FR2882626A1 - Acides nucleiques augmentant la synthese de 2-acetyl-1-pyrroline chez les plantes et les champignons - Google Patents

Abstract

Le composé aromatique 2-acétyl-1-pyrroline (2AP) est le composant majeur de la flaveur de tous les riz aromatiques.La présente invention fournit des plantes non naturelles dans lesquelles le 2-acétyl-1-pyrroline est synthétisé à un meilleur niveau que dans des variétés naturelles non-aromatiques.Des acides nucléiques sont aussi fournis, qui peuvent être utilisés comme marqueurs moléculaires pour sélectionner des plantes ou des champignons qui synthétisent à un meilleur niveau la 2 acétyl-1-pyrroline.

Description

ACIDES NUCLEIQUES AUGMENTANT LA SYNTHESE DE 2-ACETYL-1-PYRROLINE CHEZ LES

PLANTES ET LES CHAMPIGNONS

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne d'une manière générale la génétique moléculaire végétale. En particulier, elle concerne des plantes et champignons non naturels qui ont des niveaux élevés de 2acétyl-1-pyrrolidine, des procédés pour produire de telles plantes et de tels champignons, et des acides nucléiques impliqués dans la synthèse de la 2-acétyl- l -pyrrroline.

ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION L'arôme des grains est la caractéristique la plus attirante du riz de grande qualité demandé de plus en plus non seulement par le marché asiatique mais aussi largement reconnu en Europe et dans le monde entier. La fragrance du riz cuit est composée de plus de cent composés volatils comme des hydrocarbures, des alcools, des aldéhydes, des cétones, des acides, des esters, des phénols, des pyridines, des pyrazines et d'autres composés (Yajima et al., 1978; Maga, 1984; Takashi et al., 1980; Paule et Power, 1989). Le composé aromatique "analogue au popcorn" 2-acétyl-l-pyrroline (2AP) a été découvert comme étant le principal composant de la flaveur de tous les riz aromatiques, de la croûte du pain de froment et du pain de seigle (Buttery et al., 1982, 1983). La 2-acétyl-1-pyrroline est principalement responsable de la fragrance caractéristique de nombreuses variétés de riz aromatique (Tanchotikul et Hsieh, 1991). De manière surprenante, cette fragrance du riz a aussi été isolée et identifié à partir des feuilles de pandanus (Buttery et al., 1983), des fleurs d'arbre à pain (Vallaris Glabra Ktze.) (Wongpornchai et al., 2003), du millet humide (Seitz et al., 19931, du popcorn (Schieberle, 1991), de Bacillus ceres (Romanczyk et al. , 1995) et de champignons (Nagsuk et al., 2004). La 2-acétyl-1-pyrroline est présente dans toutes les parties de la plante riz aromatiques (tiges, feuilles, grains) sauf les racines (Lorieux et al., 1996). Tandis que cette fragrance est présente dans les grains aromatiques, elle ne l'est pas dans tous les grains.

Le composé aromatique 2-acétyl-1-pyrroline a un cycle pyrroline similaire à l'aminoacide proline (FIGURE 1). Le premier indice impliquant l'aminoacide proline en tant que précurseur de synthèse de la 2-acétyl-1pyrroline a été trouvé dans des expériences de culture de cellules et de cals (Suprasanna et al., 1998; Suprasanna et al., 2002). Cette conclusion était soutenue par des expériences utilisant un marquage isotopique montrant que le précurseur de la 2-acétyl-l-pyrroline des grains est très probablement l'aminoacide proline dans le riz Thai Hom Mali (THM) (Yoshihashi et al., 2002) et probablement dans d'autres riz aromatiques. Cependant, la voie de biosynthèse exacte de la 2-acétyl-1-pyrroline reste à élucider. Ainsi, il est nécessaire d'identifier les gènes impliqués dans la synthèse de la 2-acétyl-1-pyrroline et de fournir un procédé pour augmenter les niveaux de 2-acétyl-l-pyrroline dans les plantes et les champignons pour augmenter l'arôme.

RESUME DE L'INVENTION La présente invention répond à cette nécessité en fournissant des plantes et champignons non naturels dans lesquels le composé 2-acétyl-1-pyrroline est produit à un niveau élevé par rapport à des plantes et champignons témoins. Les plantes et champignons témoins désignent des plantes et des champignons de génotype similaire ou apparenté qui ont de plus bas niveaux du composé 2-acétyl-l-pyrroline. De telles plantes témoins peuvent être non naturelles. La présente invention fournit en outre des procédés pour cribler et pour créer de telles plantes et de tels champignons non naturels, et des semences produites par lesdites plantes.

La voie de biosynthèse exacte du composé 2-acétyl-l-pyrroline n'est pas connue, mais c'est un dérivé de la proline. On a émis l'hypothèse que la proline peut être convertie en 2-acétyl-1-pyrroline ou en acide glutamique, de sorte que l'inhibition de la voie de synthèse de l'acide glutamique augmentera la disponibilité de]a proline (ou d'intermédiaires) pour la synthèse de la 2-acétyl-l-pyrroline (FIGURE 4A). Un gène codant une protéine régulant l'arôme dans le riz, appelé Os2AP (Oryza sativa 2acétyl-1-pyrroline) a été identifié comme membre de la famille des aldéhyde déshydrogénases qui peuvent jouer un rôle clé dans la conversion de la proline en acide glutamique. Toutes les variétés de riz aromatique testées ont une délétion de huit nucléotides dans ce gène. La délétion crée un codon d'arrêt prématuré qui conduit à une dégradation médiée non sens contre son propre ARNm, ce qui conduit à un phénotype de perte de fonction.

Des études d'interférence à ARN (ARNi) ont montré que l'interruption de la transcription du gène Os2AP conduisait à des niveaux élevés de 2acétyl-1-pyrroline chez des plantes, en même temps qu'un arôme accru.

La présente invention fournit des plantes et champignons non naturels ayant un niveau élevé de 2-acétyl-1-pyrroline créé par inhibition de l'expression du gène de 2-acétyl-1-pyrroline (2AP), réduction des niveaux d'ARNm du gène 2AP, et/ou réduction de l'activité de la protéine 2AP. Le niveau de la protéine 2AP peut être réduit de 25 %, 50 % ô ou 100 % par rapport à une plante témoin. L'inhibition de l'expression du gène 2AP ou la réduction des niveaux d'ARNm du gène 2AP peut être accomplie par: a) expression du gène 2AP ou d'un fragment de celui-ci dans l'orientation antisens; b) clonage d'une partie du gène dans une construction d'interférence à ARN et expression de cette construction dans des plantes transgéniques; ou c) mutagenèse par différents procédés (incluant Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) et la mutagenèse par insertion d'ADNt) puis criblage par PCR ou d'autres procédés pour un variant aromatique.

La présente invention fournit aussi une plante de type riz transgénique ayant un niveau élevé de composé 2-acétyl-l-pyrroline par rapport à son niveau dans une plante de type riz non transgénique témoin, où le niveau du composé est augmenté dans la plante transgénique par une réduction des niveaux d'ARNm ou de protéine codés par le gène 2AP dans la plante transgénique par rapport aux niveaux d'ARNm ou de protéine codés par le gène 2AP dans la plante non transgénique témoin. Dans un format, les niveaux d'ARNm et de protéine sont réduits par interférence à ARN ou. par antisens. L'invention concerne en outre des semences de riz transgéniques produites à partir du riz de l'invention.

Bien que les exemples qui suivent décrivent des expériences réalisées sur le riz, l'invention concerne d'autres plantes et champignons, incluant sans limitation, le blé, l'orge, le seigle, le cocotier, le sorgho et l'avoine.

La présente invention fournit en outre un acide nucléique isolé codant le gène 2AP, où ledit acide nucléique inclut un acide nucléique qui s'hybride à la séquence d'acide nucléique représentée dans SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 ou son complément dans des conditions d'hybridation qui incluent au moins un lavage dans 0,1 X SSC et 0,1% SDS à 60-65 C pendant trente minutes, un acide nucléique qui est identique à raison d'au moins 70%, 80%, 90%, 95%, ou plus de 95% à la séquence représentée dans SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5, et un acide nucléique qui code un polypeptide qui est identique à raison d'au moins 70%, 80%, 90%, 95% ou de plus de 95% à la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6.

La quantité de 2-acétyl-l-pyrroline dans le riz peut varier selon les conditions de récolte et le type de sol. Une variété non aromatique, Nipponbare, a des niveaux de 2-acétyl-1-pyrroline dans la plage de 0 à 0, 1 ppm (parties par million). Au contraire, une variété de riz aromatique, Thai Hom Mali, a une quantité de 2-acétyl-1-pyrroline dans la plage de 1 à 2,5 ppm. L'exemple 2 décrit en détail une expérience d'interférence à ARN contre le gène Os2AP du riz, qui augmentait les niveaux de 2-acétyl-lpyrroline dans le riz Nipponbare jusqu'à 2,5 ppm. La présente invention fournit ainsi des procédés pour augmenter le niveau de fragrance à des niveaux aromatiques dans une plante non aromatique.

L'invention fournit aussi des constructions recombinantes et des vecteurs d'expression contenant les acides nucléiques de l'invention, où l'acide nucléique peut être lié de manière fonctionnelle à un promoteur. Un promoteur utile est un promoteur du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) qui confère de hauts niveaux d'expression dans la plupart des tissus végétaux.

L'invention fournit aussi des cellules hôtes qui contiennent les acides nucléiques, des constructions et des vecteurs d'expression de l'invention.

L'invention fournit aussi des procédés pour cribler des plantes et des acides nucléiques pour une mutation dans un gène 2AP conduisant à une diminution de l'expression ou de l'activité de la protéine 2AP et donc à une augmentation d'arôme résultant de la production accrue du composé 2AP. Une mutation spécifique est une délétion de huit nucléotides associée à un phénotype aromatique dans le gène 2AP du riz. Le criblage pour cette mutation et d'autres mutations peut être réalisé par différents procédés, comme la PCR, le séquençage, l'hybridation ou des expériences avec des puces à ADN ( microarray ). Une autre option consiste à rechercher la réduction des niveaux de la protéine 2AP ou un changement de structure ou d'activité de la protéine 2AP'. Ceci pourrait être réalisé par exemple au moyen d'un anticorps qui se lie à la protéine 2AP active, ou par une analyse de l'activité de la protéine 2AP.

Les séquences décrites ici peuvent être utilisées comme sondes ou comme amorces dans des expériences d'hybridation d'acide nucléique. Les segments d'acide nucléique qui incluent une séquence contiguë longue d'au moins 14 nucléotides qui a la même séquence que, ou qui est complémentaire, d'un segment d'ADN contigu long de 14 nucléotides de la séquence nucléotidique représentée dans SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 peuvent être utilisés.

Des séquences identiques ou complémentaires contiguës plus longues, par exemple celles d'environ 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 5, 000, 10,000 etc. (y compris toutes les longueurs intermédiaires et jusques et y compris les séquences de longueur intégrale) seront utiles aussi dans certains modes de réalisation.

L'aptitude de telles sondes d'acide nucléique à s'hybrider spécifiquement à des séquences de gène 2AP leur permettra d'être utiles dans la détection de la présence de séquences complémentaires dans un échantillon donné.

Cependant, d'autres utilisations, qui comprennent l'utilisation de l'information de séquence pour la préparation d'amorces d'espèces mutantes, ou d'amorces destinées à être utilisées dans la préparation d'autres constructions génétiques, sont envisagées.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS

La figure 1 représente la structure chimique de la 2-acétyl-1-pyrroline d'après CG-SM extraite de Khoa Dawk Mali (KDML105), du riz au jasmin thai (aromatique), et de Koshihikari, un riz non aromatique.

La figure 2 représente la cartographie à petite échelle du gène d'arôme dans le riz utilisant 186 plantes F9 issues d'une seule plante F6 à ségrégation pour l'arôme des grains et la construction d'une carte physique englobant le gène pour l'arôme des grains.

La première partie de la figure 2 montre les génotypes graphiques de huit plantes F11 issues de la seule plante F6. La seconde partie montre la cartographie à ultraéchelle utilisant 1116 plantes F12 issues d'une seule plante F6 pour rétrécir la région critique à 27 kb dans un seul vecteur BAC. La troisième partie montre l'annotation de la séquence génomique de KDLM105 qui a révélé trois cadres de lecture ouverts. La quatrième partie montre que l'utilisation de 177 plantes F6 issues du croisement entre KDML105 et JHN identifiait trois doubles recombinants dans l'exon 7 du gène de protéine inconnue qui affecte sensiblement l'arôme des grains et les teneurs en 2-acétyl-l-pyrroline. Le gène de protéine inconnue a été appelé Os2AP, Oryza sativa 2-acétyl-1-pyrroline. Aromarker est le marqueur basé sur la PCR définissant la délétion de 8 paires de bases et 3 SNP ( single nucleotide polymorphisms ) spécifiques de l'arôme des grains.

La figure 3A représente l'expression de sept gènes candidats par RT-PCR à partir de l'ARN total isolé 10, 15 et 20 jours après la pollinisation entre des lignées isogéniques (ISL) aromatiques et non aromatiques. Sur cette figure, Os2AP est appelée bétaïne aldéhyde déshydrogénase.

La figure 3B représente l'expression différentielle de transcripts de Os2AP dans des feuilles, des tiges et des racines à partir d'ARN total isolé 15 jours après la pollinisation (JAP) entre des lignées isogéniques aromatiques et non aromatiques.

La figure 3C représente l'analyse des niveaux de 2-acétyl-1-pyrroline dans des grains de THM (KDML105), la lignée isogénique aromatique 117, la lignée isogénique non aromatique 10, et leur F2 (ISL117 x ISL10). Dans F1, l'analyse des niveaux de 2-acétyl- l -pyrroline a été réalisée dans les feuilles.

La figure 3D, partie supérieure, représente l'expression de l'homologue de Os2AP provenant du chromosome 4 et de l'actine dans Nipponbare transgénique portant une construction Os2AP RNAi. La figure 3D, partie inférieure, représente le gène Os2AP (appelé ici BADH) sur le chromosome 8, pas sur le chromosome 4, montrant une expression différentielle dans des lignés isogéniques aromatiques et non aromatiques de riz.

La figure 4A montre la voie métabolique entre la proline et l'acide glutamique. La L-proline peut être synthétisée à partir de l'acide glutamique avec l'enzyme P5C synthase et la P5C réductase, et l'acide glutamique peut être synthétisé à partir de la proline avec la proline déshydrogénase (ProDH), et la P5C déshydrogénase (P5C DH). Le déplacement métabolique proposé était médié par une mutation nonsens de Os2AP.

La figure 4B montre la structure protéique prédite de l'enzyme Os2AP créée avec RASMOL, un programme disponible sur le site Internet du Microbiology Department of the University of Massachusetts, Amherst, USA (la nouvelle version est Protein Explorer).

La figure 5A montre une comparaison des séquences génomiques des gènes Os2AP provenant de KDML105 (aromatique) and Nipponbare (non-aromatique).

La figure 5B représente un alignement d'ADN montrant une délétion de huit paires de bases dans une souche aromatique, Thai Hom Mali (THM), par comparaison avec Nipponbare, une souche non aromatique, et la comparaison des séquences d'aminoacides entre les deux souches. Les séquences nucléotidiques dans l'alignement incluent les nucléotides 701 à 765 de SEQ ID NO: 5 et les nucléotides 701 à 757 de SEQ ID NO: 2.

La figure 6 représente des génotypes graphiques de huit plantes F11 issues de la seule plante F6 et l'analyse des niveaux de 2-acétyl-l- pyrroline dans les grains de riz.

La figure 7A représente une construction d'interférence à ARN et un vecteur pour la transformation. La partie inférieure montre la confirmation de l'expression de la construction. BADH désigne ici Os2AP.

La figure 7B représente l'expression de la construction d'ARNi, GFP, et Os2AP endogène. La partie inférieure montre les niveaux de 2-acétyl-lpyrroline et l'arôme. BADH-RNAi2 est une construction d'ARNi contre le gène Os2AP.

La figure 8A représente les résultats du criblage de la descendance F6 pour le variant de Os2AP corrélé avec un arôme accru avec l'ensemble d'amorces "Aromarker".

La figure 8B représente les résultats du criblage de différentes variétés de riz pour l'allèle Os2AP aromatique.

La figure 9A montre les séquences d'ADN des orthologues de Os2AP issus de différentes souches de riz. Les séquences nucléotidiques dans l'alignement incluent les nucléotides 701 à 765 de SEQ ID NO: 5 et les nucléotides 701-757 de SEQ ID NO: 2.

La figure 9B montre l'arbre phylogénétique conAru4 avec l'arbre &dgh6oJintd 22 orthologues de BADH(O(Os2AP).

