagtcttact tccatgattt ctttaactat gccggaatcc atcgcagcgt aatgctctac 720 accacgccga acacctgggt ggacgatatc accgtggtga cgcatgtcgc gcaagactgt 780 aaccacgcgt ctgttgactg gcaggtggtg gccaatggtg atgtcagcgt tgaactgcgt 840 gatgcggatc aacaggtggt tgcaactgga caaggcacta gcgggacttt gcaagtggtg 900 aatccgcacc tctggcaacc gggtgaaggt tatctctatg aactgtgcgt cacagccaaa 960 agccagacag agtgtgatat ctacccgctt cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag 1020 ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa 1080 gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta 1140 atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg 1200 ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt 1260 aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa 1320 gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg 1380 cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt 1440 ccgcaaggtg cacgggaata tttcgcgcca ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg 1500 acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg ttctgcgacg ctcacaccga taccatcagc 1560 gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat 1620 ttggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat 1680 cagccgatta tcatcaccga atacggcgtg gatacgttag ccgggctgca ctcaatgtac 1740 accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt 1800 gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg 1860 caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag aaagggatct tcactcgcga ccgcaaaccg 1920 aagtcggcgg cttttctgct gcaaaaacgc tggactggca tgaacttcgg tgaaaaaccg 1980 cagcagggag gcaaacaatg a 2001 <210> 161 <211> 253 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 161 gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60 atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120 atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180 gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240 atgttactag atc 253 <210> 162 <211> 210 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 162 ctgcatgcgt ttggacgtat gctcattcag gttggagcca atttggttga tgtgtgtgcg 60 agttcttgcg agtctgatga gacatctctg tattgtgttt ctttccccag tgttttctgt 120 acttgtgtaa tcggctaatc gccaacagat tcggcgatga ataaatgaga aataaattgt 180 tctgattttg agtgcaaaaa aaaaggaatt 210 <210> 163 <211> 1204 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1204) <223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group. <400> 163 ggtccgattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc 60 ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 120 catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 180 gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 240 aagcaagtgg attgatgtga tggtccgatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga 300 aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag 360 gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc 420 tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa 480 gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg 540 gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt 600 catttggaga ggacacgctg acaagctgac tctagcagat cctctagaac catcttccac 660 acactcaagc cacactattg gagaacacac agggacaaca caccataaga tccaagggag 720 gcctccgccg ccgccggtaa ccaccccgcc cctctcctct ttctttctcc gttttttttt 780 ccgtctcggt ctcgatcttt ggccttggta gtttgggtgg gcgagaggcg gcttcgtgcg 840 cgcccagatc ggtgcgcggg aggggcggga tctcgcggct ggggctctcg ccggcgtgga 900 tccggcccgg atctcgcggg gaatggggct ctcggatgta gatctgcgat ccgccgttgt 960 tgggggagat gatggggggt ttaaaatttc cgccgtgcta aacaagatca ggaagagggg 1020 aaaagggcac tatggtttat atttttatat atttctgctg cttcgtcagg cttagatgtg 1080 ctagatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat ccctcagcat tgttcatcgg 1140 tagtttttct tttcatgatt tgtgacaaat gcagcctcgt gcggagcttt tttgtaggta 1200 gaag 1204 <210> 164 <211> 1399 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 164 tcgaggtcat tcatatgctt gagaagagag tcgggatagt ccaaaataaa acaaaggtaa 60 gattacctgg tcaaaagtga aaacatcagt taaaaggtgg tataaagtaa aatatcggta 120 ataaaaggtg gcccaaagtg aaatttactc ttttctacta ttataaaaat tgaggatgtt 180 tttgtcggta ctttgatacg tcatttttgt atgaattggt ttttaagttt attcgctttt 240 ggaaatgcat atctgtattt gagtcgggtt ttaagttcgt ttgcttttgt aaatacagag 300 ggatttgtat aagaaatatc tttagaaaaa cccatatgct aatttgacat aatttttgag 360 aaaaatatat attcaggcga attctcacaa tgaacaataa taagattaaa atagctttcc 420 cccgttgcag cgcatgggta ttttttctag taaaaataaa agataaactt agactcaaaa 480 catttacaaa aacaacccct aaagttccta aagcccaaag tgctatccac gatccatagc 540 aagcccagcc caacccaacc caacccaacc caccccagtc