CN109306352B - 番木瓜u6启动子基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两种番木瓜U6启动子及应用，该两种启动子序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，通过GUS染色瞬时表达验证，能高效的在番木瓜上表达。在转基因技术领域，这些启动子不仅适用于番木瓜，用于启动功能基因表达，更可在植物转化时启动RNAi发夹结构，在CRISPR/Cas9系统中启动sgRNA引导序列等特殊结构的表达等。

Description

番木瓜U6启动子基因及应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及植物转基因技术领域，具体涉及番木瓜U6启动子基因的克隆和应用。

背景技术

U6启动子是二型启动子，与真核生物RNA聚合酶III结合后，负责转录U6RNA，这类启动子的特点是几乎所有启动子元件(除了+1位的转录起点)都位于转录起始位点的上游，也即它对转录起点后的序列无特殊选择或要求，能保证转录序列的结构特征。U6启动子+1位是鸟苷酸。RNA聚合酶III启动子识别的终止信号是连续4-5个胸苷酸，转录产物末端一般有4个尿苷酸。几乎所有的真核生物都具有U6启动子，U6启动子在真核生物体内一般发现是启动小片段，不带PolyA尾的序列，由RNA聚合酶III聚合U6启动子转录产生shRNA,经剪切后产生成熟siRNA，产生干扰效果；shRNA的表达量取决于启动子的强弱，与同类的RNA聚合酶III的启动子H1相比，U6启动子启动能力更强，表达时间也长。

目前，在转基因技术领域，U6启动子多用在构建RNAi表达载体上，用于启动干扰发夹结构的表达；此外，随着基因编辑技术的兴起，U6启动子也被开始广泛用于CRISPR/Cas9系统中sgRNA引导序列的启动表达，以保证引导序列的结构特征。U6启动子具有种属特异性，在转基因技术中，使用转化物种本身或接近物种的U6启动子能取得更高的的启动效率。

前人研究表明，人U6启动子有几个明显的特点：1、具有TATA box，位于-30～-25bp，被Pol III转录；2、在转录起点上游-66～-47bp处存在近端序列元素PSE(proximalsequence element)，该元件是snRNA激活因子蛋白复合物的结合位点；3、在-244～-214存在远端序列元素DSE(distal sequence element)；4、启动子下游存在5'-TTTT-3'序列为Pol III提供转录终止信号；5、PSE和DSE之间的距离变化可显著影响转录效率；6、+1位的G对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用U6启动子构建RNAi表达载体时，U6启动子的长度最好在300bp左右，尽量不改变PSE和DSE的间距，同时保留TATA box和+1位的G，在下游应有5'-TTTTT-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。

番木瓜(Carica papaya)是中国和其它世界热带地区最重要的消费和出口热带水果之一，被世界卫生组织列为最有营养价值的十大水果之首。目前是世界上产量增幅最大的热带水果，年增长率达4％，已成为第四大热带、亚热带畅销水果。以PRSV和番木瓜畸叶嵌纹病毒(Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)为代表的RNA病毒是番木瓜生产上的最大限制因子，不抗病的品种几乎绝产，在物理和化学防治措施效果不佳与抗性品种缺乏的情况下，现代生物技术方法被大量引入PRSV的防治工作。1998年抗PRSV转基因番木瓜彩虹(Rainbow)和日升(Sunup)品种开始商业化应用，这代表第一次实际应用的转基因水果作物。番木瓜起源于南墨西哥和中美洲，属番木瓜科(Caricaceae)，番木瓜属(Caricapapaya L.)，番木瓜科分为6个属35种(Ray et al.,2014)，番木瓜属中没有找到抗病种质，几种野生型番木瓜比如C.cauliflora,C.pubescens，C.quercifolia对PRSV有抗性，但它们与Carica papaya杂交不亲和。目前，实际利用的番木瓜抗病毒基因多数是来自病毒本身的基因，抗病策略主要利用RNAi干扰的原理，U6启动子能很高效的启动转基因株系的RNAi干扰，但U6启动子具有种属特异性，在番木瓜转基因技术中，最好使用番木瓜本身或接近物种的U6启动子，这样能取得更高的的启动效率。