BREVE DESCRIPTION DE CERTAINES DESSqUEmrS DANS 5 LE LITAGE DESEQUENCS SEQ ID NO: 1 est la séquence nu léo6 q e gén mi u du gène Os2AP issu d'une souche de riz aromatique, Thai Hom Mali.

SEQ ID NO: 1 atggccacgg cgatcccgca g gc ctc ttcgtcgccg gcgagtggcg cgcccccgcg 60 c cggccgcc gcctccccgt cgtcaacccc gccaccgagt cccccatcgg taccctcctc 120 ttcacc et ccaccctctg cttctgcctc tgattagcct ttttgttgtt gttgttgttg 180 ctg gtttt ttgcgtgtcg gtgcgcaagc gagatcccgg cgggcacggc gg gac tg 240 gacgcggcgg tggcggcggc g ggaggcg cttaaaaag a acccgggccg cgactgggcg 300 Cccgcgccgg g c tccg ggccaagtac attcgcgcaa tcgctgacaa agtagggtgg 360 tgactaccct tata gcctg cccgttttaa cgggagcctt gtgcgtgtgt tccgtacagg 420 ggg gagct ccgcgtggct ctccagtagg tttttgagcc cc atcgat cgatatgctc 480 t ttttaag tttgctgctt aaattcctca agggtttagt ttgcaaccaa atccttattt 540 t cttcggt ataagccccc catatgatgt gcgtgcgtcg gcatcggaag tgcgtatcct 600 ctgttctgga ctaggaattg gccataggtt g cgaca tcgagtattc tg tctgtt 660 tgg taagt tggaagcatg gctg tg tatctggatg ctgtttttgt ggtgattcgt 720 ttcaagctct tgttaattga tgggttcaag cggagagggt gcgcaacaac aagtgtatat 780 ggctcacggc catgggtgtg cacatttgat tggtgcgcaa caacaagtgt at tgtgtg 840 tgcttcgtta gttggcaggt cctagtcact aaatcactat tg ttggta ctagcta:tt 900 ttgtgccttg acgatgggac gattacta gcc ttggt tgcctttgtg attccgtt 960 OZ6t; e*eiôT&bô DED' D'e D$ ỳ,2i65e Daar6 ib6 66166,264 D ea,eiD6 092# $BaeeDDb e et,J5Dae ZUZ6 atn 6eeZ'e6 U5 eÊneTbelTë $61Ia eii2 008P IDaaeaDp ia=2re66 n 61.1166ief3 Ii6itôta DuDE22a%= ,Taie; 0#Zf;$$, B261.ED D6 4;a?DI? telPei$ID a66pDDae 28$II1.6III III2rTITir 0291 aee eeDDDD et*iee! a bi Dit;; .66 l6DD DaDD66 2 rebl26ilea OZ9# 6e ee I6i 6DnueeD6p alla,,$ i DI666-eYe 66$ 6t* D61.5e=D6z 09SP $lem 6 $b; ô B21lee 5$t 61.,116 e I IBib i4i4eta Bi i=lBla 61 00!# I ôiae $TnIDD6er DDi a;bôe ôôie aieb D aa6 rE ôe,fyceDll 0### E D nIII DtE iôu De DDez6b De& 6 6 6'e l il6DDD66el I 55ea6i 6 0 EP 55 5t?ô$ia eaDltôDib IBôee$It;t reDD56B 2,614664x6 tu6eeD=T OZEP;2252E ZDE, DarruPe, 26 tab11 I6ee eôleDaôiD D4.a6;4Di;a 6eal4=D6el 09ZP 2 612 =!2 $,ôl%tl;a6 6U'eP Ve 6ueepe+at Bliaiebil 6lezD 2ra OOZP lem epDB 51.eaB6 D6 leze, uiat iitaJJôi2E i l,iolelr DD1_6 6zIII 0 # yr*lDeD6t 6;ir6t e 4 tTTI i;e =aa614 ,6l tie* J e I=l e ôeD o8ot 51?D D6*eI,.e;6$; 2t *eE6D6t6rD uD6*=eo2;DD6zuba2 12;$2112 O?Ot D: 6e6 DD, Duen'eô* I I;;IIT 61 4De4eiJôii JDI 4aD= eeD=B=D*21 096É e1226;a B 22161 J;a 1.1,D5 D5 Diya 566 2=611126 DôôletDD 6 006E 611.1.D61 46 61. ;Di=t 6646 ô1$BI D De$ôi$a DJJDDI65 16$ital;i 9[ 821 D;I a' 6 U W? >I12911tJ6 1 DTDe6 6Ie*i66D1 BI=JIEa i 08Z[ 5 466 1e$;}>2 2; IrulTaa 6lliJr1$D aiflyJ 14$ 6 Dl;E2ô 0zLE a61D6raD 14tr,6&1;e!eô**Jeaiô eD45e4l.le 4DD2D a UZDUe DD: 099E 1 2Ia;D116 J6 B6 D=i6e3 DL z IDul622D PD6 rr26 1. 26,B 2 009E BAa*; D6D rbbeeabb Ili I;! 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SEQ ID NO: 3 Met Ala Thr Ala Il e Pro Gl n Arg Gin Leu Phe Val Ala Gly Glu Trp 1 5 10 15 Arg Ala Pro Ala Leu Gly Arg Arg Leu Pro Val Val Asn Pro Ala Thr 25 30 Glu Ser Pro lie Gly Glu 11e Pro Ala Gly Thr Ala Glu Asp Val Asp 35 40 45 Ala Ala Val Ala Ala Ala Arg Glu Ala Leu Lys Lys Asn Pro Gly Arg 50 55 60 Asp Trp Ala Pro Ala Pro Gly Ala Val Arg Ala Lys Tyr 11e Arg Ala 65 70 75 80 1le Ala Asp Lys 11e lie Glu Arg Lys Ser Glu Leu Ala Arg Leu Glu 90 95 Thr Leu Asp Cys Gly Lys Pro Leu Asp Glu Ala Ala Trp Asp met Asp 105 110 Asp val Ala Gly Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Asp Leu Ala Glu Ser Leu 120 125 Asp Lys Arg Gln Asn Ala Pro Val ser Leu Pro Met Glu Asn Phe Lys 130 135 140 Cys Tyr Leu Arg Lys Glu Pro 'le Gly Val val Gly Leu 11e Thr Pro 145 150 155 160 Trp Asn Tyr Pro Leu Leu met Ma Thr Trp Lys val Ala Pro Ala Leu 170 3.75 Ala Ala Gly Cys Thr Ala val Leu Lys Pro Ser Glu Leu tala Ser val 185 190 Thr Cys Leu Glu Leu Ala Asp val Cys Lys Glu Val Gly Leu Pro Ser 200 205 Gly Val Leu Asn lie val Thr Gly Leu Gly Ser Glu Ala Gly Ala Pro 210 215 220 Leu Ser Ser His Pro Gly Val Asp Lys val Ala Phe Thr Gly Ser Tyr 225 230 235 240 Glu Thr Gly rie Tyr Phe Ser Cys Ser Tyr Gly 245 250 09E8 00E8 OtZE 081E 0Z E 090E 000E 0i6Z 0992 OZ8Z 09ZZ ZZ 0f9? 09&Z OZSZ 09tZ 00t o#EZ 02ZZ OZZZ 09 Z 00IZ 0>0Z 09 OZ61 098T 008T

I

O#ZT 0991 OZu 09ST 0051 t,T 02ET OZET 09 OOZT 0 I Ozu 096 006 0#a 08Z On 099 009 4 S 08t OZ t, 09E 00E 0#Z 091 OZ 09 Dl i*ti 2Ie 6rD6z a+ti rame 6r,e'e,2ÉJ; a4=J6loer Ier I;,aI IiaDz6zz6l;agi e D / ,e6zuzz6e6 e6 266* a,a De,*e 4B a*ila; I;a,iezD$ IM'e6$4 elôlôa,&a, D62166 265 IB1251B2 ^ zzED6z 2 *Eieeu eb;eelr;e; af>;= D D bue 2Dm 'ep.)z6plDDI ô;iet ea; 61: rai Iôelae$82I ab. e! D ?ahzia;2 eIBI2 ;a,1 D1i1I6 JD6 aria rI 2e ieBi2=iir 16bel6DD 6 6urea6 i5i BIDE;$ Bee,e ôe D6$$26 ee e62$D6z D6 ôa=;I2l661 arliôe ri ôl;1ô y;r 1ea2 962E 16D11P6156 =*BIDI B; $Jas Iôaôi il;=a D;2 DzD6 'eôa 66 Drz6DDI 661666 $66 ≈666 Deba 516)266 ô6 5566,1D) Dar= ,Dam E6iD'Dabii $BI=aô66zz t iôilaB 61e6Jl6=t6 DP6T 1; raô,ô ;De É D1D11 a 111611166E 56t;1 a eD12D)DD; Dibillla , IDI6S 166 alaiai, 6 De6IP J611 B6;; BTa! 1rDEPD661E B;DI2b111 zu6zz ôôa ir&aeô2 $ ) 55)DJi6 ezezezrze,e ID)D6161E6 2I>IeDr Dlô;;e!%2I &, 225111*$ tealael561 r*ôô ;aa eeaBôz ea DSI; arl reôTea 5T rih$eirbte 1D66Ta6 D ô,ô it T D EDD DezDDe eue alla; ITe IDD11I1aa; iy ,m 6$I D61$6 561 Bôfie 1616 EED DerDEED6)6 16111116 D11e1SESDI Bee66 D6 èDD22, a $eue ie aa 16151ôD616 aDD66D T 6D 6666, i56a 666D 1151151111 6SDIEDDDDD 6562556 i De*JtÌ a;eiôôllTT 6SDSI ESI 126zzz6a66 316111661E a2622>Itô fe 1, I,i EIISSI;DD ôilôôtzz6z piô;2aieeT 6 ôax6ee6 bt2r*Biô;≈111EE15Iee 6EID6Iraaa eaD ee$ae 6IDD1DIDDI tee 2132 É a6* eD a;Be=$$22I 13116111E) É 66eèa44 iiT* ab e EDS;;1222 16J16eezei eagi eD6z6z Il ô DEii E)6EE3 De6 a31E611666 D11D1)1D16 6414)64E66 DD1IDieea 26661 a I>;eee6ôeô D66; Ili; EIJEEE1SED re I61D 5Ve66;I$ 111E1-1E1 1IE1SDIJII 111 2111 61111DD6e. 1DPDIE E1) EE) 6166 166626 6D 6zr66z3zuz IBrDE6D1Eô S iS ô1Baô 162111665EJ3 611111 JSDDDE6D6D É JSD6))1) 2Bô2 6ID SSDDD 6eô É D 11ESI É J)E)J5 6 a6D1 11 ertee n 51 T))Dbeetea a ItETaeel! ! lealO 1III1D3E11 B I 252*$i DeeZ.De J11 ID6IDSE)1I DI111 elI É DD1DDIIE É 1166E11, ze6I 611JS ) 6r)61361 f;el1SIEEI $61D6E3E16 P1D 6BED6 2Ba12I1511 EESSSE ta1 642 I)6EDSIEE1 r>BTôi;Dia Ibn D1)136 et2ztl;l IP1EDII1S) 1a I;3J,) T, 2 ya1Tô 1EIIIEIIIE 116E161653 13)ED61EEE 1361161ES) )EJEIDaô D6 2616 * rôa=earOu ee eeue 212 eôte 22$9;6 51 21115E 13PDE161 # ôte 121E IEI IBN a DD)1E561E6 DE11ES6;ae a,I6E1)316 1E6111EJED 6EED116651 51611e6136 $1b DDS 5IE6IE1ED É 1DJ1 ee ô $ DDI, eeD33DDDDD DE16?ED365 5D6 666 6 DS DSD61S DIDDS I1D DDDDEED16D D1D6E366D6 e66eDOpbat DJ,aebc1DS IES1E1JSTI EEEEE56165 311151331E 11)E1113)1 1) 13116111 3661E 11E6r 1661E)E1EE iaôe2ÌSSE 6613ES16E1 ES6 116113 33161E366 i6zzDrel5 I 66135136 TJEIJIIIEI BJtIIbIl15 EDOzDeziD1 DSEJISIIBi 15163)1)31 6uDeDe1E51 6E31111115 EEDDESI1IS)131)1)E1) Iita1IIESE ES1EE61)E1 1EI1)5D6ID 1E1DD SEE JSSE rDe ESSE)16111 115E161e1e 31)DSEE6SS 31131111;a I)111EP136 23) 113) i 32)61623)2 1)2) 126612 356131111E 113 11111 6126115133 66612tD261 6 66116 E1 6162 66123 2611221161 6123622651 61 256 $D 33)D 62212 11) 6136111;3661536)) 333333)3E) 6aalôaa636 366)663661 63;6163611 6aal Draa 1633)31)36 )Baal= f5eaaa16513 Ie66 6251 32)3612321 11 26613E 131162335E 3221111311 TIC 6616 22 166;)2 3131)1 2i 2)26216155 eae 2136$6 255233211E 161161222E 12)22111 6$3336 D& 6161265631 1116116l1. 2661D151E 212313/111 313)232321 221EIe;1) 16E1111 221161612E aàôei3321 BizIa2 21E)6 art 31E)131D11 266)11)121 6511331226 2)3112 61 2612161323 16ue 261136 33111 aga 12122 51 D6126656E) 6152)22ee1 112123332; 161E)11111 6e3E) 111 6661211611 1336161111 1631 6151 366)231366 1)1)622)11 1622122651 2661)11 a 166)1 621 5881111621 1)62662666 333321)261 563)635)6) 5536636326 111161) 61) 1)13)3; i 3353)66)1) 56D..e336612:0N QI O 3S 9Jgu ddT\ 5nbl1nmo m u ou zu a oq no ourla) çzs0 o a n a b uouD2 a b p!oqonu oo a bos \ so # :0N C! âis

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S EQ ID NO: 6 Met Ala Thr Ala 11e Pro Gln Arg Gln Leu Phe Val Ala Gly Glu Trp L 5 10 15 Arg Ala Pro Ala Leu Gly Arg Arg Leu Pro Val Val Asn Pro Ala Thr 25 30 Glu ser Pro 11e Gly Glu Ile Pro Ala Gly Thr Ala Glu Asp Val Asp 40 45 Ala Ala val Ala Ala Ala Arg Glu Ala Leu Lys Arg Asn Arg Gly Arg 55 60 Asp Trp Ala Arg Ala Pro Gly Ala Val Arg Ala Lys Tyr Leu Arg Ala 70 75 80 lie Ala Ala Lys lie Ile Glu Arg Lys Ser Glu Leu Ala Arg Leu Glu 90 95 Thr Leu Asp Cys Gly Lys Pro Leu Asp Glu Ala Ala Trp Asp Met Asp 105 110 Asp val Ala Gly Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Asp Leu Ala Glu ser Leu 120 125 Asp Lys Arg Gin Asn Ala Pro Val ser Leu Pro Met Glu Asn Phe Lys 130 135 140 Cys Tyr Leu Arg Lys Glua Pro 11e Gly Val Val Gly Leu 11e Thr Pro 145 150 155 160 Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro Ala Leu 170 175 Ala Ala Gly Cys Thr Ala val Leu Lys Pro ser Glu Leu Ala ser Val 185 190 Thr Cys Leu Glu Leu Ala Asp Val Cys Lys Glu Val Gly Leu Pro ser 200 205 Gly val Leu Asr7 11e val Thr Gly Leu Gly ser Glu Ala Gly Ala Pro 210 215 220 Leu ser Ser Hïs Pro Gly val Asp Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Tyr 225 230 235 240 Glu Thr Gly Lys Lys 'le Met Ala ser Ala Ala Pro Met Val Lys Pro 245 250 255 Val ser Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro 11e val Val Phe Asp Asp 260 265 270 Val Asp val Glu Lys Ala Val Glu Trp Thr Leu Phe Gly Cys Phe Trp 275 280 285 Thr Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala. Thr ser Arg Leu Ile Leu His Lys 290 295 300 Lys Ile Ala Lys Glu Phe Gin Glu Arg Met Val Ala Trp Ala Lys Asn 305 310 315 320 Ile Lys Val Ser Asp Pro Leu Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly Pro val 325 330 335 Ser Glu Gly Gin Tyr Glu Lys lie Lys Gln Phe Val ser Thr Ala 340 345 350 Lys ser Gln Gly Ala Thr Ile Leu Thr Gly Gly val Arg Pro Lys His 355 360 365 Leu Glu Lys Gly Phe Tyr Ile Glu Pro Thr 11e Sie Thr Asp val Asp 370 375 380 Thr ser met Gin 11e Trp Arg Glu Glu val Phe Gly pro val Leu Cys 385 390 395 400 Val Lys Glu Phe ser Thr Glu Glu Glu Ala Ile Glu Leu Ala Asn Asp 405 410 415 Thr His Tyr Gly Leu Ala Gly Ala Val Leu ser Gly Asp Arg Glu Arg 420 425 430 Cys Gin Arg Leu Thr Glu Glu Ile Asp Ala Gly Ile Ile Trp Val Asn 435 440 445 Cys ser Gin Pro Cys Phe Cys Gin Ala Pro Trp Gly Gly Asn Lys Arg 450 455 460 Ser Gly Phe Gly Arg-Glu Leu Gly Glu Gly Gly rie Asp Asn Tyr Leu 465 470 475 480 Ser Val Lys Gln Val Fhr Glu Tyr Ala Ser Asp Glu Pro Trp G1y Trp 485 490 495 Tyr Lys Ser Pro Ser Lys Leu SEQ ID NO: 7 à 88 sont des amorces qui peuvent être utilisées pour amplifier des parties de la séquence nucléotidique de Os2AP, de GFP ou de l'actine (tableau 1).

