CN109486818B - 狗尾草u6启动子基因及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了2种狗尾草U6启动子及应用，该2种启动子序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，通过GUS染色瞬时表达验证，能高效的在狗尾草上表达。在转基因技术领域，这些启动子不仅适用于狗尾草，除用于启动功能基因表达外，在构建RNAi表达载体时可用于启动发夹结构的表达，在CRISPR/Cas9系统中可用于启动sgRNA引导序列的表达等。

Description

狗尾草U6启动子基因及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及植物转基因技术领域，具体涉及狗尾草U6启动子基因的克隆和应用。
背景技术
狗尾草(Setaria viridis)是谷子(Setaria italica)的野生近缘种，属单子叶植物纲禾本科黍亚科，黍亚科常分布在热带和亚热带地区，高粱、甘蔗、玉米、谷子、薏苡、黄茅、白茅等都属于黍亚科，该科植物具有热带植物的典型特征。是研究C4光合作用的优秀模型，同时也是研究单子叶植物、非生物胁迫耐受性和能源植物的模型。它具有许多适于遗传分析的特性，如二倍体、有相对较小的基因组(～510Mb)、身材矮小、生长周期短和种子量大等。目前狗尾草作为新型模式植物的研究在国内外越来越热门，但还没有人克隆并应用狗尾草本身的U6启动子开展转基因技术研究。
U6启动子是二型启动子，与真核生物RNA聚合酶III结合后，负责转录U6RNA，这类启动子的特点是几乎所有启动子元件(除了+1位的转录起点)都位于转录起始位点的上游，也即它对转录起点后的序列无特殊选择或要求，能保证转录序列的结构特征。U6启动子+1位是鸟苷酸。RNA聚合酶III启动子识别的终止信号是连续4-5个胸苷酸，转录产物末端一般有4个尿苷酸。几乎所有的真核生物都具有U6启动子，U6启动子在真核生物体内一般发现是启动小片段，不带PolyA尾的序列，由RNA聚合酶III聚合U6启动子转录产生shRNA，经剪切后产生成熟siRNA，产生干扰效果；shRNA的表达量取决于启动子的强弱，与同类的RNA聚合酶III的启动子H1相比，U6启动子启动能力更强，表达时间也长。
目前，在转基因技术领域，U6启动子多用在构建RNAi表达载体上，用于启动干扰发夹结构的表达；此外，随着基因编辑技术的兴起，U6启动子也被开始广泛用于CRISPR/Cas9系统中sgRNA引导序列的启动表达，以保证引导序列的结构特征。U6启动子具有种属特异性，在转基因技术中，使用转化物种本身或接近物种的U6启动子能取得更高的的启动效率。前人研究表明，人U6启动子有几个明显的特点：1、具有TATA box，位于-30～-25bp，被PolIII转录；2、在转录起点上游-66～-47bp处存在PSE(proximal sequence element)，该元件是snRNA激活因子蛋白复合物的结合位点；3、在-244～-214存在DSE(distal sequenceelement)；4、启动子下游存在5'-TTTT-3'序列为Pol III提供转录终止信号；5、PSE和DSE之间的距离变化可显著影响转录效率；6、+1位的G对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用U6启动子构建RNAi表达载体时，U6启动子的长度最好在300bp左右，尽量不改变PSE和DSE的间距，同时保留TATA box和+1位的G，在下游应有5'-TTTTT-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。
发明内容
本发明的目的是提供了狗尾草U6启动子基因，克隆了2个狗尾草U6启动子，并将这2个启动子与GUS基因融合表达转化狗尾草胚性愈伤，通过瞬时表达验证了2个启动子能够在狗尾草上高效表达，为狗尾草及相近植物的转化研究提供了高效的启动子序列。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供狗尾草U6启动子基因，包括2种狗尾草U6启动子基因，分别具有序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
该2种启动子基因序列还包括含有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示基因序列的其它序列。
启动子序列分别来自于狗尾草Chr_02、Chr_04染色体。
本发明的另一目的在于提供狗尾草U6启动子基因在转基因技术领域中的应用。
本发明利用snRNA序列在真核生物体内非常保守的序列特征，用拟南芥AtU6启动子的snRNA序列与狗尾草的基因组(Setaria viridis v1.1)序列进行比对，通过比对序列结果设计多对引物，PCR克隆出狗尾草的2个U6启动子，并构建与GUS基因融合表达载体转化狗尾草胚性愈伤，GUS染色瞬时表达验证表明，克隆出的2个狗尾草U6启动子在狗尾草上具有很强的启动效率，能在狗尾草上很好的启动GUS基因的表达。狗尾草是新型的模式植物，对植物生物技术的研究越来越重要，狗尾草U6启动子的克隆和应用，必将推进这些植物相关技术领域的研究，具有重要的现实意义。
