FR2816320A1 - Utilisation d'un acide nucleique pour conferer a une plante une resistance a l'agression par un pathogene, et plante transformee avec un tel acide nucleique - Google Patents
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Abstract
Utilisation d'un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 chez une plante pour induire ou augmenter, chez cette plante, une résistance à l'agression par un pathogène.
Description
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Domaine de l'invention
La présente invention se rapporte au domaine de l'induction ou de l'augmentation de la résistance des plantes à l'agression par un pathogène.
La présente invention se rapporte au domaine de l'induction ou de l'augmentation de la résistance des plantes à l'agression par un pathogène.
Etat de la technique
La résistance des plantes aux maladies provoquées par des organismes phytopathogènes est souvent induite par la reconnaissance spécifique d'un pathogène donné. Cette reconnaissance du pathogène conduit à une induction rapide des mécanismes de défense de la plante qui limitent la multiplication et la propagation du pathogène dans les différents tissus. Parmi ces mécanismes, la réponse hypersensible constitue une forme de mort cellulaire programmée induite rapidement dans les cellules de la plante qui sont directement en contact avec le pathogène. La réponse hypersensible (HR) joue probablement un rôle essentiel dans le confinement du pathogène au sein des cellules initialement exposées à ce dernier, conférant à cette plante une résistance audit pathogène.
La résistance des plantes aux maladies provoquées par des organismes phytopathogènes est souvent induite par la reconnaissance spécifique d'un pathogène donné. Cette reconnaissance du pathogène conduit à une induction rapide des mécanismes de défense de la plante qui limitent la multiplication et la propagation du pathogène dans les différents tissus. Parmi ces mécanismes, la réponse hypersensible constitue une forme de mort cellulaire programmée induite rapidement dans les cellules de la plante qui sont directement en contact avec le pathogène. La réponse hypersensible (HR) joue probablement un rôle essentiel dans le confinement du pathogène au sein des cellules initialement exposées à ce dernier, conférant à cette plante une résistance audit pathogène.
Lorsqu'un agent pathogène possédant un gène d'avirulence (avr) déterminé entre en contact avec une plante possédant le gène de résistance correspondant, une mort cellulaire rapide est localisée au site d'inoculation est initiée, ce qui constitue la réponse hypersensible qui limite la progression du pathogène.
Lors de l'infection, la reconnaissance de l'agent pathogène se réalise dans le cas de micro-organismes pathogènes bactériens, le plus souvent dans le cytoplasme où les facteurs d'avirulence sont injectés via un système de sécrétion codé par le cluster ( hypersensibitity and pathogenicity ).
Les protéines de résistance présentent entre elles des similarités de structure et sont susceptibles d'intervenir également dans la voie de signalisation de la HR. Les analyses de mutation chez Arabidopsis ont
permis d'identifier des gènes nécessaires à la résistance associée au gène de résistance (Glazebrook et al. 1997). Les gènes EDS1 et NDR1 de Arabidopsis codent pour des composants essentiels de la résistance spécifique de race (Century et al., 1995 ; Falk et al., 1999).
permis d'identifier des gènes nécessaires à la résistance associée au gène de résistance (Glazebrook et al. 1997). Les gènes EDS1 et NDR1 de Arabidopsis codent pour des composants essentiels de la résistance spécifique de race (Century et al., 1995 ; Falk et al., 1999).
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On a démontré récemment que ces deux gènes définissent deux voies de signalisation différentes dépendantes du type structural de la protéine de résistance (AARTS et al., 1998).
Il existe un besoin dans l'état de la technique d'identifier de nouveaux gènes capables d'induire un phénotype de résistance à un pathogène chez une plante, notamment chez une plante de grande culture d'intérêt agronomique, afin d'éviter, ou à tout le moins de réduire, les traitements des cultures par des pesticides chimiques dont il est démontré qu'ils sont défavorables à l'environnement.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
L'invention a pour objet l'utilisation d'un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN 11 chez une plante pour induire ou augmenter, chez cette plante, une résistance à l'agression par un pathogène.
L'invention a pour objet l'utilisation d'un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN 11 chez une plante pour induire ou augmenter, chez cette plante, une résistance à l'agression par un pathogène.