SEQ ID NO: 89 à 95 sont des séquences de fragments d'orthologues du gène 2AP. SEQ ID NO: 89 tgcatttact gggagttatg aaactggtat atatttcagc tgctcctatg gttaag 56 SEQ ID NO: 90 tgcatttact gggagttatg aaactggtat atatttcagc tgctcctatg gttaag 56 SEQ ID NO: 91 tgcatttact gggagttatg aaactggtat atatttcagc tgctcctatg gttaag 56 SEQ ID NO: 92 tgcatttact gggagttatg aaactggtaa aaagattatg gcttcagctg ctcctatggt 60 taag 64 SEQ ID NO: 93 tgcatttact gggagttatg aaactggtat atatttcagc tgctcctatg gttaag 56 SEQ ID NO: 94 tgcatttact gggagttatg aaactggtaa aaagattatg gcttcagctg ctcctatggt 60 taag 64 SEQ ID NO: 95 tgcatttact gggagttatg aaactggtaa aaagattatg gcttcagctg ctcctatggt 60 taag 64 SEQ ID NO: 96 est le décapeptide qui est hautement conservé parmi les aldéhyde déshydrogénases générales.

Val-Thr-Leu-Glu-Leu-Gly-Gly-Lys-Ser-Pro

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

L'invention concerne des gènes de 2-acétyl-1-pyrroline (2AP). Des séquences d'acide nucléique issues de gènes 2AP sont utilisées pour augmenter les niveaux de 2-acétyl-1-pyrroline, un composé aromatique majeur trouvé dans le riz, le blé, le maïs, l'avoine, les feuilles de pandanus, le cocotier aromatique, certaines bactéries et certains champignons.

Avant d'expliquer au moins un mode de réalisation de l'invention en détail, il convient de comprendre que l'invention n'est pas limitée dans son application aux détails de construction et à l'agencement des composants présentés dans la description suivante. L'invention est susceptible d'autres modes de réalisation ou d'être mise en oeuvre ou réalisée de différentes manières. En outre, il convient de comprendre que la phraséologie et la terminologie employées ici le sont à des fins de description et ne devraient pas être considérées comme limitatives.

Dans toute cette description, différentes publications, différents brevets et différentes demandes de brevet publiées sont cités en référence. Les divulgations de ces publications, brevets et demandes de brevet publiées sont ainsi incorporées par référence dans la présente description pour décrire plus complètement l'état de la technique correspondant à l'invention. La pratique de la présente invention emploiera, sauf indication contraire, des techniques conventionnelles de production de plantes, d'immunologie, de biologie moléculaire, de microbiologie, de biologie cellulaire et d'ADN recombinant, qui sont de pratique courante. Voir par exemple Sambrook, Fritsch et Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987); Plant Breeding: Principles and Prospects (Plant Breeding, Vol 1) M.D. Hayward, N.O. Bosemark, I. Romagosa; Chapman & Hall, (1993.); Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher et Wingfeld, eds. (1995) CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (John Wiley & Sons, Inc.); la série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames et G.R. Taylor eds. (1995), Harlow et Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, et ANIMAL CELL CULTURE R.I. Freshney, ed. (1987).

Sauf indication contraire, les termes techniques sont utilisés selon l'usage conventionnel. Des définitions de termes courants en biologie moléculaire peuvent être trouvées dans Lewin, Genes V, publié par Oxford University Press, 1994 (SBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology. publié par Blackwell Science Ltd., 1994 (SBN 0-632-02182-9); et Robert A. Meyers (cd.), Molecular Biology and Biotechnology, a Comprehensive Desk Reference, publié par VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York. Des definitions de termes courants en biologie végétale peuvent être trouvées dans Esau, Plant Anatomy, publié par John Wiley & Sons (1977) (ISBN 0-471-24520-8); et Solornon et al., Biology, publié par Saunders College Publishing (1993).

Définitions Pour faciliter une revue des différents modes de réalisation de l'invention, les définitions suivantes sont données: Séquence polynucléotidique de la 2-acétyl-1-pyrroline (2AP) : Les gènes selon la présente invention incluent non seulement les séquences de longueur intégrale décrites ici mais aussi les fragments de ces séquences qui conservent l'activité caractéristique des séquences données spécifiquement ici à titre d'exemple.

La séquence du gène 2AP du riz est décrite ici. Il est apparent pour l'homme du métier que des séquences polynucléotidiques de 2AP d'une autre plante peuvent être aisément identifiées et obtenues par plusieurs moyens avec la séquence du gène 2AP du riz. Les gènes spécifiques, ou des parties de ceux-ci, peuvent être obtenus auprès d'un organisme de dépôt de cultures, ou construits par synthèse, par exemple au moyen d'une machine à gènes.

Des variantes de ces gènes peuvent être construites aisément avec des techniques standard pour produire des mutations ponctuelles. En outre, des fragments de ces gènes peuvent être obtenus avec des exonucléases ou endonucléases du commerce selon des processus standard. Par exemple, des enzymes comme Bal31 ou la mutagenèse dirigée peuvent être employées pour couper systématiquement des nucléotides des extrémités de ces gènes. Egalement, des gènes qui codent des fragments actifs peuvent être obtenus au moyen de différentes autres enzymes de restriction. Différentes enzymes peuvent être utilisées pour obtenir directement des fragments actifs de ces séquences polynucléotidiques de 2AP.

Des séquences polynucléotidiques de 2AP équivalentes et/ou des gènes codant ces séquences polynucléotidiques de 2AP équivalentes peuvent aussi être isolés à partir de souches et/ou de banques d'ADN avec les enseignements fournis ici. Par exemple, des anticorps contre les protéines 2AP décrites ici peuvent être utilisés pour identifier et isoler d'autres protéines 2AP à partir d'un mélange de protéines. Spécifiquement, des anticorps peuvent être produits contre les parties des protéines 2AP qui sont les plus constantes et les plus distinctes d'autres protéines. Ces anticorps peuvent ensuite être utilisés pour identifier spécifiquement des protéines 2AP équivalentes ayant l'activité caractéristique par immunoprécipitation, immunoanalyse liée à une enzyme (ELISA) ou transfert de Western.

Un autre procédé pour identifier les gènes de la présente invention consiste à utiliser des sondes oligonucléotidiques. Ces sondes sont des séquences nucléotidiques ayant un marqueur détectable. Comme cela est bien connu dans la technique, si la molécule sonde et l'échantillon d'acide nucléique s'hybrident en formant une liaison forte entre les deux molécules, on peut admettre raisonnablement que la sonde et l'échantillon sont sensiblement identiques. Le marqueur détectable de la sonde fournit un moyen pour déterminer d'une manière connue si une hybridation a eu lieu. Une telle analyse par sonde fournit un procédé rapide pour identifier les gènes de la présente invention. Des exemples de sondes sont décrits dans le tableau 1.

Les segments nucléotidiques qui sont utilisés comme sondes selon l'invention peuvent être synthétisés au moyen de synthétiseurs d'ADN à l'aide de processus standard. Lors de l'utilisation des segments nucléotidiques comme sondes, la sonde particulière est marquée avec un marqueur approprié quelconque connu de l'homme du métier, tel que des marqueurs radioactifs et non-radioactifs. Les marqueurs radioactifs typiques incluent 32P 1251, 35S, ou analogue. Une sonde marquée avec un isotope radioactif peut être construite à partir d'une séquence nucléotidique complémentaire de l'échantillon d'ADN par une réaction de translation de coupure conventionnelle, avec une DNase et une ADN polymérase. La sonde et l'échantillon peuvent ensuite être combinés dans une solution de tampon d'hybridation et maintenus à une température appropriée jusqu'à ce que l'hybridation se produise. Ensuite, la membrane est débarrassée des substances étrangères par lavage, tandis que les molécules d'échantillon et de sonde liées sont détectées et quantifiées typiquement par autoradiographie et/ou comptage de scintillation liquide.

Les marqueurs non radioactifs incluent, par exemple, les ligands comme la biotine ou la thyroxine, ainsi que les enzymes comme les hydrolases ou les peroxydases, ou les différentes substances chimiluminescentes comme la luciférine, ou les composés fluorescents comme la fluorescéine et ses dérivés. La sonde peut aussi être marquée aux deux extrémités avec des types de marqueurs différents pour faciliter la séparation, par exemple en utilisant un marqueur isotopique mentionné ci-dessus à une extrémité et un marqueur biotine à l'autre extrémité.

La formation et la stabilité des duplex dépendent d'une complémentarité sensible entre les deux brins d'un hybride et, comme noté ci-dessus, un certain degré de mésappariement peut être toléré. De ce fait, les sondes de la présente invention incluent des mutations (uniques et multiples), des délétions, des insertions des séquences décrites, et des combinaisons de celles-ci, où lesdites mutations, insertions et délétions permettent la formation d'hybrides stables avec le polynucléotide cible d'intérêt. Des mutations, insertions et délétions peuvent être produites dans une séquence polynucléotidique donnée de nombreuses manières, par des procédés connus actuellement de l'homme du métier moyen, et peut être par d'autres procédés qui peuvent devenir connus dans le futur.

Les variations potentielles dans les sondes énumérées sont dues en partie à la redondance du code génétique. Du fait de la redondance du code génétique, plus d'un triplet de nucléotides codant (codon) peuvent être utilisés pour la plupart des aminoacides utilisés pour produire des protéines. De ce fait, des séquences nucléotidiques différentes peuvent coder un aminoacide particulier. Ainsi, les séquences d'aminoacides des protéines et peptides 2AP peuvent être préparées par des séquences nucléotidiques équivalentes codant la même séquence d'aminoacides de la protéine ou du peptide. Ainsi, la présente invention inclut de telles séquences nucléotidiques équivalentes. En outre, les séquences inverses ou complémentaires sont un aspect de la présente invention et peuvent être utilisées aisément par l'homme du métier. De plus, on a montré que des protéines de structure et fonction identifiées peuvent être construites en changeant la séquence d'aminoacides si de tels changements ne modifient pas la structure secondaire des protéines (Kaiser et Kezdy, 1984). Ainsi, la présente invention inclut les mutants de la séquence d'aminoacides représentée ici qui ne modifient pas la structure secondaire de la protéine, ou, si la structure est modifiée, l'activité biologique est sensiblement maintenue. De plus, l'invention inclut aussi les mutants d'organismes contenant tout ou partie d'une séquence polynucléotidique de 2AP codante d'un gène de l'invention. De tels mutants peuvent être produits par des techniques bien connues de l'homme du métier. Par exemple, l'irradiation UV peut être utilisée pour préparer des mutants d'organismes hôtes, la mutagenèse par insertion d'ADNt peut être utilisée, ou le TILLING ( Targeted Induced Local Lesion of Genome ) peut être utilisé. De même, de tels mutants peuvent inclure des cellules hôtes asporogènes qui peuvent aussi être préparées par des processus bien connus dans la technique.

Des séquences polynucléotidiques de 2AP, y compris celles issues du riz, peuvent être obtenues au moyen des amorces de PCR de l'invention. Ces amorces sont montrées dans le tableau 1 et correspondent aux séquences représentées dans SEQ ID NO: 7 à SEQ ID NO: 79. Des combinaisons de ces amorces peuvent être utilisées pour amplifier différentes régions du gène Os2AP. Les conditions de PCR qui conviennent pour cette amplification sont les suivantes: 10 L de mélange réactionnel avec 10 ng d'ADN matrice, 0,1 mM de dNTP, 0,5 M de chaque amorce, 0,5 unité de Taq polymérase, 2,0 mM de MgC12, et 1 X Thermophilic Polymerase Buffer (Promega). Ce mélange devrait subir 30 cycles de PCR avec les durées et températures suivantes: 94 C pendant 30 secondes (dénaturation) , 60 C pendant 30 secondes (hybridation), et 72 C pendant 2 min (extension).

TABLEAU 1: Liste d'amorces SEQ ID Primer name Sequence (5'-*3') NO: 7 OS2AP-8L GCCATGCCAACTGAGTAAAG 8 OS2AP-8R CAATTTTATTCGCTCTGTGC 9 OS2AP-9L TGCAACATCGCGTCTTATTC OS2AP-9R GCAACTAGCAAGAGCATACACC 11 OS2AP-12L ACCTGACATCATGCCTTTGG 12 OS2AP-12R CCGGTCATCAGCTAACTTCC 13 OS2AP-13R CCCTTCGTCATAAAATATACTAGCAA 14 OS2AP-14L TCCTCCAACATGCTCTTTCG OS2AP-14R CAGAGAAGTTTACGCCGTTG 16 OS2AP-15L TTTTTAAATAAGATGAACGGTCAAA 17 OS2AP-16L CTCTCCACCCTCTGCTTCTG 18 OS2AP-16R CTCTCCGCTTGAACCCATC 19 OS2AP-17L GCATGGCTGATTGTGTATCTG OS2AP-17R TTCCAAACCTACGGACAAAAG 21 OS2AP-18L TTCCTCTTCTCTTGTGCAAAC 22 OS2AP-18R CACGGAAGCCAATTCAGATG 23 OS2AP-19L CTATCCTCTCCTGATGGCAAC 24 OS2AP-19R TGGCTACTAGAATGATGCTCAAAG OS2AP20L CCTTTTGTGTCGCTTTTGAG 26 OS2AP20R AAAATAGCCTTCACTCGTTGC 27 OS2AP21L CCATCGATTTCGAGGGTAAC 28 OS2AP21R CGCATCCGATAATATGTTG 29 OS2AP22L GTAATTAGGAGTACGACTCTCGTC OS2AP22R GCTTATAGCCTACTGTATCCTCCTC 31 OS2AP23L AATTGGTTAACCCAGCAAGC 32 OS2AP23R ACATTGTGAAACGGAGGAAG 33 OS2AP24L GCTATAAGCCAGCTGCAAAC 34 OS2AP24R GCAGTTGGTACGGACTTCG OS2AP25L CCTAAATATTTGACGCCGTTG 36 OS2AP25R TGAAGAGGAGGGTACCGATG 37 OS2AP26L CACCACTCCACACCTGACAC 38 OS2AP26R GTACGGAACACACGCACAAG 39 OS2AP27L TGTTGTTGTTGTTGCTGCTG OS2AP27R GCCGTGAGCCATATACACTTG 41 023088CO2 IL AGCTCCAGCTCCTCCTCGAT 42 023088CO2 2L TATCTCTCACCGACCCCAAA 43 023088CO2 2R TGTTGCCATCAGGAGAGGA 44 023088CO2 3R CTCTTGATGAAGCAGCATGG 023088CO2 3R CCCAGTAAATGCAACCTTGTC 46 023088CO2 4R GGCAACATGGAAGGTAGCTC 47 023088CO2 4R CCATGCAACCATCCTTTCTT 48 023088CO2 5R TTATGGCTTCAGCTGCTCCT 49 023088CO2 5R CAATGGCTTCTTCTTCAGTGC 023088CO2 6R GCCCGTTGTTAGTGAAGGAC 51 023088CO2 6R GTACCATCCCCACGGCTCAT 52 023088CO2 7L CGAGCGATGCCAGAGATTA 53 023088CO2 7R AGCACATGGCAAATCAAACA 54 OS2AP-exon 7.1-del _F TGCTCCTTTGTCATCACACC OS2AP-exon 7.1-del R TTTCCACCAAGTTCCAGTGA 56 OS2AP in 1 L TTCGCTGCAGAACAGATGAC 57 OS2AP in1R CTGATGGTTACGCGACAATTT 58 OS2AP inTA2L ATTTGAACCGGGACAGAACA 59 OS2AP inTA2R TTTTGATGTGCCCTCTCCTT OS2AP inAAT3L TGGGTAATCTTGTTCTGGAG 61 OS2AP inAAT3R AGTGCCAAATGCATGCTAGA 62 OS2AP inG4L TGGGGCTCAAAAACCTACTG 63 OS2AP inG4R GTCCGGGCCAAGTACCTC 64 OS2AP-5-UTR-EX 1-5 F ATCTCTCACCGACCCCAAAT OS2AP-5-UTR-EX 1-5 R CCATTGGAAGAGAGACAGGTG 66 OS2AP-ATG 1-600 F TGTTGTTGTTGTTGCTGCTG 67 OS2AP-ATG1-600 R TGGGGCTCAAAAACCTACTG 68 OS2AP-EX5-12 F GGTTGGTCTTCCTTCAGGTG 69 OS2AP-EX512 R GGTCCAAAAGCAACCAAAGA Aromarker BigL ACTGGTAAAAAGATTATGGC 71 Aromarker BigR CAAGCCGATCAACCAGTACA 72 Aromarker SmallL CCATGCTGCAAGCAATGTA 73 Aromarker Smal1R AACCATAGGAGCAGCTGAAATA 74 OS2AP8OUT_F ACCCTGGTGTAGACAAGGTA OS2AP8INF GGGAGTTATGAAACTGGTATAT 76 OS2AP8INR ATAGGAGCAGCTGAAGCCAT 77 OS2AP8 OUT R GTCCCGCACTTCAGAATTAG 78 OS2AP8 ex2 F CTCTGCTTCTGCCTCTGATT 79 OS2AP-exon9.1-del RN CTGGCTACTAGAATGATGCTC Exon6to9NcoIF AATTCCATGGGGTTGGTCTTCCTTCAGGTG 81 Exon6to9SpeIR AATTACTAGTTTCCACCAAGTTCCAGTGA

A

82 Exon6to8NheIR AATTCCATGGGGTTGGTCTTCCTTCAGGTG 83 GFPU CTTGTTGAATTAGATGGTGATGTT 84 GFPL GTTGTGGGAGTTGTAGTTGTATT'C 85! Os2APCH4U TAGCTTCACATCCCCATGTG 86 Os2APCH4L GCACCTTCACATCTTGCTGT 87 ActinU ACATCGCCCTGGACTATGAC 88 ActinL TGCTGAGAGATGCCAAGATG Homologues de la 2acétyl-1-pyrroline (Os2AP) de Oryza sativa: des séquences qui présentent une similarité avec celles décrites ici peuvent être identifiées par des procédés informatiques, avec des algorithmes d'alignement de séquences du domaine public et des outils de recherche de similarité de séquences pour rechercher dans des bases de données de séquences (les bases de données du domaine public comprennent Genbank, EMBL, Swiss-Prot, PIR et d'autres).

