JP2023524658A - 植物調節エレメント及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、植物内の遺伝子発現を調整するのに有用な組換えDNA分子及び構築物、ならびにこれらのヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、異種の転写可能なDNA分子と作動可能に連結された組換えDNA分子を含むトランスジェニック植物、植物細胞、植物の部位、及び種子も提供し、これらの使用方法も提供する。【選択図】なし
Description
関連出願の参照
本出願は、2020年4月28日に出願された米国仮出願第63/016,904号による利益を主張し、当該出願の全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、2020年4月28日に出願された米国仮出願第63/016,904号による利益を主張し、当該出願の全体が参照により本明細書に援用される。
配列表の援用
「MONS481WO-sequence_listing.txt」という名称のファイルに含まれる配列表は、13,550バイト(Microsoft Windows(登録商標)での計測)であり、2021年4月22日に作成されたものであり、電子申請により本明細書と共に提出され、参照により本明細書に援用される。
「MONS481WO-sequence_listing.txt」という名称のファイルに含まれる配列表は、13,550バイト(Microsoft Windows(登録商標)での計測)であり、2021年4月22日に作成されたものであり、電子申請により本明細書と共に提出され、参照により本明細書に援用される。
本発明は、植物分子生物学及び植物遺伝子工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、植物内の遺伝子発現を調整するのに有用なDNA分子に関する。
調節エレメントは、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の転写を調整することによって遺伝子活性を調節する遺伝的要素である。このようなエレメントとしては、プロモーター、リーダー、イントロン、及び3´非翻訳領域を挙げることができ、これらは、植物分子生物学及び植物遺伝子工学の分野で有用である。
本発明は、植物で使用するための遺伝子調節エレメントを提供する。本発明はまた、調節エレメントを含む組換えDNA分子も提供する。本発明は、調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、及び種子も提供する。1つの実施形態において、調節エレメントは、転写可能なDNA分子と作動可能に連結されている。ある特定の実施形態において、転写可能なDNA分子は、調節配列に対し異種であってもよい。したがって、本発明によって提供される調節エレメント配列は、特定の実施形態においては、異種の転写可能なDNA分子と作動可能に連結されていると定義され得る。本発明はまた、調節エレメントを使用し、調節エレメントを含む組換えDNA分子、ならびに転写可能なDNA分子と作動可能に連結された調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、及び種子を作製及び使用する方法も提供する。
したがって、1つの態様において、本発明は、組換えDNA分子であって、(a)配列番号1~5のいずれかに対し少なくとも約85パーセントの配列同一性を有する配列、(b)配列番号1~5のいずれかを含む配列、ならびに(c)遺伝子調節活性を有する、配列番号1~5のいずれかのフラグメントからなる群より選択されるDNA配列を含み、当該配列が、異種の転写可能なDNA分子と作動可能に連結されている、組換えDNA分子を提供する。「異種の転写可能なDNA分子」とは、転写可能なDNA分子が、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列に対し異種であることを意味する。特定の実施形態では、組換えDNA分子は、配列番号1~5のいずれかのDNA配列に対して少なくとも約85パーセント、少なくとも約86パーセント、少なくとも約87パーセント、少なくとも約88パーセント、少なくとも約89パーセント、少なくとも約90パーセント、少なくとも91パーセント、少なくとも92パーセント、少なくとも93パーセント、少なくとも94パーセント、少なくとも95パーセント、少なくとも96パーセント、少なくとも97パーセント、少なくとも98パーセント、または少なくとも99パーセントの配列同一性を有するDNA配列を含む。
別の態様において、本明細書では、組換えDNA分子を含むトランスジェニック植物細胞であって、(a)配列番号1~5のいずれかに対し少なくとも約85パーセントの配列同一性を有する配列、(b)配列番号1~5のいずれかを含む配列、ならびに(c)遺伝子調節活性を有する、配列番号1~5のいずれかのフラグメントからなる群より選択されるDNA配列を含み、当該DNA配列が、異種の転写可能なDNA分子と作動可能に連結されている、組換えDNA分子を含むトランスジェニック植物細胞を提供する。ある特定の実施形態では、トランスジェニック植物細胞は、単子葉植物細胞である。他の実施形態において、トランスジェニック植物細胞は双子葉植物細胞である。
さらにまた別の態様において、本明細書ではさらに、組換えDNA分子を含むトランスジェニック植物またはその部位であって、a)配列番号1~5のいずれかに対し少なくとも85パーセントの配列同一性を有する配列、b)配列番号1~5のいずれかを含む配列、ならびにc)遺伝子調節活性を有する、配列番号1~5のいずれかのフラグメントからなる群より選択されるDNA配列を含み、当該配列が、異種の転写可能なDNA分子と作動可能に連結されている、組換えDNA分子を含むトランスジェニック植物またはその部位を提供する。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、組換えDNA分子を含む任意の世代の後代植物である。また、成長した際にかかるトランスジェニック植物を産生する、組換えDNA分子を含むトランスジェニック種子も提供される。
別の態様では、本発明は、本発明の組換えDNA分子を含有するトランスジェニック植物またはその部位を得ることと、それから商品生産物を生産することとを含む、商品生産物を生産する方法を提供する。1つの実施形態において、商品生産物は、種子、加工種子、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、デンプン、穀物、植物の部位、種子油、バイオマス、細粉、及び粗粉である。
さらにまた別の態様において、本発明は、本発明の組換えDNA分子で植物細胞を形質転換して形質転換植物細胞を産生することと、当該形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生することとを含む、本発明の組換えDNA分子を含むトランスジェニック植物を産生する方法を提供する。
配列の簡単な説明
配列番号1はイントロン(I-ANDge.Ubq:2)に対し5´側に作動可能に連結されたリーダー(L-ANDge.Ubq:2)に対し、5´側に作動可能に連結されたプロモーター(P-ANDge.Ubq:7)から構成される、Andropogon gerardii由来の調節発現エレメント群またはEXP(EXP-ANDge.Ubq:5)のDNA配列である。
配列番号1はイントロン(I-ANDge.Ubq:2)に対し5´側に作動可能に連結されたリーダー(L-ANDge.Ubq:2)に対し、5´側に作動可能に連結されたプロモーター(P-ANDge.Ubq:7)から構成される、Andropogon gerardii由来の調節発現エレメント群またはEXP(EXP-ANDge.Ubq:5)のDNA配列である。
配列番号2はAndropogon gerardii由来のプロモーター(P-ANDge.Ubq:7)のDNA配列である。
配列番号3はAndropogon gerardii由来のリーダーまたは5´UTR(L-ANDge.Ubq:2)のDNA配列である。
配列番号4はAndropogon gerardii由来のイントロン(I-ANDge.Ubq:2)のDNA配列である。
配列番号5はArundo donax由来の3´UTR(T-ARUdo.TubA:1)のDNA配列である。
配列番号6はEXP(EXP-CaMV.35S+Zm.DnaK:12)のDNA配列である。
配列番号7はSorgum bicolor由来の3´UTR(T-Sb.Nltp4-1:1:2)のDNA配列である。
配列番号8はジャガイモ光誘導性組織特異的St-LS1遺伝子(Genbank Accession:X04753)由来のプロセシング可能なイントロンを有する、β-グルクロニダーゼ(GUS、GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1)の植物発現用に最適化された合成コード配列である。
本発明は、植物における遺伝子調節活性を有する調節エレメントを提供する。これらの調節エレメントのヌクレオチド配列は、配列番号1~5として提供される。これらの調節エレメントは、植物組織内で、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の発現に影響を及ぼし得、そのため、トランスジェニック植物内で、作動可能に連結された導入遺伝子の遺伝子発現を調節し得る。また、本発明は、提供される調節エレメントを含む組換えDNA分子を修飾、産生、及び使用する方法も提供する。また、本発明は、本発明の組換えDNA分子を含むトランスジェニック植物細胞、植物、植物の部位、及び種子を含む組成物、ならびにこれらを調製し使用するための方法も提供する。
以下の定義及び方法は、本発明をより良好に定義し、当業者が本発明を実施する指針とするために提供される。別途注記のない限り、用語は、関連技術分野の当業者により、従来の用法に従って理解されるものとする。
DNA分子
本明細書で使用する場合、「DNA」または「DNA分子」という用語は、5´(上流)末端から3´(下流)末端へと読み取られる、ゲノム起源または合成起源の2本鎖DNA分子(すなわち、デオキシリボヌクレオチド塩基またはDNA分子のポリマー)を指す。本明細書で使用する場合、「DNA配列」という用語は、DNA分子のヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される命名法は、米国連邦規則集37編1.822条の命名法に対応し、WIPO標準ST.25(1998)附属書2、表1及び3の表に定められる。
本明細書で使用する場合、「DNA」または「DNA分子」という用語は、5´(上流)末端から3´(下流)末端へと読み取られる、ゲノム起源または合成起源の2本鎖DNA分子(すなわち、デオキシリボヌクレオチド塩基またはDNA分子のポリマー)を指す。本明細書で使用する場合、「DNA配列」という用語は、DNA分子のヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される命名法は、米国連邦規則集37編1.822条の命名法に対応し、WIPO標準ST.25(1998)附属書2、表1及び3の表に定められる。
