JP7422140B2 - 植物の調節エレメント及びその使用 - Google Patents

Description

関連出願の参照
本出願は、２０１９年１月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／７９０，５７０号による利益を主張し、当該出願の全体が参照により本明細書に援用される。
配列表の組み込み

「ＭＯＮＳ４６８ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、３３，８９６バイト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）での計測）であり、２０２０年１月９日に作成されたものであり、電子申請により本明細書と共に提出され、参照により本明細書に援用される。

技術分野
本発明は、植物分子生物学及び植物遺伝子工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、植物内の遺伝子発現を調整するのに有用なＤＮＡ分子に関する。

調節エレメントは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写を調整することによって遺伝子活性を調節する遺伝子エレメントである。このようなエレメントとしては、プロモーター、リーダー、イントロン、及び３’非翻訳領域を挙げることができ、これらは、植物分子生物学及び植物遺伝子工学の分野で有用である。

本発明は、植物で使用するための新規の遺伝子調節エレメントを提供する。本発明はまた、調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子構築物も提供する。本発明は、調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、及び種子も提供する。１つの実施形態において、調節エレメントは、転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている。ある特定の実施形態において、転写可能なＤＮＡ分子は、調節配列に対し異種であってもよい。したがって、本発明によって提供される調節エレメント配列は、特定の実施形態においては、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されていると定義され得る。本発明はまた、調節エレメントを使用し、調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子、ならびに転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結された調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、及び種子を作製及び使用する方法も提供する。

したがって、１つの態様において、本発明は、組換えＤＮＡ分子であって、（ａ）配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９のいずれかに対し少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列、（ｂ）配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９のいずれかを含む配列、ならびに（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９のいずれかのフラグメントからなる群より選択されるＤＮＡ配列を含み、当該配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている、組換えＤＮＡ分子を提供する。「異種の転写可能なＤＮＡ分子」とは、転写可能なＤＮＡ分子が、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列に対し異種であることを意味する。特定の実施形態において、組換えＤＮＡ分子は、配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９のいずれかのＤＮＡ配列に対し、少なくとも約８５パーセント、少なくとも約８６パーセント、少なくとも約８７パーセント、少なくとも約８８パーセント、少なくとも約８９パーセント、少なくとも約９０パーセント、少なくとも９１パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９３パーセント、少なくとも９４パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態において、このＤＮＡ配列は調節エレメントを含む。いくつかの実施形態において、この調節エレメントは、イントロンに作動可能に連結されたプロモーターを含む。さらに他の実施形態において、この調節エレメントは３’ＵＴＲを含む。さらに他の実施形態において、異種の転写可能なＤＮＡ分子は、農学的目的の遺伝子、例えば、植物における除草剤抵抗性を提供可能な遺伝子、または植物における植物害虫耐性を提供可能な遺伝子を含む。さらに他の実施形態において、異種の転写可能なＤＮＡ分子は、低分子ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ）をコードする配列を含む。さらに他の実施形態において、本発明は、本明細書で提供される組換えＤＮＡ分子を含む構築物を提供する。

別の態様において、本明細書では、トランスジェニック植物細胞であって、（ａ）配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９のいずれかに対し少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列、（ｂ）配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９のいずれかを含む配列、ならびに（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９のいずれかのフラグメントからなる群より選択されるＤＮＡ配列を含み、当該ＤＮＡ配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている、組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物細胞を提供する。ある特定の実施形態において、トランスジェニック植物細胞は単子葉植物細胞である。他の実施形態において、トランスジェニック植物細胞は単子葉植物細胞または双子葉植物細胞である。

さらにまた別の態様において、本明細書ではさらに、トランスジェニック植物またはその部位であって、ａ）配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９のいずれかに対し少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列、ｂ）配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９のいずれかを含む配列、ならびにｃ）遺伝子調節活性を有しており、配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９のいずれかのフラグメント、からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含み、当該配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている、組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物またはその部位を提供する。特定の実施形態において、このトランスジェニック植物は、組換えＤＮＡ分子を含む任意の世代の後代植物である。また、トランスジェニック種子であって、成長したときにこのようなトランスジェニック植物を産生する組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック種子も本明細書で提供される。

別の態様において、本発明は、商品生産物を生産する方法であって、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその一部を得ることと、それから商品生産物を生産することとを含む、方法を提供する。１つの実施形態において、商品生産物は、種子、加工種子、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、デンプン、穀物、植物の部位、種子油、バイオマス、穀粉、及び粗粉である。

さらにまた別の態様において、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を生産する方法であって、植物細胞を本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換して形質転換植物細胞を生産することと、この形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生することとを含む、方法を提供する。

配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ（アワ（Ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ））のＳ－アデノシルメチオニンシンテターゼ１タンパク質遺伝子に由来する３’ＵＴＲ、Ｔ－ＳＥＴｉｔ．Ａｍｓ１：１のＤＮＡ配列である。

配列番号２は、Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ－ｊｏｂｉ（ジュズダマ（Ｊｏｂ’ｓ ｔｅａｒｓ））のＨｓｐ１６．９（熱ショックタンパク質１６．９）タンパク質遺伝子に由来する３’ＵＴＲ、Ｔ－Ｃｌ．Ｈｓｐ１６．９＿２：１のＤＮＡ配列である。

配列番号３は、Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ ｔｅｆ（Ｔｅｆ）の推定熱ショックタンパク質遺伝子に由来する３’ＵＴＲ、Ｔ－ＥＲＩｒａ．Ｈｓｐ１７．９＿３：１のＤＮＡ配列である。

配列番号４は、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｒａｖｅｎｎａｅ（ラベンナグラス（ｈａｒｄｙ ｐａｍｐａｓ ｇｒａｓｓ））のＨｓｐ１６．９（熱ショックタンパク質１６．９）タンパク質遺伝子に由来する３’ＵＴＲ、Ｔ－ＥＲＩｒａ．Ｈｓｐ１６．９＿３：１のＤＮＡ配列である。

配列番号５は、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉｉ（ビッグブルーステム（ｂｉｇ ｂｌｕｅｓｔｅｍ））及びＳｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（ソルガム）の熱ショックタンパク質遺伝子に由来する３’ＵＴＲ、Ｔ－ＡＮＤｇｅ．Ｈｓｐ／Ｓｂ．Ｈｓｐ、キメラ３’ＵＴＲのＤＮＡ配列である。

配列番号６は、プロモーター及びＳｅｔａｒｉａｉｔａｌｉｃａのアクチン４遺伝子に由来するイントロンに対して５’側に作動可能に連結された、Ｚｅａ ｍａｙｓ由来の脂質転移タンパク質様タンパク質遺伝子に由来する５’ＵＴＲを含む、ＥＸＰ、ＥＸＰ－Ｚｍ．ＬＴＰ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４のＤＮＡ配列である。

配列番号７は、Ｚｅａ ｍａｙｓの脂質転移タンパク質様タンパク質に由来するプロモーター、Ｐ－Ｚｍ．Ｌｔｐ－１：１：２のＤＮＡ配列である。

配列番号８は、Ｚｅａ ｍａｙｓの脂質転移タンパク質様タンパク質に由来する５’ＵＴＲ（リーダー）、Ｌ－Ｚｍ．Ｌｔｐ－１：１：３のＤＮＡ配列である。

配列番号９は、Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａのアクチン４遺伝子に由来するイントロンＩ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：２のＤＮＡ配列である。

配列番号１０は、逆相補配向のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターに由来するエンハンサー、Ｅ－ＣａＭＶ．３５Ｓ－ＲＣのＤＮＡ配列である。

配列番号１１は、ジャガイモ光誘導性組織特異的ＳＴ－ＬＳ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション：Ｘ０４７５３）に由来するプロセシング可能なイントロンを有するβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の植物発現に最適化された合成コード配列である。

配列番号１２は、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｒａｖｅｎｎａｅ（ラベンナグラス（ｈａｒｄｙ ｐａｍｐａｓ ｇｒａｓｓ））のＨｓｐ１６．９（熱ショックタンパク質１６．９）タンパク質遺伝子に由来する３’ＵＴＲ、Ｔ－Ｃｌ．Ｈｓｐ１６．９：２のＤＮＡ配列である。

配列番号１３は、Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ－ｊｏｂｉ（ジュズダマ（Ｊｏｂ’ｓ ｔｅａｒｓ））のＨｓｐ１６．９（熱ショックタンパク質１６．９）タンパク質遺伝子に由来する３’ＵＴＲ、Ｔ－Ｃｌ．Ｈｓｐ１６．９：２のＤＮＡ配列である。

配列番号１４は、複数の公開ダリアモザイクウイルスプロモーターに由来する、キメラ再構成エンハンサー、Ｅ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ：１のＤＮＡ配列である。第１のフラグメントは、ＤａＭＶ－Ｈｏｌｌａｎｄ（ＤａＭＶ－Ｈ）株のプロモーター、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＥＵ０９０９５７、ヌクレオチド１１７７－１４９４に由来する。このフラグメントは、ＤａＭＶ－Ｈプロモーターに由来する第２のフラグメントであるヌクレオチド１００３－１１７６に作動可能に連結されている。ネイティブＤａＭＶプロモーター構成では、第２のフラグメントが第１のフラグメントに先行する。第１のフラグメント内で、ヌクレオチド２８７～２８８、及びヌクレオチド３１９～３２２は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＪＸ２７２３２０内のＤａＭＶプロモーターの類似の位置にある配列に変更された。

配列番号１５は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＥＦ５１３４９１、ヌクレオチド１～３２２の、ダリアモザイクウイルスプロモーター由来のエンハンサー、Ｅ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ：２のＤＮＡ配列である。

配列番号１６は、プロモーターに対して５’側に作動可能に連結された、キメラ再構成エンハンサー、Ｅ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ：１（配列番号１４）及びＳｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ由来のアクチン４遺伝子に由来するイントロンに対して５’側に作動可能に連結された、Ｚｅａ ｍａｙｓ由来の脂質輸送タンパク質様タンパク質遺伝子由来の５’ＵＴＲから構成される、ＥＸＰ、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：１のＤＮＡ配列である。

配列番号１７は、プロモーターに対して５’側に作動可能に連結された、キメラ再構成エンハンサー、Ｅ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ：１（配列番号１４）及びＳｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ由来のアクチン４遺伝子に由来するイントロンに対して５’側に作動可能に連結された、Ｚｅａ ｍａｙｓ由来の脂質輸送タンパク質様タンパク質遺伝子由来の５’ＵＴＲから構成される、ＥＸＰ、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：１のＤＮＡ配列である。キメラ再構成Ｅ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ：１エンハンサーは、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：１（配列番号１６）に対して反対の方向でクローニングされる。

配列番号１８は、プロモーターに対して５’側に作動可能に連結された、エンハンサー、Ｅ－ＤａＭＶ．Ｈ－ＦＬＴ：２及びＳｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ由来の１４－３－３Ｃ遺伝子に由来するイントロンに対して５’側に作動可能に連結された、Ｔｒｙｐｓｉｃｕｍ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ由来のＲＣｃ３遺伝子由来の５’ＵＴＲから構成される、ＥＸＰ、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋ＳＥＴｉｔ．１４－３－３Ｃ－５：１のＤＮＡ配列である。