cagccaactg gacaatagtc 600 tccacacccc cccactatca ccgtgagttg tccgcacgca ccgcacgtct cgcagccaaa 660 aaaaaaaaga aagaaaaaaa agaaaaagaa aaaacagcag gtgggtccgg gtcgtggggg 720 ccggaaacgc gaggaggatc gcgagccagc gacgaggccg gccctccctc cgcttccaaa 780 gaaacgcccc ccatcgccac tatatacata cccccccctc tcctcccatc cccccaaccc 840 taccaccacc accaccacca cctccacctc ctcccccctc gctgccggac gacgagctcc 900 tcccccctcc ccctccgccg ccgccgcgcc ggtaaccacc ccgcccctct cctctttctt 960 tctccgtttt tttttccgtc tcggtctcga tctttggcct tggtagtttg ggtgggcgag 1020 aggcggcttc gtgcgcgccc agatcggtgc gcgggagggg cgggatctcg cggctggggc 1080 tctcgccggc gtggatccgg cccggatctc gcggggaatg gggctctcgg atgtagatct 1140 gcgatccgcc gttgttgggg gagatgatgg ggggtttaaa atttccgccg tgctaaacaa 1200 gatcaggaag aggggaaaag ggcactatgg tttatatttt tatatatttc tgctgcttcg 1260 tcaggcttag atgtgctaga tctttctttc ttctttttgt gggtagaatt tgaatccctc 1320 agcattgttc atcggtagtt tttcttttca tgatttgtga caaatgcagc ctcgtgcgga 1380 gcttttttgt aggtagaag 1399 <210> 165 <211> 2181 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 165 gacaacaaca tgcttctcat caacatggag ggaagaggga gggagaaagt gtcgcctggt 60 cacctccatt gtcacactag ccactggcca gctctcccac accaccaatg ccaggggcga 120 gctttagcac agccaccgct tcacctccac caccgcacta ccctagcttc gcccaacagc 180 caccgtcaac gcctcctctc cgtcaacata agagagagag agaagaggag agtagccatg 240 tggggaggag gaatagtaca tggggcctac cgtttggcaa gttattttgg gttgccaagt 300 taggccaata aggggaggga tttggccatc cggttggaaa ggttattggg gtagtatctt 360 tttactagaa ttgtcaaaaa aaaatagttt gagagccatt tggagaggat gttgcctgtt 420 agaggtgctc ttaggacatc aaattccata aaaacatcag aaaaattctc tcgatgaaga 480 tttataacca ctaaaactgc cctcaattcg aagggagttc aaaacaatta aaatcatgtt 540 cgaattgagt ttcaatttca ctttaacccc tttgaaatct caatggtaaa acatcaaccc 600 gtcaggtagc atggttcttt ttattccttt caaaaagagt taattacaaa cagaatcaaa 660 actaacagtt aggcccaagg cccatccgag caaacaatag atcatgggcc aggcctgcca 720 ccaccctccc cctcctggct cccgctcttg aatttcaaaa tccaaaaata tcggcacgac 780 tggccgccga cggagcgggc ggaaaatgac ggaacaaccc ctcgaattct accccaacta 840 cgcccaccaa cccacacgcc actgacaatc cggtcccacc cttgtgggcc cacctacaag 900 cgagacgtca gtcgctcgca gcaaccagtg ggcccacctc ccagtgagcg gcgggtagat 960 ctggactctt acccacccac actaaacaaa acggcatgaa tattttgcac taaaaccctc 1020 agaaaaattc cgatattcca aaccagtaca gttcctgacc gttggaggag ccaaagtgga 1080 gcggagtgta aaattgggaa acttaatcga gggggttaaa cgcaaaaacg ccgaggcgcc 1140 tcccgctcta tagaaagggg aggagtggga ggtggaaacc ctaccacacc gcagagaaag 1200 gcgtcttcgt actcgcctct ctccgcgccc tcctccgccg ccgctcgccg ccgttcgtct 1260 ccgccgccac cggctagcca tccaggtaaa acaaacaaaa acggatctga tgcttccatt 1320 cctccgtttc tcgtagtagc gcgcttcgat ctgtgggtgg atctgggtga tcctggggtg 1380 tggttcgttc tgtttgatag atctgtcggt ggatctggcc ttctgtggtt gtcgatgtcc 1440 ggatctgcgt tttgatcagt ggtagttcgt ggatctggcg aaatgttttg gatctggcag 1500 tgagacgcta agaatcggga aatgatgcaa tattaggggg gtttcggatg gggatccact 1560 gaattagtct gtctccctgc tgataatctg ttcctttttg gtagatctgg ttagtgtatg 1620 tttgtttcgg atagatctga tcaatgcttg tttgtttttt caaattttct acctaggttg 1680 tataggaatg gcatgcggat ctggttggat tgccatgatc cgtgctgaaa tgcccctttg 1740 gttgatggat cttgatattt tactgctgtt cacctagatt tgtactcccg tttatactta 1800 atttgttgct tattatgaat agatctgtaa cttaggcaca tgtatggacg gagtatgtgg 1860 atctgtagta tgtacattgc tgcgagctaa gaactatttc agagcaagca cagaaaaaaa 1920 tatttagaca gattgggcaa ctatttgatg gtctttggta tcatgctttg tagtgctcgt 1980 ttctgcgtag taatcttttg atctgatctg aagataggtg ctattatatt cttaaaggtc 2040 attagaacgc tatctgaaag gctgtattat gtggattggt tcacctgtga ctccctgttc 2100 gtcttgtctt gataaatcct gtgataaaaa aaattcttaa ggcgtaattt gttgaaatct 2160 tgttttgtcc tatgcagcct g 2181 <210> 166 <211> 1653 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1653) <223> Codon redesigned coding sequence. <400> 166 atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga 60 accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120 gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc 180 gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240 tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300 gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt 360 tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420 aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480 tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540 tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga 600 tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg 660 catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720 gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780 cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac 840 aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg 900 attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg 960 aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat 1020 gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080 gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140 acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt 1200 tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260 ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct 1320 ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa 1380 caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440 cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500 tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560 gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620 aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa 1653 <210> 167 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(936) <223> Codon redesigned coding sequence. <400> 167 atggcttcca aggtgtacga ccccgagcaa cgcaaacgca tgatcactgg gcctcagtgg 60 tgggctcgct gcaagcaaat gaacgtgctg gactccttca tcaactacta tgattccgag 120 aagcacgccg agaacgccgt gatttttctg catggtaacg ctgcctccag ctacctgtgg 180 aggcacgtcg tgcctcacat cgagcccgtg gctagatgca tcatccctga tctgatcgga 240 atgggtaagt ccggcaagag cgggaatggc tcatatcgcc tcctggatca ctacaagtac 300 ctcaccgctt ggttcgagct gctgaacctt ccaaagaaaa tcatctttgt gggccacgac 360 tggggggctt gtctggcctt tcactactcc tacgagcacc aagacaagat caaggccatc 420 gtccatgctg agagtgtcgt ggacgtgatc gagtcctggg acgagtggcc tgacatcgag 480 gaggatatcg ccctgatcaa gagcgaagag ggcgagaaaa tggtgcttga gaataacttc 540 ttcgtcgaga ccatgctccc aagcaagatc atgcggaaac tggagcctga ggagttcgct 600 gcctacctgg agccattcaa ggagaagggc gaggttagac ggcctaccct ctcctggcct 660 cgcgagatcc ctctcgttaa gggaggcaag cccgacgtcg tccagattgt ccgcaactac 720 aacgcctacc ttcgggccag cgacgatctg cctaagatgt tcatcgagtc cgaccctggg 780 ttcttttcca acgctattgt cgagggagct aagaagttcc ctaacaccga gttcgtgaag 840 gtgaagggcc tccacttcag ccaggaggac gctccagatg aaatgggtaa gtacatcaag 900 agcttcgtgg agcgcgtgct gaagaacgag cagtaa 936 <210> 168 <211> 675 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(675) <223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group. <400> 168 ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60 cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120 ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180 agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240 aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300 gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360 aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 420 cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 480 aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 540 gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 600 ttcatttgga gaggaaccat cttccacaca ctcaagccac actattggag aacacacagg 660 gacaacacac cataa 675 <210> 169 <211> 622 <212> DNA <213> Cauliflower mosaic virus <400> 169 ggtccgattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc 60 ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 120 catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 180 gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 240 aagcaagtgg attgatgtga tggtccgatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga 300 aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag 360 gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc 420 tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa 480 gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg 540 gatgacgcac aatcccacta tctagacgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt 600 tcatttggag aggacacgct ga 622 <210> 170 <211> 1446 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1446) <223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group. <400> 170 ggtccgattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc 60 ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 120 catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 180 gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 240 aagcaagtgg attgatgtga tggtccgatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga 300 aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag 360 gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc 420 tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa 480 gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg 540 gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt 600 catttggaga ggacacgctg