De préférence, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN 11 comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide AKIN 11 choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID ? 2 et leurs séquences homologues résultant de la dégénérescence du code génétique.
Avantageusement, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AK ! N 11 comprend un polynucléotide régulant l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide AKIN 11 chez la plante.
Selon un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN 11 chez une plante est inséré dans un vecteur d'expression.
L'invention est également relative à des procédés d'obtention d'une plante transformée avec un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN 11 chez cette plante.
L'invention a également trait à une plante résistant à un pathogène de végétal, caractérisée en ce qu'elle a été transformée avec un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN 11 chez cette plante.
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DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Il a été montré selon l'invention que le gène codant pour la protéine AKIN11 permettait d'induire une résistance à un pathogène donné chez une plante initialement sensible à l'agression par ledit pathogène.
Il a été montré selon l'invention que le gène codant pour la protéine AKIN11 permettait d'induire une résistance à un pathogène donné chez une plante initialement sensible à l'agression par ledit pathogène.
Le gène akin 11 a été isolé initialement par criblage hétérologue d'une banque d'ADNc à l'aide du gène SENF1 de levure. Il avait été montré
que le produit du gène akin 11 interagissait avec la protéine PRL1, qui est un régulateur pléiotropique des gènes induits en réponse à des signaux hormonaux ou sucre-dépendants (NEMETH et al. 1998) ; BHALEARO et al., (1999) ont montré que le gène akin11 était potentiellement impliqué dans le métabolisme des sucres chez la plante, puisque la protéine AKIN 11 interagit avec la protéine PRL1 de levure qui est impliquée dans la régulation du métabolisme du sucre en réponse à un signal régulateur du glucose chez ce micro-organisme.
que le produit du gène akin 11 interagissait avec la protéine PRL1, qui est un régulateur pléiotropique des gènes induits en réponse à des signaux hormonaux ou sucre-dépendants (NEMETH et al. 1998) ; BHALEARO et al., (1999) ont montré que le gène akin11 était potentiellement impliqué dans le métabolisme des sucres chez la plante, puisque la protéine AKIN 11 interagit avec la protéine PRL1 de levure qui est impliquée dans la régulation du métabolisme du sucre en réponse à un signal régulateur du glucose chez ce micro-organisme.
Il a été montré pour la première fois selon l'invention que le gène akin11 était capable d'induire chez une plante une résistance à l'agression par un pathogène.
Sur la base d'une opération de mutagenèse chimique chez Arabidopsis thaliana, le demandeur a caractérisé un mutant, le mutant hxc- 2, qui présente un phénotype sensible en réponse à l'infection par la souche avirulente de Xanthomonas campestris pv. campestris souche 147.
Le demandeur a également montré, par l'utilisation de marqueurs biochimiques et moléculaires, que la mutation affectait de manière pleiotropique les réponses de défense de la plante. De plus, une première analyse génétique détaillée réalisée par le demandeur a montré que la mutation est héritée comme un caractère monogénique récessif, le gène correspondant étant localisé sur le chromosome III, entre les marqueurs mi 413 et atpox, dans une région du gène d'environ 2,1 cM, ce qui correspond approximativement à une région du chromosome longue de 1 à 2 mégabases.
L'absence d'événement de recombinaison dans cette région de 2,1 cM du chromosome III ne permettait pas d'envisager d'isoler le gène par une approche classique de clonage positionnel. Le demandeur a en conséquence créé de nouveaux marqueurs physiques dans cette région,
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puis a construit une carte physique précise du locus HXC2 afin de bâtir un contigue de clones BACs entre les marqueurs mi413 et le nouveau marqueur MXO21-LE avant de construire une carte de haute résolution couvrant le locus HXC2, puis d'analyser les séquences nucléotidiques comprises dans un intervalle défini entre le marqueur mi413 et le nouveau marqueur MXE2LE.
Il est montré selon l'invention que l'intervalle défini par les marqueurs M1413 et le nouveau marqueur MXE2LE comprend le gène amin11, qui est muté dans les plantes hxc2 sensibles à un pathogène.
Il a de plus été montré selon l'invention que la complémentation du mutant hxc2 avec le gène akin11 non muté permet de restaurer, chez la plante ainsi complémentée, le phénotype de résistance à l'agression par un pathogène.
