CN1810977A - 增强植物和真菌中的2－乙酰基－1－吡咯的合成的核酸 - Google Patents
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Abstract
芳香化合物2－乙酰 基－1－吡咯(2AP)是所有芳香稻米的主要潜在香味成分。本发明提供了一种非天然出现的植物，在所述植物中，所合成的2－乙酰基1－吡咯的水平大于天然出现的非芳香变种中的水平。本发明还提供了能够用作分子标记物的核酸，所述标记物用于选择合成高水平的2－乙酰基－1－吡咯的植物和真菌。
Description
发明领域
本发明通常涉及植物分子遗传学。尤其是涉及具有高水平的2-乙酰基-1-吡咯的非天然出现的植物和真菌、这些植物和真菌的制造方法，以及2-乙酰基-1-吡咯的合成中所涉及的核酸。
发明背景
米粒的芳香是高质量稻米最吸引人的特征，而高质量的稻米不仅在亚洲市场的需求日益增长，而且也在欧洲和全世界得到广泛认可。熟米的香气是由一百多种挥发性化合物组成的，这些化合物诸如有烃类、醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚类、吡啶类、吡唑类和其它化合物(Yajima等人，1978；Maga，1984；Takashi等人，1980；Paule和Power，1989)。“爆米花样”的芳香化合物即2-乙酰基-1-吡咯(2AP)据发现是所有芳香稻米、面包麦皮和黑面包的主要有效香味成分(Buttery等人，1982，1983)。2-乙酰基-1-吡咯主要负责为许多芳香稻米变种提供特征香气(Tanchotikul和Hsieh，1991)。令人惊奇的是，这种稻米的香气也已经从露兜树叶(Buttery等人，1983)、面包花(Vallaris Glabra Ktae)(Wongpornchai等人，2003)、湿粟(Seitz等人，1993)、爆米花(Schieberle，1991)、蜡样芽胞杆菌(Romanczyk等人，1995)和真菌(Nagsuk等人，2004)中分离出来并进行了鉴定。2-乙酰基-1-吡咯存在于芳香稻米植物的除根之外的所有部分(干、叶、粒)中(Lorieux等人，1996)。虽然这种香气存在于芳香米粒中，但是并不存在于所有的米粒中。
芳香化合物2-乙酰基-1-吡咯具有与氨基酸脯氨酸类似的吡咯环(图1)。将氨基酸脯氨酸作为合成2-乙酰基-1-吡咯的前体的第一证据，在细胞和愈伤组织培养的实验中发现(Suprasanna等人，1998；Suprasanna等人，2002)。此结论被采用同位素标记的实验所支持，该实验表明，谷粒2-乙酰基-1-吡咯的前体最可能是Thai Hom Mali(THM)稻米中的氨基酸脯氨酸(Yoshihashi等人，2002)，也可能是其它芳香稻米。然而，2-乙酰基-1-吡咯的精确生物合成路线还没有阐明。这样，就需要鉴定2-乙酰基-1-吡咯合成中涉及的基因，并提供一种增大植物和真菌中的2-乙酰基-1-吡咯水平的方法，以便增加香气。
发明概述
本发明通过提供非天然出现的植物和真菌，而满足这些需要，与对照植物和真菌相比，化合物2-乙酰基-1-吡咯在这些非天然出现的植物和真菌内是以高水平产生的。对照植物和真菌是指具有较低水平化合物2-乙酰基-1-吡咯的类似或相关基因型的植物和真菌。这样的对照植物可以是非天然出现的。本发明还提供用于筛选和制造这些非天然出现的植物和真菌的方法，以及由所述植物产生的种子。
化合物2-乙酰基-1-吡咯的精确生物合成路线还不可知，但它是脯氨酸的衍生物。假定，脯氨酸能够转换成2-乙酰基-1-吡咯或谷氨酸，因此对谷氨酸合成路线的抑制，将增大脯氨酸(或中间体)对2-乙酰基-1-吡咯合成的有效性(图4A)。编码控制稻米香气的蛋白质的基因，即Os2AP(Oryza sativa 2-乙酰基-1-吡咯)，被鉴定为在脯氨酸向谷氨酸的转换过程中可以起关键作用的醛脱氢酶族的一原。所测试的所有芳香稻米变种在此基因中都具有8核苷酸缺失。该缺失产生提前终止密码子，该密码子引起其自身的mRNA发生无义介导的降解，从而导致功能损失的表型的产生。RNA干扰(RNAi)的研究表明，Os2AP基因转录的破坏导致植物内2-乙酰基-1-吡咯的水平升高，以及香气的增加。
本发明提供了非天然出现的植物和真菌，所述植物和真菌通过抑制2-乙酰基-1-吡咯(2AP)基因的表达、减少2AP基因的mRNA水平、和/或减小2AP蛋白质的活性，而具有高水平的2-乙酰基-1-吡咯。与对照植物相比，2AP蛋白质的水平可减小25％、50％或100％。通过以下手段，可实现对2AP基因表达的抑制或2AP基因的mRNA水平的减小：a)反义取向的2AP基因或其片段的表达；b)将部分基因克隆成RNA干扰构造并将此构造表达在转基因植物内；或者c)利用多种方法(包括靶向诱导的基因组的局部损害(TILLING)和tDNA插入诱变)进行诱变，然后利用PCR或其它方法筛选芳香变种。
本发明还提供了一种与对照的非转基因稻米植物相比，具有高水平的化合物2-乙酰基-1-吡咯的转基因稻米植物，其中与对照的非转基因植物中2AP基因编码的mRNA或蛋白质水平相比，通过减小转基因植物中2AP编码的mRNA或蛋白质水平，而增大了该转基因植物中此化合物的水平。在一个版本中，mRNA和蛋白质的水平由于RNA干扰或由于反义而得以减小。本发明还涉及由本发明的稻米产生的转基因稻米种子。
虽然后面的实例描述的是在稻米中实施的实验，但是本发明涉及其它植物和真菌，包括(但不限于)小麦、大麦、黑麦、椰子、高粱和燕麦。
本发明还提供了一种编码2AP基因的分离核酸，其中所述核酸包括：在以下杂交条件下杂交到SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中描述的核酸序列或其补体上的核酸：所述杂交条件包括在60-65℃于0.1×SSC和0.1％SDS中至少洗涤一次30分钟；与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：5中描述的序列至少70％相同、80％相同、90％相同、95％相同或大于95％相同的核酸；以及对与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6中描述的氨基酸序列至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同、至少95％相同或大于95％相同的多肽进行编码的核酸。
稻米内的2-乙酰基-1-吡咯的量可根据收获条件和土壤类型来改变。非芳香变种(Nipponbare)具有0-0.1ppm(百万分之......)的2-乙酰基-1-吡咯水平。相反，芳香稻米变种(Thai Hom Mali)具有1-2.5ppm的2-乙酰基-1-吡咯的量。例2详细描述了稻米Os2AP基因的RNA干扰实验，其将Nipponbare稻米的2-乙酰基-1-吡咯水平增大到高达2.5ppm。本发明由此提供了将非芳香植物的香气水平增大到芳香水平的方法。
本发明还提供了含有本发明核酸的重组构造和表达载体，其中所述核酸可操作地链接到启动子上。一种有用的启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子，该启动子使大多数植物组织都具有高水平的表达。
本发明还提供了含有本发明的核酸、构造和表达载体的宿主细胞。
本发明还提供了用于筛选植物及核酸的方法，用于使2AP基因发生突变，从而导致2AP的蛋白质表达或活性减小，并因此使由于2AP化合物产量的增大而产生的香气增大。一种具体的突变是与稻米2AP基因中的芳香表型有关的八核苷酸缺失。对这种或其它突变的筛选可利用各种方法来实施，这些方法诸如有PCR、测序、杂交或微阵列实验。另一种选择是查寻2AP蛋白质水平的减小或2AP蛋白质结构或活性的变化。诸如通过利用与活性2AP蛋白质结合的抗体或通过2AP蛋白质活性的测定，可实现这一点。
本文描述的序列可用作核酸杂交实验中的探针或引物。可采用包括至少14核苷酸长邻接序列的核酸节段，所述邻接序列具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中描述的核苷酸序列的14核苷酸长邻接DNA节段相同或互补的序列。
在某些实施例中也将采用更长邻接的相同或互补序列，例如大约20、30、40、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000等长度的序列(包括所有的中间长度并高达且包括整个长度的序列)。
这些核酸探针与2AP基因序列特异性杂交的能力，使其能够用于检测给定样品中互补序列的存在。
然而，预想其它用途，包括利用序列信息制备突变物种引物，或者用于制备其它遗传构造的引物。
附图简述
图1表示出来自GC-MS、从Khoa Dawk Mali(KDML105)、Thai Jasmine米(芳香的)和Koshihikari(非芳香米)提取的2-乙酰基-1-吡咯的化学结构。
图2表示出利用所分离的谷粒香气的单个F16植物衍生的186个F9植物，对稻米的芳香基因进行的精细标度作图，和包括谷粒芳香基因的物理图构造。
图2的第一部分表示出来自单个F6植物的八个F11植物的图形基因型。第二部分表示出利用单个F6植物衍生的1116个F12植物进行的超标度作图，从而使临界区向下变窄到单个BAC中的27kb。第三部分表示出来自KDML105的基因组序列的注释，揭示出三个开放读框。第四部分表示出利用来自KDML105与JHN之间的交配的177个F6植物，鉴定未知蛋白质基因的外显子7内的三个双重组体，所述的未知蛋白质基因显著影响谷粒的香气和2-乙酰基-1-吡咯的含量。未知蛋白质基因被命名为Os2AP，即Orzya saliva2-乙酰基-1-吡咯。“Aromarker”是基于PCR的标记物，其限定出8碱基对缺失和特异于谷粒香气的3SNPs(单核苷酸多态性)。
图3A表示出利用RT-PCR、在10、15、20天之后，从芳香与非芳香同基因系之间的传粉中分离的总RNA的7个候补基因的表达。在此图中，Os2AP被称作甜菜碱醛脱氢酶。
图3B表示出在15天之后从芳香与非芳香同基因系之间的传粉中分离的总RNA的叶、干和根的Os2AP转录的不同表达。
图3C表示出THM(KDML 105)、芳香同基因系117、非芳香同基因系10和它们的F2(ISL117×ISL10)的谷粒中的2-乙酰基-1-吡咯水平分析。在F1中，2-乙酰基-1-吡咯水平分析是在叶中进行的。
图3D在上部表示出携带Os2AP RNAi构造的转基因Nipponbare中的染色体4和肌动蛋白的Os2AP同系物的表达。图3D在下部表示出染色体8上的而不是染色体4上的Os2AP基因(此处称作BADH)，表示出稻米的芳香和非芳香同基因系中的不同表达。
图4A示出了脯氨酸和谷氨酸之间的代谢途径。L-脯氨酸可以利用酶P5C合成酶和P5C还原酶、用谷氨酸来合成，而谷氨酸可以利用脯氨酸脱氢酶(ProDH)和P5C脱氢酶(P5C DH)、用脯氨酸来合成。所建议的代谢漂移由Os2AP的无义突变来介导。
图4B示出了利用RASMOL创建的OS2AP酶的预测蛋白质结构，RASMOL是通过美国Amherst的Massachusetts大学的分子生物学俱乐部网站获得的程序(新的版本是蛋白质探索者)。
图5A表示出来自KDML 105(芳香的)和Nipponbare(非芳香的)的OS2AP基因的基因组序列比较。
图5B表示出DNA的排列，此排列表明与Nipponbare(非芳香株系)相比，芳香株系Thai Hom Mali(THM)中的8碱基对缺失，以及这两个株系之间的氨基酸序列比较。排列中的核苷酸序列包括来自SEQ 1D NO：5的核苷酸701-765，和来自SEQ ID NO：2的核苷酸701-757。
图6表示出来自单个F6植物的8个F11植物的图形基因型，和来自米粒的2-乙酰基-1-吡咯水平分析。
图7A表示出用于转化的RNA干扰构造和载体。该图的下部表示出构造表达的证实。BADH在此处称作Os2AP。
图7B表示出RNAi构造、GFP和内源性Os2AP的表达。该图的下部表示出2-乙酰基-1-吡咯的水平和香气。BADH-RNAi2是针对Os2AP基因的RNAi构造。
图8A表示出利用“Aromarker”引物组，筛选与增大的香气相关的Os2AP变种的F6子代的结果。
图8B表示出筛选芳香Os2AP等位基因的稻米的多种变种的结果。
图9A表示出稻米的多种株系的Os2AP直向同源的DNA序列。排列中的核苷酸序列包括来自SEQ ID NO：5的核苷酸701-765，和来自SEQ ID NO：2的核苷酸701-757。
图9B表示出利用22个BADH(Os2AP)直向同源的邻近—接合点(Neighbor-Joint)树构建的系统发育树。
序列表中的一些序列的简单描述
SEQ ID NO：1是芳香米株系Thai Hom Mali的Os2AP基因的基因组核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是Thai Hom Mali Os2AP的蛋白质编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3是Thai Hom Mali Os2AP蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是非芳香米株系Nipponbare的Os2AP基因的基因组核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是Nipponbare Os2AP的蛋白质编码的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6是Nipponbare Os2AP的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7至88是能够用来扩增Os2AP核苷酸序列、GFP或肌动蛋白部分的引物(表1)。
SEQ ID NO：89至95是2AP基因直向同源片段的序列。
SEQ ID NO：96是高度保存在通常的醛脱氢酶之中的脱肽。
发明详述
本发明涉及2-乙酰基-1-吡咯(2Ap)基因。2AP基因的核酸序列用来增大2-乙酰基-1-吡咯的水平，此化合物是在稻米、小麦、玉米、露兜树叶、芳香椰子和一些细菌及真菌中发现的一种主要芳香化合物。
在详细解释本发明的至少一个实施例之前，应该理解，本发明并不局限于应用于一些描述中提到的成分的构建和布置细节。本发明能够具有其它实施例或者以多种方式进行实践或完成。而且，应该理解，此处采用的措词和术语是为了进行描述，而不应该被认为是对本发明的限定。
在此公开文本中，参考多个不同的出版物、专利和出版的专利说明书。这些出版物、专利和出版的专利说明书在此作为参考并入本发明的公开文本中，以便更充分地描述本发明所属的技术领域状态。除非另外指出，否则本发明的实践将采用本领域技能范围内常规的植物繁殖、免疫学、分子生物学、细胞生物学和重组DNA技术。参见诸如，Sambrook、Fritsch和Maniatis的分子克隆：实验室手册(MOLECULAR COLNING：A LABORATORY MANUAL)，第二版(1989)；分子生物学中的当前方案(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY)(F.M.Ausubel等人，eds.，(1987))；植物的繁殖：原理和前景(PlantBreeding：Principles and Prospects)(植物繁殖(Plant Breeding)，第1卷)M.D.Hayward，N.O.Romagosa；Chapman & Hall，(1993)；Coligan、Dunn、Ploegh、Speicher和Wingfeld，eds，(1995)蛋白质科学中的当前方案(CURRENTPROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE)(John Wiley & Sons，Inc.)；酶学中的系列方法(the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY)(Academic Press，Inc.)：PCR2：实践方法(APRACTICAL APPROACH)(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G R.Tayloreds，(1995)，Harlow和Lane，eds，(1988))；抗体，实验室手册(ANTIBODIES，ALABORATORYMANUAL)和动物细胞培养(ANIMAL CELL CULTURE)R.I.Freshney，ed，(1987)。
