CN1728937A

CN1728937A - 用于植物中表达基因的时间特异性种子启动子

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Publication number: CN1728937A
Application number: CNA038157748A
Authority: CN
Inventors: 王�琦; 莉萨·M·韦弗; 蒂姆·N·奥尔马索夫; 杰弗里·阿伦斯; 帕特里斯·杜波依斯; 杰弗里·Q·申
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co; Monsanto Technology LLC
Priority date: 2002-05-03
Filing date: 2003-05-05
Publication date: 2006-02-01
Anticipated expiration: 2023-05-05
Also published as: CN1728937B; EP1549132A2; US7179959B2; CA2483782A1; US20100077504A1; US9303267B2; AU2003225283A8; US20120317679A1; BR0309869A; US20040016024A1; EP1549132A4; AU2003225283A1; US8193413B2; US7615680B2; WO2003092361A3; US20070180570A1; CA2483782C; WO2003092361A2; US8581044B2; US20140143911A1

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域。更具体地说，本发明涉及胚胎发生的固定时期中的种子特异性基因表达。本发明提供能够在种子中转录异源核酸序列的启动子，及对其修饰、制备和应用的方法。

Description

用于植物中表达基因的时间特异性种子启动子

本申请要求2002年5月3日提交的美国临时申请60/377247的优先权和利益。

本发明涉及植物遗传工程领域。更具体地说，本发明涉及胚胎发生过程中具有特定时间模式的种子特异性基因表达。本发明提供能够在种子中转录异源核酸序列的启动子，及其对其进行修饰、制备和应用的方法。

种子提供了对人和家畜而言重要的饮食蛋白源。然而，种子的营养含量经常不足。例如，许多种子蛋白质缺乏一或多种必需氨基酸。通过遗传修饰天然或非天然蛋白而具有营养更全面的氨基酸组成(或其它一些预期特性)，并在转基因植物中过量表达该修饰蛋白，可克服上述缺陷。可选地，可将一或多个基因导入作物中以操纵其代谢途径和改变游离氨基酸含量。这些方法在产生农艺性状(如产量)、营养性能和药物学特性被改善了的作物中非常有用。

基因的导入可对植物生长和发育产生有害的影响。如此，有必要将基因的表达限制在预期的靶组织中。例如，必需将氨基酸去调节(deregulation)基因的表达限定为种子特异性或种子增强型以防止非期望表型而影响产量或其它农艺性状。在有些情况中，转基因的表达必需进一步限制在特异靶组织的生长和发育过程中确定时期内(时间模式(temporal profile))。例如，需要将脂肪酸代谢基因控制在当种子中的油生物合成最活跃的时期内表达。

基因的启动子部分在控制基因表达中起着核心作用。通过启动子区域，才能组装转录体并进而起始转录。该早期步骤相对于接下来的基因表达步骤而言常常是关键的调控步骤。在启动子阶段调控转录起始有数种方式。例如，由于特定化合物的存在诱导启动子、只在特异性组织中表达基因、或组成性表达编码序列。因此，编码序列的转录可通过将编码序列可操作性的连接到具有不同调控特性的启动子而得以修饰改变，但其中的问题是预期特性的启动子的可获得性，而本发明的着眼点正在于此。

发明概述

本发明包括并提供一种基本纯的核酸分子，其编码的核酸序列具有与SEQ ID NO：1或其互补序列至少75％的同一性。

本发明包括并提供一种植物，它包含有导入的核酸分子，其中所述核酸分子包含的启动子含有与SEQ ID NO：1或其互补序列有至少75％的同一性的核酸序列。

本发明包括并提供一种植物，它包含有导入的核酸分子，其中所述核酸分子包含的启动子含有选自如下序列：SEQ ID NO：1-4所示序列或其互补序列。

本发明包括并提供一种产生转化植物的方法，包括：提供一种核酸分子，包括含有选自SEQ ID NO：1-4所示序列及其它们的互补序列的核酸序列的启动子，与结构性核酸序列可操作性连接；并用所述核酸分子转化植物。

本发明包括并提供一种在种子中表达结构性核酸分子的方法，包括：培育包含有导入的核酸分子的植物，所述核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：1、2、3、4所示序列及其它们的互补序列的核酸序列的启动子，其与结构性核酸分子可操作性连接，其中所述植物产生种子，并且所述结构性核酸分子在所述种子中发生转录；和分离所述种子。

本发明包括并提供一种获得结构性核酸分子的产物被增强的种子的方法，包括：培育包含有导入核酸分子的植物，所述核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：1、2、3、4所示序列及其它们的互补序列的核酸序列的启动子，其与结构性核酸分子可操作性连接，其中所述转化植物产生种子，并且所述结构性核酸分子在所述种子中发生转录；和从所述植物收获(isolating)所述种子。

本发明包括并提供一种获得结构性核酸分子的产物被促进的食物(meal)的方法，包括：培育包含有导入核酸分子的植物，所述核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：1、2、3、4所示序列及其它们的互补序列的核酸序列的启动子，其与所述结构性核酸分子可操作性相连，其中所述植物产生种子，并且所述结构性核酸分子在所述种子中发生转录；和制备包含所述植物或其部分的所述食物(meal)。

本发明包括并提供一种获得结构性核酸分子的产物被增强的原种(feedstock)的方法，包括：培育包含有导入核酸分子的植物，所述核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：1、2、3、4所示序列及其它们的互补体的核酸序列的启动子，其与所述结构性核酸分子可操作性相连，其中所述植物产生种子，并且所述结构性核酸分子在所述种子中发生转录；和制备包含所述植物或其部分的所述原种(feedstock)。

本发明包括并提供一种获得结构性核酸分子的产物被增强的油(oil)的方法，包括：培育包含有导入核酸分子的植物，所述核酸分子包括含有在严谨条件下与选自SEQ ID NO：1、2、3、4所示序列及其它们的互补序列杂交的核酸序列的启动子，其与所述结构性核酸分子可操作性相连，其中所述植物产生种子，并且所述结构性核酸分子在所述种子中发生转录；和收获所述油(oil)。

本发明包括并提供一种细胞，其包括含有选自SEQ ID NO：1、2、3、4所示序列及其互补体的核酸序列的载体。

本发明包括并提供从下述植物的一或多个种子中产生的油(oil)，所述植物包含有导入的核酸分子，其包括含有选自SEQ ID NO：1-4及其互补核酸序列的启动子。

本发明包括并提供从下述植物的一或多个种子中制备的油(oil)，所述植物包含有导入的核酸分子，其包括含有选自SEQ ID NO：1-4及其互补序列的核酸序列的启动子，其与结构性核酸序列可操作性连接，其中所述启动子相对于结构性核酸序列是异源的。

本发明包括并提供由下述植物产生的种子，所述植物包含有被导入的核酸分子，该核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：1-4及其互补体的核酸序列的启动子。

本发明包括并提供含下述植物或其部分的原种，所述植物或其部分包含有导入的的核酸分子，其包括含有选自SEQ ID NO：1-4及其互补体的核酸序列的启动子。

本发明包括并提供含来自下述植物的植物材料的食物(meal)，所述植物包含有导入的核酸分子，其包括含有选自SEQ ID NO：1-4及其互补序列的核酸序列的启动子。

本发明包括并提供种子的容器，其中至少25％的所述种子包括含有与结构性核酸序列可操作性连接的选自SEQ ID NO：1-4及其互补体的核酸序列的启动子，其中所述启动子与结构性核酸序列彼此异源。

本发明包括并提供一种在植物中表达结构性核酸序列的方法，包括：用包含与所述结构性核酸序列可操作性连接的启动子的核酸分子转化所述植物，其中所述启动子包括选自SEQ ID NO：1、2、3、4所示序列及其它们的互补序列的序列，并且其中所述启动子和所述结构性核酸彼此异源；并培育所述植物。

本发明包括并提供一种在植物的种子中积聚游离氨基酸的方法，包括：用包含与所述结构性核酸序列可操作性连接的启动子的核酸分子转化所述植物，其中所述启动子包括选自SEQ ID NO：1、2、3、4所示序列及其它们的互补体的序列，并且其中所述启动子和所述结构性核酸彼此异源；并培育所述植物。

本发明包括并提供一种调节大豆种子萌发的方法，包括：用包含与编码赤霉素生物合成多肽的结构性核酸序列可操作性连接的启动子的核酸分子转化所述植物，其中所述启动子包括选自SEQ ID NO：1、2、3、4所示序列及其它们的互补体的序列，并且其中所述启动子和所述结构性核酸彼此异源；收获所述植物的种子；种植所述种子。

附图简述

图1为pMON8677的结构示意图。

图2为pMON49801的结构示意图。

图3为pMON42316的结构示意图。

图4为pMON42320的结构示意图。

图5为pMON42302的结构示意图。

图6为pMON69650的结构示意图。

图7为pMON69651的结构示意图。

图8为pMON64210的结构示意图。

图9为pMON64213的结构示意图。

图10为pMON66893的结构示意图。

图11为pMON66894的结构示意图。

图12为pMON63662的结构示意图。

图13为pMON63682的结构示意图。

序列表简述

SEQ ID NO：1表示sle2基因启动子。

SEQ ID NO：2表示lea9启动子。

SEQ ID NO：3表示AtPerl启动子。

SEQ ID NO：4表示凝集素启动子。

SEQ ID NOs：5-25表示引物序列。

定义

下述提供的定义帮助对本发明详细描述的理解。

术语“编码序列”、“结构性序列”和“结构性核酸序列”指包含核苷酸有序排列的物理结构(一级结构)。核苷酸按三联体排列，使每个三联体形成密码子。每个密码编码特定氨基酸。因此，编码序列、结构性序列和结构性核酸序列编码的一系列氨基酸形成蛋白质、多肽或肽序列。编码序列、结构性序列和结构性核酸序列可包含在大核酸分子、载体等之中。此外，这些序列中的核苷酸有序排列可通过序列表、图、表、电子介质等来描述。

术语“DNA序列”、“核酸序列”和“核酸分子”指包含核苷酸有序排列的物理结构。DNA序列或核苷酸序列可包含在大核酸分子、载体等之中。此外，这些序列中的核苷酸有序排列可通过序列表、图、表、电子介质等来描述。

术语“表达”指基因的转录产生相应的mRNA，该mRNA翻译产生相应的基因产物(即肽、多肽或蛋白质)。

术语“反义RNA的表达”指DNA转录产生第一RNA分子，其能够与第二RNA分子杂交。

术语“同源”指两个或多个核酸或氨基酸序列之间的相似性水平，通过位置相同百分率来计算(即序列相似或同一性)。同源性也用于指不同核酸或蛋白质中的相似功能特性。

术语“异源”指两个或多个不同来源的核酸或蛋白质序列之间的相互关系。例如，如果启动子与编码序列之间的组合在自然界通常不存在，则两者彼此异源。此外，特定序列可以相对于它所插入的细胞或生物体是异源的(即其在特定细胞或生物体中在自然条件下通常不存在)。

术语“杂交”指第一条核酸链与第二条链在具有足够序列同一性时通过氢键碱基配对的能力。当两个核酸分子在适当条件下相互退火即可发生杂交。

术语“可操作性连接”指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区与核酸序列安排的位置关系以使核酸序列可由该启动子区调控而引导转录。此时，启动子区与核酸序列属于“可操作性连接”。

术语“启动子”或“启动子区”指经常存在于编码序列的上游(5′)的核酸序列，其能够调控核酸序列转录成mRNA。启动子或启动子区典型地提供RNA聚合酶或其它为转录合适起始的因子的识别位点。在此处，启动子或启动子区包括通过插入或缺失调节区，或对启动子进行随机或定点突变等而衍生的启动子变体。启动子的强度或活性可通过它能够产生RNA的量来衡量，或通过蛋白在细胞或组织中的积聚量来衡量，而是相对于与其比较的启动子的转录活性事先进行确定进行。

术语“5′UTR”指被DNA上游或基因编码区的5′转录而不被翻译区。在实际中，启动子经常与天然的5′UTR组合使用。某些情况下，启动子与异源的5′UTR组合可获得最佳的表达。

术语“3′UTR”指DNA下游或基因编码区的3′的非翻译区。3′UTR包含录终止和RNA多腺苷酸化信号。

术语“重组载体”指诸如质粒、粘粒、病毒、自我复制序列、噬菌体或线性单链、环状单链、线性双链或环状双链DNA或RNA核苷酸序列。重组载体可是任何来源的，并能够发生基因组整合或自我复制。

术语“调节序列”指位于编码序列的上游(5′)、内部、或下游(3′)的核苷酸序列。典型地，所述编码序列的转录和表达因调节序列的存在或不存在而受到影响。

术语“基本上同源”指两条序列至少有约90％的序列相同，其中用BestFit程序(Version 10；Genetics Computer Group，Inc.，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，WI))于默认参数下的计算作为结果。

术语“转化”指将核酸导入到受体宿主中。术语“宿主”指细菌细胞、真菌、动物或动物细胞、植物或种子、或任何植物部分或组织，包括植物细胞、原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、苗、胚和花粉。

在此处，术语“转基因植物”指导入的核酸稳定地整合到其基因组的植物，例如整合到核基因组或质体基因组中。

此处，术语“基本上纯的”指将分子从基本上所有其它的天然状态与它通常在一起的分子分离开来。更具体地说，基本纯的分子是所述制品中的占优势地位的种类。一种基本纯的分子可以是高于60％、优选75％、更优选90％、最优选95％去除了天然混合物中存在的其它分子(溶剂除外)。术语“基本纯的”不意欲包括存在于天然状态下的分子。

在一个优选方面，相似遗传背景是指核遗传材料相比共同背景有50％或更高的生物体。在一个更优选方面，相似遗传背景是指核遗传材料相比共同背景有75％或更高，甚至更优选为90％或更高的生物体的背景。在另一更优选方面，相似遗传背景是指被比较的是植物，除由于用植物转化技术而原先导入的遗传材料之外，植物是同基因的。

优选实施方式的详细描述

本发明提供能够在种子中转录异源结构性核酸序列的启动子，及其对所述启动子的修饰、制备和应用方法。本发明也提供含有种子特异性启动子的组合物、转化的宿主细胞和植物，以及它们的制备和应用方法。

核酸分子

本发明提供包含选自SEQ ID NO：1-4所示序列及其互补体序列的核酸分子。SEQ ID NO：1表示sle2基因启动了。SEQ ID NO：2表示lea9启动了。SEQ ID NO：3表示AtPerl启动子。SEQ ID NO：4表示凝集素启动子。

核酸杂交技术是DNA操作领域中的技术人员熟知的技术。给定的核酸对的杂交特性反映了它们之间的相似性或同一性。

低严谨条件可用于选择与靶核酸序列有较低序列同一性的核酸序列。可采用的条件例如约0.15M至约0.9M氯化钠，温度为约20至约55℃。

高严谨条件可用于选择与公开的核酸序列有较高程度的序列同一性的核酸序列(Sambrook et al.，1989)。

高严谨条件典型涉及在约2X至约10X SSC(由20X SSC母液中释稀得到，该母液包含3M氯化钠和0.3M柠檬酸钠的蒸馏水溶液，pH 7.0)、约2.5X至约5X Denhardt’s溶液(由50X母液释稀得到，该母液包含1％(w/v)牛血清白蛋白，1％(w/v)ficoll及1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮于蒸馏水中)、约10mg/mL至约100mg/mL鱼精子DNA及约0.02％(w/v)至约0.1％(w/v)SDS中于约50℃至约70℃温育数小时至过夜以完成核酸杂交。高严谨条件优选为6X SSC、5X Denhardt’s溶液、100mg/mL鱼精子DNA及0.1％(w/v)SDS中于55℃温育数小时。

上述杂交后通常接着进行数次洗涤步骤。洗涤液组合物通常包含0.5X至约10X SSC和0.01％(w/v)至约0.5％(w/v)SDS，并于约20℃至约70℃温育15分钟。优选地，在65℃，用0.1X SSC洗至少1次之后，核酸片段仍然保持杂交。