Un premier objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN1 chez une plante pour induire ou augmenter, chez cette plante, une résistance à l'agression par un pathogène.
Par polypeptide AKIN1 1 , non entend un polypeptide comprenant la séquence en acides aminés SEQ ID ? 3 du listage de séquences.
Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al., (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES et HIGGINS (1985), et AUSUBEL et al. (1989).
Aux fins de la présente description, l'expression séquence
nucléotidique peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression séquence nucléotidique englobe le matériel génétique lui-même qui n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
nucléotidique peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression séquence nucléotidique englobe le matériel génétique lui-même qui n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes acide nucléique , polynucléotide , oligonucléotide ou encore séquence nucléotidique englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme duplex.
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Le terme nucléotide désigne à la fois des nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04064.
Un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKINH consiste en un acide nucléique dont la séquence comprend la totalité des codons nécessaires à la traduction de cet acide nucléique, ou d'un acide nucléique qui en est dérivé, vers le polypeptide AKIN11 de séquence SEQ ID D ? 3. Ainsi, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 englobe un acide nucléique comprenant les onze
exons du gène akin11 qui est décrit notamment dans la base de données GENBANK sous le n d'accès X99. 279, ou encore par la séquence SEQ ID ? 2 du listage de séquences. La position respective du premier et du dernier nucléotide de chacun des exons du gène akin11, dans la séquence SEQ ID N'2, est respectivement : Exon 1 (14-97) ; Exon 2 (393-587) ; Exon 3 (717-901) ; Exon 4 (996-1180) ; Exon 5 (1276-1406) ; Exon 6 (1504-1688) ; Exon 7 (1764-1854) ; Exon 8 (1940-2023) ; Exon 9 (2107-2246) ; Exon 10 (2383-2613) et Exon 11 (2899-3203). La base A du codon ATG d'initiation de la traduction est le nucléotide en position 395 de la séquence SEQ ID ? 2. La base T du codon TGA d'arrêt de la traduction est le nucléotide en position 3005 de la séquence SEQ ID ? 2.
exons du gène akin11 qui est décrit notamment dans la base de données GENBANK sous le n d'accès X99. 279, ou encore par la séquence SEQ ID ? 2 du listage de séquences. La position respective du premier et du dernier nucléotide de chacun des exons du gène akin11, dans la séquence SEQ ID N'2, est respectivement : Exon 1 (14-97) ; Exon 2 (393-587) ; Exon 3 (717-901) ; Exon 4 (996-1180) ; Exon 5 (1276-1406) ; Exon 6 (1504-1688) ; Exon 7 (1764-1854) ; Exon 8 (1940-2023) ; Exon 9 (2107-2246) ; Exon 10 (2383-2613) et Exon 11 (2899-3203). La base A du codon ATG d'initiation de la traduction est le nucléotide en position 395 de la séquence SEQ ID ? 2. La base T du codon TGA d'arrêt de la traduction est le nucléotide en position 3005 de la séquence SEQ ID ? 2.
Un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 englobe aussi les acides nucléiques comprenant la région codant le polypeptide AKIN11 qui se présentent sous la forme d'un ARN ou d'un ADNc, la région codante de l'ADNc codant pour le polypeptide AKIN11 étant incluse dans la séquence SEQ ID N 1 du listage de séquences.
Pour obtenir la séquence d'ADNc du gène amin11, l'homme du métier peut réaliser une amplification par RT-PCR sur les ARNs messagers extraits des cellules de Arabidopsis thaliana à l'aide du couple d'amorces AKIN 68 (SEQ ID Nu15) et AKIN1648 (SEQ ID Nu16). Une séquence d'ADNc comprenant la région codant le polypeptide AKIN1 consiste en la séquence SEQ ID D ? 1. La base A du codon ATG d'initiation de la traduction est le nucléotide en position 1 de la séquence SEQ ID ? 1. La
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base T du codon TGA d'arrêt de la traduction est le nucléotide en position 1537 de la séquence SEQ ID N'l.