除非另外指出，否则技术术语是按照常规用途来使用的。分子生物学中的通用术语的定义可以在以下书籍中找到：1994年Oxford University Press出版的Lewin，Genes V(SBN0-19-854287-9)；1994年Blackwell Science Ltd.出版的Kendrew等人(eds.)的分子生物学百科全书(The Encyclopedia of Molecular Biology)(SBN0-632-02182-9)；以及1995年VCH Publishers，Inc.出版的Robert A.Meyers(ed.)的分子生物学和生物技术(Molecular Biology and Biotechnology)，aComprehensive Desk Reference，(ISBN 1-56081-569-8)；Ausubel等人的(1987)分子生物学中的当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)，Green Publishing；Sambrook等人的(1989)分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor，New York。植物生物学中的通用术语定义可以在以下书籍中找到：Esau的植物解剖学(Plant Anatomy)，由John Wiley & Sons出版(1977)(ISBN 0-471-24520-8)；以及Solomon等人的生物学(Biology)，SaundersCollege Publishing出版(1993)。
定义
为了易于阅读本发明的多种实施例，提供以下定义：
2-乙酰基-1-吡咯(2AP)多核苷酸序列：按照本发明的这些基因不仅包括本文公开的整个长度的序列，而且还包括这些序列的片段，所述片段保留了本文具体解释的序列的特征活性。
本文公开了稻米的2AP基因序列。本领域技术人员显而易见的是，利用稻米的2AP基因序列，通过若干方式能够容易地鉴定和获得另一种植物的2AP多核苷酸序列。具体的基因或其一部分可以从培养基存放处获得，或者诸如利用基因机器来合成构建。
利用制造点突变的标准技术，可容易地构建这些基因的变异。而且，利用商业上购得的内切核酸酶或外切核酸酶、按照标准方案，能够制造这些基因的片段。例如，诸如Bal31之类的酶或针对位点的诱变可用来从这些基因的端部系统切断核苷酸。而且，利用各种其它限制酶可获得为活性片段编码的基因。多种酶可用来直接获得这些2AP多核苷酸序列的活性片段。
利用本文提供的技术，还可以从株系和/或DNA文库中分离出等同的2AP多核苷酸序列和/或编码这些等同2AP多核苷酸序列的基因。例如，本文公开的2AP蛋白质的抗体可用来从蛋白质混合物中鉴定和分离出其它2AP蛋白质。具体地说，抗体可以提升到2AP蛋白质最稳定和距离其它蛋白质最远的部分。然后，通过免疫沉淀法、酶联免疫测定法(ELISA)或Western印迹法，利用特征活性，用这些抗体来具体鉴定等同的2AP蛋白质。
用于鉴定本发明基因的另一种方法是，采用寡核苷酸探针。这些探针是具有可检测标记物的核苷酸序列。如本领域内众所周知的，如果探针分子与核酸样品通过在这两个分子之间形成强键而进行杂交，那么可以合理地假设，探针和样品实质上是相同的。探针的可检测标记物提供了用公知方式进行测定的方法，而无论杂交是否已经发生。这样的探针分析提供了用于鉴定本发明基因的快速方法。
示范性探针在表1中有所描述。
用作按照本发明的探针的核苷酸节段，可以利用标准方案、采用DNA合成器来合成。在利用核苷酸节段作为探针的过程中，用本领域技术人员公知的任何适宜标记物来标记特定的探针，所述标记物包括放射性和非放射性标记物。一般的放射性标记物包括32P、125I、35S等。用放射性同位素标记的探针可以用与DNA样品互补的核苷酸序列、通过常规的切口转录反应、利用Dnase和DNA聚合酶来构建。探针和样品然后合并在杂交缓冲液中，并保持在合适的温度下，直到退火发生为止。其后，洗掉膜上的外源性材料，而剩下一般用自动放射显影法和/或液体闪烁计数检测和鉴定的样品及结合探针分子。
非放射性标记物包括诸如配体例如生物素或甲状腺素，以及酶类例如水解酶或过氧化物酶，或者多种化学发光剂例如荧光素(luciferin)，或者诸如荧光素(fluorescein)及其衍生物之类的荧光化合物。探针也可以在两端用不同种类的标记物进行标记，以便容易分离，或者诸如通过在以上所述的端部使用同位素标记物、在另一端使用生物素标记物，而进行标记。
双螺旋的形成和稳定性取决于两个杂交链之间的实质互补性，并且如上所述，可容许一定程度的错配。因此，本发明的探针包括所述序列的突变(一个或多个)、缺失、插入、及其组合，其中所述突变、插入和缺失允许和感兴趣的靶多核苷酸形成稳定的杂交。利用本领域普通技术人员目前公知的方法，以及或许是将来公知的其它方法，能够以许多方式在给定的多核苷酸序列中产生突变、插入和缺失。
所列出的探针的潜在变异是由于(或者部分是由于)遗传密码的丰余。由于遗传密码的丰余，即多个编码核苷酸三联体(密码子)的遗传密码能够用于用来制造蛋白质的大多数氨基酸。因此，不同的核苷酸序列能够为特定的氨基酸编码。这样，用编码蛋白质或肽的相同氨基酸序列的等同核苷酸序列，能够制备2AP蛋白质和肽的氨基酸序列。据此，本发明包括这样等同的核苷酸序列。而且，反向或互补序列是本发明的一个方面，并且能够容易地被本领域的技术人员所使用。此外，已经表明，通过改变氨基酸序列，可以构建结构和功能已鉴定的蛋白质，如果这样的变化不改变蛋白质的二级结果的话(Kaiser和Kezdy，1984)。因此，本发明包括此处所述的不改变蛋白质的二级结构的氨基酸序列突变体，或者如果结构改变，则基本上保留生物活性。另外，本发明还包括宿主所有或部分2AP多核苷酸序列的有机体的突变体，所述2AP多核苷酸序列编码本发明的基因。这样的突变体可利用本领域技术人员公知的技术来制造。例如，紫外辐射可用来制备宿主有机体的突变体，可采用tDNA插入诱变，或者采用TILLING(定向诱导的基因组局部损伤)。同样，这些突变体可包括也能够用本领域公知的方案来制备的无孢子宿主细胞。
2AP多核苷酸序列(包括稻米中的那些)可以利用本发明的PCR引物来获得。这些引物在表1中示出，并对应于SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：79中所描述的序列。这些引物的组合可用来扩增Os2AP基因的不同区域。为此扩增工作的PCR条件如下所示：10μL的反应混合物中具有10ng的摸板DNA、0.1mM的dNTP、0.5M的每种引物、0.5个单位的Taq聚合酶、2.0mM的MgCl2和1x嗜热性聚合酶缓冲液(Promega)。此混合物应该在以下时间和温度下进行30个循环的PCR：94℃，30秒钟(变性)；60℃，30秒钟(退火)；以及72℃，2分钟(延伸反应)。
表1：引物列表
| SEQ IDNO： | 引物名 | 序列(5’→3’) |
| 7 | OS2AP-8L | GCCATGCCAACTGAGTAAAG |
| 8 | OS2AP-8R | CAATTTTATTCGCTCTGTGC |
| 9 | OS2AP-9L | TGCAACATCGCGTCTTATTC |
| 10 | OS2AP-9R | GCAACTAGCAAGAGCATACACC |
| 11 | OS2AP-12L | ACCTGACATCATGCCTTTGG |
| 12 | OS2AP-12R | CCGGTCATCAGCTAACTTCC |
| 13 | OS2AP-13R | CCCTTCGTCATAAAATATACTAGCAA |
| 14 | OS2AP-14L | TCCTCCAACATGCTCTTTCG |
| 15 | OS2AP-14R | CAGAGAAGTTTACGCCGTTG |
| 16 | OS2AP-15L | TTTTTAAATAAGATGAACGGTCAAA |
| 17 | OS2AP-16L | CTCTCCACCCTCTGCTTCTG |
| 18 | OS2AP-16R | CTCTCCGCTTGAACCCATC |
| 19 | OS2AP-17L | GCATGGCTGATTGTGTATCTG |
| 20 | OS2AP-17R | TTCCAAACCTACGGACAAAAG |
| 21 | OS2AP-18L | TTCCTCTTCTCTTGTGCAAAC |
| 22 | OS2AP-18R | CACGGAAGCCAATTCAGATG |
| 23 | OS2AP-19L | CTATCCTCTCCTGATGGCAAC |
| 24 | OS2AP-19R | TGGCTACTAGAATGATGCTCAAAG |
| 25 | OS2AP20L | CCTTTTGTGTCGCTTTTGAG |
| 26 | OS2AP20R | AAAATAGCCTTCACTCGTTGC |
| 27 | OS2AP21L | CCATCGATTTCGAGGGTAAC |
| 28 | OS2AP21R | CGCATCCGATAATATGTTG |
| 29 | OS2AP22L | GTAATTAGGAGTACGACTCTCGTC |
| 30 | OS2AP22R | GCTTATAGCCTACTGTATCCTCCTC |
| 31 | OS2AP23L | AATTGGTTAACCCAGCAAGC |
| 32 | OS2AP23R | ACATTGTGAAACGGAGGAAG |
| 33 | OS2AP24L | GCTATAAGCCAGCTGCAAAC |
| 34 | OS2AP24R | GCAGTTGGTACGGACTTCG |
| 35 | OS2AP25L | CCTAAATATTTTGACGCCGTTG |
| 36 | OS2AP25R | TGAAGAGGAGGGTACCGATG |
| 37 | OS2AP26L | CACCACTCCACACCTGACAC |
| 38 | OS2AP26R | GTACGGAACACACGCACAAG |
| 39 | OS2AP27L | TGTTGTTGTTGTTGCTGCTG |
| 40 | OS2AP27R | GCCGTGAGCCATATACACTTG |
| 41 | 023088C02 1L | AGCTCCAGCTCCTCCTCGAT |
| 42 | 023088C02 2L | TATCTCTCACCGACCCCAAA |
| 43 | 023088C02 2R | TGTTGCCATCAGGAGAGGA |
| 44 | 023088C02 3R | CTCTTGATGAAGCAGCATGG |
| 45 | 023088C02 3R | CCCAGTAAATGCAACCTTGTC |
| 46 | 023088C02 4R | GGCAACATGGAAGGTAGCTC |
| 47 | 023088C02 4R | CCATGCAACCATCCTTTCTT |
| 48 | 023088C02 5R | TTATGGCTTCAGCTGCTCCT |
| 49 | 023088C02 5R | CAATGGCTTCTTCTTCAGTGC |
| 50 | 023088C02 6R | GCCCGTTGTTAGTGAAGGAC |
| 51 | 023088C02 6R | GTACCATCCCCACGGCTCAT |
| 52 | 023088C02 7L | CGAGCGATGCCAGAGATTA |
| 53 | 023088C02 7R | AGCACATGGCAAATCAAACA |
| 54 | OS2AP-exon7.1-del_F | TGCTCCTTTGTCATCACACC |
| 55 | OS2AP-exon7.1-del_R | TTTCCACCAAGTTCCAGTGA |
| 56 | OS2AP_in1L | TTCGCTGCAGAACAGATGAC |
| 57 | OS2AP_in1R | CTGATGGTTACGCGACAATTT |
| 58 | OS2AP_intA2L | ATTTGAACCGGGACAGAACA |
| 59 | OS2AP_inTA2R | TTTTGATGTGCCCTCTCCTT |
| 60 | OS2AP_inAAT3L | TGGGTAATCTTGTTCTGGAG |
| 61 | OS2AP_inAAT3R | AGTGCCAAATGCATGCTAGA |
| 62 | OS2AP_inG4L | TGGGGCTCAAAAACCTACTG |
| 63 | OS2AP_inG4R | GTCCGGGCCAAGTACCTC |
| 64 | OS2AP-5-UTR-EX1-5F | ATCTCTCACCGACCCCAAAT |
| 65 | OS2AP-5-UTR-EX1-5R | CCATTGGAAGAGAGACAGGTG |
| 66 | OS2AP-ATG1-600F | TGTTGTTGTTGTTGCTGCTG |
| 67 | OS2AP-ATG1-600R | TGGGGCTCAAAAACCTACTG |
| 68 | OS2AP-EX5-12F | GGTTGGTCTTCCTTCAGGTG |
| 69 | OS2AP-EX5-12R | GGTCCAAAAGCAACCAAAGA |
| 70 | Aromarker BigL | ACTGGTAAAAAGATTATGGC |
| 71 | Aromarker BigR | CAAGCCGATCAACCAGTACA |
| 72 | AromarkerSmallL | CCATGCTGCAAGCAATGTA |
| 73 | AromarkerSmallR | AACCATAGGAGCAGCTGAAATA |
| 74 | OS2AP8_OUT_F | ACCCTGGTGTAGACAAGGTA |
| 75 | OS2AP8_IN_F | GGGAGTTATGAAACTGGTATAT |
| 76 | OS2AP8_IN_R | ATAGGAGCAGCTGAAGCCAT |
| 77 | OS2AP8_OUT_R | GTCCCGCACTTCAGAATTAG |
| 78 | OS2AP8_ex2_F | CTCTGCTTCTGCCTCTGATT |
| 79 | OS2AP-exon9.1-del_RN | CTGGCTACTAGAATGATGCTC |
| 80 | Exon6to9NcoIF | AATTCCATGGGGTTGGTCTTCCTTCAGGTG |
| 81 | Exon6to9SpeIR | AATTACTAGTTTCCACCAAGTTCCAGTGAA |
| 82 | Exon6to8NheIR | AATTCCATGGGGTTGGTCTTCCTTCAGGTG |
| 83 | GFPU | CTTGTTGAATTAGATGGTGATGTT |
| 84 | GFPL | GTTGTGGGAGTTGTAGTTGTATTC |
| 85 | Os2APCH4U | TAGCTTCACATCCCCATGTG |
| 86 | Os2APCH4L | GCACCTTCACATCTTGCTGT |
| 87 | 肌动蛋白U | ACATCGCCCTGGACTATGAC |
| 88 | 肌动蛋白L | TGCTGAGAGATGCCAAGATG |
Oryza sativa 2-乙酰基-1-吡咯(Os2AP)同系物：通过基于计算机的方法，利用公共域序列排列算式和检索序列数据库(公共域数据库包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR等)的序列相似性检索工具，能够鉴定显示出与本申请所述的那些序列相似的序列。
相似性检索找回并排列序列，以便与待分析的靶序列(即，查询序列)进行比较。比较序列局部区域之间的最佳排列被称作局部排列。序列比较算式利用记分矩阵将全部分数分配给每个排列。
多核苷酸及多肽序列可以进行排列，并利用通过公共途径获得的计算机算式，针对多核苷酸及多肽序列，来确定特定区域中的相同残基的百分率。百分率相同性分数取决于比较序列的重叠区长度。
两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的相似性可以用序列的相同性来表达(或者，对于蛋白质，也可以用序列的相似性来表达)。序列的相同性经常以百分率相同性来测定；百分率越高，两个序列就越相似。如本文所述，2AP蛋白质编码的核酸分子的同系物和变种可用于本发明。这些核酸分子的同系物和变种在利用标准方法进行排列时，将拥有相当高程度的序列相同性。这样的同系物和变种在高度严格的条件下将彼此杂交。
为了进行比较而排列序列的方法在本领域内是公知的。多种程序和排列算式在以下有所描述：Smith and Waterman(1981)；Needleman and Wunsch(1970)；Pearson and Lipman(1988)；Higgins and Sharp(1988)；Higgins and Sharp(1989)；Corpet等人(1988)；Huang等人(1992)；以及Pearson等人(1994)。Altschul等人(1994)详细描述了序列的排列方法和同系物计算。