本明細書で使用する場合、「組換えDNA分子」とは、人間の介入なしには天然に一緒に生じないであろうDNA分子の組合せを含むDNA分子である。例えば、組換えDNA分子とは、互いに対して異種である少なくとも2つのDNA分子から構成されているDNA分子、自然界に存在するDNA配列から逸脱するDNA配列を含むDNA分子、合成DNA配列を含むDNA分子、または遺伝子形質転換もしくは遺伝子編集によって宿主細胞のDNAに組み込まれたDNA分子であってもよい。
本出願における「単離されたDNA分子」、または等価の用語もしくは表現への言及は、DNA分子が、単独で、または他の組成物と組合せて存在するが、その自然環境内には存在しないものであることを意味するように意図されている。例えば、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列等のような、生物のゲノムのDNA内で天然に見出される核酸エレメントは、当該エレメントが生物のゲノム内にあり、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にある限りは、「単離された」とは見なされない。ただし、これらのエレメントの各々、及びこれらのエレメントの下位部分は、当該エレメントが生物のゲノム内になく、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にない限り、本開示の範囲内で「単離されている」ものである。同様に、殺虫性タンパク質またはそのタンパク質の天然に生じる任意の殺虫性バリアントをコードするヌクレオチド配列は、当該ヌクレオチド配列が、当該タンパク質をコードする配列が天然に見出される細菌のDNA内にない限り、単離されたヌクレオチド配列と考えられる。天然に存在する殺虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的において単離されていると見なされると考えられる。本開示の目的において、任意のトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞のゲノム内に挿入されるか、または染色体外ベクター内に存在するDNAのヌクレオチド配列は、それが、細胞の形質転換に使用されるプラスミドもしくは同様の構造内に存在しても、植物もしくは細菌のゲノム内に存在しても、または植物もしくは細菌に由来する組織、後代、生物学的試料、もしくは商品生産物の中に検出可能量で存在しても、単離されたヌクレオチド配列であると見なされると考えられる。
本明細書で使用する場合、「配列同一性」という用語は、2つの最適にアラインメントしたポリヌクレオチド配列または2つの最適にアラインメントしたポリペプチド配列が同一である程度を指す。最適な配列アラインメントは、2つの配列、例えば、参照配列ともう1つの配列とを手動でアラインメントして、適切な内部ヌクレオチド挿入、欠失、またはギャップを伴った配列アラインメント内のヌクレオチドマッチ数を最大化することによって作出される。本明細書で使用する場合、「参照配列」という用語は、配列番号1~5として提供されるDNA配列を指す。
本明細書で使用する場合、「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」または「同一性%」という用語は、同一性の割合に100を掛けたものである。参照配列に対して最適にアラインメントした配列についての「同一性の割合」は、最適アラインメント内のヌクレオチドマッチ数を、参照配列内のヌクレオチド総数、例えば、全長の参照配列全体のヌクレオチド総数で割ったものである。故に、本発明の1つの実施形態は、本明細書で配列番号1~5として提供される参照配列に対して最適にアラインメントした場合に、参照配列に対して少なくとも約85パーセントの同一性、少なくとも約86パーセントの同一性、少なくとも約87パーセントの同一性、少なくとも約88パーセントの同一性、少なくとも約89パーセントの同一性、少なくとも約90パーセントの同一性、少なくとも約91パーセントの同一性、少なくとも約92パーセントの同一性、少なくとも約93パーセントの同一性、少なくとも約94パーセントの同一性、少なくとも約95パーセントの同一性、少なくとも約96パーセントの同一性、少なくとも約97パーセントの同一性、少なくとも約98パーセントの同一性、少なくとも約99パーセントの同一性、または少なくとも約100パーセントの同一性を有する配列を含む、DNA分子を提供する。
調節エレメント
プロモーター、リーダー(別名、5´UTR)、エンハンサー、イントロン、及び転写終結領域(または3´UTR)等の調節エレメントは、生細胞内での遺伝子の全体的発現において不可欠な役割を果たす。本明細書で使用する場合、「調節エレメント」という用語は、遺伝子調節活性を有するDNA分子を指す。本明細書で使用する場合、「遺伝子調節活性」という用語は、例えば、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の転写及び/または翻訳に影響を及ぼすことにより、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の発現に影響を及ぼす能力を指す。植物において機能するプロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン、及び3´UTR等の調節エレメントは、遺伝子工学による植物の表現型の修飾に有用である。
プロモーター、リーダー(別名、5´UTR)、エンハンサー、イントロン、及び転写終結領域(または3´UTR)等の調節エレメントは、生細胞内での遺伝子の全体的発現において不可欠な役割を果たす。本明細書で使用する場合、「調節エレメント」という用語は、遺伝子調節活性を有するDNA分子を指す。本明細書で使用する場合、「遺伝子調節活性」という用語は、例えば、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の転写及び/または翻訳に影響を及ぼすことにより、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の発現に影響を及ぼす能力を指す。植物において機能するプロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン、及び3´UTR等の調節エレメントは、遺伝子工学による植物の表現型の修飾に有用である。
本明細書で使用する場合、「調節発現エレメント群」または「EXP」配列とは、作動可能に連結された調節エレメント群、例えば、エンハンサー、プロモーター、リーダー、及びイントロンの群を指し得る。例えば、調節発現エレメント群は、例えば、イントロン配列に対して5´側に作動可能に連結されたリーダー配列に対して5´側に作動可能に連結されたプロモーターから構成され得る。本発明を実施するのに有用なEXPは、配列番号1として提示されている。
調節エレメントは、それらの遺伝子発現パターン、例えば、正及び/または負の効果、例えば、恒常的発現または時間的、空間的、発達的、組織、環境的、生理学的、病理学的、細胞周期、及び/もしくは化学的応答性の発現、ならびにそれらの任意の組合せ、加えて定量的または定性的指標によって特徴付けられ得る。本明細書で使用する場合、「遺伝子発現パターン」とは、作動可能に連結されたDNA分子が転写RNA分子へと転写される任意のパターンである。転写されたRNA分子は、翻訳されてタンパク質分子を生み出す場合もあれば、アンチセンスRNAまたは他の調節RNA分子、例えば、二本鎖RNA(dsRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)等をもたらす場合もある。
本明細書で使用する場合、「タンパク質発現」という用語は、転写RNA分子がタンパク質分子へと翻訳される任意のパターンである。タンパク質発現は、その時間的、空間的、発達的、または形態学的な性質によって、加えて定量的または定性的指標によって特徴付けられ得る。
プロモーターは、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の発現を調整するための調節エレメントとして有用である。本明細書で使用する場合、「プロモーター」という用語は、一般に、転写を開始するためにRNAポリメラーゼII及び他のタンパク質(例えば、トランス作用転写因子)の認識及び結合に関与するDNA分子を指す。プロモーターは、ゲノム遺伝子コピーの5´非翻訳領域(5´UTR)から初期に単離され得るか、または本開示の目的において、本明細書で提供されるプロモーターは、リーダーに対して5´側に作動可能に連結されたプロモーターから構成される。代替的に、プロモーターは、合成的に生産または操作されたDNA分子であってもよい。また、プロモーターはキメラであってもよい。キメラプロモーターは、2つ以上の異種DNA分子の融合により生産される。本発明を実施するのに有用なプロモーターは、配列番号2として提示されているか、またはそのフラグメントもしくはバリアントである。本発明の特定の実施形態において、本明細書で説明される、特許請求の範囲のDNA分子及びその任意のバリアントまたは誘導体はさらに、プロモーター活性を含むものとして定義され、すなわち、トランスジェニック植物などの宿主細胞内でプロモーターとして作用し得る。なおさらなる特定の実施形態において、フラグメントは、それが由来する開始プロモーター分子が有するプロモーター活性を示すものとして定義される場合もあれば、フラグメントは、基礎レベルの転写をもたらし、転写開始するためにRNAポリメラーゼII複合体が認識及び結合するためのTATAボックスまたは同等のDNA配列から構成された「最小プロモーター」を含む場合もある。
1つの実施形態において、本明細書で開示されるプロモーター配列のフラグメントが提供される。プロモーターフラグメントは、上記のようなプロモーター活性を含み得、また、単独で、または(例えば、キメラプロモーターを構築する際の)他のプロモーター及びプロモーターフラグメントとの組合せで、または他の発現エレメント及び発現エレメントのフラグメントとの組合せで有用であり得る。特定の実施形態において、少なくとも約50、少なくとも約75、少なくとも約95、少なくとも約100、少なくとも約125、少なくとも約150、少なくとも約175、少なくとも約200、少なくとも約225、少なくとも約250、少なくとも約275、少なくとも約300、少なくとも約500、少なくとも約600、少なくとも約700、少なくとも約750、少なくとも約800、少なくとも約900、または少なくとも約1000の連続したヌクレオチド、またはそれ以上の、本明細書で開示されるプロモーター活性を有するDNA分子を含む、プロモーターのフラグメントが提供される。開始プロモーター分子からこのようなフラグメントを産生するための方法は、当該技術分野で周知である。
配列番号2のプロモーターエレメント(例えば、内部もしくは5´欠失)に由来する組成物は、例えば、発現を改善または改変するために、発現に正もしくは負いずれかの効果を及ぼすエレメントの除去、発現に正もしくは負の効果を及ぼすエレメントの重複、及び/または発現に組織特異的もしくは細胞特異的な効果を及ぼすエレメントの重複もしくは除去を含む、当該技術分野で公知の方法を用いて産生され得る。配列番号2のプロモーターエレメント(TATAボックスエレメントもしくはその同等の配列及び下流配列が除去されている3´欠失から構成される)に由来する組成物を使用して、例えば、エンハンサーエレメントを作製し得る。さらなる欠失を行って、発現に正または負の組織特異的、細胞特異的、または時間特異的な(例えば、限定されるものではないが、概日リズム)効果を及ぼす任意のエレメントを除去することができる。配列番号2として提供されるプロモーターエレメント、ならびにそれに由来するフラグメントもしくはエンハンサーを使用して、キメラ転写調節エレメント組成物を作製し得る。