配列番号１９は、プロモーターに対して５’側に作動可能に連結された、エンハンサー、Ｅ－ＤａＭＶ．Ｈ－ＦＬＴ：２及びＳｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ由来の１４－３－３Ｃ遺伝子に由来するイントロンに対して５’側に作動可能に連結された、Ｔｒｙｐｓｉｃｕｍ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ由来のＲＣｃ３遺伝子由来の５’ＵＴＲから構成される、ＥＸＰ、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋ＳＥＴｉｔ．１４－３－３Ｃ－５：１のＤＮＡ配列である。Ｅ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ：２エンハンサーは、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋ＳＥＴｉｔ．１４－３－３Ｃ－５：１（配列番号１８）に対して反対方向にクローニングされる。

本発明は、植物における遺伝子調節活性を有する調節エレメントを提供する。これらの調節エレメントのヌクレオチド配列は、配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９として示される。これらの調節エレメントは、植物組織内で、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を及ぼし得、そのため、トランスジェニック植物内で、作動可能に連結された導入遺伝子の遺伝子発現を調節し得る。また、本発明は、提供される調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子を修飾、産生、及び使用する方法も提供する。また、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞、植物、植物の部位、及び種子を含む組成物、ならびにこれらを調製し使用するための方法も提供する。

以下の定義及び方法は、本発明をより良好に定義し、当業者が本発明を実施する指針とするために提供される。別段の記載がない限り、用語は、関連技術分野の当業者による従来的な使用法に従って理解するものとする。

ＤＮＡ分子
本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」という用語は、５’（上流）末端から３’（下流）末端に読み取られるゲノム起源または合成起源の２本鎖ＤＮＡ分子（すなわち、デオキシリボヌクレオチド塩基の多量体またはＤＮＡ分子）を指す。本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ配列」という用語は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される命名法は、米国連邦規則集３７編１．８２２条の命名法に対応し、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）附属書２の表、表１及び３に記載されている。

本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ分子」とは、ヒトの介入なしで天然に同時に生じないであろうＤＮＡ分子の組合せを含むＤＮＡ分子である。例えば、組換えＤＮＡ分子とは、互いに異種の少なくとも２つのＤＮＡ分子から構成されたＤＮＡ分子、自然界に存在するＤＮＡ配列から逸脱するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、合成ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、または遺伝子形質転換もしくは遺伝子編集によって宿主細胞のＤＮＡ内に組み込まれたＤＮＡ分子であってもよい。

本出願における「単離されたＤＮＡ分子」、または等価の用語もしくは表現への言及は、このＤＮＡ分子が、単独で、または他の組成物と組み合わせて存在するが、その自然環境内には存在しないＤＮＡ分子であることを意味するものとする。例えば、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列などのような、生物のゲノムのＤＮＡ内で天然に見出される核酸エレメントは、当該エレメントが生物のゲノム内にあり、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にある限りは、「単離された」とは見なされない。ただし、これらのエレメントの各々、及びこれらのエレメントの下位部分は、当該エレメントが生物のゲノム内になく、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にない限り、本開示の範囲内で「単離されている」ものである。同様に、殺虫性タンパク質またはそのタンパク質の天然に生じる任意の殺虫性バリアントをコードするヌクレオチド配列は、当該ヌクレオチド配列が、当該タンパク質をコードする配列が天然に見出される細菌のＤＮＡ内にない限り、単離されたヌクレオチド配列と考えられる。天然に存在する殺虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的において単離されていると見なされると考えられる。本開示の目的において、任意のトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞のゲノム内に挿入されるか、または染色体外ベクター内に存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、それが、細胞の形質転換に使用されるプラスミドもしくは同様の構造内に存在しても、植物もしくは細菌のゲノム内に存在しても、または植物もしくは細菌に由来する組織、後代、生物学的試料、もしくは商品生産物の中に検出可能量で存在しても、単離されたヌクレオチド配列であると見なされる。

本明細書で使用する場合、「配列同一性」という用語は、２つの最適にアラインメントしたポリヌクレオチド配列または２つの最適にアラインメントしたポリペプチド配列が同一である程度を指す。最適な配列アラインメントは、２つの配列、例えば、参照配列ともう１つの配列とを手動でアラインメントして、適切な内部ヌクレオチド挿入、欠失、またはギャップを伴った配列アラインメント内のヌクレオチドマッチ数を最大化することによって作成される。本明細書で使用する場合、「参照配列」という用語は、配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９として示されるＤＮＡ配列を指す。

本明細書で使用する場合、「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」または「同一性％」という用語は、同一性の割合に１００を掛けたものである。参照配列に対し最適にアラインメントした配列における「同一性の割合」は、最適アラインメント内のヌクレオチドマッチ数を、参照配列内のヌクレオチド総数、例えば、全長の参照配列全体のヌクレオチドの総数で割ったものである。したがって、本発明の１つの実施形態は、本明細書で配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９として示される参照配列に対し最適にアラインメントした場合に、参照配列に対し、少なくとも約８５パーセントの同一性、少なくとも約８６パーセントの同一性、少なくとも約８７パーセントの同一性、少なくとも約８８パーセントの同一性、少なくとも約８９パーセントの同一性、少なくとも約９０パーセントの同一性、少なくとも約９１パーセントの同一性、少なくとも約９２パーセントの同一性、少なくとも約９３パーセントの同一性、少なくとも約９４パーセントの同一性、少なくとも約９５パーセントの同一性、少なくとも約９６パーセントの同一性、少なくとも約９７パーセントの同一性、少なくとも約９８パーセントの同一性、少なくとも約９９パーセントの同一性、または少なくとも約１００パーセントの同一性を有する配列を含むＤＮＡ分子を提供する。参照分子に対し、あるパーセントの配列同一性を有するＤＮＡ分子は、参照配列の活性を示し得る。

調節エレメント
調節エレメント、例えば、プロモーター、リーダー（５’ＵＴＲとしても公知）、エンハンサー、イントロン、及び転写終結領域（または３’ＵＴＲ）は、生細胞内での遺伝子の全体的発現において不可欠な役割を担っている。本明細書で使用する場合、「調節エレメント」という用語は、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を指す。本明細書で使用する場合、「遺伝子調節活性」という用語は、例えば、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写及び／または翻訳に影響を及ぼすことにより、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を及ぼす能力を指す。植物内で機能する調節エレメント、例えば、プロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン、及び３’ＵＴＲは、遺伝子工学による植物の表現型の修飾に有用である。

本明細書で使用する場合、「調節発現エレメント群」または「ＥＸＰ」配列とは、作動可能に連結された調節エレメント群、例えば、エンハンサー、プロモーター、リーダー、及びイントロンの群を指し得る。例えば、調節発現エレメント群は、例えば、イントロン配列に対して５’側に作動可能に連結された、リーダー配列と５’側に作動可能に連結されたプロモーターから構成され得る。本発明を実施するのに有用なＥＸＰは、配列番号６、１６、１７、１８、及び１９として提示されている。

調節エレメントは、その遺伝子発現パターンによって特徴付けられ得、例えば、正及び／または負の効果、例えば、構成的発現または時間的、空間的、発達的、組織、環境的、生理学的、病理学的、細胞周期、及び／または化学的応答性の発現、ならびにこれらの任意の組合せ、加えて定量的または定性的指標によって特徴付けられ得る。本明細書で使用する場合、「遺伝子発現パターン」とは、作動可能に連結されたＤＮＡ分子の転写ＲＮＡ分子への転写の任意のパターンである。転写ＲＮＡ分子は、翻訳されてタンパク質分子を生成する場合もあれば、アンチセンスまたは他の調節ＲＮＡ分子、例えば、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などをもたらす場合もある。

本明細書で使用する場合、「タンパク質発現」という用語は、転写ＲＮＡ分子のタンパク質分子への翻訳の任意のパターンである。タンパク質の発現は、その時間的、空間的、発達的、または形態学的な性質により、さらに定量的または定性的指標により、特徴付けられ得る。

プロモーターは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための調節エレメントとして有用である。本明細書で使用する場合、「プロモーター」という用語は、概して、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びその他のタンパク質（例えば、トランス作用転写因子）の認識及び結合に関与するＤＮＡ分子を指す。プロモーターは、最初、遺伝子のゲノムコピーの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）から単離されてもよい。代替的に、プロモーターは、合成的に産生または操作されたＤＮＡ分子であってもよい。また、プロモーターはキメラであってもよい。キメラプロモーターは、２つ以上の異種ＤＮＡ分子の融合によって産生される。本発明を実施する上で有用なプロモーターは、配列番号７として示されるか、または配列番号１８に含まれるプロモーターであるか、またはこれらのフラグメントもしくはバリアントである。本発明の特定の実施形態において、本明細書で説明される、特許請求の範囲のＤＮＡ分子及びその任意のバリアントまたは誘導体はさらに、プロモーター活性を含むものとして定義され、すなわち、トランスジェニック植物などの宿主細胞内でプロモーターとして作用し得る。なおさらなる特定の実施形態において、フラグメントは、それが由来する開始プロモーター分子が有するプロモーター活性を示すものとして定義される場合もあれば、フラグメントは、基礎レベルの転写をもたらし、転写開始するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体が認識及び結合するためのＴＡＴＡボックスまたは同等のＤＮＡ配列から構成された「最小プロモーター」を含む場合もある。

１つの実施形態において、本明細書で開示されるＥＸＰ配列またはプロモーター配列のフラグメントが提供される。プロモーターフラグメントは、上記のようなプロモーター活性を含み得、また、単独で、または（例えば、キメラプロモーターを構築する際の）他のプロモーター及びプロモーターフラグメントとの組合せで、または他の発現エレメント及び発現エレメントのフラグメントとの組合せで有用であり得る。特定の実施形態において、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、または少なくとも約２０００の連続したヌクレオチド、またはそれ以上の、本明細書で開示されるプロモーター活性を有するＤＮＡ分子を含む、プロモーターのフラグメントが提供される。出発プロモーター分子からこのようなフラグメントを産生するための方法は、当該技術分野で周知である。

配列番号７として提供されるプロモーター、または配列番号１８に含まれる（例えば、内部もしくは５’欠失）プロモーターに由来する組成物は、例えば、発現を改善または改変するために、当該技術分野で公知の方法を用いて、発現に正もしくは負いずれかの効果を及ぼすエレメントの除去、発現に正もしくは負の効果を及ぼすエレメントの重複、及び／または発現に組織特異的もしくは細胞特異的な効果を及ぼすエレメントの重複もしくは除去を含む方法を用いて、産生され得る。配列番号７として提供されるプロモーター、または配列番号１８に含まれるプロモーター（ＴＡＴＡボックスエレメントもしくはその同等の配列及び下流配列が除去されている３’欠失から構成された）に由来する組成物を使用して、例えば、エンハンサーエレメントを作製してもよい。さらなる欠失を行って、発現に正または負の組織特異的、細胞特異的、または時間特異的な（例えば、限定されるものではないが、概日リズム）効果を及ぼすエレメントを除去してもよい。配列番号７で提供されるプロモーター、または配列番号１８に含まれるプロモーター、ならびにこれらに由来するフラグメントもしくはエンハンサーを使用して、キメラ転写調節エレメント組成物を作製してもよい。