NCBI基本局部检索工具(BLAST)(Altschul等人，1990)可从几个来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和互连网，所述检索工具与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。它能够在NCBI网站上存取。有关如何利用此程序确定序列的相同性的描述可在NCBI网站上得到。
所公开的蛋白质序列同系物的一般特征是，拥有利用NCBI Blast 2.0(设定到缺席参数的gapped blastp)在具有所公开序列的氨基酸序列的整个长度排列上计数的至少40％序列相同性。可调整的参数优选用以下值来设定：重叠跨度1，重叠分数＝0.125，字阈值(word threshold)(T)＝11。HSP S和HSP S2是动态值，并且用程序来建立，而程序本身取决于特定序列的组成和检索感兴趣序列的特定数据库的组成；然而，可调整这些值，以增大灵敏度。与参比序列具有更大相似性的蛋白质在用此方法评估时，将显示百分率相同性增大，诸如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的序列相同性。
所公开的核酸序列同系物的一般特征是，拥有利用NCBI Blast 2.0(设定到缺席参数的gapped blastp)在具有所公开序列的氨基酸序列的整个长度排列上计数的至少40％序列相同性。此外，这样的序列在高度严格的条件下与同源序列杂交。一种优选方法采用WU-BLAST-2的BLASTN模块(Altschul等人，1996)；设定到缺席参数，具有分别设定到1和0.125的重叠跨度和重叠分数。与参比序列具有更大相似性的核酸序列在用此方法评估时，将显示百分率相同性增大，诸如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的序列相同性。
排列包括将间隙引入到待排列的序列中。此外，对于含有比SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6中描述的蛋白质多或少的氨基酸的序列，应该理解，在一个实施例中，将基于与氨基酸总数相关的相同氨基酸的数目，来确定序列相同性的百分率。这样，诸如，在一个实施例中，将利用更长序列中的氨基酸数目来确定比附图中所示(如下所述)更短的序列的序列相同性。在百分率相同性的计算中，并没有将相对重量分配给序列变异的多种表现形式，例如插入、缺失、取代等。
在一个实施例中，仅将相同性记录为正的(+1)，而将包括间隙的所有序列变异形式指定为“0”值，从而无需用于序列相似性计算的加权标度或参数(如此处所述)。诸如，可如下计算序列相同性百分率：用配对的相同残基数目除以排列区域中“更短”序列的残基总数，并乘以100。“更长”的序列是在排列区域中具有大多数实际残基的序列。
蛋白质按照它们与相同基因组(平生同源)或不同基因组(直向同源)中的其它蛋白质的序列相关性，来进行分类。直向同源基因是由共同祖先基因的物种形成所进化的基因。这些基因通常保留了与它们进化的相同的功能。平生同源基因是在基因组内复制的基因。这些基因可获得与原始相关的新的物种形成或修正功能。系统发育分析方法对于生物信息学领域的普通技术人员来说是众所周知的。
正如本领域技术人员所理解的，本发明的序列可含有排序误差。也就是说，在任何序列中可以有不正确的氨基酸序列、核苷酸移码、未知核苷酸或其它种类的排序误差；然而，正确的序列将落在此处对核酸的同源和严格定义以及针对蛋白质或多肽所述的蛋白质同源性之内。
2-乙酰基-1-吡咯(2AP)多肽：如此处所使用的，术语“2AP多肽”是指基本上具有2AP直向同源的氨基酸序列的基因产物。2AP多肽的特征是(或部分是)，其表达的减少、其mRNA水平的减少、或者蛋白质的量或活性的减少，导致植物中的化合物2-乙酰基-1-吡咯的水平增大。2AP多肽的特征还在于(或部分是)，具有与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6中所描述的氨基酸序列至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％氨基酸相同的氨基酸序列。
基本上相同：“基本上相同”的意思是，多肽或核酸表现出，与参比氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6中描述的氨基酸序列)或核酸序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中描述的核酸序列)具有至少30％、优选50％、更优选80％、最优选90％、甚至95％的同源性。对于多肽，比较序列的长度通常至少为16个氨基酸，优选至少20个氨基酸，更优选至少25个氨基酸，最优选35个氨基酸或更多。对于核酸，比较序列的长度通常至少为50个核苷酸，优选至少60个核苷酸，更优选至少75个核苷酸，最优选110个核苷酸或更多。
序列的相同性一般利用序列分析软件(例如，基因计算机集团的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group)，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，Wis.53705，BLAST，或者PILEUP/PRETTYBOX程序)来测定。诸如，这样的软件在设定到标准参数时，通过将同源性程度分配给多种取代、缺失和/或其它修正，来匹配相同或相似的序列。保守的取代一般包括下列组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
高水平：高水平，如此处所使用的，是指非天然出现的植物中的化合物2-乙酰基-1-吡咯的平均水平与相应的天然出现的植物中的化合物2-乙酰基-1-吡咯的平均水平相比，是增大的。给出，植物中的化合物2-乙酰基-1-吡咯的水平将依据许多变量，而在植物与植物之间是不同的，本领域的技术人员应该理解，在比较非天然出现的植物与相应的天然出现的植物中的化合物2-乙酰基-1-吡咯的平均水平时，应该比较在相似受控条件下生长的每种植物的合理尺寸的样品群。化合物2-乙酰基-1-吡咯的水平优选地在来自每个群体的几种植物中进行测定，并进行平均，以便确定非天然出现的植物是否含有高水平的这种化合物。本发明的非天然出现的植物中的高水平是，按平均水平计，比相应的天然出现的植物大至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、250％、300％、400％或500％。
启动子：DNA序列或DNA序列组上的识别位点，它为结构基因提供表达控制要素，并且RNA聚合酶特异性结合到该位点上，并启动此基因的RNA合成(转录)。
在Fraley等人的U.S.5,352,605中发现了利用这些启动子的植物表达构造实例。在大多数转基因植物组织中，CaMV 35S启动子是强启动子(参见例如，Odell等人，自然(Nature)313：810，1985)。CaMV启动子在单子叶植物中也具有高度活性(参见例如，Dekeyser等人，植物细胞(Plant Cell)2：591，1990；Terada和Shimamoto，Mol.Gen.Genet.220：389，1990).而且，通过CaMV 35S启动子的复制，此启动子的活性能够进一步增大(即，在2-10倍之间)(参见例如，Kay等人，科学(Science)236：1299，1987；Ow等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.84：4870，1987；和Fang等人，植物细胞(Plant Cell)1：141，1989，以及McPherson和Kay，U.S.Pat.No.5,378,142)。
其它有用的植物启动子包括(但不限于)胭脂氨酸合成酶(NOS)启动子(An等人，Plant Physiol.88：547，1988以及Rodgers和Fraley，U.S.Pat.No.5,034,322)、章鱼氨酸合成酶启动子(Fromm等人，植物细胞(Plant Cell)1：977，1989)、玄参镶嵌病毒(FMV)启动子(Rogers，U.S.Pat.No.5,378,619)、以及稻米肌动蛋白启动子(Wu and McElroy，WO91/09948)。
示范性单子叶植物启动子包括(但不限于)鸭草跖黄斑驳病毒启动子、甘蔗badna病毒启动子、水稻tungro bacilliform病毒启动子、玉米划线病毒元素和小麦矮化病毒启动子。
构造：除非另外指明，否则术语“构造”是指包括本发明的一个或多个分离多核苷酸序列的重组遗传分子。
用于宿主有机体内的转基因表达的基因构造包括可操作地链接到开放读框上并任选地链接到开放读框下游的基因端序列3’上的基因启动子序列。开放读框可以在有义或反义方向上取向，这取决于基因序列的预计使用。构造还可包括可选择的标记物基因和基因表达的其他调节元素。
载体：能够在宿主细胞中复制和/或另一DNA节段能够可操作地链接到其上从而导致附着节段复制的DNA分子。质粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒、YACs和BACs是所有的示范性载体。
术语“载体”是指用来将多核苷酸序列引入宿主细胞内、借此产生转化宿主细胞的核酸分子。“载体”除了上述的基因构造之外，还可包括基因材料，例如允许在一个或多个宿主细胞内复制的一个或多个核酸序列，例如复制的起源、可选择的标记物基因以及本领域内公知的其它基因元素(例如，将基因材料并入宿主细胞的基因组内的序列，等等)。
转化：转化细胞是已经用分子生物学技术引入核酸分子的细胞。如此处所使用的，术语转化包含将核酸分子引入这样的细胞、植物或动物细胞内的所有技术，包括利用病毒载体的转染、利用质粒载体由土壤杆菌属实施的转化、以及通过电穿孔、质脂转染和粒子枪加速引入裸DNA，并且包括瞬时稳定的转化体。
植物细胞的DNA转化方法包括土壤杆菌属介导的植物转化、原生质体的转化、基因转移到花粉内、注入再生器官、注入未成熟的胚胎内和粒子轰击法。这些每种方法都具有不同的优缺点。因此，将基因引入特定植物株系的一种特定方法可以不必是对另一种植物株系最有效的方法，但是哪一种方法对特定植物株系有用，这是公知的。
有许多将转化DNA节段引入细胞内的方法，但不是所有的方法都适合将DNA运送到植物细胞内。合适的方法据信包括诸如通过土壤杆菌属感染、DNA的直接运送诸如通过REG介导的原生质体转化(Omirulleh等人，1993)、通过干燥/抑制介导的DNA摄取、通过电穿孔、通过用碳化硅纤维实施的搅拌、通过DNA涂布的粒子的加速等，而将DNA引入细胞的任何实际方法。在某些实施例中，加速方法是优选的并包括诸如微粒轰击等。
将DNA引入细胞的技术对于本领域的技术人员来说是公知的。将基因运送到细胞内的四种通用方法已经有所描述：(1)化学方法(Graham and van der Eb，1973；Zatloukal等人，1992)；(2)物理方法例如微注射(Capecchi，1980)、电穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等人，1985)和基因枪(Johnston和Tang，1994；Fynan等人，1993)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等人，1993；Eglitis和Anderson，1988a；1988b)；以及(4)受体介导机制(Curiel等人，1991；1992；Wagner等人，1992)。
电穿孔：将短暂的高压电脉冲施加到各种动物和植物细胞上，导致在质膜上形成纳米大小的孔。DNA通过这些孔或作为伴随着孔闭合的膜组分的重新分布结果，而直接被摄取到细胞胞质内。电穿孔是极其有效的，并可用于克隆基因的瞬时表达和建立运载感兴趣基因的一体拷贝的细胞系。电穿孔，与磷酸钙介导的转染和原生质体的融合相反，其频繁地作用于运载一个或者至多几个一体拷贝的细胞系上。
借助于电穿孔引入DNA的方法对于本领域的技术人员来说是公知的。在这种方法中，利用某些细胞壁降解酶诸如果胶降解酶使靶受体细胞比未处理的细胞更易受电穿孔的转化。或者是，使受体细胞更易受机械创伤的转化。为了使电穿孔的转化有效，一种方法是采用易碎组织例如细胞或胚胎发育胼胝的敏感培养基，或者是直接转化未成熟的胚胎或其它有机化组织。一种方法是通过将所选细胞暴露于果胶降解酶(果胶酶)中或者以受控的方式进行机械创伤，而部分降解所述细胞的细胞壁。这些细胞然后通过可以在此阶段完成的电穿孔接受DNA转染，并且然后用合适的选择或筛选方案(这取决于新并入的DNA的性质)来鉴定所转化的细胞。
微粒轰击：将转化DNA节段运送到植物细胞中的另一种有益的方法是微粒轰击。在这种方法中，粒子用核酸涂布并利用推进力运送到细胞内。示范性粒子包括用钨、金、铂等组成的粒子。
微粒轰击除了是一种有效的重复获得稳定转化的单子叶植物的方式之外，它的另一个优点是，不需要分离原生质体(Cristou等人，1988)，也无需承受土壤杆菌属的转染。通过加速将DNA运送到玉米细胞内的一种方法的图解实施例是生物列表(Biolistic)粒子运送系统，该系统用来将用DNA或细胞涂布的粒子通过筛子(例如不锈钢或Nytex筛)推到用培养在悬浮液中的谷物细胞涂布的过滤器表面上。筛将这些粒子分散，以便粒子不会以大凝聚体的形式运送到受体细胞中。据信，介于抛射装置与待轰击细胞之间的筛子减小了抛射凝聚体的尺寸，并且通过减小由太大的抛射造成的施加在受体细胞上的损害，可以使转化的频率更高。
对于轰击，悬浮液中的细胞优选地集中在过滤器或固态培养介质上。或者是，未成熟的胚胎或其它靶细胞可以安置在固态培养介质上。使待轰击的细胞位于微粒终止板之下的合适距离处。如果需要的话，一个或多个筛子也可位于加速装置与待轰击的细胞之间。通过使用本文提到的技术，可以获得高达1000或更多的瞬时表达标记物基因的细胞焦点。48小时轰击后表达外源性基因产物的焦点处细胞数经常在1-10的范围内，平均为1-3。
在轰击转化中，可以优化预先轰击培养条件和轰击参数，以产生最大数目的稳定转化体。轰击的物理和生物参数在此技术中都是重要的。物理因数是包括操纵DNA/微粒沉淀物或影响大颗粒或微粒的飞行和速度的那些因数。生物因数包括在轰击之前或轰击之后立即操纵细胞的所有步骤、靶细胞的渗透调节以有助于减轻有关轰击的损伤，还有转化DNA的性质，例如线性化DNA或完整的超螺旋质粒。据信，预先轰击的操纵对于未成熟胚胎的成功转化是重要的。
据此，可设想在小规模的研究中调整一些轰击参数，以充分优化这些条件。特别希望调整物理参数例如间隙的距离、飞行距离、组织的距离和氦压。通过调整影响受体细胞的生理状态并因此影响转化和整合效率的条件，还可以使损失减小因数(TRFs)最小。例如，为了优化转化，可调整渗透状态、组织水合以及受体细胞的传代培养阶段和细胞周期。
土壤杆菌介导的转移：土壤杆菌介导的转移是将基因引入植物细胞的广泛应用的系统，这是因为DNA可以引入到全部植物组织内，借此无需由原生质体再生完整的植物。利用土壤杆菌介导的植物整合载体将DNA引入到植物细胞内，这在本领域内是公知的。参见例如，(Fraley等人，1985；Rogers等人，1987)中所述的方法。另外，Ti-DNA的整合是导致很少重排的相当精确的过程。待转移的DNA区域由边界序列限定出，并且间插DNA经常插入植物基因组内，如(Spielmann等人，1986；Jorgensen等人，1987)所述。
现代的土壤杆菌转化载体能够在大肠杆菌(E.coli.)以及土壤杆菌中复制从而允许便利地进行操纵，如(Klee等人，1985)所述。而且，在土壤杆菌介导的基因转移载体上的最近技术进展，已经改善了载体中的基因排列和限制位点，从而易于构建能够表达编码基因的多种多肽的载体。(Rogers等人，1987)中所述的载体，具有便利的由启动子和聚腺苷酸化位点侧翼包围的多个接头区域，以便直接表达所插入的编码基因的多肽，并适合本发明的目的。此外，含有接臂和无臂Ti基因的土壤杆菌可用于转化。在土壤杆菌介导的转化有效的那些植物株系中，由于基因转移的易得和确定性质，这是所选择的方法。
叶盘和其它组织例如子叶和胚轴的土壤杆菌介导的转化似乎局限于土壤杆菌天然感染的植物。土壤杆菌介导的转化在双子叶植物中最有效。很少的单子叶植物表现出是土壤杆菌的天然宿主，尽管利用天然杆菌载体已经在芦笋中产生转基因植物，如(Bytebier等人，1987)所述。因此，商业上重要的谷粒诸如稻米、玉米和小麦必需经常用等同的方法来转化。
利用土壤杆菌转化方法形成的转基因植物一般在一个染色体上含有一个基因。这样的转基因植物被称作外加基因的杂种。然而，由于词汇“杂种”的使用经常暗示在一对染色体的第二个染色体的相同基因座存在互补基因，并且在含有一个外加基因的植物中没有这样的基因存在，因此据信，对这种植物的更准确命名是一个单独分离的部分，因为外加的外源性基因在有丝分裂和减数分裂的过程中是单独分离的。
更优选的是，转基因植物是外加结果基因的杂种；即，含有两个外加基因的转基因植物，一个基因在染色体对的每个染色体上的相同基因座处。杂合转基因植物可如下获得：使含有一个外加基因的单独分离的转基因植物有性交配(自交)，然后使所生成的一些种子萌发，并分析所产生的植物相对于对照物(天然、非转基因的)或单独分离的转基因植物升高的2-乙酰基-1-吡咯水平。
