CN112639106A - 植物调控元件和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于调节植物中基因表达的重组DNA分子和构建体，以及它们的核苷酸序列。本发明还提供了包含可操作地连接到异源可转录DNA分子的重组DNA分子的转基因植物、植物细胞、植物部分和种子，以及它们的使用方法。

Description

植物调控元件和其用途
相关申请的引用
本申请要求于2019年1月10日提交的美国临时申请号62/790,570的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
序列表的并入
包含在名为“MONS468WO_ST25.txt”的文件中的序列表为33,896字节(如Microsoft
Figure BDA0002963392440000011
中所测量)，创建于2020年1月9日，并且通过电子递交一起提交并且以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及植物分子生物学和植物遗传工程领域。更具体地说，本发明涉及可用于调节植物中基因表达的DNA分子。
背景技术
调控元件是通过调节可操作地连接的可转录DNA分子的转录来调控基因活性的遗传元件。此类元件可包括启动子、前导序列、内含子和3′非翻译区，并且可用于植物分子生物学和植物遗传工程领域。
发明内容
本发明提供了用于植物的新型基因调控元件。本发明还提供了包含所述调控元件的重组DNA分子构建体。本发明还提供了包含所述调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。在一个实施方案中，所述调控元件可操作地连接到可转录DNA分子。在某些实施方案中，所述可转录DNA分子相对于所述调控序列可以是异源的。因此，在特定的实施方案中，本发明提供的调控元件序列可被限定为可操作地连接到异源可转录DNA分子。本发明还提供了使用调控元件以及制备和使用包含所述调控元件的重组DNA分子以及包含可操作地连接到可转录DNA分子的调控元件的转基因植物细胞、植物和种子的方法。
因此，在一方面，本发明提供了一种重组DNA分子，其包含选自由以下组成的组的DNA序列：(a)与SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者具有至少约85％序列同一性的序列；(b)包含SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者的序列；以及(c)SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述序列可操作地连接到异源可转录DNA分子。“异源可转录DNA分子”意指所述可转录DNA分子相对于其可操作地连接到的多核苷酸序列是异源的。在特定的实施方案中，所述重组DNA分子包含与SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者的DNA序列具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的DNA序列。在特定的实施方案中，所述DNA序列包含调控元件。在一些实施方案中，所述调控元件包含可操作地连接到内含子的启动子。在再其他实施方案中，所述调控元件包括3′UTR。在再其他实施方案中，所述异源可转录DNA分子包含农艺学感兴趣的基因，诸如能够在植物中提供除草剂抗性的基因，或能够在植物中提供植物害虫抗性的基因。在再其他实施方案中，所述异源可转录DNA分子包含编码小RNA诸如dsRNA、miRNA或siRNA的序列。在再其他实施方案中，本发明提供了一种构建体，其包含如本文所提供的重组DNA分子。
在另一方面，本文提供了转基因植物细胞，其包含重组DNA分子，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的DNA序列：(a)与SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者具有至少约85％序列同一性的序列；(b)包含SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者的序列；以及(c)SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接到异源可转录DNA分子。在某些实施方案中，所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。在其他实施方案中，所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。
在又一方面，本文还提供了转基因植物或其部分，其包含重组DNA分子，所述重组DNA分子含有选自由以下组成的组的DNA序列：a)与SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者具有至少85％序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者的序列；以及c)SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述序列可操作地连接到异源可转录DNA分子。在具体的实施方案中，所述转基因植物是包含重组DNA分子的任何世代的子代植物。本文还提供了包含所述重组DNA分子的转基因种子，所述重组DNA分子在生长时产生这种转基因植物。
在另一方面，本发明提供了一种生产商品的方法，所述方法包括获得含有本发明的重组DNA分子的转基因植物或其部分，以及由所述转基因植物或其部分生产商品。在一个实施方案中，所述商品是种子、加工种子、蛋白浓缩物、蛋白分离物、淀粉、谷物、植物部分、种子油、生物质、面粉和粗粉。
在又一方面，本发明提供了一种产生包含本发明的重组DNA分子的转基因植物的方法，所述方法包括使用本发明的重组DNA分子转化植物细胞以产生转化的植物细胞，以及从所述转化的植物细胞中再生转基因植物。
序列简述
SEQ ID NO:1是3′UTR T-SETit.Ams1:1的DNA序列，其衍生自来自粟米(Setariaitalica)(谷子(Foxtail millet))的S-腺苷甲硫氨酸合成酶1蛋白基因。
SEQ ID NO:2是3′UTR T-Cl.Hsp16.9_2:1的DNA序列，其衍生自来自薏苡(Coixlacryma-jobi)(薏米(Job's tears))的Hsp16.9(热休克蛋白16.9)蛋白基因。
SEQ ID NO:3是3′UTR T-ERIra.Hsp17.9_3:1的DNA序列，其衍生自来自苔麸(Eragrostis tef)(Tef)的假定的热休克蛋白基因。
SEQ ID NO:4是3′UTR T-ERIra.Hsp16.9_3:1的DNA序列，其衍生自来自沙生蔗茅(Saccharum ravennae)(生活力强的蒲苇(hardy pampas grass))的Hsp16.9(热休克蛋白16.9)蛋白基因。
SEQ ID NO:5是3′UTR T-ANDge.Hsp/Sb.Hsp的DNA序列，一种衍生自来自须芒草(Andropogon gerardii)(大蓝茎(big bluestem))和双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱属(Sorghum))的热休克蛋白基因的嵌合3′UTR。
SEQ ID NO:6是EXP EXP-Zm.LTP-SETit.Act4的DNA序列，其包含衍生自来自玉米(Zea mays)的脂质转移蛋白样蛋白基因的启动子和5′UTR，所述5′UTR将5′可操作地连接到衍生自来自粟米的肌动蛋白4基因的内含子。
SEQ ID NO:7是启动子P-Zm.Ltp-1:1:2的DNA序列，其衍生自来自玉米的脂质转移蛋白样蛋白。
SEQ ID NO:8是5′UTR(前导序列)L-Zm.Ltp-1:1:3的DNA序列，其衍生自来自玉米的脂质转移蛋白样蛋白。
SEQ ID NO:9是内含子I-SETit.Act4:2的DNA序列，其衍生自来自粟米的肌动蛋白4基因。
SEQ ID NO:10是增强子E-CaMV.35S-RC的DNA序列，其以反向互补方向衍生自花椰菜花叶病毒35S启动子。
SEQ ID NO:11是用于β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的植物表达优化的合成编码序列，其具有衍生自马铃薯光诱导的组织特异性ST-LS1基因(Genbank登录号：X04753)的可加工内含子。
SEQ ID NO:12是3′UTR T-Cl.Hsp16.9:2的DNA序列，其衍生自来自沙生蔗茅(生活力强的蒲苇)的Hsp16.9(热休克蛋白16.9)蛋白基因。
SEQ ID NO:13是3′UTR T-Cl.Hsp16.9:2的DNA序列，其衍生自来自薏苡(薏米)的Hsp16.9(热休克蛋白16.9)蛋白基因。
SEQ ID NO:14是嵌合重排的增强子E-DaMV.H-Flt:1的DNA序列，其衍生自多个公共大丽花(Dahlia)花叶病毒启动子。第一片段衍生自DaMV-荷兰(DaMV-H)菌株的启动子，Genbank登录号EU090957，核苷酸1177-1494。此片段可操作地连接到衍生自DaMV-H启动子的第二片段，核苷酸1003-1176。在天然DaMV启动子构型中，所述第二片段将在所述第一片段之前。在所述第一片段内，核苷酸287至288和核苷酸319至322被改变为Genbank登录号JX272320内的DaMV启动子的类似位置的序列。
SEQ ID NO:15是增强子E-DaMV.FLT:2的DNA序列，其衍生自大丽花花叶病毒启动子，Genbank登录号EF513491，核苷酸1至322。