Pour obtenir la séquence nucléotidique génomique du gène akinll, l'homme du métier peut réaliser une réaction d'amplification à l'aide du couple d'amorces AKINF (SEQ ID N 13) etAKINR (SEQ ID N 14), à partir d'ADN génomique de Arabidopsis thaliana, par exemple à partir d'ADN génomique contenu dans une banque de vecteurs BACs, ou de vecteurs YACs contenant des inserts d'ADN génomique de cette plante.
De préférence, l'acide nucléique permettant la synthèse du
polypeptide AKIN 11 comprend un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 et SEQ ID N02, ainsi que leurs séquences homologues résultant de la dégénérescence du code génétique.
polypeptide AKIN 11 comprend un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 et SEQ ID N02, ainsi que leurs séquences homologues résultant de la dégénérescence du code génétique.
Par région codante du polypeptide AKIN11, on entend une séquence qui est transcrite et traduite dans le polypeptide AKIN11 dans une cellule, in vitro ou in vivo, lorsque cette séquence est placée sous le contrôle de séquence (s) régulatrice (s) appropriée (s). Les extrémités de la région codante sont délimitées, du côté 5'de cette région, par le codon d'initiation de la traduction et, du côté 3'de cette région, par le codon d'arrêt de la traduction.
L'objectif poursuivi par l'invention est : - soit d'induire chez une plante la résistance à un pathogène auquel elle est naturellement sensible ; - soit d'augmenter chez une plante sa résistance à une agression par un pathogène.
En conséquence, on s'assurera que l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 est exprimé de manière optimale et/ou contrôlée chez la plante pour laquelle une résistance à l'agression par un pathogène est recherchée.
Dans un premier mode de réalisation préféré d'un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN1 selon l'invention, ledit acide nucléique comprend, outre la région codante nécessaire à la synthèse du polypeptide, un polynucléotide régulateur de l'expression de la séquence nucléotidique codant pour AKIN11 chez la plante.
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Au sens de l'invention, les signaux régulant l'expression de la région codant le polypeptide AKIN11 englobent des séquences contrôlant la transcription ou la traduction, tels que des promoteurs, des séquences activatrices ( enhancers ), des séquences terminateurs et, le cas échéant, des signaux de polyadénylation.
Une séquence régulatrice du type promoteur , au sens de l'invention, est une région régulatrice reconnue par une ARN polymérase dans la cellule capable d'initier la transcription de la région codante du polypeptide AKIN11. De préférence, une séquence promoteur selon l'invention comprend le site d'initiation de la transcription ainsi que les domaines responsables de la fixation de l'ARN polymérase.
La région codante du polypeptide AKIN11 est placée sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur dans une cellule de plante, lorsque l'ARN polymérase transcrit cette région codante en ARN messager,
qui peut être ultérieurement épissé lorsque la région codante est d'origine génomique, puis traduite dans la protéine AKIN11.
qui peut être ultérieurement épissé lorsque la région codante est d'origine génomique, puis traduite dans la protéine AKIN11.
Selon les cas, on recherche une expression constitutive du polypeptide AKIN11 chez la plante dans laquelle une induction ou une augmentation de la résistance à l'agression contre un pathogène est recherchée, ou une expression inductible de ce polypeptide en réponse à des signaux externes, par exemple un stress biotique, soit encore une expression du polypeptide AKIN1 qui puisse être limitée à un ou plusieurs tissus de la plante, notamment dans le cas où le pathogène à laquelle la plante est naturellement sensible attaque spécifiquement seulement certains de ses tissus ou organes.
Selon un autre aspect, on recherche la localisation du polypeptide AKIN11 dans un compartiment donné de la cellule, telle que les
chloroplastes, les mitochondries, le réticulum endoplasmique, les vacuoles ou la paroi cellulaire.
chloroplastes, les mitochondries, le réticulum endoplasmique, les vacuoles ou la paroi cellulaire.
Dans ce mode de réalisation particulier, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 code pour un polypeptide de fusion constitué du polypeptide AKIN11 fusionné avec un peptide signal permettant sa localisation dans un compartiment cellulaire donné ou sa sécrétion dans la paroi cellulaire.