acaagctgac tctagcagat ctaccgtctt cggtacgcgc 660 tcactccgcc ctctgccttt gttactgcca cgtttctctg aatgctctct tgtgtggtga 720 ttgctgagag tggtttagct ggatctagaa ttacactctg aaatcgtgtt ctgcctgtgc 780 tgattacttg ccgtcctttg tagcagcaaa atatagggac atggtagtac gaaacgaaga 840 tagaacctac acagcaatac gagaaatgtg taatttggtg cttagcggta tttatttaag 900 cacatgttgg tgttataggg cacttggatt cagaagtttg ctgttaattt aggcacaggc 960 ttcatactac atgggtcaat agtataggga ttcatattat aggcgatact ataataattt 1020 gttcgtctgc agagcttatt atttgccaaa attagatatt cctattctgt ttttgtttgt 1080 gtgctgttaa attgttaacg cctgaaggaa taaatataaa tgacgaaatt ttgatgttta 1140 tctctgctcc tttattgtga ccataagtca agatcagatg cacttgtttt aaatattgtt 1200 gtctgaagaa ataagtactg acagtatttt gatgcattga tctgcttgtt tgttgtaaca 1260 aaatttaaaa ataaagagtt tcctttttgt tgctctcctt acctcctgat ggtatctagt 1320 atctaccaac tgacactata ttgcttctct ttacatacgt atcttgctcg atgccttctc 1380 cctagtgttg accagtgtta ctcacatagt ctttgctcat ttcattgtaa tgcagatacc 1440 aagcgg 1446 <210> 171 <211> 1165 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1165) <223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group. <400> 171 ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60 cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120 ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180 agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240 aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300 gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360 aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 420 cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 480 aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 540 gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 600 ttcatttgga gaggacacgc tgacaagctg actctagcag atcctctaga accatcttcc 660 acacactcaa gccacactat tggagaacac acagggacaa cacaccataa gatccaaggg 720 aggcctccgc cgccgccggt aaccaccccg cccctctcct ctttctttct ccgttttttt 780 ttccgtctcg gtctcgatct ttggccttgg tagtttgggt gggcgagagg cggcttcgtg 840 cgcgcccaga tcggtgcgcg ggaggggcgg gatctcgcgg ggaatggggc tctcggatgt 900 agatctgcga tccgccgttg ttgggggaga tgatgggggg tttaaaattt gcgccgtgct 960 aaacaagatc aggaagaggg gaaaagggca ctatggttta tatttttata tatttctgct 1020 gcttcgtcag gcttagatgt gctagatctt tctttcttct ttttgtgggt agaatttgaa 1080 tccctcagca ttgttcatcg gtagtttttc ttttcatgat ttgtgacaaa tgcagcctcg 1140 tgcggagctt ttttgtaggt agaag 1165 <210> 172 <211> 1751 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1751) <223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group. <400> 172 tcgaggtcat tcatatgctt gagaagagag tcgggatagt ccaaaataaa acaaaggtaa 60 gattacctgg tcaaaagtga aaacatcagt taaaaggtgg tataaagtaa aatatcggta 120 ataaaaggtg gcccaaagtg aaatttactc ttttctacta ttataaaaat tgaggatgtt 180 tttgtcggta ctttgatacg tcatttttgt atgaattggt ttttaagttt attcgctttt 240 ggaaatgcat atctgtattt gagtcgggtt ttaagttcgt ttgcttttgt aaatacagag 300 ggatttgtat aagaaatatc tttagaaaaa cccatatgct aatttgacat aatttttgag 360 aaaaatatat attcaggcga attagcttag gcctcatcgt tgaagatgcc tctgccgaca 420 gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa 480 ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac 540 aatcccacta tccttcgagg cctcatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 600 gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 660 aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat 720 ccttcgaagc taattctcac aatgaacaat aataagatta aaatagcttt cccccgttgc 780 agcgcatggg tattttttct agtaaaaata aaagataaac ttagactcaa aacatttaca 840 aaaacaaccc ctaaagttcc taaagcccaa agtgctatcc acgatccata gcaagcccag 900 cccaacccaa cccaacccaa cccaccccag tccagccaac tggacaatag tctccacacc 960 cccccactat caccgtgagt tgtccgcacg caccgcacgt ctcgcagcca aaaaaaaaaa 1020 gaaagaaaaa aaagaaaaag aaaaaacagc aggtgggtcc gggtcgtggg ggccggaaac 1080 gcgaggagga tcgcgagcca gcgacgaggc cggccctccc tccgcttcca aagaaacgcc 1140 ccccatcgcc actatataca tacccccccc tctcctccca tccccccaac cctaccacca 1200 ccaccaccac cacctccacc tcctcccccc tcgctgccgg acgacgagct cctcccccct 1260 ccccctccgc cgccgccgcg ccggtaacca ccccgcccct ctcctctttc tttctccgtt 1320 tttttttccg tctcggtctc gatctttggc cttggtagtt tgggtgggcg agaggcggct 1380 tcgtgcgcgc ccagatcggt gcgcgggagg ggcgggatct cgcggctggg gctctcgccg 1440 gcgtggatcc ggcccggatc tcgcggggaa tggggctctc ggatgtagat ctgcgatccg 1500 ccgttgttgg gggagatgat ggggggttta aaatttccgc cgtgctaaac aagatcagga 1560 agaggggaaa agggcactat ggtttatatt tttatatatt tctgctgctt cgtcaggctt 1620 agatgtgcta gatctttctt tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc tcagcattgt 1680 tcatcggtag