本发明的核酸分子优选为在高严谨条件下能与具有选自SEQ ID NO：1-4所示序列及其互补序列的核酸分子发生杂交。在一个优选实施方式中，本发明的核酸分子在高严谨条件下能与含有SEQ ID NO：1所示序列的核酸分子发生杂交。在一个优选实施方式中，本发明的核酸分子在高严谨条件下能与含有SEQ ID NO：2所示序列的核酸分子发生杂交。在一个优选实施方式中，本发明的核酸分子在高严谨条件下能与含有SEQ ID NO：3所示序列的核酸分子发生杂交。在一个优选实施方式中，本发明的核酸分子在高严谨条件下能与含有SEQ ID NO：4所示序列的核酸分子发生杂交。

在一个优选实施方式中，本发明的核酸分子包含与SEQ ID NO：1、2、3或4所示序列具有高于约75、约80、约85、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98或约99％的序列同一性的核酸序列。

序列同一性百分率优选通过Sequence Analysis Software Package^TM(Version 10；Genetics Computer Group，Inc.，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，WI)的“Best Fit”或“Gap”程序来计算。“Gap”利用Needleman和Wunsch的运算法则(Needleman和Wunsch，1970)以找到配对数目最大化和缺口(gap)数目最小化的两条序列对比。“BestFit”是按照两条序列之间相似性的最佳部分的优化对比，并插入缺口以将配对数目最大化，其利用Smith和Waterman的局部同源运算法则(Smith和Waterman，1981；Smithet al.，1983)。同一性百分比最优选通过“Best Fit”程序以默认参数进行计算而获得。

本发明也提供与SEQ ID NO：1-4及其互补序列中任一序列有同一性百分比的核酸分子片段。在一个实施方式中，所述片段是本发明核酸分子中50和600之间的连续核苷酸、50和550之间的连续核苷酸、50和500之间的连续核苷酸、50和450之间的连续核苷酸、50和400之间的连续核苷酸、50和350之间的连续核苷酸、50和300之间的连续核苷酸、50和250之间的连续核苷酸、50和200之间的连续核苷酸、50和150之间的连续核苷酸、50和100、15至100、15至50、或15至25之间的连续核苷酸。

在另一实施方式中，所述片段包括本发明核酸序列中的至少约15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或约650个连续核苷酸。

本发明包括编码具有酶活性的多肽的核酸序列，该酶活性为类固醇途径酶鲨烯环氧酶、固醇甲基转移酶I、固醇C4脱甲基酶、钝叶鼠曲草醇(obtusifoliol)C14α脱甲基酶、固醇C5去饱和酶和固醇甲基转移酶II。

鲨烯环氧酶(也称作鲨烯单加氧酶)催化鲨烯转化为环氧化鲨烯(2，3-氧化鲨烯)，环氧化鲨烯是植物甾醇类合成路径中的起始固醇分子的前体，环阿屯醇。这是该路径中首次报道的步骤，该路径是需氧的。环氧化鲨烯的形成也是最近经常报道的动物、真菌和植物的固醇生物合成中步骤。近来报道一些拟南芥属(Arabidopsis)和芸苔属(Brassica)环氧化鲨烯基因的同系物(Schafer，U.A.，Reed，D.W.，Hunter，D.G.，Yao，K.，Weninger，A.M.，Tsang，E.W.，Reaney，M.J.，MacKenzie，S.L.，和Covello，P.S.(1999)，Plant Mol.Biol.，39(4)：721-728)。这些作者还进行PCT申请，其中公开了使用环氧化鲨烯的反义技术来评价植物中的鲨烯水平的用途(WO 97/34003)。

鲨烯环氧化酶，也称作鲨烯单加氧酶，是参考号为1.14.99.7的酶，EnzymeNomenclature，1992，146。

一些鲨烯环氧化酶是本领域已知的。它们包括拟南芥鲨烯环氧化酶蛋白质序列登录号AC004786拟南芥属(Arabidopsis)鲨烯环氧化酶登录号N64916，和拟南芥鲨烯环氧化酶登录号T44667。日本专利申请07194381A公开了编码哺乳动物的鲨烯环氧化酶的DNA。

本发明的另一个方面是包含编码鲨烯环氧化酶的核酸序列的重组构建体和载体，以及制备新的鲨烯环氧化酶方法，包括在使生成鲨烯环氧化酶的条件下培养用新的构建体或载体转化的宿主细胞一段时间，和回收由此生成的鲨烯环氧化酶。

S-腺苷L-甲硫氨酸：固醇C24甲基转移酶(SMT1和SMT2)催化将甲基从辅助因子S-腺苷L-甲硫氨酸上转移到固醇侧链的C24中心(Bach，T.J.和Benveniste，P.(1997)，Prog.Lipid Res.，36：197-226)。在高等植物细胞中，SMT表示产生24-甲基和24-乙基固醇的能力(Schaffer，A.，Bouvier-Nave，Benveniste，P.，Schaller，H.(2000)Lipids，35：263-269)。采用酵母erg6表达系统的SMT功能性特征清楚地证明，在特定植物种类中，SMT1序列编码环阿屯醇-C24-甲基转移酶和SMT2序列编码24-亚甲基烯胆烷醇(methylenelophenol)-C24-甲基转移酶(Bouvier-Nave，P.，Husselstein，T.，和Benveniste，P.(1998)，Eur.J.Biochem.，246：518-529)。一些编码SMT1和SMT2的基因已经被报道和评论(Schaffer，A.，Bouvier-Nave，Benveniste，P.，Schaller，H.(2000)Lipids，35：263-269)。表达SMT1或SMT2的同系物的转基因植物已经被试验(Schaffer，A.，Bouvier-Nave，Benveniste，P.，Schaller，H.(2000)Lipids，35：263-269)。这些基因用于改进植物固醇组成的用途也被两个专利申请覆盖(WO 98/45457和WO 00/61771)。

本领域已知的固醇甲基转移酶I可被用于本发明。示例性的序列包括已知的拟南芥固醇甲基转移酶I蛋白序列登录号U71400，已知的烟草固醇甲基转移酶I蛋白序列登录号U81312和蓖麻(Ricinus Communis)固醇C甲基转移酶，Eur.J.Biochem.，246(2)：518-529(1997)(Complete cds，登录号g2246457)。

S-腺苷L-甲硫氨酸固醇C24甲基转移酶-一种编码拟南芥S-腺苷L-甲硫氨酸固醇C24甲基转移酶的核酸序列已经被Husselstein等，(1996)FEBSLetters 381：87-92发表。Δ24固醇甲基转移酶是编号为2.1.1.41的酶，EnzymeNomenclature，1992，160。

固醇C4脱甲基酶催化个别脱甲基反应的前面反应，导致C4上的两个甲基基团去除。虽然在动物和真菌中，连续发生两个C4甲基基团的去除，但是已经报道在植物中，在第一次和第二次C4脱甲基之间还有其他步骤(Bach，T.J.和Benveniste，P.(1997)，Prog.Lipid Res.，36：197-226)。C4脱甲基是由单加氧酶、NAD+依赖的固醇4-脱羧酶和NADPH依赖的3-类固酮还原酶组成的微粒体酶复合物催化的。

固醇C14脱甲基酶催化C14处的脱甲基，去除C14的甲基基团并且在该位置上产生双键。在真菌和动物中，这是固醇合成路径的第一步。但是，在高等植物中，14α-甲基在一个C4甲基缺失后被去除。因此，虽然羊毛固醇是动物和真菌细胞中的C14脱甲基酶的底物，植物酶利用钝叶鼠曲草醇(obtusifoliol)作为底物。固醇C14脱甲基化通过细胞色素P-450复合物调节。去除14甲基的机制包括两个氧化步骤，在C29生成乙醇，然后转化为乙醛，以及另一个氧化步骤，涉及产生甲酸和典型的8，14-双烯固醇的去甲酰基化(Aoyama，Y.，Yoshida，Y.，Sonoda，Y.，和Sato，Y.(1989)J；Biol.Chem.，264：18502-18505)。来自Sorghum bicolor(L)Moench的钝叶鼠曲草醇(obtusifoliol)C14α-脱甲基酶已经采用由从内在14氨基酸序列设计的PCR引物生成的基因特异性探针克隆，并且在大肠杆菌中被功能性地表达(Bak，S.，Kahn，R.A.，Olsen，C.E.，和Halkier，B.A.(1997)The Plant Journal，11(2)：191-201)。此外，编码羊毛甾醇C14-脱甲基酶的酿酒酵母CYP51A1在烟草中被功能性地表达(Grausem，B.，Chaubet，N.，Gigot，C.，Loper，J.C.，和Benveniste，P.(1995)The Plant Journal，7(5)：761-770)。

固醇C14脱甲基酶和序列是本领域已知的。例如，Sorghum bicolor钝叶鼠曲草醇C14α脱甲基酶CYP51 mRNA在Plant J.，11(2)：191-201(1997)中被描述(全编码序列(cds)登录号U74319)。

本发明的另一个方面在于包含编码钝叶鼠曲草醇(obtusifoliol)C14α脱甲基酶的核酸序列的重组构建体和载体，以及制备钝叶鼠曲草醇C14α脱甲基酶的方法，包括在使生成钝叶鼠曲草醇C14α脱甲基酶的条件下培养用新的构建体或载体转化的宿主细胞一段时间，和回收由此生成的钝叶鼠曲草醇C14α脱甲基酶。

固醇C5去饱和酶催化Δ⁵双键的插入，这通常在Δ⁷-固醇水平上发生，从而形成Δ^5，7固醇(Parks等，Lipids，30：227-230(1995))。该反应被报道包括立体特异地去除5α和6α氢原子，这两个氢原子分别由(+)和(-)R-甲羟戊酸4pro-R和5pro-S氢生物合成地产生(Goodwin，T.W.(1979)Annu.Rev.PlantPhysio.，30：369-404)。该反应显然是需要氧和NADPH或NADH的。去饱和酶已经被报道是一种存在于微粒体中的多酶复合物。由去饱和酶本身、细胞色素b5和吡啶核苷酸依赖的黄素蛋白组成。Δ⁵-去饱和酶被报道是单加氧酶，其通过细胞色素b利用来自被还原的吡啶核苷酸的电子(Taton，M.，和Rahier，A.(1996)Arch.Biochem.Biophys.，325：279-288)。编码固醇-C5去饱和酶的拟南芥cDNA通过ERG3中缺乏erg3的酵母突变体的功能性互补物被克隆，ERG3是编码麦角固醇生物合成必需的固醇C5去饱和酶的基因(Gachotte D.，Husselstein，T.，Bard，M.，Lacroute F.，和Benveniste，P.(1996)The Plant Journal，9(3)：391-398)。已知的固醇C5去饱和酶可用于本发明，包括拟南芥固醇C5去饱和酶蛋白质序列登录号X90454，和在The Plant J.9(3)：391-398(1996)中描述的固醇C5去饱和酶的拟南芥mRNA(全编码序列登录号g1061037)。

NCBI(国家生物技术信息中心)数据库显示了37条固醇去饱和酶的序列，它们可以被用于本发明。如下是这种序列的示例。来自酵母：C5固醇去饱和酶NP_013157(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))；推定的C5固醇去饱和酶裂殖体(fission)T40027(粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe))；C5固醇去饱和酶裂殖体T37759(粟酒裂殖酵母)；C5固醇去饱和酶JQ1146(酿酒酵母)；C5固醇去饱和酶BAA21457(粟酒裂殖酵母)；C5固醇去饱和酶CAA22610(粟酒裂殖酵母)；推定的C5固醇去饱和酶CAA16898(粟酒裂殖酵母)；可能的C5固醇去饱和酶O13666(erg3_schpo)；C5固醇去饱和酶P50860(Erg3_canga)；C5固醇去饱和酶P32353(erg3_yeast)；C5，6去饱和酶AAC99343(白色假丝酵母(candida albicans))；C5固醇去饱和酶BAA20292(酿酒酵母)；C5固醇去饱和酶AAB39844(酿酒酵母)；C5固醇去饱和酶AAB29844(酿酒酵母)；C5固醇去饱和酶CAA64303(酿酒酵母)；C5固醇去饱和酶AAA34595(酿酒酵母)；C5固醇去饱和酶AAA34594(酿酒酵母)。来自植物的：C5固醇去饱和酶S71251(拟南芥)；推定的固醇C5去饱和酶AAF32466(拟南芥)；固醇C5去饱和酶AAF32465(拟南芥)；推定的固醇去饱和酶AAF22921(拟南芥(Arabidopsis thaliana))；Δ⁷-固醇C5去饱和酶(拟南芥)；固醇C5(6)去饱和酶同系物AAD20458(烟草)；固醇C5去饱和酶AAD12944(拟南芥)；固醇C5，6去饱和酶AAD04034(烟草)；固醇C5去饱和酶CAA62079(拟南芥)。来自哺乳动物的：固醇C5去饱和酶(Mus musculus)BAA33730；固醇C5去饱和酶BAA33729(Homo sapiens)；7-烯胆(甾)烷醇氧化酶CAB65928(Leishmania major)；7-烯胆(甾)烷醇氧化酶(7-烯胆(甾)烷醇C5去饱和酶)088822(家鼠)；7-烯胆(甾)烷醇5去饱和酶075845(Homosapiens)；Δ⁷-固醇C5去饱和酶AAF00544(Homo sapiens)。其他：真菌固醇C5去饱和酶同系物BAA18970(Homo sapiens)。

对于可用于本发明的编码固醇C5去饱和酶的DNA序列，NCBI核苷酸检索“固醇去饱和酶”获得110条序列。如下是这些序列的示例。NC_001139(酿酒酵母)；NC_001145(酿酒酵母)；NC_001144(酿酒酵母)；AW700015(physcomitrella patens)；AB004539(粟酒裂殖酵母)；和AW596303(大豆(Glycine max)；AC012188(拟南芥)。

结合导入HMG-CoA还原酶基因以及固醇甲基转移酶II基因到细胞中，来除了减少24-甲基固醇如菜油甾醇的沉积外，还减少固醇路径中间的化合物沉积。

已知的固醇甲基转移酶II可以被用于本发明，包括拟南芥固醇甲基转移酶II蛋白质序列(来自FEBS Lett.381(12)：87-92(1996)登录号X89867的完整mRNA编码序列)。

编码任何一种前述的影响固醇生物合成路径的酶的重组构建体可以被结合到包含重组构建体的重组载体中，该重组构建体包含分离的DNA分子。这种载体可以是细菌的或植物的表达载体。

在优选实施方案中，任何一种本发明的植物或生物体用本发明的核酸和编码选自鲨烯环氧酶、固醇甲基转移酶I、固醇C4脱甲基酶、钝叶鼠曲草醇(obtusifoliol)C14α脱甲基酶、固醇C5去饱和酶和固醇甲基转移酶II的一种成员的基因转化。在一个优选实施方案中，本发明的植物或生物体用SEQ IDNO：1-4的一种或多种和编码选自鲨烯环氧酶、固醇甲基转移酶I、固醇C4脱甲基酶、钝叶鼠曲草醇C14α脱甲基酶、固醇C5去饱和酶和固醇甲基转移酶II的一种成员的基因转化。在另一个优选实施方案中，本发明的植物或生物体用SEQ ID NO：1-4的一种或多种，编码选自鲨烯环氧酶、固醇甲基转移酶I、固醇C4脱甲基酶、钝叶鼠曲草醇C14α脱甲基酶、固醇C5去饱和酶或固醇甲基转移酶II的一种成员的基因，和在本文别处公开的编码生育酚途径酶的基因的一种或多种转化。在还有一个优选实施方案中，本发明的植物或生物体用SEQ ID NO：1-4的一种或多种和编码选自鲨烯环氧酶、固醇甲基转移酶I、固醇C4脱甲基酶、钝叶鼠曲草醇C14α脱甲基酶、固醇C5去饱和酶或固醇甲基转移酶II的一种成员的两种基因和在本文别处公开的编码生育酚途径酶的两种基因转化。任何上述的生育酚和固醇生物合成基因的结合可以在一种或多种本领域已知和在本文描述的构建体或载体中被导入到植物。