SEQ ID NO:16是EXP EXP-DaMV.H-Flt+Zm.Ltp+SETit.Act4:1的DNA序列，其由嵌合重排的增强子E-DaMV.H-Flt:1(SEQ ID NO:14)组成，所述嵌合重排的增强子将5′可操作地连接到启动子和5′UTR，所述启动子和5′UTR衍生自来自玉米的脂质转移蛋白样蛋白基因，所述5′UTR将5′可操作地连接到衍生自来自粟米的肌动蛋白4基因的内含子。
SEQ ID NO:17是EXP EXP-DaMV.H-Flt+Zm.Ltp+SETit.Act4:1的DNA序列，其由嵌合重排的增强子E-DaMV.H-Flt:1(SEQ ID NO:14)组成，所述嵌合重排的增强子将5′可操作地连接到启动子和5′UTR，所述启动子和5′UTR衍生自来自玉米的脂质转移蛋白样蛋白基因，所述5′UTR将5′可操作地连接到衍生自来自粟米的肌动蛋白4基因的内含子。嵌合重排的E-DaMV.H-Flt:1增强子以相对于EXP-DaMV.H-Flt+Zm.Ltp+SETit.Act4:1(SEQ ID NO:16)相反的方向进行克隆。
SEQ ID NO:18是EXP EXP-DaMV.FLT+Td.RCc3_1+SETit.14-3-3C-5:1的DNA序列，其由增强子E-DaMV.FLT:2组成，所述增强子将5′可操作地连接到启动子和5′UTR，所述启动子和5′UTR衍生自来自鸭茅状摩擦禾(Trypsicum dactyloides)的RCc3基因，所述5′UTR将5′可操作地连接到衍生自来自粟米的14-3-3C基因的内含子。
SEQ ID NO:19是EXP EXP-DaMV.FLT+Td.RCc3_1+SETit.14-3-3C-5:1的DNA序列，其由增强子E-DaMV.FLT:2组成，所述增强子将5′可操作地连接到启动子和5′UTR，所述启动子和5′UTR衍生自来自鸭茅状摩擦禾的RCc3基因，所述5′UTR将5′可操作地连接到衍生自来自粟米的14-3-3C基因的内含子。E-DaMV.FLT:2增强子以相对于EXP-DaMV.FLT+Td.RCc3_1+SETit.14-3-3C-5:1(SEQ ID NO:18)相反的方向进行克隆。
具体实施方式
本发明提供了在植物中具有基因调控活性的调控元件。这些调控元件的核苷酸序列以SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19提供。这些调控元件能够影响植物组织中可操作地连接的可转录DNA分子的表达，并因此调控转基因植物中可操作地连接的转基因的基因表达。本发明还提供了用于修饰、产生和使用含有所提供的调控元件的重组DNA分子的方法。本发明还提供了包含含有本发明的重组DNA分子的转基因植物细胞、植物、植物部分和种子的组合物，以及制备和使用所述组合物的方法。
提供了以下定义和方法来更好地限定本发明并指导本领域普通技术人员实践本发明。除非另外说明，否则术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。
DNA分子
如本文所用，术语“DNA”或“DNA分子”是指基因组或合成来源的双链DNA分子，即从5′(上游)末端读取到3′(下游)末端的脱氧核苷酸碱基的聚合物或DNA分子。如本文所用，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。本文所用的命名法对应于美国联邦法规§1.822的第37标题的命名法，并且在WIPO标准ST.25(1998)附录2的表1和表3中的表格中列出。
如本文所用，“重组DNA分子”是包含在没有人类干预的情况下不会天然地一起存在的DNA分子的组合的DNA分子。例如，重组DNA分子可以是由彼此相对异源的至少两个DNA分子组成的DNA分子、包含偏离自然界中存在的DNA序列的DNA序列的DNA分子、包含通过遗传转化或基因编辑已掺入宿主细胞DNA中的合成DNA序列或DNA分子的DNA分子。
在本申请中，提及“分离的DNA分子”或等效术语或短语旨在意指DNA分子是单独存在或与其他组合物组合但不在其天然环境内的DNA分子。例如，在生物体的基因组的DNA内天然存在的核酸元件，诸如编码序列、内含子序列、非翻译的前导序列、启动子序列、转录终止序列等不被认为是“分离的”，只要所述元件在生物体的基因组内并且在其天然存在的基因组内的位置即可。然而，这些元件中的每一个以及这些元件的子部分在本公开的范围内将是“分离的”，只要所述元件不在生物体的基因组内并且不在其天然存在的基因组内的位置即可。类似地，编码杀虫蛋白或所述蛋白的任何天然存在的杀虫变体的核苷酸序列将是分离的核苷酸序列，只要所述核苷酸序列不在天然存在编码所述蛋白的序列的细菌的DNA内即可。出于本公开的目的，编码天然存在的杀虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即插入植物或细菌的细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列，无论其存在于用于转化细胞的质粒或类似结构内，存在于植物或细菌的基因组内，还是以可检测的量存在于衍生自植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品中，都被认为是分离的核苷酸序列。
如本文所用，术语“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸序列或两个最佳比对的多肽序列相同的程度。通过手动比对两个序列，例如参考序列和另一个序列，以使在具有适当的内部核苷酸插入、缺失或空位的序列比对中的核苷酸匹配的数量最大化，来产生最佳的序列比对。如本文所用，术语“参考序列”是指以SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19提供的DNA序列。
如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”或“％同一性”是乘以100的同一性分数。与参考序列最佳比对的序列的“同一性分数”是最佳比对中的核苷酸匹配的数量除以参考序列中的核苷酸总数，例如，整个参考序列全长中的核苷酸总数。因此，本发明的一个实施方案提供了一种DNA分子，其包含当与在本文中提供为SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19的参考序列最佳比对时，与参考序列具有至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约87％同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性或至少约100％同一性的序列。与参考分子具有百分比序列同一性的DNA分子可表现出参考序列的活性。
调控元件
调控元件，诸如启动子、前导序列(也称为5’UTR)、增强子、内含子和转录终止区(或3′UTR)在活细胞中基因的总体表达中起着不可缺少的作用。如本文所用，术语“调控元件”是指具有基因调控活性的DNA分子。如本文所用，术语“基因调控活性”是指例如通过影响可操作地连接的可转录DNA分子的转录和/或翻译来影响可操作地连接的可转录DNA分子的表达的能力。在植物中起作用的调控元件，诸如启动子、前导序列、增强子、内含子和3′UTR可用于通过遗传工程来修饰植物表型。
如本文所用，“调控表达元件组”或“EXP”序列可指一组可操作地连接的调控元件，诸如增强子、启动子、前导序列和内含子。例如，调控表达元件组可以由例如将5′可操作地连接到前导序列的启动子组成，所述前导序列将5′可操作地连接到内含子序列。可用于实施本发明的EXP以SEQ ID NO:6、16、17、18和19呈现。
调控元件可以通过它们的基因表达模式，例如，积极和/或消极的影响，诸如组成型表达或时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学反应性表达，以及其任何组合以及通过定量或定性的指示来表征。如本文所用，“基因表达模式”是可操作地连接的DNA分子转录成转录的RNA分子的任何模式。转录的RNA分子可被翻译以产生蛋白质分子，或者可提供反义或其他调节性RNA分子，诸如双链RNA(dsRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)等。
如本文所用，术语“蛋白质表达”是转录的RNA分子翻译成蛋白质分子的任何模式。蛋白质表达可以通过其时间、空间、发育或形态性质以及定量或定性的指示来表征。
启动子可用作用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的调控元件。如本文使用，术语“启动子”通常是指参与识别和结合RNA聚合酶II和其他蛋白质(诸如反式作用转录因子)以启动转录的DNA分子。启动子可最初从基因的基因组拷贝的5′非翻译区(5′UTR)中分离。可替代地，启动子可以是合成产生的或操纵的DNA分子。启动子也可以是嵌合的。嵌合启动子通过两个或更多个异源DNA分子的融合来产生。可用于实施本发明的启动子以SEQ ID NO:7提供，或为包含在SEQ ID NO:18内的启动子或其片段或变体。在本发明的具体实施方案中，如本文所述的要求保护的DNA分子及其任何变体或衍生物被进一步限定为包含启动子活性，即能够在宿主细胞诸如转基因植物中充当启动子。在再其他具体实施方案中，片段可以被限定为表现出衍生其的起始启动子分子所具有的启动子活性，或者片段可包含提供转录基础水平并由TATA盒或等效的DNA序列组成的“最小启动子”，用于识别和结合RNA聚合酶II复合物以启动转录。