附图说明
图1：狗尾草U6基因与拟南芥U6基因的盒式位置比对图；
图2：狗尾草U6启动子退火温度50～55℃时的PCR结果图(注：每对引物从左到右退火温度从55℃到50℃)；
图3：狗尾草U6启动子退火温度55～60℃时的PCR结果(注：每对引物从左到右退火温度从60℃到55℃)；
图4：从狗尾草Q、S序列上PCR出构建GUS融合表达载体具有粘性末端的2个U6启动子序列图；
图5：是用于转化的pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)质粒载体图；
图6：是用于转化的pSeU6Q-GUS(SeU6Q-HPH)质粒载体图；
图7：是用于转化的pSeU6S-GUS(SeU6S-HPH)质粒载体图；
图8：狗尾草胚性愈伤GUS基因瞬时表达情况图。Ubi是对照载体pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)载体，S是pSeU6S-GUS(SeU6S-HPH)载体，Q是pSeU6Q-GUS(SeU6Q-HPH)载体，CK是不经转化的愈伤，为空白对照。
图9：pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)、pSeU6Q-GUS(SeU6Q-HPH)、pSeU6S-GUS(SeU6S-HPH)载体转化狗尾草胚性愈伤后不同启动子GUS瞬时表达差异性分析。Q是pSeU6Q-GUS(SeU6Q-HPH)载体染色情况，S是pSeU6S-GUS(SeU6S-HPH)载体染色情况，UBI是pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)载体染色情况，从分析可知，以农杆菌AGL1进行转化，Q、S与对照UBI启动子启动能力差异不显著。
具体实施方式
1、利用U6启动子snRNA序列的保守性，在https://phytozome.jgi.doe.gov网站上，利用拟南芥AtU6启动子的snRNA序列(gtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcataaatcgagaaatggtccaaatttt)与狗尾草的基因组(Setaria viridis v1.1)序列进行比对(BLAST)。检查比对结果，从中挑选出序列同源性大于95％的位置(Chr_02、Chr_04、Chr_06、Chr_08、Chr_09)，下载这些位置的序列信息，并在http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi#！网站上对挑选出的序列进行BOXSHADE(盒式)序列分析比对，找到这些启动序列的USE位置和TATA框位置(图1)。
2、狗尾草U6启动子的PCR克隆：在下载的U6启动序列USE和TATA框位置前寻找和设计引物，引物设计参考http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/网站，尽量选择能区别克隆目标启动序列的引物对。然后以狗尾草A10品系DNA为模版，PCR克隆目标启动序列，PCR后跑胶观察，回收通过PCR克隆出的目标条带进行测序比对。克隆启动子序列的位置、引物对及序列大小(见表1)。PCR试剂购于BBI生命科学有限公司，反应条件：95℃5min，94℃30s，退火设计50～55℃和55～60℃两个温度梯度45s，72℃1min 32循环，72℃5min，4℃保存。最后能克隆出启动子序列，测序后符合预期启动序列的启动子序列分别位于Chr_02、Chr_04染色体上(图2、3)，分别命名为Q、S，Q最佳反应温度为60℃，S最佳反应温度为53℃。
表1从狗尾草A10品系克隆U6启动子的PCR引物
注：Reverse代表正向序列，Forward代表反向序列。
Figure BDA0001865212700000041
Figure BDA0001865212700000051
3、狗尾草U6启动子与GUS基因融合植物表达载体构建：以带GUS基因的pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)质粒(见图4)为骨架质粒(HygR植物筛选基因，KanR菌落筛选基因)，质粒由美国Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P.Brutnell实验室提供；以表1克隆的SETARIA 02_R(Q)和SETARIA 04-R(S)U6启动子序列为模版，设计带骨架质粒GUS基因启动子粘性末端的引物对(见表2)PCR克隆目标启动子序列(图4)，通过酶切连接将质粒GUS基因前的ZmUbi启动子替换为克隆的狗尾草U6启动子，构建狗尾草U6启动子与GUS基因融合植物表达载体。融合植物表达载体通过DNA测序检测目标启动序列构建情况。PCR使用东盛生物的HSTM mix，反应条件：94℃3min，94℃30s，50℃30S，72℃1min，34循环，72℃5min，4℃保存。