番木瓜基因组小(372Mb)，二倍体，生命周期短，产种子量高，树体不高，基因转化效率高，是理想的热带模式植物，对热带作物生物技术的研究越来越重要。目前还没有研究报道番木瓜U6启动子的克隆与应用。因此，番木瓜U6启动子的克隆和应用，必将推进这些植物相关技术领域的研究，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供了番木瓜U6启动子基因，通过GUS染色瞬时表达验证，番木瓜U6启动子基因能高效的在番木瓜上表达。在转基因技术领域，这些启动子不仅适用于番木瓜，用于启动功能基因表达，更可在植物转化时启动RNAi发夹结构，在CRISPR/Cas9系统中启动sgRNA引导序列等特殊结构的表达等。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供番木瓜U6启动子基因，包括两种番木瓜U6启动子基因，分别具有序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

该两种启动子基因序列还包括含有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示基因序列的其它序列。

启动子序列来自于番木瓜supercontig_179染色体。

本发明的另一目的在于提供番木瓜U6启动子基因在转基因技术领域中的应用。

本发明利用snRNA序列在真核生物体内非常保守的序列特征，用拟南芥AtU6启动子的snRNA序列与番木瓜的基因组(Carica papaya ASGPBv0.4)序列进行比对，通过比对序列结果设计多对引物，PCR克隆出番木瓜的2种U6启动子，并构建与GUS基因融合表达载体转化番木瓜胚性愈伤，GUS染色瞬时表达验证表明，克隆出的2种番木瓜U6启动子在番木瓜上具有很强的启动效率，能在番木瓜上很好的启动GUS基因的表达。

附图说明

图1：从番木瓜DNA上克隆出2种U6启动子序列。

图2：从番木瓜K、L序列上PCR出构建GUS融合表达载体具有粘性末端的2种U6启动子序列。

图3：用于转化的pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)质粒载体图。

图4：用于转化的pCaU6K-GUS(CaU6K-HPH)质粒载体图。

图5：用于转化的pCaU6L-GUS(CaU6L-HPH)质粒载体图。

图6：番木瓜胚性愈伤转化pZmUbi-GUS、pCaU6K-GUS、pCaU6L-GUS载体后GUS表达瞬时染色情况。CK是不经转化的愈伤，为空白材料，上排从左到右分别是农杆菌LBA4404转化pZmUbi-GUS、pCaU6K-GUS、pCaU6L-GUS的情况，下排左到右分别是农杆菌GV3101转化pZmUbi-GUS、pCaU6K-GUS、pCaU6L-GUS的情况。

图7：pCaU6K-GUS、pCaU6L-GUS、pZmUbi-GUS载体转化番木瓜胚性愈伤后不同启动子、不同农杆菌GUS瞬时表达差异性分析。L是pCaU6L-GUS载体染色情况，K是pCaU6K-GUS载体染色情况，UBI是pZmUbi-GUS载体染色情况。A以农杆菌GV3101进行转化，L、K与对照UBI启动子启动能力差异不显著；B以农杆菌LBA4404进行转化，L、K与对照UBI启动子启动能力差异不显著；C启动子L在农杆菌GV3101和LBA4404分别转化条件下，在5％显著水平，LB4404表达水平显著高于GV3101；D启动子K在农杆菌GV3101和LBA4404分别转化条件下，差异不显著；E启动子UBI在农杆菌GV3101和LBA4404分别转化条件下，差异不显著。