在一个实施方案中，提供了本文公开的EXP序列或启动子序列的片段。如上所述，启动子片段可包含启动子活性，并且可单独使用或与其他启动子和启动子片段组合使用，诸如用于构建嵌合启动子，或与其他表达元件和表达元件片段组合使用。在具体的实施方案中，提供了启动子的片段，所述片段包含具有如本文所公开的启动子活性的DNA分子的至少约50、至少约75、至少约95、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225、至少约250、至少约275、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500、至少约550、至少约600、至少约650、至少约700、至少约750、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1100、至少约1200、至少约1300、至少约1400、至少约1500、至少约1600、至少约1700、至少约1800、至少约1900或至少约2000个或更长的连续核苷酸。从起始启动子分子中产生此类片段的方法是本领域众所周知的。
衍生自SEQ ID NO:7中提供的启动子或包含在SEQ ID NO:18内的启动子的组合物，诸如例如内部或5′缺失，可使用本领域已知的改善或改变表达的方法来产生，包括通过去除对表达有积极或消极影响的元件；复制对表达有积极或消极影响的元件；和/或复制或去除对表达具有组织特异性或细胞特异性影响的元件。衍生自SEQ ID NO:7中提供的启动子或包含在SEQ ID NO:18内的启动子，包含其中TATA盒元件或其等效序列和下游序列被去除的3′缺失的组合物，可用于例如制备增强子元件。可产生进一步缺失以去除对表达具有积极或消极；组织特异性；细胞特异性或时间特异性(诸如但不限于昼夜节律)影响的任何元件。SEQ ID NO:7中提供的启动子元件或包含在SEQ ID NO:18内的启动子，以及由此衍生的片段或增强子可用于制备嵌合转录调控元件组合物。
根据本发明，可分析启动子或启动子片段的已知启动子元件的存在，即DNA序列特性，诸如TATA盒和其他已知转录因子结合位点基序。此类已知启动子元件的鉴定可以被本领域技术人员用于设计具有与初始启动子类似的表达模式的启动子变体。
如本文所用，术语“前导序列”是指从基因的非翻译的5′区域(5′UTR)中分离的DNA分子，并且通常被限定为转录起始位点(TSS)与蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸区段。可替代地，前导序列可以是合成产生的或操纵的DNA元件。前导序列可用作用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的5′调控元件。前导序列分子可与异源启动子或与其天然启动子一起使用。可用于实施本发明的前导序列以SEQ ID NO:8提供或为SEQ ID NO:18内包含的前导序列。在具体的实施方案中，此类DNA序列可被限定为能够在宿主细胞，包括例如转基因植物细胞中充当前导序列。在一个实施方案中，此类序列被解码为包含前导序列活性。
以SEQ ID NO:8或包含在SEQ ID NO:18内的前导序列呈现的前导序列(也称为5′UTR)可由调控元件组成，或可采用可对可操作地连接的可转录DNA分子的转录或翻译有影响的二级结构。根据本发明，可使用以SEQ ID NO:8或包含在SEQ ID NO:18内的前导序列呈现的前导序列，来制备影响可操作地连接的可转录DNA分子的转录或翻译的嵌合调控元件。
如本文所用，术语“内含子”是指可从基因中分离或鉴定的DNA分子，并且通常可被限定为在翻译之前的信使RNA(mRNA)加工过程中剪接出来的区域。可替代地，内含子可以是合成产生的或操纵的DNA元件。内含子可含有影响可操作地连接的基因的转录的增强子元件。内含子可用作用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的调控元件。构建体可包含内含子，并且所述内含子相对于可转录DNA分子可以是异源的或可以不是异源的。本领域中的内含子的实例包括水稻肌动蛋白内含子和玉米HSP70内含子。
在植物中，相对于缺乏内含子的构建体，基因构建体中包含一些内含子导致mRNA和蛋白质积累增加。这种作用已被称为基因表达的“内含子介导的增强”(IME)。已在玉米基因(例如tubA1、Adh1、Sh1和Ubi1)、水稻基因(例如tpi)和双子叶植物基因(像来自矮牵牛(例如rbcS)、马铃薯(例如st-ls1)和来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)(例如ubq3和pat1)的双子叶植物基因)中鉴定出已知能刺激植物中的表达的内含子。已表明的是，内含子剪接位点内的缺失或突变降低基因表达，这表明IME可能需要剪接。然而，双子叶植物中的IME已由来自拟南芥pat1基因的剪接位点内的点突变示出。已表明，在一个植物中多次使用相同的内含子表现出缺点。在那些情况下，必须具有基本控制元件的集合以构建适当的重组DNA元件。可用于实施本发明的示例性内含子以SEQ ID NO:9以及包含在SEQ ID NO:18内的前导序列呈现。
在一个实施方案中，提供了本文公开的内含子序列的片段。如上所述，内含子片段可包含内含子活性，并且可单独使用或与其他表达元件和表达元件片段组合使用。在具体的实施方案中，提供了内含子的片段，所述片段包含具有如本文所公开的内含子活性的DNA分子的至少约50、至少约75、至少约95、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225、至少约250、至少约275、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500、至少约550、至少约600、至少约650、至少约700、至少约750、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1100、至少约1200、至少约1300、至少约1400、至少约1500、至少约1600、至少约1700、至少约1800、至少约1900或至少约2000个或更长的连续核苷酸。从起始内含子分子中产生此类片段的方法是本领域众所周知的。
如本文所用，术语“3′转录终止分子”、“3′非翻译区”或“3′UTR”是指在转录成mRNA分子的3′部分的非翻译区时使用的DNA分子。mRNA分子的3′非翻译区可以通过特异性裂解和3′聚腺苷酸化(也称为polyA尾)来产生。3′UTR可以可操作地连接到并位于可转录DNA分子的下游，并且可包含聚腺苷酸化信号和能够影响转录、mRNA加工或基因表达的其他调控信号。PolyA尾被认为在mRNA稳定性和翻译起始中起作用。本领域中3′转录终止分子的实例是胭脂碱合酶3′区域、小麦hsp17 3′区域、豌豆rubisco小亚基3′区域、棉花E6 3′区域和coixin 3′UTR。
3′UTR通常发现用于特异性DNA分子的重组表达的有益用途。弱的3′UTR可能会产生通读，这可能影响位于邻近的表达盒中的DNA分子的表达。转录终止的适当控制可防止通读到位于下游的DNA序列(例如其他表达盒)中，并且可进一步允许RNA聚合酶的高效循环以改善基因表达。转录的高效终止(从DNA中释放RNA聚合酶II)是转录重新起始的前提，并因此直接影响总体转录物水平。转录终止后，成熟的mRNA从合成位点中释放，并将模板转运到细胞质。真核mRNA在体内以poly(A)形式积累，从而很难通过常规方法来检测转录终止位点。
通过3′UTR调控基因功能是一个相对较新的领域，因为只有最新的测序技术才为我们提供跨物种和细胞类型的3′UTR的全貌。在测序技术可用之前，详细的功能和机理研究仅在少数3′UTR模型上进行。虽然这些模型3′UTR充分促进了我们对3′UTR生物学的理解，但关于其调控功能得出的结论却受到限制，并且更多地集中在mRNA的稳定性上。(Mayr,Christine(2017)Regulation by3′-Untranslated Regions.Annual Review ofGenetics,51:171-194)。全基因组电子分析表明，3′UTR中的基序主要保存在一条链上，这与3′UTR在转录后水平调控基因表达的作用相一致(Xie,X.等,(2005)Systematicdiscovery of regulatory motifs in human promoters and 3′UTRs by comparison ofseveral mammals,Nature 434:338-345)。3′UTR通过调控主要由富含AU的元件和miRNA介导的mRNA稳定性和翻译来确定蛋白质水平。3′UTR还可通过调控mRNA定位来实现局部翻译。3′UTR的长度可通过替代的裂解和聚腺苷酸化来调控。3′UTR介导蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)，这对蛋白质复合物的形成、蛋白质定位和蛋白质功能具有广泛的影响。3′UTR通过RNA结合蛋白(RBP)的结合来调控基因表达。RBP与3′UTR顺式元件结合，并通过效应蛋白的募集来介导3′UTR功能。RBP与其他结合的RBP合作以在体内实现功能特异性。在给定时刻与3′UTR结合的RBP的组合是动态的，并且可根据当地环境而变化，例如，通过添加翻译后修饰、其他RBP的局部表达以及与膜和细胞骨架丝的相互作用。RBP结合也受二级和三级RNA结构形成的影响，所述结构形成调控3′UTR的可及性(Mayr,Christine(2017)Regulation by3′-Untranslated Regions.Annual Review of Genetics,51:171-194)。
