JP2023512284A - 植物調節エレメント及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、植物における遺伝子発現を調節するために有用な組換えＤＮＡ分子及び構築物、ならびにそれらのヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物、植物細胞、植物部位、及び種子、ならびにそれらの使用方法も提供する。【選択図】なし
Description
関連出願の参照
本出願は、２０２０年２月４日に出願された米国仮出願第６２／９６９，９９３号の利益を主張する。当該仮出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年２月４日に出願された米国仮出願第６２／９６９，９９３号の利益を主張する。当該仮出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
配列表の組み込み
「ＭＯＮＳ４７９ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、４１．２キロバイト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）での計測）であり、２０２１年１月１１日に作成されたものであり、電子申請により本明細書とともに提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
「ＭＯＮＳ４７９ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、４１．２キロバイト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）での計測）であり、２０２１年１月１１日に作成されたものであり、電子申請により本明細書とともに提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、植物分子生物学及び植物遺伝子工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、植物における遺伝子発現を調節するために有用なＤＮＡ分子に関する。
調節エレメントは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写を調節することによって遺伝子活性を調節する遺伝子エレメントである。かかるエレメントとしては、プロモーター、リーダー、イントロン、及び３’非翻訳領域を挙げることができ、これらは、植物分子生物学及び植物遺伝子工学の分野で有用である。
本発明は、植物に使用するための遺伝子調節エレメントを提供する。本発明はまた、該調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子も提供する。本発明はまた、該調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、及び種子も提供する。１つの実施形態では、該調節エレメントは、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、該転写可能なＤＮＡ分子は、調節配列に対して異種であってもよい。従って、本発明が提供する調節エレメント配列は、特定の実施形態では、異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されるとして定義され得る。本発明はまた、該調節エレメントを使用する方法ならびに該調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子を作製及び使用する方法、ならびに転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された該調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、及び種子を提供する。
従って、１つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号１～２０のいずれかに対して少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列、（ｂ）配列番号１～２０のいずれかを含む配列、及び（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１～２０のいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含み、該配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される組換えＤＮＡ分子を提供する。「異種の転写可能なＤＮＡ分子」とは、転写可能なＤＮＡ分子が作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列に対して異種であることを意味する。特定の実施形態では、該組換えＤＮＡ分子は、配列番号１～２０のいずれかのＤＮＡ配列に対して少なくとも約８５パーセント、少なくとも約８６パーセント、少なくとも約８７パーセント、少なくとも約８８パーセント、少なくとも約８９パーセント、少なくとも約９０パーセント、少なくとも９１パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９３パーセント、少なくとも９４パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、（ａ）配列番号１～２０のいずれかに対して少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列、（ｂ）配列番号１～２０のいずれかを含む配列、及び（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１～２０のいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞である。ある特定の実施形態では、該トランスジェニック植物細胞は、単子葉植物細胞である。他の実施形態では、該トランスジェニック植物細胞は、双子葉植物細胞である。
さらに別の態様では、さらに本明細書に提供するのは、（ａ）配列番号１～２０のいずれかに対して少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列、（ｂ）配列番号１～２０のいずれかを含む配列、及び（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１～２０のいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含み、該配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物、またはその部位である。特定の実施形態では、該トランスジェニック植物は、該組換えＤＮＡ分子を含む任意の世代の後代植物である。成長時にかかるトランスジェニック植物を産生する組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック種子もまた提供する。
別の態様では、本発明は、商品生産物を生産する方法を提供し、該方法は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその部位を得ること及びそれから商品生産物を生産することを含む。１つの実施形態では、該商品生産物は、種子、加工種子、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、デンプン、穀物、植物部位、種子油、バイオマス、細粉及び粗粉である。
さらにまた別の態様では、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を生産する方法を提供し、該方法は、植物細胞を本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換して形質転換植物細胞を生産すること及び該形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生することを含む。
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、リーダーに作動可能に連結されたプロモーター、Ｐ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ４８７３２２：２のＤＮＡ配列である。
配列番号１は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、リーダーに作動可能に連結されたプロモーター、Ｐ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ４８７３２２：２のＤＮＡ配列である。
配列番号２は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、３’ＵＴＲ、Ｔ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ４８７３２２：２のＤＮＡ配列である。
配列番号３は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、リーダーに作動可能に連結されたプロモーター、Ｐ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ３３９７８１：１のＤＮＡ配列である。
配列番号４は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、３’ＵＴＲ、Ｔ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ３３９７８１：１のＤＮＡ配列である。
配列番号５は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、イントロン（Ｉ－Ｚｍ．Ｘｅｔ：１）に作動可能に連結された、リーダーに作動可能に連結されたプロモーター（Ｐ－Ｚｍ．Ｘｅｔ：１）で構成される、調節発現エレメント群またはＥＸＰである、ＥＸＰ－Ｚｍ．Ｘｅｔ：１のＤＮＡ配列である。
配列番号６は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、リーダーに作動可能に連結されたプロモーター、Ｐ－Ｚｍ．Ｘｅｔ：１のＤＮＡ配列である。
配列番号７は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、イントロン、Ｉ－Ｚｍ．Ｘｅｔ：１のＤＮＡ配列である。
配列番号８は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、３’ＵＴＲ、Ｔ－Ｚｍ．Ｘｅｔ：１のＤＮＡ配列である。
配列番号９は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、イントロン（Ｉ－Ｚｍ．Ｓａｔ６：１）に作動可能に連結された、リーダーに作動可能に連結されたプロモーター（Ｐ－Ｚｍ．Ｓａｔ６：１）で構成されるＥＸＰである、ＥＸＰ－Ｚｍ．Ｓａｔ６：１のＤＮＡ配列である。
配列番号１０は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、リーダーに作動可能に連結されたプロモーター、Ｐ－Ｚｍ．Ｓａｔ６：１のＤＮＡ配列である。
配列番号１１は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、イントロン、Ｉ－Ｚｍ．Ｓａｔ６：１のＤＮＡ配列である。
配列番号１２は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、３’ＵＴＲ、Ｔ－Ｚｍ．Ｓａｔ６：１のＤＮＡ配列である。
配列番号１３は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、イントロン（Ｉ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ０４９７２６：１）に作動可能に連結された、リーダーに作動可能に連結されたプロモーター（Ｐ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ０４９７２６：１）で構成されるＥＸＰである、ＥＸＰ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ０４９７２６：１のＤＮＡ配列である。
配列番号１４は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、リーダーに作動可能に連結されたプロモーター、Ｐ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ０４９７２６：１のＤＮＡ配列である。