tttttctttt catgatttgt gacaaatgca gcctcgtgcg gagctttttt 1740 gtaggtagaa g 1751 <210> 173 <211> 1101 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1101) <223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group. <400> 173 ggtccgattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc 60 ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 120 catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 180 gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 240 aagcaagtgg attgatgtga tggtccgatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga 300 aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag 360 gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc 420 tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa 480 gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg 540 gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt 600 catttggaga ggacacgctg accgccgccg ccggtaacca ccccgcccct ctcctctttc 660 tttctccgtt tttttttccg tctcggtctc gatctttggc cttggtagtt tgggtgggcg 720 agaggcggct tcgtgcgcgc ccagatcggt gcgcgggagg ggcgggatct cgcggctggg 780 gctctcgccg gcgtggatcc ggcccggatc tcgcggggaa tggggctctc ggatgtagat 840 ctgcgatccg ccgttgttgg gggagatgat ggggggttta aaatttccgc cgtgctaaac 900 aagatcagga agaggggaaa agggcactat ggtttatatt tttatatatt tctgctgctt 960 cgtcaggctt agatgtgcta gatctttctt tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc 1020 tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt catgatttgt gacaaatgca gcctcgtgcg 1080 gagctttttt gtaggtagaa g 1101 <210> 174 <211> 200 <212> DNA <213> Cauliflower mosaic virus <400> 174 aaatcaccag tctctctcta caaatctatc tctctctatt tttctccaga ataatgtgtg 60 agtagttccc agataaggga attagggttc ttatagggtt tcgctcatgt gttgagcata 120 taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt ctatcaataa aatttctaat 180 tcctaaaacc aaaatccagt 200 <210> 175 <211> 300 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 175 attaatcgat cctccgatcc cttaattacc ataccattac accatgcatc aatatccata 60 tatatataaa ccctttcgca cgtacttata ctatgttttg tcatacatat atatgtgtcg 120 aacgatcgat ctatcactga tatgatatga ttgatccatc agcctgatct ctgtatcttg 180 ttatttgtat accgtcaaat aaaagtttct tccacttgtg ttaataatta gctactctca 240 tctcatgaac cctatatata actagtttaa tttgctgtca attgaacatg atgatcgatg 300 <210> 176 <211> 623 <212> DNA <213> Cauliflower mosaic virus <400> 176 ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60 cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120 ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180 agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240 aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300 gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360 aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 420 cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 480 aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 540 gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 600 ttcatttgga gaggacacgc tga 623 <210> 177 <211> 8 <212> DNA <213> Cauliflower mosaic virus <400> 177 acacgctg 8 <210> 178 <211> 804 <212> DNA <213> Zea mays <400> 178 accgtcttcg gtacgcgctc actccgccct ctgcctttgt tactgccacg tttctctgaa 60 tgctctcttg tgtggtgatt gctgagagtg gtttagctgg atctagaatt acactctgaa 120 atcgtgttct gcctgtgctg attacttgcc gtcctttgta gcagcaaaat atagggacat 180 ggtagtacga aacgaagata gaacctacac agcaatacga gaaatgtgta atttggtgct 240 tagcggtatt tatttaagca catgttggtg ttatagggca cttggattca gaagtttgct 300 gttaatttag gcacaggctt catactacat gggtcaatag tatagggatt catattatag 360 gcgatactat aataatttgt tcgtctgcag agcttattat ttgccaaaat tagatattcc 420 tattctgttt ttgtttgtgt gctgttaaat tgttaacgcc tgaaggaata aatataaatg 480 acgaaatttt gatgtttatc tctgctcctt tattgtgacc ataagtcaag atcagatgca 540 cttgttttaa atattgttgt ctgaagaaat aagtactgac agtattttga tgcattgatc 600 tgcttgtttg ttgtaacaaa atttaaaaat aaagagtttc ctttttgttg ctctccttac 660 ctcctgatgg tatctagtat ctaccaactg acactatatt gcttctcttt acatacgtat 720 cttgctcgat gccttctccc tagtgttgac cagtgttact cacatagtct ttgctcattt 780 cattgtaatg cagataccaa gcgg 804 <210> 179 <211> 1396 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 179 tcgaggtcat tcatatgctt gagaagagag tcgggatagt ccaaaataaa acaaaggtaa 60 gattacctgg tcaaaagtga aaacatcagt taaaaggtgg tataaagtaa aatatcggta 120 ataaaaggtg gcccaaagtg aaatttactc ttttctacta ttataaaaat tgaggatgtt 180 tttgtcggta ctttgatacg tcatttttgt atgaattggt ttttaagttt attcgctttt 240 ggaaatgcat atctgtattt gagtcgggtt ttaagttcgt ttgcttttgt aaatacagag 300 ggatttgtat aagaaatatc tttagaaaaa cccatatgct aatttgacat aatttttgag 360 