本発明によれば、プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、公知のプロモーターエレメント、すなわち、ＴＡＴＡボックス及び他の公知の転写因子結合部位モチーフなどのＤＮＡ配列特徴の存在について解析され得る。このような公知のプロモーターエレメントの識別情報は、当業者により、元のプロモーターと同様の発現パターンを有するプロモーターのバリアントを設計するために使用され得る。

本明細書で使用する場合、「リーダー」という用語は、遺伝子の非翻訳５’領域（５’ＵＴＲ）から単離され、転写開始部位（ＴＳＳ）とタンパク質コード配列開始部位との間のヌクレオチドセグメントとして一般に定義されるＤＮＡ分子を指す。代替的に、リーダーは、合成的に産生または操作されたＤＮＡエレメントであってもよい。リーダーは、作動可能に連結されている転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための５’調節エレメントとして使用され得る。リーダー分子は、異種のプロモーターまたはそのネイティブプロモーターと共に使用してもよい。本発明を実施するのに有用なリーダーは、配列番号８として提供され、このリーダーは、配列番号１８内に含まれる。特定の実施形態において、このようなＤＮＡ配列は、宿主細胞（例えば、トランスジェニック植物細胞を含む）内でリーダーとして作用し得ると定義され得る。１つの実施形態において、このような配列は、リーダー活性を含むものとしてデコードされる。

配列番号８として提示されるリーダー配列（５’ＵＴＲとも称される）、または配列番号１８に含まれるリーダーは、調節エレメントから構成される場合もあれば、または作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写もしくは翻訳に効果を及ぼし得る二次構造を採用する場合もある。配列番号８として提示されるリーダー配列、または配列番号１８に含まれるこのリーダーを本発明に従って使用して、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写または翻訳に影響を与えるキメラ調節エレメントを作製してもよい。

本明細書で使用する場合、「イントロン」という用語は、遺伝子から単離または同定され得、翻訳前のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）プロセシング中にスプライシング除去された領域として一般に定義され得る、ＤＮＡ分子を指す。代替的に、イントロンは、合成的に生成または操作されたＤＮＡエレメントであってもよい。イントロンは、作動可能に連結された遺伝子の転写をもたらすエンハンサーエレメントを含んでもよい。イントロンは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための調節エレメントとして使用することができる。構築物はイントロンを含むことができ、このイントロンは、転写可能なＤＮＡ分子に対し異種であってもなくてもよい。当該技術分野におけるイントロンの例としては、イネのアクチンイントロン及びトウモロコシＨＳＰ７０イントロンが挙げられる。

植物において、遺伝子構築物にいくつかのイントロンを含めると、イントロンを含まない構築物に比べて、ｍＲＮＡ及びタンパク質の蓄積が増加する。この効果は、遺伝子発現の「イントロン媒介増強」（ＩＭＥ）と称されている。植物内の発現を刺激することが公知のイントロンは、トウモロコシ遺伝子（例えば、ｔｕｂＡ１、Ａｄｈ１、Ｓｈ１、及びＵｂｉ１）、イネ遺伝子（例えば、ｔｐｉ）、ならびにペチュニア（例えば、ｒｂｃＳ）、ジャガイモ（例えば、ｓｔ－ｌｓ１）由来、及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（例えば、ｕｂｑ３及びｐａｔ１）由来の遺伝子のような双子葉植物遺伝子で同定されている。イントロンのスプライス部位内の欠失または変異によって遺伝子発現が低減することが示されており、このことは、ＩＭＥにはスプライシングが必要であり得ることを示すものである。ただし、双子葉植物におけるＩＭＥは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのｐａｔ１遺伝子のスプライス部位内の点変異によって示されている。１つの植物における同じイントロンの複数回使用は、デメリットを呈することが示されている。このような場合、適切な組換えＤＮＡエレメントを構築するための基本的な制御エレメントの集合を有することが必要になる。本発明を実施する上で有用な例示的なイントロンは、配列番号９、及び配列決定１８内に含まれるリーダーとして提示されている。

１つの実施形態において、本明細書で開示されるイントロン配列のフラグメントが提供される。イントロンフラグメントは、上記のようにイントロン活性を含み得、そして単独で、または他の発現エレメント及び発現エレメントのフラグメントと組み合わせて有用であり得る。特定の実施形態において、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、または少なくとも約２０００の連続したヌクレオチド、またはそれ以上の、本明細書で開示されるイントロン活性を有するＤＮＡ分子を含む、イントロンのフラグメントが提供される。出発イントロン分子からこのようなフラグメントを産生するための方法は、当該技術分野で周知である。

本明細書で使用する場合、「３’転写終結分子」、「３’非翻訳領域」、または「３’ＵＴＲ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の３’部分の非翻訳領域への転写の間に使用されるＤＮＡ分子を指す。ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域は、特異的切断及び３’ポリアデニル化（ポリＡテールとしても公知）によって生成され得る。３’ＵＴＲは、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結され、その下流に位置し得、転写、ｍＲＮＡプロセシング、または遺伝子発現に影響を及ぼし得るポリアデニル化シグナル及びその他の調節シグナルを含んでもよい。ポリＡテールは、ｍＲＮＡの安定性及び翻訳の開始において機能すると考えられている。当該技術分野における３’転写終結分子の例は、ノパリンシンターゼ３’領域、コムギｈｓｐ１７ ３’領域、エンドウルビスコ小サブユニット３’領域、ワタＥ６ ３’領域、及びコイクシン（ｃｏｉｘｉｎ）３’ＵＴＲである。

３’ＵＴＲは、典型的には、特定のＤＮＡ分子の組換え発現に有益な用途が見出される。弱い３’ＵＴＲはリードスルーを生じる可能性を有し、このリードスルーにより、隣接する発現カセット内にあるＤＮＡ分子の発現に影響が及ぶ恐れがある。転写終結を適切に制御することにより、下流に局在するＤＮＡ配列（例えば、他の発現カセット）へのリードスルーを防止し、さらに、遺伝子発現を改善するためのＲＮＡポリメラーゼの効率的なリサイクルを可能にし得る。効率的な転写終結（ＤＮＡからのＲＮＡポリメラーゼＩＩの遊離）は、転写の再開の前提条件であり、これによって全体的な転写レベルに直接影響が及ぶ。転写終結に続いて、成熟ｍＲＮＡが合成部位から遊離され、鋳型が細胞質に輸送される。真核生物のｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでポリ（Ａ）形態として蓄積され、従来の方法で転写終結部位を検出することが困難になる。

３’ＵＴＲを通じた遺伝子機能の調節は、比較的新しい分野であるのは、最近の配列決定技術だけが、種及び細胞タイプ全体にわたる３’ＵＴＲの全体像を提供してくれたからである。配列決定技術が利用可能になる前は、詳細な機能的及び機構的研究は、いくつかのモデル３’ＵＴＲでしか実行されなかった。これらのモデル３’ＵＴＲは、３’ＵＴＲ生物学の理解に大きく貢献しているが、それらの調節機能について導き出された結論は限られており、ｍＲＮＡの安定性に重点が置かれた。（Ｍａｙｒ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ（２０１７）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ３’－Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５１：１７１－１９４）ゲノム全体のインシリコ分析により、３’ＵＴＲのモチーフは主に、転写後レベルで遺伝子発現を調節するように作用する３’ＵＴＲと一致する、１本の鎖に保存されていることが明らかになった（Ｘｉｅ，Ｘ．ｅｔ．ａｌ．，（２００５）Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ ３’ ＵＴＲｓ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｍａｍｍａｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ ４３４：３３８－３４５）。３’ＵＴＲは、主にＡＵに富むエレメント及びｍｉＲＮＡによって媒介されるｍＲＮＡの安定性及び翻訳の調節を通じてタンパク質レベルを決定する。３’ＵＴＲはまた、ｍＲＮＡ局在化の調節を通じて局所翻訳も可能にする。３’ＵＴＲの長さは、代替の切断及びポリアデニル化によって調節され得る。３’ＵＴＲは、タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）を媒介し、これは、タンパク質複合体の形成、タンパク質の局在化、及びタンパク質の機能に広範な影響を及ぼす。３’ＵＴＲは、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）の結合を通じて遺伝子発現を調節する。ＲＢＰは３’ＵＴＲ ｃｉｓ－エレメントに結合し、エフェクタータンパク質の動員を通じて３’ＵＴＲ機能を媒介する。ＲＢＰは、ｉｎ ｖｉｖｏで機能的な特異性を可能にするために、他の結合したＲＢＰと協力する。特定の瞬間に３’ＵＴＲに結合するＲＢＰの組成は動的であり、例えば、翻訳後修飾の追加、他のＲＢＰの局所発現、ならびに膜及び細胞骨格フィラメントとの相互作用など、局所環境に応じて変化し得る。ＲＢＰ結合はまた、３’ＵＴＲのアクセス可能性を調節する二次及び三次ＲＮＡ構造形成によっても影響を受ける（Ｍａｙｒ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ（２０１７）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ３’－Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５１：１７１－１９４）。

ポリ（Ａ）テールは、ＲＮＡ分子の３’末端に対する一連のアデノシン塩基の付加の結果である。これにより、ｍＲＮＡの輸出、安定性及び崩壊、ならびに翻訳など、遺伝子発現の調節に役割を果たすポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）と呼ばれる調節因子のクラスの結合部位がｍＲＮＡに提供される。ｍＲＮＡの５’キャップ構造及びポリＡテールは、相乗的に機能してｍＲＮＡの翻訳を制御する。ＰＡＢＰとポリ（Ａ）テールとの結合は、５’キャップ構造に結合したｅＩＦ４Ｆとの相互作用を促進し、結果として翻訳開始を促進し、リボソームのリサイクル及び効率的な翻訳を保証するｍＲＮＡの環状化を生じる。この相互作用によりまた、３’ＵＴＲに結合した阻害剤タンパク質による翻訳の阻害も可能になる（Ｂａｒｒｅｔ，Ｌ ｅｔ．ａｌ．（２０１２）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６９：３６１３－３６３４）。