本発明によれば、プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、公知のプロモーターエレメント、すなわち、TATAボックス及び他の公知の転写因子結合部位モチーフなどのDNA配列特性の存在について解析されることがある。このような公知のプロモーターエレメントの識別情報は、当業者により、元のプロモーターと同様の発現パターンを有するプロモーターのバリアントを設計するために使用され得る。
本明細書で使用する場合、「リーダー」という用語は、遺伝子の非翻訳5´領域(5´UTR)から単離され、転写開始部位(TSS)とタンパク質コード配列開始部位との間のヌクレオチドセグメントとして一般に定義される、DNA分子を指す。代替的に、リーダーは、合成的に産生または操作されたDNAエレメントであってもよい。リーダーは、作動可能に連結されている転写可能なDNA分子の発現を調整するための5´調節エレメントとして使用され得る。リーダー分子は、異種プロモーターまたはそれらのネイティブプロモーターと共に使用されてもよい。本発明を実施するのに有用なリーダーは、配列番号3として提示されているか、またはそのフラグメントもしくはバリアントである。特定の実施形態において、このようなDNA配列は、宿主細胞(例えば、トランスジェニック植物細胞を含む)内でリーダーとして作用し得ると定義され得る。1つの実施形態において、このような配列は、リーダー活性を含むものとしてデコードされる。
配列番号3のリーダー配列(5´UTRとも称される)は、調節エレメントから構成される場合もあれば、または作動可能に連結された転写可能なDNA分子の転写もしくは翻訳に効果を及ぼし得る二次構造を採用する場合もある。配列番号3のリーダー配列を本発明に従って使用して、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の転写または翻訳に影響を与えるキメラ調節エレメントを作製し得る。
本明細書で使用する場合、「イントロン」という用語は、遺伝子から単離または同定され得、翻訳前のメッセンジャーRNA(mRNA)プロセシング中にスプライシング除去される領域として一般に定義され得る、DNA分子を指す。代替的に、イントロンは、合成的に生成または操作されたDNAエレメントであってもよい。イントロンは、作動可能に連結された遺伝子の転写をもたらすエンハンサーエレメントを含んでもよい。イントロンは、作動可能に連結されている転写可能なDNA分子の発現を調整するための調節エレメントとして使用され得る。構築物はイントロンを含んでもよく、このイントロンは、転写可能なDNA分子に対して異種である場合もそうでない場合もある。当該技術分野におけるイントロンの例としては、イネのアクチンイントロン及びトウモロコシのHSP70イントロンが挙げられる。
植物では、遺伝子構築物にいくつかのイントロンを含めると、イントロンを欠く構築物と比較して、mRNA及びタンパク質の蓄積が増加する。この効果は、遺伝子発現の「イントロン媒介増強」(IME)と称されている。植物での発現を刺激することが公知のイントロンは、トウモロコシ遺伝子(例えば、tubA1、Adh1、Sh1、及びUbi1)、イネ遺伝子(例えば、tpi)、ならびにペチュニア(例えば、rbcS)、ジャガイモ(例えば、st-ls1)由来、及びArabidopsis thaliana(例えば、ubq3及びpat1)由来の遺伝子のような双子葉植物遺伝子で同定されている。イントロンのスプライス部位内の欠失または変異によって遺伝子発現が低減することが示されており、このことは、IMEにはスプライシングが必要であり得ることを示すものである。ただし、双子葉植物でのIMEは、A.thalianaのpat1遺伝子のスプライス部位内における点変異によって示されている。1つの植物における同じイントロンの複数回使用は、デメリットを呈することが示されている。このような場合、適切な組換えDNAエレメントを構築するために、基本的な制御エレメントを集めることが必要になる。本発明を実施するのに有用な例示的なイントロンは、配列番号4として提示されている。
本明細書で使用する場合、「3´転写終結分子」、「3´非翻訳領域」、または「3´UTR」という用語は、mRNA分子の3´部分の非翻訳領域への転写中に使用されるDNA分子を指す。mRNA分子の3´非翻訳領域は、特異的切断及び3´ポリアデニル化(ポリAテールとしても公知)によって生成され得る。3´UTRは、転写可能なDNA分子に作動可能に連結され、その下流に位置し得、転写、mRNAプロセシング、または遺伝子発現に影響を及ぼし得るポリアデニル化シグナル及びその他の調節シグナルを含んでもよい。ポリAテールは、mRNAの安定性及び翻訳の開始において機能すると考えられている。当該技術分野における3´転写終結分子の例は、ノパリンシンターゼ3´領域、コムギhsp17 3´領域、エンドウルビスコ小サブユニット3´領域、ワタE6 3´領域、及びコイクシン(coixin)3´UTRである。
典型的には、3´UTRが特定のDNA分子の組換え発現に用いるのに有益であることが認められている。弱い3´UTRはリードスルーを生じる可能性を有し、このリードスルーにより、隣接する発現カセット内にあるDNA分子の発現に影響が及ぶ恐れがある。転写終結を適切に制御することで、下流に局在するDNA配列(例えば、他の発現カセット)へのリードスルーを防ぐことができ、さらにRNAポリメラーゼを効率的にリサイクルして遺伝子発現を向上させることができる。転写の効率的な終結(DNAからのRNAポリメラーゼIIの遊離)は転写の再開に必要な条件であり、そのため全体の転写レベルに直接影響する。転写終結に続いて、成熟mRNAが合成部位から遊離され、鋳型が細胞質に輸送される。真核生物のmRNAは、in vivoでポリ(A)形態として蓄積され、従来の方法で転写終結部位を検出することが困難になる。もっとも、バイオインフォマティクス法による機能的かつ効率的な3´UTRの予測は、有効な3´UTRを容易に予測させるはずの保存されたDNA配列が存在しない点で困難である。
実際的な観点から、典型的には、発現カセットで使用される3´UTRが以下の特徴を有することは有益である。最初に、3´UTRは、導入遺伝子の転写を効率的かつ有効に終結できるべきであり、かつ、1つの転移DNA(T-DNA)内に存在する複数の発現カセットの場合のように別の発現カセットから構成され得る任意の隣接するDNA配列、またはT-DNAを挿入した隣接する染色体DNAへの転写物のリードスルーを防止できるべきである。次に、3´UTRは、DNA分子の発現を促進するために使用されるプロモーター、リーダー、エンハンサー、及びイントロンが付与する転写活性の低減を引き起こすべきではない。最後に、植物のバイオテクノロジーにおいて、3´UTRは、形質転換植物から抽出された逆転写RNAの増幅反応のプライミングに使用されることが多く、そして、(1)植物染色体に一旦組み込まれた発現カセットの転写活性または発現を評価すること、(2)植物DNA内の挿入物のコピー数を評価すること、及び(3)育種後に得られた種子の接合性を評価することに使用される。また、3´UTRは、挿入されたカセットのインタクト性を特徴付けるために、形質転換植物から抽出されたDNAの増幅反応にも使用される。本発明を実施するのに有用な3´UTRは、配列番号5として提示されている。
本明細書で使用する場合、「エンハンサー」または「エンハンサーエレメント」という用語は、シス作用調節エレメント(別名、シスエレメント)を指し、これは、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の全体的発現パターンの一側面(ただし通常、単独では転写の駆動に不十分である)を付与する。プロモーターとは異なり、通常、エンハンサーエレメントには、転写開始部位(TSS)もしくはTATAボックス、または同等のDNA配列は含まれていない。プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、天然に、作動可能に連結されたDNA配列の転写に影響を及ぼす1つ以上のエンハンサーエレメントを含んでもよい。また、エンハンサーエレメントをプロモーターと融合させて、遺伝子発現の全体的調整の一側面を付与するキメラプロモーターシスエレメントを生み出してもよい。
多くのプロモーターエンハンサーエレメントは、DNA結合タンパク質に結合するか、及び/またはDNAトポロジーに影響を及ぼして、RNAポリメラーゼのDNA鋳型へのアクセスを選択的に許可もしくは制限する局所的立体構造、または転写開始部位での二重らせんの選択的開放を促進する局所的立体構造を生成すると考えられている。エンハンサーエレメントは、転写を調節する転写因子に結合するように機能し得る。いくつかのエンハンサーエレメントは2つ以上の転写因子に結合し、転写因子は、異なる親和性で2つ以上のエンハンサードメインと相互作用し得る。エンハンサーエレメントの同定は、欠失解析(すなわち、プロモーターに対する5´末端もしくは内部から1つ以上のヌクレオチドを欠失させる)や、DNaseIフットプリント法を用いたDNA結合タンパク質解析、メチル化干渉、電気泳動移動度シフトアッセイ、ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるin vivoゲノムフットプリント法、及びその他の従来的なアッセイを含めた複数の技法によって行うか、または、BLASTなどの従来のDNA配列比較法による、標的配列もしくは標的モチーフとして公知のシスエレメントモチーフもしくはエンハンサーエレメントを用いたDNA配列類似性解析によって行うことができる。エンハンサードメインの微細構造は、1つ以上のヌクレオチドの変異誘発(もしくは置換)により、または当該技術分野で公知の他の従来的な方法により、さらに研究され得る。エンハンサーエレメントは、化学合成により、またはこのようなエレメントを含む調節エレメントからの単離により得ることができ、これらは、部分配列の操作を容易にするための有用な制限酵素部位を含む追加の隣接ヌクレオチドと共に合成され得る。したがって、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の発現を調整するための、本明細書で開示される方法に従ったエンハンサーエレメントの設計、構築、及び使用は、本発明に包含される。エンハンサーは、配列番号2として提示されているプロモーターに由来し得る。
本明細書で使用する場合、「キメラ」という用語は、第1のDNA分子を第2のDNA分子と融合させることによって産生される単一のDNA分子を指し、第1のDNA分子も第2のDNA分子も、通常はこの構成(すなわち、他方と融合した構成)では見出されない。したがって、キメラDNA分子は、他の方法では通常は自然界に見出されない新規のDNA分子である。本明細書で使用する場合、「キメラプロモーター」という用語は、このようなDNA分子の操作によって産生されたプロモーターを意味する。キメラプロモーターは、2つ以上のDNAフラグメントを組合せる(例えば、プロモーターをエンハンサーエレメントと融合させる)ことができる。したがって、作動可能に結合した転写可能なDNA分子の発現を調整するための、本明細書で開示される方法に従ったキメラプロモーターの設計、構築、及び使用は、本発明に包含される。