配列番号１５は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、イントロン、Ｉ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ０４９７２６：１のＤＮＡ配列である。
配列番号１６は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、３’ＵＴＲ、Ｔ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ０４９７２６：１のＤＮＡ配列である。
配列番号１７は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、リーダーに作動可能に連結されたプロモーター、Ｐ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ１４１７６２：１のＤＮＡ配列である。
配列番号１８は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、リーダーに作動可能に連結されたプロモーター、Ｐ－Ｚｍ．ＤＳＵＬ：１のＤＮＡ配列である。
配列番号１９は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、リーダーに作動可能に連結されたプロモーター、Ｐ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ５１２１１３：１のＤＮＡ配列である。
配列番号２０は、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する、３’ＵＴＲ、Ｔ－Ｚｍ．ＧＲＭＺＭ２Ｇ５１２１１３：１のＤＮＡ配列である。
配列番号２１は、ジャガイモ光誘導性組織特異的Ｓｔ－ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：Ｘ０４７５３）に由来するプロセシング可能なイントロンを有するβ－グルクロニダーゼの植物発現に最適化された合成コード配列（ＧＵＳ，ＧＯＩ－Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１．ｎｎｏ：１）である。
本発明は、植物において遺伝子調節活性を有する調節エレメントを提供する。これらの調節エレメントのヌクレオチド配列は、配列番号１～２０として示される。これらの調節エレメントは、植物組織内で、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を及ぼすことが可能であり、ひいては、トランスジェニック植物内で、作動可能に連結された導入遺伝子の遺伝子発現を調節することが可能である。また、本発明は、該示される調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子を修飾、産生、及び使用する方法も提供する。また、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞、植物、植物部位、及び種子を含む組成物、ならびにこれらを調製及び使用する方法も提供する。
以下の定義及び方法は、本発明をより良好に定義し、当業者が本発明を実施する指針とするために提供される。別段の記載がない限り、用語は、関連技術分野の当業者による従来の使用に従って理解されるものとする。
ＤＮＡ分子
本明細書で使用される、「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」という用語は、５’（上流）末端から３’（下流）末端に読み取られるゲノム起源または合成起源の二本鎖ＤＮＡ分子、すなわち、デオキシリボヌクレオチド塩基の重合体またはＤＮＡ分子を指す。本明細書で使用される、「ＤＮＡ配列」という用語は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される命名法は、米国連邦規則集３７編１．８２２条の命名法に対応し、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）附属書２、表１及び３の表に定められる。
本明細書で使用される、「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」という用語は、５’（上流）末端から３’（下流）末端に読み取られるゲノム起源または合成起源の二本鎖ＤＮＡ分子、すなわち、デオキシリボヌクレオチド塩基の重合体またはＤＮＡ分子を指す。本明細書で使用される、「ＤＮＡ配列」という用語は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される命名法は、米国連邦規則集３７編１．８２２条の命名法に対応し、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）附属書２、表１及び３の表に定められる。
本明細書で使用される、「組換えＤＮＡ分子」とは、人間の介入なしでは天然に一緒に生じないＤＮＡ分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子である。例えば、組換えＤＮＡ分子とは、互いに対して異種である少なくとも２つのＤＮＡ分子で構成されるＤＮＡ分子、自然界に存在するＤＮＡ配列から逸脱するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、合成ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、または遺伝子形質転換もしくは遺伝子編集によって宿主細胞のＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子であってもよい。
本出願における「単離されたＤＮＡ分子」、または等価の用語もしくは表現への言及は、該ＤＮＡ分子が、単独で、または他の組成物と組み合わせて存在するが、その自然環境内には存在しないＤＮＡ分子であることを意味するものとする。例えば、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列等のような、生物のゲノムのＤＮＡ内で天然に見出される核酸エレメントは、当該エレメントが生物のゲノム内にあり、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にある限りは、「単離された」とは見なされない。しかしながら、これらのエレメントの各々、及びこれらのエレメントの下位部分は、当該エレメントが生物のゲノム内になく、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にない限り、本開示の範囲内で「単離された」とされる。同様に、殺虫性タンパク質またはそのタンパク質の天然に生じる任意の殺虫性バリアントをコードするヌクレオチド配列は、当該ヌクレオチド配列が、当該タンパク質をコードする配列が天然に見出される細菌のＤＮＡ内にない限り、単離されたヌクレオチド配列とされる。天然に生じる殺虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的において単離されていると見なされる。本開示の目的において、任意のトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞のゲノム内に挿入されるか、または染色体外ベクター内に存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、それが、細胞の形質転換に使用されるプラスミドもしくは類似の構造内に存在するか、植物もしくは細菌のゲノム内に存在するか、または植物もしくは細菌に由来する組織、後代、生物学的試料、もしくは商品生産物において検出可能量で存在するかを問わず、単離されたヌクレオチド配列であると見なされる。
本明細書で使用される、「配列同一性」という用語は、２つの最適にアラインされたポリヌクレオチド配列または２つの最適にアラインされたポリペプチド配列が同一である程度を指す。最適な配列アラインメントは、２つの配列、例えば、参照配列と別の配列とを手動でアラインして、適切な内部ヌクレオチドの挿入、欠失、またはギャップを備えた配列アラインメント内のヌクレオチドマッチ数を最大化することによって創出される。本明細書で使用される、「参照配列」という用語は、配列番号１～２０として示されるＤＮＡ配列を指す。
本明細書で使用される、「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」または「同一性％」という用語は、同一性の分数に１００を掛けたものである。参照配列に対して最適にアラインされた配列についての「同一性の分数」は、最適アラインメント内のヌクレオチドマッチ数を、参照配列内の全ヌクレオチド数、例えば、完全長の全参照配列の全ヌクレオチド数で除したものである。従って、本発明の１つの実施形態は、本明細書において配列番号１～２０として示される参照配列に対して最適にアラインされた場合に、該参照配列に対して少なくとも約８５パーセントの同一性、少なくとも約８６パーセントの同一性、少なくとも約８７パーセントの同一性、少なくとも約８８パーセントの同一性、少なくとも約８９パーセントの同一性、少なくとも約９０パーセントの同一性、少なくとも約９１パーセントの同一性、少なくとも約９２パーセントの同一性、少なくとも約９３パーセントの同一性、少なくとも約９４パーセントの同一性、少なくとも約９５パーセントの同一性、少なくとも約９６パーセントの同一性、少なくとも約９７パーセントの同一性、少なくとも約９８パーセントの同一性、少なくとも約９９パーセントの同一性、または少なくとも約１００パーセントの同一性を有する配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
調節エレメント
プロモーター、リーダー（別名、５’ＵＴＲ）、エンハンサー、イントロン、及び転写終結領域（または３’ＵＴＲ）等の調節エレメントは、生細胞内での遺伝子の全体的発現において不可欠な役割を果たす。本明細書で使用される、「調節エレメント」という用語は、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を指す。本明細書で使用される、「遺伝子調節活性」という用語は、例えば、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写及び／または翻訳に影響を及ぼすことにより、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を及ぼす能力を指す。植物で機能するプロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン、及び３’ＵＴＲ等の調節エレメントは、遺伝子工学による植物の表現型の変更に有用である。
プロモーター、リーダー（別名、５’ＵＴＲ）、エンハンサー、イントロン、及び転写終結領域（または３’ＵＴＲ）等の調節エレメントは、生細胞内での遺伝子の全体的発現において不可欠な役割を果たす。本明細書で使用される、「調節エレメント」という用語は、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を指す。本明細書で使用される、「遺伝子調節活性」という用語は、例えば、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写及び／または翻訳に影響を及ぼすことにより、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を及ぼす能力を指す。植物で機能するプロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン、及び３’ＵＴＲ等の調節エレメントは、遺伝子工学による植物の表現型の変更に有用である。
本明細書で使用される、「調節発現エレメント群」または「ＥＸＰ」配列とは、作動可能に連結された調節エレメント、例えば、エンハンサー、プロモーター、リーダー、及びイントロンの群を指し得る。例えば、調節発現エレメント群は、例えば、イントロン配列に対して５’に作動可能に連結されたリーダー配列に対して５’に作動可能に連結されたプロモーターで構成され得る。本発明を実施する上で有用なＥＸＰとしては、配列番号５、９、及び１３が挙げられる。