実際的な観点から、典型的には、発現カセットで使用される３’ＵＴＲが以下の特徴を有することは有益である。第１に、３’ＵＴＲは、導入遺伝子の転写を効率的かつ有効に終結し得るべきであり、かつ、１つの転移ＤＮＡ（Ｔ－ＤＮＡ）内に存在する複数の発現カセットの場合のように別の発現カセットから構成され得る、任意の隣接するＤＮＡ配列、またはＴ－ＤＮＡを挿入した隣接する染色体ＤＮＡへの転写物のリードスルーを防止し得るべきである。第２に、３’ＵＴＲは、ＤＮＡ分子の発現を駆動するために使用されるプロモーター、リーダー、エンハンサー、及びイントロンが付与する転写活性の低減を（これが望ましい転帰でない限り）引き起こすべきではない。以下の実施例では、同じエンハンサー、プロモーター、リーダー、及びイントロン配列を使用して発現を駆動することを示すデータが提供されており、配列番号１～５として示される３’ＵＴＲは、発現を互いに示差的に調節し、タンパク質発現に対して組織特異的な効果を示す。最後に、植物のバイオテクノロジーにおいて、３’ＵＴＲは、形質転換植物から抽出された逆転写ＲＮＡの増幅反応のプライミングに使用されることが多く、そして、（１）植物染色体に一旦組み込まれた発現カセットの転写活性または発現を評価すること、（２）植物ＤＮＡ内の挿入物のコピー数を評価すること、及び（３）育種後に得られた種子の接合性を評価することに使用される。また、３’ＵＴＲは、挿入されたカセットのインタクト性を特徴付けるために、形質転換植物から抽出されたＤＮＡの増幅反応にも使用される。本発明を実施する上で有用な３’ＵＴＲは、配列番号１～５、及び１２～１３として提示されている。

一実施形態では、本明細書に開示される３’ＵＴＲ配列のフラグメントが提供される。３’ＵＴＲフラグメントは、上記のように３’ＵＴＲ活性を含んでもよく、そして単独で、または他の発現エレメント及び発現エレメントのフラグメントと組み合わせて有用であり得る。特定の実施形態において、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、または少なくとも約６５０、またはそれ以上の、本明細書で開示される３’ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ分子を含む、３’ＵＴＲのフラグメントが提供される。出発３’ＵＴＲ分子からこのようなフラグメントを産生するための方法は、当該技術分野で周知である。

本明細書で使用する場合、「エンハンサー」または「エンハンサーエレメント」という用語は、ｃｉｓ作用性調節エレメント（別名ｃｉｓ－エレメント）を意味し、これは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の全体的発現パターン（ただし通常、単独では転写の駆動に不十分である）の一態様をもたらす。プロモーターとは異なり、通常、エンハンサーエレメントには、転写開始部位（ＴＳＳ）もしくはＴＡＴＡボックス、または同等のＤＮＡ配列は含まれていない。プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、天然に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列の転写に影響を及ぼす１つ以上のエンハンサーエレメントを含んでもよい。また、エンハンサーエレメントをプロモーターと融合させて、キメラプロモーターｃｉｓ－エレメントを産生してもよく、これにより遺伝子発現の全体的調整の一態様がもたらされる。

多くのプロモーターエンハンサーエレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質に結合するか、及び／またはＤＮＡトポロジーに影響を及ぼして、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡ鋳型へのアクセスを選択的に許可もしくは制限する局所的立体構造、または転写開始部位での二重らせんの選択的開放を促進する局所的立体構造を生成すると考えられている。エンハンサーエレメントは、転写を調節する転写因子に結合するように機能し得る。いくつかのエンハンサーエレメントは２つ以上の転写因子に結合し、転写因子は、異なる親和性で２つ以上のエンハンサードメインと相互作用し得る。エンハンサーエレメントの同定は、欠失解析（すなわち、プロモーターに対する５’末端もしくは内部から１つ以上のヌクレオチドを欠失させる）や、ＤＮａｓｅＩフットプリンティングを用いたＤＮＡ結合タンパク質解析、メチル化干渉、電気泳動移動度シフトアッセイ、ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｉｎ ｖｉｖｏゲノムフットプリンティング、及びその他の従来的なアッセイを含めた複数の技法によって行っても、または、ＢＬＡＳＴなどの従来のＤＮＡ配列比較法と共に標的配列もしくは標的モチーフとして、公知のｓｉｓ－エレメントモチーフもしくはエンハンサーエレメントを用いたＤＮＡ配列類似性解析によって行ってもよい。エンハンサードメインの微細構造は、１つ以上のヌクレオチドの変異誘発（もしくは置換）により、または当該技術分野で公知の他の従来的な方法により、さらに研究され得る。エンハンサーエレメントは、化学合成により、またはこのようなエレメントを含む調節エレメントからの単離により得ることができ、これらは、部分配列の操作を容易にするための有用な制限酵素部位を含む追加の隣接ヌクレオチドと共に合成され得る。したがって、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための、本明細書で開示される方法に従ったエンハンサーエレメントの設計、構築、及び使用は、本発明に包含される。本発明を実施するのに有用なエンハンサーは、配列番号１０、１４、及び１５として提供される。

１つの実施形態において、本明細書で開示されるエンハンサー配列のフラグメントが提供される。エンハンサーフラグメントは、上記のようにエンハンサー活性を含んでもよく、そして単独で、または他の発現エレメント及び発現エレメントのフラグメントと組み合わせて有用であり得る。特定の実施形態において、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、または少なくとも約４５０、またはそれ以上の、本明細書で開示されるエンハンサー活性を有するＤＮＡ分子を含む、エンハンサーのフラグメントが提供される。出発エンハンサー分子からこのようなフラグメントを産生するための方法は、当該技術分野で周知である。

本明細書で使用する場合、「キメラ」という用語は、第１のＤＮＡ分子を第２のＤＮＡ分子と融合させることによって産生される単一のＤＮＡ分子を指し、第１のＤＮＡ分子も第２のＤＮＡ分子も、通常はこの構成（すなわち、他方と融合した構成）では見出されない。したがって、キメラＤＮＡ分子は、他の方法では通常は自然界に見出されない新規のＤＮＡ分子である。本明細書で使用する場合、「キメラプロモーター」という用語は、このようなＤＮＡ分子の操作によって産生されたプロモーターを指す。「キメラエンハンサー」とは、ＤＮＡ分子の操作によって生成されるエンハンサーを指す。「キメライントロン」とは、ＤＮＡ分子の操作によって生成されるイントロンを指す。「キメラ３’ＵＴＲ」とは、ＤＮＡ分子の操作によって生成される３’ＵＴＲを指す。キメラプロモーター、エンハンサー、イントロンまたは３’ＵＴＲは、２つ以上のＤＮＡフラグメントを組み合わせてもよい（例えば、プロモーターのエンハンサーエレメントに対する融合）。したがって、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための、本明細書で開示される方法に従ったキメラプロモーター、エンハンサー、イントロンまたは３’ＵＴＲの設計、構築、及び使用は、本発明に包含される。

キメラ調節エレメントは、当該技術分野で公知の様々な方法、例えば、制限酵素消化及びライゲーション、ライゲーション非依存的クローニング、増幅中のＰＣＲ産物のモジュラーアセンブリ、または調節エレメントの直接化学合成、ならびに当該技術分野で公知のその他の方法によって、作動可能に連結され得る様々な構成エレメントを含むように設計され得る。得られる様々なキメラ調節エレメントは、同じ構成エレメントまたは同じ構成エレメントのバリアントから構成されてもよいが、構成部分が作動可能に連結するのを可能にする連結ＤＮＡ配列（複数可）を含むＤＮＡ配列（複数可）が異なる。本発明において、配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９として提供されるＤＮＡ配列は、調節エレメント参照配列を提供する場合があり、このとき、参照配列を構成する構成エレメントは、当該技術分野で公知の方法によって連結されてもよく、また、細菌及び植物細胞の形質転換で天然に生じる１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、及び／または挿入、あるいは変異を含んでもよい。

本明細書で使用する場合、「バリアント」という用語は、組成が第１のＤＮＡ分子と類似しているが同一ではない第２のＤＮＡ分子、例えば、調節エレメントを指し、このとき、第２のＤＮＡ分子は、例えば、第１のＤＮＡ分子とおおよそ同等の転写活性によって、そのＤＮＡ分子の一般的な機能性、すなわち、同じまたは同様の発現パターンを依然として維持する。バリアントは、第１のＤＮＡ分子のより短いもしくは短縮バージョン、または第１のＤＮＡ分子の配列の改変バージョン、例えば、制限酵素部位が異なるか、及び／または内部の欠失、置換、もしくは挿入を有するバージョンであり得る。また、「バリアント」は、参照配列の１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入を含むヌクレオチド配列を有する調節エレメントも包含し得、このとき、誘導体調節エレメントは、対応する親調節分子よりも大きいかもしくは小さいかまたは同等の転写もしくは翻訳活性を有する。また、調節エレメント「バリアント」は、細菌及び植物細胞の形質転換で天然に生じる変異から生じるバリアントも包含する。本発明において、配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９として提供されるポリヌクレオチド配列を使用して、元の調節エレメントのＤＮＡ配列と組成が類似するが同一ではなく、一方で元の調節エレメントの一般的な機能性、すなわち、同じまたは同様の発現パターンを依然として維持する、バリアントを創出し得る。本発明のこのようなバリアントの産生は、本開示に照らして当業者の通常の技量範囲内であり、本発明の範囲内に包含される。

本明細書で説明される修飾、重複、または欠失における、特定の導入遺伝子の所望の発現態様に対する有効性は、安定した一過性の植物アッセイ、例えば、本明細書の作業実施例で説明されるアッセイで、経験的に試験して結果を検証し得、この結果は、出発ＤＮＡ分子に行う変更、及び変更の目的に応じて異なり得る。

構築物
本明細書で使用する場合、「構築物」という用語は、任意の供給源に由来し、ゲノム統合または自己複製が可能であり、少なくとも１つのＤＮＡ分子が別のＤＮＡ分子と機能的に作動する方式で連結された、すなわち作動可能に連結されたＤＮＡ分子を含む、任意の組換えＤＮＡ分子、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または線状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を意味する。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、形質転換、すなわち、宿主細胞内に異種のＤＮＡまたはＲＮＡを導入する目的で使用することができる任意の構築物を意味する。構築物は、典型的には、１つ以上の発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「発現カセット」とは、１つ以上の調節エレメント、典型的には少なくともプロモーター及び３’ＵＴＲと作動可能に連結された、少なくとも１つの転写可能なＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子を指す。

本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、第１のＤＮＡ分子が第２のＤＮＡ分子と連結し、この第１のＤＮＡ分子が第２のＤＮＡ分子の機能に影響を及ぼすようにこの第１及び第２のＤＮＡ分子が配置されていることを指す。２つのＤＮＡ分子は、単一の連続したＤＮＡ分子の一部である場合もそうでない場合もあり、隣接する場合もそうでない場合もある。例えば、プロモーターが細胞内の目的の転写可能なＤＮＡ分子の転写を調整する場合、このプロモーターは転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている。例えば、リーダーは、ＤＮＡ配列の転写または翻訳に影響を及ぼし得る、ＤＮＡ配列と作動可能に連結されている。