Les recherches de similarité récupèrent et alignent des séquences pour les comparer avec une séquence cible qui doit être analysée (c'est-à-dire une séquence d'interrogation). L'alignement optimal entre des régions locales des séquences comparées est connu comme étant l'alignement local. Les algorithmes de comparaison de séquences utilisent des matrices de notation pour attribuer une note globale à chacun des alignements.

Les séquences polynucléotidiques et polypeptidiques peuvent être alignées, et le pourcentage de résidus identiques dans une région spécifiée peut être déterminé par rapport à d'autres séquences polynucléotidiques et polypeptidiques, avec des algorithmes informatiques qui sont publiquement disponibles. Le pourcentage d'identité dépend de la longueur de la région chevauchante des séquences qui sont comparées.

La similarité entre deux séquences d'acide nucléique ou deux séquences d'aminoacides peut être exprimée en termes d'identité de séquences (ou, pour les protéines, aussi en termes de similarité de séquences). L'identité de séquences est fréquemment mesurée en termes de pourcentage d'identité ; plus le pourcentage est élevé, plus les deux séquences sont similaires. Comme décrit ici, des horologues et variants des molécules d'acide nucléique codant la protéine 2AP peuvent être utilisés dans la présente invention. Les homologues et variants de ces molécules d'acide nucléique posséderont un degré d'identité de séquences relativement élevé quand ils sont alignés au moyen de procédés standard. De tels homologues et variants s'hybrideront entre eux dans des conditions de haute stringence.

Des procédés d'alignement de séquences à des fins de comparaison sont bien 30 connus dans la technique. Différents programmes et algorithmes d'alignement sont décrits dans: Smith et Waterman (1981); Needleman et Wunsch (1970); Pearson et Lipman (1988); Higgins et Sharp (1988); Higgins et Sharp (1989); Corpet et al. (1988); Huang et al. (1992) ; et Pearson et al. (1994). Altschul et al. (1994) présentent un compte rendu détaillé de procédés d'alignement de séquences et de calculs d'homologie.

Le NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1990) est disponible auprès de différentes sources, incluant le National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) et sur l'Internet, en vue d'une utilisation en liaison avec les programmes d'analyse de séquences blastp, blastn, blastx, tblastn et tblastx. Il est accessible sur le site internet de NCBI. Une description de la manière de déterminer l'identité de séquences avec ce programme est disponible sur le site internet de NCBI.

Les homologues des séquences protéiques décrites sont typiquementcaractérisés en ce qu'ils possèdent au moins 40 % d'identité de séquences comptés sur l'alignement de toute la longueur avec la séquence d'aminoacides de la séquence décrite au moyen du NCBI Blast 2.0, gapped blastp réglé sur des paramètres de défaut. Les paramètres réglables sont de préférence fixés avec les valeurs suivantes: étendue de chevauchement 1, fraction de chevauchement = 0,125, seuil de mot (T) = 11. Les paramètres HSP S et HSP S2 sont des valeurs dynamiques et sont établis par le programme lui-même selon la composition de la séquence particulière et la composition de la base de données particulière dans laquelle la séquence d'intérêt est recherchée; cependant, les valeurs peuvent être ajustées pour augmenter la sensibilité. Les protéines présentant une similarité encore plus grande avec les séquences de référence présenteront des pourcentages d'identité croissants quand ils sont déterminés par ce procédé, par exemple au moins environ 50 %, au moins environ 60 %, au moins environ 70 %, au moins environ 75 %, au moins environ 80 %, au moins environ 85 %, au moins environ 90 % ou au moins environ 95 % d'identité de séquences.

Les homologues des séquences d'acide nucléique décrites sont typiquement caractérisés en ce qu'ils possèdent au moins 40 % d'identité de séquences comptés sur l'alignement de toute la longueur avec la séquence d'aminoacides de la séquence décrite avec le NCBI Blast 2.0, gapped blastn réglé sur des paramètres de défaut. 1)e plus, de telles séquences s'hybrident à des séquences homologues dans des conditions de haute stringence. Un procédé préféré utilise le module BLASTN de WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996) réglé sur les paramètres de défaut, avec l'étendue de chevauchement et la fraction de chevauchement réglées respectivement à 1 et 0,125. Les séquences d'acide nucléique ayant une similarité encore plus grande avec les séquences de référence présenteront des pourcentages d'identité croissants quand ils sont déterminés par ce procédé, par exemple au moins environ 50 %, au moins environ 60 %, au moins environ 70 %, au moins environ 75 %, au moins environ 80 %, au moins environ 85 %, au moins environ 90 % ou au moins environ 95 % d'identité de séquences.

L'alignement peut inclure l'introduction de lacunes dans les séquences à aligner. De plus, pour les séquences qui contiennent plus ou moins d'aminoacides que la protéine représentée dans SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6, on comprend que, dans un mode de réalisation, le pourcentage d'identité de séquences sera déterminé sur la base du nombre d'aminoacides identiques par rapport au nombre total d'aminoacides. Ainsi, par exemple, l'identité de séquence de séquences plus courtes que celle montrée sur les figures, comme discuté ci-dessous, sera déterminée avec le nombre d'aminoacides dans la séquence plus longue, dans un mode de réalisation. Dans les calculs de pourcentage d'identité, un poids relatif n'est pas attribué à différentes manifestations de variation de séquence comme des insertions, des délétions, des substitutions, etc. Dans un mode de réalisation, seules les identités sont notées positivement (+1) et toutes les formes de variation de séquence y compris les lacunes se voient attribuer une valeur de 0 , ce qui évite la nécessité d'une échelle pondérée ou de paramètres pondérés comme décrit ici pour les calculs de similarité de séquences. Le pourcentage d'identité de séquences peut être calculé par exemple en divisant le nombre de résidus identiques coïncidants par le nombre total de résidus de la séquence plus courte dans la région alignée et en multipliant par 100. La séquence plus longue est celle qui a le plus de résidus réels dans la région alignée.

Les protéines peuvent être classées selon leur parenté de séquence avec d'autres protéines dans le même génome (paralogues) ou un génome différent (orthologues). Les gènes orthologues sont des gènes qui ont évolué par spéciation à partir d'un gène ancestral commun. Ces gènes conservent normalement la même fonction quand ils évoluent. Les gènes paralogues sont des gènes qui sont dupliqués dans un génome. Ces gènes peuvent acquérir de nouvelles spécificités ou des fonctions modifiées qui peuvent être liées à la fonction originelle. Des procédés d'analyse phylogénétique sont bien connus de l'homme du métier moyen en bioinformatique.

Comme le comprendra l'homme du métier, les séquences de la présente invention peuvent contenir des erreurs de séquençage. C'est-à-dire qu'il peut y avoir des séquences d'aminoacides incorrectes, des nucléotides incorrects, des déphasages, des nucléotides inconnus, ou d'autres types d'erreurs de séquençage dans l'une quelconque des séquences; cependant, les séquences correctes se situeront dans les présentes définitions d'homologie et de stringence pour les acides nucléiques, et l'homologie des protéines décrite pour les protéines ou les polypeptides.

Polypeptide 2-acétyl-1-pyrroline (2AP) : Tel qu'il est utilisé ici, le terme polypeptide 2AP désigne un produit génique ayant sensiblement la séquence d'aminoacides d'un orthologue de 2AP. Un polypeptide 2AP est caractérisé, en partie, en ce qu'une diminution de son expression, une réduction de ses niveaux d'ARNm ou une réduction de la quantité ou de l'activité de la protéine conduit à une augmentation des niveaux du composé 2-acétyl-l-pyrroline dans la plante. Un polypeptide 2AP est caractérisé aussi, en partie, en ce qu'il a une séquence d'aminoacides ayant au moins environ 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité d'aminoacides avec la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6.

Sensiblement identique: par sensiblement identique on entend un polypeptide ou un acide nucléique présentant au moins 30 %, de préférence 50 %, de préférence encore 80 %, et de manière particulièrement préférable 90 %, ou même 95 % d'homologie avec une séquence d'aminoacides de référence (par exemple, la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6) ou une séquence d'acide nucléique (par exemple, la séquence d'acide nucléique représentée dans SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5) . Pour les polypeptides, la longueur des séquences de comparaison sera généralement d'au moins 16 aminoacides, de préférence d'au moins 20 aminoacides, de préférence encore d'au moins 25 aminoacides, et de manière particulièrement préférable de 35 aminoacides ou plus. Pour les acides nucléiques, la longueur des séquences de comparaison sera généralement d'au moins 50 nucléotides, de préférence d'au moins 60 nucléotides, de préférence encore d'au moins 75 nucléotides, et de manière particulièrement préférable de 110 nucléotides ou plus.

L'identité de séquence est typiquement mesurée avec un logiciel d'analyse de séquences (par exemple, le Sequence Analysis Software Package de Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, ou les programmes PILEUP/PRETTYBOX).

Par exemple, quand il est réglé sur des paramètres standard, un tel logiciel fait coïncider des séquences identiques ou similaires en attribuant des degrés d'homologie à différentes substitutions, délétion, et/ou autres modifications. Les substitutions conservatrices incluent typiquement des substitutions dans les groupes suivants: glycine, alanine; valine, isoleucine, leucine; acide aspartique, acide glutamique, asparagine, glutamine; sérine, thréonine; lysine, arginine; et phénylalanine, tyrosine.

Niveau élevé : un niveau élevé, tel qu'il est utilisé ici, désigne une augmentation du niveau moyen du composé 2-acétyl-l-pyrroline dans une plante non naturelle par rapport au niveau moyen du composé 2-acétyl-1pyrroline dans la plante naturelle correspondante. Etant donné que le niveau du composé 2-acétyl-l-pyrroline dans une plante variera d'une plante à une autre selon un certain nombre de variables, l'homme du métier comprendra qu'en comparant le niveau moyen du composé 2-acétyl-1pyrroline dans une plante non naturelle et dans la plante naturelle correspondante, il convient de comparer un échantillon de population de taille raisonnable de chaque type de plante cultivée dans des conditions contrôlées de manière similaire. Le niveau du composé 2-acétyl-1pyrroline est de préférence mesuré dans plusieurs plantes de chaque population et moyenné pour déterminer si la plante non naturelle contient un niveau élevé. Le niveau élevé dans la plante non naturelle de la présente invention est, en moyenne, environ 20 % plus élevé, 40 % plus élevé, 60 % plus élevé, 80 plus élevé, 100 % plus élevé, 150 % plus élevé, 200 % plus élevé, 250 % plus élevé, 300 % plus élevé, 400 % plus élevé ou 500 % plus élevé que dans la plante naturelle correspondante.

Promoteur: un site de reconnaissance sur une séquence d'ADN ou un groupe de séquences d'ADN qui forme un élément de régulation de l'expression d'un gène de structure et auquel l'ARN polymérase se lie spécifiquement et initie la synthèse d'ARN (transcription) de ce gène.

Des exemples de constructions d'expression de plantes utilisant ces promoteurs sont trouvés dans Fraley et al., brevet US No. 5 352 605. Dans la plupart des tissus de plantes transgéniques, le promoteur CaMV 35S est un promoteur fort (voir par exemple Odell et al., Nature 313:810, 1985). Le promoteur CaMV est aussi très actif dans les monocotylédones (voir par exemple Dekeyser et al., Plant Cell 2:591, 1990; Terada et Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220:389, 1990). De plus, l'activité de ce promoteur peut être augmentée encore (c'est à dire entre 2 et 10 fois) par duplication du promoteur CaMV 35S (voir par exemple Kay et al., Science 236:1299, 1987; Ow et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 84:4870, 1987; et Fang et al., Plant Cell 1:141, 1989, et McPherson et Kay, brevet U.S. No. 5 378 142).

D'autres promoteurs de plantes utiles incluent, sans limitation, le promoteur de la nopaline synthase (NOS) (An et al., Plant Physiol. 88:547, 1988 et Rodgers et Fraley, brevet U.S. No. 5 034 322), le promoteur de l'octopine synthase (Fromm et al., Plant Cell 1:977, 1989), le promoteur du virus de la mosaïque de la ficaire (FMV) (Rogers, brevet U.S. No. 5 378 619), et le promoteur de l'actine du riz (Wu et McElroy, WO91/09948).

Les exemples de promoteurs de monocotylédones incluent, sans limitation, le promoteur du virus de la tacheture jaune de la commélyne, le promoteur du virus badna de la canne à sucre, le promoteur du virus bacilliforme tungro du riz, l'élément viral des rayures du maïs, et le promoteur du virus du nanisme du blé.

Construction: sauf indication contraire, le terme "construction" désigne une molécule génétique recombinante comprenant une ou plusieurs séquences polynucléotidiques isolées de l'invention.

Les constructions génétiques utilisées pour l'expression de transgènes dans un organisme hôte incluent une séquence promotrice de gène liée de manière fonctionnelle à un cadre de lecture ouvert et éventuellement une séquence de terminaison de gène 3' en aval du cadre de lecture ouvert. Le cadre de lecture ouvert peut être orienté dans une direction sens ou antisens, selon l'utilisation de la séquence génique qui est envisagée. La construction peut inclure aussi un ou des gènes marqueurs sélectionnables et d'autres éléments régulateurs pour l'expression génique.

Vecteur: une molécule d'ADN capable de se répliquer dans une cellule hôte et/ou à laquelle un autre segment d'ADN peut être lié de manière fonctionnelle pour provoquer la réplication du segment fixé. Les plasmides, les phagémides, les cosmides, les phages, les virus, les YAC et les BAC sont tous des exemples de vecteurs.

Le terme vecteur désigne une molécule d'acide nucléique qui est utilisée pour introduire une séquence polynucléotidique dans une cellule hôte, en produisant ainsi une cellule hôte transformée. Un "vecteur" peut inclure du matériel génétique en plus de la construction génétique décrite ci-dessus, par exemple une ou plusieurs séquences d'acide nucléique qui lui permettent de se répliquer dans une ou plusieurs cellules hôtes, comme une ou des origines de réplication, des gènes marqueurs sélectionnables et d'autres éléments génétiques connus dans la technique (par exemple des séquences pour intégrer le matériel génétique dans le génome de la cellule hôte, etc.).

Transformée: une cellule transformée est une cellule dans laquelle a été introduite une molécule d'acide nucléique par des techniques de biologie moléculaire.