启动子

在一个实施方案中，任何被公开的核酸分子可以是启动子。在一个优选实施方案中，该启动子是组织或器官特异性的，并且优选是种子特异性的。在一个特别优选的实施方案中，启动子优先在胚乳或胚中表达相关的结构基因。在优选实施方案中，启动子优选在种子胚胎发生过程中的确定时期启动相关结构性基因的表达。

在一个方面，如果在该组织或器官中mRNA以比在其他组织或器官中至少高10倍，优选至少高100倍或至少高1000倍水平被表达，则该启动子被认为是组织或器官特异性的。可以在单个时间点上或多个时间点上测定mRNA水平，同样倍数增加可以是平均倍数增加或来自试验测定值的推定值。由于是进行水平的比较，可以采用任何测定mRNA水平的方法。在优选方面，被比较的组织或器官是种子或种子组织和叶片或叶片组织。在另一个优选方面，比较多个组织或器官。优选的多种比较是种子或种子组织与2，3，4，或多种组织或器官之间比较，这些组织或器官选自花组织、花原端、花粉、叶片、胚、苗、叶原基、苗端、根、根尖、维管组织和子叶。如在此所用，植物器官的例子是种子、叶片、根等。组织的例子是叶原基、根尖、维管组织等。可通过在生长和发育过程中的某一时间点或多个时间点，在特定组织中启动子所特异产生的mRNA或蛋白质积累量相对于总mRNA量来测定出启动了活性或强度。可通过比较在生长和发育过程中的多个时间测得的组织中启动子相对强度得出启动子的时间谱(temporal profile)。

可选地，启动子的时间谱(temporal profile)可以指相对于特性非常清楚的启动子(即其表达谱以前已研究清楚)而言的。例如，目的启动子可与报告序列(如GUS)可操作性连接并导入到特定细胞类型中。已知的启动子可按相似方法制备并导入到相同背景的细胞中。目的启动子的转录活性即可相对于已知启动子，比较报告基因的表达时间来确定。所用细胞优选为大豆。

结构性核酸序列

本发明的启动子可以被可操作地连接到结构性核酸序列上，该核酸序列相对于启动子是异源的。结构性核酸序列一般可以是任何核酸序列，其转录水平有望被提高。结构性核酸序列优选编码适合于被结合到人类或动物的食物(diet)中的多肽，或该多肽产生某些其他农业上的重要特性。

合适的结构性核酸序列包括但是不限于编码种子贮存蛋白、脂肪酸途径酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、固醇途径酶和淀粉分支酶的核酸序列。

优选的种子储存蛋白包括玉米蛋白(美国专利4,886,878；4,885,357；5,215,912；5,589,616；5,508,468；5,939,599；5,633,436；和5,990,384；专利申请：WO 90/01869，WO 91/13993，WO 92/14822，WO 93/08682，WO94/20628，WO 97/28247，WO 98/26064，和WO 99/40209)，7S蛋白(美国专利5,003,045和5,576,203)，巴西坚果(brazil nut)蛋白(美国专利5,850,024)，不含苯丙氨酸的蛋白质(专利申请：WO 96/17064)，白蛋白(专利申请：WO97/35023)，β-伴球蛋白(conglycinin)(专利申请：WO 00/19839)，11S(美国专利6,107,051)，α-hordothionin(美国专利5,885,802和5885801)，arcelin种子储存蛋白(美国专利5,270,200)，凝集素(美国专利6,110,891)，和麦谷蛋白(美国专利5,990,389和5,914,450)。

优选脂肪酸途径酶包括硫酯酶(美国专利5,512,482；5,530,186；5,945,585；5,639,790；5,807,893；5,955,650；5,955,329；5,759,829；5,147,792；5,304,481；5,298,421；5,344,771；和5,760,206)，和去饱和酶(美国专利5,689,050；5,663,068；5,614,393；5,856,157；6,117,677；6,043,411；6,194,167；5,705,391；5,663,068；5,552,306；6,075,183；6,051,754；5,689,050；5,789,220；5,057,419；5,654,402；5,659,645；6,100,091；5,760,206；6,172,106；5,952,544；5,866,789；5,443,974；和5,093,249)。优选生育酚生物合成途径酶包括tyrA，slr1736，ATPT2，dxs，dxr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，tMT2，AANT1，slr1737，和尿黑酸的双加氧酶的反义构建体(Kridl等，Seed Sci.Res.，1：209：219(1991)；Keegstra，Cell，56(2)：247-53(1989)；Nawrath，等.，Proc，Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，91：12760-12264(1994)；Xia等J.Gen.Microbiol.，138：1309-1316(1992)；cyanobase http://www.kazusa.or.jp/cyanobase；Lois etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(5)：2105-2110(1998)；Takahashi等Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(17)，9879-9884(1998)；Norris等，Plant Physiol.，117：1317-1323(1998)；Bartley和Scolnik，Plant Physiol.，104：1469-1470(1994)；Smith等，Plant J.，11：83-92(1997)；WO 00/32757；WO 00/10380；Saint Guily，等，Plant Physiol.，100(2)：1069-1071(1992)；Sato等，J.DNA Res.，7(1)：31-63(2000))。

各种基因及其编码的参与生育酚生物合成的蛋白质被列举在下表中。

基因ID	酶的名称
基因ID	酶的名称	tyrA	预苯酸脱氢酶(Prephanate dehydrogenases)
Slr1736	来自Synechocystis的叶绿基异戊二烯基转移酶	tyrA	预苯酸脱氢酶(Prephanate dehydrogenases)
Slr1736	来自Synechocystis的叶绿基异戊二烯基转移酶	ATPT2	来自拟南芥的叶绿基异戊二烯基转移酶
DXS	1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶	ATPT2	来自拟南芥的叶绿基异戊二烯基转移酶
DXS	1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶	DXR	1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原酮异构酶(reductoisomerase)
GGPPS	香叶基香叶基焦磷酸合成酶	DXR	1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原酮异构酶(reductoisomerase)
GGPPS	香叶基香叶基焦磷酸合成酶	HPPD	p-羟基苯基丙酮酸双加氧酶
AANTI	酰苷酰转运蛋白	HPPD	p-羟基苯基丙酮酸双加氧酶
AANTI	酰苷酰转运蛋白	slr1737	生育酚环化酶
IDI	异戊烯二磷酸异构酶	slr1737	生育酚环化酶
IDI	异戊烯二磷酸异构酶	GGH	香叶基香叶基还原酶
GMT	γ甲基转移酶	GGH	香叶基香叶基还原酶

上表给出的“基因ID”确定与所列酶相关的基因。任何列于表中的出现在本公开中的基因ID是指编码在表中与基因ID相关的酶的基因。

优选的氨基酸生物合成酶包括邻氨基苯甲酸合成酶(美国专利5,965,727；专利申请：WO 97/26366，WO 99/11800，和WO 99/49058)，色氨酸脱羧酶(专利申请：WO 99/06581)，苏氨酸脱羧酶(美国专利5,534,421和5,942,660,专利申请：WO 95/19442)，苏氨酸脱氨酶(专利申请：WO 99/02656，和WO 98/55601)，和天门冬氨酸激酶(美国专利5,367,110；5,858,749；和6,040,160)。

优选的淀粉分支酶包括那些列举在美国专利6,232,122和6,147,279；和专利申请WO 97/22703中的酶。

此外，启动子和结构性核酸序列可以设计成下调(downregulate)特定核酸序列。这一般是通过将启动子连接到结构性核酸序列上来实现，该序列以反义方向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被反面调节。

这种调控的靶点可能包括具有低必需氨基酸含量的多肽，但是这种多肽在特定组织中以相对较高水平被表达。例如，β-伴球蛋白和大豆球蛋白在种子被丰富地表达，但是从必需氨基酸角度考虑是缺乏营养的。这种反义方法还可以被用于有效地从植物来源的饲料中去除不期望的蛋白质，如拒食素(如凝集素)、白蛋白和过敏原，或者下调参与降解期望的化合物如必需氨基酸的分解代谢酶。

改进的结构性核酸序列

本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的结构性核酸序列上，该核酸序列相对于启动子是异源的。这种结构性核酸序列可以被改进来产生各种期望的特性。例如，结构性核酸序列可以被改进来增加必需氨基酸的含量、提高氨基酸序列的翻译、改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)、将翻译产物转运到细胞内外的腔室、改善蛋白质稳定性、插入或删除细胞信号基序，增加植物细胞或器官的大小等等。

在优选实施方案中，结构性核酸序列被增强来编码至少一种和更加优选2，3，或4种必需氨基酸含量升高的多肽，这些必需氨基酸选自组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸。如果需要，还可以添加非必需氨基酸，从结构和营养上提高该多肽。特别适合于这种升高的结构性核酸序列包括那些编码天然多肽的序列，这些多肽以相对高的水平被表达，具有特别低的必需氨基酸含量或包含这两种情况。这种多肽的例子是种子贮存蛋白，如大豆球蛋白和β-伴球蛋白。其他合适的靶包括arcelin、菜豆蛋白、凝集素、玉米蛋白和白蛋白。

结构性核酸序列中的密码子使用

由于遗传密码的简并性，不同核苷酸密码子可以被用于编码特定氨基酸。宿主细胞通常具有密码子使用的选择模式。结构性核酸序列优选被构建来利用特定宿主细胞的密码子选择模式。这通常在被转化的宿主细胞中增强结构性核酸序列的表达。任何上述核酸和氨基酸序列可以被改进来体现含有它们的宿主细胞或生物体的优选密码子选择。在植物中进行最佳密码子使用的对结构性核酸序列的修饰在美国专利5,689,052中被描述。

结构性核酸序列的其他修饰

上述结构性核酸序列中的其他变体可以编码当与用于加工得到它们的蛋白质比较时具有相当或更好特性的蛋白质。突变包括删除、插入、截断、取代、融合、基序序列改组等。

对结构性核酸序列的突变可以以特定或随机的方式被导入，这两种方法是分子生物学领域的技术人员熟知的。还有许多定点突变技术，一般采用寡核苷酸来在结构性核酸序列的特定位点上导入突变。例子包括单链拯救(Kunkel等，1985)，特定位点消除(Deng和Nickloff，1992)，缺口保护(Vandeyar等，1988)，和PCR(Costa等，1996)。随机或非特异性突变可以化学试剂产生(综述，参见Singer和Kusmierek，1982)如亚硝基胍(Cerda-Olmedo等，1968；Guerola等，1971)，和2-氨基嘌呤(Rogan和Bessman，1970)；或通过生物学方法如通过增变株传代(Greener等，1997)。用于制备上面描述的改变的其他方法被描述在Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik(1985)；Frits Eckstein等(1982)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；和Osuna等(1994)。

这种修饰可能在氨基酸序列上产生保守或非保守的变化。保守变化是不改变最终的蛋白质的氨基酸序列的变化。在优选实施方案中，蛋白质具有约5个和约500个之间的保守变化，更加优选约10个和约300个之间的保守变化，甚至更加优选约25个和约150个之间的保守变化和最优选在约5个和约25个之间的保守变化或在约1个和约5个之间的保守变化。

非保守变化包括添加、删除和取代，这产生被改变的氨基酸序列。在优选的实施方案中，蛋白质具有约5个和约500个之间的非保守变化，更加优选约10个和约300个之间的非保守变化，甚至更加优选约25个和约150个之间的非保守变化和最优选在约5个和约25个之间的非保守变化或在约1个和约5个之间的非保守变化。

可以对本文公开的蛋白质序列和编码它们的核酸序列进行修饰，保留这些分子的期望特性。如下是基于改变蛋白质的氨基酸序列来产生相当的或可能是改进的第二代分子的讨论。氨基酸变化可以根据表2中给出的密码子来改变结构性核酸序列的密码子来实现。

氨基酸的密码子简并性

氨基酸	单字母	三字母	密码子
氨基酸	单字母	三字母	密码子	丙氨酸	A	Ala	GCA GCC GCG GCT
半胱氨酸	C	Cys	TGC TGT	丙氨酸	A	Ala	GCA GCC GCG GCT
半胱氨酸	C	Cys	TGC TGT	天冬氨酸	D	Asp	GAC GAT
谷氨酸	E	Glu	GAA GAG	天冬氨酸	D	Asp	GAC GAT
谷氨酸	E	Glu	GAA GAG	苯丙氨酸	F	Phe	TTC TTT
甘氨酸	G	Gly	GGA GGC GGG GGT	苯丙氨酸	F	Phe	TTC TTT
甘氨酸	G	Gly	GGA GGC GGG GGT	组氨酸	H	His	CAC CAT
异亮氨酸	I	Ile	ATA ATC ATT	组氨酸	H	His	CAC CAT
异亮氨酸	I	Ile	ATA ATC ATT	赖氨酸	K	Lys	AAA AAG
亮氨酸	L	Leu	TTA TTG CTA CTC CTG CTT	赖氨酸	K	Lys	AAA AAG
亮氨酸	L	Leu	TTA TTG CTA CTC CTG CTT	甲硫氨酸	M	Met	ATG
天冬酰胺	N	Asn	AAC AAT	甲硫氨酸	M	Met	ATG
天冬酰胺	N	Asn	AAC AAT	脯氨酸	P	Pro	CCA CCC CCG CCT
谷氨酰胺	Q	Gln	CAA CAG	脯氨酸	P	Pro	CCA CCC CCG CCT
谷氨酰胺	Q	Gln	CAA CAG	精氨酸	R	Arg	AGA AGG CGA CGC CGG CGT
丝氨酸	S	Ser	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	精氨酸	R	Arg	AGA AGG CGA CGC CGG CGT
丝氨酸	S	Ser	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	苏氨酸	T	Thr	ACA ACC ACG ACT
缬氨酸	V	Val	GTA GTC GTG GTT	苏氨酸	T	Thr	ACA ACC ACG ACT
缬氨酸	V	Val	GTA GTC GTG GTT	色氨酸	W	Trp	TGG
酪氨酸	Y	Tyr	TAC TAT	色氨酸	W	Trp	TGG

一些氨基酸可以被用于取代蛋白质序列中的其他氨基酸，而不使期望活性产生可评估的损失。因此，可预期地在肽序列或蛋白质序列或者它们的相应核酸序列中进行各种改变，而不使生物活性产生可检测的损失。

在进行这种改变时，考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指标在赋予一种蛋白质交互式生物学功能中的重要性是本领域认可的(Kyte和Doolittle，1982)。一般认为，氨基酸的相对亲水性特性产生生成的蛋白质的二级结构，该二级结构随后限定该蛋白质与其他分子的互作，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等。

可以根据每种氨基酸的疏水性和电荷特征赋予其亲水指数。即：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

本领域已知，一些氨基酸可以被其他具有相似亲水指数或值的氨基酸取代，并且仍然能够生成具有相似生物学活性的蛋白质，即仍然获得具有生物学功能的蛋白质。在进行这种改变中，亲水指数在±2内的氨基酸取代是优选的，亲水指数在±1内的氨基酸取代是更加优选的，亲水指数在±0.5内的氨基酸取代是最优选的。

本领域还理解，类似氨基酸的取代可以根据亲水性有效地进行。美国专利4,554,101指出蛋白质的最大局部平均亲水性受其邻近的氨基酸的控制，与蛋白质的生物学性质相关。如下亲水性值被赋予氨基酸：精氨酸/赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸/异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。

一般认为，一些氨基酸可以被其他具有相似亲水性值的氨基酸取代，并且仍然能够生成具有相似生物学活性的蛋白质，即仍然获得具有生物学功能的蛋白质。在进行这种改变中，亲水指数在±2内的氨基酸取代是优选的，亲水指数在±1内的氨基酸取代是更加优选的，亲水指数在±0.5内的氨基酸取代是最优选的。

如上简要描述，氨基酸取代是基于氨基酸侧链取代的相对相似性，如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特性的示例性取代是本领域技术人员已知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。如果相对于加工获得它们的未改进的多肽，生成的蛋白质具有改进的对瘤胃的抗性，增强对蛋白质水解降解的抵抗，或者同时具有改进的对瘤胃的抗性并增强对蛋白质水解降解的抵抗，被认为是不期望的改变也可以被使用。或者，进行改变以改善代谢酶的动力学。