本発明の構築物は、１つの実施形態において、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞がもたらす転移分子と共に、Ｔ－ＤＮＡの植物細胞のゲノム内への統合を可能にするＴ－ＤＮＡを含む、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓから単離されたＴｉプラスミドの右側境界（ＲＢまたはＡＧＲｔｕ．ＲＢ）及び左側境界（ＬＢまたはＡＧＲｔｕ．ＬＢ）領域を有する二重腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド境界構築物として提供され得る（例えば、米国特許第６，６０３，０６１号を参照）。また、構築物は、細菌細胞における複製機能及び抗生物質選択をもたらすプラスミド骨格ＤＮＡセグメント、例えば、ｏｒｉ３２２などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ複製開始点、ｏｒｉＶまたはｏｒｉＲｉなどの広宿主域複製開始点、及びスペクチノマイシンもしくはストレプトマイシンに対する抵抗性を付与するＴｎ７アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードするＳｐｅｃ／Ｓｔｒｐなどの選択マーカー、またはゲンタミシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）選択マーカー遺伝子についてのコード領域も含んでもよい。植物形質転換については、宿主細菌株は、多くの場合Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＢＩ、Ｃ５８、またはＬＢＡ４４０４であるが、植物形質転換の技術分野において当業者に公知のその他の株も、本発明では機能し得る。

転写可能なＤＮＡ分子が、タンパク質として翻訳及び発現される機能的ｍＲＮＡ分子に転写されるような方式で、構築物を集成し細胞内に導入するための方法が、当該技術分野で公知である。本発明の実施については、構築物及び宿主細胞を調製及び使用するための従来的な組成物及び方法は、当業者に周知である。より高等な植物内での核酸の発現に有用である典型的なベクターは当該技術分野で周知であり、これにはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドに由来するベクター及びｐＣａＭＶＣＮ転移制御ベクターが含まれる。

本明細書で提供される任意の調節エレメントを含めた様々な調節エレメントを構築物に含んでもよい。任意のこのような調節エレメントは、他の調節エレメントと組み合わせて提供され得る。このような組合せは、望ましい調節機能をもたらすように設計または修飾され得る。１つの実施形態において、本発明の構築物は、３’ＵＴＲと作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結された、少なくとも１つの調節エレメントを含む。

本発明の構築物は、本明細書で提供されるか、または当該技術分野で公知である任意のプロモーターまたはリーダーを含んでもよい。例えば、本発明のプロモーターは、異種の非翻訳５’リーダー（例えば、熱ショックタンパク質遺伝子に由来するもの）と作動可能に連結されてもよい。代替的に、本発明のリーダーは、異種のプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写物プロモーターと作動可能に連結され得る。

発現カセットはまた、作動可能に連結されたタンパク質が、特に葉緑体、白色体、もしくは他の色素体細胞小器官、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、液胞、または細胞外の位置に対し、細胞レベル以下で標的化するのに有用なペプチドをコードする、輸送ペプチドコード配列も含んでもよい。多くの葉緑体局在化タンパク質は、核遺伝子から前駆体として発現され、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体に標的化される。このような単離された葉緑体タンパク質の例としては、限定されるものではないが、リブロース－１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、集光性複合タンパク質Ｉ及びタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、ならびにエノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）に関連するものが挙げられる。葉緑体輸送ペプチドは、例えば、米国特許第７，１９３，１３３号で説明されている。非葉緑体タンパク質は、非葉緑体タンパク質をコードする導入遺伝子と作動可能に連結された異種ＣＴＰを発現させることにより、葉緑体を標的化させ得ることが実証されている。

転写可能なＤＮＡ分子
本明細書で使用する場合、「転写可能なＤＮＡ分子」という用語は、ＲＮＡ分子への転写が可能な任意のＤＮＡ分子を指し、これには、限定されるものではないが、タンパク質コード配列を有するＤＮＡ分子、及び遺伝子抑制に有用な配列を有するＲＮＡ分子を産生するＤＮＡ分子が挙げられる。ＤＮＡ分子のタイプとしては、限定されるものではないが、同じ植物からのＤＮＡ分子、別の植物からのＤＮＡ分子、異なる生物からのＤＮＡ分子、あるいは合成ＤＮＡ分子、例えば、遺伝子のアンチセンスメッセージを含むＤＮＡ分子、または人工、合成、もしくは別の方法で修飾されたバージョンの導入遺伝子をコードするＤＮＡ分子を挙げることができる。本発明の構築物に組み込むための例示的な転写可能なＤＮＡ分子としては、例えば、ＤＮＡ分子を組み込む種以外の種由来のＤＮＡ分子もしくは遺伝子、または同じ種から生じるか、もしくは同じ種に存在するが、古典的な育種技法ではなく遺伝子工学の方法によってレシピエント細胞に組み込まれる遺伝子が挙げられる。

「導入遺伝子」とは、少なくとも宿主細胞ゲノム内の位置に関して宿主細胞に対し異種である転写可能なＤＮＡ分子、及び／または細胞の現行世代もしくは任意の過去の世代に人工的に宿主細胞のゲノムに組み込まれた転写可能なＤＮＡ分子を指す。

調節エレメント、例えば、本発明のプロモーター、エンハンサー、イントロンまたは３’ＵＴＲは、調節エレメントに対し異種である転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されていてもよい。本明細書で使用する場合、「異種」という用語は、２つ以上のＤＮＡ分子の組合せであって、このような組み合わせが自然界で通常は見出されないときの組合せを指す。例えば、２つのＤＮＡ分子は異なる種に由来してもよく、及び／または２つのＤＮＡ分子は異なる遺伝子に由来してもよい（例えば、同じ種由来の異なる遺伝子、または異なる種由来の同じ遺伝子）。したがって、調節エレメントは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子に対して、このような組合せが自然界で通常は見出されない場合、すなわち、転写可能なＤＮＡ分子が、調節エレメントと作動可能に連結して天然に生じない場合、異種である。

転写可能なＤＮＡ分子は、概して、転写物の発現が所望される任意のＤＮＡ分子であり得る。このような転写物の発現により、結果として生じるｍＲＮＡ分子の翻訳、したがってタンパク質発現がもたらされ得る。代替的に、例えば、転写可能なＤＮＡ分子は、最終的に、特定の遺伝子またはタンパク質の発現低下を引き起こすように設計され得る。１つの実施形態において、これは、アンチセンス方向に配向した転写可能なＤＮＡ分子を使用することによって達成され得る。当業者は、このようなアンチセンス技術の使用に精通している。この方式で任意の遺伝子を負に調節し得、１つの実施形態においては、転写可能なＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子の発現を通じて特定の遺伝子を抑制するように設計し得る。

したがって、本発明の１つの実施形態は、構築物がトランスジェニック植物細胞のゲノムに統合されたときに、転写可能なＤＮＡ分子の転写を所望のレベルまたは所望のパターンで調整するように異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている、配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９として提供されるものなど、本発明の調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子である。１つの実施形態において、転写可能なＤＮＡ分子は遺伝子のタンパク質コード領域を含み、別の実施形態において、転写可能なＤＮＡ分子は遺伝子のアンチセンス領域を含む。

農学的目的の遺伝子
転写可能なＤＮＡ分子は、農学的目的の遺伝子であり得る。本明細書で使用する場合、「農学的目的の遺伝子」という用語は、特定の植物組織、細胞、または細胞タイプで発現したときに、望ましい特性を付与する転写可能なＤＮＡ分子を指す。農学的目的の遺伝子の産物は、植物の形態、生理学、成長、発達、収量、穀粒組成、栄養プロファイル、病害もしくは害虫抵抗性、及び／または環境的もしくは化学的耐性に対する効果を引き起こすために植物内で作用する場合もあれば、植物を常食とする害虫の餌で殺虫剤として作用する場合もある。本発明の１つの実施形態において、本発明の調節エレメントは、この調節エレメントが、農学的目的の遺伝子である転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結するように、構築物内に組み込まれる。このような構築物を含むトランスジェニック植物において、農学的目的の遺伝子の発現は、有益な農学的形質を付与し得る。有益な農学的形質としては、例えば、限定されるものではないが、除草剤耐性、昆虫防除、改変された収量、疾患抵抗性、病原体抵抗性、改変された植物成長及び発達、改変されたデンプン含量、改変された油含量、改変された脂肪酸含量、改変されたタンパク質含量、改変された果実成熟、動物及びヒトの栄養強化、生体高分子産生、環境ストレス抵抗性、医薬品ペプチド、加工品質の改善、風味の改善、ハイブリッド種子産生有用性、繊維産生の改善、ならびに望ましいバイオ燃料産生を挙げることができる。

当該技術分野で公知の農学的目的の遺伝子の例としては、除草剤抵抗性（米国特許第６，８０３，５０１号；第６，４４８，４７６号；第６，２４８，８７６号；第６，２２５，１１４号；第６，１０７，５４９号；第５，８６６，７７５号；第５，８０４，４２５号；第５，６３３，４３５号；及び第５，４６３，１７５号）、収量増加（米国特許第ＵＳＲＥ３８，４４６号；第６，７１６，４７４号；第６，６６３，９０６号；第６，４７６，２９５号；第６，４４１，２７７号；第６，４２３，８２８号；第６，３９９，３３０号；第６，３７２，２１１号；第６，２３５，９７１号；第６，２２２，０９８号；及び第５，７１６，８３７号）、昆虫防除（米国特許第６，８０９，０７８号；第６，７１３，０６３号；第６，６８６，４５２号；第６，６５７，０４６号；第６，６４５，４９７号；第６，６４２，０３０号；第６，６３９，０５４号；第６，６２０，９８８号；第６，５９３，２９３号；第６，５５５，６５５号；第６，５３８，１０９号；第６，５３７，７５６号；第６，５２１，４４２号；第６，５０１，００９号；第６，４６８，５２３号；第６，３２６，３５１号；第６，３１３，３７８号；第６，２８４，９４９号；第６，２８１，０１６号；第６，２４８，５３６号；第６，２４２，２４１号；第６，２２１，６４９号；第６，１７７，６１５号；第６，１５６，５７３号；第６，１５３，８１４号；第６，１１０，４６４号；第６，０９３，６９５号；第６，０６３，７５６号；第６，０６３，５９７号；第６，０２３，０１３号；第５，９５９，０９１号；第５，９４２，６６４号；第５，９４２，６５８号；５，８８０，２７５号；第５，７６３，２４５号；及び第５，７６３，２４１号）、真菌病害抵抗性（米国特許第６，６５３，２８０号；第６，５７３，３６１号；第６，５０６，９６２号；第６，３１６，４０７号；第６，２１５，０４８号；第５，５１６，６７１号；第５，７７３，６９６号；第６，１２１，４３６号；第６，３１６，４０７号；及び第６，５０６，９６２号）、ウイルス抵抗性（米国特許第６，６１７，４９６号；第６，６０８，２４１号；第６，０１５，９４０号；第６，０１３，８６４号；第５，８５０，０２３号；及び第５，３０４，７３０号）、線虫抵抗性（米国特許第６，２２８，９９２号）、細菌病害抵抗性（米国特許第５，５１６，６７１号）、植物成長及び発達（米国特許第６，７２３，８９７及び第６，５１８，４８８号）、デンプン産生（米国特許第６，５３８，１８１号；第６，５３８，１７９号；第６，５３８，１７８号；第５，７５０，８７６号；及び第６，４７６，２９５号）、改変された油産生（米国特許第６，４４４，８７６号；第６，４２６，４４７号；第６，３８０，４６２号）、高い油産生（米国特許第６，４９５，７３９号；第５，６０８，１４９号；第６，４８３，００８号；第６，４７６，２９５号）、改変された脂肪酸含量（米国特許第６，８２８，４７５号；第６，８２２，１４１号；第６，７７０，４６５号；第６，７０６，９５０号；第６，６６０，８４９号；第６，５９６，５３８号；第６，５８９，７６７号；第６，５３７，７５０号；第６，４８９，４６１号；第６，４５９，０１８号）、高いタンパク質産生（米国特許第６，３８０，４６６号）、果実成熟（米国特許第５，５１２，４６６号）、動物及びヒトの栄養強化（米国特許第６，７２３，８３７号；第６，６５３，５３０号；第６，５４１２，５９号；第５，９８５，６０５号；第６，１７１，６４０号）、生体高分子（米国特許第ＵＳＲＥ３７，５４３号；第６，２２８，６２３号；第５，９５８，７４５号、及び第６，９４６，５８８号）、環境ストレス抵抗性（米国特許第６，０７２，１０３号）、医薬ペプチド及び分泌性ペプチド（米国特許第６，８１２，３７９号；第６，７７４，２８３号；第６，１４０，０７５号；及び第６，０８０，５６０号）、プロセシング形質の改善（米国特許第６，４７６，２９５号）、消化率の改善（米国特許第６，５３１，６４８号）、低いラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号）、工業用酵素産生（米国特許第５，５４３，５７６号）、風味の改善（米国特許第６，０１１，１９９号）、窒素固定（米国特許第５，２２９，１１４号）、ハイブリッド種子産生（米国特許第５，６８９，０４１号）、繊維産生（米国特許第６，５７６，８１８号；第６，２７１，４４３号；第５，９８１，８３４号；及び第５，８６９，７２０号）、ならびにバイオ燃料産生（米国特許第５，９９８，７００号）が挙げられる。