poly(A)尾是由于在RNA分子的3′末端添加一系列腺苷碱基而产生的。这为mRNA提供了称为poly(A)结合蛋白(PABP)的一类调控因子的结合位点，所述调控因子在基因表达的调控中起作用，包括mRNA的输出、稳定性和衰变以及翻译。mRNA的5′帽结构与poly-A尾协同地作用以控制mRNA翻译。PABP与poly(A)尾的缔合促进结合到5′帽结构的eIF4F的相互作用，从而产生促进翻译起始并确保核糖体循环和高效翻译的mRNA环化。这种相互作用还可通过结合到3′UTR的抑制剂蛋白来抑制翻译(Barret,L等,(2012)Regulation ofeukaryotic gene expression by the untranslated regions and other non-codingelements.Cell.Mol.Life Sci.69:3613-3634)。
从实施的角度来看，表达盒中使用的3′UTR具有以下特性通常是有益的。首先，3′UTR应该能够高效且有效地终止转基因的转录，并防止转录物通读到可由另一个表达盒组成的任何邻近的DNA序列中，如在驻留在一个转移DNA(T-DNA)中的多个表达盒或T-DNA已插入其中的邻近染色体DNA的情况下。其次，除非这是希望的结果，否则3′UTR不应引起由用于驱动DNA分子表达的启动子、前导序列、增强子和内含子赋予的转录活性降低。在下文实施例中提供的数据表明使用相同的增强子、启动子、前导序列和内含子序列来驱动表达，以SEQ ID NO:1-5呈现的3′UTR彼此不同地调节表达，并表明组织特异性对蛋白质表达的影响。最后，在植物生物技术中，3′UTR常常用于引发从转化植物中提取的逆转录RNA的扩增反应，并用于：(1)在整合到植物染色体中时评估表达盒的转录活性或表达；(2)评估植物DNA内插入的拷贝数；以及(3)评估育种后所得种子的接合性。3′UTR还用于从转化植物中提取的DNA的扩增反应，以表征插入盒的完整性。可用于实施本发明的3′UTR以SEQ ID NO:1-5和12-13呈现。
在一个实施方案中，提供了本文公开的3’UTR序列的片段。如上所述，3’UTR片段可包含3’UTR活性，并且可单独使用或与其他表达元件和表达元件片段组合使用。在具体的实施方案中，提供了3’UTR的片段，所述片段包含具有如本文所公开的3’UTR活性的DNA分子的至少约50、至少约75、至少约95、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225、至少约250、至少约275、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500、至少约550、至少约600或至少约650个或更长。从起始3’UTR分子中产生此类片段的方法是本领域众所周知的。
如本文所用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用调控元件，也被称为顺式元件，其赋予总体表达模式的方面，但是常常不足以单独驱动可操作地连接的可转录DNA分子的转录。不同于启动子，增强子元件常常不包含转录起始位点(TSS)或TATA盒或等效DNA序列。启动子或启动子片段可天然地包含一个或多个影响可操作地连接的DNA序列的转录的增强子元件。增强子元件还可融合至启动子以产生嵌合启动子顺式元件，其赋予基因表达的总体调节的方面。
据信许多启动子增强子元件结合DNA结合蛋白质且/或影响DNA拓扑结构，从而产生选择性允许或限制RNA聚合酶接近DNA模板或者促进转录起始位点处双螺旋的选择性打开的局部构象。增强子元件可以起到结合调控转录的转录因子的作用。一些增强子元件结合多于一个转录因子，并且转录因子可以不同亲和力与多于一个增强子结构域相互作用。增强子元件可通过多种技术来鉴定，包括缺失分析，即从启动子的5′末端或内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNase I足迹分析、甲基化干扰、电泳迁移率迁移测定、通过连接介导的聚合酶链反应(PCR)和其他常规测定或通过使用已知的顺式元件基序或增强子元件作为靶序列或靶基序与常规DNA序列比较方法(诸如BLAST)进行的DNA序列相似性分析来进行体内基因组足迹分析的DNA结合蛋白分析。增强子结构域的精细结构可以通过诱变(或取代)一个或多个核苷酸或通过本领域已知的其他常规方法来进一步研究。增强子元件可通过化学合成或通过从包含此类元件的调控元件中分离来获得，并且它们可与含有可用的限制酶位点的另外的侧翼核苷酸一起合成以促进子序列操纵。因此，本发明涵盖了根据本文公开的方法用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的增强子元件的设计、构建和用途。可用于实施本发明的增强子以SEQ ID NO:10、14和15提供。
在一个实施方案中，提供了本文公开的增强子序列的片段。如上所述，增强子片段可包含增强子活性，并且可单独使用或与其他表达元件和表达元件片段组合使用。在具体的实施方案中，提供了增强子的片段，所述片段包含具有如本文所公开的增强子活性的DNA分子的至少约50、至少约75、至少约95、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225、至少约250、至少约275、至少约300、至少约350、至少约400或至少约450个或更长。从起始增强子分子中产生此类片段的方法是本领域众所周知的。
如本文所用，术语“嵌合”是指通过将第一DNA分子融合至第二DNA分子而产生的单个DNA分子，其中无论所述第一DNA分子还是所述第二DNA分子通常都不会以所述构型存在，即彼此融合。因此，嵌合DNA分子是通常不以其他方式存在于自然界中的新的DNA分子。如本文所用，术语“嵌合启动子”是指通过这种DNA分子的操纵产生的启动子。“嵌合增强子”是指通过DNA分子的操纵产生的增强子。“嵌合内含子”是指通过DNA分子的操纵产生的内含子。“嵌合的3’UTR”是指通过DNA分子的操纵产生的3’UTR。嵌合启动子、增强子、内含子或3’UTR可组合两个或更多个DNA片段，例如，启动子与增强子元件的融合。因此，本发明涵盖了根据本文公开的方法用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的嵌合启动子、增强子、内含子或3’UTR的设计、构建和用途。
嵌合调控元件可被设计为包含各种组成元件，其可通过本领域已知的各种方法可操作地连接，所述方法诸如限制酶消化和连接、不依赖连接的克隆、扩增过程中PCR产物的模块化组装或调控元件的直接化学合成以及本领域已知的其他方法。所得的各种嵌合调控元件可由相同组成元件或相同组成元件的变体组成，但这些组成元件在一个或多个DNA序列方面不同，其包含允许组成部分可操作地连接的一个或多个连接DNA序列。在本发明中，以SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19提供的DNA序列可提供调控元件参考序列，其中包含所述参考序列的组成元件可通过本领域已知的方法连接，并可包含一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或插入或细菌和植物细胞转化中天然存在的突变。
如本文所用，术语“变体”是指与第一DNA分子在组成方面类似但不相同的第二DNA分子，诸如调控元件，并且其中所述第二DNA分子仍保持所述第一DNA分子的一般功能，即相同或类似的表达模式，例如通过更多或更少的等效转录活性。变体可以是所述第一DNA分子的较短或截短的型式或所述第一DNA分子的序列的改变型式，诸如具有不同限制酶位点和/或内部缺失、取代或插入的变体。“变体”还可涵盖具有核苷酸序列的调控元件，所述核苷酸序列包含参考序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，其中衍生的调控元件具有比对应的亲本调控分子更多或更少或等效的转录活性或翻译活性。调控元件“变体”还将涵盖由细菌和植物细胞转化中天然存在的突变产生的变体。在本发明中，以SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19提供的多核苷酸序列可用于产生与初始调控元件的DNA序列在组成中类似但不相同的变体，同时所述变体仍保持初始调控元件的一般功能，即相同或类似的表达模式。根据本公开，本发明的此类变体的产生完全在本领域普通技术人员的技术范围内，并且涵盖在本发明的范围内。
本文所述的修饰、重复或缺失对特定转基因的所需表达方面的功效可在稳定的和瞬时的植物测定(诸如本文工作实施例中所述的那些测定)中进行经验性测试，以便验证可根据所做的改变和起始DNA分子中的改变目标而变化的结果。
构建体
如本文所用，术语“构建体”意指任何重组DNA分子，诸如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或线性或环状DNA或RNA分子，其衍生自任何来源，能够进行基因组整合或自主复制、包含DNA分子，其中至少一个DNA分子已以功能上可操作的方式连接到另一DNA分子，即可操作地连接。如本文所用，术语“载体”意指可用于转化(即将异源DNA或RNA引入宿主细胞中)目的的任何构建体。构建体通常包含一个或多个表达盒。如本文所用，“表达盒”是指至少包含可操作地连接到一个或多个调控元件(通常至少是启动子和3′UTR)的可转录DNA分子的DNA分子。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指连接到第二DNA分子的第一DNA分子，其中所述第一DNA分子和所述第二DNA分子被布置成使得所述第一DNA分子影响所述第二DNA分子的功能。所述两个DNA分子可能是单一连续DNA分子的一部分或可能不是单一连续DNA分子的一部分，并且可能相邻或可能不相邻。例如，如果启动子调节细胞中的感兴趣的可转录DNA分子的转录，则所述启动子可操作地连接到所述可转录DNA分子。例如，当前导序列能够影响DNA序列的转录或翻译时，所述前导序列可操作地连接到所述DNA序列。