在一个优选方面，被改进的蛋白质选自种子贮存蛋白质、脂肪酸途径酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶或淀粉分支酶。

重组载体

任何一种上面描述的启动子和结构性核酸序列可以在重组载体中被提供。重组载体一般包括，从5′到3′方向：引导结构性核酸序列转录的启动子和结构性核酸序列。合适的启动子和结构性核酸序列包括本文描述的那些。如果需要，重组载体还可以包括3′转录终止子、3′多聚腺苷酸化信号、其他非翻译核酸序列、转运和靶向核酸序列、可选择标记、增强子和操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。用于制备特别适合于植物转化的重组载体的方法被描述在美国专利4,971,908；4,940,835；4,769,061；和4,757,011中。这些类型的载体也已经被评述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。

用于在高等植物中表达核酸的典型载体是本领域熟知的，包括来自根癌农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体(Rogers等，1987)。其他可以用于植物转化的重组多肽包括pCaMVCN转化控制载体，也已经被描述(Fromm等，1985)。

在一个实施方案中，多个启动子在单构建体中被可操作地连接到任何结构基因的组合上。在优选实施方案中，任何1，2，3，4，5，或6或多种包含SEQ IDNO：1-4的核酸分子的组合在单个构建体中被可操作地连接到任何结构基因的组合上。在优选实施方案的另一个方面，核酸分子被修饰。这种修饰包括例如去除或添加一种或多种结构性或功能性的元件。

重组载体中的其他启动子

还可以在重组载体中提供一种或多种其他启动子。这些启动子可以被可操作地连接到，例如但不限于，任何上述的结构性核酸序列上。可选择地，启动子可以被可操作地连接到其他核酸序列上，如那些编码转运肽、可选择的标记蛋白的序列或反义序列。

这些其他的启动子可以根据将插入载体的细胞的类型来选择。此外，在细菌、酵母和植物中起作用的启动子都在本领域中被充分地教导。其他启动子还可以根据其调控特性来选择。这种特性的例子包括增强转录活性、可诱导性、组织特异性和发育阶段特异性。在植物中，可诱导的、病毒的或合成来源的、组成型活性的、时间调控的和空间调控的启动子都已经被描述(Poszkowski等，1989；Odell等，1985；Chau等，1989)。

常用的组成型启动子包括CaMV 35S启动子(Odell等，1985)、增强的CaMV 35S启动子、玄参(Figwort)花叶病毒(FMV)启动子(Richins等，1987)、甘露碱合成酶(mas)启动子，胭脂碱合成酶(nos)启动子和章鱼碱合成酶(ocs)启动子。

有用的可诱导的启动子包括被水杨酸或聚丙烯酸诱导的启动子(PR-1；Williams等，1992)，由应用安全剂诱导的启动子(替代苯磺酰胺除草剂；Hershey和Stoner，1991)、热休克启动子(Ou-Lee等，1986；Ainley等，1990)、来自菠菜亚硝酸盐还原酶结构性核酸序列的硝酸盐诱导的启动子(Back等，1991)、激素诱导的启动子(Yamaguchi-Shinozaki等，1990；Kares等，1990)、和与RuBP羧化酶小亚基和LHCP家族相关的光诱导的启动子(Kuhlemeier等，1989；Feinbaum等，1991；Weisshaar等，1991；Lam和Chua，1990；Castresana等，1988；Schulze-Lefert等，1989)。

有用的组织或器官特异性启动子的例子包括β-伴球蛋白，(Doyle等，1986；Slighton和Beachy，1987)和其他种子特异性启动子(Knutzon等，1992；Bustos等，1991；Lam和Chua，1991)。用于在种子中优先表达的植物功能性启动子包括来自植物储存蛋白和来自参与油料种子中的脂肪酸生物合成的启动子。这种启动子的例子包括来自这种的结构性核酸序列的5′调控区，如napin(Kridl等，1991)、菜豆蛋白、玉米蛋白、大豆胰岛素抑制剂、ACP、硬酯酰-ACP去饱和酶和oleosin。种子特异性调控还在EP 0255378中被讨论。

另一种示例性的种子特异性启动子是凝集素启动子。大豆种子中的凝集素启动子由单一的结构性核酸序列(Lel)编码，该序列仅在种子发育过程中被表达。凝集素结构性核酸序列和种子特异性启动子已经被表征，并被用于在转基因烟草植物中引导种子特异性表达(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。

重组载体中的其他特别优选的启动子包括胭脂碱合成酶(nos)、甘露碱合成酶(mas)和章鱼碱合成酶(ocs)启动子，在根癌农杆菌的肿瘤诱导质粒中携带这些启动子；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子；增强的CaMV 35S启动子；玄参花叶表达病毒(FMV)35S启动子；来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚基的光诱导启动子(ssRUBISCO)；烟草EIF-4A启动子(Mandel等，1995)；玉米蔗糖合成酶1(Yang和Russell，1990)；玉米乙醇脱氢酶1(Vogel等，1989)；玉米集光(light harvesting)复合物(Simpson，1986)；玉米热休克蛋白(Odell等，1985)；来自拟南芥的几丁质酶启动子(Samac等，1991)；来自椰菜的LTP(脂肪转运蛋白)启动子(Pyee等，1995)；矮牵牛查耳酮异构酶(Van Tunen等，1988)；豆富含甘氨酸的蛋白1(Keller等，1989)；马铃薯patatin(Wenzler等，1989)；来自玉米的泛素启动子(Christensen等，1992)；和来自稻的肌动蛋白启动子(McElroy等，1990)。

其他启动子优选是种子选择性的、组织选择性的、组成型的或可诱导的。启动子最优选为胭脂碱合成酶(nos)、章鱼碱合成酶的(ocs)、甘露氨酸合成酶(mas)的花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S，CaMV35S)、增强的CaMV(eCaMV)、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)、玄参花叶病毒(FMV)、CaMV来源的AS4、烟草RB7、小麦POX1、烟草EIF-4、凝集素蛋白(Lel)或稻RC2启动子。

具有其他结构性核酸序列的重组载体

重组载体可能还含有一种或多种其他结构性核酸序列。这些其他结构性核酸序列一般是适合于用在重组载体中的任何序列。这种结构性核酸序列包括但是不限于上述序列。其他结构性核酸序列还可以被可操作地连接到任何上述启动子上。一种或多种结构性核酸序列可以各自地被连接到各个启动子上。可选择地，结构性核酸序列可以被可操作地连接到单一启动子上(即单一操纵子)。

其他结构性核酸序列包括但是不限于那些编码种子储存蛋白、脂肪酸途径酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶和淀粉分支酶的核酸。

优选的种子储存蛋白质包括玉米蛋白(美国专利4,886,878；4,885,357；5,215,912；5,589,616；5,508,468；5,939,599；5,633,436；和5,990,384；专利申请：WO 90/01869，WO 91/13993，WO 92/14822，WO 93/08682，WO94/20628，WO 97/28247，WO 98/26064，和WO 99/40209)，7S蛋白质(美国专利5,003,045和5,576,203)，巴西坚果蛋白(美国专利5,850,024)，无苯丙氨酸蛋白(专利申请：WO 96/17064)，白蛋白(专利申请：WO 97/35023)，β-伴球蛋白(专利申请：WO 00/19839)，11S(美国专利6,107,051)，α-hordothionin(美国专利5,885,802和5,88,5801)arcelin种子储存蛋白(美国专利5,270,200)凝集素(美国专利6,110,891)和麦谷蛋白(美国专利5,990,389和5,914,450)。

优选的脂肪酸途径酶包括硫酯酶(美国专利5,512,482；5,530,186；5,945,585；5,639,790；5,807,893；5,955,650；5,955,329；5,759,829；5,147,792；5,304,481；5,298,421；5,344,771；和5,760,206)和去饱和酶(美国专利5,689,050；5,663,068；5,614,393；5,856,157；6,117,677；6,043,411；6,194,167；5,705,391；5,663,068；5,552,306；6,075,183；6,051,754；5,689,050；5,789,220；5,057,419；5,654,402；5,659,645；6,100,091；5,760,206；6,172,106；5,952,544；5,866,789；5,443,974；和5,093,249)。

优选的生育酚生物合成酶包括tyrA，slr1736，ATPT2，dxs，dwr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，tMT2，AANT1，slr1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体(Kridl等，Seed Sci.Res.，1：209：219(1991)；Keegstra，Cell，56(2)：247-53(1989)；Nawrath，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，91：12760-12764(1994)；Xia等，J.Gen.Microbiol.，138：1309-1316(1992)；Cyanobase http://www.kazusa.or.jp/cyanobase；Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(5)：2105-2110(1998)；Takahashi等Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(17)：9879-9884(1998)；Norris等，Plant Physiol.，117：1317-1323(1998)；Bartley和Scolnik，Plant Physiol，104：1469-1470(1994)；Smith等，Plant J.，11：83-92(1997)；WO 00/32757；WO00/10380；Saint Guily等，Plant Physiol.，100(2)：1069-1071(1992)；Sato等.，J.DNA Res.，7(1)：31-63(2000))。

优选的氨基酸生物合成酶包括邻氨基苯甲酸合成酶(美国专利5,965,727，专利申请：WO 97/26366，WO 99/11800和WO 99/49058)，色氨酸脱羧酶(专利申请：WO 99/06581)，苏氨酸脱羧酶(美国专利5,534,421和5,942,660；专利申请：WO 95/19442)，苏氨酸脱氨酶(专利申请WO 99/02656和WO 98/55601)，和天冬氨酸激酶(美国专利5,367,110；5,858,749和6,040,160)。

优选的淀粉分支酶包括在美国专利6,232,122和6,147,279以及专利申请WO 97/22703中列举的那些。

可选择地，第二条结构性核酸序列可能被设计来下调特定核酸序列。这一般通过将该第二条结构性氨基酸以反义方向可操作地与启动子连接来实现。本领域技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列以这种方式被负调控。优选的靶核酸序列含有低含量的必需氨基酸，但是在特定组织中以较高水平被表达。例如，β-伴球蛋白和大豆球蛋白在种子中被丰富地表达，但是从必需氨基酸来考虑是缺乏营养的。这种反义方法也可以被用于有效地从植物来源的foodstuff去除其他不期望的蛋白质，如拒食素(如凝集素)、白蛋白和过敏原，或者下调参与降解期望的化合物如必需氨基酸的分解代谢酶。

可选择的标记

载体或构建体还可以包括可选择的标记。可选择的标记还可以被用于选择含有外源遗传物质的植物或植物细胞。这种例子包括但是不限于：neo基因(Potrykus等，1985)，其编码卡那霉素抗性，可以用卡那霉素、RptII、G418、hpt等选择；bar基因，其编码bialaphos抗性；突变EPSP合成酶基因(Hinchee等，1988；Reynaerts等，1988)；aadA(Jones等，1987)，其编码草甘膦抗性；腈水解酶基因，其赋予对bromoxynil的抗性(Stalker等，1988)；突变的乙酰乙酸合成酶基因(ALS)，其赋予咪唑酮和磺脲抗性(欧洲专利申请154,204(1985))，ALS(D′Halluin等，1992)，和甲氨蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等，1988)。可选择的标记优选是抗生素抗性编码序列或除草剂(例如，草甘膦)抗性编码序列。可选择的标记最优选为卡那霉素、潮霉素或除草剂抗性标记。

载体或构建体还可以包括筛选标记。筛选标记可以被用以监控表达。示例性的筛选标记包括：β-葡萄糖苷酸酶或uidA基因(GUS)，其编码其各种发光底物已知的酶(Jefferson，1987)；R-基因座基因，其编码在植物组织中调节花色苷色素(红色)生成的产物(Dellaporta等，1988)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等，1978)，编码一种各种发光底物已知的酶的基因(例如PADAC，发光头孢菌素(cephalosporin))；荧光素酶基因(Ow等，1986)；xylE基因(Zukowsky等，1983)，其编码能够转化发光的儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikatu等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，其编码能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌的酶，随后多巴醌浓缩为黑色素；α-半乳糖苷酶，其转化发光的α半乳糖底物。

术语或短语“可选择的或筛选的标记基因”中包括的还有编码可选择标记的基因，这些可选择标记的分泌可以被检测来作为鉴定或选择被转化的细胞的手段。例子包括编码可以被抗体作用确定的可分泌抗原标记，或者甚至是可以酶促地检测的可分泌酶。可分泌蛋白分为许多种类，包括可检测的小的扩散性蛋白(如通过ELISA)，在细胞外溶液中可检测的小的活性酶(如α-淀粉酶，β-内酰胺酶，膦丝菌素转移酶)或者被插入或捕获在细胞壁上的蛋白质(例如包括先导序列的蛋白质如存在于延展的表达单位中的蛋白或烟草PR-S)。其他可能的可选择的和/或可筛选的标记基因对于本领域技术人员来说是显而易见的。

重组载体中的其他元件

各种顺式作用非翻译的5′和3′调控序列可以被包括在重组核酸载体中。任何一种这样调控序列可以与其他调控序列一起被提供在重组载体中。这种组合可以被设计和改进来产生期望的调控特性。

3′非翻译区通常具有转录终止信号和聚腺苷酸化信号，聚腺苷酸化信号在植物中起作用来将腺苷酸添加到mRNA的3′端。这些元件可以从胭脂碱合成酶(nos)编码序列、大豆7Sα′储存蛋白编码序列、arcelin-5编码序列、白蛋白编码序列和豌豆ssRUBlSCO E9编码序列的3′区获得。一般地，位于多聚腺苷酸化位点下游的数百个碱基对的核酸序列起终止转录的作用。这些区域是被转录mRNA有效多聚腺苷酸化所必需的。

转录增强子也可以被结合作为重组载体的一部分。因此，重组载体优选地含有一个或多个5′非翻译前导序列，其起增强核酸序列表达的作用。这种增强子序列可能有望增加或改变生成的mRNA的转录效率。优选的5′核酸序列包括dSSU 5′、PetHSP70 5′和GmHSP17.9 5′(美国专利5,362,865)。

重组载体可能还包含编码转运肽的核酸序列。这种肽可以被用于引导蛋白质到细胞外区域、质体或到细胞内外的一些其他腔室(参见，如EP0218571、美国专利4,940,835；5,88,624；5,610,041；5,618,988和6,107,060)。

重组载体中的结构核酸序列可能包含内含子。该内含子对于结合性核酸序列来说可能是异源的。优选的内含子对于单子叶植物包括水稻肌动蛋白内含子和玉米HSP70内含子，对于双子叶植物包括豌豆rbcS3A内含子和矮牵牛花SSU301内含子。

融合蛋白

任何上述的结构性核酸序列及其改进形式可以与其他核酸序列连接来编码融合蛋白。其他核酸序列优选编码至少1种氨基酸、肽或蛋白质。存在许多可能的融合组合。

例如，融合蛋白可能提供一种“标记”的表位来方便融合蛋白的检测，例如，GST，GFP，FLAG，或多聚HIS。这种融合优选编码1-50个氨基酸，更加优选5-30个其他的氨基酸，甚至最优选在5-20个氨基酸。

可选择地，融合可能具有调控、酶促、细胞信号或细胞内转运的功能。例如，编码质粒转运肽的序列可以被添加来引导融合蛋白到种子中的叶绿体中。这种融合配偶体优选编码1-1000个其他氨基酸，更加优选5-500个其他氨基酸，和甚至更加优选10-250个氨基酸。

序列分析

在本发明中，序列相似性或同一性优选采用序列分析软件包^TM的“BestFit”或“Gap”程序来确定(版本10；Genetics Computer Group，Inc.，University ofWisconsin Biotechnology Center，Madison，WI)。“Gap”采用Needleman和Wunsch(Needleman和Wunsch，1970)的算法来寻找两条序列的排列，这种排列使匹配数量最大化和缺口数量最小化。“BestFit”进行两条序列之间的相似性的最好片段的最佳排列。最佳排列采用Smith和Waterman(Smith andWaterman，1981；Smith等，1983)的局部同源性算法通过插入缺口来最小化匹配数量来发现。