具体实施方式

番木瓜U6启动子的克隆和功能验证方法，其具体步骤如下：

1、利用U6启动子snRNA序列的保守性，在https://phytozome.jgi.doe.gov网站上，利用拟南芥AtU6启动子的snRNA序列

(gtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcataaatcgagaaatggtccaaatttt)与番木瓜的基因组(Carica papaya ASGPBv0.4)序列进行比对(BLAST)。检查比对结果，从中挑选出序列同源性大于95％的位置(contig_26951，supercontig_43，supercontig_179，supercontig_40)，下载这些位置的序列信息，并在http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi#！网站上对挑选出的序列进行BOXSHADE(盒式)序列分析比对，找到这些启动序列的USE位置和TATA框位置。

2、番木瓜U6启动子的PCR克隆：在下载的U6启动序列USE和TATA框位置前寻找和设计引物，引物设计参考http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/网站，尽量选择能区别克隆目标启动序列的引物对。然后以番木瓜Sunrise品系DNA为模版，PCR克隆目标启动序列，PCR后跑胶观察，回收通过PCR克隆出的目标条带进行测序比对。最后能克隆出启动子序列，测序后符合预期启动序列的启动子序列位于supercontig_179染色体的不同位置上，克隆出启动子序列的位置、引物对及序列大小(见表1)。PCR试剂购于BBI生命科学有限公司，反应条件：95℃5min，94℃30s，53℃45s，72℃1min，32循环，72℃5min，4℃保存。

表1：克隆出番木瓜2个U6启动子的引物序列及克隆位置与大小

3、番木瓜U6启动子与GUS基因融合植物表达载体构建：以带GUS基因的pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)质粒(见图1)为骨架质粒(HygR植物筛选基因，KanR菌落筛选基因)，质粒由美国Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P.Brutnell实验室提供；以表1克隆的PAPAYA 179-1(K)和PAPAYA 179-2R(L)U6启动子序列为模版，设计带骨架质粒GUS基因启动子粘性末端的引物对(见表2)PCR克隆目标启动子序列，通过酶切连接将质粒GUS基因前的ZmUbi启动子替换为克隆的番木瓜U6启动子，构建番木瓜U6启动子与GUS基因融合植物表达载体。图4为用于转化的pCaU6K-GUS(CaU6K-HPH)质粒载体图。图5为用于转化的pCaU6L-GUS(CaU6L-HPH)质粒载体图。融合植物表达载体通过DNA测序检测目标启动序列构建情况。PCR使用北京博迈德生物技术有限公司的2×Taq PCR Master Mix，反应条件：94℃3min，94℃30s，50℃30S，72℃1min，34循环，72℃5min，4℃保存。

表2：番木瓜2个U6启动子与GUS基因融合表达载体的构建引物及克隆位置与大小

4、番木瓜U6启动子农杆菌转化验证：将U6启动子与GUS基因融合植物表达载体pCaU6K-GUS(见图2)，pCaU6L-GUS(见图3)，以及对照质粒pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)转化到农杆菌LB4404或GV3101菌株，以番木瓜幼苗茎段诱导的胚性愈伤为转化外植体材料，进行农杆菌转化，共培养6天后取出胚性愈伤进行GUS染色观察，从GUS基因的GUS染色表达情况评估克隆的U6启动子的启动能力和表达活性。GUS染色液按照常规方法配制X-Gluc母液和X-Gluc基液，然后按比例混合后储存于4℃冰箱备用，取用于检测的组织块，加入GUS染色液中37℃过夜染色，倒掉染色液，70％酒精脱色1～3次，95％的酒精脱色1～2次，观察GUS染色情况(见图6)。最后收集胚性愈伤在体视显微镜下观察拍照。同时，取同等重量的每种愈伤GUS染液的蓝色上清液在620nm波长(蓝色上清液的最大吸收波长)处测定光吸收值(见表3)。数据、图标处理在Excel 2010下进行,通过Sigma Plot 10.0软件对数据进行统计分析、差异显著性检验和相关性分析。从分析结果可知，以农杆菌GV3101进行转化，目标载体启动子L、K与对照Ubi启动子启动能力差异不显著(图7A)；以农杆菌LBA4404进行转化，目标载体启动子L、K与对照Ubi启动子启动能力差异不显著(图7B)；启动子L在农杆菌GV3101和LBA4404分别转化条件下，在5％显著水平，LB4404表达水平显著高于GV3101(图7C)；启动子K在农杆菌GV3101和LBA4404分别转化条件下，差异不显著(图7D)；启动子Ubi在农杆菌GV3101和LBA4404分别转化条件下，差异不显著(图7E)。