aaaaatatat attcaggcga attctcacaa tgaacaataa taagattaaa atagctttcc 420 cccgttgcag cgcatgggta ttttttctag taaaaataaa agataaactt agactcaaaa 480 catttacaaa aacaacccct aaagttccta aagcccaaag tgctatccac gatccatagc 540 aagcccagcc caacccaacc caacccagcc caccccagtc cagccaactg gacaatagtc 600 tccacacccc cccactatca ccgtgagttg tccgcacgca ccgcacgtct cgcagccaaa 660 aaaaaaaaga aagaaaaaaa agaaaaagaa aaaacagcag gtgggtccgg gtcgtggggg 720 ccggaaacgc gaggaggatc gcgagccagc gacgaggccg gccctccctc cgcttccaaa 780 gaaacgcccc ccatcgccac tatatacata cccccccctc tcctcccatc cccccaaccc 840 taccaccacc accaccacca cctccacctc ctcccccctc gctgccggac gacgagctcc 900 tcccccctcc ccctccgccg ccgccgcgcc ggtaaccacc ccgcccctct cctctttctt 960 tctccgtttt tttttccgtc tcggtctcga tctttggcct tggtagtttg ggtgggcgag 1020 aggcggcttc gtgccgccca gatcggtgcg cgggaggggc gggatctcgc ggctggctct 1080 cgcccccgtg gatccggccc ggatctcgcg gggaatgggg ctctcggatg tagatctgcg 1140 atccgccgtt gttggggccg atgatggggc ccttaaaatt tccgccgtgc taaacaagat 1200 caggaagagg ggaaaagggc actatggttt atatttttat atatttctgc tgcttcgtca 1260 ggcttagatg tgctagatct ttctttcttc tttttgtggg tagaatttaa tccctcagca 1320 ttgttcatcg gtagtttttc ttttcatgat tcgtgacaaa tgcagcctcg tgcggacgtt 1380 tttttgtagg tagaag 1396 <210> 180 <211> 2625 <212> DNA <213> Setaria italica <400> 180 actgccgcga cacgcctcac tggcgggagg gctccgagcg ctctctcccc ggcggccggc 60 ggagcagcga tctggattgg agagaataga ggaaagagag ggaaaaggag agagatagcg 120 caaagagctg aaaagataag gttgtgcggg ctgtggtgat tagaggacca ctaatccctc 180 catctcctaa tgacgcggtg cccaagacca gtgccgcggc acaccagcgt ctaagtgaac 240 ttccgctaac cttccggtca ttgcgcctga aagatgtcat gtggcgaggc ccccctctca 300 gtagattgcc aactgcctac cgtgccactc ttccatgcat gattgctccc gtctatcccg 360 tttctcacaa cagatagaca acagtaagca tcactaaagc aagcatgtgt agaaccttaa 420 aaaaaggctt atactaccag tatactatca accagcatgc cgtttttgaa gtatccagga 480 ttagaagctt ctactgcgct tttatattat agctgtggac ccgtggtaac ctttctcttt 540 tggcgcttgc ttaatctcgg ccgtgctggt ccatgcttag gcactaggca gagatagagc 600 cgggggtgaa tggggctaaa gctcagctgc tcgaggggcc gtgggctggt ttccactagc 660 ctacagctgt gccacgtgcg gccgcgcaag ccgaagcaag cacgctgagc cgttggacag 720 cttgtcataa tgccattacg tggattacac gtaactggcc ctgtaactac tcgttcggcc 780 atcatcaaac gacgacgtcc gctaggcgac gacacgggta atgcacgcag ccacccaggc 840 gcgcgcgcta gcggagcacg gtcaggtgac acgggcgtcg tgacgcttcc gagttgaagg 900 ggttaacgcc agaaacagtg tttggccagg gtatgaacat aacaaaaaat attcacacga 960 aagaatggaa gtatggagct gctactgtgt aaatgccaag caggaaactc acgcccgcta 1020 acatccaacg gccaacagct cgacgtgccg gtcagcagag catcggaaca ctggtgattg 1080 gtggagccgg cagtatgcgc cccagcacgg ccgaggtggt ggtggcccgt ggccctgctg 1140 tctgcgcggc tcgggacaac ttgaaactgg gccaccgcct cgtcgcaact cgcaacccgt 1200 tggcggaaga aaggaatggc tcgtaggggc ccgggtagaa tcgaagaatg ttgcgctggg 1260 cttcgattca cataacatgg gcctgaagct ctaaaacgac ggcccggtcg ccgcgcgatg 1320 gaaagagacc ggatcctcct cgtgaattct ggaaggccac acgagagcga cccaccaccg 1380 acgcggagga gtcgtgcgtg gtccaacacg gccggcgggc tgggctgcga ccttaaccag 1440 caaggcacgc cacgacccgc cccgccctcg aggcataaat accctcccat cccgttgccg 1500 caagactcag atcagattcc gatccccagt tcttccccaa tcaccttgtg gtctctcgtg 1560 tcgcggttcc cagggacgcc tccggctcgt cgctcgacag cgatctccgc cccagcaagg 1620 tatagattca gttccttgct ccgatcccaa tctggttgag atgttgctcc gatgcgactt 1680 gattatgtca tatatctgcg gtttgcaccg atctgaagcc tagggtttct cgagcgaccc 1740 agttatttgc aatttgcgat ttgctcgttt gttgcgcagc gtagtttatg tttggagtaa 1800 tcgaggattt gtatgcggcg tcggcgctac ctgcttaatc acgccatgtg acgcggttac 1860 ttgcagaggc tgggttctgt tatgtcgtga tctaagaatc tagattaggc tcagtcgttc 1920 ttgctgtcga ctagtttgtt ttgatatcca tgtagtacaa gttacttaaa atttaggtcc 1980 aatatatttt gcatgctttt ggcctgttat tcttgccaac aagttgtcct ggtaaaaagt 2040 agatgtgaaa gtcacgtatt gggacaaatt gatggtttag tgctatagtt ctatagttct 2100 gtgatacatc tatctgattt tttttggtct attggtgcct aacttatctg aaaatcatgg 2160 aacatgaggc tagtttgatc atggtttagt tcattgtgat taataatgta tgatttagta 2220 gctattttgg tgatcgtgtc attttatttg tgaatggaat cattgtatgt aaatgaagct 2280 agttcagggg ttacgatgta gctggctttg tattctaaag gctgctatta ttcatccatc 2340 gatttcacct atatgtaatc cagagctttt gatgtgaaat ttgtctgatc cttcactagg 2400 aaggacagaa cattgttaat attttggcac atctgtctta ttctcatcct ttgtttgaac 2460 atgttagcct gttcaaacag atactgttgt aatgtcctag ttatataggt acatatgtgt 2520 tctctattga gtttatggac ttttgtgtgt gaagttatat ttcattttgc tcaaaactca 2580 tgtttgcaag ctttctgaca ttattctatt gttctgaaac aggtg 2625 <210> 181 <211> 2008 <212> DNA <213> Zea mays subsp. Mexicana <400> 181 gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta aagtataaaa