这些系统在不同植物株系中的应用取决于由原生质体再生特定植物株系的能力。图示的由原生质体再生谷类的方法在(Fujimura等人，1985；Toriyama等人，1986；Yamada等人，1986；Abdullah等人，1986)中有所描述。
为了转化不能由原生质体成功产生的植物株系，可采用将DNA引入完整细胞或组织的其它方式。例如，如(Vasil，1988)所述，用未成熟胚胎或外植体再生谷类。此外，可采用“粒子枪”或高速微粒技术(Vasil，1992)。
利用后一种技术，小金属粒子表面上的DNA通过细胞壁并进入胞质内，如(Klein等人，1987；Klein等人，1988；McCabe等人，1988)所述。金属粒子穿过细胞的几个层，由此使细胞在组织外植体内转化。
分离的：“分离的”生物组分(例如核酸或蛋白质或细胞器)已经从组分在其中天然出现的细胞或有机体内的其它生物组分中基本上分离出来或提纯出来，所述的其它生物组分为其它染色体或外染色体DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已经“分离的”的核酸及蛋白质包括用标准的纯化方法提纯的核酸及蛋白质。此术语包含包括化学合成的核酸的核酸，也包含通过在体外或宿主细胞内重组表达而制备的蛋白质，和重组核酸(如下定义)。作为一个实例，大基因组DNA片段例如重叠群中的基因，由于在平均重叠群中发现的相当大量的外DNA，而不能充分地从将要考虑分离的其它生物组分中提纯出来。概括地说，以下的“重组核酸”及“重组蛋白质”也是如上所述进行“分离的”。
重组体：“重组核酸”在此处是指这样的核酸：这种核酸具有不是天然出现的序列，或者具有通过将两个另外分离的序列节段人工组合而生成的序列。此人工组合经常通过以下方式来实现：化学合成，或者更通用的是核酸的人工操纵，例如通过基因工程技术，诸如通过用限制酶、连接酶、重组酶和/或聚合酶操纵至少一个核酸。一旦重组核酸被引入宿主细胞，就由宿主细胞来复制；然而，曾经在宿主细胞内复制的重组核酸保留了用于本发明目的的重组核酸。“重组蛋白质”在此处是指，由采用重组核酸的方法产生的蛋白质。概括地说，以上的“重组核酸”及“重组蛋白质”也是如上所述进行“分离的”。大片段例如重叠群中的基因不是“重组核酸”，如果这样的人工组合与此基因无关的话。然而，如果重叠群中的基因周围或内部的序列为了与该基因相关已经被操纵(及不仅仅是因为该基因在重叠群附近)，那么重叠群中的这种基因，由于核酸的重组部分相对接近可疑基因，而将构成“重组核酸”。
非天然出现的植物：如此处所用的，术语“非天然出现”在用于指植物时，是指植物已经通过人的干涉在基因上进行了修饰，从而改变了植物的化合物2-乙酰基-1-吡咯的水平。已经进行基因修饰的天然出现的植物被称作“控制”植物。在本发明的上下文中，控制植物可以是转基因植物。例如，控制植物可以是抗除莠的转基因植物。在此例中，非天然出现的植物是抗除莠的，并且与抗除莠的控制植物相比具有高水平的化合物2-乙酰基-1-吡咯。本发明的转基因植物诸如是，含有编码2AP基因或其片段的外源性核酸分子并因此已经通过人类干涉进行基因修饰的非天然出现的植物。此外，在诸如2AP基因调节元件或编码序列中含有突变的植物，也被认为是非天然出现的植物，这是因为它已经通过人类干涉进行了基因修饰，其中所述突变是所计算的暴露于诱变剂例如化学诱变剂或“插入诱变剂”(诸如转座子或T-DNA)的结果。反之，含有仅仅自发或天然出现的突变的植物不是此处所定义的“非天然出现的植物”。本领域的技术人员应该理解，虽然非天然出现的植物与天然出现的植物相比一般具有改变的核苷酸序列，但是非天然出现的植物例如通过修饰其甲基化图，也能够通过人类干涉进行基因修饰，而不会改变其核苷酸序列。
转基因植物：即，由转化的植物细胞或原始质体衍生的植物或其子代，其中植物DNA含有不是原始存在于相同株系的天然、非转基因植物中的引入的外源性DNA。术语“转基因植物”和“转化植物”有时在本领域内是作为同义词使用的，用来定义其DNA含有外源性DNA分子的植物。然而，应该更科学地将从转化的植物细胞或原生质体获得的再生植物或愈伤组织成为转基因植物，并且其用途在此处如下所述。
I.2-乙酰基-1-吡咯(2AP)基因
A.直向同源/同系物的分离：描述稻米中Os2AP基因的分离和特征的以下实例部分，是分离2AP基因的通用方法示范。这样的2AP基因编码2AP蛋白质。所分离的基因然后用来构建减小植物中2AP基因表达的重组载体。
通常，以下所述的重组DNA技术中的命名和方案在本领域内是公知的并普遍采用的。标准的技术用于克隆、DNA和RNA的分离、扩增以及纯化。涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制内切核酸酶等的酶反应通常按照制造者的具体说明来实施。这些技术和多种其它技术通常按照Sambrook等人的分子克隆—实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.，(1989))来实施。
2AP基因的分离可利用许多技术来完成。例如，基于本文公开的序列的寡核苷酸探针可用来鉴定cDN或基因组ADNA文库中的所需DNA。为了构建基因组文库，基因组DNA的大节段通过诸如利用限制性内切核酸酶的随机断裂而产生，并与载体DNA连接，从而形成能够包装成合适载体的多联体。为了制备cDNA文库，将mRNA从所需的器官例如叶中分离出来，并且含有2AP转录物的cDNA文库用mRNA来制备。或者是，cDNA可以用从表达2AP基因或同系物的其它组织中提取的mRNA来制备。
然后，可利用基于克隆2AP基因(例如本文公开的稻米Os2AP基因)序列的探针筛选cDNA或基因组文库。探针可用来与DNA或cDNA序列杂交，从而将相同或不同植物物种中的同源基因分离出来。
具有序列区的核酸分子尤其预计作为用于诸如南北印迹法的杂交探针，其中所述序列区包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中描述的DNA序列相同或互补的10-14、15-20、30、50、甚至100-200个核苷酸等的邻接核苷酸延伸序列。较小的片段通常发现用于杂交实施例，其中邻接互补区的长度可以诸如在约10-14以及100或200个核苷酸之间变化，但是较长的邻接互补延伸序列可按照希望检测的互补序列长度来使用。
约14个核苷酸长度的杂交分子的使用，允许形成稳定的、可选择的双螺旋分子。在超过14个碱基长度的延伸序列上具有邻接互补序列的分子通常是优选的，以便增加杂交的稳定性和选择性，借此提高所得到的特定杂交分子的质量和杂交度。通常优选的是，设计具有15-20个邻接核苷酸、甚至更长(如果需要的话)的基因互补延伸序列的核酸分子。
当然，片段也可利用其它技术诸如通过机械剪切或通过限制酶消化来获得。通过诸如利用化学方式直接合成片段，可容易地制备小核酸节段或片段，诸如利用自动寡核苷酸合成器所普遍实践的。而且，通过应用核酸再生技术例如U.S.4,683,195和4,683,202(每一篇文献作为参考引入本文)的PCR.TM.技术、通过将所选序列引入重组载体用于重组制备、以及通过分子生物学领域内的技术人员通常公知的其它重组DNA技术，可获得这些片段。
据此，本发明的核苷酸序列可用于同DNA片段的互补延伸序列选择性形成双螺旋分子。根据设想的应用，期望采用不同的杂交条件，以获得不同选择程度的针对靶序列的探针。对于需要高度选择的应用，一般期望采用相当严格的条件来形成杂交，例如选择相当低的盐和/或高温条件，诸如约0.02M-约0.15M NaCl和约50℃-约70℃的温度。这样的选择性条件容许探针与模板或靶链之间具有很少的错配序列(即便有的话)，并且特别适合于分离编码DNA节段的2AP多肽或蛋白质。通过杂交对DNA节段的检测，对于本领域的技术人员来说是公知的，并且U.S.4,965,188和5,176,995(每一篇文献作为参考引入本文)的教导是杂交分析方法的示范。诸如在Maloy等人，1994；Segal 1976；Prokop，1991；和Kuby，1994的正文中发现的那些教导是特别相关的。
当然，对于一些应用，诸如当需要制备采用杂交到下面模板上的突变型引物链的突变体时，或者在寻求从相关物种、功能性等同物或类似物质中分离2AP蛋白质编码序列时，一般需要不太严格的杂交条件，以便形成异源双链体。在这些情况下，期望采用诸如约0.15M-约0.9M的盐和约20℃-约55℃的温度之类的条件。交叉杂交物种借此能够容易地被鉴定为相对于对照杂交的正杂交信号。在任何情况下，通常认为，通过加入大量的甲酰胺而使条件更加严格。这样，杂交条件容易操纵，并由此通常作为根据所需结果的选择方法。
在某些实施例中，有益的是，将本发明的核酸序列与合适的方式例如标记物结合使用，来测定杂交。各种合适的指示剂在本领域内是公知的，包括能够给出可检测信号的荧光物质、放射性物质、酶或其它配体例如亲和素/生物素。在优选的实施例中，可能期望采用荧光标记物或酶标记例如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶，而不是放射性或其它对环境有害的试剂。在酶标记的情形中，量热指示剂底物是公知的，其能够用来提供人眼可视的或分光光度测量的方式，从而能够鉴定与含有互补核酸的样品的特定杂交。
通常，预想，本文所述的杂交探针可用作溶液杂交中的试剂以及用于采用固相的实施例。在涉及固相的实施例中，被测DNA(或RNA)被吸附或固定到所选择的基质或表面上。此固定的单链核酸然后在所需的条件下接受与所选探针的杂交。所选择的条件将取决于基于所需的特定临界(诸如取决于G+C内容、靶核酸的类型、核酸的来源、杂交探针的尺寸等)的特定情况。在洗涤杂交表面以除去非特异结合的探针分子之后，借助于标记物对特异性杂交进行检测、甚至定量。或者是，利用扩增技术从核酸样品扩增感兴趣的核酸。例如，聚合酶链反应(PCR)技术可用来直接从mRNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库扩增2AP基因序列。PCR以及其它体外扩增方法也可用于诸如克隆为待表达的蛋白质编码的核酸序列、制备用作检测样品中所需mRNA的存在、核酸测序或其它目的探针的核酸。
用于从植物组织中鉴定2AP基因序列的核酸引物及探针，是由本文提供的序列比较产生的。对于PCR的综述，参见PGR方案：方法和应用指南(A Guide toMethods and Applications.(Innis，M，Gelfand，D.，Sninsky，J.和White，T.， eds.)，Academic Press，San Diego(1990)，此文献作为参考引入本文。
多核苷酸也可以用诸如技术文献中描述的公知技术来合成。参见例如，Carruthers等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-418(1982)，和Adams等人，J.Am.Chem.Soc.105：661(1983)。然后，通过合成互补链并在合适条件下使这些链一起退火，或者通过利用DNA聚合酶将互补链与合适的因为序列加成，可获得双链DNA片段。
B.从中分离出2AP基因直向同源的有机体：可使用许多种植物和真菌，包括来自普通Zea，Avena，Hordeum，Secale，Triticum和Sorghum的物种。已经表明，2-乙酰基-1-吡咯是所有芳香稻米、小麦和黑面包(Buttery等人，1982，1983)、湿粟(Seitz等人，1993)、爆米花(Schieberle等人，1991)、蜡样芽胞杆菌(Romanczyk等人，1995)和一些真菌物种例如Aspergellus oryzae、Aspergellus awamori和Sporobolus virginicus(Nagsuk等人，2004)的主要潜在香味化合物。有几个报告表明谷类中的基因组宽的同线性以及植物和微生物中良好保存的脯氨酸代谢途径(在京都Kyoto大学的化学研究所生物信息中心的基因和基因组的京都百科全书的网页上联机发现的)(found online at the web page for the Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes，Kyoto University，Bioinformatics Center，Institute for ChemicalResearch)。因此，2AP基因的直向同源在谷类植物中可以比较的方式起作用，并且本发明提供的教导在其它植物中能够以与在稻米中类似的方式增强化合物2-乙酰基-1-吡咯的积累。
II.减小2AP基因表达或2AP蛋白质水平或活性，以增加植物中的2-乙酰基-1-吡咯的水平
A.诱变：化学诱变剂例如EMS(甲磺酸、乙酸乙酯)和γ射线以及快速中子辐射能够在DNA中产生突变。突变的一些实例是缺失、插入和错义突变。在突变之后，进行筛选，以鉴定产生终止提前密码子或非功能性2AP基因的缺失。通过测序或通过利用由本发明提供的特异于2AP基因或蛋白质的探针或引物，可实施突变体的筛选。2AP基因的特异性突变是也可通过TILLING(靶向诱导的基因组的局部损害)和tDNA插入来产生。这样的突变可导致2AP基因表达的减小、2AP mRNA稳定性的减小或者2AP蛋白质的活性和/或稳定性的减小。这样的植物如本文所定义的，是非天然出现的。
B.反义技术：反义技术阻止靶mRNA(例如2AP mRNA)的翻译。如此，反义技术通常减小靶蛋白质(此处是2AP蛋白质)的水平。2AP基因或其片段能够引入到反义取向的植物内。这些片段可以象18个核苷酸那么小，象3000个核苷酸那么大或更大。2AP基因的cDNA片段可以被克隆到与天然基因相反取向的载体(例如，pCAMBIAI302)内。反向转录物将与天然2AP基因转录物形成异源双链结构，该结构然后在转录之前发生降解。有义和反义结构不必相同，甚至部分同源就足以抑制靶基因的表达。于是，来自稻米Os2AP(SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)的序列能够用来抑制其它植物中的2AP基因的表达，而无需知道该植物的2AP基因直向同源序列。
C.RNA干扰：RNA干扰是另一种适合消除靶mRNA的技术。在RNAi载体的构建中有若干变异，但是基本的结果是在RNA中形成发夹环结构(Horiguchi2004)。在例2中，在与其cDNA相反方向上包含外显子6、7和8的Os2AP核苷酸序列片段被克隆到载体内，从而导致在mRNA中形成反向发夹环结构。利用名为Dicer的内切核酸酶，将这些发夹结构裂解成若干小的片段，所述核酸酶的作用是避免错误的转录被翻译(Hamilton和Baulcombe，1999，Matzke等人，2001)。MRNA的小片段通常约20-21个核苷酸的大小，并且已经被命名为siRNAs或小的干涉RNAs。也可采用更大或更小的片段。这些siRNAs能够下调同源基因的表达。再者，同源性不必是完全的，因此本发明祥述的稻米序列能够用来产生其它植物的RNAi构造。例如2表示出靶向非芳香米株系中的Os2AP基因的RNAi实验是如何将2-乙酰基-1-吡咯的水平和香气升高到芳香米中发现的水平。
III.转基因植物的产生
为了利用以前技术中所分离的2AP基因序列，可制备适合植物细胞转化的重组DNA载体。转化各种更高级植物物种的技术是公知的并且在科学技术文献中有所描述。参见例如，Weising等人的Ann.Rev.Genet.22：421-477(1988)。
利用各种常规技术，将这样的DNA构造引入所需植物宿主的基因组内。例如，利用诸如电穿孔、PEG扩散(poration)、粒子轰击和植物细胞原生质体或胚胎发育愈伤组织的微注射之类的技术，可以将DNA构造直接引入植物细胞的基因组DNA中，或者利用弹道方法例如DNA粒子轰击，将DNA构造直接引入到植物组织内。或者是，DNA构造可以与合适的T-DNA侧翼区组合，并引入到常规的Agrobacterium tumefaciens宿主载体内。当细胞被细菌感染时，Agrobacteriumtumefaciens宿主的毒力作用将引导构造和相邻标记物插入到植物细胞的DNA内。微注射技术在本领域内是公知的，并且在科学技术文献中有较好的描述。利用聚乙二醇沉淀物引入DNA构造，这在Paszkowski等人的Embo J.3：2717-2722(1984)中有所描述。电穿孔技术在Fromm等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824(1985)中有所描述。弹道转化技术在Klein等人的Nature 327：70-73(1987)中有所描述。利用许多方法，可以转化谷类物种例如黑麦(de la Pena等人，Nature 325：274-276(1987))、玉米(Rhodes等人，Science 240：204-207(1988))和稻米(Shimamoto等人，Nature 338：274-276(1989)，通过电穿孔；Li等人的Plant Cell Rep.12：250-255(1993)，通过弹道技术)。