表2从ETARIA 02_Reverse(Q)和SETARIA 04-Reverse U6(S)启动子克隆产物PCR目标启动子序列到GUS基因融合植物表达载体上的引物对
Figure BDA0001865212700000052
4、狗尾草U6启动子农杆菌转化验证：将对照质粒pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)(图5)，狗尾草U6启动子与GUS基因融合植物表达载体pSeU6Q-GUS(SeU6Q-HPH)(图6)，pSeU6S-GUS(SeU6S-HPH)(图7)，转化到农杆菌AGL 1菌株，以狗尾草成熟种子诱导的胚性愈伤为转化外植体材料，进行农杆菌转化，共培养5天后取出胚性愈伤进行GUS染色观察，从GUS基因的GUS染色表达情况评估克隆的U6启动子的启动能力和表达活性。GUS染色液按照常规方法配制X-Gluc母液和X-Gluc基液，然后按比例混合后储存于4℃冰箱备用，取用于检测的组织块，加入GUS染色液中37℃过夜染色，倒掉染色液，70％酒精脱色1～3次，95％的酒精脱色1～2次，观察GUS染色情况(见图8)。最后收集胚性愈伤在体视显微镜下观察拍照。同时，取同等重量的每种愈伤GUS染液的蓝色上清液在620nm波长(蓝色上清液的最大吸收波长)处测定光吸收值(见表3)。数据、图标处理在Excel 2010下进行，通过Sigma Plot 10.0软件对数据进行统计分析、差异显著性检验和相关性分析。从分析结果可知，以农杆菌AGL 1进行转化，目标载体启动子Q、S与对照Ubi启动子启动能力差异不显著(图9)。
表3 pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)、pSeU6Q-GUS(SeU6Q-HPH)、pSeU6S-GUS(SeU6S-HPH)载体转化番木瓜胚性愈伤后GUS瞬时表达染色液OD620测定
重复1 重复2 重复3 平均值
Ubi 2.075 2.336 2.376 2.262
Q 2.087 2.113 2.350 2.183
S 1.996 2.372 2.530 2.299
备注：Q是pSeU6Q-GUS(SeU6Q-HPH)载体染色情况，S是pSeU6S-GUS(SeU6S-HPH)
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 狗尾草U6启动子基因及应用
<160> 2
<210> 1
<211> 414
<212> DNA
<213> 狗尾草（Setaria viridis）的U6启动子基因序列
<400> 1
CCCGTGGTCT ACAAGAATCT GAATGCAAAA CATGCCATAT CTCTGACACG GATTGAATTC 60
ACGTAGTGAT TGGTCTGTTC TATCGTGTCT GAACTCCCCA TTCATGAATG AAATTGTTAA 120
AGTTTTTCTA CTTACAGTCT GTGTGCATCA AAGAAAGATT TCACGTACTT TATTTGCGCT 180
TTGGAAAGCA TGATCGCGTA GTTGCAAAAA ATCCCTCGCA GAAAAGAAAA AAAAAGCCAC 240
GGAGAAGTAC GGGCCATGGC CCAATACGAA GTACCGCGCA GCCCATGTCT ATCGGTGGGG 300
ATGGGAGAAC TGGCGGGCTC AACGACGCGG GGCAACAAGC CGAAGAATTA GTCCCACCTC 360
GGCTGCTCAC AAAGCGAAAG CACAGCTTAT AAACCGAGGC GCTAGCACCG GGTT 414
<210> 2
<211> 204
<212> DNA
<213> 狗尾草（Setaria viridis）的U6启动子基因序列
<400> 2
GCCCACATCC CACATGACTC CGCCGAACCG GGCCGTTGAG GGAGAATCGG CCCACGTGCT 60
GGCTTCCGCT GGGCCTCCCG TGCGCTGCGG GTCTGCGGGT GTGGGGAGTT GGGACGAGAA 120
CAACAGGCTC GGAAGTTTAG TACCACATCG CCAGATTAGT AGCGCGTAGA CCAGCTTATA 180
TACGCGGAGC TCCACCCTCG TTCT 204

Claims (3)

1.狗尾草U6启动子基因，其特征在于：包括2种狗尾草U6启动子基因，分别为序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的狗尾草U6启动子基因，其特征在于：启动子序列分别来自于狗尾草Chr_02、Chr_04染色体。
3.如权利要求1所述的狗尾草U6启动子基因在转基因技术领域中的应用。
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