上面描述的序列分析软件包含有大量其他有用的序列分析工具来确定本公开的核苷酸和氨基酸序列的同系物。例如，“BLAST”程序在特定数据库(例如由Bethesda，MD的国家生物信息中心(NCBI)维护的序列数据库)中检索与被检索的序列(肽或核酸)相似的序列；“FastA”(Lipman和Pearson，1985；参见还有Pearson和Lipman，1988；Pearson，1990)进行Pearson和Lipman检索来确定被检索序列与一组相同类型(核酸或蛋白质)的序列之间的相似性。“TfastA”进行Pearson和Lipman检索来确定一种蛋白质的被查询序列与任何一组核苷酸序列(在进行比较之前，以所有6种阅读框翻译核苷酸序列)之间的相似性；“FastX”进行Pearson和Lipman检索来确定被检索的核酸序列与一组蛋白质序列之间的相似性，考虑移码。“TfastX”进行Pearson和Lipman检索来确定被检索的蛋白质序列与任何一种核苷酸序列之间的相似性，考虑移码(在进行比较之前，翻译核酸序列的两条链)。

探针和引物

能够特异性地杂交到互补性核酸序列上的短核酸序列可以被制备，并被用于本发明。这种短的核酸分子可以被用作探针来鉴定在特定样本中是否存在互补的核酸序列。因此，通过构建与特定核酸序列的小部分互补的核酸探针，核酸序列的存在可以被检测和评价。

可选择地，短的核酸序列可以被用作寡核苷酸引物，采用PCR技术来扩增或突变互补的核酸序列。这些引物可能还方便扩增相关互补的核酸序列(例如，来自其他物种的相关核酸序列)。

短的核酸序列可以被用作引物和特异地作为PCR引物。PCR探针是能够在双链结构中与其他核酸一起起始聚合酶活性的核酸分子。本领域存在各种用于确定PCR引物结构的方法和PCR技术。采用程序如Primer3问(www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)，STSPipeline(www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www.STSPipeline)或者GeneUp(Pesole等，1998)在计算机中进行的检索可以被用于确定潜在的PCR引物。

任何本文公开的核酸序列可以被用作引物或探针。这些探针或引物的使用极大地方便确定转基因植物，该转基因植物含有本发明公开的启动子和结构性核酸序列。这种探针或引物还可以被用于筛选与本申请公开的启动子和结构性核酸序列相关或具有同源性的其他核酸序列的cDNA或基因组文库。

引物或探针通常与被鉴定、扩增或突变的核酸序列的一部分互补，该序列足够长以与其互补体形成稳定的和序列特异性的双链核酸分子。引物或探针优选为长约10到约200个核苷酸，更加优选为长约10到约100个核苷酸，甚至更加优选为长约10到约50个核苷酸，和最优选为长约14到约30个核苷酸。

引物或探针例如但是不限于通过直接化学合成、通过PCR(美国专利4,683,195和4,683,202)或通过从较大的核酸分子上切除核酸特异性片段来制备。

转基因植物和转化的植物宿主细胞

本发明还涉及转基因植物和转化的宿主细胞，其包含被可操作地连接到异源的结构性核酸序列的启动子。其他核酸序列也可能与启动子和结构性核酸序列一起被导入到植物或宿主细胞中。这些其他序列可能包括3′转录终止子、3′多聚腺苷酸信号、其他的非翻译核酸序列、转运或靶向序列、可选择标记、增强子和操纵子。上面描述了本发明的优选核酸序列，包括重组载体、结构性核酸序列、启动子和其他调控元件。

在本发明的进一步实施方式中，此处描述的任何启动子序列均可用于表达改善植物总的幼苗活力的基因。在优选实施方式中，本发明的具有改善的幼苗活力的植物包含SEQ ID NO：1或2所示的序列。在此处，幼苗所具有的“改善的幼苗活力”是指相对于具有类似遗传背景但缺乏本发明启动子序列的植物而言，所述幼苗的活力被改善。

在本发明的进一步实施方式中，此处描述的任何启动子序列均可用于表达改善幼苗植株的生长率的基因。在优选实施方式中，本发明的具有改善的幼苗生长率的植物包含SEQ ID NO：1或2所示的序列。在此处，幼苗所具有的“改善的生长率”是指相对于具有类似遗传背景但缺乏本发明启动子序列的植物而言在相同生长阶段，所述幼苗的生长速度更快。

在本发明的进一步实施方式中，此处描述的任何启动子序列均可用于表达能够延长植物在种子饱满充实(fill its seed)阶段的时间的基因。在优选实施方式中，对种子的饱满包括大豆植物中对豆荚的饱满和玉米中对玉米籽的饱满。

在本发明的另一实施方式中，此处描述的任何启动子序列均可用于表达改变植物的库容强度调节(sink strength regulation)以增强种子中谷粒的饱满率。在此处，“改变”植物的库容强度调节指相对于类似遗传背景但缺乏本发明启动子序列的植物而言，增加或降低植物的库容强度调节。

在本发明另一实施方式，此处描述的任何启动子序列均可用于表达调节或增强种子活力或种子贮藏性能，以改善出苗率(stand count)和/或产量。

在优选实施方式中，转基因植物或转化宿主细胞中包含种子启动子。在最优选实施方式中，转基因植物和转化宿主细胞包含本发明此处描述的任何核酸分子，包括选自SEQ ID NOs：1-4所示序列及其互补序列的核酸分子。

在特别优选实施方式中，本发明转基因植物是大豆植物。在优选实施方式中，本发明的大豆包含植株被导入一或多个本发明的核酸分子。在优选实施方式中，本发明的转化的大豆植株包含选自SEQ ID NOs：1-4所示序列的核酸分子。在优选实施方式中，本发明转化的大豆植株包括含SEQ ID NOs：1所示序列的核酸分子。

用于制备这种重组载体的方法在本领域是熟知的。例如，用于制备突变特别适合于植物转化的重组载体的方法被描述在美国专利4,971,908；4,940,835；4,769,061；和4,757,011中。这些载体也被评述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。

用于在细胞和高等植物中表达核酸的典型载体在本领域是熟知的，包括来自根癌农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体(Rogers等，1987)。可用于植物转化的其他重组载体也已经被描述(Fromm等，1985)。这种重组载体的元件包括但是不限于上面讨论的那些。

转化的宿主细胞通常是任何与本发明相容的细胞。转化的宿主植物或细胞可以是或来源于单子叶植物或双子叶植物，包括但是不限于，canola、海甘蓝(crambe)、玉米、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、Arabidopsisphaseolus、花生、紫花苜蓿、小麦、稻、燕麦、高梁、油菜籽、黑麦、tritordeum、粟类(millet)、酥油草(fescue)、多年生黑麦草(perennial ryefrass)、甘蔗、酸果(cranberry)、番木瓜(papaya)、香蕉、红花、油椰榈(oil palms)、亚麻(flax)、香瓜(muskmelon)、苹果、黄瓜、石斛兰(dendrobium)、唐菖蒲(gladiolus)、菊花(chrysanthemum)、百合(liliacea)、棉花、桉树(eucalyptus)、向日葵、芸苔(Brassica campestris)、欧洲油菜(Brassica napus)、草坪草(turfgrass)、甜菜(sugarbeet)、咖啡(coffee)和薯蓣属(dioscorea)(Christou，Particle Bombardnzentfor Genetic Engineering of Plants，Biotechnology Intelligence Unit，学院出版社，圣地亚哥，加利福尼亚(1996))，canola、玉米、芸苔、欧洲油菜、油菜籽、大豆、红花、小麦，水稻和向日葵是优选的，而canola、油菜籽、玉米、芸苔，欧洲油菜、大豆、向日葵、红花、油椰子和花生是更加优选的。在特别优选的实施方案中，植物或细胞是或者来源于canola。在另一个特别优选实施方案中，植物或细胞是或来源于欧洲油菜。在另一个特别优选的实施方案中，植物或细胞是或者来源于大豆。

大豆细胞或植物优选是原种(elite)大豆品系。“原种品系”是任何从繁育和从优良的农学操作选择中可商业获得的品系。原种品系的例子包括并不限于下述的，如HARTZ^TM品种H4994，HARTZ^TM品种H5218，HARTZ^TM品种H5350，HARTZ^TM品种H5545，HARTZ^TM品种H5050，HARTZ^TM品种H5454，HARTZ^TM品种H5233，HARTZ^TM品种H5488，HARTZ^TM品种HLA572，HARTZ^TM品种H6200，HARTZ^TM品种H6104，HARTZ^TM品种H6255，HARTZ^TM品种H6586，HARTZ^TM品种H6191，HARTZ^TM品种H7440，HARTZ^TM品种H4452 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H4994RoundupReady^TM，HARTZ^TM品种H4988 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5000Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5147 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5247 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5350 RoundupReady^TM，HARTZ^TM品种H5545 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5855 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5088 RoundupReady^TM，HARTZ^TM品种H5164RoundupReady^TM，HARTZ^TM品种H5361 RoundupReady^TM，HARTZ^TM品种H5566 RoundupReady^TM，HARTZ^TM品种H5181 RoundupReady^TM，HARTZ^TM品种H5889 RoundupReady^TM，HARTZ^TM品种H5999 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H6013 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H6255 RoundupReady^TM，HARTZ^TM品种H6454 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H6686Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H7152 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H7550 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H8001 Roundup Ready^TM(HARTZSEED，Stuttgart，AR)；A0868，AG0901，A1553，A1900，AG1901，A1923，A2069，AG2101，AG2201，A2247，AG2301，A2304，A2396，AG2401，AG2501，A2506，A2553，AG2701，AG2702，A2704，A2833，A2869，AG2901，AG2902，AG3001，AG3002，A3204，A3237，A3244，AG3301，AG3302，A3404，A3469，AG3502，A3559，AG3601，AG3701，AG3704，AG3750，A3834，AG3901，A3904，A4045AG4301，A4341，AG4401，AG4501，AG4601，AG4602，A4604，AG4702，AG4901，A4922，AG5401，A5547，AG5602，A5704，AG5801，AG5901，A5944，A5959，AG6101，QR4459，and QP4544(Asgrow Seeds，Des Moines，IA)；DeKalb品种CX445(DeKalb，IL)。

本发明还涉及一种制备转化植物的方法，该植物从5′到3′方向包括被可操作地连接到异源结构性核酸序列的启动子。其他序列也可以与启动子和结构性核酸来一起被导入到植物中。这些其他可能包括3′转录终止子、3′多聚腺苷酸化信号、其他非翻译序列、转运或靶向序列、可选择标记、增强子和操作子。优选的重组载体、结构性核酸序列、启动子和其他调控序列包括但是不限于本文描述的那些。

这种方法通常包括选择合适的植物、用重组载体转化植物，获得转化的宿主细胞的步骤。

有许多用于将核酸导入植物的方法。合适方法包括细菌感染(如农杆菌)、双元人工染色体载体、直接呈递核酸(如通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的核酸摄取、电穿孔、用碳化硅纤维激发，和加速核酸包被的粒子等(在Potrykus等，1991中被评述))。

用于将核酸导入细胞中的技术是本领域技术人员熟知的。一般可以将方法分为四类：(1)化学方法(Graham和van der Eb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法如微注射(Capecchi，1980)、电穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；美国专利5,384,253)和粒子加速(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988)；和(4)受体介导的机制(Curiel等，1992；Wagner等，1992)。可选择地，可以通过直接注射植物生殖器官将核酸直接导入到花粉中(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988；Pena等，1987)。在另一个方面，核酸还可以被注射到未成熟的胚中(Neuhaus等，1987)。

本领域已经教导了从被转化的植物原生质体或外植体再生、发育和培养植物(Weissbach和Weissbach，1988；Horsch等，1985)。转化株通常在存在选择性培养液时被培养，该培养液选择被成功转化的细胞，并且包括再生植物幼苗(Fraley等，1983)。这种幼苗通常在2-4个月之内获得。

然后幼苗被转移到合适的诱导根的培养液中，该培养液含有选择试剂和防止细菌生长的抗生素。许多幼苗将会生长出根来。然后这些幼苗被转移到土壤或者其他介质中，使根继续发育。所概述的方法通常根据所选用的特定植物而改变。

优选地，再生的转基因植物是自花授粉的，产生纯合的转基因植物。可选择地，从再生转基因植物中获得的花粉可以与非转基因植物杂交，优选与农业上重要的品种的近交系杂交。相反，来自非转基因植物的花粉可以被用于对再生的转基因植物授粉。

转基因植物可以将编码增强基因表达的核酸序列传递给其后代。转基因植物优选是编码增强基因表达的核酸纯合的，并且通过有性繁殖将该序列传递给所有其后代。后代可能从由转基因植物生成的种子中生长得到。然后，这些额外的植物被自花授粉来产生该植物的真正繁殖品系。

评价来自这些植物的后代的基因表达。基因表达可以通过许多常规方法如western印迹、northern印迹、免疫沉淀和ELISA来检测。

本发明的植物或试剂可以被用于方法中，例如但是不限于，来获得在其中表达结合核酸分子的种子，获得结构基因产生升高的种子，获得结构基因产生升高的食物，获得结构基因产生升高的原种和获得结构基因产生升高的油。

被用于这种方法中的植物可以被加工。植物或植物部分可以被与其他植物部分分开或分离。用于该目的的优选植物部分是种子。一般认为，甚至在与其他植物部分分开或分离后，被分离或分开的植物部分可能被其他植物部分污染。在优选方面，被分开的植物部分超过被分开的物质的约50％(w/w)，更加优选地，超过被分开的物质的约75％(w/w)，和甚至更加优选超过被分开的物质的约90％(w/w)。通过这种方法生成的本发明的植物或植物部分可以用已知技术加工成产品。优选的产品是食物、原种(feedstock)和油。

饲料、食物、蛋白质和油的制备物

任何本发明的植物或其部分可以被加工来制备饲料、食物、蛋白质或油制备物。用于该目的的特别优选的植物部分是种子。在优选实施方案中，饲料、食物、蛋白质或油制备物是给反刍动物设计的。制备饲料、食物、蛋白质或油制备物的方法在本领域是熟知的。参见，如美国专利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669；和6,156,227。在优选实施方案中，蛋白质制备物是高蛋白制备物。这种高蛋白制备物优选具有超过约5％w/v的蛋白质含量，更加优选超过约10％w/v，和甚至更加优选超过约15％w/v。在优选的油制备物中，油制备物是高油含量的制备物，具有来自本发明的植物或其部分的油成分，超过约5％w/v，更加优选超过约10％w/v，和甚至更加优选超过约15％w/v。在一个优选实施方案中，油制备物是液体，体积超过约1，约5，约10，或约50L。本发明提供从本发明的植物制备或通过本发明的方法生成的油。这种油可以是任何生成的产物的次要或主要成分。而且，这种油可以与其他油混合。在更加优选的实施方案中，从本发明的植物制备或由本发明的方法生成的油在体积或重量上组成任何产物的油成分的约0.5％，约1％，约5％，约10％，约25％，约50％，约75％，或约90％以上。在另一个优选实施方案中，油制备物被混合，在体积上占该混合物的约10％，约25％，约35％，约50％，或约75％以上。从本发明的植物中制备的油可以与一种或多种有机溶剂或石油馏出物混合。

在另一个实施方案中，本发明的食物与其他食物混合。在优选实施方案中，从本发明的植物中制备的或通过本发明方法生成的食物在体积或重量上占任何产物的食物成分的约0.5％，约1％，约5％，约10％，约25％，约50％，约75％，或约90％以上。在另一个实施方案中，食物制备物可以被混合，并且在体积上占该混合物的约约10％，约25％，约35％，约50％，或约75％以上。

种子容器

植物的种子被放置在容器中。如在此所用，容器是任何能够装载这种种子的物体。容器优选含有超过约500，约1000，约5000，或约25000粒种子，其中至少约10％，约25％，约50％，约75％，或约100％的种子是来自本发明的植物。