Agrobacterium tumefaciens介导的转化技术在科学文献中有较好的描述。参见例如，Horsch等人的Science 233：496-498(1984)和Fraley等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803(1983)。虽然Agrobacterium主要用于双子叶植物，但是某些单子叶植物也能用Agrobacterium来转化。例如，稻米的Agrobacterium转化在Hiei等人，Plant J.6：271-282(1994)中有所描述。
可以培养用上述任何转化技术衍生的转化植物细胞，以便再生拥有所转化的基因型并由此拥有高水平的2-乙酰基-1-吡咯和较大香气的整个植物。这种再生技术依赖于组织培养生长介质中某些植物激素的操纵，一般依赖于已经与2AP核苷酸序列一起引入的抗微生物剂和/或除莠剂。由所培养的原生质体再生植物，这在Evans等人，原生质体的分离和培养(Protoplasts Isolation and Culture)，Handbook ofPlant Cell Culture，pp.124-176，MacMillilan Publishing Company，New York，1983；和植物、植物原生质体的结合、再生(Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts)，pp.21-73，CRC Press，Boca Raton，1985中有所描述。再生也可从植物愈伤组织、外植体、器官、或其一部分得到。这样的再生技术通常在Klee等人的Ann.Rev.ofPlant Phys.38：467-486(1987)中有所描述。
本领域的技术人员将认识到，表达盒在稳定并入转基因植物并确定是可操作的之后，它能够通过有性交配引入到其它植物内。根据待交配的物种，可采用许多标准繁殖技术中的任一种。
IV.测试2-乙酰基-1-吡咯水平
A.感觉评估：感觉干种子、熟米或地面叶子的挥发性香气(Dhulappanavar，1976，Ghose等人，1952，Kadam等人，1938)。这样的感觉包括品尝测试。在稻米种植者中另一种受欢迎的实践是，在水中加热叶组织，然后施加稀KOH溶液(Sood andSiddiq，1978)。这些测试并不总是一致和可靠的，也倾向于人的误差和偏爱。
B.色谱学：建立了一种更可靠的利用气相色谱的方法，用于定量100克熟米中的挥发性化合物(Petrov等人，1995)。最近，开发了气相色谱/质谱(GCMS)技术，用于分析仅1克米中的十亿分之一那么小的2-乙酰基-1-吡咯水平(Mahatheeranont等人，1995)。如此，利用GCMS来测试天然出现和非天然出现的植物中的2-乙酰基-1-吡咯水平。参见图1。
优选实施例的描述
例1：控制稻米香气的基因的定位克隆：以前已经基于定性和定量香气测定方法，在染色体8上对稻米的芳香特征进行了作图(Lorieux等人，1996)。已经在距离RG284.5cM处(Ahn等人，1992)并且在RG28与RG1之间的12cM之内(Lorieux等人，1996)对芳香基因进行作图。最近，已经在距离芳香基因2cM处，对由公共稻米基因组序列开发的单核苷酸多态性(SNP)标记物RSP04进行作图(Jin等人，2003)。
单个QTL位于由染色体8上的RFLP标记物RG1和RG28侧翼包围的4.5cM区域上(Lorieux等人，1996；Lanceras等人，2000)。来自KDML105的EcoRI BAC文库包括75,264个代表单倍体基因组的克隆。包括25个BAC克隆的初始BAC重叠群用该区域内的六个图标记物来选择(Wanchana等人，2005)，并进一步用HindIII指纹法来精制。为了鉴定2-乙酰基-1-吡咯累积中涉及的基因，利用以下策略使临界区域向下变窄。
最初，将为F7中的粒香分离的单个F6植物选为在临界区内产生新的重组体的来源。从F7至F12，对于每个生成，基于粒香和标记物的基因型来选择杂种植物。在F10的生成中，通过利用从KDML105 BAC末端序列开发的八个多态性标记物筛选374个F10植物，而使临界区域向下变窄到380kb。通过筛选274个F11植物，该区域进一步精制到120kb(图2)。基于图形基因型和2-乙酰基-1-吡咯的量，选择8个F11植物，以产生芳香的、非芳香的和杂种同基因系(图2)。在此阶段，为鸟枪测序选择3个KDML BAC克隆、155L11、68L13和167M23。来自KDML的序列和相应的Nipponbare基因组重叠群的排列，导致21个插入/缺失(“indel”)标记物的鉴定，以便在F12的产生中实施进一步的筛选。通过利用1,116个F12植物，靶区在58kb BAC，167M23之内向下变窄到27kb(图2)。在此交配中没有鉴定出进一步的重组。开发出几对等基因系，从而清楚地表明，米粒中的2-乙酰基-1-吡咯的累积差异(图6)。
序列分析揭示出，BAC 167M23含有19个基因。然而，仅有10个基因与公知蛋白或编码序列具有相似性。在27kb区域之内，三个候补基因被鉴定为：3-甲基巴豆酰-CoA羧基酶(MCCase)、假拟基因和未知蛋白质。利用来自KDML105与Jao Hom Nin(JHN)之间的交配的177个F6植物，在影响米粒香气和2-乙酰基-1-吡咯水平的未知蛋白质的外显子7之内鉴定出非芳香的黑米(一个重组位点)。为了研究来自BAC 167M23和BAC 68L13的这7个候补基因的表达，当2-乙酰基-1-吡咯在米粒中累积时，在米粒填充过程中实施RT-PCR。在芳香和非芳香同基因系传粉之后的10、15和20天从水稻圆锥花中收集总RNA。对于NBS/LRR基因，没有检测出表达。大多数的互补基因在芳香与非芳香同基因系之间并没有显示出不同的表达。仅仅在Os2AP的情形中，在传粉之后的15天芳香同基因系中的基因表达急剧下降(图3A)。Os2AP基因表达的急剧下降在叶、干和根中也出现了(图3B)。因此，表达研究和定位克隆都支持Os2AP作为负责米粒香气和2-乙酰基-1-吡咯合成的体内累积的调节剂。
研究者以前已经报道控制米粒香气的单个隐性核基因(Berner和Hoff，1986；Yanjuan等人，1992；Ali等人，1993)。这符合本文报道的发现。比较芳香和非芳香同基因系以及F1植物中的2-乙酰基-1-吡咯的累积。结果表明，在F1叶中检测不到2-乙酰基-1-吡咯。由于F2产生中的分离，因此2-乙酰基-1-吡咯的水平是在供体亲代中发现的水平的四分之一(图3C)。因此，经典的和分子遗传学都支持，外显子7中的突变是调节植物中2-乙酰基-1-吡咯的累积的分子机制。
比较KDML105、芳香同基因系、非芳香同基因系和Nipponbare中的Os2AP基因的结构。5.8kb Os2AP基因包括15个具有在外显子2发现的几个同义突变的外显子(图5A)。对于KDML105和芳香同基因系，在外显子7鉴定出两个重要的突变事件。首先，在位置730(A至T)和732(T至A)发现两个传递突变，随后8碱基对缺失‘GATTAGGC’始于位置734。在8个同基因系中2-乙酰基-1-吡咯水平的分析表明，8碱基对缺失与米粒中的2-乙酰基-1-吡咯的累积相关(图6A)。此突变导致移码翻译始于位置729、终止提前密码子始于位置753(图5B)。在Nipponbare中，Os2AP的整个长度cDNA被翻译成503个氨基酸。缺失产生252个氨基酸的截短肽(图5B)。在由KDML105和JHN衍生的177个F6植物中，侧翼包围8碱基对缺失的双重组解释在米粒中生成2-乙酰基-1-吡咯的失败。
此终止提前密码子对Os2AP的表达可具有显著作用。含有翻译终止提前密码子的大多数mRNAs经常不能被翻译。据此，它们经常触发无义介导的mRNA的衰变(NMD)，即其作用是减少基因表达中的错误的监督系统(Pulak和Anderson，1993)。此现象可解释芳香米中的Os2AP基因表达的低水平。
可能Os2AP可能对脯氨酸的代谢路径起作用。由脯氨酸合成谷氨酸需要脯氨酸脱氢酶(ProDH)和δ-1-脯氨酸-5-羧基酶脱氢酶(P5CDH)。在米粒填充期间，不能检测到脯氨酸脱氢酶的表达，同时非芳香同基因系中的Os2AP基因的表达上调。因此，在非芳香稻米中Os2AP可代替ProDH，而在芳香稻米中，Os2AP的降解可移动脯氨酸集合体，以便用于2-乙酰基-1-吡咯的合成。同位素标记实验也支持这个假说(Yoshihashi等人，2002)。
例2：利用Os2AP基因的植物转化：Os2AP基因并入用来下调稻米中的Os2AP的基因表达并增强2-乙酰基-1-吡咯水平的RNAi构造。
含有载体的Os2AP-ihp2AP的构建：pCAMBIA 1302载体用于表达Os2AP基因的有义—反义片段。有义和反义片段是分别利用来自KDML105的DNA和总RNA作为模板、通过PCR制备的。含有对应于外显子6-9的基因组DNA序列的有义片段，用含有NcoI和SpeI限制位点(下划线)的引物来扩增(正向：AATT
CCATGGGGTTGGTCTTCCTTCAGGTG(SEQ ID NO：80)；反向：AATT
ACTAGTTTCCACCAAGTTCCAGTGAA(SEQ ID NO：81))。含有对应于外显子6-8的cDNA序列的反义片段，用含有NcoI和NheI限制位点的引物来扩增(正向：AATT
CCATGGGGTTGGTCTTCCTTCAGGTG(SEQ ID NO：80)；反向：AATT
GCTAGCGGTCCAAAAGCAACCAAAGA(SEQ ID NO：82)。PCR产物首先用SpeI和NheI来消化，然后用T4DNA连接酶来连接。所连接的片段然后用NcoI来消化。将纯化的连接片段在NcoI克隆位点克隆成pCAMBIA1302载体(图7A)。
稻米的转化：非芳香稻米变种(Oryza sativa L.japonica变种Nipponbare)的胚胎发育愈伤组织用作粒子轰击转化的靶组织(Nimlek，1999)。利用引物Os2AP-外显子7.1-del F和R(U：5’-TGCTCCTTTGTCATCACACC-3’(SEQ ID NO：54)和L：5’-TTTCCACCAAGTTCCAGTGA-3’(SEQ ID NO：55))以及GFP引物(U：5’-CTTGTTGAATTAGATGGTGATGTT-3’(SEQ ID NO：83)和L：5’-GTTGTGGGAGTTGTAGTTGTATTC-3’(SEQ ID NO：84)、通过PCR，来筛选耐潮霉素的愈伤组织。
Souther印迹分析：经总DNA从转基因植物(R0)和对照植物(Nipponbare)中分离出来。基因组DNA(10mg)用NcoI消化，以便检测Os2AP-ihpRNA片段。作为阳性对照物，从质粒Os2AP-RNAi中分离的DNA用NcoI消化。在通过0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳之后，DNA被转移到Hybond-N+Nylon膜(Southem1975)。按照制造者(Amersham)的指令来实施与探针的杂交。利用(α-32P)-dCTP、通过随机引物方法来制备放射性探针。探针包括Os2AP基因的编码区(pOs2AP-RNAi的SpeI-NcoI片段，210个核苷酸)。
RT-PCR：为了调查不同生长阶段和不同组织中的转录水平，从Nipponbare和转基因植物的幼苗(10天)、成年叶(30天)和根(14天)以及开花圆锥中提取总RNA，并用于RT-PCR分析。染色体8上的Os2AP基因的芳香基因座用Os2AP-外显子7.1引物(U：5’-TGCTCCTTTGTCATCACACC-3’(SEQ ID NO：54)和L：5’-TTTCCACCAAGTTCCAGTGA-3’(SEQ ID NO：55))、通过PCR来扩增。也被称作BADH(Os2AP-chr4；Genbank Accession No.AB001348)的染色体4上的Os2AP基因同系物，用Os2APch4引物(U：5’-TAGCTTCACATCCCCATGTG-3’(SEQ ID NO：85)和L：5’-GCACCTTCACATCTTGCTGT-3’(SEQ ID NO：86)、通过PCR来扩增。作为对照物，稻米的肌动蛋白基因(Genbank Accession No：X16280)用肌动蛋白U：5’-ACATCGCCCTGGACTATGAC-3’(SEQ ID NO：87)和肌动蛋白L：5’-TGCTGAGAGATGCCAAGATG-3’(SEQ ID NO：88)来扩增。
实时定量PCR：利用Taqman化学和ABI PRISM 7700序列检测系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)、按照制造者的指令来实施实施定量PCR。将相对量作为Os2AP的拷贝数与稻米肌动蛋白的拷贝数之比来计算。Taqman探针被设计成在Os2AP基因的芳香与非芳香等位基因之间是有差别的。
结果：再生四个潮霉素-GFP阳性小植物。GFP的表达在转基因稻米植物中是改变的。T0RNAi2(10)即具有最好的GFP表达的细胞系，具有最少的内源性Os2AP表达(图7B)。2-乙酰基-1-吡咯内容物的分析以及利用KOH方法的感觉评估良好相关。T0RNAi2(10)含有最大量的2-乙酰基-1-吡咯并具有最香的叶子。表达少量干扰序列的T0RNAi5(20)和T0RNAi3(30)，累积较少的2-乙酰基-1-吡咯并具有较低的香叶分数(图7B)。T1RNAi2(10)的米粒香气的分离分析证实了这个结果。因此，RNA干涉对Os2AP基因表达的抑制，增强了稻米植物中2-乙酰基-1-吡咯的累积。这暗示，由8碱基对缺失产生的芳香稻米中的NMD对Os2AP基因表达的天然抑制，是芳香稻米香气的直接原因。
例3：稻米的Os2AP/BADH基因座的特征：Os2AP是以前在染色体4上发现的BADH(甜菜碱醛脱氢酶)的同系物(Nagamura等人，1997)。我们分别用Genbank序列存取号码AB001348和AP004463作为染色体4的BADH基因的基因组序列和染色体8的Os2AP基因的特征。按照基因注释，来自RiceGAAS(稻米基因组自动注释系统(Rice Genome Automated Annotation System)，来自Sakata等人，2002)的结果，即BADH和Os2AP的结构基因包括被14个内显子中断的15个外显子。ORFs分别编码BADH和Os2AP的505个和503个氨基酸残基的蛋白质。这两种蛋白质在氨基酸水平上具有77％的相同性，并与其它植物BADH蛋白质具有88％-99％的相同性。而且，这两种蛋白质含有编码去肽Val-Thr-Leu-Glu-Leu-Gly-Gly-Lys-Ser-Pro(SEQ ID NO：96)的核苷酸序列，该序列高度保存在普通的醛脱氢酶中(Weretilnyk等人，1990)。按照蛋白质序列的Pfam分析，BADH和Os2AP属于醛脱氢酶族。该族中的蛋白质在某些植物物种的糖胶甜菜碱的合成中具有推定作用。然而，在诸如不累积糖胶甜菜碱的稻米、玉米和小麦之类的谷类中，这些蛋白质的功能是未知的。我们惊讶，在脯氨酸分解代谢中起作用的脯氨酸-5-羧化脱氢酶(P5CDH)(Genbank Accession No.P30038)叶包括在此族内，这是由于已经报道，脯氨酸是2-乙酰基-1-吡咯的前体。Os2AP的功能可能是，催化其它醛而不是甜菜碱醛的脱氢。
Os2AP基因的表达和稻米的香气：为了鉴定Os2AP基因是否与香气的生物合成有关，分析芳香和非芳香同基因系(除了芳香基因区域之外，它们的基因组背景相同)的表达水平。结果，我们发现，BADH在两种同基因系之间没有显示出不同的表达，同时Os2AP相应地在芳香同基因系的所有组织中显示出基因抑制(图3D)。我们还研究了同基因系和Nipponbare及K105(芳香株系)中的蛋白质表达。Os2AP基因表达仅在芳香同基因系和KDMLL105中下调。反之，在非芳香的同基因系和Nipponbare稻米(非芳香株系)中没有检测到Os2AP基因表达的下调。
例4：标记物有助选择
为了利用传统的交配繁殖开发新的芳香稻米，可以使芳香稻米供体与更高产量的受体稻米变种交配。将针对其它特征中的米粒香气分离出交配的子代。此情形使种植者困惑并且使香气更大的稻米的传统繁殖很少成功。芳香基因的发现将为传统种植者制造一个新的范例。可开发用于检测芳香基因的特异性分子标记物，以便将成千种植物以最高的准确度筛选出来。DNA标记物技术使得种植者能够在早期阶段以高灵敏度检测出Os2AP的芳香等位基因。这使得种植者有更多的机会在以后阶段将优选的特征加到芳香植物中。在稻米中鉴定的香气的分子基础可能在其它谷类中发现，这也为其它谷类的DNA标记物的开发提供了途径。
例5：Os2AP基因的系统发育分析
脯氨酸的生物合成在植物王国中是高度保守的途径。本文提到的2-乙酰基-1-吡咯的生物合成可以是其它产生2-乙酰基-1-吡咯的植物所利用的共同主题。为了阐明这一点，利用多个序列排列来比较2AP的氨基酸序列。所得到的系统发育树表明，来自稻米、小麦和大麦的2AP基因可共享共同的祖先(图9B)。因此，谷类中的2-乙酰基-1-吡咯的生物合成可共享共同的主题。用其它谷类中的2AP基因直向同源所做的实验，在阐明这一点的将来必然得以实施。