代替的に、農学的目的の遺伝子は、内在的遺伝子の遺伝子発現の標的化された調整を引き起こすＲＮＡ分子をコードすることにより、例えば、アンチセンス（例えば、米国特許５，１０７，０６５号を参照）、阻害ＲＮＡ（「ＲＮＡｉ」；例えば、米国特許出願公開第２００６／０２００８７８及び同第２００８／００６６２０６、ならびに米国特許出願第１１／９７４，４６９号で説明されているように、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、トランス作用ｓｉＲＮＡ、及びフェーズｓＲＮＡが媒介する機構による遺伝子発現の調整が含まれる）により、または共抑制が媒介する機構により、上記の植物の特性または表現型に影響を及ぼし得る。また、ＲＮＡは、所望の内在的ｍＲＮＡ産物を切断するように操作された触媒ＲＮＡ分子（例えば、リボザイムまたはリボスイッチ；例えば、米国特許出願公開第２００６／０２００８７８を参照）であってもよいと考えられる。転写可能なＤＮＡ分子が遺伝子抑制を引き起こし得る分子に転写されるような方式で、構築物を構築し細胞内に導入するための方法が、当該技術分野で公知である。

選択マーカー
選択マーカー導入遺伝子を本発明の調節エレメントと共に使用してもよい。本明細書で使用する場合、「選択マーカー導入遺伝子」という用語は、トランスジェニック植物、組織、もしくは細胞内の発現、または発現の欠如が何らかの方法でスクリーニングまたはスコアリングされ得る、任意の転写可能なＤＮＡ分子を指す。本発明を実施する上で使用するための選択マーカー遺伝子、ならびにその関連する選択及びスクリーニング技法は当該技術分野で公知であり、これには、限定されるものではないが、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、抗生物質抵抗性を付与するタンパク質、及び除草剤耐性を付与するタンパク質をコードする転写可能なＤＮＡ分子が挙げられる。選択マーカー導入遺伝子の例は、配列番号１１として提供される。

細胞形質転換
本発明は、形質転換された細胞及び植物を産生する方法であって、転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結された１つ以上の調節エレメントを含む、方法も対象とする。

「形質転換」という用語は、ＤＮＡ分子をレシピエント宿主内に導入することを指す。本明細書で使用する場合、「宿主」という用語は細菌、真菌、または植物を意味し、これには、任意の細胞、組織、器官、または細菌、真菌、もしくは植物の後代が含まれる。特に目的となる植物組織及び細胞としては、プロトプラスト、カルス、根、塊茎、種子、茎、葉、実生、胚、及び花粉が挙げられる。

本明細書で使用する場合、「形質転換された」という用語は、外来ＤＮＡ分子（例えば、構築物）が導入された細胞、組織、器官、または生物体を指す。導入されたＤＮＡ分子をレシピエント細胞、組織、器官、または生物体のゲノムＤＮＡに組み込んで、導入されたＤＮＡ分子が次の後代に受け継がれるようにしてもよい。「トランスジェニック」または「形質転換された」細胞または生物体としては、細胞または生物の後代、及び交配でこのようなトランスジェニック生物を親として用いた育種プログラムから産生され、外来ＤＮＡ分子の存在によって生じる表現型の改変を示す後代も含まれ得る。また、導入されたＤＮＡ分子をレシピエント細胞内に一過性に導入して、導入されたＤＮＡ分子が次の後代に受け継がれないようにしてもよい。「トランスジェニック」という用語は、１つ以上の異種のＤＮＡ分子を含む細菌、真菌、または植物を指す。

ＤＮＡ分子を植物細胞内に導入するための方法は多数存在し、当業者に周知である。このプロセスは、概して、好適な宿主細胞を選択するステップと、宿主細胞をベクターで形質転換するステップと、形質転換宿主細胞を得るステップとを含む。本発明を実施する上で、植物構築物を植物ゲノム内に導入することにより植物細胞を形質転換するための方法及び材料としては、任意の周知でありかつ実証された方法が含まれ得る。好適な方法としては、限定されるものではないが、中でも細菌感染（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バイナリーＢＡＣベクター、ＤＮＡの直接送達（例えば、ＰＥＧ媒介の形質転換、乾燥／阻害媒介のＤＮＡ取込み、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維による撹拌、及びＤＮＡコーティング粒子の加速）、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）が挙げられる。

宿主細胞は、任意の細胞または生物、例えば、植物細胞、藻類細胞、藻類、真菌細胞、真菌、細菌細胞、または昆虫細胞であってもよい。特定の実施形態において、宿主細胞及び形質転換細胞としては、作物植物からの細胞が含まれ得る。

トランスジェニック植物は、その後、本発明のトランスジェニック植物細胞から再生され得る。従来の育種技法または自家受粉を用いて、このトランスジェニック植物から種子が産生され得る。このような種子、及びこのような種子から成長した結果生じる後代植物は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含み、そのためトランスジェニックとなる。

本発明のトランスジェニック植物は、自家受粉して（組換えＤＮＡ分子に対してホモ接合性の）本発明のホモ接合性トランスジェニック植物の種子を提供し得るか、または非トランスジェニック植物もしくは異なるトランスジェニック植物と交配して、（組換えＤＮＡ分子に対しヘテロ接合性の）本発明のヘテロ接合性トランスジェニック植物の種子を提供し得る。このようなホモ接合性及びヘテロ接合性のトランスジェニック植物は共に、本明細書では「後代植物」と称される。後代植物とは、元のトランスジェニック植物に由来し本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物である。本発明のトランスジェニック植物を用いて産生した種子を、収穫し、本発明の構築物を含みかつ農学的目的の遺伝子を発現するトランスジェニック植物、すなわち本発明の後代植物の世代を成長させるために使用してもよい。種々の作物に一般に使用されている育種の方法についての説明は、いくつかの参考文献の１つから見出すことができる。例えば、Ａｌｌａｒｄ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｕ．ｏｆ ＣＡ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ，５０－９８（１９６０）；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，３６９－３９９（１９７９）；Ｓｎｅｅｐ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅｎ，Ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ（ｅｄ），Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ（１９７９）；Ｆｅｈｒ，Ｓｏｙｂｅａｎｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ，１６：２４９（１９８７）；Ｆｅｈｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｖａｒｉｅｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，（Ｖｏｌ．１）ａｎｄ Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｏｙｂｅａｎ（Ｖｏｌ．２），Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ＮＹ，３６０－３７６（１９８７）を参照のこと。

形質転換植物は、目的の遺伝子（複数可）の存在、ならびに本発明の調節エレメントが付与する発現レベル及び／またはプロファイルについて解析され得る。当業者は、形質転換植物の解析に利用できる多数の方法を認識している。例えば、植物解析の方法としては、限定されるものではないが、サザンブロットまたはノーザンブロット、ＰＣＲベースのアプローチ、生化学的解析、表現型スクリーニング法、現地評価、及び免疫診断アッセイが挙げられる。転写可能なＤＮＡ分子の発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））の試薬及び製造業者が説明する方法、ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘを用いて決定したＰＣＲサイクル時間を用いて測定され得る。代替的に、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））の試薬及び製造業者が説明する方法を使用して、導入遺伝子の発現を評価してもよい。

本発明はまた、本発明の植物の部位も提供する。植物の部位としては、限定されるものではないが、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、及び花粉が挙げられる。本発明の植物の部位は、生存可能、生存不能、再生可能、及び／または再生不可能であり得る。また、本発明は、本発明のＤＮＡ分子を含む形質転換植物細胞も含み、これを提供する。本発明の形質転換またはトランスジェニック植物細胞としては、再生可能及び／または再生不可能な植物細胞が含まれる。

また、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその一部から産生される商品生産物も提供する。本発明の商品生産物は、配列番号２～８、１２～１４及び１６～１９からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、ある検出可能量のＤＮＡを含む。本明細書で使用する場合、「商品生産物」とは、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物、種子、植物細胞、または植物の部位に由来する材料から構成される任意の組成物または産物を指す。商品生産物としては、限定されるものではないが、加工された種子、穀物、植物の部位、及び粗粉が挙げられる。本発明の商品生産物は、本発明の組換えＤＮＡ分子に対応する、ある検出可能量のＤＮＡを含むことになる。商品生産物の含量または供給源を決定するために、試料中での１つ以上のこのＤＮＡの検出を使用してもよい。本明細書で開示される検出方法を含めて、任意の標準的なＤＮＡ分子の検出方法を使用してもよい。

本発明は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解され得、この実施例は、明記されない限り、例示として示されるものであり、本発明を限定するとは意図されていない。当業者は、以下の実施例で開示される技法が、発明者によって発見された、本発明を実施する上で十分に機能するための技法に相当することを、理解するはずである。ただし、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態に多くの変更を行ってもよく、それでもなお、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、類似のまたは同様の結果が得られることを理解するはずであり、そのため、示された全ての内容は例示的なものとして解釈するものとし、限定的な意味では解釈しないものとする。

実施例１
調節エレメントの同定及びクローニング
新規の転写調節エレメント及び調節発現エレメント群（ＥＸＰ）を同定し、いくつかの単子葉植物種のゲノムＤＮＡからクローニングした。