キメラ調節エレメントは、当該技術分野で公知の様々な方法、例えば、制限酵素消化及びライゲーション、ライゲーション非依存的クローニング、増幅中のPCR産物のモジュラーアセンブリ、または調節エレメントの直接化学合成、ならびに当該技術分野で公知のその他の方法によって、作動可能に連結され得る様々な構成エレメントを含むように設計され得る。得られる様々なキメラ調節エレメントは、同じ構成エレメントまたは同じ構成エレメントのバリアントから構成されてもよいが、構成部分が作動可能に連結するのを可能にする連結DNA配列(複数可)を含むDNA配列(複数可)が異なる。本発明において、配列番号1~5として提供されるDNA配列は、調節エレメント参照配列を提供する場合があり、このとき、参照配列を構成する構成エレメントは、当該技術分野で公知の方法によって連結されてもよく、また、細菌及び植物細胞の形質転換で天然に生じる1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、及び/または挿入、あるいは変異を含んでもよい。
本明細書で使用する場合、「バリアント」という用語は、組成が第1のDNA分子と類似しているが同一ではない第2のDNA分子、例えば、調節エレメントを指し、このとき、第2のDNA分子は、例えば、第1のDNA分子とおおよそ同等の転写活性によって、そのDNA分子の一般的な機能性、すなわち、同じまたは同様の発現パターンを依然として維持する。バリアントは、第1のDNA分子のより短いもしくは短縮バージョン、または第1のDNA分子の配列の改変バージョン、例えば、制限酵素部位が異なる、及び/または内部の欠失、置換、もしくは挿入を有するバージョンであり得る。また、「バリアント」は、参照配列の1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入を含むヌクレオチド配列を有する調節エレメントも包含し得、このとき、誘導体調節エレメントは、対応する親調節分子よりも大きいかもしくは小さいかまたは同等の転写もしくは翻訳活性を有する。また、調節エレメント「バリアント」は、細菌及び植物細胞の形質転換で天然に生じる変異から生じるバリアントも包含する。本発明において、配列番号1~5として提供されるポリヌクレオチド配列を使用して、元の調節エレメントのDNA配列と組成が類似するが同一ではなく、一方で元の調節エレメントの一般的な機能性、すなわち、同じまたは同様の発現パターンを依然として維持する、バリアントを創出し得る。本発明のかかるバリアントの生産は、本開示に照らして当業者の技能範囲内に十分にあり、本発明の範囲内に包含される。
特定の導入遺伝子の望ましい発現態様に対する、本明細書で説明される修飾、重複、または欠失の効力は、結果を検証するために本明細書の研究実施例において説明されるものなど、安定し、かつ一過性の植物アッセイにおいて実験により検査してもよく、当該効力は、出発DNA分子においてなされた変更及び変更の目的に応じて変わり得る。
構築物
本明細書で使用する場合、「構築物」という用語は、少なくとも1つのDNA分子が別のDNA分子に機能的に作動可能な様式で連結されている、すなわち作動可能に連結されたDNA分子を含む、ゲノム組み込みまたは自己複製が可能な、任意の源に由来する、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または直鎖もしくは環状DNA分子もしくはRNA分子などの任意の組換えDNA分子を意味する。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、形質転換、すなわち、宿主細胞中に異種DNAまたはRNAを導入する目的で使用され得る、任意の構築物を意味する。構築物は、典型的には、1つ以上の発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「発現カセット」とは、1つ以上の調節エレメント、典型的には少なくともプロモーター及び3´UTRと作動可能に連結された、少なくとも1つの転写可能なDNA分子を含む組換えDNA分子を指す。
本明細書で使用する場合、「構築物」という用語は、少なくとも1つのDNA分子が別のDNA分子に機能的に作動可能な様式で連結されている、すなわち作動可能に連結されたDNA分子を含む、ゲノム組み込みまたは自己複製が可能な、任意の源に由来する、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または直鎖もしくは環状DNA分子もしくはRNA分子などの任意の組換えDNA分子を意味する。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、形質転換、すなわち、宿主細胞中に異種DNAまたはRNAを導入する目的で使用され得る、任意の構築物を意味する。構築物は、典型的には、1つ以上の発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「発現カセット」とは、1つ以上の調節エレメント、典型的には少なくともプロモーター及び3´UTRと作動可能に連結された、少なくとも1つの転写可能なDNA分子を含む組換えDNA分子を指す。
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、第2のDNA分子に連結した第1のDNA分子を指し、ここで、第1及び第2のDNA分子は、第1のDNA分子が第2のDNA分子の機能に影響するよう配置される。2つのDNA分子は、単一の連続したDNA分子の一部である場合もそうでない場合もあり、隣接する場合もそうでない場合もある。例えば、プロモーターが細胞内の目的の転写可能なDNA分子の転写を調整する場合、このプロモーターは転写可能なDNA分子と作動可能に連結されている。例えば、リーダーは、DNA配列の転写または翻訳に影響を及ぼすことができる場合、DNA配列に作動可能に連結されている。
本発明の構築物は、1つの実施形態において、A.tumefaciens細胞がもたらす転移分子と共に、T-DNAの植物細胞ゲノム内への統合を可能にするT-DNAを含む、Agrobacterium tumefaciensから単離されたTiプラスミドの右側境界(RBまたはAGRtu.RB)及び左側境界(LBまたはAGRtu.LB)領域を有する二重腫瘍誘導(Ti)プラスミド境界構築物として提供され得る(例えば、米国特許第6,603,061号を参照)。また、構築物は、細菌細胞における複製機能及び抗生物質選択をもたらすプラスミド骨格DNAセグメント、例えば、ori322などのEscherichia coli複製開始点、oriVまたはoriRiなどの広宿主域複製開始点、及びスペクチノマイシンもしくはストレプトマイシンに対する抵抗性を付与するTn7アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ(aadA)をコードするSpec/Strpなどの選択マーカー、またはゲンタマイシン(Gm、Gent)選択マーカー遺伝子についてのコード領域も含んでもよい。植物形質転換については、宿主細菌株は、多くの場合A.tumefaciens ABI、C58、またはLBA4404であるが、植物形質転換の技術分野において当業者に公知のその他の株も、本発明では機能し得る。
転写可能なDNA分子が、タンパク質として翻訳及び発現される機能的mRNA分子に転写されるような方式で、構築物を集成し細胞内に導入するための方法が、当該技術分野で公知である。本発明の実施に関して、構築物及び宿主細胞を調製及び使用するための従来的な組成物及び方法は、当業者に周知である。より高等な植物内での核酸の発現に有用である典型的なベクターは当該技術分野で周知であり、これにはAgrobacterium tumefaciensのTiプラスミドに由来するベクター及びpCaMVCN導入制御ベクターが含まれる。
本明細書で提供される任意の調節エレメントを含めた様々な調節エレメントを構築物に含んでもよい。任意のこのような調節エレメントは、他の調節エレメントと組合せて提供され得る。このような組合せは、望ましい調節機能をもたらすように設計または修飾され得る。1つの実施形態において、本発明の構築物は、3´UTRと作動可能に連結された転写可能なDNA分子と作動可能に連結された、少なくとも1つの調節エレメントを含む。
本発明の構築物は、本明細書で提供されるか、または当該技術分野で公知である任意のプロモーターまたはリーダーを含んでもよい。例えば、本発明のプロモーターは、異種の非翻訳5´リーダー(例えば、熱ショックタンパク質遺伝子に由来するもの)と作動可能に連結されてもよい。代替的に、本発明のリーダーは、異種プロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス35S転写物プロモーターに作動可能に連結されてもよい。
発現カセットはまた、作動可能に連結されたタンパク質が、特に葉緑体、白色体、もしくは他の色素体細胞小器官、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、液胞、または細胞外の位置に対し、細胞レベル以下で標的化するのに有用なペプチドをコードする、輸送ペプチドコード配列も含んでもよい。多くの葉緑体局在化タンパク質は、核遺伝子から前駆体として発現され、葉緑体輸送ペプチド(CTP)によって葉緑体に標的化される。このような単離された葉緑体タンパク質の例としては、限定されるものではないが、リブロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット(SSU)、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、集光性複合タンパク質I及びタンパク質II、チオレドキシンF、ならびにエノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ(EPSPS)に関連するものが挙げられる。葉緑体輸送ペプチドは、例えば、米国特許第7,193,133号で説明されている。非葉緑体タンパク質は、非葉緑体タンパク質をコードする導入遺伝子と作動可能に結合した異種CTPを発現させることにより、葉緑体を標的化させ得ることが実証されている。
転写可能なDNA分子