調節エレメントは、それらの遺伝子発現パターン、例えば、正及び／または負の影響、例えば、構成的発現または時間的、空間的、発達的、組織、環境的、生理学的、病理学的、細胞周期、及び／または化学的応答性の発現、ならびにそれらの任意の組み合わせ、加えて定量的または定性的指標によって特徴付けられ得る。本明細書で使用される、「遺伝子発現パターン」とは、作動可能に連結されたＤＮＡ分子の、転写されたＲＮＡ分子への転写の任意のパターンである。転写されたＲＮＡ分子は、翻訳されてタンパク質分子を生み出す場合もあれば、アンチセンスＲＮＡまたは他の調節ＲＮＡ分子、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等をもたらす場合もある。
本明細書で使用される、「タンパク質発現」という用語は、転写されたＲＮＡ分子の、タンパク質分子への翻訳の任意のパターンである。タンパク質発現は、その時間的、空間的、発達的、または形態学的な性質によって、加えて定量的または定性的指標によって特徴付けられ得る。
プロモーターは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための調節エレメントとして有用である。本明細書で使用される、「プロモーター」という用語は、一般に、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩ及び他のタンパク質、例えば、トランス作用性転写因子の認識及び結合に関与するＤＮＡ分子を指す。プロモーターは、最初に、遺伝子のゲノムコピーの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）から単離され得るが、本開示の目的で、本明細書に提供するプロモーターは、リーダーに対して５’に作動可能に連結されたプロモーターで構成される。代替的に、プロモーターは、合成的に産生される場合もあれば、操作されたＤＮＡ分子の場合もある。また、プロモーターはキメラであってもよい。キメラプロモーターは、２つ以上の異種ＤＮＡ分子の融合により産生される。本発明を実施する上で有用なプロモーターとしては、配列番号１、３、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、及び１９のいずれかに含まれるプロモーターエレメント、またはそれらの断片もしくはバリアントが挙げられる。本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載の特許請求の範囲のＤＮＡ分子及びその任意のバリアントまたは誘導体はさらに、プロモーター活性を含むものとして定義され、すなわち、トランスジェニック植物等の宿主細胞内でプロモーターとして作用することが可能である。さらなる特定の実施形態では、断片は、それが由来する開始プロモーター分子が有するプロモーター活性を示すものとして定義される場合もあれば、断片は、基礎レベルの転写をもたらし、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体が認識及び結合するためのＴＡＴＡボックスまたは同等のＤＮＡ配列で構成される「最小プロモーター」を含む場合もある。
１つの実施形態では、本明細書に開示するプロモーター配列の断片を提供する。プロモーターの断片は、上記のようなプロモーター活性を含んでもよく、また、単独で、または、例えば、キメラプロモーターを構築する際の他のプロモーター及びプロモーターの断片との組み合わせで、または他の発現エレメント及び発現エレメントの断片との組み合わせで有用であってもよい。特定の実施形態では、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００の連続したヌクレオチド、またはそれ以上の、本明細書に開示するプロモーター活性を有するＤＮＡ分子を含むプロモーターの断片を提供する。出発プロモーター分子からかかる断片を産生する方法は、当技術分野で周知である。
例えば、内部または５’欠失等の、配列番号１、３、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、及び１９のいずれかに含まれるプロモーターエレメントのいずれかに由来する組成物は、発現を改善または変更するための当技術分野で既知の方法、すなわち、発現に正の影響もしくは負の影響を及ぼすエレメントを除去すること、発現に正の影響もしくは負の影響を及ぼすエレメントを重複させること、及び／または発現に組織特異的もしくは細胞特異的な影響を及ぼすエレメントを重複させることもしくは除去すること等を使用して産生され得る。ＴＡＴＡボックスエレメントまたはその同等の配列及び下流の配列が除去されている３’欠失で構成される配列番号１、３、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、及び１９のいずれかに含まれるプロモーターエレメントのいずれかに由来する組成物を使用して、例えば、エンハンサーエレメントを作製することができる。さらなる欠失を行って、発現に正の影響もしくは負の影響、組織特異的な影響、細胞特異的な影響、またはタイミング特異的な（概日リズム等であるが、これに限定されない）影響を及ぼす任意のエレメントを除去してもよい。配列番号１、３、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、及び１９のいずれかに含まれるとして示されるプロモーターエレメント及びそれらに由来する断片またはエンハンサーのいずれかを使用して、キメラ転写調節エレメント組成物を作製することができる。
本発明によれば、プロモーターまたはプロモーター断片は、既知のプロモーターエレメント、すなわち、ＴＡＴＡボックス及び他の既知の転写因子結合部位モチーフ等のＤＮＡ配列特性の存在について解析され得る。かかる既知のプロモーターエレメントの識別情報は、当業者により、元のプロモーターと同様の発現パターンを有するプロモーターのバリアントを設計するために使用され得る。
本明細書で使用される、「リーダー」という用語は、遺伝子の非翻訳５’領域（５’ＵＴＲ）から単離され、転写開始部位（ＴＳＳ）とタンパク質コード配列開始部位との間のヌクレオチドセグメントとして一般に定義されるＤＮＡ分子を指す。代替的に、リーダーは、合成的に産生されたＤＮＡエレメントでも操作されたＤＮＡエレメントでもよい。リーダーは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための５’調節エレメントとして使用され得る。リーダー分子は、異種プロモーターまたはそれらの天然のプロモーターとともに使用され得る。本発明を実施する上で有用なリーダーとしては、配列番号１、３、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、及び１９のいずれかに含まれるリーダーエレメント、またはそれらの断片もしくはバリアントが挙げられる。特定の実施形態では、かかるＤＮＡ配列は、例えば、トランスジェニック植物細胞を含めた宿主細胞内でリーダーとして作用可能であるとして定義され得る。１つの実施形態では、かかる配列は、リーダー活性を含むものとして解読される。
配列番号１、３、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、及び１９のいずれかに含まれるリーダー配列（５’ＵＴＲとも呼ばれる）は、調節エレメントを構成する場合もあれば、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写または翻訳に影響を及ぼし得る二次構造を採用する場合もある。配列番号１、３、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、及び１９のいずれかに含まれるリーダー配列を、本発明に従って使用し、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写または翻訳に影響を及ぼすキメラ調節エレメントを作製することができる。
本明細書で使用される、「イントロン」という用語は、遺伝子から単離または同定される可能性がある、一般に、翻訳前のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のプロセシングの間にスプライシング除去される領域として定義され得るＤＮＡ分子を指す。代替的に、イントロンは、合成的に産生されたＤＮＡエレメントでも操作されたＤＮＡエレメントでもよい。イントロンは、作動可能に連結された遺伝子の転写をもたらすエンハンサーエレメントを含んでもよい。イントロンは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための調節エレメントとして使用されてもよい。構築物は、イントロンを含んでもよく、該イントロンは、転写可能なＤＮＡ分子に対して異種であっても異種でなくてもよい。当技術分野におけるイントロンの例としては、イネのアクチンイントロン及びトウモロコシＨＳＰ７０イントロンが挙げられる。
植物では、遺伝子構築物にいくつかのイントロンを含めると、該イントロンを含まない構築物と比較して、ｍＲＮＡ及びタンパク質の蓄積が増加する。この効果は、遺伝子発現の「イントロン媒介増強」（ＩＭＥ）と称されている。植物での発現を刺激することが知られているイントロンは、トウモロコシ遺伝子（例えば、ｔｕｂＡ１、Ａｄｈ１、Ｓｈ１、及びＵｂｉ１）、イネ遺伝子（例えば、ｔｐｉ）、ならびに双子葉植物遺伝子、例えば、ペチュニア由来の遺伝子（例えば、ｒｂｃＳ）、ジャガイモ由来の遺伝子（例えば、ｓｔ－ｌｓ１）、及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来の遺伝子（例えば、ｕｂｑ３及びｐａｔ１）で同定されている。イントロンのスプライス部位内の欠失または変異によって遺伝子発現が低減することが分かっており、ＩＭＥにはスプライシングが必要であり得ることを示している。しかしながら、双子葉植物において、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのｐａｔ１遺伝子のスプライス部位内の点変異によるＩＭＥが示されている。１つの植物で同じイントロンを複数使用することは、不利益を示すことが分かっている。その場合、適切な組換えＤＮＡエレメントを構築するための基本的な制御エレメントを収集する必要がある。本発明を実施する上で有用な例示的なイントロンは、配列番号７、１１、及び１５として示される。
本明細書で使用される、「３’転写終結分子」、「３’非翻訳領域」または「３’ＵＴＲ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の３’部分の非翻訳領域への転写の過程で使用されるＤＮＡ分子を指す。ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域は、特異的切断及びポリＡテールとしても知られる３’ポリアデニル化によって生じ得る。３’ＵＴＲは、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されてその下流に位置してもよく、ポリアデニル化シグナル及び転写、ｍＲＮＡプロセシング、または遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な他の調節シグナルを含んでもよい。ポリＡテールは、ｍＲＮＡの安定性及び翻訳の開始において機能すると考えられている。当技術分野における３’転写終結分子の例は、ノパリンシンターゼ３’領域、コムギｈｓｐ１７ ３’領域、エンドウマメルビスコ小サブユニット３’領域、ワタＥ６ ３’領域、及びコイキシン（ｃｏｉｘｉｎ）３’ＵＴＲである。
３’ＵＴＲは、通常、特定のＤＮＡ分子の組換え発現に有益な用途が見出される。弱い３’ＵＴＲはリードスルーを生じる可能性を有し、これにより、隣接する発現カセット内に位置するＤＮＡ分子の発現に影響が及ぶ可能性がある。転写終結を適切に制御することにより、下流に局在するＤＮＡ配列（例えば、他の発現カセット）へのリードスルーを防止することができ、さらに、遺伝子発現を改善するためのＲＮＡポリメラーゼの効率的なリサイクルを可能にすることができる。効率的な転写終結（ＤＮＡからのＲＮＡポリメラーゼＩＩの放出）は、転写の再開の前提条件であるため、全体的な転写レベルに直接影響を及ぼす。転写終結に続いて、成熟ｍＲＮＡは合成部位から放出され、鋳型は細胞質に輸送される。真核生物のｍＲＮＡは、インビボでポリ（Ａ）型として蓄積されることから、従来の方法で転写終結部位を検出することは困難である。しかしながら、バイオインフォマティクス法により機能的かつ効率的に３’ＵＴＲを予測することは、有効な３’ＵＴＲを容易に予測することを可能にする保存ＤＮＡ配列が存在しないため困難である。