新規の３つの主要な非翻訳領域（３’ＵＴＲ）配列を、いくつかの単子葉植物種の独自の配列で同定した。以下の表１は、様々な３’ＵＴＲ及びそれらが由来する単子葉植物の種を示している。３’ＵＴＲ、Ｔ－ＳＥＴｉｔ．Ａｍｓ１：１（配列番号１）は、米国特許出願ＵＳ２０１３００３１６７２で 配列番号２７０として以前に提示されている。

さらに、Ｚｅａ ｍａｙｓのゲノムＤＮＡから単離されたプロモーター（Ｐ－Ｚｍ．Ｌｔｐ－１：１：２）及びリーダー（Ｌ－Ｚｍ．Ｌｔｐ－１：１：３）、ならびにＳｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃのゲノムＤＮＡから単離されたイントロンを含むＥＸＰ配列を作成して、クローニングした。ＥＸＰ、ＥＸＰ－Ｚｍ．ＬＴＰ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４（配列番号６）は、５’ＵＴＲの５’に作動可能に連結されているプロモーターであるＰ－Ｚｍ．Ｌｔｐ－１：１：２（配列番号７）、イントロンの５’に作動可能に連結されているＬ－Ｚｍ．Ｌｔｐ－１：１：３（配列番号８）、Ｉ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：２（配列番号９；以前は米国特許出願ＵＳ２０１３００３１６７２の配列番号６２７として提示）から構成される。

これらの３’ＵＴＲ及びＥＸＰ－Ｚｍ．ＬＴＰ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４は、当該技術分野で公知の方法を使用して、バイナリー植物形質転換ベクターにクローニングされた。

実施例２
３’ＵＴＲの分析、及び安定的に形質転換されたトウモロコシ植物における導入遺伝子の発現に対するそれらの影響
トウモロコシ植物をベクター、具体的には、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する転写調節エレメント及び実施例１に提示された七（７）つの３’ＵＴＲ調節エレメントのそれぞれの１つを含む植物発現ベクターで形質転換した。発現に対する３’ＵＴＲ調節エレメントの効果を評価するために、ＧＵＳタンパク質発現について、得られた植物を分析した。

トウモロコシ植物を植物ＧＵＳ発現構築物で形質転換した。当該技術分野で公知である方法を用いて、３’ＵＴＲ調節エレメントをベースの植物発現ベクターにクローニングした。得られた植物発現ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の左側の境界領域と、除草剤グリホサートに対する抵抗性を付与する形質転換植物細胞の選択に使用する第１の導入遺伝子選択カセットと、３’ＵＴＲ調節エレメントの活性を評価するための第２の導入遺伝子カセットであって、実施例１に示される七（７）つの３’ＵＴＲ調節エレメントの各々のうちの１つに対して５’側で作動可能に連結された、ジャガイモ光誘導性組織特異的ＳＴ－ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：Ｘ０４７５３）に由来するプロセシング可能なイントロンを含むβ－グルクロニダーゼをコードする植物細胞内での発現用に設計された合成コード配列（ＧＵＳ、ＧＯＩ－Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１．ｎｎｏ：１、配列番号１１）に対して５’側に作動可能に連結されたＥＸＰ，ＥＸＰ－Ｚｍ．ＬＴＰ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４（配列番号６）に対して５’側に作動可能に連結された、逆相補性方向でカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター由来のエンハンサー（Ｅ－ＣａＭＶ．３５Ｓ－ＲＣ、配列番号１０）を含む第２の導入遺伝子カセット、続いて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の右側境界領域を含んでいた。

トウモロコシ変種０１ＤＫＤ２由来のトウモロコシ植物細胞を、当該技術分野で周知であるように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介の形質転換により、これらのバイナリー形質転換ベクター構築物を用いて形質転換した。得られた形質転換植物細胞を、全トウモロコシ植物を形成するように誘導した。

組織化学的ＧＵＳ分析は、形質転換植物の定性的及び定量的発現分析に使用した。組織切片全体をＧＵＳ染色液Ｘ－Ｇｌｕｃ（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－ｂ－グルクロニド）（１ミリグラム／ミリリットル）と適切な時間インキュベートし、すすいで、青色の着色を視覚的に検査した。ＧＵＳの活性は、直接の目視検査または選択した植物器官及び組織を使用した顕微鏡下での検査によって定性的に決定した。

ＧＵＳ発現の定量的解析のために、形質転換したトウモロコシ植物の選択組織から全タンパク質を抽出した。１マイクログラムの全タンパク質を、５０マイクロリットルの総反応体積中の蛍光発生基質４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルクロニド（ＭＵＧ）と共に用いた。反応産物４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）は高ｐＨで最大限に蛍光性となり、このときヒドロキシル基がイオン化される。炭酸ナトリウムの塩基性溶液を添加すると、同時に、アッセイが停止し、蛍光産物を定量化するためのｐＨが調整される。蛍光は、ＦＬＵＯｓｔａｒ（登録商標）オメガマイクロプレートリーダーを用い、３６５ｎｍでの励起と４４５ｎｍでの発光によって測定した。値は、全タンパク質１ｍｇあたり１時間あたりのＧＵＳのｎｍｏｌ（ｎｍｏｌ ＧＵＳ／時間／ｍｇ）という単位で示す。

以下の組織を、Ｒ_０世代における実施例１で示される３’ＵＴＲ調節エレメントのうち五（５）つのＧＵＳ発現のために試料採取した：Ｖ４段階の葉及び根；Ｖ７段階の葉及び根；ＶＴ段階の花／葯、葉、及び根；Ｒ１段階の穂軸／毛（ｓｉｌｋ）；受粉から２１日後（ＤＡＰ）のＲ３段階の種子胚及び種子胚乳。以下の表２及び３は、ＧＵＳの発現に対する３’ＵＴＲ調節エレメントのそれぞれの影響を示している。

表２及び３に見られるように、各３’ＵＴＲ調節エレメントは、同じエンハンサー／プロモーター／イントロン構築物の組み合わせに作動可能に連結されている場合、サンプリングされた各組織で独自に発現に影響を及ぼした。プロモーターＰ－Ｚｍ．Ｌｔｐ－１：１：２は、根で優先的に発現することが実験的に確認されている。エンハンサーＥ－ＣａＭＶ．３５Ｓ－ＲＣを追加すると、構成的発現成分が追加される。３’ＵＴＲ調節エレメントのそれぞれが、エンハンサー／プロモーター／イントロン構築物の組み合わせによって与えられる発現を調節する。例えば、３’ＵＴＲ、Ｔ－ＳＥＴｉｔ．Ａｍｓ１：１は、Ｔ－ＥＲＡｔｅ．Ｈｓｐ１７．９：１及びＴ－ＡＮＤｇｅ．Ｈｓｐ／Ｓｂ．Ｈｓｐと比較して、構築物の根の発現を強化した。Ｔ－ＳＥＴｉｔ．Ａｍｓ１：１を使用した葉の発現は、根の発現よりもはるかに低かった。Ｔ－Ｃｌ．Ｈｓｐ１６．９＿２：１を使用した根での発現は、Ｔ－ＳＥＴｉｔ．Ａｍｓ１：１を含むトウモロコシ植物と同様に高かったが、葉の発現は、Ｔ－ＳＥＴｉｔ．Ａｍｓ１：１を含むトウモロコシ植物と比較した場合、Ｔ－Ｃｌ．Ｈｓｐ１６．９＿２：１を含む植物で高かった。根の発現は、Ｖ４段階でＴ－ＥＲＩｒａ．Ｈｓｐ１６．９＿３：１を含むトウモロコシ植物で低かったが、Ｖ７からＶＴ段階まで徐々に増加した。ＶＴの花及び葯、Ｒ１の穂軸及び毛、及び２１ ＤＡＰ胚に関しては、他の４つの３’ＵＴＲ調節エレメントと比較して、Ｔ－Ｃｌ．Ｈｓｐ１６．９＿２：１を含むトウモロコシ植物で発現が最も高かった。２１ ＤＡＰ胚乳での発現は、他の４つの３’ＵＴＲ調節エレメントと比較して、Ｔ－ＳＥＴｉｔ．Ａｍｓ１：１を含むトウモロコシ植物で最も高かった。

トウモロコシ植物はまた、実施例１に提示された３’ＵＴＲ調節エレメントのうちの２つ、Ｔ－ＳＡＣｒａ．Ｈｓｐ１６．９：２（配列番号１２）及びＴ－Ｃｌ．Ｈｓｐ１６．９：２（配列番号１３）を含む上記のような植物ＧＵＳ発現構築物で形質転換された。ＧＵＳ発現は上記のように決定された。Ｖ２段階の葉及び根のみをサンプリングした。以下の表４は、２つの３’ＵＴＲ調節エレメントを含む構築物で安定的に形質転換されたトウモロコシ植物の平均ＧＵＳ発現を示している。

上記の表４に見られるように、Ｔ－ＳＡＣｒａ．Ｈｓｐ１６．９：２（配列番号１２）は、Ｔ－Ｃｌ．Ｈｓｐ１６．９：２（配列番号１３）と比較した場合、根及び葉で全体的に高レベルのＧＵＳ発現を示した。Ｔ－ＳＡＣｒａ．Ｈｓｐ１６．９：２に関して発現は、葉よりも根で約６．３倍高かった。比較すると、Ｔ－Ｃｌ．Ｈｓｐ１６．９：２に関する根と葉の発現の比率は、Ｔ－ＳＡＣｒａ．Ｈｓｐ１６．９：２のそれよりも約４．２倍低かった。
上記の七（７）つの３’ＵＴＲ調節エレメントのそれぞれが、ＧＵＳ導入遺伝子の発現を調節して、様々な組織での遺伝子発現の独自のパターンを提供し得た。これらの固有の発現パターンを使用して、目的の特定の導入遺伝子の発現を微調整して、特定の好ましい組織での発現プロファイルを提供する一方で、他のあまり好ましくない組織での発現を減らしてもよい。７つの３’ＵＴＲ調節エレメントのそれぞれによって、トランスジェニック植物の特定の形質を駆動するための大きな柔軟性が得られる。

実施例３
安定的に形質転換されたトウモロコシ植物における導入遺伝子の発現に関するＥＸＰ－Ｚｍ．ＬＴＰ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４の分析
トウモロコシ植物をベクターで、具体的には、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する転写調節エレメントを含む植物発現ベクターで、形質転換した。得られた植物を、ＧＵＳタンパク質発現について分析して、ＥＸＰ、ＥＸＰ－Ｚｍ．ＬＴＰ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４（配列番号６）の発現特性を評価した。