本明細書で使用する場合、「転写可能なDNA分子」という用語は、RNA分子に転写されることができる任意のDNA分子を指し、これには、タンパク質コード配列を有するもの、ガイドRNAをコードするもの、及び遺伝子抑制に有用な配列を有するRNA分子を生み出すものが含まれるが、これらに限定されない。DNA分子の種類には、同じ植物からのDNA分子、別の植物からのDNA分子、異なる生物からのDNA分子、あるいは合成DNA分子、例えば、遺伝子のアンチセンスメッセージを含むDNA分子、または導入遺伝子の人工、合成、もしくは別様の変更バージョンをコードするDNA分子が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の構築物に組み込むための例示的な転写可能なDNA分子としては、例えば、DNA分子を組み込む種以外の種由来のDNA分子もしくは遺伝子、または同じ種から生じるか、もしくは同じ種に存在するが、古典的な育種技法ではなく遺伝子工学の方法によってレシピエント細胞に組み込まれる遺伝子が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「転写可能なDNA分子」という用語は、RNA分子に転写されることができる任意のDNA分子を指し、これには、タンパク質コード配列を有するもの、ガイドRNAをコードするもの、及び遺伝子抑制に有用な配列を有するRNA分子を生み出すものが含まれるが、これらに限定されない。DNA分子の種類には、同じ植物からのDNA分子、別の植物からのDNA分子、異なる生物からのDNA分子、あるいは合成DNA分子、例えば、遺伝子のアンチセンスメッセージを含むDNA分子、または導入遺伝子の人工、合成、もしくは別様の変更バージョンをコードするDNA分子が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の構築物に組み込むための例示的な転写可能なDNA分子としては、例えば、DNA分子を組み込む種以外の種由来のDNA分子もしくは遺伝子、または同じ種から生じるか、もしくは同じ種に存在するが、古典的な育種技法ではなく遺伝子工学の方法によってレシピエント細胞に組み込まれる遺伝子が挙げられる。
「導入遺伝子」とは、少なくとも宿主細胞ゲノム内の位置に関して宿主細胞に対して異種である転写可能なDNA分子、及び/または細胞の現行世代もしくは任意の過去の世代に宿主細胞のゲノムに人工的に組み込まれた転写可能なDNA分子を指す。
本発明のプロモーター等の調節エレメントは、調節エレメントに対して異種である転写可能なDNA分子に作動可能に連結されてもよい。本明細書で使用する場合、「異種」という用語は、2つ以上のDNA分子の組合せにおいて、かかる組合せが自然界で通常は見出されない場合を指す。例えば、2つのDNA分子は異なる種に由来してもよく、及び/または2つのDNA分子は異なる遺伝子に由来してもよい(例えば、同じ種由来の異なる遺伝子、または異なる種由来の同じ遺伝子)。故に、調節エレメントは、作動可能に連結された転写可能なDNA分子に対して、かかる組合せが自然界で通常は見出されない場合、すなわち、転写可能なDNA分子が、調節エレメントに作動可能に連結されて天然に生じない場合、異種である。
転写可能なDNA分子は、概して、転写物の発現が所望される任意のDNA分子であり得る。このような転写物の発現により、結果として生じるmRNA分子の翻訳、したがってタンパク質発現がもたらされ得る。代替的に、例えば、転写可能なDNA分子は、特定の遺伝子またはタンパク質の発現低下を最終的に引き起こすように設計され得る。1つの実施形態において、これは、アンチセンス方向に配向した転写可能なDNA分子を使用することによって達成され得る。当業者は、かかるアンチセンス技術の使用に精通している。この様態で任意の遺伝子を負に調節してもよく、1つの実施形態では、転写可能なDNA分子は、dsRNA、siRNA、またはmiRNA分子の発現を介して特定の遺伝子を抑制するように設計されてもよい。
したがって、本発明の1つの実施形態は、構築物がトランスジェニック植物細胞のゲノムに統合されたときに、転写可能なDNA分子の転写を所望のレベルまたは所望のパターンで調整するように異種の転写可能なDNA分子と作動可能に連結されている、配列番号1~5として提供されるものなど、本発明の調節エレメントを含む組換えDNA分子である。1つの実施形態において、転写可能なDNA分子は遺伝子のタンパク質コード領域を含み、別の実施形態において、転写可能なDNA分子は遺伝子のアンチセンス領域を含む。
農学的目的の遺伝子
転写可能なDNA分子は、農学的目的の遺伝子であり得る。本明細書で使用する場合、「農学的目的の遺伝子」という用語は、特定の植物組織、細胞、または細胞タイプで発現したときに、望ましい特性を付与する転写可能なDNA分子を指す。農学的目的の遺伝子の産物は、植物の形態、生理学、成長、発達、収量、穀粒組成、栄養プロファイル、病害もしくは害虫抵抗性、及び/または環境的もしくは化学的耐性に対する効果を引き起こすために植物内で作用する場合もあれば、植物を常食とする害虫の餌で殺虫剤として作用する場合もある。本発明の1つの実施形態において、本発明の調節エレメントは、この調節エレメントが、農学的目的の遺伝子である転写可能なDNA分子と作動可能に連結するように、構築物内に組み込まれる。このような構築物を含むトランスジェニック植物において、農学的目的の遺伝子の発現は、有益な農学的形質を付与し得る。有益な農学的形質としては、例えば、限定されるものではないが、除草剤耐性、昆虫防除、改変された収量、疾患抵抗性、病原体抵抗性、改変された植物成長及び発達、改変されたデンプン含量、改変された油含量、改変された脂肪酸含量、改変されたタンパク質含量、改変された果実成熟、動物及びヒトの栄養強化、生体高分子産生、環境ストレス抵抗性、医薬品ペプチド、加工品質の改善、風味の改善、ハイブリッド種子産生有用性、繊維産生の改善、炭素隔離の増強、ならびに望ましいバイオ燃料産生を挙げることができる。
転写可能なDNA分子は、農学的目的の遺伝子であり得る。本明細書で使用する場合、「農学的目的の遺伝子」という用語は、特定の植物組織、細胞、または細胞タイプで発現したときに、望ましい特性を付与する転写可能なDNA分子を指す。農学的目的の遺伝子の産物は、植物の形態、生理学、成長、発達、収量、穀粒組成、栄養プロファイル、病害もしくは害虫抵抗性、及び/または環境的もしくは化学的耐性に対する効果を引き起こすために植物内で作用する場合もあれば、植物を常食とする害虫の餌で殺虫剤として作用する場合もある。本発明の1つの実施形態において、本発明の調節エレメントは、この調節エレメントが、農学的目的の遺伝子である転写可能なDNA分子と作動可能に連結するように、構築物内に組み込まれる。このような構築物を含むトランスジェニック植物において、農学的目的の遺伝子の発現は、有益な農学的形質を付与し得る。有益な農学的形質としては、例えば、限定されるものではないが、除草剤耐性、昆虫防除、改変された収量、疾患抵抗性、病原体抵抗性、改変された植物成長及び発達、改変されたデンプン含量、改変された油含量、改変された脂肪酸含量、改変されたタンパク質含量、改変された果実成熟、動物及びヒトの栄養強化、生体高分子産生、環境ストレス抵抗性、医薬品ペプチド、加工品質の改善、風味の改善、ハイブリッド種子産生有用性、繊維産生の改善、炭素隔離の増強、ならびに望ましいバイオ燃料産生を挙げることができる。
当該技術分野で公知である農学的目的の遺伝子の例としては、除草剤抵抗性(米国特許第6,803,501号;第6,448,476号;第6,248,876号;第6,225,114号;第6,107,549号;第5,866,775号;第5,804,425号;第5,633,435号;及び第5,463,175号)、収量増加(米国特許第USRE38,446号;第6,716,474号;第6,663,906号;第6,476,295号;第6,441,277号;第6,423,828号;第6,399,330号;第6,372,211号;第6,235,971号;第6,222,098号;及び第5,716,837号)、昆虫防除(米国特許第6,809,078号;第6,713,063号;第6,686,452号;第6,657,046号;第6,645,497号;第6,642,030号;第6,639,054号;第6,620,988号;第6,593,293号;第6,555,655号;第6,538,109号;第6,537,756号;第6,521,442号;第6,501,009号;第6,468,523号;第6,326,351号;第6,313,378号;第6,284,949号;第6,281,016号;第6,248,536号;第6,242,241号;第6,221,649号;第6,177,615号;第6,156,573号;第6,153,814号;第6,110,464号;第6,093,695号;第6,063,756号;第6,063,597号;第6,023,013号;第5,959,091号;第5,942,664号;第5,942,658号;5,880,275号;第5,763,245号;及び第5,763,241号)、真菌病害抵抗性(米国特許第6,653,280号;第6,573,361号;第6,506,962号;第6,316,407号;第6,215,048号;第5,516,671号;第5,773,696号;第6,121,436号;第6,316,407号;及び第6,506,962号)、ウイルス抵抗性(米国特許第6,617,496号;第6,608,241号;第6,015,940号;第6,013,864号;第5,850,023号;及び第5,304,730号)、線虫抵抗性(米国特許第6,228,992号)、細菌病害抵抗性(米国特許第5,516,671号)、植物成長及び発達(米国特許第6,723,897及び第6,518,488号)、デンプン産生(米国特許第6,538,181号;第6,538,179号;第6,538,178号;第5,750,876号;及び第6,476,295号)、改変された油産生(米国特許第6,444,876号;第6,426,447号;第6,380,462号)、高い油産生(米国特許第6,495,739号;第5,608,149号;第6,483,008号;第6,476,295号)、改変された脂肪酸含量(米国特許第6,828,475号;第6,822,141号;第6,770,465号;第6,706,950号;第6,660,849号;第6,596,538号;第6,589,767号;第6,537,750号;第6,489,461号;第6,459,018号)、高いタンパク質産生(米国特許第6,380,466号)、果実成熟(米国特許第5,512,466号)、動物及びヒトの栄養強化(米国特許第6,723,837号;第6,653,530号;第6,5412,59号;第5,985,605号;第6,171,640号)、生体高分子(米国特許第USRE37,543号;第6,228,623号;第5,958,745号、及び第6,946,588号)、環境ストレス抵抗性(米国特許第6,072,103号)、医薬ペプチド及び分泌性ペプチド(米国特許第6,812,379号;第6,774,283号;第6,140,075号;及び第6,080,560号)、プロセシング形質の改善(米国特許第6,476,295号)、消化率の改善(米国特許第6,531,648号)、低いラフィノース(米国特許第6,166,292号)、工業用酵素産生(米国特許第5,543,576号)、風味の改善(米国特許第6,011,199号)、窒素固定(米国特許第5,229,114号)、ハイブリッド種子産生(米国特許第5,689,041号)、繊維産生(米国特許第6,576,818号;第6,271,443号;第5,981,834号;及び第5,869,720号)、ならびにバイオ燃料産生(米国特許第5,998,700号)が挙げられる。
代替的に、農学的目的の遺伝子は、内在的遺伝子の遺伝子発現の標的化された調整を引き起こすRNA分子をコードすることにより、例えば、アンチセンス(例えば、米国特許5,107,065号を参照)、阻害RNA(「RNAi」;例えば、米国出願公開第2006/0200878号及び同第2008/0066206号、ならびに米国特許出願第11/974,469号で説明されているように、miRNA、siRNA、トランス作用siRNA、及びフェーズsRNAが媒介する機構による遺伝子発現の調整が含まれる)により、または共抑制が媒介する機構により、上記の植物の特性または表現型に影響を及ぼし得る。また、RNAは、所望の内在的mRNA産物を切断するように操作された触媒RNA分子(例えば、リボザイムまたはリボスイッチ;例えば、米国第2006/0200878号を参照)であってもよいと考えられる。転写可能なDNA分子が遺伝子抑制を引き起こし得る分子に転写されるような方式で、構築物を構築し細胞内に導入するための方法が、当該技術分野で公知である。