有趣的是，往回追踪Os2AP基因出自于哪里。通过利用“Aromarker”PCR引物筛选95个兰德瑞斯猪变种，我们发现，具有8碱基对缺失的等位基因与增大的香气密切相关。我们还测序包括Oryza nivara和O.Ruftpogon的野生物种中的8碱基对缺失的外显子7(图9A)。我们发现，包括Thai Jasmine、Basmat和Azucena的大多数芳香变种都具有缺失，并因此共享可往回追踪到远古时代的共同祖先。我们还鉴定了芳香野生稻米中的芳香等位基因。因此，在人类耕作很久之前发生的单个突变，导致我们今天知道的芳香稻米的产生。
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tagttttaag tttgctgctt aaattcctca agggtttagt ttgcaaccaa atccttattt 540
tagcttcggt ataagccccc catatgatgt gcgtgcgtcg gcatcggaag tgcgtatcct 600
ctgttctgga ctaggaattg gccataggtt gatcgacagt tcgagtattc tgcttctgtt 660
tggaataagt tggaagcatg gctgattgtg tatctggatg ctgtttttgt ggtgattcgt 720
ttcaagctct tgttaattga tgggttcaag cggagagggt gcgcaacaac aagtgtatat 780
ggctcacggc catgggtgtg cacatttgat tggtgcgcaa caacaagtgt atattgtgtg 840
tgcttcgtta gttggcaggt cctagtcact aaatcactat tggattggta ctagctactt 900
ttgtgccttg acgatgggac tggattacta gccttttggt tgcctttgtg gtattccgtt 960
gttatgggcc tgttgatgga tggatccctt taatttctag tgccaaatgc atgctagatt 1020
tctcacagtt tttctcttca ggttatattt ctcgtatttc cttttcctaa aggattgctt 1080
tttcatgtat tttctggcat atataggtta ttattattat tattctccag aacaagatta 1140
cccatattat ggatcactag tgtacacttt tttggatgaa aaacctactt actgaaagta 1200
aaacagtgac cagtgcacac tttacttgaa ctgtcaaacc atcaattttc tagcaaagca 1260
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ggaaatatgc taatttctat cataaaaatt ttcatggcat atgcgagcat tttatgatca 1380
ccttttccct ttttcttcag ataatcgaga ggaaatctga gctggctaga ctagagacgc 1440
ttgattgtgg gaagcctctt gatgaagcag catgggacat ggtatgtggc cagttatcca 1500
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atccttggac aaaaggcaaa atgcacctgt ctctcttcca atggaaaact ttaaatgcta 1680
tcttcggaaa gagcctatcg gtgtagttgg gttgatcaca ccttggtatt tcacattttt 1740
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catgcatata ctgaatgagt ttacaacttt acatgatttt tttgaactat gaaagttgaa 1860
gacatttgag attttattcc tcttctcttg tgcaaacata ttattgtctc acaaattgta 1920
cctagcagct actctctccg tttcatatta taagtcgttt gacttttttc ctagtcaaaa 1980
tgtgttaagt ttgaccaagt ttatagaaaa atttagcaac atctaaaata tcaaagtcat 2040
gttttagtgt tttttcaggc tctcatgtaa gcaattttga tgtgccctct cctttcttct 2100
taatataatg atacacagct cttgtgtatt caaaggaata tatatatata tatatatata 2160
taatgataca cacctctcct ccgtgttaat gcagctcatt tgttctgtcc cggttcaaat 2220
atctattttt ctcatatgtt gtcagcatga ttcacttaat ttagtatata gaagatgcca 2280
ttatttatgt ctggaatctt actgcagaag ggaaaacaat tgataacgga attgattgca 2340
ttctaatttg ttgtttcttt gttatgttct tatcgacaat tacaaatttg attctgagaa 2400
tcatgttcgg gatgtgtatt tctactgcag gaactatcct ctcctgatgg caacatggaa 2460
ggtagctcct gccctggctg ctggctgtac agctgtacta aaaccatctg aattggcttc 2520
cgtgtaagtt taacatgtta acttgttaat gtcataccca tgctagttgc aatgacattt 2580
gattttaaaa tgttgtggca tgtccatgct gcaagcaatg taatttgaaa tctctctcta 2640
tcattaatta ccaggacttg tttggagctt gctgatgtgt gtaaagaggt tggtcttcct 2700
tcaggtgtgc taaacatagt gactggatta ggttctgaag ccggtgctcc tttgtcatca 2760
caccctggtg tagacaaggt acagctattc ctcctgtaat catgtatacc ccatcaatgg 2820
aaatgatatt cctctcaata catggtttat gttttctgtt aggttgcatt tactgggagt 2880
tatgaaactg gtatatattt cagctgctcc tatggttaag gtttgtttcc aaatttctgt 2940
ggatattttt tgttctcttt ctactaactc tctattatca attctcaatg ttgtcctttt 3000
cttttaactc ctttactttt tagaattgtg atcaagacac tttgagcatc attctagtag 3060
ccagttctat cctgtttctt acctttttat ggttcgtctt ttcttgacag cctgtttcac 3120
tggaacttgg tggaaaaagt cctatagtgg tgtttgatga tgttgatgtt gaaaaaggta 3180
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gtcctgtatt attttgagca gatcttgtac tggttgatcg gcttgcatga aaatattgtt 3480
gaggattata atgccatgcc aactgagtaa agaaaagagt tgtaaaatat gttatgcaac 3540
atgaatatat atgtgatttc atttttcctt tttcttttcg tggcaaggaa ggcagttagg 3600
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ttcctaacta caattcacct tgattagtca gtaacttgat attggcaatt ctagctgatt 3720
atgaattctg tttatatttc actaattttg aatctttaat tacattttat ggttgaaatt 3780
taacgttttg tctggttatg gactctgttt gtattcactc aatttggatc ttccattaga 3840
tttcattgtt ggtccttctt cttgtacagc tgttgagtgg actctctttg gttgcttttg 3900
gaccaatggc cagatttgca gtgcaacatc gcgtcttatt cttcatgtaa gcattgaata 3960
tatccgtcaa tcataatcta ttgttgtact tgattttttt tctgatcaac tcctgagttc 4020
agattattat atgatgccat tactattgca cagagcgaat aaaattgtat ttatgcacag 4080
catgtatttt gagtaatata tgcattgcct attatttaat atatagattg tagcacttaa 4140
ttttgtgtcc atgtctctat gatgtttatt actttattat tgccggcatg aagcaacttt 4200
gaactctatg ttgatcttga actaaaattg aaattaattg gcttattgct attaatgata 4260
tagctttcag cttcttgctc ctgaccatga aagttttgca gaaaaaaatc gctaaagaat 4320
ttcaagaaag gatggttgca tgggccaaaa atattaaggt gtcagatcca cttgaagagg 4380
gttgcaggct tgggcccgtt gttagtgaag gacaggtacc acatgtaaac tttttctaaa 4440
ttcaaaaaag aaatgccact gatcaatggt aggtccttcc aagccttatt gctggattgt 4500
tgcactgttt tgtcaatttt gtgtaatata gttctgaatg aattagtcgg tgtatgctct 4560
tgctagttgc tagtatgtgg tacagggtct tcctactttg agcaaattcg tgttaaaatg 4620
cattgatgaa aaggccacct ttccgtaggt ttatcttgtc ataatttaaa ccccaataaa 4680
attttaattt tttgttttga ccccatggca ctttaatgaa atcacttagc catgagcttt 4740
tgtatatatt ttcaaagcac cagaatgttt agatggtttg ttggaaatct tacacatcct 4800
attgccttgt gtcagtatga gaagattaag caatttgtat ctaccgccaa aagccaaggt 4860
gctaccattc tgactggtgg ggttagaccc aaggtaataa tctactacac ggttgtatat 4920
ataggtaccc acatatcatt atgaagtaga aataatcttg tatgtttttg tcagcatctg 4980
gagaaaggtt tctatattga acccacaatc attactgatg tcgatacatc aatgcaaatt 5040
tggagggaag aagtttttgg tccagtgctc tgtgtgaaag aatttagcac tgaagaagaa 5100
gccattgaat tggccaacga tactcagtga gttttttttt taatacagtt cattgtcctg 5160
ttcaatcttg cagcatatgt atatactctg tggcatatga acttattctg ctactactac 5220
ttttgatagt tatggtctgg ctggtgctgt gctttccggt gaccgcgagc gatgccagag 5280
attaactgag gtatatccaa gtgaaggggg ttggcattgt ttgattcata tgacatggtt 5340
gcatcaagct gatattcaag aatctcattt attacttgca ttctatgcat ctccagttct 5400
tccctggact ccggtcaatg ttaatatagt ttgtttgcta gtagtatgct actccaatta 5460
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caaaagagag ggaaatactt aacgaaaatt tcctactgca ggagatcgat gccggaatta 5580
tctgggtgaa ctgctcgcaa ccctgcttct gccaagctcc atggggcggg aacaagcgca 5640
gcggctttgg acgcgagctc ggagaagggt gggtagcaca caacaatctc actttaaaac 5700
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tttcaggggc attgacaact acctaagcgt caagcaagtg acggagtacg cctccgatga 5820
gccgtgggga tggtacaaat ccccttccaa gctgtaa 5857
<210>2
<211>1504
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>2
atggccacgg cgatcccgca gcggcagctc ttcgtcgccg gcgagtggcg cgcccccgcg 60
ctcggccgcc gcctccccgt cgtcaacccc gccaccgagt cccccatcgg cgagatcccg 120
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tttgcagatc ttgcagaatc cttggacaaa aggcaaaatg cacctgtctc tcttccaatg 420
gaaaacttta aatgctatct tcggaaagag cctatcggtg tagttgggtt gatcacacct 480
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gccggtgctc ctttgtcatc acaccctggt gtagacaagg ttgcatttac tgggagttat 720
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gtaa 1504
<210>3
<211>251
<212>PRT
<213>Oryza sativa
<400>3
Met Ala Thr Ala Ile Pro Gln Arg Gln Leu Phe Val Ala Gly Glu Trp
1 5 10 15
Arg Ala Pro Ala Leu Gly Arg Arg Leu Pro Val Val Asn Pro Ala Thr
20 25 30
Glu Ser Pro Ile Gly Glu Ile Pro Ala Gly Thr Ala Glu Asp Val Asp
35 40 45
Ala Ala Val Ala Ala Ala Arg Glu Ala Leu Lys Lys Asn Pro Gly Arg
50 55 60
Asp Trp Ala Pro Ala Pro Gly Ala Val Arg Ala Lys Tyr Ile Arg Ala
65 70 75 80