aattaccaca 60 tatttttttg tcacacttat ttgaagtgta gtttatctat ctctatacat atatttaaac 120 ttcactctac aaataatata gtctataata ctaaaataat attagtgttt tagaggatca 180 tataaataaa ctgctagaca tggtctaaag gataattgaa tattttgaca atctacagtt 240 ttatcttttt agtgtgcatg tgatctctct gttttttttg caaatagctt gacctatata 300 atacttcatc cattttatta gtacatccat ttaggattta gggttgatgg tttctataga 360 ctaattttta gtacatccat tttattcttt ttagtctcta aattttttaa aactaaaact 420 ctattttagt tttttattta ataatttaga tataaaatga aataaaataa attgactaca 480 aataaaacaa atacccttta agaaataaaa aaactaagca aacatttttc ttgtttcgag 540 tagataatga caggctgttc aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 600 agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtag ctgcctctgg 660 acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 720 gcgtggcgga gcggcagacg tgaggcggca cggcaggcgg cctcttcctc ctctcacggc 780 accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 840 gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttcg ttcggagcgc 900 acacacacgc aaccagatct cccccaaatc cagccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 960 ccgctcatcc tccccccccc cctctctcta ccttctctag atcggcgatc cggtccatgg 1020 ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gagcaaacat gttcatgttc 1080 atgtttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag gatactgttt 1140 caagctacct ggtggattta ttaattttgt atctgtatgt gtgtgccata catcttcata 1200 gttacgagtt taagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc 1260 gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttttctcg cttggttgtg atgatatggt 1320 ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtggattt 1380 attaaaggat aaagggtcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgg 1440 atttattaaa ggatctgtat gtatgtgcct acatcttcat agttacgagt ttaagatgat 1500 ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat 1560 acagagatgc tttttttcgc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 1620 atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgt atctttatgt 1680 gtgtgccata catcttcata gttacgagtt taagatgatg gatggaaata ttgatctagg 1740 ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcggcat 1800 ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860 ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920 agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcc gatgctcacc 1980 ctgttgttgg gtgatacttc tgcagcgg 2008 <210> 182 <211> 1053 <212> DNA <213> Zea mays subsp. Mexicana <400> 182 gtacgccgct catcctcccc ccccccctct ctctaccttc tctagatcgg cgatccggtc 60 catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagagca aacatgttca 120 tgttcatgtt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtaggatac 180 tgtttcaagc tacctggtgg atttattaat tttgtatctg tatgtgtgtg ccatacatct 240 tcatagttac gagtttaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 300 gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttt tctcgcttgg ttgtgatgat 360 atggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg 420 gatttattaa aggataaagg gtcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct 480 ggtggattta ttaaaggatc tgtatgtatg tgcctacatc ttcatagtta cgagtttaag 540 atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg 600 catatacaga gatgcttttt ttcgcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt 660 tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttgtatctt 720 tatgtgtgtg ccatacatct tcatagttac gagtttaaga tgatggatgg aaatattgat 780 ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc 840 ggcatctatt catatgctct aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt 900 tataattatt ttgatcttga tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat 960 tttttagccc tgccttcata cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt tgtccgatgc 1020 tcaccctgtt gttgggtgat acttctgcag cgg 1053 <210> 183 <211> 2625 <212> DNA <213> Setaria italica <400> 183 actgccgcga cacgcctcac tggcgggagg gctccgagcg ctctctcccc ggcggccggc 60 ggagcagcga tctggattgg agagaataga ggaaagagag ggaaaaggag agagatagcg 120 caaagagctg aaaagataag gttgtgcggg ctgtggtgat tagaggacca ctaatccctc 180 catctcctaa tgacgcggtg cccaagacca gtgccgcggc acaccagcgt ctaagtgaac 240 ttccgctaac cttccggtca ttgcgcctga aagatgtcat gtggcgaggc ccccctctca 300 gtagattgcc aactgcctac cgtgccactc ttccatgcat gattgctccc gtctatcccg 360 tttctcacaa cagatagaca acagtaagca tcactaaagc aagcatgtgt agaaccttaa 420 aaaaaggctt atactaccag tatactatca accagcatgc cgtttttgaa gtatccagga 480 ttagaagctt ctactgcgct tttatattat agctgtggac ccgtggtaac ctttctcttt 540 tggcgcttgc ttaatctcgg ccgtgctggt ccatgcttag gcactaggca gagatagagc 600 cgggggtgaa