実際的な観点から、通常は発現カセットで使用される３’ＵＴＲが以下の特性を有することが有益である。第一に、３’ＵＴＲは、導入遺伝子の転写を効率的かつ有効に終結することが可能であるべきであり、かつ、１つのトランスファーＤＮＡ（Ｔ－ＤＮＡ）に存在する複数の発現カセットの場合のように別の発現カセットで構成され得る任意の隣接するＤＮＡ配列、またはＴ－ＤＮＡを挿入した隣接する染色体ＤＮＡへの転写物のリードスルーを防止することが可能であるべきである。第二に、３’ＵＴＲは、ＤＮＡ分子の発現を駆動するために使用されるプロモーター、リーダー、エンハンサー、及びイントロンによって付与される転写活性の低減を引き起こすべきではない。最後に、植物バイオテクノロジーにおいて、３’ＵＴＲは、多くの場合、形質転換植物から抽出された逆転写ＲＮＡの増幅反応のプライミングに使用されるとともに、（１）植物染色体に一旦組み込まれた発現カセットの転写活性または発現を評価するため、（２）植物ＤＮＡ内の挿入物のコピー数を評価するため、及び（３）育種後に得られた種子の接合性を評価するために使用される。３’ＵＴＲはまた、挿入されたカセットのインタクト性を特徴付けるために、形質転換植物から抽出されたＤＮＡの増幅反応にも使用される。本発明を実施する上で有用な３’ＵＴＲは、配列番号２、４、８、１２、１６、及び２０として示される。
本明細書で使用される、「エンハンサー」または「エンハンサーエレメント」という用語は、シス作用性調節エレメント、別名、シスエレメントを指し、これは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の全体的な発現パターンの一側面を付与するが、通常、単独では転写を駆動するには不十分である。プロモーターとは異なり、エンハンサーエレメントには、通常、転写開始部位（ＴＳＳ）やＴＡＴＡボックス、または同等のＤＮＡ配列は含まれない。プロモーターまたはプロモーター断片は、作動可能に連結されたＤＮＡ配列の転写に影響を及ぼす１つ以上のエンハンサーエレメントを自然に含み得る。また、エンハンサーエレメントをプロモーターと融合させて、遺伝子発現の全体的な調節の一側面を付与するキメラプロモーターシスエレメントを産生してもよい。
多くのプロモーターエンハンサーエレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質に結合し、及び／またはＤＮＡトポロジーに影響を及ぼして、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡ鋳型へのアクセスを選択的に許可もしくは制限する局所立体配座、または転写開始部位での二重らせんの選択的開放を促進する局所立体配座を生じると考えられている。エンハンサーエレメントは、転写を調節する転写因子に結合するように機能し得る。いくつかのエンハンサーエレメントは、複数の転写因子に結合し、転写因子は、異なる親和性で複数のエンハンサードメインと相互作用し得る。エンハンサーエレメントは、欠失解析、すなわち、１つ以上のヌクレオチドを５’末端もしくは内部からプロモーターまで削除すること、ＤＮａｓｅ Ｉフットプリンティングを用いたＤＮＡ結合タンパク質解析、メチル化干渉、電気泳動移動度シフトアッセイ、ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるインビボゲノムフットプリンティング、及びその他の従来のアッセイを含めたいくつかの技術によって特定される場合もあれば、ＢＬＡＳＴ等の従来のＤＮＡ配列比較法で、標的配列または標的モチーフとして既知のシスエレメントモチーフまたはエンハンサーエレメントを使用するＤＮＡ配列類似性解析によって特定される場合もある。エンハンサードメインの微細構造は、１つ以上のヌクレオチドの変異誘発（もしくは置換）により、または当技術分野で既知の他の従来の方法により、さらに研究され得る。エンハンサーエレメントは、化学合成により、またはかかるエレメントを含む調節エレメントからの単離により得ることができ、これらは、部分配列の操作を容易にするための有用な制限酵素部位を含む追加の隣接ヌクレオチドとともに合成され得る。従って、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための、本明細書に開示する方法に従うエンハンサーエレメントの設計、構築、及び使用が本発明に包含される。エンハンサーは、配列番号１、３、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、及び１９に含まれるプロモーターのいずれかに由来し得る。
本明細書で使用される、「キメラ」という用語は、第一のＤＮＡ分子を第二のＤＮＡ分子と融合させることによって産生される単一のＤＮＡ分子を指し、該第一のＤＮＡ分子も該第二のＤＮＡ分子も、通常はその構成で、すなわち、他方と融合して見出されることはない。従って、キメラＤＮＡ分子は、通常は自然界に見出されない新たなＤＮＡ分子である。本明細書で使用される、「キメラプロモーター」という用語は、ＤＮＡ分子のかかる操作によって産生されるプロモーターを指す。キメラプロモーターは、２つ以上のＤＮＡ断片を組み合わせてもよく、例えば、プロモーターをエンハンサーエレメントに融合させてもよい。従って、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための、本明細書に開示する方法に従うキメラプロモーターの設計、構築、及び使用が本発明に包含される。
キメラ調節エレメントは、当技術分野で既知の様々な方法、例えば、制限酵素消化及びライゲーション、ライゲーション非依存的クローニング、増幅中のＰＣＲ産物のモジュールアセンブリ、または調節エレメントの直接化学合成、ならびに当技術分野で既知のその他の方法によって、作動可能に連結され得る様々な構成エレメントを含むように設計され得る。得られる様々なキメラ調節エレメントは、同じ構成エレメントまたはそのバリアントで構成され得るが、構成部分が作動可能に連結されるようにする連結ＤＮＡ配列（複数可）を含むＤＮＡ配列（複数可）が異なる。本発明において、配列番号１～２０として示されるＤＮＡ配列は、調節エレメントの参照配列を提供する場合があり、該参照配列を含む構成エレメントは、当技術分野で既知の方法によって連結され得るとともに、細菌及び植物細胞の形質転換で天然に生じる１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、及び／または挿入、または変異を含み得る。
本明細書で使用される、「バリアント」という用語は、組成が第一のＤＮＡ分子と類似しているが同一ではない第二のＤＮＡ分子、例えば、調節エレメントを指し、ここで、該第二のＤＮＡ分子は、該第一のＤＮＡ分子の一般的な機能、すなわち、同じまたは同様の発現パターンを、例えば、おおよそ同等の転写活性によって維持している。バリアントは、該第一のＤＮＡ分子の短縮もしくは切断型、または該第一のＤＮＡ分子の配列の改変型、例えば、制限酵素部位が異なる、及び／または内部の欠失、置換、もしくは挿入を有する型であり得る。また、「バリアント」は、参照配列の１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入を含むヌクレオチド配列を有する調節エレメントも包含することができ、ここで、該誘導体調節エレメントは、対応する親調節分子とおおよそ同等の転写もしくは翻訳活性を有する。また、調節エレメントの「バリアント」は、細菌及び植物細胞の形質転換で天然に生じる変異から生じるバリアントも包含する。本発明において、配列番号１～２０として示されるポリヌクレオチド配列を使用して、元の調節エレメントのＤＮＡ配列と組成が類似するが同一ではなく、一方で元の調節エレメントの一般的な機能、すなわち、同じまたは同様の発現パターンを依然として維持するバリアントが創出され得る。本発明のかかるバリアントの産生は、本開示に照らして当業者の技能の範囲内に十分にあり、本発明の範囲内に包含される。
特定の導入遺伝子の所望の発現の側面に対する本明細書に記載の修飾、重複、または欠失の有効性は、安定した一過性の植物アッセイ、例えば、本明細書の実施例に記載のアッセイで実験的に試験し、開始ＤＮＡ分子に行われた変更及び該変更の目的に応じて異なり得る結果を検証してもよい。
構築物
本明細書で使用される、「構築物」という用語は、任意の供給源に由来し、ゲノム組み込みまたは自律複製が可能であり、少なくとも１つのＤＮＡ分子が別のＤＮＡ分子と機能的に作動可能な方法で連結された、すなわち、作動可能に連結されたＤＮＡ分子を含む、任意の組換えＤＮＡ分子、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または線状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を意味する。本明細書で使用される、「ベクター」という用語は、形質転換、すなわち、宿主細胞中に異種ＤＮＡまたはＲＮＡを導入する目的で使用され得る、任意の構築物を意味する。構築物は、通常、１つ以上の発現カセットを含む。本明細書で使用される、「発現カセット」とは、１つ以上の調節エレメント、通常は少なくともプロモーター及び３’ＵＴＲに作動可能に連結された、少なくとも転写可能なＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子を指す。
本明細書で使用される、「構築物」という用語は、任意の供給源に由来し、ゲノム組み込みまたは自律複製が可能であり、少なくとも１つのＤＮＡ分子が別のＤＮＡ分子と機能的に作動可能な方法で連結された、すなわち、作動可能に連結されたＤＮＡ分子を含む、任意の組換えＤＮＡ分子、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または線状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を意味する。本明細書で使用される、「ベクター」という用語は、形質転換、すなわち、宿主細胞中に異種ＤＮＡまたはＲＮＡを導入する目的で使用され得る、任意の構築物を意味する。構築物は、通常、１つ以上の発現カセットを含む。本明細書で使用される、「発現カセット」とは、１つ以上の調節エレメント、通常は少なくともプロモーター及び３’ＵＴＲに作動可能に連結された、少なくとも転写可能なＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子を指す。
本明細書で使用される、「作動可能に連結される」という用語は、第一のＤＮＡ分子が第二のＤＮＡ分子に連結し、該第一のＤＮＡ分子が該第二のＤＮＡ分子の機能に影響を及ぼすように該第一のＤＮＡ分子及び該第二のＤＮＡ分子が配置されていることを指す。該２つのＤＮＡ分子は、単一の連続ＤＮＡ分子の一部である場合もそうでない場合もあり、隣接する場合もそうでない場合もある。例えば、プロモーターが細胞において目的の転写可能なＤＮＡ分子の転写を調節する場合、該プロモーターは転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されている。例えば、リーダーは、ＤＮＡ配列の転写または翻訳に影響を及ぼすことが可能である場合、該ＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。
本発明の構築物は、１つの実施形態では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞がもたらすトランスファー分子とともに、Ｔ－ＤＮＡの植物細胞のゲノム内への統合を可能にするＴ－ＤＮＡを含む、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓから単離されたＴｉプラスミドの右側の境界（ＲＢまたはＡＧＲｔｕ．ＲＢ）及び左側の境界（ＬＢまたはＡＧＲｔｕ．ＬＢ）領域を有する二重腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド境界構築物として提供され得る（例えば、米国特許第６，６０３，０６１号参照）。また、該構築物は、細菌細胞における複製機能及び抗生物質選択をもたらすプラスミド骨格ＤＮＡセグメント、例えば、ｏｒｉ３２２等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ複製開始点、ｏｒｉＶまたはｏｒｉＲｉ等の広宿主域複製開始点、及びスペクチノマイシンもしくはストレプトマイシンに対する抵抗性を付与するＴｎ７アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードするＳｐｅｃ／Ｓｔｒｐ等の選択マーカー、またはゲンタマイシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）選択マーカー遺伝子についてのコード領域も含み得る。植物形質転換については、宿主細菌株は、多くの場合、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＢＩ、Ｃ５８、またはＬＢＡ４４０４であるが、植物形質転換の技術分野において当業者に既知のその他の株も、本発明では機能し得る。