選択マーカー
選択マーカー導入遺伝子も、本発明の調節エレメントと共に使用されることがある。本明細書で使用する場合、「選択マーカー導入遺伝子」という用語は、トランスジェニック植物、組織、もしくは細胞内の発現、または発現の欠如が何らかの方法でスクリーニングまたはスコアリングされ得る、任意の転写可能なDNA分子を指す。本発明の実施において使用するための選択可能マーカー遺伝子、ならびにそれらの関連する選択及びスクリーニング技法は、当該技術分野で既知であり、これには、β-グルクロニダーゼ(GUS)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、抗生物質抵抗性を付与するタンパク質、及び除草剤抵抗性を付与するタンパク質をコードする転写可能なDNA分子が含まれるが、これらに限定されない。選択マーカー導入遺伝子の例は、配列番号8として提供される。
選択マーカー導入遺伝子も、本発明の調節エレメントと共に使用されることがある。本明細書で使用する場合、「選択マーカー導入遺伝子」という用語は、トランスジェニック植物、組織、もしくは細胞内の発現、または発現の欠如が何らかの方法でスクリーニングまたはスコアリングされ得る、任意の転写可能なDNA分子を指す。本発明の実施において使用するための選択可能マーカー遺伝子、ならびにそれらの関連する選択及びスクリーニング技法は、当該技術分野で既知であり、これには、β-グルクロニダーゼ(GUS)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、抗生物質抵抗性を付与するタンパク質、及び除草剤抵抗性を付与するタンパク質をコードする転写可能なDNA分子が含まれるが、これらに限定されない。選択マーカー導入遺伝子の例は、配列番号8として提供される。
ゲノム編集
いくつかの実施形態は、ゲノム改変を行うための部位特異的ゲノム修飾酵素及び/または任意の関連タンパク質(複数可)をコードする異種のDNA配列に作動可能に連結された、配列番号1~5のいずれかに対し少なくとも約85%の配列同一性を有する配列またはその断片を含む発現カセット(複数可)を含む、組換えDNA構築物に関する。これらのヌクレアーゼ発現カセット(複数可)は、テンプレート編集用のドナーテンプレートと同じ分子もしくはベクター内に(シス)、または別個の分子もしくはベクター上に(トランス)存在してもよい。ゲノムDNAを改変する、種々の配列特異的ゲノム修飾酵素(またはタンパク質及び/もしくはガイドRNAの複合体)に関わるいくつかの編集方法が、当該技術分野で公知である。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、所望のゲノム部位または遺伝子座において2本鎖切断(DSB)またはニックを誘発することによりゲノムを改変する。一部の実施形態では、ゲノム修飾酵素によって導入されたDSBまたはニックを修復するプロセス中に、ドナーテンプレートDNAが、DSB部位またはニック部位でゲノム内に組み込まれ得る。一部の実施形態では、ゲノム修飾酵素によって導入されたDSBまたはニックを修復するプロセス中に、挿入変異または欠失変異(インデル)がゲノム内に導入されてもよい。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、シチジンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、アデニンデアミナーゼを含む。本開示において、部位特異的ゲノム修飾酵素としては、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、デアミナーゼ、ヘリカーゼ、リバーストランスクリプターゼ及びそれらの任意の組合せが挙げられる。
いくつかの実施形態は、ゲノム改変を行うための部位特異的ゲノム修飾酵素及び/または任意の関連タンパク質(複数可)をコードする異種のDNA配列に作動可能に連結された、配列番号1~5のいずれかに対し少なくとも約85%の配列同一性を有する配列またはその断片を含む発現カセット(複数可)を含む、組換えDNA構築物に関する。これらのヌクレアーゼ発現カセット(複数可)は、テンプレート編集用のドナーテンプレートと同じ分子もしくはベクター内に(シス)、または別個の分子もしくはベクター上に(トランス)存在してもよい。ゲノムDNAを改変する、種々の配列特異的ゲノム修飾酵素(またはタンパク質及び/もしくはガイドRNAの複合体)に関わるいくつかの編集方法が、当該技術分野で公知である。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、所望のゲノム部位または遺伝子座において2本鎖切断(DSB)またはニックを誘発することによりゲノムを改変する。一部の実施形態では、ゲノム修飾酵素によって導入されたDSBまたはニックを修復するプロセス中に、ドナーテンプレートDNAが、DSB部位またはニック部位でゲノム内に組み込まれ得る。一部の実施形態では、ゲノム修飾酵素によって導入されたDSBまたはニックを修復するプロセス中に、挿入変異または欠失変異(インデル)がゲノム内に導入されてもよい。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、シチジンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、部位特異的ゲノム修飾酵素は、アデニンデアミナーゼを含む。本開示において、部位特異的ゲノム修飾酵素としては、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、デアミナーゼ、ヘリカーゼ、リバーストランスクリプターゼ及びそれらの任意の組合せが挙げられる。
いくつかの実施形態は、ゲノム編集システムの1つ以上の構成要素をコードする、異種の転写可能なDNA分子に作動可能に連結された、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントに関する。ゲノム編集システムは、宿主細胞のゲノムに、1つ以上の挿入、欠失、置換、塩基修飾、転座、または逆位を導入するために使用され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、CRISPR-Casエフェクタータンパク質、ジンクフィンガータンパク質、または転写活性化(TAL)タンパク質等の配列特異的DNA結合ドメインをコードする、異種の転写可能なDNA分子に作動可能に連結される。一部の実施形態では、配列特異的DNA結合ドメインは融合タンパク質であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、CRISPR-Casエフェクタータンパク質をコードする、異種の転写可能なDNA分子に作動可能に連結される。一部の実施形態では、CRISPR-Casエフェクタータンパク質は、Type I CRISPR-Casシステム、Type II CRISPR-Casシステム、Type III CRISPR-Casシステム、Type IV CRISPR-Casシステム、Type V CRISPR-Casシステム、またはType VI CRISPR-Casシステムから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、ガイドRNAをコードする、異種の転写可能なDNA分子に作動可能に連結される。本明細書で使用する場合、「ガイドRNA」または「gRNA」は、標的DNA配列を認識し、CRISPRエフェクタータンパク質を標的DNA配列に導く、または「ガイドする」RNAを指す。ガイドRNAは、標的DNAと相補的である領域(crRNAと称される)及びCRISPRエフェクタータンパク質と結合する領域(tracrRNAと称される)から構成される。ガイドRNAは、単一のRNA分子(sgRNA)または2種の別々のRNA分子(2種gRNA)であり得る。一部の実施形態では、gRNAは、リバーストランスクリプターゼのためのRNAテンプレート(pegRNA)をさらに含んでいてもよい。
いくつかの実施形態は、CRISPR-Casエフェクタータンパク質及びガイドRNAを含む、CRISPR-Casゲノム編集システムの1つ以上の構成要素をコードする、異種の転写可能なDNA分子に作動可能に連結された、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントに関する。CRISPR-Casエフェクタータンパク質の例としては、限定されるものではないが、Cas9、C2c1、C2c3、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas12a(Cpf1とも称される)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12h、Cas12i、Cas12g、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3´、Cas3”、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csnl及びCsx12としても公知である)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)、Csf5、Cas14a、Cas14b、及びCas14cエフェクタータンパク質が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、ヌクレアーゼ活性部位(例えば、RuvC、HNH、例えば、Cas12aヌクレアーゼドメインのRuvC部位;例えば、Cas9ヌクレアーゼドメインのRuvC部位及び/またはHNH部位)に変異を含む、CRISPR-Casエフェクタータンパク質に作動可能に連結される。ヌクレアーゼ活性部位に変異を有し、したがって、もはやヌクレアーゼ活性を含まないCRISPR-Casエフェクタータンパク質は、一般に、「dead」、例えば、dCasと称される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ活性部位に変異を有するCRISPR-Casエフェクタータンパク質ドメインまたはポリペプチドは、変異のない同じCRISPR-Casエフェクタータンパク質と比較して、活性が障害されているか、または活性が低減していることがある。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、ヌクレアーゼ活性部位に変異を有するCRISPR-Casエフェクタータンパク質に作動可能に連結されて、リバーストランスクリプターゼ酵素に作動可能に連結されたニッカーゼ活性を生成する。
細胞形質転換
本発明はまた、転写可能なDNA分子に作動可能に連結された1つ以上の調節エレメントを含む、形質転換された細胞及び植物を産生する方法にも向けられている。
本発明はまた、転写可能なDNA分子に作動可能に連結された1つ以上の調節エレメントを含む、形質転換された細胞及び植物を産生する方法にも向けられている。