Tel qu'il est utilisé ici, le terme transformation englobe toutes les techniques par lesquelles une molécule d'acide nucléique peut être introduite dans une telle cellule, une cellule végétale ou animale, incluant la transfection avec des vecteurs viraux, la transformation par Agrobacterium, avec des vecteurs plasmidiques, et l'introduction d'ADN nu par électroporation, lipofection, et accélération par un pistolet à particules et inclut les transformants transitoires ainsi que les transformants stables.

Les procédés de transformation de cellules végétales avec de l'ADN incluent la transformation de plantes médiée par Agrobacterium, la transformation de protoplastes, le transfert génique dans le pollen, l'injection dans des organes reproducteurs, l'injection dans des embryons immatures et le bombardement avec des particules. Chacun de ces procédés a des avantages et des inconvénients distincts. Ainsi, un procédé particulier pour introduire des gènes dans une souche végétale particulière peut ne pas être nécessairement le plus efficace pour une autre souche végétale, mais les procédés qui sont utiles pour une souche végétale particulière sont bien connus.

Il existe de nombreux procédés pour introduire des segments d'ADN transformants dans des cellules, mais tous ne sont pas appropriés pour délivrer de l'ADN à des cellules végétales. On considère que les procédés appropriés incluent virtuellement tout procédé par lequel de l'ADN peut être introduit dans une cellule, comme l'infection avec Agrobacterium, la délivrance directe d'ADN comme, par exemple, par transformation de protoplastes médiée par le PEG (Omirulleh et al., 1993), par absorption d'ADN médiée par desiccation/inhibition, par électroporation, par agitation avec des fibres de carbure de silicium, par accélération de particules recouvertes d'ADN, etc. Dans certains modes de réalisation, les procédés d'accélération sont préférés, et ceux-ci incluent, par exemple, le bombardement avec des microprojectiles et analogues.

La technologie pour introduire de l'ADN dans des cellules est bien connue de l'homme du métier. Quatre procédés généraux pour délivrer un gène à des cellules ont été décrits: (1) des procédés chimiques (Graham et van der Eb, 1973; Zatloukal et al., 1992); (2) des procédés physiques comme la microinjection (Capecchi, 1980), l'électroporation (Wong et Neumann, 1982; Fromm et al., 1985) et le pistolet à gènes (Johnston et Tang, 1994; Fynan et al., 1993); (3) les vecteurs viraux (Clapp., 1993; Lu et al., 1993; Eglitis et Anderson, 1988a; 1988b); et (4) les mécanismes médiés par des récepteurs (Curiel et al., 1991; 1992; Wagner et al., 1992).

Electroporation: l'application de brèves impulsions électriques à haute tension à différentes cellules animales et végétales conduit à la formation de pores de dimensions de l'ordre du nanomètre dans la membrane plasmique. L'ADN est absorbé directement dans le cytoplasme de la cellule par ces pores ou par suite de la redistribution des composants de la membrane qui accompagne la fermeture des pores L'électroporation peut être extrêmement efficace et peut être utilisée pour l'expression transitoire de gènes clonés et pour l'établissement de lignées cellulaires qui portent des copies intégrées du gène d'intérêt. Contrairement à la transfection médiée par le phosphate de calcium et à la fusion de protoplastes, l'électroporation donne naissance fréquemment à des lignées cellulaires qui portent une copie, ou au plus quelques copies de l'ADN étranger intégrées.

L'introduction d'ADN par électroporation est bien connue de l'homme du métier. Dans ce procédé, certaines enzymes dégradant la paroi cellulaire, comme les enzymes dégradant la pectine, sont employées pour rendre les cellules receveuses cibles plus susceptibles d'être transformées par électroporation que les cellules non traitées. A titre d'alternative, les cellules receveuses sont rendues plus sensibles à la transformation par une lésion mécanique. Pour réaliser la transformation par électroporation, on peut employer des tissus friables comme une culture de cellules en suspension ou un cal embryogène, ou encore on peut transformer des embryons immatures ou d'autres tissus organisés directement. On peut dégrader partiellement les parois cellulaires des cellules choisies en les exposant à des enzymes dégradant la pectine (pectolyases) ou en les lésant mécaniquement d'une manière contrôlée. De telles cellules seront ensuite réceptives au transfert d'ADN par électroporation, qui peut être réalisé à ce stade, et les cellules transformées peuvent ensuite être identifiées par un protocole de sélection ou de criblage approprié, selon la nature de l'ADN nouvellement incorporé.

Bombardement avec des microprojectiles: Un autre procédé avantageux pour délivrer des segments d'ADN transformants à des cellules végétales est le bombardement avec des microprojectiles. Dans ce procédé, des particules peuvent être recouvertes d'acides nucléiques et délivrées à des cellules par une force propulsive. Les exemples de particules incluent celles constituées par du tungstène, de l'or, du platine et analogues.

Un avantage du bombardement avec des microprojectiles, en plus du fait d'être un moyen efficace pour obtenir de manière reproductible la transforrnation stable de monocotylédones, est que ni l'isolement de protoplastes (Cristou et al., 1988) ni la sensibilité à une infection avec Agrobacterium ne sont nécessaires. Un mode de réalisation illustratif d'un procédé pour délivrer de l'ADN à des cellules de maïs par accélération est un Biolistics Particle Delivery System , qui peut être utilisé pour propulser des particules recouvertes d'ADN ou des cellules recouvertes d'ADN au travers d'un crible en acier inoxydable ou en Nytex, sur la surface d'un filtre recouvert de cellules de maïs cultivées en suspension. Le crible disperse les particules de sorte qu'elles ne sont pas délivrées aux cellules receveuses en agrégats de grande taille. On pense qu'un crible disposé entre l'appareil à projectiles et les cellules qui doivent être bombardées réduit la taille des agrégats de projectiles et peut contribuer à une plus grande fréquence de transformation en réduisant les dégâts infligés aux cellules receveuses par des projectiles qui sont de trop grande taille.

Pour le bombardement, les cellules en suspension sont de préférence concentrées sur des filtres ou un milieu de culture solide. A titre d'alternative, des embryons immatures ou d'autres cellules cibles peuvent être disposés sur un milieu de culture solide. Les cellules qui doivent être bombardées sont positionnées à une distance appropriée sous la plaque d'arrêt des macroprojectiles. Si on le souhaite, un ou plusieurs cribles sont placés aussi entre le dispositif d'accélération et les cellules qui doivent être bombardées. Grâce à l'utilisation des techniques présentées ici on peut obtenir jusqu'à 1000 ou plus de 1000 foyers de cellules exprimant de manière transitoire un gène marqueur. Le nombre de cellules dans un foyer qui expriment le produit génique exogène 48 heures après le bombardement est souvent de 1 à 10 et en moyenne de 1 à 3.

Dans la transformation par bombardement, on peut optimiser les conditions de culture avant le bombardement et les paramètres du bombardement pour obtenir le nombre maximum de transformants stables. Les paramètres physiques et les paramètres biologiques pour le bombardement sont importants dans cette technologie. Les facteurs physiques sont ceux qui impliquent la manipulation du précipité d'ADN/microprojectiles ou ceux qui affectent le vol et la vitesse des macroprojectiles ou des microprojectiles. Les facteurs biologiques incluent toutes les étapes impliquées dans la manipulation des cellules avant et immédiatement après le bombardement, l'ajustement osmotique des cellules cibles pour contribuer à atténuer le traumatisme associé au bombardement, et aussi la nature de l'ADN transformant, par exemple ADN linéarisé ou plasmides superenroulés intacts. On considère que les manipulations avant le bombardement sont particulièrement importantes pour une transformation réussie d'embryons immatures.

Ainsi, il est envisagé que l'on peut souhaiter ajuster certains des paramètres du bombardement dans des études à petite échelle pour optimiser totalement les conditions. On peut souhaiter en particulier ajuster des paramètres physiques comme la distance de l'intervalle, la distance de vol, la distance du tissu et la pression d'hélium. On peut aussi minimiser les facteurs de réduction des traumatismes (FRT) en modifiant les conditions qui influencent l'état physiologique des cellules receveuses et qui peuvent donc influencer l'efficacité de la transformation et de l'intégration. Par exemple, l'état osmotique, l'hydratation des tissus et le stade de sous-culture ou le cycle cellulaire des cellules receveuses peuvent être ajustés pour une transformation optimale. La réalisation d'autres ajustements de routine sera connue de l'homme du métier à la lumière de la présente description.

Transfert médié par Agrobacterium: le transfert médié par Agrobacterium est un système largement applicable pour introduire des gènes dans des cellules végétales car l'ADN peut être introduit dans des tissus de plantes entières, ce qui évite la nécessité de régénérer une plante intacte à partir d'un protoplaste. L'utilisation de vecteurs d'intégration dans des plantes médiés par Agrobacterium pour introduire de l'ADN dans des cellules végétales est bien connue dans la technique. Voir par exemple les procédés décrits (Fraley et al., 1985; Rogers et al., 1987). En outre, l'intégration de l'ADN Ti est un processus relativement précis qui conduit à peu de réarrangements. La région d'ADN qui doit être transférée est définie par les séquences terminales, et l'ADN intermédiaire est habituellement inséré dans le génome de la plante comme décrit (Spielmann et al., 1986; Jorgensen et al., 1987).

Les vecteurs modernes de transformation avec Agrobacterium sont capables de réplication dans E. coli ainsi que Agrobacterium, ce qui permet des manipulations appropriées comme décrit (Klee et al., 1985). De plus, les progrès technologiques récents dans les vecteurs pour le transfert génique médié par Agrobacterium ont amélioré l'agencement des gènes et des sites de restriction dans les vecteurs pour faciliter la construction de vecteurs capables d'exprimer différents gènes codant des polypeptides. Les vecteurs décrits (Rogers et al., 1987) ont des régions de lieurs multisites commodes flanquées par un promoteur et un site de polyadénylation pour diriger l'expression de gènes codant des polypeptides insérés et sont appropriés pour les présents objets. En outre, Agrobacterium contenant des gènes Ti munis de bras et sans bras peut être utilisé pour les transformations. Dans les souches végétales où la transformation médiée par Agrobacterium est efficace, c'est le procédé de choix du fait de la nature aisée et définie du transfert génique.

La transformation médiée par Agrobacterium de disques foliaires et d'autres tissus comme les cotylédons et les hypocotyles semble être limitée aux plantes que Agrobacterium infecte naturellement. La transformation médiée par Agrobacterium est la plus efficace dans les plantes dicotylédones. Peu de monocotylédones semblent être des hôtes naturels pour Agrobacterium, bien que des plantes transgéniques aient été produites dans asparagus avec des vecteurs Agrobacterium comme décrit (Bytebier et al., 1987). De ce fait, les céréales à grains commercialement importantes comme le riz, le maïs et le blé doivent habituellement être transformées à l'aide d'autres procédés.

Une plante transgénique formée au moyen de procédés de transformation utilisant Agrobacterium contient typiquement un seul gène sur un chromosome. De telles plantes transgéniques peuvent être qualifiées d'hétérozygotes pour le gène ajouté. Toutefois, dans la mesure où l'utilisation du mot hétérozygote implique habituellement la présence d'un gène complémentaire au même locus du second chromosome d'une paire de chromosomes, et où un tel gène n'est pas présent dans une plante contenant un gène ajouté comme ici, on considère qu'un terme plus précis pour une telle plante est un ségrégant indépendant, car le gène exogène ajouté présente une ségrégation indépendamment pendant la mitose et la méiose.

On préfère encore une plante transgénique qui est homozygote pour le gène de structure ajouté, c'est à dire une plante transgénique qui contient deux gènes ajoutés, un gène au même locus sur chaque chromosome d'une paire de chromosome. Une plante transgénique homozygote peut être obtenue par appariement sexué (autofcondation) d'une plante transgénique ségrégante indépendante qui contient un seul gène ajouté, germination de certaines des graines produites et analyse des plantes résultantes produites concernant les niveaux de 2-acétyl-l-pyrroline élevés par rapport à une plante témoin (native, non transgénique) ou une plante transgénique ségrégante indépendante.

L'application de ces systèmes à différentes souches végétales dépend de l'aptitude à régénérer cette souche végétale particulière à partir de protoplastes. Des procédés illustratifs pour la régénération de céréales à partir de protoplastes sont décrits (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986).

Pour transformer des souches végétales qui ne peuvent pas être régénérées avec succès à partir de protoplastes, il est possible d'utiliser d'autres rnoyens pour introduire de l'ADN dans des cellules intactes ou des tissus intacts. Par exemple, la régénération de céréales à partir d'embryons immatures ou d'expiants peut être réalisée comme décrit (Vasil, 1988). En outre, il est possible d'utiliser la technologie du pistolet à particules ou des microprojectiles à grande vitesse (Vasil, 1992).

Avec cette dernière technologie, l'ADN est transporté au travers de la paroi cellulaire et dans le cytoplasme sur la surface de petites particules métalliques comme décrit (Klein et al., 1987; Klein et al., 1988; McCabe et al., 1988). Les particules métalliques pénètrent dans plusieurs couches de cellules et permettent ainsi la transformation de cellules dans des expiants de tissus.

Isolé : un composant biologique "isolé" (comme un acide nucléique ou une protéine ou une organelle) a été de façon appréciable séparé ou purifié d'autres composants biologiques dans la cellule ou l'organisme où le composant existe naturellement, c'est à dire d'autres ADN et ARN chromosomiques et extrachromosomiques, protéines et organelles. Les acides nucléiques et les protéines qui ont été "isolés" incluent les acides nucléiques et protéines purifiés par des procédés de purification standard. Le terme englobe les acides nucléiques y compris les acides nucléiques synthétisés chimiquement et englobe aussi les protéinespréparées par expression recombinante in vitro ou dans une cellule hôte et les acides nucléiques recombinants tels que définis ci-dessous. A titre d'exemple, un gène dans un grand fragment d'ADN génomique comme un contig n'est pas suffisamment purifié d'autres composants biologiques pour être considéré comme isolé du fait de la quantité relativement grande d'ADN supplémentaire trouvée dans le contig moyen. Comme indiqué ci-dessous, les "acides nucléiques recombinants" et les "protéines recombinantes" sont aussi "isolés" comme décrit ci-dessus.

Recombinant: Par "acide nucléique recombinant" on entend ici un acide nucléique qui a une séquence qui n'est pas naturelle ou qui a une séquence qui est produite par une combinaison artificielle de deux segments de séquence autrement séparés. Cette combinaison artificielle est souvent accomplie par synthèse chimique ou, plus communément, par la manipulation artificielle d'acides nucléiques, par exemple par des techniques de génie génétique, par exemple par la manipulation d'au moins un acide nucléique par une enzyme de restriction, une ligase, une recombinase et/ou une polyrnérase. Lorsqu'il est introduit dans une cellule hôte, un acide nucléique recombinant est répliqué par la cellule hôte; cependant, l'acide nucléique recombinant une fois répliqué dans la cellule reste un acide nucléique recombinant aux fins de cette invention. Par "protéine recombinante" on entend ici une protéine produite par un procédé employant un acide nucléique recombinant. Comme indiqué ci-dessus, les "acides nucléiques recombinants" et les "protéines recombinantes" sont aussi "isolés" comme décrit ci-dessus. Un gène dans un grand fragment comme un contig ne serait pas un acide nucléique recombinant étant donné qu'une telle combinaison artificielle ne concerne pas le gène. Toutefois, si des séquences au voisinage ou à l'intérieur d'un gène dans un contig ont été manipulées à des fins liées à ce gène (c'est à dire pas simplement car le gène est à proximité de l'extrémité du contig), un tel gène dans un contig constituerait un acide nucléique recombinant du fait de la proximité relative de la partie recombinante de l'acide nucléique et du gène en question.

Plante non naturelle: tel qu'il est utilisé ici, le terme "non naturelle" quand il est utilisé en référence à une plante, signifie une plante qui a été modifiée génétiquement par une intervention humaine pour modifier les niveaux du composé 2-acétyl-l-pyrroline dans la plante. La plante naturelle qui a été modifiée génétiquement est appelée plante témoin . Dans le contexte de l'invention, la plante témoin peut être une plante transgénique. Par exemple, la plante témoin peut être une plante transgénique résistante à un herbicide. Dans cet exemple, Dans cet exemple, une plante non naturelle serait résistante à un herbicide et aurait des niveaux élevés du composé 2-acétyl-lpyrroline par rapport à la plante résistante à l'herbicide témoin. Une plante transgénique de l'invention, par exemple, est une plante non naturelle qui contient une molécule d'acide nucléique exogène codant un gène 2AP ou un fragment de celui-ci de sorte qu'elle a été modifiée génétiquement par une intervention humaine. En outre, une plante qui contient une mutation, par exemple dans un élément régulateur du gène 2AP ou la séquence codante du gène 2AP par suite de l'exposition calculée à un agent mutagène, comme un mutagène chimique, ou un mutagène insertionnel , comme un transposon ou un ADN-T, est considérée aussi comme une plante non naturelle, car elle a été modifiée génétiquement par une intervention humaine. Au contraire, une plante contenant seulement des mutations spontanées ou naturelles n'est pas une plante non naturelle telle qu'elle est définie ici. L'homme du métier comprend que, tandis qu'une plante non naturelle a typiquement une séquence nucléotidique qui est modifiée par rapport à une plante naturelle, une plante non naturelle peut aussi être génétiquement modifiée par une intervention humains sans modifier sa séquence nucléotidique, par exemple, par modification de sa configuration de méthylation.