育种程序

本发明的植物可以是育种程序的一部分或者来自育种程序。育种方法的选择取决于植物繁殖模式、被改进的特性的遗传性和商业上所用的栽培种的类型(如F₁杂合栽培种、纯系栽培种等)。被选择的非限制性的用繁殖本发明的植物的方法被列举在下文中。育种程序可以采用标记辅助性选择任何杂交后代来加强。还应当理解，任何商业性的和非商业性的栽培种可以被用于育种程序。因素如，emergence vigor、营养势(vegetative vigor)、应激耐受、抗病性、分枝、开花、结果、种子大小、种子密度、持久性和脱粒性等通常会决定该选择。

对于高度遗传的特性，选择在单个区域中被评价的优良个体植物是有效的，而对于低遗传力的特性，应当在从重复评价相关植物家族获得的平均值的基础上进行选择。常用的选择方法一般包括家谱选择、改进的家谱选择、群体选择和轮回选择。在优选实施方案中，进行回交或轮回育种程序。

遗传的复杂性影响育种方法的选择。回交育种可以被用于将一种或少数高度遗传的特性优良基因转移给期望的栽培种。这种方法已经被广泛地用于繁育抗病的栽培种。各种轮回选择技术被用于改进由大量基因控制的数量遗传特性。轮回选择在自花授粉的农作物中的用途取决于授粉的难易程度、每次自花授粉的成功杂交的频率和每次成功杂交的杂交后代的数量。

繁育品系可以被检测，在代表商业目标地区的环境下与合适的标准物比较两代或多代。最好的品系是新的商业栽培中的候选；那些仍然缺乏特性的品系可以被用作亲本来制备作为进一步选择的新群体。

一种确定较好的植物的方法是观察其相对于其他试验植物和相对于广泛种植的标准栽培种的性能。如果一次观察不是决定性的，重复观察可以提供对其遗传价值的较好评价。育种人员能够选择和杂交两种或多种亲本品系，接着通过重复自花授粉和选择，产生许多新的遗传组合。

开发新的栽培种需要开发和选择品种，杂交这些品种，和选择较好的杂合杂交。杂合的种子可以通过手工杂交被选择的雄性繁育亲本或者通过采用雄性不育体系来制备。根据某些单基因特性来选择杂种，如荚颜色、花的颜色、种子产量、软毛(pubescene)颜色或除草剂抗性，该特性表明种子是真正杂种。关于亲本品系的其他数据，以及杂种的表型，影响育种人员的决定是否继续特定的杂合杂交。

家谱育种和轮回选择育种方法可以被用于从繁育群体中开发栽培种。育种程序将来自两种或多种栽培种或各种广泛来源的期望特性结合到育种库(breeding pool)中，通过自花授粉和选择期望表型从育种库中开发栽培种。新的栽培种可以被评价来确定哪种具有商业潜能。

家谱育种通常被用来改进自花授粉的农作物。两个具有期望、互补特性的亲本进行杂交来制备F₁。通过自花授粉一株或多株F₁来制备F₂群体。从最好的家族中选择最佳个体。重复检测家族可以在F₄代开始进行来提高低遗传力的特性的选择效率。在近交的高级阶段(即F₆和F₇)，最好的品系或表型相似品系被检测作为新的栽培种的潜在释放。

回交育种已经被用于将简单遗传、高遗传特性的基因转移到期望的纯合栽培种或作为轮回亲本的近交品系中。被转移的特性的来源被称为供体亲本。生成的植物被期望具有轮回亲本(如栽培种)的特征和从供体亲本转移来的期望特性。在开始杂交后，具有供体亲本表型的个体被选择和重复与轮回亲本杂交(回交)。生成的亲本被期望具有轮回亲本(如栽培种)的特征和从供体亲本转移来的期望特性。

在严格意义上，单一种子传代程序是指种植一种分离群体，每棵植物收获一粒种子样本，并且使用该种子样本来种植下一代。当该群体已经从F₂发展到期望水平的近交程度时，产生品系的植物各自追溯到不同的F₂个体。由于一些种子未能够发芽或者一些植物不能生产至少一粒种子，群体中植物的数量逐代减少。结果，当世代进展完成时，并非所有最初被取样在群体中的F₂植物都被后代表现。

在多种子程序中，育种人员通常从群体的每棵植物中收获一个或多个荚，并将它们在一起脱粒来形成批量。批量的一部分被用来种植下一代，一部分被保存。该程序已经被称作为改进的单一种子传代或荚-批量技术。

多种子程序已经被用于在收获时节约劳力。用机器脱粒荚显著快于单一种子程序中通过手工从每个荚中取出种子。多种子程序还使得可能在每代近交中种植相同数量种子群体。

对于通常用于不同特性和农作物的其他育种方法的描述可以在一些参考书籍之一找到(如Fehr，Principles of Cultivar Development，1，2-3(1987))。

本发明的转基因植物还可以采用孤雌生殖方法繁殖。孤雌生殖是植物中的繁殖的遗传控制方法，其中胚乳不是通过卵子和精子的结合形成。有三种基本的孤雌生殖繁殖类型：1)其中胚在从核来源的胚囊中由染色体不减数的卵子发育得到的孤雌生殖，2)其中胚在从大孢子母细胞来源的胚囊中由染色体不减数的卵子发育得到的二倍数孢子形成(diplospory)，和3)胚直接从体细胞发育得到的不定胚生殖。在大多数孤雌生殖形式中，假受精或极体核受精来生成胚乳对于种子发育能力是必需的。在无孢子生殖中，保育栽培种可以被用作种子中胚乳形成的花粉来源。由于栽培种的不减数卵子孤雌发育，保育栽培种不影响无孢子生殖的单性生殖的栽培种的遗传学，而是可能生成胚乳。孤雌生殖在经济上是重要的，特别是在转基因植物中，因为无论多大的杂合程度，其使任何的基因型进行纯育。因此，通过孤雌生殖繁殖，杂合的转基因植物能够在整个重复的生活周期中保持其遗传的忠实性。用于制备孤雌生殖的植物的方法在本领域是已知的。参见，美国专利5,811,636。

实施例

提供如下实施例，并且这些实施例无论如何不被解释为限制本发明的保护范围。

实施例1

大豆lea9基因的启动子(Hsing，et al.，Plant Physiol.，100：2121-2122(1992))通过对大豆基因组DNA(cv.Asgrow 4922)进行PCR扩增获得，利用基于公开序列设计的下述引物：

引物编号lea9-5′

5′-ACCTGCGGCCGCCAAGTACTTACGCCACACCAACTTAC-3′(SEQID NO：5)；和

引物编号lea9-3′

5′-GCAGCTGTTTCCTTGATGGACTCTC-3′(SEQ ID NO：6).

所有寡核苷酸引物均获自于Gibco Life Technologies(Grand Island，NY)。初步PCR反应利用Taq DNA聚合酶试剂盒(Boehringer Mannheim，Germany)。嵌套式PCR反应在最初PCR反应之后进行，利用的引物是初步PCR反应的5′引物和lea9-3′nest′(GAAGATCTCCTGCAATTTCAAAGATC AATTATTTCC)(SEQ ID NO：7)。下面总述这些反应的成分：

初步PCR反应

成分用量

大豆基因组DNA(80ng/μl) 1.0μl

dNTP混合物(每一种dNTP为10mM) 1.0μl

引物lea9-5′(10μM) 1.0μl

引物lea9-3′(10μM) 1.0μl

10X PCR缓冲液(含有MgCl₂) 5μl(最终浓度为1X)

Taq聚合酶 1.0μl

蒸馏水补充到最终体积50μl

嵌套式PCR反应

成分用量

初步PCR反应的等份 1.0μl

dNTP混合物(每一种dNTP为10mM) 1.0μl

引物lea9-5′(10μM) 1.0μl

引物lea9-3′nest′(10μM) 1.0μl

10X PCR缓冲液(含有MgCl₂) 5μl(最终浓度为1X)

Taq聚合酶 1.0μl

蒸馏水补充到最终体积50μl

在加聚合酶之前，将反应混合液加热到95℃。起始(initial)和嵌套式PCR反应均从样品于94℃变性2分钟开始。进而反应混合液于由94℃30秒、72℃2.5分钟(-1℃/循环)组成的循环进行7次。然后，将反应混合液于由94℃30秒、68℃2分钟、72℃2分钟(seconds minutes)组成的循环进行30次，最后72℃下保持10分钟。再将反应液于4℃保持至下一步。

嵌套式PCR反应的产物进行琼脂糖凝胶电泳并用Qiagen Gel ExtractionKit(Qiagen，Valencia，California；产品编号Cat 28704)纯化。纯化的PCR产物的分成等份后，用限制性内切酶NotI和BglII(Promega，Madison，WI)进行消化，并连接到也用NotI和BglII进行切割而去除了e35S启动盒的pMON8677载体(图1)中。连接反应采用Boehringer-Mannheim(Germany，产品编号Cat#1635379)的Rapid DNA Ligation试剂盒，并按厂商推荐的方法进行操作。获得的构建体中，lea9启动子直接位于uidA(β-葡糖苷酸酶)报告基因的上游，称为pMON49801(图2)，用于瞬时检验分析。

连接反应液的等分用于转化合适的E.coli(DH5α)，将细胞涂布到选择培养基上，所用的选择培养基为含100μg/ml氨苄青霉素的Luria Broth培养基((LB)(10％细菌用胰蛋白胨(Bactotryptone)、5％酵母抽提物和10％NaCl)。选择的细菌转化体，于液体培养基中培养，进而用Qiaprep Spin Microprep Kit(Qiagen Corp.，Valencia，California)分离其质粒DNA。对根据限制性酶分析而含有预期插入大小纯质粒进行测序。

实施例2

拟南芥(Arabidopsis thaliana)的perl基因的启动子(Haslekas，et al.，PlantMol Biol.36：833-845(1998))通过对Arabidopsis(cv.Columbia)基因组DNA进行PCR扩增，利用基于公开序列设计的下述引物：

引物编号JA44

5′-GGATCCAAATCAAAGTTTAATAGACTT-3′(SEQ ID NO：8)；和

引物编号JA46

5′-TCTAGGTTCGGCACCGTGTCTC-3′(SEQ ID NO：9).

所有寡核苷酸引物均由Gibco Life Technologies(Grand Island，NY)提供。初步PCR反应用Expand High Fidelity PCR系统(Boehringer Mannheim，(Germany)，产品编号1732641)进行。在初步PCR反应之后，取初步反应产物1μl用嵌套式PCR引物进行第二轮反应，利用基于公开的序列的下述引物

引物编号JA45

5′-TAGCGGCCGCTAATAGACTTTGCACCTCCAT-3′(SEQ ID NO：10)；及

引物编号JA47

5′-AACCATGGTTTACCTTTTATATTTATATATAGAA-3′(SEQ ID NO：11)。

PCR反应成分和条件总述如下：

初步PCR反应

成分用量

拟南芥(Arabidopsis)基因组DNA 0.5μl(0.75μg)

dNTP混合物(每一种dNTP为10mM) 2.0μl

引物JA44(10μM) 3.0μl

引物JA46(10μM) 3.0μl

10X PCR缓冲液(含有MgCl₂) 10μl(最终浓度为1X)

聚合酶 0.75μl

蒸馏水补充到最终体积100μl

嵌套式PCR反应

成分用量

初步PCR反应的等份 1.0μl

dNTP混合物(每一种dNTP为10mM) 2.0μl

引物JA45(10μM) 3.0μl

引物JA47(10μM) 3.0μl

10X PCR缓冲液(含有MgCl₂) 10μl(最终浓度为1X)

聚合酶 0.75μl

蒸馏水补充到最终体积100μl

在加聚合酶之前，将反应混合液加热到95℃。初步和嵌套式PCR反应均从样品于94℃变性2分钟开始。反应混合液于由94℃15秒、60℃30秒和72℃90秒组成的循环进行10次。然后，将反应混合液于94℃15秒、60℃30秒、72℃30秒作为初始循环，而以后循环中的72℃50秒，共进行26个循环，每个额外循环50秒，最后72℃下保持7分钟。再将反应液于4℃保持至下一步使用。

PCR产物的等份25μl用于琼脂糖凝胶电泳分析。剩余的PCR产物用Qiagen PCR Purification Kit(Qiagen，INC.，Valencia，California，产品编号28104)按厂家推荐方法进行纯化。纯化的PCR产物分成等份后，用限制性内切酶NotI和NcoI(Promega，Madison，WI)进行消化，并连接到也用NotI和NcoI进行切割而去除了e35S启动盒的pMON8677载体(图1)中。连接反应采用Boehringer-Mannheim(Germany，产品编号Cat#1635379)的Rapid DNALigation试剂盒，并按厂商推荐的方法进行操作。获得的构建体中，AtPerl启动子直接位于uidA(β-葡糖苷酸酶)报告基因的上游，称为pMON42316(图3)。

连接反应液的等份用于转化合适的E.coli(DH5α)，将细胞涂布到选择培养基(含100μg/ml羧苄青霉素的LB培养基)。选择转化的细菌，于液体培养基(含100μg/ml羧苄青霉素的LB培养基)中生长，进而用Qiaprep SpinMicroprep Kit(Qiagen Corp.，Valencia，California)分离其质粒DNA。用限制性酶分析质粒是否含有预期大小的插入片段，纯化含有预期插入片段的质粒，并用引物JA45、JA47和称为GUS5′-2的引物进行测序，其中GUS5′-2的序列为5′-GTAACGCGCTTTCCCACCAACGCT(SEQ ID NO：12)，可与质粒的GUS编码区退火。克隆的AtPerl启动子序列与公开的启动子序列匹配。

实施例3

大豆Sle2基因的启动子(Calvo，et al.，Theor.Appl.Genet.，94：957-967(1997))通过对大豆基因组DNA(cv.Williams 82，购自Stratagene，La Jolla，California；产品编号946103)进行PCR扩增获得，基于公开序列，设计下述引物用于初步PCR反应：

引物编号JA41

5′-GTGTTACATTATCACTTATCCTGGTC-3′(SEQ ID NO：13)；和

引物编号Jeahre2

5′-GCTCAATTAACCCTCACTAAAGGGA-3′(SEQ ID NO：14).