「形質転換」という用語は、レシピエント宿主へのDNA分子の導入を指す。本明細書で使用する場合、「宿主」という用語は細菌、真菌、または植物を意味し、これには、任意の細胞、組織、器官、または細菌、真菌、もしくは植物の後代が含まれる。特に目的となる植物組織及び細胞には、プロトプラスト、カルス、根、塊茎、種子、茎、葉、実生、胚、及び花粉が含まれる。
本明細書で使用する場合、「形質転換された」という用語は、外来DNA分子(例えば、構築物)が導入された細胞、組織、器官、または生物を指す。導入されたDNA分子をレシピエント細胞、組織、器官、または生物のゲノムDNAに組み込んで、導入されたDNA分子が次の後代に受け継がれるようにしてもよい。「トランスジェニック」または「形質転換された」細胞または生物にはまた、細胞または生物の後代、及び交配でかかるトランスジェニック生物を親として用いた育種プログラムから生産され、外来DNA分子の存在からもたらされる変化した表現型を示す後代も含まれ得る。また、導入されるDNA分子をレシピエント細胞内に一過性に導入して、導入されたDNA分子が次の後代に受け継がれないようにしてもよい。「トランスジェニック」という用語は、1つ以上の異種のDNA分子を含む細菌、真菌、または植物を指す。
DNA分子を植物細胞に導入するための、当業者に周知の方法が多数存在する。このプロセスは、概して、好適な宿主細胞を選択するステップと、宿主細胞をベクターで形質転換するステップと、形質転換宿主細胞を得るステップとを含む。本発明の実施において植物構築物を植物ゲノムに導入することによって植物細胞を形質転換するための方法及び材料には、周知でありかつ実証された方法のうちのいずれも含まれ得る。好適な方法としては、限定されるものではないが、中でも細菌感染(例えば、Agrobacterium)、バイナリーBACベクター、DNAの直接送達(例えば、PEG媒介の形質転換、乾燥/阻害媒介のDNA取込み、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維による撹拌、及びDNAコーティング粒子の加速)、遺伝子編集(例えば、CRISPR-Casシステム)が挙げられる。
宿主細胞は、任意の細胞または生物、例えば、植物細胞、藻類細胞、藻類、真菌細胞、真菌、細菌細胞、または昆虫細胞であってもよい。特定の実施形態において、宿主細胞及び形質転換細胞としては、作物植物からの細胞が含まれ得る。
トランスジェニック植物は、その後、本発明のトランスジェニック植物細胞から再生され得る。従来の育種技法または自家受粉を用いて、このトランスジェニック植物から種子が産生され得る。このような種子、及びこのような種子から成長した結果生じる後代植物は、本発明の組換えDNA分子を含み、そのためトランスジェニックとなる。
本発明のトランスジェニック植物を自家受粉させて、本発明のホモ接合性トランスジェニック植物(組換えDNA分子についてホモ接合性)の種子を得ることができるか、または非トランスジェニック植物もしくは異なるトランスジェニック植物と交配させて、本発明のヘテロ接合性トランスジェニック植物(組換えDNA分子についてヘテロ接合性)の種子を得ることができる。このようなホモ接合性及びヘテロ接合性のトランスジェニック植物は共に、本明細書では「後代植物」と称される。後代植物とは、元のトランスジェニック植物に由来し本発明の組換えDNA分子を含むトランスジェニック植物である。本発明のトランスジェニック植物を用いて産生した種子を、収穫し、本発明の組換えDNA分子を含みかつ農学的目的の遺伝子を発現するトランスジェニック植物、すなわち本発明の後代植物の世代を成長させるために使用し得る。種々の作物に一般に使用されている育種の方法についての説明は、いくつかの参考文献の1つから見出すことができる。例えば、Allard,Principles of Plant Breeding,John Wiley & Sons,NY,U.of CA,Davis,CA,50-98(1960);Simmonds,Principles of Crop Improvement,Longman,Inc.,NY,369-399(1979);Sneep and Hendriksen,Plant breeding Perspectives,Wageningen(ed),Center for Agricultural Publishing and Documentation(1979);Fehr,Soybeans: Improvement,Production and Uses,2nd Edition,Monograph,16:249(1987);Fehr,Principles of Variety Development,Theory and Technique,(Vol.1)and Crop Species Soybean(Vol.2),Iowa State Univ.,Macmillan Pub.Co.,NY,360-376(1987)を参照のこと。
形質転換植物は、目的の遺伝子(複数可)の存在、ならびに本発明の調節エレメントが付与する発現レベル及び/またはプロファイルについて解析され得る。当業者は、形質転換植物の解析に利用できる多数の方法を認識している。例えば、植物解析の方法としては、限定されるものではないが、サザンブロットまたはノーザンブロット、PCRベースのアプローチ、生化学的解析、表現型スクリーニング法、現地評価、及び免疫診断アッセイが挙げられる。転写可能なDNA分子の発現は、TaqMan(登録商標)(Applied Biosystems(Foster City,CA))の試薬及び製造業者が説明する方法、ならびにTaqMan(登録商標)Testing Matrixを用いて決定したPCRサイクル時間を用いて測定され得る。代替的に、Invader(登録商標)(Third Wave Technologies(Madison,WI))の試薬及び製造業者が説明する方法を使用して、導入遺伝子の発現を評価することができる。
本発明はまた、本発明の植物の部位も提供する。植物の部位としては、限定されるものではないが、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、及び花粉が挙げられる。本発明の植物の部位は、生育可能、生育不可能、再生可能、及び/または再生不可能であってもよい。また、本発明は、本発明のDNA分子を含む形質転換植物細胞も含み、これを提供する。本発明の形質転換またはトランスジェニック植物細胞としては、再生可能及び/または再生不可能な植物細胞が含まれる。
本発明はまた、本発明の組換えDNA分子を含むトランスジェニック植物またはその部位から生産される商品生産物も提供する。本発明の商品生産物は、配列番号1~5からなる群より選択されるDNA配列を含む、検出可能量のDNAを含む。本明細書で使用する場合、「商品生産物」とは、本発明の組換えDNA分子を含むトランスジェニック植物、種子、植物細胞、または植物の部位に由来する材料から構成される任意の組成物または生産物を指す。商品生産物としては、限定されるものではないが、加工された種子、穀物、植物の部位、及び粗粉が挙げられる。本発明の商品生産物は、本発明の組換えDNA分子に対応する、検出可能量のDNAを含むことになる。商品生産物の内容または供給源を決定するために、試料におけるこのDNAのうちの1つ以上の検出が用いられ得る。本明細書で開示される検出方法を含めて、任意の標準的なDNA分子の検出方法を使用してもよい。
本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され得、これらの実施例は、明記されない限り、例示説明として提供されるものであり、本発明を限定することは意図されない。当業者は、以下の実施例で開示される技法が、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技法を代表するものであることを理解するはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更を行い、それでもなお同様のまたは類似の結果を得ることができることを理解するはずである。したがって、添付図面に記載または示される全ての事柄は、限定的な意味ではなく、例示説明として解釈されるものとする。
実施例1
調節エレメントの同定及びクローニング
本実施例は、Andropogon gerardii(Big blue stem)及びArundo donax(Giant reed)由来の調節発現エレメントの同定、合成、及びクローニングを説明するものである。
調節エレメントの同定及びクローニング
本実施例は、Andropogon gerardii(Big blue stem)及びArundo donax(Giant reed)由来の調節発現エレメントの同定、合成、及びクローニングを説明するものである。
単子葉植物種であるAndropogon gerardii(Big blue stem)のゲノムDNAから新規ユビキチン調節エレメントを同定し、単離した。ユビキチン1転写物のそれぞれの5´非翻訳領域(5´UTR)を用いて、作動可能に連結されたプロモーター、リーダー(5´UTR)、及び第1のイントロンを含む、同定したユビキチン遺伝子の対応する調節エレメントを増幅するためのプライマーを設計した。プライマーを製造業者のプロトコルに従って構築したGenomeWalker(商標)(Clontech Laboratories,Inc(Mountain View,CA))ライブラリーと共に使用して、対応するゲノムDNA配列の5´領域をクローニングした。
加えて、単子葉植物種であるArundo donax(Giant reed)のゲノムDNAから新規3´UTRを同定し、単離した。Andropogon gerardiiの同定したEXPならびにそれに対応するプロモーター、リーダー、及びイントロンと、Arundo donaxの3´UTRを表1に提示する。
β-グルクロニダーゼ(GUS)の発現を駆動するために用いられる発現カセットにおいて、同定したEXP及び3´UTRを、当該技術分野で公知の方法を用いてバイナリー植物形質転換ベクター構築物内に合成及びクローニングして、実施例2及び3に記載したように、安定して形質転換されたトウモロコシ植物におけるそれらの活性を評価した。
実施例2
安定して形質転換されたトウモロコシ植物におけるGUS発現を駆動するEXP-ANDge.Ubq:5の解析
トウモロコシ植物をベクター、具体的には、β-グルクロニダーゼ(GUS)導入遺伝子の発現を駆動するEXP(EXP-ANDge.Ubq:5)を含む植物発現ベクターで形質転換した。得られた植物をGUSタンパク質発現について解析して、発現に対する調節エレメント群(EXP)の効果を評価し、標準対照のEXPと比較した。
安定して形質転換されたトウモロコシ植物におけるGUS発現を駆動するEXP-ANDge.Ubq:5の解析
トウモロコシ植物をベクター、具体的には、β-グルクロニダーゼ(GUS)導入遺伝子の発現を駆動するEXP(EXP-ANDge.Ubq:5)を含む植物発現ベクターで形質転換した。得られた植物をGUSタンパク質発現について解析して、発現に対する調節エレメント群(EXP)の効果を評価し、標準対照のEXPと比較した。