トウモロコシ植物を、植物ＧＵＳ発現構築物で形質転換した。当該技術分野で公知の方法を用いて、ＥＸＰ，ＥＸＰ－Ｚｍ．ＬＴＰ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４（配列番号６）を、ベースの植物発現ベクターにクローニングした。得られた植物発現ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの左側の境界領域と、除草剤グリホサートに対する抵抗性を付与する形質転換植物細胞の選択に使用する第１の導入遺伝子選択カセットと、３’ＵＴＲ調節エレメント Ｔ－ＳＥＴｉｔ．Ａｍｓ１：１に対して５’側に作動可能に連結された β－グルクロニダーゼをコードする植物細胞中の発現のために設計された合成コード配列（ＧＵＳ、ＧＯＩ－Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１．ｎｎｏ：１）と５’側に作動可能に連結されたＥＸＰ，ＥＸＰ－Ｚｍ．ＬＴＰ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４を含むＥＸＰ－Ｚｍ．ＬＴＰ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４の活性を評価するための第２の導入遺伝子カセットと、続いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の右側境界領域とを含んでいた。

トウモロコシ変種０１ＤＫＤ２由来のトウモロコシ植物細胞を、当該技術分野で周知であるように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介の形質転換により、上記のバイナリー形質転換ベクター構築物を用いて形質転換した。得られた形質転換植物細胞を、トウモロコシ植物全体を形成するように誘導した。ＧＵＳ発現の定量的及び定性的測定は、Ｖ２段階の葉及び根を使用して前の実施例で説明したように決定した。表５は、安定して形質転換されたＶ２の葉及び根の平均ＧＵＳ発現と、葉と比較した根のＧＵＳ発現の比率を示している。

表５に見られるように、ＥＸＰ－Ｚｍ．ＬＴＰ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４によって駆動されるＧＵＳ発現は、葉よりも根ではるかに高い。根の発現は葉で測定された発現の三十五（３５）倍超である。この発現パターンは、地上での発現よりも根の発現がより好ましい特定の導入遺伝子を駆動するのに有利であり得る。

実施例４
エンハンサーの配向は、安定して形質転換されたトウモロコシ植物の根と葉との間の発現の比率に影響を与える
この実施例は、異なる方向のダリアモザイクウイルスエンハンサーをプロモーターに作動可能に連結し、葉及び根の導入遺伝子の相対的な発現を変化させることの影響を示している。トウモロコシ植物は、エンハンサー配列を含む天然プロモーターに対して順方向または逆方向のエンハンサーを含むＥＸＰを含む植物発現ベクターで形質転換された。得られた植物を分析して、根及び葉におけるＧＵＳタンパク質発現に対するエンハンサーの配向の影響を決定した。

トウモロコシ植物を、植物ＧＵＳ発現構築物で形質転換した。ＥＸＰ類である、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：１（配列番号１６）、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：４（配列番号１７）、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋ＳＥＴｉｔ．１４－３－３Ｃ－５：１（配列番号１８）、及びＥＸＰ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋ＳＥＴｉｔ．１４－３－３Ｃ－５：５（配列番号１９）を、当該技術分野で公知の方法を使用して、ベースの植物発現ベクターにクローニングした。得られた植物発現ベクターは、除草剤グリホサートに対する耐性を付与する形質転換植物細胞の選択に使用される第１の導入遺伝子選択カセットである、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（アグロバクテリウム・ツメファシエンス）由来の左境界領域と、３’ＵＴＲ調節エレメント、Ｔ－ＳＥＴｉｔ．Ａｍｓ１：１に５’に作動可能に連結された、β－グルクロニダーゼをコードする植物細胞での発現用に設計された合成コード配列（ＧＵＳ、ＧＯＩ－Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１．ｎｎｏ：１）に５’側に作動可能に連結されている、上記のＥＸＰの活性を評価するための第２の導入遺伝子カセットと、その後に続くＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの右境界領域とを含んだ。

各ＥＸＰは、ダリアモザイクウイルスプロモーターに由来するエンハンサーを含んだ。エンハンサーは、順方向（ダリアモザイクウイルスゲノムのネイティブプロモーター内のエンハンサーの方向）または逆方向（ダリアモザイクウイルスゲノムのネイティブプロモーター内のエンハンサーの反対方向）のいずれかで、各ＥＸＰのそれぞれのプロモーターに５’側に作動可能に連結されていた。ＥＸＰ類である、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：１（配列番号１６）及びＥＸＰ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：４（配列番号１７）は、複数の公開ダリアモザイクウイルスプロモーターに由来する、キメラ再構成エンハンサー、Ｅ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ：１（配列番号１４）を含んでいた。第１のフラグメントは、ＤａＭＶ－Ｈｏｌｌａｎｄ（ＤａＭＶ－Ｈ）株のプロモーター、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＥＵ０９０９５７、ヌクレオチド１１７７－１４９４に由来した。このフラグメントは、ＤａＭＶ－Ｈプロモーターに由来する第２のフラグメントであるヌクレオチド１００３－１１７６に作動可能に連結されていた。ネイティブＤａＭＶプロモーターの構成では、第２のフラグメントが第１のフラグメントに先行する。第１のフラグメント内で、配列番号１４と比較して、ヌクレオチド２８７～２８８、及びヌクレオチド３１９～３２２は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＪＸ２７２３２０内のＤａＭＶプロモーターの類似の位置の配列に変更された。ＥＸＰ類である、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋ＳＥＴｉｔ．１４－３－３Ｃ－５：１（配列番号１８）及びＥＸＰ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋ＳＥＴｉｔ．１４－３－３Ｃ－５：５（配列番号１９）は、ダリアモザイクウイルスプロモーター、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＥＦ５１３４９１、ヌクレオチド１～３２２に由来するエンハンサー、Ｅ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ：２（配列番号１５）を含んでいた。

ＥＸＰ類である、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：１（配列番号１６）及びＥＸＰ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：４（配列番号１７）は、キメラ再構成エンハンサー、プロモーターに５’側に作動可能に連結されたＥ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ：１（配列番号１４）、及びＳｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ由来のアクチン４遺伝子に由来するイントロンに５’側で作動可能に連結されている、Ｚｅａ ｍａｙｓ由来の脂質転移タンパク質様タンパク質遺伝子に由来する５’ＵＴＲを含む。ＥＸＰ類である、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋ＳＥＴｉｔ．１４－３－３Ｃ－５：１（配列番号１８）及びＥＸＰ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋ＳＥＴｉｔ．１４－３－３Ｃ－５：５（配列番号１９）は、プロモーターに５’側で作動可能に連結されたエンハンサーＥ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ：２（配列番号１５）及びＳｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ由来の１４－３－３Ｃ遺伝子由来のイントロンに作動可能に連結されたＴｒｙｐｓｉｃｕｍ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ由来のＲＣｃ３遺伝子に由来する５’ＵＴＲを含む。

トウモロコシ変種０１ＤＫＤ２由来のトウモロコシ植物細胞を、当該技術分野で周知であるように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介の形質転換によって、上記のバイナリー形質転換ベクター構築物を用いて形質転換した。得られた形質転換植物細胞を、トウモロコシ植物全体を形成するように誘導した。ＧＵＳ発現の定量的及び定性的測定は、Ｖ２段階の葉及び根を使用して、実施例２に記載されるように決定した。表６は、四（４）つのＥＸＰのそれぞれについて、安定して形質転換されたＶ２の葉及び根の平均ＧＵＳ発現を示している。エンハンサーの方向及び根と葉の発現の比率も表６に示されている。

実施例３、表５において、ＥＸＰ、ＥＸＰ－Ｚｍ．ＬＴＰ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４（配列番号６）は、三十五（３５）倍を超えて根では葉よりもはるかに高いＧＵＳの発現を駆動した。表６に示すように、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：１（配列番号１６）及びＥＸＰ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋Ｚｍ．Ｌｔｐ＋ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４：４（配列番号：１７）内に含まれる、ＥＸＰ－Ｚｍ．ＬＴＰ－ＳＥＴｉｔ．Ａｃｔ４内のプロモーターに、キメラ再構成エンハンサーであるＥ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ：１（配列番号１４）５’を作動可能に連結することにより、ＧＵＳ発現は根に比べて葉で増大した。ただし、これら２つのＥＸＰ内のエンハンサーの向きは、根及び葉のＧＵＳ発現の相対レベルに影響を与えた。Ｅ－ＤａＭＶ．Ｈ－Ｆｌｔ：１が順方向と比較して逆方向に配向された場合、根と葉の発現の比率は高かった。同様に、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋ＳＥＴｉｔ．１４－３－３Ｃ－５：１（配列番号１８）内で逆方向に、Ｅ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ：２（配列番号１５）エンハンサーを、作動可能に連結することによって、ＥＸＰ－ＤａＭＶ．ＦＬＴ＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１＋ＳＥＴｉｔ．１４－３－３Ｃ－５：５（配列番号１９）内の順方向と比較した場合、葉に対する根のＧＵＳ発現の比率が高くなった。２つのエンハンサーを逆方向に作動可能に連結することにより、エンハンサーが順方向に作動可能に連結されている場合よりも高い根対葉の発現比率をもたらす発現プロファイルを得ることができる。この特徴は、ウイルスエンハンサーを使用して発現を増強したいが、可能な限り高い根対葉の発現比を提供することを好む場合に望ましい。

本発明の原理を例示及び説明したが、このような原理から逸脱することなく、本発明を配置及び詳細において変更し得ることは、当業者には明らかであるはずである。発明者らは、特許請求の範囲の趣旨及び範囲内にある全ての変更を特許請求する。本明細書で引用される全ての刊行物及び公表された特許文献は、各々の個々の刊行物または特許出願が、参照により援用されているように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度まで、参照により援用される。

Claims (14)

1. 組換えＤＮＡ分子であって、
   ａ）配列番号２に対し少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する配列であって、転写調節活性を有する配列、及び
   ｂ）配列番号２を含む配列、
   からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含み、
   前記配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に連結されている、前記組換えＤＮＡ分子。
2. 前記配列が、配列番号２のＤＮＡ配列に対し少なくとも９５パーセントの配列同一性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
3. 前記ＤＮＡ配列が転写調節活性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
4. 前記異種の転写可能なＤＮＡ分子が植物における除草剤抵抗性を提供可能な遺伝子、または植物における植物害虫耐性を提供可能な遺伝子を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
5. 前記異種の転写可能なＤＮＡ分子が、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡをコードする、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
6. 請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞。
7. 前記トランスジェニック植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項６に記載のトランスジェニック植物細胞。
8. 前記トランスジェニック植物細胞が双子葉植物細胞である、請求項６に記載のトランスジェニック植物細胞。
9. 請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物またはその部位。
10. 請求項９に記載のトランスジェニック植物の後代植物またはその部位であって、前記組換えＤＮＡ分子を含む、前記後代植物またはその部位。
11. トランスジェニック種子であって、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、前記トランスジェニック種子。
12. 商品生産物を生産する方法であって、請求項９に記載のトランスジェニック植物またはその部位を得ることと、そこから前記商品生産物を生産することとを含む、前記方法。
13. 前記商品生産物が、種子、加工種子、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、デンプン、穀物、植物の部位、種子油、バイオマス、穀粉、及び粗粉である、請求項１２に記載の方法。
14. 転写可能なＤＮＡ分子を発現させる方法であって、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を得ることと、前記植物を栽培することとを含み、前記転写可能なＤＮＡが発現される、前記方法。