在一个实施方案中，本发明的构建体可以双肿瘤诱导(Ti)质粒边界构建体提供，其具有从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中分离的Ti质粒的右边界(RB或AGRtu.RB)和左边界(LB或AGRtu.LB)区域，所述区域包含T-DNA，所述T-DNA与由根癌农杆菌细胞提供的转移分子一起，允许T-DNA整合到植物细胞的基因组中(参见例如美国专利6,603,061)。所述构建体还可包含质粒主链DNA区段，其在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)复制起点(诸如ori322)、广泛的宿主范围复制起点(诸如oriV或oriRi)以及用于选择性标记(诸如Spec/Strp)的编码区，所述编码区编码赋予对壮观霉素(spectinomycin)或链霉素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷转移酶(aadA)或庆大霉素(Gm，Gent)选择性标记基因。对于植物转化，宿主细菌菌株常常是根癌农杆菌ABI、C58或LBA4404，然而植物转化领域的技术人员已知的其他菌株也可以在本发明中起作用。
以将可转录DNA分子转录为被翻译并表达为蛋白质的功能性mRNA分子的这种方式，来组装构建体并将其引入细胞中的方法是本领域已知的。为了实施本发明，用于制备和使用构建体以及宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员众所周知的。可用于在高等植物中表达核酸的典型载体是本领域众所周知的，并包含衍生自根癌农杆菌的Ti质粒的载体和pCaMVCN转移控制载体。
构建体中可包含各种调控元件，包括本文提供的任何调控元件。任何此类调控元件可与其他调控元件组合来提供。可设计或修饰此类组合以产生理想的调控特征。在一个实施方案中，本发明的构建体包含至少一个可操作地连接到可转录DNA分子的调控元件，所述可转录DNA分子可操作地连接到3′UTR。
本发明的构建体可包含本文提供的或本领域已知的任何启动子或前导序列。例如，本发明的启动子可以可操作地连接到异源非翻译的5′前导序列，诸如衍生自热休克蛋白基因的5′前导序列。可替代地，本发明的前导序列可以可操作地连接到异源启动子，诸如花椰菜花叶病毒35S转录物启动子。
表达盒还可包含转运肽编码序列，其编码可用于可操作地连接的蛋白质的亚细胞靶向的肽，特别是靶向叶绿体、白色体或其他质体细胞器；线粒体；过氧化物酶体；液泡；或细胞外位置的肽。许多叶绿体定位蛋白由作为前体的核基因表达，并通过叶绿体转运肽(CTP)靶向叶绿体。此类分离的叶绿体蛋白的实例包括但不限于与核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、捕光复合物蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F和烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合酶(EPSPS)相关联的那些叶绿体蛋白。叶绿体转运肽描述于例如美国专利号7,193,133中。已证明非叶绿体蛋白可通过可操作地连接到编码非叶绿体蛋白的转基因的异源CTP的表达来靶向叶绿体。
可转录DNA分子
如本文所用，术语“可转录DNA分子”是指能够被转录成RNA分子的任何DNA分子，其包括但不限于具有蛋白质编码序列的DNA分子和产生具有可用于基因抑制的序列的RNA分子的DNA分子。DNA分子的类型可包括但不限于来自同一植物的DNA分子、来自另一植物的DNA分子、来自不同生物体的DNA分子或合成的DNA分子，诸如含有基因的反义信息的DNA分子或编码人工的、合成的或以其他方式修饰的转基因型式的DNA分子。用于掺入本发明的构建体中的示例性可转录DNA分子包括，例如，来自除了所述DNA分子所掺入的物种以外的物种的DNA分子或基因，或源于相同物种或存在于相同物种中但通过遗传工程方法而不是经典育种技术掺入受体细胞中的基因。
“转基因”是指至少相对于其在宿主细胞基因组中的位置与宿主细胞异源的可转录DNA分子，和/或在宿主细胞的当前或任何先前世代中人工地掺入宿主细胞的基因组中的可转录DNA分子。
本发明的调控元件，诸如启动子、增强子、内含子或3’UTR，可以可操作地连接到相对于所述调控元件异源的可转录DNA分子。如本文所用，术语“异源”是指两种或更多种DNA分子的组合，然而这种组合通常不存在于自然界中。例如，所述两个DNA分子可衍生自不同的物种，并且/或者所述两个DNA分子可衍生自不同的基因，例如，来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。因此，如果这种组合正常不存在于自然界中，即可转录DNA分子不天然地发生可操作地连接到调控元件，则所述调控元件相对于可操作地连接的可转录DNA分子是异源的。
可转录DNA分子通常可以是需要表达转录物的任何DNA分子。这种转录物的表达可使得所得的mRNA分子的翻译，并因此使得蛋白质表达。可替代地，例如，可设计可转录DNA分子以最终引起特定基因或蛋白质的表达降低。在一个实施方案中，这可通过使用以反义方向定向的可转录DNA分子来实现。本领域普通技术人员熟悉使用这种反义技术。任何基因都可以这种方式被负调控，并且在一个实施方案中，可设计可转录DNA分子用于通过表达dsRNA、siRNA或miRNA分子来抑制特定基因。
因此，本发明的一个实施方案是重组DNA分子，其包含本发明的调控元件，诸如以SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19提供的调控元件，所述调控元件可操作地连接到异源可转录DNA分子，以便在构建体整合到转基因植物细胞的基因组中时，以所需水平或所需的模式调节可转录DNA分子的转录。在一个实施方案中，可转录DNA分子包含基因的蛋白质编码区，并且在另一实施方案中，可转录DNA分子包含基因的反义区。
农艺学感兴趣的基因
可转录DNA分子可以是农艺学感兴趣的基因。如本文所用，术语“农艺学感兴趣的基因”是指当在特定植物组织、细胞或细胞类型中表达时，赋予理想特性的可转录DNA分子。农艺学感兴趣的基因的产物可在植物内起作用，以引起对植物形态、生理、生长、发育、产量、谷物组成、营养概况、疾病或害虫抗性和/或环境或化学耐受性的影响，或者可在以植物为食的害虫的饮食中充当杀虫剂。在本发明的一个实施方案中，将本发明的调控元件掺入构建体中，使得所述调控元件可操作地连接到作为农艺学感兴趣的基因的可转录DNA分子。在含有这种构建体的转基因植物中，农艺学感兴趣的基因的表达可赋予有益的农艺学性状。例如，有益的农艺学性状可包括但不限于除草剂耐受性、昆虫防治、改良的产量、疾病抗性、病原体抗性、改良的植物生长和发育、改良的淀粉含量、改良的油含量、改良的脂肪酸含量、改良的蛋白质含量、改良的果实成熟、增强的动物和人类营养、生物聚合物生产、环境应力抗性、药物肽、改善的加工质量、改善的风味、杂交种子生产效用、改善的纤维生产和理想的生物燃料生产。
本领域已知的农艺学感兴趣的基因的实例包括用于除草剂抗性(美国专利号6,803,501；6,448,476；6,248,876；6,225,114；6,107,549；5,866,775；5,804,425；5,633,435；和5,463,175)、增加的产量(美国专利号USRE38,446；6,716,474；6,663,906；6,476,295；6,441,277；6,423,828；6,399,330；6,372,211；6,235,971；6,222,098；和5,716,837)、昆虫防治(美国专利号6,809,078；6,713,063；6,686,452；6,657,046；6,645,497；6,642,030；6,639,054；6,620,988；6,593,293；6,555,655；6,538,109；6,537,756；6,521,442；6,501,009；6,468,523；6,326,351；6,313,378；6,284,949；6,281,016；6,248,536；6,242,241；6,221,649；6,177,615；6,156,573；6,153,814；6,110,464；6,093,695；6,063,756；6,063,597；6,023,013；5,959,091；5,942,664；5,942,658；5,880,275；5,763,245；和5,763,241)、真菌疾病抗性(美国专利号6,653,280；6,573,361；6,506,962；6,316,407；6,215,048；5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407；和6,506,962)、病毒抗性(美国专利号6,617,496；6,608,241；6,015,940；6,013,864；5,850,023；和5,304,730)、线虫抗性(美国专利号6,228,992)、细菌疾病抗性(美国专利号5,516,671)、植物生长和发育(美国专利号6,723,897和6,518,488)、淀粉产量(美国专利号6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876；6,476,295)、改良的油产量(美国专利号6,444,876；6,426,447；和6,380,462)、高油产量(美国专利号6,495,739；5,608,149；6,483,008；和6,476,295)、改良的脂肪酸含量(美国专利号6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461；和6,459,018)、高蛋白产量(美国专利号6,380,466)、果实成熟(美国专利号5,512,466)、增强的动物和人类营养(美国专利号6,723,837；6,653,530；6,5412,59；5,985,605；和6,171,640)、生物聚合物(美国专利号USRE37,543；6,228,623；和5,958,745以及6,946,588)、抗环境应力(美国专利号6,072,103)、药物肽和分泌肽(美国专利号6,812,379；6,774,283；6,140,075；和6,080,560)、改善的加工性状(美国专利号6,476,295)、改善的消化率(美国专利号6,531,648)、低棉子糖(美国专利号6,166,292)、工业酶产量(美国专利号5,543,576)、改善的风味(美国专利号6,011,199)、固氮(美国专利号5,229,114)、杂交种子产量(美国专利号5,689,041)、纤维产量(美国专利号6,576,818；6,271,443；5,981,834；和5,869,720)和生物燃料产量(美国专利号5,998,700)的那些农艺学感兴趣的基因。