トウモロコシ植物を植物GUS発現構築物で形質転換した。当該技術分野で公知の標準的な方法を用いて、EXP(EXP-ANDge.Ubq:5、配列番号1)をベースとなる植物発現ベクター内にクローニングした。得られた植物発現ベクターは、Agrobacterium tumefaciensの左側境界領域(B-AGRtu.left border)と、除草剤グリホサートに対する抵抗性を付与する形質転換植物細胞の選択に使用する第1の導入遺伝子選択カセットと、EXP-ANDge.Ubq:5の活性を評価するための第2の導入遺伝子カセットであって、3´UTR(T-Sb.Nltp4-1:1:2、配列番号7)に作動可能に連結された、プロセシング可能なイントロン(配列番号8)から構成されるGUSコード配列に対し、5´側に作動可能に連結された、EXP-ANDge.Ubq:5(配列番号1)を含む導入遺伝子カセットから構成される、第2の導入遺伝子カセットと、Agrobacterium tumefaciensの右側境界領域(B-AGRtu.right border)とを含むものであった。EXP-ANDge.Ubq:5によって駆動されるGUS発現を、3´UTR(T-Sb.Nltp4-1:1:2)に作動可能に連結されたGUSコード配列に対し5´側に作動可能に連結された、EXP(EXP-CaMV.35S+Zm.DnaK:12、配列番号6)から構成されるGUS導入遺伝子発現カセットを含む、上記のものと類似した対照構築物の発現と比較した。
トウモロコシ植物細胞を、当該技術分野で周知されているように、Agrobacterium媒介の形質転換により、上記のバイナリー形質転換ベクター構築物を用いて形質転換した。得られた形質転換植物細胞を、全トウモロコシ植物を形成するように誘導した。
定性的及び定量的GUS解析を使用して、形質転換植物の選択した植物器官及び組織内での発現エレメントの活性を評価した。組織化学的染色によるGUS発現の定性的解析については、ホールマウント組織または切片化した組織を、1mg/mLのX-Gluc(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b-グルクロニド)を含有するGUS染色液と共に37℃で5時間インキュベートし、35%EtOH及び50%酢酸で脱染した。GUS発現は、解剖顕微鏡または複合顕微鏡で、選択した植物器官または組織の青色発色を目視検査することにより定性的に判断した。
酵素アッセイによるGUS発現の定量的解析については、形質転換されたトウモロコシ植物の選択された組織から全タンパク質を抽出した。1~2マイクログラムの全タンパク質を、50マイクロリットルの総反応体積中の1mM濃度の蛍光発生基質4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルクロニド(MUG)と共にインキュベートした。37℃で1時間インキュベートした後、350マイクロリットルの200mM重炭酸ナトリウム溶液を添加することにより反応を停止させた。反応生成物4-メチルウンベリフェロン(4-MU)は高pHで最大限に蛍光性となり、このときヒドロキシル基がイオン化される。塩基性の炭酸ナトリウム溶液の添加により、アッセイを停止させると同時に、蛍光生成物4-MUの定量のためにpHを調整する。FLUOstar Omega Microplate Reader(BMG LABTECH)(励起:355nm、発光:460nm)を用いて、生成した4-MUの蛍光を測定し、その量を推定した。GUS活性値は、ナノモル単位の4-MU/時間/mg全タンパク質で提供される。
以下の組織を、R0世代におけるGUS発現のために試料採取した:V4段階の葉及び根;V7段階の葉及び根;VT段階の葉、花/葯、及び花粉;R1段階の穂軸/毛;受粉から(DAP)21日後のR3段階の種子胚及び種子胚乳。表2は、試料採取した組織の平均定量的GUS発現を示している。
表2から理解できるように、EXP(EXP-ANDge.Ubq:5、配列番号1)により、対照(EXP-CaMV.35S+Zm.DnaK:12、配列番号6)のものとは全く異なる発現プロファイルが得られた。例えば、VTの葯及び花粉における、EXP-ANDge.Ubq:5によって駆動される発現量は、EXP-CaMV.35S+Zm.DnaK:12によって駆動される発現量より多い。EXP-CaMV.35S+Zm.DnaK:12によって駆動される葉での発現が、V4からV7段階まで増加し、次いで、VT段階までには減少するように見えた一方で、EXP-ANDge.Ubq:5によって駆動される葉での発現は、全3段階を通して一定のままであった。R1の穂軸/毛において、EXP-ANDge.Ubq:5によって駆動される発現は、対照と比較して多かった。EXP-ANDge.Ubq:5(配列番号1)は、特有の発現特性を示し、選択した導入遺伝子の発現に向けた新規のツールを提供するものである。
実施例3
安定して形質転換されたトウモロコシ植物における3´UTR(T-ARUdo.TubA:1)のGUS発現調整
トウモロコシ植物をベクター、具体的には、β-グルクロニダーゼ(GUS)導入遺伝子の発現を調整する3´UTR(T-ARUdo.TubA:1)を含む植物発現ベクターで形質転換した。得られた植物をGUSタンパク質発現について解析して、発現に対する3´UTR調節エレメントの効果を評価した。
安定して形質転換されたトウモロコシ植物における3´UTR(T-ARUdo.TubA:1)のGUS発現調整
トウモロコシ植物をベクター、具体的には、β-グルクロニダーゼ(GUS)導入遺伝子の発現を調整する3´UTR(T-ARUdo.TubA:1)を含む植物発現ベクターで形質転換した。得られた植物をGUSタンパク質発現について解析して、発現に対する3´UTR調節エレメントの効果を評価した。
トウモロコシ植物を、植物GUS発現構築物及び対照構築物で形質転換した。構築物は、実施例2において上述したものと類似したものとした。どちらの構築物も、プロセシング可能なイントロン(配列番号8)から構成されるGUSコード配列に対し、5´側に作動可能に連結された、EXP(EXP-CaMV.35S+Zm.DnaK:12、配列番号6)を含むものであった。対照構築物は、実施例2において上述した通りであって、GUSコード配列が3´UTR(T-Sb.Nltp4-1:1:2)に作動可能に連結されたものとした。もう一方の構築物には3´UTR(T-ARUdo.TubA:1、配列番号5)を使用して、GUS導入遺伝子の転写を終結させた。
実施例2に記載したように、トウモロコシ植物を形質転換し、GUS発現をアッセイした。以下の組織を、R0世代におけるGUS発現のために試料採取した:V4段階の葉及び根;V7段階の葉及び根;VT段階の葉、花/葯、及び花粉;R1段階の穂軸/毛;受粉から(DAP)21日後のR3段階の種子胚及び種子胚乳。表3は、試料採取した組織の平均定量的GUS発現及びT-ARUdo.TubA:1によりもたらされるGUS増強倍率を示している。
表3から理解できるように、3´UTR(T-ARUdo.TubA:1、配列番号5)は、3´UTR(T-Sb.Nltp4-1:1:2)と比較したとき、アッセイした全組織において、GUS導入遺伝子の発現量を増強させた。転写解析により、GUS mRNAの適切な終結及びポリアデニル化が示された。一部の例では、導入遺伝子の発現量の増強は相当大きいものであった。例えば、VTの葉での発現量は、対照における発現量よりも176.8倍多かった。V7の根での発現量は、対照における発現量よりも93.7倍多かった。したがって、3´UTR(T-ARUdo.TubA:1、配列番号5)は、対照と比較して、導入遺伝子の発現を増強させる。
本発明の原理を例示及び説明したが、かかる原理から逸脱することなく、本発明の配置及び詳細を変更することができることが、当業者には明らかであるはずである。発明者らは、特許請求の範囲の趣旨及び範囲内にある全ての変更を特許請求する。本明細書で引用される全ての刊行物及び公開された特許文献は、あたかも個々の刊行物または特許出願の各々が参照により援用されることが明確かつ個別に示されているのと同じ程度まで、これにより本明細書に援用される。
Claims (17)
- 組換えDNA分子であって、
a)配列番号1~5のいずれかに対し少なくとも85パーセントの配列同一性を有する配列、
b)配列番号1~5のいずれかを含む配列、及び
c)遺伝子調節活性を有する、配列番号1~5のいずれかのフラグメント、
からなる群より選択されるDNA配列を含み、
前記配列が、異種の転写可能なDNA分子と作動可能に連結されている、前記組換えDNA分子。 - 前記配列が、配列番号1~5のいずれかのDNA配列に対し少なくとも90パーセントの配列同一性を有する、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 前記配列が、配列番号1~5のいずれかのDNA配列に対し少なくとも95パーセントの配列同一性を有する、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 前記DNA配列が遺伝子調節活性を含む、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 前記異種の転写可能なDNA分子が農学的目的の遺伝子を含む、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 前記農学的目的の遺伝子が、植物における除草剤耐性を付与する、請求項5に記載の組換えDNA分子。
- 前記農学的目的の遺伝子が、植物における害虫抵抗性を付与する、請求項5に記載の組換えDNA分子。
- 前記異種の転写可能なDNA分子が、dsRNA、miRNA、またはsiRNAをコードする、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- トランスジェニック植物細胞であって、
a)配列番号1~5のいずれかに対し少なくとも85パーセントの配列同一性を有する配列、
b)配列番号1~5のいずれかを含む配列、及び
c)遺伝子調節活性を有する、配列番号1~5のいずれかのフラグメント、
からなる群より選択される配列を含む組換えDNA分子を含み、
前記配列が、異種の転写可能なDNA分子と作動可能に連結されている、前記トランスジェニック植物細胞。 - 前記トランスジェニック植物細胞が、単子葉植物細胞である、請求項9に記載のトランスジェニック植物細胞。
- 前記トランスジェニック植物細胞が、双子葉植物細胞である、請求項9に記載のトランスジェニック植物細胞。
- 請求項1に記載の組換えDNA分子を含む、トランスジェニック植物またはその部位。
- 請求項12に記載のトランスジェニック植物の後代植物、またはその部位であって、前記後代植物またはその部位が、前記組換えDNA分子を含む、前記後代植物、またはその部位。
- トランスジェニック種子であって、前記種子が、請求項1に記載の組換えDNA分子を含む、前記トランスジェニック種子。
- 請求項12に記載のトランスジェニック植物またはその部位を得ることと、それから商品生産物を生産することとを含む、前記商品生産物を生産する方法。
- 前記商品生産物が、種子、加工種子、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、デンプン、穀物、植物の部位、種子油、バイオマス、細粉及び粗粉である、請求項15に記載の方法。
- 転写可能なDNA分子を発現させる方法であって、請求項12に記載のトランスジェニック植物を得ることと、前記植物を栽培することとを含み、前記転写可能なDNAが発現する、前記方法。
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