Plante transgénique: une plante ou sa descendance issue d'une cellule végétale transformée ou d'un protoplaste transformé, où l'ADN de la plante contient une molécule d'ADN exogène introduite qui n'est pas présente originellement dans une plante non transgénique native de la même souche. Les ternies plante transgénique et plante transformée ont parfois été utilisés dans la technique comme des termes synonymes pour définir une plante dont l'ADN contient une molécule d'ADN exogène.

Cependant, on considère qu'il est plus correct scientifiquement de qualifier de plante transgénique une plante régénérée ou un cal régénéré obtenu à partir d'une cellule végétale transformée ou d'un protoplaste transformé, et cet usage sera suivi ici.

1. Le gène de la 2-acétyl-l-pyrroline (2AP) A. Isolement d'orthologues/homologues: la section des exemples ci- dessous, qui décrit l'isolement et la caractérisation de gènes Os2AP dans le riz, illustre une approche générale pour isoler des gènes 2AP. Ces gènes 2AP codent des protéines 2AP. Les gènes isolés peuvent ensuite être utilisés pour construire des vecteurs recombinants pour abaisser l'expression des gènes 2AP dans des plantes.

Généralement, la nomenclature et les processus de laboratoire dans la technologie de l'ADN recombinant décrits ci-dessous sont ceux qui sont bien connus et communément utilisés dans la technique. Des techniques standard sont utilisées pour le clonage, l'isolement, l'amplification et la purification d'ADN et d'ARN. Généralement, des réactions enzymatiques mettant en jeu une ADN ligase, une ADN polymérase, des enzymes de restriction et analogue sont conduites selon les spécifications du fabricant.

Ces techniques et différentes autres techniques sont généralement mises en oeuvre selon Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989).

L'isolement d'un gène 2AP peut être accompli par un certain nombre de techniques. Par exemple, des sondes oligonucléotidiques basées sur les séquences décrites ici peuvent être utilisées pour identifier le gène souhaité dans une banque d'ADNc ou d'ADN génomique. Pour construire des banques génomiques, de grands segments d'ADN génomique sont produits par fragmentation aléatoire, par exemple avec des endonucléases de restriction, et sont ligaturés avec un ADN vecteur pour former des concatémères qui peuvent être empaquetés dans le vecteur approprié. Pour preparer une banque d'ADNc, de l'ARNm est isolé de l'organe souhaité, comme une feuille, et une banque d'ADNc qui contient le transcript du gène 2AP est préparée à partir de l'ARNm. A titre d'alternative, PADNc peut être préparé à partir de l'ARNm extrait d'autres tissus où des gènes 2AP ou des homologues sont exprimés.

La banque d'ADNc ou génomique peut ensuite être criblée avec une sonde basée sur la séquence d'un gène 2AP cloné comme les gènes Os2AP du riz décrits ici. Des sondes peuvent être utilisées pour s'hybrider avec des séquences d'ADN génomique ou d'ADNc pour isoler des gènes homologues dans la même espèce végétale ou dans des espèces végétales différentes.

Des molécules d'acide nucléique ayant des régions de séquence consistant en étendues de nucléotides contigus de 10-14, 15-20, 30, 50, ou même de 100-200 nucleotides environ, identiques ou complémentaires des séquences d'ADN représentées dans SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 sont particulièrement envisagées comme sondes d'hybridation destinées à être utilisées, par exemple en transfert de Southern et de Northern. Des fragments plus petits seront généralement utilisés dans des modes de réalisation d'hybridation où la longueur de la région complémentaire contiguë peut être modifiée, par exemple entre environ 1014 et environ 100 ou 200 nucleotides, mais des étendues complémentaires contiguës plus grandes peuvent être utilisées selon la longueur des séquences complémentaires que l'on souhaite détecter.

L'utilisation d'une sonde d'hybridation d'une longueur d'environ 14 nucléotides permet la formation d'une molécule duplex qui est stable et sélective. Les molécules ayant des séquences complémentaires contiguës sur des étendues de plus de 14 bases de longueur sont généralement préférées, bien que, pour augmenter la stabilité et la spécificité de l'hybride, et donc améliorer la qualité et le degré de spécificité des molécules hybrides obtenues, on préfère généralement concevoir des molécules d'acide nucléique ayant des étendues complémentaires de gène de 15 à 20 nucléotides contigus, ou même plus longues si on le souhaite.

Bien entendu, des fragments peuvent aussi être obtenus par d'autres techniques, par exemple par cisaillement mécanique ou par digestion avec des enzymes de restriction. De petits segments ou fragments d'acide nucléique peuvent être préparés aisément, par exemple par synthèse directe du fragment par des moyens chimiques, comme cela est pratiqué communément au moyen d'un synthétiseur automatique d'oligonucléotides. En outre, des fragments peuvent être obtenus par application d'une technologie de reproduction d'acide nucléique, comme la technologie PCR. TM. des brevets US No. 4 683 195 et 4 683 202 (chacun incorporé ici par référence), par introduction de séquences choisies dans des vecteurs recombinants pour la production de recombinants, et par d'autres techniques d'ADN recombinant généralement connues de l'homme du métier dans le domaine de la biologie moléculaire.

Ainsi, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être utilisées pour leur aptitude à former sélectivement des molécules duplex avec des étendues complémentaires de fragments d'ADN. Selon l'application envisagée, on souhaitera employer des conditions d'hybridation variables pour obtenir différents degrés de sélectivité de la sonde à l'égard de la séquence cible. Pour les applications nécessitant une haute sélectivité, on souhaitera typiquement employer des conditions relativement stringentes pour former les hybrides, par exemple on choisira des conditions de concentrations de sel relativement basses et/ou de températures élevées, par exemple NaCl environ 0,02 M à environ 0,15 M à des températures d'environ 50 C à environ 70 C. Ces conditions sélectives tolèrent peu, ou pas, de mésappariement entre la sonde et le brin matrice ou le brin cible, et seraient particulièrement appropriées pour isoler des segments d'ADN codant un polypeptide ou une protéine 2AP. La détection de segments d'ADN par hybridation est bien connue de l'homme du métier, et les enseignements des brevets US n . 4 965 188 and 5 176 995 (incorporés chacun par référence ici) illustrent les procédés d'analyse d'hybridation. Les enseignements comme ceux trouvés dans les ouvrages de Maloy et al., 1994; Segal 1976; Prokop, 1991; et Kuby, 1994, sont particulièrement pertinents.

Bien entendu, pour certaines applications, par exemple quand on souhaite préparer des mutants en employant un brin d'amorce mutant hybridé à une matrice sous-jacente ou quand on cherche à isoler des séquences codant la protéine 2AP à partir d'espèces apparentées, d'équivalents fonctionnels, ou analogues, des conditions d'hybridation moins stringentes seront typiquement nécessaires pour permettre la formation de l'hétéroduplex. Dans ces circonstances, on peut souhaiter employer des conditions comme environ 0,15 M à environ 0,9 M de sel, à des températures allant d'environ 20 C à environ 55 C. I1 est ainsi possible d'identifier aisément les espèces présentant une hybridation croisée sous forme de signaux d'hybridation positive par rapport à des hybridations témoins. Dans tous les cas, on comprendra généralement que les conditions peuvent être rendues plus stringentes par addition de quantités croissantes de formamide qui sert à déstabiliser le duplex hybride de la même manière qu'une augmentation de la température. Ainsi, les conditions d'hybridation peuvent être manipulées aisément, et ce sera donc généralement une question de choix selon les résultats souhaités.

Dans certains modes de réalisation, il sera avantageux d'employer des séquences d'acide nucléique de la présente invention en combinaison avec un moyen approprié, comme un marqueur, pour déterminer l'hybridation. Une grande variété de moyens indicateurs appropriés sont connus dans la technique, incluant les ligands fluorescents, radioactifs, enzymatiques ou d'autres ligands, comme l'avidine/biotine, qui sont capables de donner un signal détectable. Dans des modes de réalisation préférés, on souhaitera de même employer un marqueur fluorescent ou un marqueur enzymatique, comme l'uréase, la phosphatase alcaline ou la peroxydase, à la place de réactifs radioactifs ou d'autres réactifs indésirables du point de vue de l'environnement. Dans le cas de marqueurs enzymatiques, on connaît des substrats indicateurs colorimétriques qui peuvent être employés pour produire un moyen visible à l'oeil humain ou par spectrophotométrie, pour identifier une hybridation spécifique avec des échantillons contenant un acide nucléique complémentaire.

En général, il est envisagé que les sondes d'hybridation décrites ici seront utiles comme réactifs dans l'hybridation en solution et dans des modes de réalisation qui emploient une phase solide. Dans les modes de réalisation faisant intervenir une phase solide, l'ADN (ou ARN) test est adsorbé ou fixé d'une autre manière à une matrice ou surface choisie. Cet acide nucléique simple brin fixé est ensuite soumis à une hybridation spécifique avec des sondes choisies dans des conditions souhaitées. Les conditions choisies dépendront des circonstances particulières sur la base des critères particuliers qui sont requis (dépendant par exemple de la teneur en G+C, du type de l'acide nucléique cible, de la source d'acide nucléique, de la taille de la sonde d'hybridation, etc.). Après lavage de la surface hybridée pour retirer les molécules de sonde liées de manière non spécifique, l'hybridation spécifique est détectée, ou même quantifiée, au moyen du marqueur.

A titre d'alternative, les acides nucléiques d'intérêt peuvent être amplifiés à partir d'échantillons d'acides nucléiques au moyen de techniques d'amplification. Par exemple, la technologie d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) peut être utilisée pour amplifier les séquences de gènes 2AP directement à partir d'ARNm, d'ADNc, de banques génomiques ou de banques d'ADNc. La PCR et d'autres procédés d'amplification in vitro peuvent aussi être utiles, par exemple, pour cloner des séquences d'acide nucléique qui codent des protéines destinées à être exprimées, pour produire des acides nucléiques destinés à être utilisés comme sondes pour détecter la présence de l'ARNm voulu dans des échantillons, pour le séquençage d'acides nucléiques, ou pour d'autres applications.

Des amorces et sondes appropriées pour identifier des séquences de gène 2AP provenant de tissus végétaux sont produites d'après des comparaisons des séquences fournies ici. Pour un aperçu général de la PCR voir PCR Protocc-ls: A Guide to Methods and Applications. (Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. et White, T., eds.), Academic Press, San Diego (1990), incorporé ici par référence.

Des polynucléotides peuvent aussi être synthétisés par des techniques bien connues comme décrit dans la literature technique. Voir par exemple Camithers et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418 (1982), et Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 105:661 (1983). Des fragments d'ADN double brin peuvent ensuite être obtenus par synthèse du brin complémentaire et hybridation des brins dans des conditions appropriées, ou par addition du brin complémentaire au moyen de l'ADN polymérase avec une séquence d'amorce appropriée.

B. Organismes à partir desquels un orthologue de gène 2AP peut être isolé Il est possible d'utiliser un grand nombre de plantes et de champignons incluant des espèces provenant des genres Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum et Sorghum. On a montré que la 2-acétyl-l-pyrroline est le principal composant d'arôme actif de tous les riz aromatiques, du pain de blé et d'orge (Buttery et al., 1982, 1983), du millet humide (Seitz et al. , 1993), du popcorn (Schieberle et al., 1991), Bacilles ceres (Romanczyk et al., 1995), et certaines espèces fongiques comme Aspergellus oryzae, Aspergellus awamori, et Sporobolus virginicus (Nagsuk et al., 2004). Plusieurs articles montrent une ample synténie génomique parmi les céréales ainsi qu'une voie métabolique de la proline et de la polyamine bien conservée dans les plantes et les microorganismes (trouvé en ligne sur la page web de the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Kyoto University, Bioinformatics Center, Institute for Chemical Research). De ce fait, des orthologues du gène 2AP peuvent agir d'une manière comparable parmi les plantes de type céréales, et les enseignements fournis dans cette invention peuvent augmenter l'accumulation du composé 2-acétyl-l-pyrroline dans d'autres plantes de la même manière que dans le riz.

II. Réduction de l'expression du gène 2AP ou des niveaux ou de 5 l'activité de la protéine 2AP pour augmenter les niveaux de 2-acétyl-1pyrroline dans des plantes A. Mutagenèse. Des mutagènes chimiques comme EMS (méthanesulfonate d'éthyle) et les rayons gamma et les rayons neutroniques rapides peuvent créer des mutations dans l'ADN. Certains exemples de mutations sont les délétions, les insertions et les mutations faux sens. Après une mutation, il est possible d'opérer un criblage pour identifier les délétions qui créent des codons d'arrêt prématurés ou des gènes 2AP non fonctionnels d'une autre manière. Le criblage de mutants peut être opéré par séquençage, ou au moyen de sondes ou d'amorces spécifiques du gène ou de la protéine 2AP, qui sont fournies par la présente invention. Des mutations spécifiques dans des gènes 2AP peuvent aussi être créées par TILLING (Targeted Induced Local Lesion of Genome) (Till et al., 2003) et insertion d'ADNt. De telles mutations peuvent conduire à des diminutions de l'expression du gène 2AP, une diminution de la stabilité de l'ARNm de 2AP, ou une réduction de l'activité et/ou de la stabilité de la protéine 2AP. Les plantes telles qu'elles sont définies ici sont non naturelles B. Technologie antisens La technologie antisens empêche la traduction d'un ARNrn cible, comme l'ARNm de 2AP. Ainsi, la technologie antisens réduit généralement les niveaux de la protéine cible, ici la protéine 2AP. Le gène 2AP ou des fragments de ce gène peuvent être introduits dans la plante dans l'orientation antisens. Les fragments peuvent avoir une taille aussi petite que 18 nucléotides et aussi grande que 3000 nucléotides ou plus. Des fragments d'ADNc d'un gène 2AP peuvent être clonés dans un vecteurs (par exemple, pCAMBIAI302) dans l'orientation opposée au gène natif. Le transcrit inversé formera une structure d'hétéroduplex avec le transcrit du gène 2AP natif, qui alors dégradé avant la traduction. Il n'est pas nécessaire que les séquences sens et antisens soient identiques, une homologie même partielle peut être suffisante pour obtenir la suppression de l'expression du gène cible. Ainsi, une séquence Os2AP provenant du riz (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5) peut être utilisée pour supprimer l'expression du gène 2AP dans d'autres plantes, sans connaître la séquence des orthologues du gène 2AP provenant de ces plantes.

C. Interférence à ARN: L'interférence à ARN (ARNi) est une autre technique qui concerne l'élimination d'un ARNm cible. Il existe des variantes dans la construction de vecteurs pour l'ARNi, mais le résultat fondamental est la formation d'une structure en épingle à cheveux dans l'ARN (Horiguchi 2004). Dans l'exemple 2, un fragment de séquence nucléotidique de Os2AP englobant les exons 6, '7 et 8 dans la direction opposée à son ADNc a été cloné dans un vecteur pour donner une structure en épingle à cheveux inversée dans l'ARNm. Ces structures en épingle à cheveux sont clivées en petits fragments par une endonucléase appelée Dicer, dont la fonction est d'empêcher la traduction de transcrits erronés (Hamilton et Baulcombe, 1999, Matzke et al., 2001). Les petits fragments d'ARNm ont généralement une taille d'environ 20 à 21 nucléotides, et ont été appelés ARNsi, ou petits ARN interférents. Il est possible aussi d'utiliser des fragments plus grands ou plus petits. Ces ARNsi peuvent réguler négativement l'expression de gènes homologues. Là encore, il n'est pas nécessaire que l'homologie soit totale, de sorte que des séquences provenant du riz décrites en détail dans cette invention pourraient être utilisées pour créer des constructions d'ARNi pour d'autres plantes. L'exemple 2 montre comment une expérience d'ARNi ciblant le gène Os2AP dans une souche de riz non aromatique a conduit à des niveaux de 2-acétyl-1-pyrroline élevés, et à un arôme à un niveau rencontré dans le riz aromatique.

III. Création de plantes transgéniques Pour utiliser des séquences de gène 2AP isolées dans les techniques précédentes, il est possible de préparer des vecteurs d'ADN recombinants qui conviennent pour la transformation de cellules végétales. Des techniques pour transformer une grande variété d'espèces végétales supérieures sont bien connues et sont décrites dans la littérature technique et scientifique. Voir, par exemple, Weising et al. Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988).