Ile Ala Asp Lys Ile Ile Glu Arg Lys Ser Glu Leu Ala Arg Leu Glu
85 90 95
Thr Leu Asp Cys Gly Lys Pro Leu Asp Glu Ala Ala Trp Asp Met Asp
100 105 110
Asp Val Ala Gly Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Asp Leu Ala Glu Ser Leu
115 120 125
Asp Lys Arg Gln Asn Ala Pro Val Ser Leu Pro Met Glu Asn Phe Lys
130 135 140
Cys Tyr Leu Arg Lys Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr Pro
145 150 155 160
Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro Ala Leu
165 170 175
Ala Ala Gly Cys Thr Ala Val Leu Lys Pro Ser Glu Leu Ala Ser Val
180 185 190
Thr Cys Leu Glu Leu Ala Asp Val Cys Lys Glu Val Gly Leu Pro Ser
195 200 205
Gly Val Leu Asn Ile Val Thr Gly Leu Gly Ser Glu Ala Gly Ala Pro
210 215 220
Leu Ser Ser His Pro Gly Val Asp Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Tyr
225 230 235 240
Glu Thr Gly Ile Tyr Phe Ser Cys Ser Tyr Gly
245 250
<210>4
<211>5859
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>4
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gaaaacttta aatgctatct tcggaaagag cctatcggtg tagttgggtt gatcacacct 480
tggaactatc ctctcctgat ggcaacatgg aaggtagctc ctgccctggc tgctggctgt 540
acagctgtac taaaaccatc tgaattggct tccgtgactt gtttggagct tgctgatgtg 600
tgtaaagagg ttggtcttcc ttcaggtgtg ctaaacatag tgactggatt aggttctgaa 660
gccggtgctc ctttgtcatc acaccctggt gtagacaagg ttgcatttac tgggagttat 720
gaaactggta aaaagattat ggcttcagct gctcctatgg ttaagcctgt ttcactggaa 780
cttggtggaa aaagtcctat agtggtgttt gatgatgttg atgttgaaaa agctgttgag 840
tggactctct ttggttgctt ttggaccaat ggccagattt gcagtgcaac atcgcgtctt 900
attcttcata aaaaaatcgc taaagaattt caagaaagga tggttgcatg ggccaaaaat 960
attaaggtgt cagatccact tgaagagggt tgcaggcttg ggcccgttgt tagtgaagga 1020
cagtatgaga agattaagca atttgtatct accgccaaaa gccaaggtgc taccattctg 1080
actggtgggg ttagacccaa gcatctggag aaaggtttct atattgaacc cacaatcatt 1140
actgatgtcg atacatcaat gcaaatttgg agggaagaag tttttggtcc agtgctctgt 1200
gtgaaagaat ttagcactga agaagaagcc attgaattgg ccaacgatac tcattatggt 1260
ctggctggtg ctgtgctttc cggtgaccgc gagcgatgcc agagattaac tgaggagatc 1320
gatgccggaa ttatctgggt gaactgctcg caaccctgct tctgccaagc tccatggggc 1380
gggaacaagc gcagcggctt tggacgcgag ctcggagaag ggggcattga caactaccta 1440
agcgtcaagc aagtgacgga gtacgcctcc gatgagccgt ggggatggta caaatcccct 1500
tccaagctgt aa 1512
<210>6
<211>503
<212>PRT
<213>Oryza sativa
<400>6
Met Ala Thr Ala Ile Pro Gln Arg Gln Leu Phe Val Ala Gly Glu Trp
1 5 10 15
Arg Ala Pro Ala Leu Gly Arg Arg Leu Pro Val Val Asn Pro Ala Thr
20 25 30
Glu Ser Pro Ile Gly Glu Ile Pro Ala Gly Thr Ala Glu Asp Val Asp
35 40 45
Ala Ala Val Ala Ala Ala Arg Glu Ala Leu Lys Arg Asn Arg Gly Arg
50 55 60
Asp Trp Ala Arg Ala Pro Gly Ala Val Arg Ala Lys Tyr Leu Arg Ala
65 70 75 80
Ile Ala Ala Lys Ile Ile Glu Arg Lys Ser Glu Leu Ala Arg Leu Glu
85 90 95
Thr Leu Asp Cys Gly Lys Pro Leu Asp Glu Ala Ala Trp Asp Met Asp
100 105 110
Asp Val Ala Gly Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Asp Leu Ala Glu Ser Leu
115 120 125
Asp Lys Arg Gln Asn Ala Pro Val Ser Leu Pro Met Glu Asn Phe Lys
130 135 140
Cys Tyr Leu Arg Lys Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr Pro
145 150 155 160
Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro Ala Leu
165 170 175
Ala Ala Gly Cys Thr Ala Val Leu Lys Pro Ser Glu Leu Ala Ser Val
180 185 190
Thr Cys Leu Glu Leu Ala Asp Val Cys Lys Glu Val Gly Leu Pro Ser
195 200 205
Gly Val Leu Asn Ile Val Thr Gly Leu Gly Ser Glu Ala Gly Ala Pro
210 215 220
Leu Ser Ser His Pro Gly Val Asp Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Tyr
225 230 235 240
Glu Thr Gly Lys Lys Ile Met Ala Ser Ala Ala Pro Met Val Lys Pro
245 250 255
Val Ser Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Ile Val Val Phe Asp Asp
260 265 270
Val Asp Val Glu Lys Ala Val Glu Trp Thr Leu Phe Gly Cys Phe Trp
275 280 285
Thr Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala Thr Ser Arg Leu Ile Leu His Lys
290 295 300
Lys Ile Ala Lys Glu Phe Gln Glu Arg Met Val Ala Trp Ala Lys Asn
305 310 315 320
Ile Lys Val Ser Asp Pro Leu Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly Pro Val
325 330 335
Val Ser Glu Gly Gln Tyr Glu Lys Ile Lys Gln Phe Val Ser Thr Ala
340 345 350
Lys Ser Gln Gly Ala Thr Ile Leu Thr Gly Gly Val Arg Pro Lys His
355 360 365
Leu Glu Lys Gly Phe Tyr Ile Glu Pro Thr Ile Ile Thr Asp Val Asp
370 375 380
Thr Ser Met Gln Ile Trp Arg Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Leu Cys
385 390 395 400
Val Lys Glu Phe Ser Thr Glu Glu Glu Ala Ile Glu Leu Ala Asn Asp
405 410 415
Thr His Tyr Gly Leu Ala Gly Ala Val Leu Ser Gly Asp Arg Glu Arg
420 425 430
Cys Gln Arg Leu Thr Glu Glu Ile Asp Ala Gly Ile Ile Trp Val Asn
435 440 445
Cys Ser Gln Pro Cys Phe Cys Gln Ala Pro Trp Gly Gly Asn Lys Arg
450 455 460
Ser Gly Phe Gly Arg Glu Leu Gly Glu Gly Gly Ile Asp Asn Tyr Leu
465 470 475 480
Ser Val Lys Gln Val Thr Glu Tyr Ala Ser Asp Glu Pro Trp Gly Trp
485 490 495
Tyr Lys Ser Pro Ser Lys Leu
500
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>7
gccatgccaa ctgagtaaag 20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>8
caattttatt cgctctgtgc 20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>9
tgcaacatcg cgtcttattc 20
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>10
gcaactagca agagcataca cc 22
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>11
acctgacatc atgcctttgg 20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>12
ccggtcatca gctaacttcc 20
<210>13
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>13
cccttcgtca taaaatatac tagcaa 26
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>14
tcctccaaca tgctctttcg 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>15
cagagaagtt tacgccgttg 20
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>16
tttttaaata agatgaacgg tcaaa 25
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>17
ctctccaccc tctgcttctg 20
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>18
ctctccgctt gaacccatc 19
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>19
gcatggctga ttgtgtatct g 21
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>20
ttccaaacct acggacaaaa g 21
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>21
ttcctcttct cttgtgcaaa c 21
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>22
cacggaagcc aattcagatg 20
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>23
ctatcctctc ctgatggcaa c 21
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>24
tggctactag aatgatgctc aaag 24
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>25
ccttttgtgt cgcttttgag 20
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>26
aaaatagcct tcactcgttg c 21
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>27
ccatcgattt cgagggtaac 20
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>28
cgcatccgat aatatgttg 19
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>29
gtaattagga gtacgactct cgtc 24
<210>30
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>30
gcttatagcc tactgtatcc tcctc 25
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>31
aattggttaa cccagcaagc 20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>32
acattgtgaa acggaggaag 20
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>33
gctataagcc agctgcaaac 20
<210>34
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>34
gcagttggta cggacttcg 19
<210>35
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>35
cctaaatatt tgacgccgtt g 21