可替代地，农艺学感兴趣的基因可通过编码引起内源基因的基因表达的靶向调节的RNA分子来影响上述植物特性或表型，例如通过反义(参见例如美国专利5,107,065)；抑制性RNA(“RNAi”，包括通过miRNA介导的、siRNA介导的、反式作用siRNA介导的和分阶段sRNA介导的机制来调节基因表达，例如，如公布的申请U.S.2006/0200878和U.S.2008/0066206以及美国专利申请11/974,469中所述)；或共抑制介导的机制。所述RNA也可以是被工程化以裂解所需的内源mRNA产物的催化RNA分子(例如核酶或核糖开关；参见例如U.S.2006/0200878)。以将可转录DNA分子转录为能够引起基因抑制的分子的这种方式来构建构建体并将其引入细胞中的方法是本领域已知的。
选择性标记
选择性标记转基因也可与本发明的调控元件一起使用。如本文所用，术语“选择性标记转基因”是指可以某种方式筛选或评分在转基因植物、组织或细胞中表达或其缺乏的任何可转录DNA分子。用于实施本发明的选择性标记基因及其相关的选择和筛选技术是本领域已知的，并且包括但不限于编码β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、赋予抗生素抗性的蛋白质和赋予除草剂耐受性的蛋白质的可转录DNA分子。选择性标记转基因的实例以SEQ ID NO:11提供。
细胞转化
本发明还涉及产生转化的细胞和植物的方法，所述细胞和植物包含可操作地连接到可转录DNA分子的一个或多个调控元件。
术语“转化”是指将DNA分子引入受体宿主中。如本文所用，术语“宿主”是指细菌、真菌或植物，包括细菌、真菌或植物的任何细胞、组织、器官或子代。特定的感兴趣的植物组织和细胞包括原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、幼苗、胚和花粉。
如本文所用，术语“转化”是指已向其中引入外来DNA分子(诸如构建体)的细胞、组织、器官或生物体。引入的DNA分子可被整合到受体细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA中，使得引入的DNA分子被后续的子代遗传。“转基因”或“转化的”细胞或生物体也可包括所述细胞或生物体的子代，以及从育种计划中产生的子代，所述育种计划在杂交中使用这种转基因生物体作为亲本并表现出由外来DNA分子的存在引起的改变的表型。引入的DNA分子也可被瞬时引入受体细胞中，使得引入的DNA分子不被后续的子代遗传。术语“转基因”是指含有一种或多种异源DNA分子的细菌、真菌或植物。
存在许多本领域技术人员众所周知的用于将DNA分子引入植物细胞中的方法。所述过程通常包括以下步骤：选择合适的宿主细胞，使用载体转化宿主细胞，以及获得转化的宿主细胞。在本发明的实施中，通过将植物构建体引入植物基因组中来转化植物细胞的方法和材料可包括任何众所周知的和已证明的方法。合适的方法包括但不限于细菌感染(例如农杆菌)、二元BAC载体、DNA的直接递送(例如通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA摄取、电穿孔、使用碳化硅纤维搅拌以及DNA涂覆颗粒的加速)、基因编辑(例如CRISPR-Cas系统)等。
宿主细胞可以是任何细胞或生物体，诸如植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌、细菌细胞或昆虫细胞。在具体的实施方案中，宿主细胞和转化的细胞可包括来自农作物植物的细胞。
随后可从本发明的转基因植物细胞中再生出转基因植物。使用常规育种技术或自花授粉，可从这种转基因植物中产生种子。此类种子以及由此类种子生长所得的子代植物将含有本发明的重组DNA分子，并因此它们将是转基因的。
本发明的转基因植物可以是自花授粉的以提供本发明的纯合子转基因植物(重组DNA分子的纯合子)的种子或与非转基因植物或不同的转基因植物杂交以提供本发明的杂合子转基因植物(重组DNA分子的杂合子)的种子。此类纯合子转基因植物和杂合子转基因植物在本文中均被称为“子代植物”。子代植物是源自初始转基因植物的转基因植物，并包含本发明的重组DNA分子。可收获使用本发明的转基因植物产生的种子，并用于种植转基因植物的世代，即本发明的子代植物，其包含本发明的构建体并表达农艺学感兴趣的基因。通常用于不同农作物的育种方法的描述可见于若干本参考书之一，参见例如Allard,Principles of Plant Breeding,John Wiley和Sons,NY,U.of CA,Davis,CA,50-98(1960)；Simmonds,Principles of Crop Improvement,Longman,Inc.,NY,369-399(1979)；Sneep和Hendriksen,Plant breeding Perspectives,Wageningen(编),Center forAgricultural Publishing and Documentation(1979)；Fehr,Soybeans:Improvement,Production and Uses,第2版,Monograph,16:249(1987)；Fehr,Principles of VarietyDevelopment,Theory and Technique,(第1卷)和Crop Species Soybean(第2卷),IowaState Univ.,Macmillan Pub.Co.,NY,360-376(1987)。
可分析转化的植物中的感兴趣的一种或多种基因的存在以及由本发明的调控元件赋予的表达水平和/或分布。本领域技术人员知道许多可用于分析转化的植物的方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于DNA印迹法(Southern blot)或RNA印迹法(northernblot)、基于PCR的方法、生化分析、表型筛选方法、现场评估和免疫诊断测定。可使用
Figure BDA0002963392440000261
(Applied Biosystems，Foster City，CA)试剂和如制造商所述的方法测量可转录DNA分子的表达，并使用
Figure BDA0002963392440000262
测试基质确定PCR循环次数。可替代地，
Figure BDA0002963392440000263
(Third Wave Technologies，Madison，WI)试剂和如制造商所述的方法可用于评估转基因表达。
本发明还提供了本发明的植物的部分。植物部分包括但不限于叶、茎、根、块茎、种子、胚乳、胚珠和花粉。本发明的植物部分可以是存活的、非存活的、可再生的和/或不可再生的。本发明还包含并提供含有本发明的DNA分子的转化的植物细胞。本发明的转化的植物细胞或转基因植物细胞包括可再生的和/或不可再生的植物细胞。
本发明还提供了由含有本发明的重组DNA分子的转基因植物或其部分产生的商品。本发明的商品包含可检测量的DNA，所述DNA包含选自由SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19组成的组的DNA序列。如本文所用，“商品”是指由衍生自含有本发明的重组DNA分子的转基因植物、种子、植物细胞或植物部分的材料组成的任何组合物或产品。商品包括但不限于加工的种子、谷物、植物部分和粗粉。本发明的商品将含有对应于本发明的重组DNA分子的可检测量的DNA。样品中这种DNA的一种或多种的检测可用于确定商品的含量或来源。可以使用任何标准的DNA分子检测方法，包括本文公开的检测方法。
通过参考以下实施例可以更容易地理解本发明，所述实施例是以说明的方式提供的，并且除非指定，否则不旨在限制本发明。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表由本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在已公开的具体实施方案中做出许多改变并仍获得相似或类似结果，因此列出的所有事项都应被解释为说明性的，而非限制意义的。
实施例
实施例1
调控元件的鉴定和克隆
从若干种单子叶植物物种的基因组DNA中鉴定并克隆新型转录调控元件和调控表达元件组(EXP)。
在若干种单子叶植物物种的专有序列中鉴定新型的3′非翻译区(3′UTR)序列。下文表1示出了不同的3′UTR和它们衍生自的单子叶植物物种。3′UTR T-SETit.Ams1:1(SEQID NO:1)先前已在美国专利申请US20130031672中以SEQ ID NO:270呈现。
表1.3′UTR和对应的属以及物种。
Figure BDA0002963392440000281