De telles constructions d'ADN peuvent être introduites dans le génome de l'hôte végétal souhaité par différentes techniques conventionnelles. Par exemple, la construction d'ADN peut être introduite directement dans l'ADN génomique de la cellule végétale au moyen de techniques comme l'électroporation, la poration avec le PEG, le bombardement avec des particules et la micro-injection de protoplastes de cellules végétales ou de cals embryonnaires, ou bien les constructions d'ADN peuvent être introduites directement dans un tissu végétal au moyen de procédés ballistiques, comme le bombardement avec des particules à ADN. A titre d'alternative, les constructions d'ADN peuvent être combinées avec des régions flanquantes d'ADN-T appropriées et introduites dans un vecteur hôte Agrobacterium tumefaciens conventionnel. Les fonctions de virulence de l'hôte Agrobacterium tumefaciens dirigeront l'insertion de la construction et du marqueur adjacent dans l'ADN de la cellule végétale quand la cellule est infectée par les bactéries.

Des techniques de micro-injection sont connues dans la technique et sont bien décrites dans la littérature scientifique et des brevets. L'introduction de constructions d'ADN au moyen de la précipitation avec le polyéthylèneglycol est décrite dans Paszkowski et al. Embo J. 3:2717- 2722 (1984). Des techniques d'électroporation sont décrites dans Fromm et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824 (1985). Des techniques de transformation ballistiques sont décrites dans Klein et al. Nature 327:7073 (1987). En utilisant un certain nombre d'approches, il est possible de transformer des espèces de céréales comme l'orge (de la Pena et al., Nature 325:274-276 (1987)), le maïs (Rhodes et al., Science 240:204-207 (1988)) et le riz (Shimamoto et al., Nature 338:274-276 (1989) par électroporation; Li et al. Plant Cell Rep. 12:250-255 (1993) par des techniques ballistiques).

Des techniques de transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens sont bien décrites dans la littérature scientifique. Voir par exemple Horsch et al. Science 233:496-498 (1984), et Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983). Bien que Agrobacterium soit utile principalement dans les dicotylédones, certaines monocotylédones peuvent être transformées par Agrobacterium. Par exemple, la transformation du riz par Agrobacterium est décrite par Hiei et al., Plant J. 6:271-282 (1994).

Les cellules végétales transformées qui sont obtenues par l'une quelconque des techniques de transformation ci-dessus peuvent être cultivées pour régénérer une plante entière qui possède le génotype transformé, et donc un niveau élevé de 2-acétyl-1-pyrroline et un arôme accru. De telles techniques de régénération sont basées sur la manipulation de certaines phytohormones dans un milieu de croissance en culture de tissu, typiquement basée sur un marqueur biocide et/ou herbicide qui a été introduit en même temps que les séquences nucléotidiques de 2AP. La régénération d'une plante à partir de protoplastes cultivés est décrite dans Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; et Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La régénération peut aussi être obtenue à partir de cals, d'expiants, d'organes végétaux ou de parties de ceux-ci. De telles techniques de régénération sont décrites d'une manière générale dans Klee et al. Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987).

L'homme du métier comprendra qu'après que la cassette d'expression a été incorporée de manière stable dans des plantes transgéniques et qu'il a été confirmé qu'elle est fonctionnelle, elle peut être introduite dans d'autres plantes par croisement sexué. Il est possible d'utiliser un certain nombre de techniques de production standard, sel les espèces à croiser.

IV. Test des niveaux de 2-acétyl-1-pyrroline A. Evaluation sensorielle La fragrance volatile peut être détectée à partir de graines sèches, de riz cuit ou de feuilles broyées (Dhulappanavar, 1976, (ihose et al., 1952, Kadam et al., 1938). Une telle détection inclut un test gustatif. Une autre pratique populaire parmi les producteurs de riz consiste à chauffer du tissu foliaire dans l'eau puis à appliquer une solution de KOH diluée (Sood et Siddiq, 1978). Ces tests ne sont pas toujours cohérents et fiables, et sont susceptibles d'erreurs humaines et de préférence.

B. Chromatographie: un procédé plus fiable utilisant la chromatographie en phase gazeuse a été créé pour quantifier les composants volatils à partir de 100 grammes de riz cuit (Petrov et al., 1995). Récemment, une technique de chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse (CGSM) a été développée pour analyser des niveaux de 2-acétyl-1-pyrroline aussi faibles que 1 partie par milliard à partir de seulement un gramme de riz (Mahatheeranont et al., 1995). Ainsi, la CGSM peut être utilisée pour tester les niveaux de 2-acétyl- l -pyrroline dans des plantes naturelles et non naturelles. Voir la figure 1.

Description de modes de réalisation préférés

EXEMPLE 1: clonage positionnel du gène régulant l'arôme dans le riz Le trait arôme du riz a été localisé par cartographie antérieurement sur le chromosome 8 sur la base de procédés de détermination de l'arôme quantitatifs et qualitatifs (Lorieux et al. 1996). Le gène de l'arôme a été localisé par cartographie à 4,5 cM de RG28 (Ahn et al. 1992) et à 12 cM entre RG28 et RG1 (Lorieux et al. 1996).

Récemment, le marqueur de polymorphisme de nucléotide unique (SNP) RSPO4 développé à partir de la séquence génomique du riz publique a été localisé par cartographie à 2 cM du gène de l'arôme (Jin et al. 2003).

Le QTL unique a été localisé sur la région de 4,5 cM flanquée par les marqueurs de RFLP RG1 et RG28 sur le chromosome 8 (Lorieux et al., 1996; Lanceras et al. 2000). La banque EcoRI BAC issue de KDML105 consistait en75264 clones représentant 17 génomes haploïdes. Un contig de BAC initial consistant en vingt cinq clones de BAC a été choisi en utilisant six marqueurs localisés par cartographie dans la région (Wanchana et al., 2005) et a été affiné encore en utilisant la technique d'empreintes Hind III ( Hind III fingerprinting ). Pour identifier les gènes impliqués dans l'accumulation de la 2-acétyl-1-pyrroline, la région critique a été rétrécie au moyen de la stratégie suivante.

Initialement, la seule plante F6 qui présentait une ségrégation pour l'arôme des grains dans F7 a été choisie comme source pour produire de nouveaux recombinants dans la région critique. De F7 à F12, pour chaque génération, des plantes hétérozygotes ont été choisies sur la base de l'arôme des grains et de génotypes marqueurs. Dans la génération F10, la région critique a été rétrécie à 380 kb par criblage de 374 plantes F10 avec dix huit marqueurs polymorphes développés à partir de séquences terminales de KDML105 BAC. La région a été affinée encore à 120 kb par criblage de 274 plantes F11 (FIGURE 2). Sur la base d'un génotypage graphique et de la quantité de 2-acétyl- 1-pyrroline, 8 plantes F11 ont été choisies pour produire des lignées isogéniques aromatiques, non aromatiques et hétérozygotes (FIGURE 2). A ce stade, trois clones KDML BAC, 155L11, 68L13 et 167M23, ont été choisis pour un séquençage aléatoire ( shotgun ). L'alignement des séquences du KDML et de contigs génomiques de Nipponbare correspondants a conduit à l'identification de 21 marqueurs d'insertion/délétion ("indel") pour un criblage supplémentaire dans la génération F12. En utilisant 1116 plantes F12, la région cible a été rétrécie à 27 kb dans le BAC, 167123 de 58 kb (FIGURE 2). Aucune recombinaison supplémentaire n'a été identifiée dans ce croisement. Plusieurs paires de lignées isogéniques qui présentaient clairement des différences dans l'accumulation de la 2-acétyl-l-pyrroline dans les grains de riz ont été développées (FIGURE 6).

L'analyse des séquences a révélé que le BAC 167M23 contient 19 gènes. Toutefois, dix gènes seulement ont une similarité avec des protéines connues ou des séquences codantes connues. Dans la région de 27 kb, trois gènes candidats ont été identifiés: 3-méthylcrotonyl-CoA carboxylase (MCCase), un gène hypothétique, et une protéine inconnue. En utilisant 177 plantes F6 provenant d'un croisement entre KDML105 et Jao Hom Nin (JHN), un riz noir non aromatique, un site de recombinaison a été identifié dans l'exon 7 de la protéine inconnue qui affectait l'arôme des grains et les niveaux de 2-acétyl- l -pyrroline. Pour étudier l'expression de ces sept gènes candidats à partir de BAC 167M23 et BAC 68L13, une RT-PCR a été réalisée pendant la période de remplissage des grains au cours de laquelle la 2-acétyl-1-pyrroline s'accumule dans les grains de riz. L'ARN total a été recueilli à partir de particules de riz 10, 15 et 20 jours après la pollinisation à partir de lignées isogéniques aromatiques et non aromatiques. Aucune expression n'a été détectée pour le gène NBS/LRR. La plupart des gènes candidats ne présentaient pas d'expression différentielle entre les lignées isogéniques aromatiques et non aromatiques. Dans le cas de Os2AP seulement, l'expression génique diminuait fortement dans les lignées isogéniques aromatiques 15 jours après la pollinisation (FIGURE 3A). La diminution de l'expression du gène Os2AP était aussi marquée dans les feuilles, les tiges et les racines (FIGURE 3B). De ce fait, les études d'expression et le clonage positionnel sont en faveur du fait que Os2AP est le régulateur responsable de l'accumulation de l'arôme des grains et de la synthèse de la 2-acétyl-1-pyrroline in vivo.

Des chercheurs avaient décrit antérieurement un seul gène nucléaire récessif régulant l'arôme des grains (Berner et Hoff, 1986; Yanjuan et al. , 1992; Ali et al., 1993). Ceci est en accord avec les résultats décrits ici. Les accumulations de 2-acétyl-lpyrroline ont été comparées dans des lignées isogéniques aromatiques et non aromatiques et les plantes F1. Les résultats montraient que la 2-acétyl-1-pyrroline n'était pas détectée dans les feuilles F 1. Du fait de la ségrégation dans la génération F2, le niveau de 2-acétyl- l -pyrroline était un quart du niveau trouvé dans les parents donneurs (FIGURE 3C). De ce fait, la génétique classique et la génétique moléculaire étaient en faveur du fait que la mutation dans l'exon 7 est le mécanisme moléculaire régulant l'accumulation de la 2acétyl-l-pyrroline dans les plantes.

Les structures des gènes Os2AP ont été comparées parmi KDML 105, une lignée isogénique aromatique, une lignée isogénique non aromatique et Nipponbare. Le gène Os2AP de 5,8 kb consistait en 15 exons avec plusieurs mutations synonymes trouvées dans l'exon 2 (FIGURE 5A). Pour KDML105 et les lignées isogéniques aromatiques, deux événements mutationnels importants ont été identifiés dans l'exon 7.

D'abord, deux mutations transitives ont été trouvées aux positions 730 (A en T) et 732 (T en A), suivies par la délétion de 8 paires de bases GATTAGGC' commençant à la position 734. L'analyse des niveaux de 2-acétyl1-pyrroline parmi 8 lignées isogéniques a montré que la délétion de 8 paires de bases est associée avec l'accumulation de 2-acétyl-1-pyrroline dans les grains de riz (FIGURE 6A). Cette mutation entraînait un décalage du début de la traduction à la position 729 et créait un codon d'arrêt prématuré à la position 753 (FIGURE 5B). Dans Nipponbare, l'ADNc de Os2AP de longueur intégrale est traduit en 503 aminoacides. La délétion créait un peptide tronqué de 252 aminoacides (FIGURE 5B). Dans les 177 plantes F6 issues de KDML105 et JHN, une double recombination flanquant la délétion de 8 paires de bases explique ['absence de production de 2acétyl-1-pyrroline dans les grains de riz.

Ce codon d'arrêt prématuré peut avoir des effets sensibles sur l'expression de Os2AP. La plupart des ARNm qui contiennent un codon d'arrêt de la traduction prématuré ne sont pas traduits. Par conséquent, ils déclenchent souvent une décroissance de l'ARNm médiée non sens (NMD), un système de surveillance dont la fonction est de réduire les erreurs dans l'expression génique (Pulak et Anderson, 1993). Ce phénomène peut expliquer le bas niveau d'expression du gène Os2AP dans le riz aromatique.

Le précurseur immédiat de 2AP n'a pas encore été découvert. Cependant, le précurseur du noyau pyrroline de Os2AP est l'acide aminé proline comme cela a été déterminé par dilution isotopique (Yoshihashi et al., 2002). Il est aussi possible que les métabolites contenant la pyrroline tel que le 1-pyrroline et l'acide pyrroline-2- carboxylique (P2C) puissent servir de précurseurs immédiats. Une possibilité d'augmenter l'intensité de l'arôme des grains est de manipuler l'expression d'enzymes impliquées dans les voies de biosynthéses relevantes de telle façon que plus de précurseurs ou d'intermédiaires s'accumulent et soient disponibles pour une conversion spécifique en 2AP lors du développement du grain. Des exemples de manipulation de l'expression d'enzymes sont l'augmentation de l'expression des enzymes P5C synthétase et P5C réductase avec en même temps la suppression de la proline deshydrogénase et de la P5C déshydrogénase. Il est aussi possible d'augmenter plusieurs enzymes dans les voies de biosynthèses de la polyamine conduisant à plus de 1pyrrolines dans les grains de riz en développement. En plus de cette approche d'ingénierie métabolique, l'expression d'enzyme dans de l'endosperme de riz peut être augmentée en utilisant un promoteur spécifique de l'endosperme disponible dans le riz. Ces techniques permettent de produire des souches de riz avec plus d'arôme dans le riz poli.

EXEMPLE 2: Transformation de plantes avec des gènes Os2AP Le gène Os2AP a été incorporé dans une construction d'ARNi qui a été utilisée pour réguler négativement l'expression du gène Os2AP et augmenter les niveaux de 2-acétyl-l-pyrroline dans le riz.

Construction d'un vecteur contenant un ihpARN de Os2AP Un vecteur pCAMBIA1302 a été utilisé pour exprimer des fragments sensantisens du gène Os2AP. Des fragments sens et antisens ont été produits par PCR avec l'ADN génomique et l'ARN total de KDML105 comme matrices, respectivement. Une séquence d'ADN génomique contenant un fragment sens correspondant aux exons 6 à 9 a été amplifiée avec les amorces contenant des sites de restriction Ncol et Spel (soulignés) (directe: AATTCCATGGGGTTGGTCTTCCTTCAGGTG (SEQ ID NO: 80); inverse: AATTACTAGTTTCCACCAAGTTCCAGTGAA (SEQ ID NO: 81)). Un fragment antisens contenant une séquence d'ADNc correspondant aux exons 6 à 8 a été amplifié avec les amorces contenant des sites de restriction Ncol et Nhel (directe: AATTCCATGGGGTTGGTCTTCCTTCAGGTG (SEQ ID NO: 80); inverse: AATTGCTAGCGGTCCAAAAGCAACCAAAGA (SEQ ID NO: 82). Les produits de PCR ont d'abord été digérés avec SpeI et Nhel puis ligaturés avec l'ADN ligase de T4. Les fragments ligaturés ont ensuite été digérés avec NcoI. Les fragments ligaturés purifiés ont été clonés dans le vecteur pCAMBIA1302 au site de clonage Ncol (FIGURE 7A).

Transformation du riz Des cals embryogènes d'une variété de riz non aromatique (Oryza sativa L. japonica variété Nipponbare) ont été utilisés comme tissus cibles pour la transformation par bombardement avec des particules (Nimlek, 1999). Des cals résistants à l'hygromycine ont été criblés par PCR avec les amorces Os2AP-exon 7.1-del_F et R (U: 5'TGCTCCTTTGTCATCACACC-3' (SEQ ID NO: 54) et L: 5'-TTTCCACCAAGTTCCAGTGA-3' (SEQ ID NO: 55)) et les amorces pour GFP (U: 5'-CTTGTTGAATTAGATGGTGATGTT3' (SEQ ID NO: 83) et L: 5'-GTTGTGGGAGTTGTAGTTGTATTC-3' (SEQ ID NO: 84).

Analyse par transfert de Southern L'ADN total a été isolé de feuilles de plantes transgéniques (RO) et témoins (Nipponbare). L'ADN génomique (10 mg) a été digéré avec Ncol pour la détection de fragments de ihpARN de Os2AP. A titre de témoin positif, l'ADN isolé du plasmide Os2AP-RNAi a été digéré avec Ncol. Après électrophorèse dans un gel d'agarose à 0,8 %, l'ADN a été transféré à des membranes en Nylon Hybond-N+ (Southern 1975). L'hybridation avec la sonde a été réalisée selon les instructions du fabricant (Amersham). La sonde radioactive a été préparée par le procédé d'amorce aléatoire avec (a-32P)-dCTP. La sonde consistait en la région codante du gène Os2AP (fragment Spe1-NcoI de pOs2AP-RNAi, 210 nucléotides) .