転写可能なＤＮＡ分子が、タンパク質として翻訳及び発現される機能的ｍＲＮＡ分子に転写されるように、構築物を組み立てて細胞に導入するための方法は、当技術分野では既知である。本発明の実施に関して、構築物及び宿主細胞を調製及び使用するための従来の組成物及び方法は、当業者には周知である。高等植物での核酸の発現に有用な典型的なベクターは、当技術分野では周知であり、これには、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドに由来するベクター及びｐＣａＭＶＣＮトランスファー制御ベクターが含まれる。
本明細書に提供する調節エレメントのいずれかを含め、様々な調節エレメントが構築物に含まれ得る。任意のかかる調節エレメントは、他の調節エレメントと組み合わせて提供される場合もある。かかる組み合わせは、所望の調節機能を生じるように設計または変更され得る。１つの実施形態では、本発明の構築物は、３’ＵＴＲに作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された、少なくとも１つの調節エレメントを含む。
本発明の構築物は、本明細書に提供するまたは当技術分野で既知の任意のプロモーターまたはリーダーを含み得る。例えば、本発明のプロモーターは、異種の非翻訳５’リーダー、例えば、熱ショックタンパク質遺伝子に由来するものに作動可能に連結され得る。代替的に、本発明のリーダーは、異種プロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写物プロモーターに作動可能に連結され得る。
発現カセットは、作動可能に連結されたタンパク質を、特に葉緑体、白色体、もしくは他の色素体細胞小器官、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、液胞、または細胞外の位置に対し、細胞レベル以下で標的化するのに有用なペプチドをコードする、輸送ペプチドコード配列も含み得る。多くの葉緑体局在化タンパク質は、核遺伝子から前駆体として発現され、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体に標的化される。かかる単離された葉緑体タンパク質の例としては、リブロース－１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、光収穫複合体タンパク質Ｉ及びタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、ならびにエノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）に関連するものが挙げられるが、これらに限定されない。葉緑体輸送ペプチドは、例えば、米国特許第７，１９３，１３３号に記載されている。非葉緑体タンパク質は、非葉緑体タンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結された異種ＣＴＰの発現により、葉緑体を標的とし得ることが実証されている。
転写可能なＤＮＡ分子
本明細書で使用される、「転写可能なＤＮＡ分子」という用語は、ＲＮＡ分子に転写することが可能な任意のＤＮＡ分子を指し、これには、タンパク質コード配列を有するもの、ガイドＲＮＡをコードするもの、及び遺伝子抑制に有用な配列を有するＲＮＡ分子を産生するものが含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡ分子の種類には、同じ植物からのＤＮＡ分子、別の植物からのＤＮＡ分子、異なる生物からのＤＮＡ分子、あるいは合成ＤＮＡ分子、例えば、遺伝子のアンチセンスメッセージを含むＤＮＡ分子、または導入遺伝子の人工、合成、もしくは別様の改変型をコードするＤＮＡ分子が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の構築物に組み込むための例示的な転写可能なＤＮＡ分子には、例えば、ＤＮＡ分子が組み込まれる種以外の種に由来するＤＮＡ分子もしくは遺伝子、または同じ種を起源とするもしくは同じ種に存在するが、古典的な育種技術ではなく遺伝子工学法によってレシピエント細胞に組み込まれる遺伝子が含まれる。
本明細書で使用される、「転写可能なＤＮＡ分子」という用語は、ＲＮＡ分子に転写することが可能な任意のＤＮＡ分子を指し、これには、タンパク質コード配列を有するもの、ガイドＲＮＡをコードするもの、及び遺伝子抑制に有用な配列を有するＲＮＡ分子を産生するものが含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡ分子の種類には、同じ植物からのＤＮＡ分子、別の植物からのＤＮＡ分子、異なる生物からのＤＮＡ分子、あるいは合成ＤＮＡ分子、例えば、遺伝子のアンチセンスメッセージを含むＤＮＡ分子、または導入遺伝子の人工、合成、もしくは別様の改変型をコードするＤＮＡ分子が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の構築物に組み込むための例示的な転写可能なＤＮＡ分子には、例えば、ＤＮＡ分子が組み込まれる種以外の種に由来するＤＮＡ分子もしくは遺伝子、または同じ種を起源とするもしくは同じ種に存在するが、古典的な育種技術ではなく遺伝子工学法によってレシピエント細胞に組み込まれる遺伝子が含まれる。
「導入遺伝子」とは、少なくとも宿主細胞ゲノム内の位置に関して宿主細胞に対し異種である転写可能なＤＮＡ分子、及び／または細胞の現行世代もしくは任意の過去の世代に人工的に宿主細胞のゲノムに組み込まれた転写可能なＤＮＡ分子を指す。
調節エレメント、例えば、本発明のプロモーターは、調節エレメントに対して異種である転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。本明細書で使用される、「異種」という用語は、２つ以上のＤＮＡ分子の組み合わせが自然界では通常見出されない場合のかかる組み合わせを指す。例えば、該２つのＤＮＡ分子は、異なる種に由来してもよく、及び／または該２つのＤＮＡ分子は、異なる遺伝子に由来してもよく、例えば、同じ種に由来する異なる遺伝子でも、異なる種に由来する同じ遺伝子でもよい。従って、調節エレメントは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子に対して、かかる組み合わせが自然界では通常見出されない場合、すなわち、転写可能なＤＮＡ分子が、天然には調節エレメントに作動可能に連結されては生じない場合は異種である。
転写可能なＤＮＡ分子は、概して、転写物の発現が所望される任意のＤＮＡ分子であり得る。転写物のかかる発現により、結果として生じるｍＲＮＡ分子の翻訳、ひいてはタンパク質の発現がもたらされ得る。代替的に、例えば、転写可能なＤＮＡ分子は、特定の遺伝子またはタンパク質の発現低下を最終的に引き起こすように設計され得る。１つの実施形態では、これは、アンチセンス方向に配向された転写可能なＤＮＡ分子を使用することによって遂行され得る。当業者は、かかるアンチセンス技術の使用に精通している。この方法で任意の遺伝子を負に調節してもよく、１つの実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ分子の発現を介して特定の遺伝子を抑制するように設計されてもよい。
従って、本発明の１つの実施形態は、構築物がトランスジェニック植物細胞のゲノムに統合された場合に、転写可能なＤＮＡ分子の転写を所望のレベルまたは所望のパターンで調節するように異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された、配列番号１～２０として示されるもの等、本発明の調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子である。１つの実施形態では、該転写可能なＤＮＡ分子は、遺伝子のタンパク質コード領域を含み、別の実施形態では、該転写可能なＤＮＡ分子は、遺伝子のアンチセンス領域を含む。
農学的目的の遺伝子
転写可能なＤＮＡ分子は、農学的目的の遺伝子であり得る。本明細書で使用される、「農学的目的の遺伝子」という用語は、特定の植物組織、細胞、または細胞型で発現した場合に、所望の特性を付与する転写可能なＤＮＡ分子を指す。農学的目的の遺伝子の産物は、植物の形態、生理学、成長、発達、収量、穀粒組成、栄養プロファイル、病害もしくは害虫抵抗性、及び／または環境的もしくは化学的耐性に対する効果を引き起こすために植物内で作用する場合もあれば、植物を常食とする害虫の餌で殺虫剤として作用する場合もある。本発明の１つの実施形態では、本発明の調節エレメントは、該調節エレメントが、農学的目的の遺伝子である転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されるように構築物内に組み込まれる。かかる構築物を含むトランスジェニック植物において、農学的目的の遺伝子の発現は、有益な農学的形質を付与し得る。有益な農学的形質としては、例えば、限定されるものではないが、除草剤耐性、昆虫防除、改変された収量、病害抵抗性、病原体抵抗性、改変された植物成長及び発達、改変されたデンプン含量、改変された油含量、改変された脂肪酸含量、改変されたタンパク質含量、改変された果実の熟成、動物及びヒトの栄養強化、生体高分子産生、環境ストレス抵抗性、医薬品ペプチド、加工品質の改善、風味の改善、ハイブリッド種子産生有用性、繊維産生の改善、ならびに所望のバイオ燃料産生を挙げることができる。
転写可能なＤＮＡ分子は、農学的目的の遺伝子であり得る。本明細書で使用される、「農学的目的の遺伝子」という用語は、特定の植物組織、細胞、または細胞型で発現した場合に、所望の特性を付与する転写可能なＤＮＡ分子を指す。農学的目的の遺伝子の産物は、植物の形態、生理学、成長、発達、収量、穀粒組成、栄養プロファイル、病害もしくは害虫抵抗性、及び／または環境的もしくは化学的耐性に対する効果を引き起こすために植物内で作用する場合もあれば、植物を常食とする害虫の餌で殺虫剤として作用する場合もある。本発明の１つの実施形態では、本発明の調節エレメントは、該調節エレメントが、農学的目的の遺伝子である転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されるように構築物内に組み込まれる。かかる構築物を含むトランスジェニック植物において、農学的目的の遺伝子の発現は、有益な農学的形質を付与し得る。有益な農学的形質としては、例えば、限定されるものではないが、除草剤耐性、昆虫防除、改変された収量、病害抵抗性、病原体抵抗性、改変された植物成長及び発達、改変されたデンプン含量、改変された油含量、改変された脂肪酸含量、改変されたタンパク質含量、改変された果実の熟成、動物及びヒトの栄養強化、生体高分子産生、環境ストレス抵抗性、医薬品ペプチド、加工品質の改善、風味の改善、ハイブリッド種子産生有用性、繊維産生の改善、ならびに所望のバイオ燃料産生を挙げることができる。
当技術分野で既知の農学的目的の遺伝子の例としては、除草剤抵抗性（米国特許第６，８０３，５０１号、第６，４４８，４７６号、第６，２４８，８７６号、第６，２２５，１１４号、第６，１０７，５４９号、第５，８６６，７７５号、第５，８０４，４２５号、第５，６３３，４３５号、及び第５，４６３，１７５号）、収量増加（米国特許第ＵＳＲＥ３８，４４６号、第６，７１６，４７４号、第６，６６３，９０６号、第６，４７６，２９５号、第６，４４１，２７７号、第６，４２３，８２８号、第６，３９９，３３０号、第６，３７２，２１１号、第６，２３５，９７１号、第６，２２２，０９８号、及び第５，７１６，８３７号）、昆虫防除（米国特許第６，８０９，０７８号、第６，７１３，０６３号、第６，６８６，４５２号、第６，６５７，０４６号、第６，６４５，４９７号、第６，６４２，０３０号、第６，６３９，０５４号、第６，６２０，９８８号、第６，５９３，２９３号、第６，５５５，６５５号、第６，５３８，１０９号、第６，５３７，７５６号、第６，５２１，４４２号、第６，５０１，００９号、第６，４６８，５２３号、第６，３２６，３５１号、第６，３１３，３７８号、第６，２８４，９４９号、第６，２８１，０１６号、第６，２４８，５３６号、第６，２４２，２４１号、第６，２２１，６４９号、第６，１７７，６１５号、第６，１５６，５７３号、第６，１５３，８１４号、第６，１１０，４６４号、第６，０９３，６９５号、第６，０６３，７５６号、第６，０６３，５９７号、第６，０２３，０１３号、第５，９５９，０９１号、第５，９４２，６６４号、第５，９４２，６５８号、第５，８８０，２７５号、第５，７６３，２４５号、及び第５，７６３，２４１号）、真菌病害抵抗性（米国特許第６，６５３，２８０号、第６，５７３，３６１号、第６，５０６，９６２号、第６，３１６，４０７号、第６，２１５，０４８号、第５，５１６，６７１号、第５，７７３，６９６号、第６，１２１，４３６号、第６，３１６，４０７号、及び第６，５０６，９６２号）、ウイルス抵抗性（米国特許第６，６１７，４９６号、第６，６０８，２４１号、第６，０１５，９４０号、第６，０１３，８６４号、第５，８５０，０２３号、及び第５，３０４，７３０号）、線虫抵抗性（米国特許第６，２２８，９９２号）、