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>36
tgaagaggag ggtaccgatg 20
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>37
caccactcca cacctgacac 20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>38
gtacggaaca cacgcacaag 20
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>39
tgttgttgtt gttgctgctg 20
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>40
gccgtgagcc atatacactt g 21
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>41
agctccagct cctcctcgat 20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>42
tatctctcac cgaccccaaa 20
<210>43
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>43
tgttgccatc aggagagga 19
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>44
ctcttgatga agcagcatgg 20
<210>45
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>45
cccagtaaat gcaaccttgt c 21
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>46
ggcaacatgg aaggtagctc 20
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>47
ccatgcaacc atcctttctt 20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>48
ttatggcttc agctgctcct 20
<210>49
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>49
caatggcttc ttcttcagtg c 21
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>50
gcccgttgtt agtgaaggac 20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>51
gtaccatccc cacggctcat 20
<210>52
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>52
cgagcgatgc cagagatta 19
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>53
agcacatggc aaatcaaaca 20
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>54
tgctcctttg tcatcacacc 20
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>55
tttccaccaa gttccagtga 20
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>56
ttcgctgcag aacagatgac 20
<210>57
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>57
ctgatggtta cgcgacaatt t 21
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>58
atttgaaccg ggacagaaca 20
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>59
ttttgatgtg ccctctcctt 20
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>60
tgggtaatct tgttctggag 20
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>61
agtgccaaat gcatgctaga 20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>62
tggggctcaa aaacctactg 20
<210>63
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>63
gtccgggcca agtacctc 18
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>64
atctctcacc gaccccaaat 20
<210>65
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>65
ccattggaag agagacaggt g 21
<210>66
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>66
tgttgttgtt gttgctgctg 20
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>67
tggggctcaa aaacctactg 20
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>68
ggttggtctt ccttcaggtg 20
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>69
ggtccaaaag caaccaaaga 20
<210>70
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>70
actggtaaaa agattatggc 20
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>71
caagccgatc aaccagtaca 20
<210>72
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>72
ccatgctgca agcaatgta 19
<210>73
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>73
aaccatagga gcagctgaaa ta 22
<210>74
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>74
accctggtgt agacaaggta 20
<210>75
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>75
gggagttatg aaactggtat at 22
<210>76
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>76
ataggagcag ctgaagccat 20
<210>77
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>77
gtcccgcact tcagaattag 20
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>78
ctctgcttct gcctctgatt 20
<210>79
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>79
ctggctacta gaatgatgct c 21
<210>80
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>80
aattccatgg ggttggtctt ccttcaggtg 30
<210>81
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>81
aattactagt ttccaccaag ttccagtgaa 30
<210>82
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>82
aattgctagc ggtccaaaag caaccaaaga 30
<210>83
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>83
cttgttgaat tagatggtga tgtt 24
<210>84
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>84
gttgtgggag ttgtagttgt attc 24
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>85
tagcttcaca tccccatgtg 20
<210>86
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>86
gcaccttcac atcttgctgt 20
<210>87
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>87
acatcgccct ggactatgac 20
<210>88
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>Primer
<400>88
tgctgagaga tgccaagatg 20
<210>89
<211>56
<212>DNA
<213>Oryza rufipogon
<400>89
tgcatttact gggagttatg aaactggtat atatttcagc tgctcctatg gttaag 56
<210>90
<211>56
<212>DNA
<213>Oryza rufipogon
<400>90
tgcatttact gggagttatg aaactggtat atatttcagc tgctcctatg gttaag 56
<210>91
<211>56
<212>DNA
<213>Oryza rufipogon
<400>91
tgcatttact gggagttatg aaactggtat atatttcagc tgctcctatg gttaag 56
<210>92
<211>64
<212>DNA
<213>Oryza rufipogon
<400>92
tgcatttact gggagttatg aaactggtaa aaagattatg gcttcagctg ctcctatggt 60
taag 64
<210>93
<211>56
<212>DNA
<213>Oryza nivara
<400>93
tgcatttact gggagttatg aaactggtat atatttcagc tgctcctatg gttaag 56
<210>94
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<212>DNA
<213>Oryza nivara
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1 5 10
Claims (23)
1、一种转基因稻米植物，所述转基因稻米植物与对照的非转基因稻米植物相比，包括高水平的化合物2-乙酰基-1-吡咯，其中与所述对照的非转基因稻米植物中的2-乙酰基-1-吡咯基因编码的mRNA或蛋白质水平相比，通过减小所述转基因稻米植物中2-乙酰基-1-吡咯编码的mRNA或蛋白质水平，而增大所述转基因植物中的所述化合物的水平。
2、如权利要求1所述的转基因稻米植物，其特征在于，通过反义取向的2-乙酰基-1-吡咯基因或其一部分的表达，或通过RNA干扰，而减小所述转基因植物中的2-乙酰基-1-吡咯基因的mRNA水平。
3、如权利要求1所述的转基因稻米植物，其特征在于，所述2-乙酰基-1-吡咯基因包括SEQ ID NO：5中描述的序列。
4、来自权利要求1所述的转基因植物的种子。
5、一种编码植物的2-乙酰基-1-吡咯蛋白质的分离核酸，其中所述核酸在以下杂交条件下杂交到SEQ ID NO：2中描述的核酸序列或其补体上：所述杂交条件包括在60-65℃于0.1X SSC和0.1％SDS中至少洗涤一次30分钟。
6、如权利要求5所述的分离核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO：2中描述的核酸序列相同性大于70％、大于80％、大于90％或大于95％。
7、如权利要求5所述的分离核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO：2中描述的序列基本上相同。
8、如权利要求5所述的分离核酸，其特征在于，所述核酸编码与SEQ ID NO：3中描述的氨基酸序列基本上相同的多肽。
9、如权利要求5所述的分离核酸，其特征在于，所述核酸编码与SEQ ID NO：3中描述的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％相同的多肽。
10、如权利要求5所述的分离核酸，其特征在于，所述核酸能够操作地连接到启动子上。
11、如权利要求10所述的分离核酸，其特征在于，所述启动子是组成型启动子、发育型启动子或诱导型启动子。
12、如权利要求10所述的分离核酸，其特征在于，所述启动子是从以下选择的：鸭草跖黄斑驳病毒启动子、甘蔗badna病毒启动子、水稻tungro bacilliform病毒启动子、玉米划线病毒元素、小麦矮化病毒启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子、胭脂氨酸合成酶(NOS)启动子、章鱼氨酸合成酶启动子、玄参花叶病毒(FMV)启动子和稻米肌动蛋白启动子。
13、一种包括权利要求5所述的分离核酸的细胞。
14、一种非天然出现的植物，所述植物与对照的天然出现的植物相比，包括高水平的化合物2-乙酰基-1-吡咯，其中与所述对照植物相比，通过减小一种或多种2-乙酰基-1-吡咯基因的表达、减少所述一种或多种2-乙酰基-1-吡咯基因产生的mRNA水平，和/或减小一种或多种2-乙酰基-1-吡咯蛋白质的活性或量，而增大所述所述化合物2-乙酰基-1-吡咯的水平。
15、如权利要求14所述的非天然出现的植物，其特征在于，通过反义取向的2-乙酰基-1-吡咯基因或其一部分的表达，或通过RNA干扰，而减小所述2-乙酰基-1-吡咯基因的表达。
16、如权利要求14所述的非天然出现的植物，其特征在于，通过诱变减小所述2-乙酰基-1-吡咯基因的表达。
17、如权利要求14所述的非天然出现的植物，其特征在于，所述植物选自于由稻米、小麦、大麦、黑麦、椰子、高粱和燕麦构成的组合。
18、一种由权利要求14所述的非天然出现的植物产生的种子。
19、一种检测植物或植物部分中2-乙酰基-1-吡咯基因的芳香等位基因的存在的方法，包括检测2-乙酰基-1-吡咯基因是否具有减小2-乙酰基-1-吡咯蛋白质的量、功能或活性的突变。
20、如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述突变是在Os2AP的芳香等位基因中发现的8碱基对缺失。
21、如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述检测突变的方法包括PCR和/或微阵列的使用。
22、如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述检测突变的方法包括杂交或测序。
23、如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述检测突变的方法包括检测2-乙酰基-1-吡咯蛋白质的水平、结构或活性。
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