表3 pCaU6L-GUS、pCaU6K-GUS、pZmUbi-GUS载体转化番木瓜胚性愈伤后GUS瞬时表达染色液OD620测定

备注：L是pCaU6L-GUS载体染色情况，K是pCaU6K-GUS载体染色情况，UBI是pZmUbi-GUS载体染色情况。

本发明第一次克隆了番木瓜U6启动子，并在番木瓜上验证了其启动功能，为番木瓜及相近物种转基因研究提供了很好的启动子工具。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 番木瓜U6启动子基因及应用

<160> 2

<210> 1

<211> 212

<212> DNA

<213> 番木瓜(Carica papaya)的U6启动子基因序列

<400> 1

CGGGCATCTA CCATTAGTTA TTAGTTATTC ATGTTTATGG GCGAACAACG GGAATTAAAC 60

CTACACGTGG TTATAGCGTT TGTTTTTTCG CATCCGATTT TGTCTGCATC GGCCGGTGGC 120

CGAATTTATG GAACGCCCAC AGAAATCGTC CCACAATGTT TAGGGCCAAA GAAAATCTAA 180

GCTTTATATA AGGTATCTCC GCTTCTCCAA TA 212

<210> 2

<211> 703

<212> DNA

<213> 番木瓜(Carica papaya)的U6启动子基因序列

<400> 2

GGGTAGTTTA TTCTCTCTGG TGAGTGAAGC CACTTGCTTT ATTCAGGACG ATTGTTTGGA 60

TTGTTTTTCC TCCCGATTGA ACCTACTCAA CGCGCCGTGG TCGTCGTGTT TTTGGTCCTA 120

CATTGTTCTT CAAAGATTTC GTCGACCTTT AAGGTAAACA AATTCTATCT CGGCTTTTGA 180

AAACGAGAGA ATGTCCGATA ATCCACCCTG CAAACCACCG TTTCCTGAGG AGCTAATGAA 240

TCTTGGACCA GAGTTGGCGC CGCGAACGCA ATGAAATTAT GCAGTTGGAG AAGTTTATCC 300

TGGCCCGGGT TGGAACTCAG ATGGTTGGAA GAAGTCCAAA AAGGAAGAAA TATAGTGAGA 360

ATTTGATCAT TGGGCGCCAT AGTAAGTGGG TTAACTGTGA CACGTTCACA AAAAAAATCT 420

TTTCATAGCA AATCATTTAT TAAGGAAAAT AGATATAATA CATAAGTGGA AGAAGAAAGA 480

AGAACTTGGT ATCGGGCATC TTCCATTAGT TATTAGTTAT TCATGTTACG GGCGAACAAC 540

GGGAATTAAA CCTACACGTG GTTATAGCGT CTGTTTTTTC GCATTCGATT TTGTCTGCGT 600

CGGCCGGTGG CCGAATTTAT AAACGCCCAC AGTAATCGTC CCACAGTGTT TAGGGCTAAA 660

TAAAATCTAA GCTTTATATA AGTCTATCCC CGCGACCGTC AAT 703

Claims (3)

1.番木瓜U6启动子基因，其特征在于：包括两种番木瓜U6启动子基因，分别为序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的番木瓜U6启动子基因，其特征在于：启动子序列来自于番木瓜supercontig_179染色体。

3.如权利要求1所述的番木瓜U6启动子基因在转基因技术领域中的应用。

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