細菌病害抵抗性（米国特許第５，５１６，６７１号）、植物成長及び発達（米国特許第６，７２３，８９７号及び第６，５１８，４８８号）、デンプン産生（米国特許第６，５３８，１８１号、第６，５３８，１７９号、第６，５３８，１７８号、第５，７５０，８７６号、第６，４７６，２９５号）、改変された油産生（米国特許第６，４４４，８７６号、第６，４２６，４４７号、及び第６，３８０，４６２号）、高い油産生（米国特許第６，４９５，７３９号、第５，６０８，１４９号、第６，４８３，００８号、及び第６，４７６，２９５号）、改変された脂肪酸含量（米国特許第６，８２８，４７５号、第６，８２２，１４１号、第６，７７０，４６５号、第６，７０６，９５０号、第６，６６０，８４９号、第６，５９６，５３８号、第６，５８９，７６７号、第６，５３７，７５０号、第６，４８９，４６１号、及び第６，４５９，０１８号）、高いタンパク質産生（米国特許第６，３８０，４６６号）、果実の熟成（米国特許第５，５１２，４６６号）、動物及びヒトの栄養強化（米国特許第６，７２３，８３７号、第６，６５３，５３０号、第６，５４１２，５９号、第５，９８５，６０５号、及び第６，１７１，６４０号）、生体高分子（米国特許第ＵＳＲＥ３７，５４３号、第６，２２８，６２３号、及び第５，９５８，７４５号、及び第６，９４６，５８８号）、環境ストレス抵抗性（米国特許第６，０７２，１０３号）、医薬ペプチド及び分泌性ペプチド（米国特許第６，８１２，３７９号、第６，７７４，２８３号、第６，１４０，０７５号、及び第６，０８０，５６０号）、プロセシング形質の改善（米国特許第６，４７６，２９５号）、消化率の改善（米国特許第６，５３１，６４８号）、低いラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号）、工業用酵素産生（米国特許第５，５４３，５７６号）、風味の改善（米国特許第６，０１１，１９９号）、窒素固定（米国特許第５，２２９，１１４号）、ハイブリッド種子産生（米国特許第５，６８９，０４１号）、繊維産生（米国特許第６，５７６，８１８号、第６，２７１，４４３号、第５，９８１，８３４号、及び第５，８６９，７２０号）、ならびにバイオ燃料産生（米国特許第５，９９８，７００号）に関するものが挙げられる。
代替的に、農学的目的の遺伝子は、内在性遺伝子の遺伝子発現の標的化された調節を引き起こすＲＮＡ分子をコードすることにより、例えば、アンチセンス（例えば、米国特許第５，１０７，０６５号参照）、抑制性ＲＮＡ（「ＲＮＡｉ」、例えば、公開出願Ｕ．Ｓ．２００６／０２００８７８及びＵ．Ｓ．２００８／００６６２０６、ならびに米国特許出願第１１／９７４，４６９号に記載の通り、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、トランス作用性ｓｉＲＮＡ、及びフェーズｓＲＮＡが媒介する機構による遺伝子発現の調節を含む）により、または共抑制が媒介する機構により、上記の植物の特性または表現型に影響を及ぼし得る。また、ＲＮＡは、所望の内在性ｍＲＮＡ産物を切断するように操作された触媒ＲＮＡ分子（例えば、リボザイムまたはリボスイッチ、例えば、Ｕ．Ｓ．２００６／０２００８７８参照）であり得る。転写可能なＤＮＡ分子が、遺伝子抑制を引き起こし得る分子に転写されるような方法で、構築物を構築し細胞内に導入するための方法は、当技術分野で既知である。
選択マーカー
選択マーカー導入遺伝子もまた、本発明の調節エレメントとともに使用され得る。本明細書で使用される、「選択マーカー導入遺伝子」という用語は、トランスジェニック植物、組織、もしくは細胞における発現、または発現の欠如が何らかの方法でスクリーニングまたはスコア化され得る、任意の転写可能なＤＮＡ分子を指す。本発明の実施に使用するための選択マーカー遺伝子、ならびにそれらの関連する選択及びスクリーニング技術は、当技術分野で既知であり、これには、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、抗生物質抵抗性を付与するタンパク質、及び除草剤耐性を付与するタンパク質をコードする転写可能なＤＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。選択マーカー導入遺伝子の例は、配列番号２１として示される。
選択マーカー導入遺伝子もまた、本発明の調節エレメントとともに使用され得る。本明細書で使用される、「選択マーカー導入遺伝子」という用語は、トランスジェニック植物、組織、もしくは細胞における発現、または発現の欠如が何らかの方法でスクリーニングまたはスコア化され得る、任意の転写可能なＤＮＡ分子を指す。本発明の実施に使用するための選択マーカー遺伝子、ならびにそれらの関連する選択及びスクリーニング技術は、当技術分野で既知であり、これには、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、抗生物質抵抗性を付与するタンパク質、及び除草剤耐性を付与するタンパク質をコードする転写可能なＤＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。選択マーカー導入遺伝子の例は、配列番号２１として示される。
ゲノム編集
いくつかの実施形態は、部位特異的ゲノム改変酵素及び／またはゲノム改変を行うための任意の関連するタンパク質（複数可）をコードする異種ＤＮＡ配列に作動可能に連結された、配列番号１～２０のいずれかまたはその断片に対して少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列を含む発現カセット（複数可）を含む組換えＤＮＡ構築物に関する。これらのヌクレアーゼ発現カセット（複数可）は、鋳型編集用のドナー鋳型と同じ分子またはベクターに存在する（シス）場合もあれば、別の分子またはベクターに存在する（トランス）場合もある。ゲノムＤＮＡを改変する異なる配列特異的ゲノム改変酵素（またはタンパク質の複合体及び／またはガイドＲＮＡ）を含む編集用のいくつかの方法が当技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、部位特異的ゲノム改変酵素は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することまたは所望のゲノム部位もしくは遺伝子座に切れ目を誘導することによってゲノムを改変する。いくつかの実施形態では、該ゲノム改変酵素によって導入されるＤＳＢまたは切れ目を修復するプロセスで、ドナー鋳型ＤＮＡが該ＤＳＢまたは切れ目の部位で該ゲノムに統合され得る。いくつかの実施形態では、該ゲノム改変酵素によって導入されるＤＳＢまたは切れ目を修復するプロセスで、挿入または欠失変異（インデル）が該ゲノムに導入され得る。いくつかの実施形態では、部位特異的ゲノム改変酵素は、シチジンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ゲノム改変酵素は、アデニンデアミナーゼを含む。本開示では、部位特異的ゲノム改変酵素には、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、デアミナーゼ、ヘリカーゼ、逆転写酵素及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態は、部位特異的ゲノム改変酵素及び／またはゲノム改変を行うための任意の関連するタンパク質（複数可）をコードする異種ＤＮＡ配列に作動可能に連結された、配列番号１～２０のいずれかまたはその断片に対して少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列を含む発現カセット（複数可）を含む組換えＤＮＡ構築物に関する。これらのヌクレアーゼ発現カセット（複数可）は、鋳型編集用のドナー鋳型と同じ分子またはベクターに存在する（シス）場合もあれば、別の分子またはベクターに存在する（トランス）場合もある。ゲノムＤＮＡを改変する異なる配列特異的ゲノム改変酵素（またはタンパク質の複合体及び／またはガイドＲＮＡ）を含む編集用のいくつかの方法が当技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、部位特異的ゲノム改変酵素は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することまたは所望のゲノム部位もしくは遺伝子座に切れ目を誘導することによってゲノムを改変する。いくつかの実施形態では、該ゲノム改変酵素によって導入されるＤＳＢまたは切れ目を修復するプロセスで、ドナー鋳型ＤＮＡが該ＤＳＢまたは切れ目の部位で該ゲノムに統合され得る。いくつかの実施形態では、該ゲノム改変酵素によって導入されるＤＳＢまたは切れ目を修復するプロセスで、挿入または欠失変異（インデル）が該ゲノムに導入され得る。いくつかの実施形態では、部位特異的ゲノム改変酵素は、シチジンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ゲノム改変酵素は、アデニンデアミナーゼを含む。本開示では、部位特異的ゲノム改変酵素には、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、デアミナーゼ、ヘリカーゼ、逆転写酵素及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態は、ゲノム編集システムの１つ以上の構成要素をコードする異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントに関する。ゲノム編集システムを使用して、宿主細胞のゲノムに１つ以上の挿入、欠失、置換、塩基修飾、転座、または逆位を導入してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、ジンクフィンガータンパク質、または転写活性化因子（ＴＡＬ）タンパク質等の配列特異的ＤＮＡ結合ドメインをコードする異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、該配列特異的ＤＮＡ結合ドメインは、融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードする異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムから選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、ガイドＲＮＡをコードする異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される。本明細書で使用される、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」とは、標的ＤＮＡ配列を認識し、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を標的ＤＮＡ配列に向ける、または「ガイドする」ＲＮＡを指す。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡに相補的な領域（ｃｒＲＮＡと呼ばれる）及びＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合する領域（ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる）で構成される。ガイドＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）の場合もあれば、２つの別々のＲＮＡ分子（２ピースｇＲＮＡ）の場合もある。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、逆転写酵素のためのＲＮＡ鋳型（ｐｅｇＲＮＡ）をさらに含み得る。