此外，产生并克隆了包含从玉米基因组DNA中分离的启动子(P-Zm.Ltp-1:1:2)和前导序列(L-Zm.Ltp-1:1:3)，以及从粟米基因组DNA中分离的内含子的EXP序列。EXP EXP-Zm.LTP-SETit.Act4(SEQ ID NO:6)由启动子P-Zm.Ltp-1:1:2(SEQ ID NO:7)组成，所述启动子将5′可操作地连接到5′UTR L-Zm.Ltp-1:1:3(SEQ ID NO:8)，所述5′UTR将5′可操作地连接到内含子I-SETit.Act4:2(SEQ ID NO:9；先前在美国专利申请US20130031672中以SEQID NO:627呈现)。
使用本领域已知的方法将这些3′UTR和EXP-Zm.LTP-SETit.Act4克隆到二元植物转化载体中。
实施例2
3′UTR及其对稳定转化的玉米植物中的转基因表达的影响的分析
使用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的转录调控元件以及实施例1中呈现的七(7)种3′UTR调控元件每一种中的一种的植物表达载体，来转化玉米植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估3′UTR调控元件对表达的影响。
使用植物GUS表达构建体来转化玉米植物。使用本领域已知的方法将3′UTR调控元件克隆到基础植物表达载体中。所得的植物表达载体含有根癌农杆菌的左边界区域；用于选择赋予对除草剂草甘膦的抗性的转化植物细胞的第一转基因选择盒；用于评估3′UTR调控元件的活性的第二转基因盒，其包含以反向互补方向衍生自花椰菜花叶病毒35S启动子的增强子(E-CaMV.35S-RC,SEQ ID NO:10)，所述增强子将5′可操作地连接到EXP EXP-Zm.LTP-SETit.Act4(SEQ ID NO:6)，所述EXP将5′可操作地连接到被设计用于在植物细胞中表达的编码β-葡萄糖醛酸酶的合成编码序列(GUS，GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1，SEQ IDNO:11)，所述合成编码序列含有衍生自马铃薯光诱导的组织特异性ST-LS1基因(Genbank登录号：X04753)的可加工内含子，所述合成编码序列将5′可操作地连接到实施例1中呈现的七(7)种3′UTR调控元件每一种中的一种，随后是来自根癌农杆菌的右边界区域。
如本领域众所周知的，通过农杆菌介导的转化，使用这些二元转化载体构建体来转化来自玉米品种01DKD2的玉米植物细胞。诱导所得转化的植物细胞以形成完整的玉米植物。
组织化学GUS分析用于转化的植物的定性和定量表达分析。将整个组织切片与GUS染色液X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-葡萄糖醛酸)(1毫克/毫升)一起孵育适当的时间，冲洗并进行蓝色着色的可视化检查。通过直接可视化检查或在显微镜下使用所选择的植物器官和组织进行检查，来定性地确定GUS活性。
为了定量分析GUS表达，从转化的玉米植物的所选择的组织中提取总蛋白。一微克总蛋白与50微升总反应体积中的荧光底物4-甲基伞形酮酰--D-葡萄糖醛酸(MUG)一起使用。反应产物4-甲基伞形酮(4-MU)在高pH下为最大荧光，其中羟基是电离的。同时添加碱性碳酸钠溶液终止测定，并调节pH用于定量荧光产物。使用
Figure BDA0002963392440000291
Omega酶标仪测量荧光，其中在365nm处激发，在445nm处发射。值以nmol GUS/小时/mg总蛋白的单位提供。
在R0世代中对以下组织进行实施例1中呈现的五(5)种3′UTR调控元件的GUS表达的取样：V4阶段的叶和根；V7阶段的叶和根；VT阶段的花/花药、叶和根；R1阶段的穗轴和丝；授粉后(DAP)21天的R3阶段的种子胚和胚乳。下文表2和表3示出了3′UTR调控元件中的每一种对GUS表达的影响。
表2.3′UTR调控元件对稳定转化的R0玉米植物中定量GUS表达的影响。
Figure BDA0002963392440000301
表3.3′UTR调控元件对稳定转化的R0玉米植物中定量GUS表达的影响。
Figure BDA0002963392440000302
由表2和表3可以看出，当每种3′UTR调控元件可操作地连接到相同的增强子/启动子/内含子构建体组合时，都会在每个取样的组织中独特地影响表达。启动子P-Zm.Ltp-1:1:2已实验性地确定优先在根中表达。增强子E-CaMV.35S-RC的添加增加了组成型表达组分。3′UTR调控元件中的每一种均调节由增强子/启动子/内含子构建体组合赋予的表达。例如，相对于T-ERAte.Hsp17.9:1和T-ANDge.Hsp/Sb.Hsp，3′UTR T-SETit.Ams1:1增强构建体的根表达。使用T-SETit.Ams1:1的叶表达远低于根表达。使用T-Cl.Hsp16.9_2:1的根中的表达与包含T-SETit.Ams1:1的玉米植物类似，但当与包含T-SETit.Ams1:1的玉米植物相比时，包含T-Cl.Hsp16.9_2:1的植物中的叶表达更高。根表达在V4阶段在包含T-ERIra.Hsp16.9_3:1的玉米植物中较低，但从V7阶段到VT阶段逐渐增加。相对于VT花和花药、R1穗轴和丝以及21DAP胚，与其他四种3′UTR调控元件相比，在包含T-Cl.Hsp16.9_2:1的玉米植物中的表达最高。与其他四种3′UTR调控元件相比，21DAP胚乳中的表达在包含T-SETit.Ams1:1的玉米植物中最高。
还使用如上所述的植物GUS表达构建体转化玉米植物，所述植物GUS表达构建体包含实施例1中呈现的两种3′UTR调控元件，即T-SACra.Hsp16.9:2(SEQ ID NO:12)和T-Cl.Hsp16.9:2(SEQ ID NO:13)。如上所述确定GUS表达。仅对V2阶段的叶和根进行取样。下文表4示出了使用包含两种3′UTR调控元件的构建体稳定转化的玉米植物的平均GUS表达。
表4.3′UTR调控元件对稳定转化的R0玉米植物中定量GUS表达的影响。
Figure BDA0002963392440000311
由上文表4可以看出，当与T-Cl.Hsp16.9:2(SEQ ID NO:13)相比时，T-SACra.Hsp16.9:2(SEQ ID NO:12)提供根和叶中的总体上更高水平的GUS表达。对于T-SACra.Hsp16.9:2，根中的表达比叶中的表达高约6.3倍。相比之下，T-Cl.Hsp16.9:2的根与叶表达的比率比T-SACra.Hsp16.9:2的根与叶表达的比率低约4.2倍。
上文呈现的七(7)种3′UTR调控元件中的每一种都能调节GUS转基因的表达，以提供不同组织中的独特的基因表达模式。这些独特的表达模式可用于微调感兴趣的特定转基因的表达，以提供某些优选的组织中的表达谱，同时减少在其他不太优选的组织中的表达。七种3′UTR调控元件中的每一种都为驱动转基因植物中的某些性状提供了极大的灵活性。
实施例3
稳定转化的玉米植物中EXP-Zm.LTP-SETit.Act4对转基因表达的影响的分析
使用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的转录调控元件的植物表达载体，来转化玉米植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估EXP EXP-Zm.LTP-SETit.Act4(SEQ ID NO:6)的表达特性。
使用植物GUS表达构建体来转化玉米植物。使用本领域已知的方法将EXP EXP-Zm.LTP-SETit.Act4(SEQ ID NO:6)克隆到基础植物表达载体中。所得的植物表达载体含有根癌农杆菌的左边界区域；用于选择赋予对除草剂草甘膦的抗性的转化植物细胞的第一转基因选择盒；用于评估EXP-Zm.LTP-SETit.Act4活性的第二转基因盒，所述第二转基因盒包含EXP EXP-Zm.LTP-SETit.Act4，所述EXP将5′可操作地连接到被设计用于在植物细胞中表达的编码β-葡萄糖醛酸酶的合成编码序列(GUS，GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1)，所述合成编码序列将5′可操作地连接到3′UTR调控元件T-SETit.Ams1:1，随后是来自根癌农杆菌的右边界区域。
如本领域众所周知的，通过农杆菌介导的转化，使用上文所述二元转化载体构建体来转化来自玉米品种01DKD2的玉米植物细胞。诱导所得转化的植物细胞以形成完整的玉米植物。如先前实施例中所述，使用V2阶段叶和根确定GUS表达的定量和定性测量。表5示出了稳定转化的V2叶和根的平均GUS表达以及根与叶相比的GUS表达比率。
表5.在稳定转化的玉米植物中由EXP-Zm.LTP-SETit.Act4驱动的V2叶和根中的平均GUS表达和表达比率。
Figure BDA0002963392440000331
由表5可以看出，由EXP-Zm.LTP-SETit.Act4驱动的GUS表达在根中比在叶中高得多。根表达是叶中测量的表达的三十五(35)倍以上。这种表达模式在驱动某些转基因方面可能是有利的，其中根表达比地上表达更优选。
实施例4
增强子方向影响稳定转化的玉米植物中根与叶之间的表达比率
此实施例说明了将不同方向的大丽花花叶病毒增强子可操作地连接到启动子，改变转基因在叶和根中的相对表达的作用。使用含有EXP的植物表达载体转化玉米植物，所述EXP包含相对于包含增强子序列的天然启动子而言正向方向或反向方向的增强子。分析所得植物以确定增强子的方向对根和叶中GUS蛋白表达的影响。