寡核苷酸引物由Gibco Life Technologies(Grand Island，NY)提供。初步PCR反应用Expand Long Template PCR系统(Boehringer Mannheim，Germany，产品编号1681834)进行。

在初步PCR反应之后，取初步反应的1μl产物作为模板进行嵌套式PCR反应，嵌套式PCR引物基于公开的序列进行设计：

引物编号JA43

5′-CTCTTGAGCACGTTCTTCTCCT-3′(SEQ ID NO：15)；和

引物编号Jeahre2

5′-GCTCAATTAACCCTCACTAAAGGGA-3′(SEQ ID NO：16)。

两种PCR反应的成分和条件总述如下：

初步PCR反应

成分用量

大豆基因组DNA 1.0μl

dNTP混合物(每一种dNTP为10mM) 2.5μl

引物JA41(10μM) 1.0μl

引物Jeahre2(10μM) 1.0μl

10X PCR缓冲液#3(含有MgCl₂) 5μl(最终浓度为1X)

聚合酶混合物 0.75μl

蒸馏水补充到最终体积50μl

嵌套式PCR反应

成分用量

初步PCR反应的等份 1.0μl

dNTP混合物(每一种dNTP为10mM) 2.5μl

引物JA43(10μM) 1.0μl

引物Jeahre2(10μM) 1.0μl

10X PCR缓冲液#3(含有MgCl₂) 5μl(最终浓度为1X)

聚合酶混合物 0.75μl

蒸馏水补充到最终体积50μl

初步和嵌套式PCR反应均从样品于94℃变性2分钟开始。接着反应混合液于由94℃10秒、69℃30秒(-1.5℃/循环)组成的循环进行10次和68℃12分钟。然后，将反应混合液于由94℃10秒、58℃30秒和68℃12分钟组成的循环进行25次，最后于68℃下保持7分钟。再将反应液于4℃保持。在成功克隆和鉴定Sle2启动子区后，再用Expand High Fidelity PCR System(Boehringer Mannheim，Germany，产品编号1732641)再次扩增，利用下述引物：

引物编号JA53

5′-GTGCGGCCGCACTCAAAGTTTATTGAGTTTACTTAGAG-3′(SEQID NO：17)；和

引物编号JA54

5′-ACAGATCTGTTTCTCACACTTGCAAAATTCTCTC-3′(SEQ ID NO：18)。

该第三次反应是为了在克隆的5′和3′末端分别增加NotI和BglII限制性位点。

反应之后，High Fidelity PCR产物的等份25μl用于琼脂糖凝胶电泳分析。凝胶中的条带与预期大小(～1.3kb)相符，因而用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen，Valencia，California；产品编号28704)按所符详细方法进行纯化。纯化的PCR产物的等份，用限制性内切酶NotI和BglII(Promega，Madison，WI)进行消化，并连接到也用NotI和BglII进行切割而去除了e35S启动盒的pMON8677载体(图1)中。连接反应采用Boehringer-Mannheim(Germany，产品编号1635379)的Rapid DNA Ligation试剂盒，并按厂商推荐的方法进行操作。获得的构建体中，Sle2启动子直接位于uidA(β-葡糖苷酸酶)报告基因的上游，称为pMON42320(图4)。

细菌的转化按实施例1中描述的方法进行。基于限制酶酶切分析证实质粒含有预期大小的插入片段，纯化质粒，并用引物JA51、JA53、JA54、JA55和GUS 5′-2引物进行测序，其中：

JA51

5′-ATAGTACCCCAACACGCTAC-3′(SEQ ID NO：19)；

JA53

5′-GTGCGGCCGCACTCAAAGTTTATTGAGTTTACTTAGAG-3′(SEQID NO：20)；

JA54(SEQ ID NO：18)；

JA55

5′-GGAACCGAATATAATTGGCTC-3′(SEQ ID NO：21)；和

GUS 5′-2引物(SEQ ID NO：12)，可与质粒的GUS编码区退火。

实施例4

大豆凝集素启动子通过对大豆基因组DNA(cv.3237)进行PCR扩增获得。PCR反应采用Expand High Fidelity PCR System(Boehringer Mannheim，Germany，产品编号Cat#1732641)，并基于公开序列(Vodkin et.al.，Cell，34：1023-1231(1983))，设计下述引物用于初步PCR反应：

引物编号JA23

5′-GCCTTCCTGGTCAGTAGCACCAGTA-3′[SEQ ID NO：22]；和

引物编号JA25

5′-CCATGCCATCGTATCGTGTCACAAT-3′[SEQ ID NO：23]。

寡核苷酸引物均由Gibco Life Technologies(Grand Island，NY)提供。在初步PCR反应之后，取初步反应产物1μl进行嵌套式PCR反应，所用引物如下：

引物编号JA26

5′-AGGCGGCCGCCTGCAGATGGAATACAGCAATGAACAAATGC-3′(SEQ ID NO：24)；和

引物编号JA28

5′-CTCCATGGAGATCTTGCTTTGCTTCAGCTAAATTGCACT-3′(SEQID NO：25)。

该反应是为了在克隆的启动子5′和3′末端分别增加NotI和NcoI限制性酶克隆位点。

初步PCR反应的成分和条件总述如下：

初步PCR反应

成分用量

大豆基因组DNA 2.0μl

dNTP混合物(每一种dNTP为10mM) 1.0μl

引物JA23(10μM) 1.5μl

引物JA25(10μM) 1.5μl

10X PCR缓冲液#3(含有MgCl₂) 5μl(最终浓度为1X)

聚合酶混合物 0.75μl

蒸馏水补充到最终体积50μl

初步PCR反应的开始步骤是将样品加热到94℃保持2分钟。接着反应混合液于由94℃15秒、52℃30秒和72℃1分钟组成的循环进行10次。然后，将反应混合液于由52℃30秒和72℃1分钟组成的循环，进行20循环，并且每一循环后时间增加20秒，然后于72℃下保持7分钟为最后延伸，最后于4℃保持用于下面的培养。

嵌套式PCR反应的成分和条件总述如下：

嵌套式PCR反应

成分用量

初步PCR产物 1.0μl

dNTP混合物(每一种dNTP为10mM) 1.0μl

引物JA26(10μM) 1.5μl

引物JA28(10μM) 1.5μl

10X PCR缓冲液#3(含有MgCl₂) 5μl(最终浓度为1X)

聚合酶混合物 0.75μl

蒸馏水补充到最终体积50μl

嵌套式PCR反应的开始步骤是将样品加热到94℃变性2分钟。反应混合液于由94℃15秒、46℃30秒和72℃1分钟组成的循环进行10次。然后，将反应混合液于由94℃15秒和72℃1分钟组成的循环，进行20循环，并且每一循环后时间增加20秒，然后于72℃下保持7分钟为最终延伸，最后于4℃保持直到下一个操作步骤延伸培养。

嵌套式PCR之后，High Fidelity PCR反应的整个产物用琼脂糖凝胶分析。切出0.96Kb条带并用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen，Valencia，California；产品编号28704)进行纯化。纯化PCR产物的等份用限制性内切酶NotI和NcoI(Promega，Madison，WI)进行消化并连接到也用NotI和NcoI切割以去除e35S启动子盒(NBP#6301633)的pMON8677载体(图1)上。连接反应用Rapid DNA Ligation Kit(Boehringer-Mannheim，Germany，产品编号1635379)按厂家推荐方法进行。获得的构建体中，凝集素启动子直接位于uidA(β-葡糖苷酸酶)报告基因的上游，称为pMON42302(图5)。

连接反应液的等份用于转化合适的E.coli(DH5α)，将细胞涂布到选择培养基(含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基)。选择转化的细菌，于液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基)中生长，进而用Qiaprep SpinMicroprep Kit(Qiagen Corp.，Valencia，California)分离其质粒DNA。用限制性酶分析质粒是否含有预期大小的插入片段，纯化含有预期插入片段的质粒，并用引物JA26、JA28和GUS5′-2引物进行测序，其中GUS5′-2可与质粒的GUS编码区退火。克隆的凝集素启动子序列与Vodkin，et al.，(1983)公开的启动子序列匹配。

实施例5

该实施例描述由sle2和凝集素启动子控制的异源基因转化大豆植株。

载体构建

通过标准分子克隆方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning-A laboratorymanual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Maliga et al.，Methods inPlant Molecular Biology-A laboratory course manual，1995，Cold Spring HarborLaboratory Press)构建了两个根癌农杆菌载体。在两个载体即pMON66893(图10)和pMON66894(图11)中均包括了由FMV：Elflα启动子、CTP2和CP4编码基因和E93′UTR组成的表达盒用于选择标记。第三个载体pMON63682(图13)利用的是由FMV启动子、CTP2和CP4编码基因及E93′UTR组成的表达盒作为选择标记。在pMON66893(图10)中，凝集素启动子连接于由叶绿体转运肽CTP1和农杆菌邻氨基苯甲酸合成酶(AgroAS)构成的基因的上游。用NOS 3′UTR作为转录终止信号和聚腺苷酸化信号。载体pMON66894(图11)的构建类似于pMON66893，只是所用的启动子为sle2启动子而非凝集素启动子。载体pMON63682(图13)的构建也类似于pMON66893，使用Lea9启动子而不是凝集素启动子。

根癌农杆菌介导的大豆转化

上述载体通过三亲交配法转移到根癌农杆菌菌株ABI中(Ditta et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，77：7347-7351(1980))。并按已知方法制备用于转化的细菌细胞。

从商业途径获得的大豆种子(Asgrow A3244)萌发10-12小时。切取分生组织作为外植体，置于创伤管中，通过超声波进行创伤处理。创伤之后，加入上述的农杆菌培养物，将外植体孵育大约1小时。之后，用吸管去除农杆菌培养物，将外植体共培养2-4天。然后将外植体转移到选择培养基即Woody Plant Medium(McCown和Lloyd，Proc.International Plant PropagaionSoc.，30：421，(1981))，另加入75μM草甘膦和抗生素以抑制农杆菌的过度生长)，培养5-7周以使转基因苗得以选择和生长。在接种后大约5-7周，收集表型为阳性的苗，将其置于根选择培养基即含25μM草甘膦的BeanRooting Media(BRM)(Martinell，et al.；美国专利5914451)，培养2-3周。将产生根的苗转移到温室中盆栽于土壤中。在选择培养基上仍然健康，但没有产生根的苗转移到非选择根培养基(即不含草甘膦的BRM)，再培养两周。那些来自产根的任何苗的根进行筛选，在转移到温室盆栽之前，检测植物选择标记的表达。植株于标准温室条件下生长直到收获R1代种子。

游离氨基酸分析

利用下述程序分析每一转基因事件中的游离氨基酸水平。将来自每次转基因事件的种子单独压碎成细粉，并将大约50mg细粉转移到预称重的离心管中。记录样品的精确重量，在每一样品管中加入1.0ml 5％三氯乙酸。于室温下旋涡混合后，于Eppendorf离心机(Model 5415C，Brinkmann Instrument，Westbury，NY)以14,000rpm离心15分钟。取出(remove)上清液的等份并用HPLC(Agilent 1100)进行分析，其程序按Agilent Technical Publication″AminoAcid Analysis Using the Zorbax Eclipse-AAA Columns and the Agilent 1100HPLC，″March 17，2000中所述的进行。

结果表明具有由lea9、凝集素和sle2启动子控制的AgroAS基因的转化大豆中，在它们的种子中有更高水平的游离色氨酸。

实施例6

该实施例描述了在转化大豆植株中由lea9和perl启动子控制的表达分析，以检验在转基因大豆植株中lea9和perl启动子控制异源基因表达导致在种子中的氨基酸含量提高的效率。

载体构建

通过标准分子克隆方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning-A laboratorymanual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Maliga et al.，Methods inPlant Molecular Biology-A laboratory course manual，1995，Cold Spring HarborLaboratory Press)构建4个根癌农杆菌载体。在所有4个载体中均包含由FMV启动子(包括HSP70前导序列)、CTP2和CP4编码基因和E93′UTR组成的表达盒作为选择标记。在载体pMON69650(图6)中，lea9启动子连接于C28玉米的邻氨基苯甲酸合成酶(Anderson et AL.；美国专利6,118,047)的对色氨酸不敏感α-亚基的上游。用NOS 3′UTR作为转录终止信号和聚腺苷酸化信号。载体pMON696514(图7)的构建类似于pMON69650，只是所用的启动子为per1启动子而非凝集素启动子，控制相同的C28玉米邻氨基苯甲酸合成酶的对色氨酸不敏感的α-亚基。载体pMON63662包括(图12)的遗传元件与pMON69651相同，但有两套边界序列将目标基因与选择标记分开，以使标记与邻氨基苯甲酸合成酶基因能够独立分离。

载体pMON64210(图8)和pMON64213(图9)设计用于揭示对多个途径同时去调节(deregulation)的效果。pMON64210和pMON64213两者均包含由7Sα′启动子控制的C28玉米邻氨基苯甲酸合成酶的对色氨酸不敏感的α-亚基和NOS 3′UTR。此外，pMON64210还包含由lea9启动子控制拟南芥(Arabidopsis)SSU CTP和Ile-不敏感苏氨酸脱氨酶的融合蛋白(Gruys et al；美国专利5,942,660)和Arc5 3′UTR。载体pMON64213的构建与pMON64210相似，只不过用per1启动子取代lea9，调控相同的C28玉米邻氨基苯甲酸合成酶的对色氨酸不敏感的α-亚基。

根癌农杆菌介导的大豆转化

从商业途径获得的大豆种子(Asgrow A3244)萌发10-12小时。切取分生组织作为外植体，置于创伤管中，通过超声波进行创伤处理。创伤之后，加入上述的农杆菌培养物，将外植体孵育大约1小时。之后，用吸管去除农杆菌培养物，将外植体共培养2-4天。然后将外植体转移到选择培养基即由Woody Plant Medium组成(McCown和Lloyd，Proc.International PlantPropagation Soc.，30：421，(1981))，另加入75μM草甘膦和抗生素以抑制农杆菌的生长)，培养5-7周以使转基因苗得以选择和生长。在接种后大约5-7周，收集表型为阳性的苗，将基置于根选择培养基即含25μM草甘膦的BeanRooting Media(BRM)(Martinell，et al.；美国专利5914451)，培养2-3周。将产生根的苗转移到温室中盆栽于土壤中。在选择培养基上仍然健康，但没有产生根的芽转移到非选择性根培养基(即不含草甘膦的BRM)，再培养两周。对那些来自经过筛选产根的苗的根，在转移到温室盆栽之前，检测植物选择标记的表达。植株于标准温室条件下生长直到收获R1代种子。

游离氨基酸分析

利用下述程序分析每一转基因事件中的游离氨基酸水平。将来自每次转基因事件的种子单独压碎成细粉，并将大约50mg细粉转移到预称重的离心管中。记录样品的精确重量，在每一样品管中加入1.0ml 5％三氯乙酸。于室温下旋涡混合后，于Eppendorf离心机(Model 5415C，Brinkmann Instrument，Westbury，NY)以14,000rpm离心15分钟。取出上清液的等份并用HPLC(Agilent 1100)进行分析，其程序按Agilent Technical Publication″Amino AcidAnalysis Using the Zorbax Eclipse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC，″March 17，2000中所述的进行。

上述分析的数据列如下面的表中。因为来自每一事件的R1种子代表了一个分离种子群，对每一事件，取10个被分析种子，选择具有最高色氨酸含量的种子作为同源基因型的代表。从Asgrow3244中随机选择10个非转基因种子也进行同样的分析。具有最高色氨酸水平的种子作为阴性对照。数据表明，由lea9和perl启动子控制Asα基因的表达(分别是pMON69650和pMON69651)时，色氨酸含量增加。具有由lea9和perl启动子控制TD基因的(分别是pMON64210和pMON64213)的转化植株中，色氨酸和异亮氨酸的含量增加。

使用pMON69650的转基因大豆种子中的色氨酸的积累量

事件号	Trp(ppm)
事件号	Trp(ppm)	A3244	307
pMON69650-1	3548	A3244	307
pMON69650-1	3548	2	2339
3	990	2	2339
3	990	4	2983
5	2455	4	2983
5	2455	6	2761
7	2720	6	2761
7	2720	8	3949
9	1865	8	3949
9	1865	10	407
11	2880	10	407

12	2062
12	2062	13	3170
14	3504	13	3170
14	3504	15	1723
16	1260	15	1723
16	1260	17	708
18	1878	17	708
18	1878	19	1490
20	2437	19	1490
20	2437	21	7160
22	2792	21	7160
22	2792	23	1292
24	2333	23	1292
24	2333	25	696
26	1513	25	696
26	1513	27	2390
28	3636	27	2390
28	3636	29	871
30	433	29	871
30	433	31	2122
32	2116	31	2122
32	2116	33	665
34	435	33	665

使用pMON69651的转基因大豆种子中的色氨酸的积累量

事件号	Trp(ppm)
事件号	Trp(ppm)	A3244	307
pMON69651-1	3249	A3244	307
pMON69651-1	3249	2	3284
3	4649	2	3284
3	4649	4	2808
5	3832	4	2808
5	3832	6	2264
7	4400	6	2264
7	4400	8	2854
9	5160	8	2854
9	5160	10	5479
11	2647	10	5479

12	4079
12	4079	13	2994
14	3946	13	2994
14	3946	15	5511
16	515	15	5511
16	515	17	958
18	2764	17	958

用pMON64210的转基因大豆种子中的色氨酸和异亮氨酸的积累量

事件号	ILE(ppm)	TRP(ppm)
事件号	ILE(ppm)	TRP(ppm)	A3244	182.4	86.9
pMON64210-1	8829.6	774.7	A3244	182.4	86.9
pMON64210-1	8829.6	774.7	2	14933.3	1763.3
3	21474.8	1928.1	2	14933.3	1763.3
3	21474.8	1928.1	4	21892.9	2500.0
5	21117.8	2489.4	4	21892.9	2500.0
5	21117.8	2489.4	6	20639.7	2451.2
7	1843.1	347.8	6	20639.7	2451.2
7	1843.1	347.8	8	19124.1	1755.5
9	10000.0	1395.5	8	19124.1	1755.5
9	10000.0	1395.5	10	15728.8	1305.1
11	21992.6	1988.9	10	15728.8	1305.1
11	21992.6	1988.9	12	17530.9	2034.0