いくつかの実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集システムの１つ以上の構成要素をコードする異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントに関する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質の例としては、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃ２ｃ１０、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１とも呼ばれる）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３”、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２とも呼ばれる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４（ｄｉｎＧ）、Ｃｓｆ５、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、ならびにＣａｓ１４ｃエフェクタータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、そのヌクレアーゼ活性部位（例えば、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ、例えば、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼドメインのＲｕｖＣ部位、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインのＲｕｖＣ部位及び／またはＨＮＨ部位）に変異を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質に作動可能に連結される。ヌクレアーゼ活性部位に変異を有し、ひいてはヌクレアーゼ活性をもはや含まないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、一般に「ｄｅａｄ」、例えば、ｄＣａｓと呼ばれる。いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼ活性部位に変異を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質ドメインまたはポリペプチドは、該変異を含まない同じＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質と比較して、活性が損なわれている場合もあれば、活性が低下している場合もある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、そのヌクレアーゼ活性部位に変異を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質に作動可能に連結され、逆転写酵素に作動可能に連結されたニッカーゼ活性を生じる。
細胞形質転換
本発明はまた、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメントを含む、形質転換細胞及び植物を生産する方法に関する。
本発明はまた、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメントを含む、形質転換細胞及び植物を生産する方法に関する。
「形質転換」という用語は、レシピエント宿主へのＤＮＡ分子の導入を指す。本明細書で使用される、「宿主」という用語は、任意の細胞、組織、器官を含む細菌、真菌、もしくは植物、または該細菌、真菌、もしくは植物の後代を指す。特に重要な植物組織及び細胞としては、プロトプラスト、カルス、根、塊茎、種子、茎、葉、実生、胚、及び花粉が挙げられる。
本明細書で使用される、「形質転換された」という用語は、外来ＤＮＡ分子、例えば、構築物が導入された細胞、組織、器官、または生物を指す。導入されたＤＮＡ分子をレシピエント細胞、組織、器官、または生物のゲノムＤＮＡに統合し、導入されたＤＮＡ分子が次の後代に受け継がれるようにしてもよい。「トランスジェニック」または「形質転換された」細胞または生物にはまた、細胞または生物の後代、及び交配でかかるトランスジェニック生物を親として用いた育種プログラムから生産され、外来ＤＮＡ分子の存在からもたらされる変化した表現型を示す後代も含まれ得る。また、導入されたＤＮＡ分子が次の後代に受け継がれないように、導入されたＤＮＡ分子をレシピエント細胞に一過性に導入してもよい。「トランスジェニック」という用語は、１つ以上の異種ＤＮＡ分子を含む細菌、真菌、または植物を指す。
ＤＮＡ分子を植物細胞に導入するための、当業者に周知の方法が多数存在する。該プロセスは、一般に、好適な宿主細胞を選択するステップ、該宿主細胞をベクターで形質転換するステップ、及び形質転換された宿主細胞を得るステップを含む。本発明の実施において植物構築物を植物ゲノムに導入することによって植物細胞を形質転換するための方法及び材料には、周知の実証された方法のいずれかが含まれ得る。好適な方法としては、限定されるものではないが、中でも細菌感染（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バイナリＢＡＣベクター、ＤＮＡの直接送達（例えば、ＰＥＧ媒介の形質転換、乾燥／阻害媒介のＤＮＡ取込み、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維による撹拌、及びＤＮＡコーティング粒子の加速）、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）が挙げられる。
宿主細胞は、任意の細胞または生物、例えば、植物細胞、藻類細胞、藻類、真菌細胞、真菌、細菌細胞、または昆虫細胞でよい。特定の実施形態では、該宿主細胞及び形質転換細胞には、作物植物からの細胞が含まれ得る。
トランスジェニック植物は、その後、本発明のトランスジェニック植物細胞から再生され得る。従来の育種技術または自家受粉を使用して、このトランスジェニック植物から種子を生産してもよい。かかる種子、及びかかる種子から成長した結果として生じる後代植物は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むため、トランスジェニックになる。
本発明のトランスジェニック植物を自家受粉させ、（組換えＤＮＡ分子に対してホモ接合性の）本発明のホモ接合性トランスジェニック植物の種子を提供することもできれば、非トランスジェニック植物または異なるトランスジェニック植物と交配して、（組換えＤＮＡ分子に対しヘテロ接合性の）本発明のヘテロ接合性トランスジェニック植物の種子を提供することもできる。かかるホモ接合性及びヘテロ接合性のトランスジェニック植物は両方とも、本明細書では「後代植物」と呼ばれる。後代植物は、元のトランスジェニック植物の系統を引き、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物である。本発明のトランスジェニック植物を使用して生産された種子を収穫し、これを使用して、本発明の構築物を含みかつ農学的目的の遺伝子を発現するトランスジェニック植物、すなわち、本発明の後代植物の世代を成長させることができる。異なる作物に一般的に使用される育種方法の説明は、いくつかある参考図書のうちの１つに見出すことができる。例えば、Ａｌｌａｒｄ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｕ．ｏｆ ＣＡ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ，５０－９８（１９６０）、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，３６９－３９９（１９７９）、Ｓｎｅｅｐ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅｎ，Ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ（ｅｄ），Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ（１９７９）、Ｆｅｈｒ，Ｓｏｙｂｅａｎｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ，１６：２４９（１９８７）、Ｆｅｈｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｖａｒｉｅｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，（Ｖｏｌ．１）及びＣｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｏｙｂｅａｎ（Ｖｏｌ．２），Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ＮＹ，３６０－３７６（１９８７）を参照されたい。
形質転換植物は、目的の遺伝子（複数可）の存在、ならびに本発明の調節エレメントによって付与される発現レベル及び／またはプロファイルについて解析され得る。当業者には、形質転換植物の解析に利用可能な多数の方法が認識される。例えば、植物解析のための方法としては、サザンブロットまたはノーザンブロット、ＰＣＲベースのアプローチ、生化学的解析、表現型スクリーニング法、圃場評価、及び免疫診断アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。転写可能なＤＮＡ分子の発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の試薬及び該製造業者が説明する方法ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘを使用して決定されるＰＣＲサイクルタイムを使用して測定され得る。代替的に、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の試薬及び該製造業者が説明する方法を使用して、導入遺伝子の発現を評価することができる。
本発明はまた、本発明の植物部位も提供する。植物部位としては、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、及び花粉が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の植物部位は、生存能力がある、生存能力がない、再生可能である、及び／または再生可能ではない場合がある。本発明はまた、本発明のＤＮＡ分子を含む形質転換植物細胞も含み、これを提供する。本発明の形質転換されたまたはトランスジェニック植物細胞には、再生可能な及び／または再生可能ではない植物細胞が含まれる。
本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその部位から生産される商品生産物も提供する。本発明の商品生産物は、配列番号１～２０からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む検出可能量のＤＮＡを含む。本明細書で使用される、「商品生産物」とは、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物、種子、植物細胞、または植物部位に由来する材料で構成される任意の組成物または生産物を指す。商品生産物には、加工種子、穀物、植物部位、及び粗粉が含まれるが、これらに限定されない。本発明の商品生産物は、本発明の組換えＤＮＡ分子に対応する検出可能量のＤＮＡを含む。試料中でのこのＤＮＡのうちの１つ以上の検出を使用して、商品生産物の含量または供給源を特定してもよい。本明細書に開示する検出方法を含め、任意の標準的なＤＮＡ分子の検出方法が使用され得る。
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解される可能性がある。該実施例は、明記されない限り、例示として示されるものであり、本発明を限定するとは意図されていない。当業者には、以下の実施例に開示する技術が、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技術を代表するものであることを理解されたい。しかしながら、当業者には、本開示に照らして、開示される特定の実施形態に多くの変更を行ってもよく、それでもなお、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、類似のまたは同様の結果が得られることが理解されるはずであり、そのため、説明されたまたは示された全ての内容は例示的なものとして解釈されるものとし、限定的な意味に解釈されないものとする。
実施例１
調節エレメントの同定及びクローニング
本実施例では、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する調節発現エレメントの同定、合成、及びクローニングについて記載する。
調節エレメントの同定及びクローニング
本実施例では、Ｚｅａ ｍａｙｓに由来する調節発現エレメントの同定、合成、及びクローニングについて記載する。
花粉で優先的に発現する遺伝子は、公的及び独自のトランスクリプトームデータを使用して同定した。各遺伝子座を生物情報学的に調べ、対応する遺伝子プロモーター、リーダー、イントロン、及び３’ＵＴＲを同定した。同定されたＥＸＰ、プロモーター／リーダー、イントロン、及び３’ＵＴＲを以下の表１に示す。