使用植物GUS表达构建体来转化玉米植物。使用本领域已知的方法将EXP EXP-DaMV.H-Flt+Zm.Ltp+SETit.Act4:1(SEQ ID NO:16)、EXP-DaMV.H-Flt+Zm.Ltp+Zm.Ltp+SETit.Act4:4(SEQ ID NO:17)、EXP-DaMV.FLT+Td.RCc3_1+SETit.14-3-3C-5:1(SEQ IDNO:18)和EXP-DaMV.FLT+Td.RCc3_1+Td.RCc3_1+SETit.14-3-3C-5:5(SEQ ID NO:19)克隆到基础植物表达载体中。所得的植物表达载体含有根癌农杆菌的左边界区域；用于选择赋予对除草剂草甘膦的抗性的转化植物细胞的第一转基因选择盒；用于评估上文呈现的EXP活性的第二转基因盒，所述第二转基因盒将5′可操作地连接到被设计用于在植物细胞中表达的编码β-葡萄糖醛酸酶的合成编码序列(GUS，GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1)，所述合成编码序列将5′可操作地连接到3′UTR调控元件T-SETit.Ams1:1，随后是来自根癌农杆菌的右边界区域。
EXP中的每一种均包含衍生自大丽花花叶病毒启动子的增强子。增强子以正向方向(大丽花花叶病毒基因组中天然启动子内的增强子的方向)或反向方向(大丽花花叶病毒基因组中天然启动子内的增强子的相反方向)将5′可操作地连接到每个EXP的相应启动子。EXP EXP-DaMV.H-Flt+Zm.Ltp+SETit.Act4:1(SEQ ID NO:16)和EXP-DaMV.H-Flt+Zm.Ltp+Zm.Ltp+SETit.Act4:4(SEQ ID NO:17)包含嵌合重排的增强子E-DaMV.H-Flt:1(SEQ IDNO:14)，所述嵌合重排的增强子衍生自多个公共大丽花花叶病毒启动子。第一片段衍生自DaMV-荷兰(DaMV-H)菌株的启动子，Genbank登录号EU090957，核苷酸1177-1494。此片段可操作地连接到衍生自DaMV-H启动子的第二片段，核苷酸1003-1176。在天然DaMV启动子构型中，所述第二片段将在所述第一片段之前。在所述第一片段内，相对于SEQ ID NO:14，核苷酸287至288和核苷酸319至322被改变为Genbank登录号JX272320内的DaMV启动子的类似位置的序列。EXP EXP-DaMV.FLT+Td.RCc3_1+SETit.14-3-3C-5:1(SEQ ID NO:18)和EXP-DaMV.FLT+Td.RCc3_1+Td.RCc3_1+SETit.14-3-3C-5:5(SEQ ID NO:19)包含增强子E-DaMV.FLT:2(SEQ ID NO:15)，所述增强子衍生自大丽花花叶病毒启动子，Genbank登录号EF513491，核苷酸1至322。
EXP EXP-DaMV.H-Flt+Zm.Ltp+SETit.Act4:1(SEQ ID NO:16)和EXP-DaMV.H-Flt+Zm.Ltp+Zm.Ltp+SETit.Act4:4(SEQ ID NO:17)包含嵌合重排的增强子E-DaMV.H-Flt:1(SEQ ID NO:14)，所述嵌合重排的增强子将5′可操作地连接到启动子和5′UTR，所述启动子和5′UTR衍生自来自玉米的脂质转移蛋白样蛋白基因，所述5′UTR将5′可操作地连接到衍生自来自粟米的肌动蛋白4基因的内含子。EXP EXP-DaMV.FLT+Td.RCc3_1+SETit.14-3-3C-5:1(SEQ ID NO:18)和EXP-DaMV.FLT+Td.RCc3_1+Td.RCc3_1+SETit.14-3-3C-5:5(SEQ IDNO:19)包含增强子E-DaMV.FLT:2(SEQ ID NO:15)，所述增强子将5′可操作地连接到启动子和5′UTR，所述启动子和5′UTR衍生自来自鸭茅状摩擦禾的RCc3基因，所述5′UTR将5′可操作地连接到衍生自来自粟米的14-3-3C基因的内含子。
如本领域众所周知的，通过农杆菌介导的转化，使用上文所述二元转化载体构建体来转化来自玉米品种01DKD2的玉米植物细胞。诱导所得转化的植物细胞以形成完整的玉米植物。如实施例2中所述，使用V2阶段叶和根确定GUS表达的定量和定性测量。表6示出了四(4)种EXP中的每一种的稳定转化的V2叶和根的平均GUS表达。表6中还示出了增强子的方向以及根与叶表达的比率。
表6.在稳定转化的玉米植物中由EXP驱动的V2叶和根中的平均GUS表达、增强子方向以及根与叶表达的比率。
Figure BDA0002963392440000351
在实施例3的表5中，EXP EXP-Zm.LTP-SETit.Act4(SEQ ID NO:6)驱动根中的GUS表达比叶中的GUS表达高三十五(35)倍以上。如表6所示，通过嵌合重排的增强子E-DaMV.H-Flt:1(SEQ ID NO:14)将5′可操作地连接到包含在EXP-DaMV.H-Flt+Zm.Ltp+SETit.Act4:1(SEQ ID NO:16)和EXP-DaMV.H-Flt+Zm.Ltp+Zm.Ltp+SETit.Act4:4(SEQ ID NO:17)内的EXP-Zm.LTP-SETit.Act4内的启动子，相对于根，GUS表达在叶中增加。然而，这两种EXP内的增强子的方向影响根和叶中GUS表达的相对水平。与正向方向相比，当E-DaMV.H-Flt:1以反向方向定向时，根与叶表达的比率更高。同样，当与EXP-DaMV.FLT+Td.RCc3_1+Td.RCc3_1+SETit.14-3-3C-5:5(SEQ ID NO:19)内的正向方向相比时，EXP-DaMV.FLT+Td.RCc3_1+SETit.14-3-3C-5:1(SEQ ID NO:18)内的以反向方向可操作地连接的E-DaMV.FLT:2(SEQID NO:15)增强子导致根与叶GUS表达的比率更高。通过以反向方向可操作地连接两个增强子，可提供一种表达谱，所述表达谱提供了比当以正向方向可操作地连接增强子时更高的根与叶表达的比率。当想使用病毒增强子加强表达但希望尽可能提供最高的根与叶表达的比率时，这种特征是非常理想的。
已说明并描述了本发明的原理，对于本领域技术人员来说，显而易见的是在不脱离此类原理的情况下可对本发明进行布置和细节上的修改。我们要求保护在权利要求的精神和范围内的所有修改。本文引用的所有出版物和出版的专利文件以引用的方式并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请具体地和单独地被指示为以引用的方式并入。
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Claims (17)

1.一种重组DNA分子，其包含选自由以下组成的组的DNA序列：
a)与SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者具有至少85％序列同一性的序列；
b)包含SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者的序列；和
c)SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者的片段，其中所述片段具有基因调控活性；
其中所述序列可操作地连接到异源可转录DNA分子。
2.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述序列与SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者的DNA序列具有至少90％的序列同一性。
3.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述序列与SEQ ID NO:2-8、12-14和16-19中任一者的DNA序列具有至少95％的序列同一性。
4.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列包含基因调控活性。
5.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述异源可转录DNA分子包含农艺学感兴趣的基因。
6.如权利要求5所述的重组DNA分子，其中所述农艺学感兴趣的基因赋予植物中的除草剂耐受性。
7.如权利要求5所述的重组DNA分子，其中所述农艺学感兴趣的基因赋予植物中的害虫抗性。
8.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述异源可转录DNA分子编码dsRNA、miRNA或siRNA。
9.一种转基因植物细胞，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
10.如权利要求9所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。
11.如权利要求9所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
12.一种转基因植物或其部分，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
13.一种如权利要求12所述的转基因植物的子代植物或其部分，其中所述子代植物或其部分包含所述重组DNA分子。
14.一种转基因种子，其中所述种子包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
15.一种生产商品的方法，其包括获得根据权利要求12所述的转基因植物或其部分，以及由所述转基因植物或其部分生产所述商品。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述商品是种子、加工种子、蛋白浓缩物、蛋白分离物、淀粉、谷物、植物部分、种子油、生物质、面粉和粗粉。
17.一种表达可转录DNA分子的方法，其包括获得包含如权利要求1所述的重组DNA分子的转基因植物，以及培养植物，其中所述可转录DNA被表达。
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