tggggctaaa gctcagctgc tcgaggggcc gtgggctggt ttccactagc 660 ctacagctgt gccacgtgcg gccgcgcaag ccgaagcaag cacgctgagc cgttggacag 720 cttgtcataa tgccattacg tggattacac gtaactggcc ctgtaactac tcgttcggcc 780 atcatcaaac gacgacgtcc gctaggcgac gacacgggta atgcacgcag ccacccaggc 840 gcgcgcgcta gcggagcacg gtcaggtgac acgggcgtcg tgacgcttcc gagttgaagg 900 ggttaacgcc agaaacagtg tttggccagg gtatgaacat aacaaaaaat attcacacga 960 aagaatggaa gtatggagct gctactgtgt aaatgccaag caggaaactc acgcccgcta 1020 acatccaacg gccaacagct cgacgtgccg gtcagcagag catcggaaca ctggtgattg 1080 gtggagccgg cagtatgcgc cccagcacgg ccgaggtggt ggtggcccgt ggccctgctg 1140 tctgcgcggc tcgggacaac ttgaaactgg gccaccgcct cgtcgcaact cgcaacccgt 1200 tggcggaaga aaggaatggc tcgtaggggc ccgggtagaa tcgaagaatg ttgcgctggg 1260 cttcgattca cataacatgg gcctgaagct ctaaaacgac ggcccggtcg ccgcgcgatg 1320 gaaagagacc ggatcctcct cgtgaattct ggaaggccac acgagagcga cccaccaccg 1380 acgcggagga gtcgtgcgtg gtccaacacg gccggcgggc tgggctgcga ccttaaccag 1440 caaggcacgc cacgacccgc cccgccctcg aggcataaat accctcccat cccgttgccg 1500 caagactcag atcagattcc gatccccagt tcttccccaa tcaccttgtg gtctctcgtg 1560 tcgcggttcc cagggacgcc tccggctcgt cgctcgacag cgatctccgc cccagcaagg 1620 tatagattca gttccttgct ccgatcccaa tctggttgag atgttgctcc gatgcgactt 1680 gattatgtca tatatctgcg gtttgcaccg atctgaagcc tagggtttct cgagcgaccc 1740 agttatttgc aatttgcgat ttgctcgttt gttgcgcagc gtagtttatg tttggagtaa 1800 tcgaggattt gtatgcggcg tcggcgctac ctgcttaatc acgccatgtg acgcggttac 1860 ttgcagaggc tgggttctgt tatgtcgtga tctaagaatc tagattaggc tcagtcgttc 1920 ttgctgtcga ctagtttgtt ttgatatcca tgtagtacaa gttacttaaa atttaggtcc 1980 aatatatttt gcatgctttt ggcctgttat tcttgccaac aagttgtcct ggtaaaaagt 2040 agatgtgaaa gtcacgtatt gggacaaatt gatggtttag tgctatagtt ctatagttct 2100 gtgatacatc tatctgattt tttttggtct attggtgcct aacttatctg aaaatcatgg 2160 aacatgaggc tagtttgatc atggtttagt tcattgtgat taataatgta tgatttagta 2220 gctattttgg tgatcgtgtc attttatttg tgaatggaat cattgtatgt aaatgaagct 2280 agttcagggg ttacgatgta gctggctttg tattctaaag gctgctatta ttcatccatc 2340 gatttcacct atatgtaatc cagagctttt gatgtgaaat ttgtctgatc cttcactagg 2400 aaggacagaa cattgttaat attttggcac atctgtctta ttctcatcct ttgtttgaac 2460 atgttagcct gttcaaacag atactgttgt aatgtcctag ttatataggt acatatgtgt 2520 tctctattga gtttatggac ttttgtgtgt gaagttatat ttcattttgc tcaaaactca 2580 tgtttgcaag ctttctgaca ttattctatt gttctgaaac aggtg 2625

Claims (18)

  1. a) 유전자-조절 활성을 갖는, 서열 99 또는 서열 80의 전체 서열에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열;
    b) 서열 99 또는 서열 80을 포함하는 서열; 및
    c) 유전자-조절 활성을 갖는, 서열 99 또는 서열 80의 적어도 50개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 단편
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되고 이종성 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결되는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열이 서열 99 또는 서열 80의 DNA 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 DNA 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열이 서열 99 또는 서열 80의 DNA 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것인 DNA 분자.
  4. 제1항에 있어서, DNA 서열이 유전자 조절 활성을 갖는 것인 DNA 분자.
  5. 제1항에 있어서, 이종성 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자가 농경학적 관심 유전자를 포함하는 것인 DNA 분자.
  6. 제5항에 있어서, 농경학적 관심 유전자가 식물에서 제초제 내성을 부여하는 것인 DNA 분자.
  7. 제5항에 있어서, 농경학적 관심 유전자가 식물에서 해충 내성을 부여하는 것인 DNA 분자.
  8. a) 유전자-조절 활성을 갖는, 서열 99 또는 서열 80의 전체 서열에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열;
    b) 서열 99 또는 서열 80을 포함하는 서열; 및
    c) 유전자-조절 활성을 갖는, 서열 99 또는 서열 80의 적어도 50개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 단편
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 이종성 DNA 분자를 포함하고, 상기 서열이 이종성 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결되는 것인 트랜스제닉 식물 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 트랜스제닉 식물 세포가 단자엽 식물 세포인 트랜스제닉 식물 세포.
  10. 제8항에 있어서, 상기 트랜스제닉 식물 세포가 쌍자엽 식물 세포인 트랜스제닉 식물 세포.
  11. 제1항의 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물, 또는 그의 일부.
  12. 제11항 기재의 DNA 분자를 포함하는, 제11항의 트랜스제닉 식물의 자손체 식물 또는 그의 일부.
  13. 제1항의 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 종자.
  14. 제11항에 따른 트랜스제닉 식물 또는 그의 일부를 얻고, 이로부터 상품을 제조하는 것을 포함하는, 상품의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상품이 단백질 농축물, 단백질 단리물, 곡실, 전분, 종자, 굵은 곡분, 고운 곡분, 바이오매스, 또는 종자 오일인 방법.
  16. 제1항의 DNA 분자를 포함하는 상품.
  17. 제16항에 있어서, 단백질 농축물, 단백질 단리물, 곡실, 전분, 종자, 굵은 곡분, 고운 곡분, 바이오매스, 또는 종자 오일인 상품.
  18. 제11항에 따른 트랜스제닉 식물을 얻고, 전사가능 폴리뉴클레오티드가 발현되는 식물을 재배하는 것을 포함하는, 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자의 발현 방법.
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