RT-PCR Pour examiner les niveaux de transcription à différents stades de croissance et dans différents tissus, l'ARN total a été extrait de jeunes plantes (10 jours), de feuilles adultes (30 jours) et de racines (14 jours), et de panicules en fleurs de plantes Nipponbare et de plantes transgéniques et a été utilisé pour l'analyse par RT-PCR. Le locus d'arôme du gène Os2AP sur le chromosome 8 a été amplifié par PCR avec les amorces Os2AP-exon7.1 (U: 5'-TGCTCCTTTGTCATCACACC-3' (SEQ ID NO: 54) et L: 5'-TTTCCACCAAGTTCCAGTGA-3' (SEQ ID NO: 55)). Un homologue du gène Os2AP sur le chromosome 4 appelé aussi BADH (Os2AP-chr4; n . d'ordre Genbank AB001348) a été amplifié par PCR avec les amorces Os2APch4 ( U: 5'-TAGCTTCACATCCCCATGTG-3' (SEQ ID NO: 85) et L: 5'-GCACCTTCACATCTTGCTGT3'(SEQ ID NO: 86). A titre de témoin, le gène d'actine du riz (n . d'ordre Genbank: X16280) a été amplifié avec ActinU: 5'ACATCGCCCTGGACTATGAC-3' (SEQ ID NO: 87) et ActinL: 5'- TGCTGAGAGATGCCAAGA TG-3' (SEQ ID NO: 88).

PCR quantitative en temps réel Une PCR quantitative en temps réel a été réalisée en utilisant la chimie Taqman et le ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) selon les instructions du fabricant. Les quantités relatives ont été calculées comme le rapport du nombre de copies de Os2AP à celui de l'actine du riz. Une sonde Taqman a été conçue pour différencier entre les allèles aromatiques et les allèles non aromatiques du gène Os2AP.

Résultats: Quatre plantules positives pour l'hygromycine-GFP ont été régénérées. L'expression de GFP variait dans les plants de riz transgéniques. ToRNAi2 (10), la lignée ayant la meilleure expression de GFP, a la plus basse expression de Os2AP endogène (FIGURE 7B). L'analyse des teneurs en 2-acétyl-l.-pyrroline et l'évaluation sensorielle avec le procédé à KOH étaient bien corrélées. ToRNAi2 (10) contenait la plus grande quantité de 2-acétyl-l-pyrroline et avait les feuilles les plus aromatiques. ToRNAi5(20) et ToRNAi3(30), qui expriment de faibles quantités de la séquence interférente, accumulaient moins de 2-acétyl-1pyrroline et avaient des valeurs plus basses concernant les feuilles aromatiques (FIGURE 7B). L'analyse de ségrégation d'arôme des grains dans T1RNAi2 (10) confirmait ce résultat. De ce fait, la suppression de l'expression du gène Os2AP par interférence à ARN augmente l'accumulation de 2-acétyl-1-pyrroline dans les plants de riz. Ceci suggère que la suppression naturelle de l'expression du gène Os2AP par NMD dans le riz aromatique due à la délétion de 8 paires de bases est la cause directe de l'arôme des grains de riz.

EXEMPLE 3: Caractérisation des locus Os2AP/BADH du riz Os2AP est un homologue de BADH (bétaïne aldéhyde déshydrogénase) trouvée antérieurement sur le chromosome 4 (Nagamura et al., 1997). La demanderesse a caractérisé la séquence génomique du gène BADH sur le chromosome 4 et du gène Os2AP sur le chromosome 8 provenant des numéros d'ordre de séquences Genbank AB001348 et AP004463, respectivement. Selon les résultats d'annotation des gènes de RiceGAAS (Rice Genome Automated Annotation System, de Sakata et al., 2002), les gènes de structure de BADH et Os2AP comprennent 15 exons interrompus par 14 introns. Les cadres de lecture ouverts codent des protéines de 505 et 503 résidus d'aminoacides pour BADH et Os2AP, respectivement. Les deux protéines sont identiques à 77 % au niveau des aminoacides et partagent 88% à 99 % d'identité avec des protéines BADH d'autres plantes. De plus, ces deux gènes contiennent des séquences nucléotidiques codant le décapeptide Val- Thr-Leu-Glu-Leu-Gly-Gly-Lys-SerPro (SEQ ID NO: 96), qui est hautement conservé parmi les aldéhyde déshydrogénases générales (Weretilnyk et al. 1990). D'après l'analyse Pfam des séquences protéiques, BADH et Os2AP appartiennent l'une et l'autre à la famille des aldéhyde déshydrogénases. Les protéines de cette famille ont une fonction supposée dans la synthèse de la glycine bétaïne dans certaines espèces végétales. Cependant, dans les céréales comme le riz, le maïs et le blé, qui n'accumulent pas de glycine bétaïne, la fonction de ces protéines est inconnue. La demanderesse a constaté avec surprise que la pyrroline-5-carboxylate déshydrogénase (P5CDH), (n . d'ordre Genbank P30038) qui fonctionne dans le catabolisme de la proline, est incluse aussi dans cette famille, car la proline a été décrite comme étant le précurseur de la 2-acétyl-1- pyrroline. Il est possible que la fonction de Os2AP soit de catalyser la déshydrogénation d'autres aldéhydes que le bétaïne aldéhyde.

Expression du gène Os2AP et arôme du riz Pour identifier si les deux gènes Os2AP sont liés à la biosynthèse d'arôme, les niveaux d'expression de lignées isogéniques aromatiques et non aromatiques (dont les arrièreplans génomiques étaient identiques sauf concernant la région des gènes d'arôme) ont été analysés. A titre de résultat, la demanderesse a trouvé que BADH ne présentait pas d'expression différentielle entre les deux lignées isogéniques, tandis que Os2AP présentait toujours une suppression génique dans tous les tissus des lignées isogéniques aromatiques (FIGURE 3D). La demanderesse a étudié aussi l'expression des deux protéines dans des lignées isogéniques et Nipponbare et K105 (souche aromatique). L'expression du gène Os2AP était régulée négativement seulement dans les lignées isogéniques aromatiques et KDMLL105. Au contraire, la régulation négative de l'expression du gène Os2AP n'a pas été détectée dans les lignées isogéniques non aromatiques et le riz Nipponbare (souche non aromatique).

EXEMPLE 4: sélection assistée par marqueur Pour développer de nouveaux riz aromatiques par croisement conventionnel, on peut croiser un donneur riz aromatique et une variété receveuse plus productive. La descendance issue du croisement présentera une ségrégation pour l'arôme des grains parmi d'autres traits. Cette situation perturbe les producteurs et rend moins couronnée de succès la production conventionnelle en vue de meilleurs riz aromatiques. La découverte du gène d'arôme va devenir un nouveau paradigme pour les producteurs conventionnels. Il est possible de développer des marqueurs moléculaires spécifiques pour détecter le gène d'arôme de sorte que des milliers de plantes peuvent être criblées avec une très grande précision. La technologie des marqueurs d'ADN peut permettre aux producteurs de détecter l'allèle aromatique du gène Os2AP à un stade précoce avec une grande sensibilité. Ceci laisse aux producteurs d'avantage d'opportunités pour ajouter des traits préférés dans des plantes aromatiques à un stade ultérieur. La base moléculaire de l'arôme identifiée dans le riz peut éventuellement être trouvée dans d'autres céréales et ceci ouvrira des voies pour développer des marqueurs d'ADN pour d'autres céréales également.

EXEMPLE 5: analyse phylogénétique du gène Os2AP La biosynthèse de la proline et de la polyamine est une voie hautement conservée dans le règne végétal. La biosynthèse de la 2-acétyl-l-pyrroline proposée ici peut être un thème commun utilisé par d'autres plantes produisant de la 2-acétyllpyrroline. Pour illustrer ce point, les séquences de gènes 2AP ont été comparées au moyen de l'alignement de séquences multiples. L'arbre phylogénétique résultant montre que les gènes 2AP du riz, du blé et de l'orge peuvent avoir un ancêtre commun (FIGURE 9B). De ce fait, la biosynthèse de la 2-acétyl-1-pyrroline parmi les céréales peut partager un thème commun. Des expériences avec des orthologues du gène 2AP dans d'autres céréales doivent être réalisées dans le futur pour illustrer ce point.

Il est intéressant de remonter à l'origine du gène Os2AP. En examinant 95 variétés de landrace avec les amorces de PCR "Aromarker" la demanderesse a trouvé que l'allèle comportant la délétion de 8 paires de bases est corrélé exactement avec un arôme accru. La demanderesse a aussi séquencé l'exon 7 concernant la délétion de 8 paires de bases parmi des espèces sauvages incluant Oryza nivara et O. rufipogon (FIGURE 9A). La demanderesse a trouvé que la plupart des variétés aromatiques incluant Thai Jasmine, Basmati et Azucena comportent la délétion, et ont donc un ancêtre commun qui peut remonter à une époque ancienne. La demanderesse a identifié l'allèle aromatique dans le riz sauvage aromatique également. De ce fait, une mutation unique est apparue longtemps avant la culture par les humains pour donner naissance au riz aromatique que nous connaissons actuellement.

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Figure 1 Figure 2 189 F9 plants 189 plantes F9 THM contiguous map carte contigue THM 1116 F 12 plants 1116 plantes F 12 Genome annotation of THM genomic anotation sur le génôme de la séquence sequence génomique THM 177 F6 plants from the cross between 177 plantes F6 provenant du croisement THM and JHN entre THM et JHN Figure 3A Aromatic ISL ISL aromatique Non aromatique ISL ISL non aromatique DAP JAP (jour après pollinisation) Oryza sativa 2-acetyl-1-pyrroline 2-acétyl-16pyrroline de Oryza sativa 3- methyl crotonyl CoA carboxylase 3-méthyl crotonym CoA carboxylase Surface glycoprotein glycoprotéine de surface NBS/LRR disease resistance gene gène de résistance aux maladies NBSILRR disease resistance gene gène de résistance aux maladies hypothetical protein protéine hypothétique carbonic anhydrase anhydrase carbonique total RNA ARN total Figure 3B Aromatic ISL ISL aromatique Non aromatique ISL ISL non aromatique Actin Actine Stems tiges Roots racines Leaves feuilles Seeds: graines DAP JAP (jour après pollinisation) Figure 3C 2AP accumulation analysis analyse d'accumulation de 2AP 117x10F1 leaves feuilles 117x10F1 117x10F2seeds graines 117xlOF2 Figure 3D Nipponbare Nipponbare T16/10Os2APi T16/10Os2APi BADHch4 BADHch4 Actin Actine Plant plante Root racine Leaves feuilles Aromatic ISL ISL aromatique Non aromatique ISL ISL non aromatique Os2APch8 Os2APch8 Figure 4A L-glutamic acid acide L-glutamique Spontaneous spontané Figure 5B 8 bp deletion in exon 7 délétion de 8 pb dans l'exon 7 Figure 6A 2AP accumulation accumulation de 2AP Figure 7A CsMV 35S polyA polyA de CsMV 35S Hygromycin (R) Hygromycine (R) CsMV 35S promotor promoteur de CsMV 35S pCAMBIAl302 T-DNA fragment fragment d'ADN- T de p CAMBIA1302 Gene expression analysis by RT-PCR analyse d'expression génique par RT-PCR Genomic fragment from RNAi construct fragment génomique issu de la construction d'ARNi cDNA fragment and endogeneous gene fragment d'ADNc et gène endogène Figure 7B RNAi ARNi Transgene transgène Endogeneous gene gène endogène Strong aroma arôme fort Figure 8A The 8 bp indel PCR-based markers, les marqueurs indel 8 pb à base de PCR, Aromarker, of wild rice Aromarker, du riz sauvage Figure 9A Aroma arôme Non aroma pas d'arôme

Claims (23)

REVENDICATIONS

1. Plante de riz transgénique comprenant un niveau élevé du composé 2acétyl-1-pyrroline par rapport à son niveau dans une plante de type riz non transgénique témoin caractérisée en ce que le niveau dudit composé est augmenté dans ladite plante transgénique par réduction des niveaux d'ARNm ou de protéine codés par le gène de 2-acétyl-1-pyrroline dans ladite plante de type riz transgénique par rapport aux niveaux d'ARNm ou de protéine codés par le gène de 2-acétyl-1-pyrroline dans ladite plante de type riz non transgénique témoin.

2. Plante de riz transgénique selon la revendication 1 caractérisée en ce que les niveaux d'ARNm du gène de 2-acétyl-l-pyrroline sont réduits dans ladite plante transgénique par expression du gène de 2-acétyl-l-pyrroline ou d'une partie de celui-ci dans l'orientation antisens, ou par interférence à ARN.

3. Plante de riz transgénique selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit gène de 2-acétyl-1-pyrroline comprend la séquence représentée dans SEQ ID NO: 15 5.

4. Semence caractérisée en ce qu'elle provient de la plante transgénique selon la revendication 1.

5. Acide nucléique isolé codant une protéine de 2-acétyl-1-pyrroline végétale caractérisé en ce qu'il s'hybride à la séquence d'acide nucléique représentée dans SEQ ID NO: 2 ou son complément dans des conditions d'hybridation qui incluent au moins un lavage dans 0,1 X SSC et 0,1 % SDS à 60-65 C pendant trente minutes.

6. Acide nucléique isolé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il est identique à plus de 70 %, plus de 80 %, plus de 90 % ou plus de 95 % à la séquence d'acide nucléique représentée dans SEQ ID NO: 2.

7. Acide nucléique isolé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il est sensiblement identique à la séquence représentée dans SEQ ID NO: 2.

8. Acide nucléique isolé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il code un polypeptide qui est sensiblement identique à la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID NO: 3.

9. Acide nucléique isolé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il code un polypeptide qui est identique à au moins 70 %, au moins 80 %, au moins 90 %, au moins 95 % ou à plus de 95 % à la séquence d'aminoacides représentée dans SEQ ID NO:3.

10. Acide nucléique isolé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il est lié de manière fonctionnelle à un promoteur.

11. Acide nucléique isolé selon la revendication 10 caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur constitutif, développemental ou inductible.

12. Acide nucléique isolé selon la revendication 10 caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi un promoteur du virus de la tacheture jaune de la commélyne, un promoteur du virus badna de la canne à sucre, un promoteur du virus bacilliforme tungro du riz, un élément viral des rayures du maïs, un promoteur du virus du nanisme du blé, un promoteur du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), un promoteur de nopaline synthase (NOS), un promoteur d'octopine synthase, un promoteur du virus de la mosaïque de la ficaire (FMV) et un promoteur d'actine du riz.

13. Cellule caractérisée en ce qu'elle comprend l'acide nucléique isolé selon la revendication 5.

14. Plante non naturelle comprenant un niveau accru du composé 2-acétyllpyrroline par rapport à son niveau dans une plante naturelle témoin caractérisée en ce que le niveau du composé 2-acétyl-1-pyrroline est augmenté par réduction de l'expression d'un ou plusieurs gènes de 2acétyl-1-pyrroline, réduction des niveaux d'ARNm produits par ledit ou lesdits gènes de 2-acétyl-1-pyrroline et/ou réduction de l'activité ou de la quantité d'une ou plusieurs protéines 2-acétyl-1-pyrroline par rapport à la plante témoin.

15. Plante non naturelle selon la revendication 14 caractérisée en ce que l'expression du gène de 2-acétyl-1-pyrroline est réduite par expression du gène de 2-acétyl-l-pyrroline ou d'une partie de celui-ci dans l'orientation antisens, ou par interférence à ARN.

16. Plante non naturelle selon la revendication 14 caractérisée en ce que 30 l'expression du gène de 2-acétyl-1-pyrroline est réduite par mutagenèse.

17. Plante non naturelle selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe consistant en le riz, le blé, l'orge, le seigle, le cocotier, le sorgho et l'avoine.

18. Semence caractérisée en ce qu'elle est produite par la plante non naturelle selon la revendication 14.

19. Procédé de détection de la présence d'un allèle aromatique d'un gène de 2-acétyl-1-pyrroline dans une plante ou une partie d'une plante caractérisé en ce qu'il comprend la détection dans le gène de 2-acétyl-1pyrroline d'une mutation qui réduit la quantité, la fonction ou l'activité de la protéine 2-acétyl-1-pyrroline.

20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que la mutation est la délétion de huit paires de bases trouvée dans l'allèle aromatique de Os2AP.

21. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que le procédé de détection de la mutation comprend la PCR et/ou l'utilisation d'une puce à ADN ( microarray ).

22. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que le procédé de détection de la mutation comprend une hybridation ou un séquençage.

23. Procédé selon la revendication 22 caractérisé en ce que le procédé de détection de la mutation comprend la détection des niveaux, de la structure ou de l'activité de la protéine 2-acétyl-1-pyrroline.