用pMON64213的转基因大豆种子中的色氨酸和异亮氨酸的积累量

事件号	ILE(ppm)	TRP(ppm)
事件号	ILE(ppm)	TRP(ppm)	A3244	182.4	86.9
pMON64210-1	8829.6	774.7	A3244	182.4	86.9
pMON64210-1	8829.6	774.7	2	14933.3	1763.3
3	21474.8	1928.1	2	14933.3	1763.3
3	21474.8	1928.1	4	21892.9	2500.0
5	21117.8	2489.4	4	21892.9	2500.0
5	21117.8	2489.4	6	20639.7	2451.2
7	1843.1	347.8	6	20639.7	2451.2
7	1843.1	347.8	8	19124.1	1755.5

9	10000.0	1395.5
9	10000.0	1395.5	10	15728.8	1305.1
11	21992.6	1988.9	10	15728.8	1305.1
11	21992.6	1988.9	12	17530.9	2034.0

携带来自pMON63662的Perl-玉米AS的三个无标记事件(mark freeevent)的色氨酸含量

构建体事件品系号平均/事件 MaxTrp

pMON63662 GM-A29574 28 1076 1723

pMON63662 GM-A29578 44 2129 3837

pMON63662 GM-A29672 76 1188 1549

携带来自pMON63682的Lea9-wt-Agro AS的三个无标记事件(两个阳性和一个null)的色氨酸含量

构建体谱系事件 Avg(TRP＞450) MaxTrp

pMON63682 GM-A30383：@.0030. GM-A30383 1678 2,018

pMON63682 GM-A30383：@.0043. GM-A30383 2064 2,820

pMON63682 GM-A30383：@.0084. GM-A30383 0 46

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美国专利4,683,195；4,683,202；4,757,011；4,769,061；4,885,357，4,886,878，4,940,835；

4,957,748；4,971,908；5,057,419；5,093,249；5,100,679；5,147,792；5,215,912；

5,219,596；5,270,200；5,298,421；5,304,481；5,344,771；5,362,865；5,576,203；

5,508,468；5,003,045；5,955,329；5,367,110；5,858,749；6,040,160；5,610,041；

5,618,988；6,107,060；5,811,636；4,766,072；5,003,045；5,576,203；5,384,253；

5,443,974；5,512,482；5,530,186；5,534,421；5,552,306；5,589,616；5,508,468；

5,614,393；5,663,068；5,663,068；5,633,436；5,639,790；5,654,402；5,659,645；

5,689,050；5,689,050；5,689,052；5,705,391；5,760,206；5,759,829；5,789,220；

5,807,893；5,850,024；5,856,157；5,866,789；5,885,802；5,885,801；5,914,450；

5,942,660；5,945,585；5,952,544；5,955,650；5,965,727；5,995,329；5,990,384；

5,990,389；5,936,069；5,939,599；6,005,076；6,051,754；6,075,183；6,043,411；

6,100,091；6,107,051；6,110,891；6,117,677；6,194,167；6,146,669；6,147,279；

6,156,227；6,172,106；and 6,232,122.

欧洲专利0 154 204；0 238 023；和0 255 378.

专利申请WO 90/01869，WO 91/13993，WO 92/14822，WO 93/08682，

WO 94/20628，WO 95/19442，WO 97/26366，WO 97/28247，WO 97/22703，

WO 98/55601，WO 98/26064，WO 96/17064，WO 97/35023，WO 00/19839，

WO 99/06581，WO 99/02656，WO 99/40209，WO 99/11800，WO 99/49058，

WO 00/32757，WO 00/10380.

序列表

<110>Ahrens，Jeffrey

Shen，Jeffery Q.

Wang，Qi

Weaver，Lisa

Oulmassov，Tim

Dubois，Patrice

<120>用于植物中表达基因的时间特异性种子启动子

<130>16515.144

<160>25

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1312

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<400>1

actcaaagtt tattgagttt acttagagtt tataaaattt gttgagaatc tacttagagt 60

ttataaaatt tattaaaagc ctaataaaaa aaatttattc aagagttaat cagttaaatc 120

aagagtttga caaatataat cggtgtcctc taggttcaca cggtgtcact cgagcaacca 180

ttttgtgaac aatcaattca accttcgcaa tccctatcac ggcctattgg gacgactttc 240

gagattcact cataatactc caaggaaaat gacagtgtgg gcgcttaagt gtgataaggt 300

tagtttgggt aattaattaa aaaaaagtta acaccgttat taatcatgat agttaaagag 360

agatacaaga aatataattt gaaataggaa tatcggtgta ataagtctta atccaagagg 420

aagcgaatat aatttgctca ataaaaaata attgtatcca tatcttttac caagttttat 480

ggagtaaaca attattcagt ctctaacaac tggaagactt tgtgaaaatg tcataaattt 540

ctaaatatca aaaaaagatc tagctaacta tttaatgtcg tcatggtccc taaatatcta 600

ttcattttat tacctaaatc acactcttta taaacatttg gactaaggcc actgtctata 660

ttttgtctat ttacatgttc agaaattttg tttgatattt tttttcattt tcaggataca 720

gcaccatcac tcaaattaaa ttttatgtaa caagtaatca agtaaattaa ttttatgtgt 780

ttcaatatta ttagtgacca tatcaacaca acatgcaact tctccatgca aatgaagtac 840

ctaatttaag taactgcata tgaacgacca aaaacaggtt caactcagca acatagtacc 900

ccaacacgct acagacaacc gcaaccgaga aaccaaaact aatacttgac catgctctag 960

accccacacg tgtcacttgg agagttacag cacctgcgtg tcttctttct cctttagccg 1020

cgtctgtgtt gcacgtgtca atgcatggca acacttactt tttccatttt aacccgtcgt 1080

caccttctgg ttaattccct ctagctaatt acaatgcatg atatatatga tgagttacaa 1140

aacattaatt attattatat gtgaattatg tcacaaattt gttctctata tataccctct 1200

aaccctatct cttcttgtca catagctttg aacacaaaac aaaaagttta cgttacaaat 1260

cgcataataa ccgtcctaaa tttattgaga gaattttgca agtgtgagaa ac 1312

<210>2

<211>885

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<400>2

caagtactta cgccacacca acttacaaca atgtcataca taaatcatag tgtgacatta 60

ttgcgatttt tgtactgaaa aacaatattt ttaaaatata tgtacgaagg caaagagcta 120

aactttgttg ttctatctct atttcaaatt cttcctttcc atctctcttt tttcttttca 180

attcaccctt cacattctct ttcaattgag gaatggttca acactacgtg cgataggcta 240

aatgtcactt ccactttaat ataaataaag gatcatattt ttgtatcaat tgataaagaa 300

agtttttttt tttcttcatg tttttatctg cctctaacta ctagtaagtg gtattaatta 360

gagcttaagt tgcatagaat taaagagaaa catttgagag ttgagagatg attagcaata 420

attttaatca ataatcaata acttttagta tatttcgcat ttgatttaac tttttattat 480

cctttttcaa attattcttt caaaatgata tcattttaaa tattaataca aatcttaaca 540

tcatatggaa gggataacgg agagacaatt tggaagggat aagagaagtc aatttcatcc 600

ccaattagat taatcgaccg tttatgtaag cccctattgc acgagtggtt gattgccacg 660

tgtccctaac actgtgttga agctcgttgc aaacagacac gcggcaatta cgtgtaagac 720

gattagtcca ataatcctca gaaacttgcc acgcgtactg cactgacacg tgtgcaaaag 780

atagcgccgc acctaaatct atttatttgg tagcatgcgg tgtgctgttg aaagaagaaa 840

gaacctaagt gagaaacaaa gaaaggaaat aattgatctt tgaaa 885

<210>3

<211>1006

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

taatagactt tgcacctcca tctatatagt atatcacagg acaataaaca caatgatcag 60

tgattataca acatcaaaga aaacttgtaa ttctgggaat ataactgaga aatgagaatt 120

aaagattcat aatttgaaca caagaaatcc taaactggta cgaaagaaaa attgctcaac 180

aaaaaaatca agctaattac tcgtatacaa agacacgaag aactaataca agaaacaaga 240

aacaacaaac cacaaagaga ttgaaccaat ccaaattcga caacataaac caagtgtgtg 300

ggtgattgga atcagaggac gtaccaaaga aaagcgtccg tgatcaacaa aaaccaaaaa 360

gagacgtttg aaataaacca gaggaagacg aagaataatt aagcaaagag aagcgttaag 420

cgggagcgag aaaggaaacg agagaaagag agagcttcca gatccgacag aagttttcgg 480

cttcttcttt ttcgtttaag aacttctgat cctcctaggt ctgtccgaag aactaatctt 540

tttgaggtaa cgacgccgtt tttctcaaaa catgggccca ttaaccatag tctcggccca 600

aacgaaactt aatacgacaa tgtttgggtg taaacgcaaa gattttgtcg attatcacaa 660

gtaaaaaaat aaatacaaac acttgagtct ctctagacat cgtgcgtcgc cttagcttta 720

agttttttct cgaaacaaaa gagttatttt atttgaactt tgaagattat acgaagacac 780

gtggcgtgaa cccaattcat aacaacgcca cgctatactc ttttgcatgc acctcaattt 840

gaacatcatc aagtctctct ctctcttttt ctgactttga tccacgaacc taaccagctt 900

gcgatctcta tttaatcggt cctcgacgca acttcaactt ctactacatc cattcacatc 960

aaatcaatac agaaagtttt ttctatatat aaatataaaa ggtaaa 1006

<210>4

<211>945

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<400>4

atggaataca gcaatgaaca aatgctatcc tcttgagaaa agtgaatgca gcagcagcag 60

cagactagag tgctacaaat gcttatcctc ttgagaaaag tgaatgcagc ggcagcagac 120

ctgagtgcta tatacaatta gacacagggt ctattaattg aaattgtctt attattaaat 180

atttcgtttt atattaattt tttaaatttt aattaaattt atatatatta tatttaagac 240

agatatattt atttgtgatt ataaatgtgt cactttttct tttagtccat gtattcttct 300

attttttcaa tttaactttt tatttttatt tttaagtcac tcctgatcaa gaaaacattg 360

ttgacataaa actattaaca taaaattatg ttaacatgtg ataacatcat attttactaa 420

tataacgtcg cattttaacg tttttttaac aaatatcgac tgtaagagta aaaatgaaat 480

gtttgaaaag gttaattgca tactaactat tttttttcct ataagtaatc ttttttggga 540

tcaattatat atcattgaga tacgatatta aatatgggta ccttttcaca aaacctaacc 600

cttgttagtc aaaccacaca taagagagga tggatttaaa ccagtcagca ccgtaagtat 660

atagtgaaga aggctgataa cacactctat tattgttagt acgtacgtat ttcctttttt 720

gtttagtttt tgaatttaat taattaaaat atatatgcta acaacattaa attttaaatt 780

tacgtctaat tatatattgt gatgtataat aaattgtcaa cctttaaaaa ttataaaaga 840

aatattaatt ttgataaaca acttttgaaa agtacccaat aatgctagta taaatagggg 900

catgactccc catgcatcac agtgcaattt agctgaagca aagca 945

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>5

acctgcggcc gccaagtact tacgccacac caacttac 38

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>6

gcagctgttt ccttgatgga ctctc 25

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>7

gaagatctcc tgcaatttca aagatcaatt atttcc 36

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>8

ggatccaaat caaagtttaa tagactt 27

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>9

tctaggttcg gcaccgtgtc tc 22

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>10

tagcggccgc taatagactt tgcacctcca t 31

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>11

aaccatggtt taccttttat atttatatat agaa 34

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>12

gtaacgcgct ttcccaccaa cgct 24

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>13

gtgttacatt atcacttatc ctggtc 26

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>14

gctcaattaa ccctcactaa aggga 25

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>15

ctcttgagca cgttcttctc ct 22

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>16

gctcaattaa ccctcactaa aggga 25

<210>17

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>17

gtgcggccgc actcaaagtt tattgagttt acttagag 38

<210>18

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>18

acagatctgt ttctcacact tgcaaaattc tctc 34

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>19

atagtacccc aacacgctac 20

<210>20

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>20

gtgcggccgc actcaaagtt tattgagttt acttagag 38

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>21

ggaaccgaat ataattggct c 21

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>22

gccttcctgg tcagtagcac cagta 25

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>23

ccatgccatc gtatcgtgtc acaat 25

<210>24

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>24

aggcggccgc ctgcagatgg aatacagcaa tgaacaaatg c 41

<210>25

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>25

ctccatggag atcttgcttt gcttcagcta aattgcact 39

Claims

1.一种分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：1所示序列或其互补体。

2.一种核酸构建体，其包含与第二核酸可操作性连接的启动子，其中所述启动子选自：SEQ ID NO：1、2、3、4所示序列及其它们的互补体。

3.一种植物，其包含权利要求2的核酸构建体。

4.根据权利要求3的植物，其中所述第二核酸是结构性核酸。

5.根据权利要求4的植物，其中所述结构性核酸编码选自下述的蛋白质：种子贮藏蛋白质、脂肪酸途径酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、类固醇途径酶或淀粉分支酶。

6.根据权利要求4的植物，其中所述结构性核酸编码选自下述的蛋白质：邻氨基苯甲酸合成酶、色氨酸脱羧酶、苏氨酸脱氨酶、或天冬氨酸激酶。

7.根据权利要求4的植物，其中所述结构性核酸编码淀粉分支酶。

8.根据权利要求4的植物，其中所述结构性核酸被定向以表达反义RNA分子。

9.根据权利要求3的植物，其中所述植物选自：canola、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、玉米、大豆、Arabidopsis phaseolus、花生、紫花苜蓿、小麦、稻、燕麦、高梁、油菜籽、黑麦、tritordeum、粟类、酥油草、多年生黑麦草、甘蔗、酸果、番木瓜、香蕉、红花、油棕榈(oil palms)、亚麻、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、唐菖蒲、菊花、liliacea、棉花、桉树、向日葵、芸苔、欧洲油菜、草坪草、甜菜、咖啡或薯蓣属。

10.根据权利要求3的植物，其中所述植物是大豆。

11.根据权利要求4的植物，其中所述结构性核酸被器官特异性地表达。

12.根据权利要求11的植物，其中所述结构性核酸在种子中表达。

13.一种产生转化植物的方法，包括：

(a)提供权利要求2的核酸构建体，其中所述第二核酸是结构性核酸；和

(b)用所述核酸构建体转化植物。

14.根据权利要求13的方法，其中所述植物产生种子和所述结构性核酸在所述种子中转录。

15.一种包含权利要求12的植物的食物。

16.一种包含如权利要求12的植物的原种(feedstock)。

17.来自于权利要求12的植物的油。

18.包含权利要求2的核酸构建体的细胞。

19.根据权利要求18的细胞，其中所述细胞选自：细菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。

20.根据权利要求19的细胞，其中所述细胞是根癌农杆菌。

21.由包含权利要求2的核酸构建体的植物产生的种子。

22.一种在植物中表达结构性核酸的方法，包括：

(a)用核酸分子转化所述植物，所述核酸分子包含与所述结构性核酸可操作性连接的启动子，其中所述启动子包括选自：SEQ ID NO：1、2、3、4所示序列及其它们的互补体的多核苷酸，并且其中所述启动子和所述结构性核酸彼此异源；和

(b)培育所述植物。

23.根据权利要求22的方法，其中所述结构性核酸是反义方向的。

24.一种在植物的种子中积聚游离氨基酸的方法，包括：

(a)用权利要求2的核酸构建体转化所述植物，其中第二核酸编码氨基酸生物合成基因，其中所述启动子和所述第二核酸彼此异源；和

(b)培育所述植物。

25.一种控制大豆种子萌发的方法，包括：

(a)用权利要求2的核酸构建体转化所述植物，其中第二核酸编码赤霉素生物合成多肽，所述启动子和所述第二核酸彼此异源；和

(b)培育所述植物；

(c)收获所述植物的种子；和

(d)种植所述种子。