同定されたＥＸＰ、プロモーター／リーダー、及び３’ＵＴＲを、当技術分野で既知の方法を使用して合成し、以下の実施例２に記載の通り、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）発現を駆動するために使用される発現カセットにて、バイナリ植物形質転換ベクター構築物にクローニングし、安定に形質転換されたトウモロコシ植物におけるそれらの活性を評価した。
実施例２
安定に形質転換されたトウモロコシ植物におけるＧＵＳ発現を駆動する調節エレメントの解析
トウモロコシ植物をベクターで、具体的には、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験調節エレメントを含む植物発現ベクターで形質転換した。得られた植物をＧＵＳタンパク質発現について解析し、選択された調節エレメントが発現に及ぼす効果を評価した。
安定に形質転換されたトウモロコシ植物におけるＧＵＳ発現を駆動する調節エレメントの解析
トウモロコシ植物をベクターで、具体的には、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験調節エレメントを含む植物発現ベクターで形質転換した。得られた植物をＧＵＳタンパク質発現について解析し、選択された調節エレメントが発現に及ぼす効果を評価した。
トウモロコシ植物を、植物ＧＵＳ発現構築物で形質転換した。当技術分野で既知の標準的な方法を用いて、調節エレメントをベース植物発現ベクターにクローニングした。得られた植物発現ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの左側の境界領域（Ｂ－ＡＧＲｔｕ．ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒ）、除草剤グリホサートに対する抵抗性を付与する形質転換植物細胞の選択に使用される第一の導入遺伝子選択カセット、プロモーター及びリーダーで構成され、任意に、ある特定のベクター設計ではイントロンに対して５’に作動可能に連結され、プロセシング可能なイントロンで構成されるＧＵＳのコード配列に作動可能に連結され、３’ＵＴＲに作動可能に連結される調節エレメントの活性を評価するための第二の導入遺伝子カセット（配列番号２１）、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの右側の境界領域（Ｂ－ＡＧＲｔｕ．ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒ）を含んでいた。
各構築物のＧＵＳ発現カセットの発現エレメントの構成を表２に示す。構築物１～構築物５は、作動可能に連結されたネイティブプロモーター及びリーダー（「Ｐ－」で示す）または作動可能に連結されたネイティブプロモーター、リーダー、及びイントロン（「ＥＸＰ－」で示す）で構成されるＧＵＳ発現カセットを含む。構築物１及び構築物２のＧＵＳ発現カセットは、イントロンを含まない。構築物１～構築物５及び構築物８は、同じ遺伝子座のプロモーター／リーダーまたはプロモーター／リーダー／イントロンのネイティブ３’ＵＴＲを含む。構築物６及び構築物７では、ネイティブプロモーター及びリーダー（「Ｐ－」で示す）は、植物で発現可能な、ネイティブ遺伝子の一部ではないイントロン及び３’ＵＴＲに作動可能に連結された。構築物８もまた、植物で発現可能な、ネイティブ遺伝子の一部ではないイントロンを含む。
トウモロコシ植物細胞を、当技術分野で周知の通り、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介の形質転換により、上記のバイナリ形質転換ベクター構築物を用いて形質転換した。得られた形質転換植物細胞を、全トウモロコシ植物を形成するように誘導した。
定性的及び定量的ＧＵＳ解析を使用して、形質転換植物の選択された植物器官及び組織での発現エレメントの活性を評価した。組織化学的染色によるＧＵＳ発現の定性的解析のために、全載または切片組織を、１ｍｇ／ｍＬのＸ－Ｇｌｕｃ（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－ｂ－グルクロニド）を含むＧＵＳ染色液とともに３７℃で５時間インキュベートし、３５％ＥｔＯＨ及び５０％酢酸で脱色した。解剖顕微鏡または複合顕微鏡下で、選択された植物器官または組織の青色呈色に関する目視検査によって、ＧＵＳの発現を定性的に特定した。
酵素アッセイによるＧＵＳ発現の定量的解析については、形質転換されたトウモロコシ植物の選択された組織から全タンパク質を抽出した。１～２マイクログラムの全タンパク質を、５０マイクロリットルの総反応体積中１ｍＭ濃度の蛍光性基質である４－メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｅｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）－β－Ｄ－グルクロニド（ＭＵＧ）とともにインキュベートした。３７℃で１時間のインキュベーション後、３５０マイクロリットルの２００ｍＭ重炭酸ナトリウム溶液を添加することによって反応を停止させた。反応生成物である４－メチルウンベリフェロン（ｍｅｔｈｌｙｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）（４－ＭＵ）は、高ｐＨで最大限に蛍光性であり、ヒドロキシル基はイオン化されている。塩基性の炭酸ナトリウム溶液の添加により、アッセイを停止させると同時に、蛍光生成物４－ＭＵの定量のためにｐＨを調整する。生じた４－ＭＵの量を、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）（励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ）を使用してその蛍光を測定することによって推定した。ＧＵＳ活性値は、ナノモル単位の４－ＭＵ／時間／ｍｇ全タンパク質で示される。
以下の組織を、Ｒ０世代におけるＧＵＳ発現のためにサンプリングした：Ｖ４ステージの葉及び根、Ｖ７ステージの葉及び根、ＶＴステージの葉、花／葯、及び花粉、Ｒ１ステージの穂軸／毛、ならびに受粉から（ＤＡＰ）２１日後のＲ３ステージの種子胚及び種子胚乳。
表３及び４は、サンプリングされた組織の平均定量的ＧＵＳ発現を示し、ここで、「ｂｄｌ」は、検出レベルを下回っていることを示し、「ＮＡ」はアッセイされていないことを示す。ＶＴステージの花／葯及び花粉、ならびにＲ１ステージの穂軸／毛に関するＧＵＳ発現の範囲もまた表４にも示す。
表３及び４に示すように、これら構築物の各々におけるＧＵＳ発現カセットの多くは、構築物６及び構築物７を除いて、ＶＴの花／葯及び／または花粉でより高い発現を示した。構築物６に関しては、ＶＴの葯、ならびに２１ＤＡＰの胚及び胚乳で高発現が定量的に測定された。構築物７の場合、ＧＵＳの高発現がＶＴの葯及びＲ１の穂軸／毛で定量的に測定された。構築物８の場合、ＶＴの葯の発現は、構築物６及び構築物７と比較して低かった。ＶＴの花粉のＧＵＳ発現は、構築物６、構築物７、及び構築物８に関しては定量的に測定されなかった。構築物１及び構築物２は、ＶＴの花粉で高ＧＵＳ発現を示し、他の組織より、ＶＴの花／葯でＧＵＳ発現が高かった。
また、これらの形質転換事象から選択された組織を顕微鏡観察し、組織のＧＵＳ染色で観察された定性的発現の側面を特定した。以下の表５に、これらの組織で行った観察を要約する。
表５に示すように、構築物１～構築物５のＧＵＳ発現は、主にＶＴの花粉で観察されたため、定量的に測定した場合、ＶＴの花／葯でより高い発現を示した。従って、構築物１～構築物５のＧＵＳ発現カセットにおける発現エレメントは、「花粉優先」発現エレメントである。構築物６及び構築物７からのＧＵＳ発現に関しては、ＧＵＳ発現は、ＶＴの花粉だけでなく、Ｖ７の葉及び根の細胞等の他の組織でも観察された。興味深いことに、構築物７からのＧＵＳ発現は、Ｒ１の毛でも見られた。構築物８の場合、ＶＴの花粉の染色、ならびにＶ４の根端及ならびにＲ３の２１ＤＡＰの胚及び胚乳組織の染色も明確に視認された。
従って、構築物１～構築物５のＧＵＳ発現カセットに含まれる発現エレメントは、花粉優先発現パターンを示す。構築物６、構築物７及び構築物８のＧＵＳ発現カセットに含まれる発現エレメントは、花粉での発現を示しながら、安定に形質転換されたトウモロコシ植物の他の組織でも発現する。
本発明の原理を例示及び説明してきたが、当業者には、かかる原理から逸脱することなく、本発明の配置及び詳細が変更され得ることが明らかであるはずである。本発明者らは、特許請求の範囲の趣旨及び範囲内にある全ての変更形態を特許請求する。本明細書で引用される全ての刊行物及び公開された特許文献は、個々の刊行物または特許出願の各々が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたものと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (17)
- （ａ）配列番号１～２０のいずれかに対して少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列、
（ｂ）配列番号１～２０のいずれかを含む配列、及び
（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１～２０のいずれかの断片
からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子であって、
前記配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される、前記組換えＤＮＡ分子。 - 前記配列が、配列番号１～２０のいずれかのＤＮＡ配列に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
- 前記配列が、配列番号１～２０のいずれかのＤＮＡ配列に対して少なくとも９５パーセントの配列同一性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
- 前記ＤＮＡ配列が、遺伝子調節活性を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
- 前記異種の転写可能なＤＮＡ分子が、農学的目的の遺伝子を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
- 前記農学的目的の遺伝子が、植物に除草剤耐性を付与する、請求項５に記載の組換えＤＮＡ分子。
- 前記農学的目的の遺伝子が、植物に害虫抵抗性を付与する、請求項５に記載の組換えＤＮＡ分子。
- 前記異種の転写可能なＤＮＡ分子が、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡをコードする、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
- （ａ）配列番号１～２０のいずれかに対して少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列、
（ｂ）配列番号１～２０のいずれかを含む配列、及び
（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１～２０のいずれかの断片
からなる群から選択される配列を含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞であって、
前記配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される、前記トランスジェニック植物細胞。 - 単子葉植物細胞である、請求項９に記載のトランスジェニック植物細胞。
- 双子葉植物細胞である、請求項９に記載のトランスジェニック植物細胞。
- 請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物またはその部位。
- 前記組換えＤＮＡ分子を含む、請求項１２に記載のトランスジェニック植物の後代植物、またはその部位。
- 請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック種子。
- 商品生産物を生産する方法であって、請求項１２に記載のトランスジェニック植物またはその部位を得ること、及びそこから前記商品生産物を生産することを含む、前記方法。
- 前記商品生産物が、種子、加工種子、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、デンプン、穀物、植物部位、種子油、バイオマス、細粉、及び粗粉である、請求項１５に記載の方法。
- 転写可能なＤＮＡ分子を発現させる方法であって、請求項１２に記載のトランスジェニック植物を得ること、及び前記植物を栽培することを含み、そこで、前記転写可能なＤＮＡが発現される、前記方法。
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