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Par pathogène on entend un pathogène d'origine bactérienne, fongique ou virale ou encore un nématode. Parmi les pathogènes contre lesquels une résistance est recherchée selon l'invention, on peut citer, à titre non limitatif, Xanthomonas Erwinia, fusarium, Sclerotinia, le mildiou, le Pvx ( Potatoe virus x ), le Pvy ( Potatoe virus y ), le cmc dz Cucumber
mosaïc virus ) ou le Tylcv ( Tomatoe yellow leaf curl virus ).
mosaïc virus ) ou le Tylcv ( Tomatoe yellow leaf curl virus ).
De manière tout à fait préférée, un pathogène contre lequel la résistance d'une plante est induite ou augmentée selon l'invention est un pathogène"nécrotrophe, qui se multiple majoritairement dans l'espace intercellulaire et pour lequel le développement d'une mort cellulaire précoce est favorable à sa propagation dans l'ensemble des tissus de la feuille. De tels pathogènes nécrotrophes sont principalement bactériens et sont souvent rencontrés dans l'Europe du Nord. La souche de Xanthomonas campestris constitue un tel pathogène nécrotrophe. D'autres pathogènes contre lesquels la résistance d'une plante est induite ou augmentée selon l'invention sont, à titre îllustratif mais non limitatif, les souches de Peronospora parasitica et Pseudomonas syringae.
Selon un premier mode de réalisation préféré, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 comprend, outre la région codante du polypeptide AKIN11, également un polynucléotide régulant
l'expression de cette région codante chez la plante. Selon un second mode de réalisation préféré de l'invention, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 est inséré dans un vecteur, ledit vecteur comprenant un ou plusieurs des signaux nécessaires au contrôle de l'expression de la région codante pour le polypeptide AKIN11 chez la plante.
l'expression de cette région codante chez la plante. Selon un second mode de réalisation préféré de l'invention, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 est inséré dans un vecteur, ledit vecteur comprenant un ou plusieurs des signaux nécessaires au contrôle de l'expression de la région codante pour le polypeptide AKIN11 chez la plante.
PROMOTEURS PREFERES SELON l'INVENTION De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989) ou encore aux techniques décrites par FULLER et al. (1996).
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Promoteurs constitutifs
Des promoteurs pour l'expression d'un acide nucléique codant pour le polypeptide AKIN11 dans les plantes sont par exemple : - le promoteur CaMV 35S du virus de ! a mosaïque du chou-fleur, Mc ELROY et al. (1991), - le promoteur 35S, ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (pd35S) du CaMV, décrits dans l'article de KAY et al.. (1987) ; - le promoteur actine du riz suivi de l'intron actine de riz (PARLAR) contenu dans le plasmide pAct-1-F4 décrit par McELROY et al.
(1991) ; -le promoteur du gène de l'actine 1 du riz (Mc ELROY et al., (1990) - ou encore le promoteur du gène AdH du maïs (DENNIS et al., 1984) ou le promoteur de l'ubiquitine du maïs (CHRISTENSEN et al., 1996) ; -le promoteur pUbi1 du gène codant pour l'ubiquitine 1 de maïs (CHRISTENSEN et al., (1992) - des promoteurs chimériques comprenant des séquences activatrices ("enhancer"), tels que le promoteur 35S décrit par HIGGINS et al. (1991).
D'autres promoteurs utiles pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans les plantes sont décrits notamment dans les brevets n US 5,750, 866 et US 5,633, 363, l'ensemble des documents et articles précités constituant des références sur lesquelles l'homme du métier pourra se fonder pour construire des vecteurs recombinants selon l'invention.
Promoteurs inductibles
Le cas échéant, la séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention peut être une séquence régulatrice inductible par un métabolite particulier, tel que : - une séquence régulatrice inductible par les glucocorticoïdes telle que décrite par AOYMA et al. (1997) ou telle que décrit par McNELLYS et al. (1998) ;
Le cas échéant, la séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention peut être une séquence régulatrice inductible par un métabolite particulier, tel que : - une séquence régulatrice inductible par les glucocorticoïdes telle que décrite par AOYMA et al. (1997) ou telle que décrit par McNELLYS et al. (1998) ;
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- une séquence régulatrice inductible par l'éthanol, telle que celle décrite par SALTER et al. (1998) ou encore telle que décrite par KADDICK et al ; (1998) ;
- une séquence régulatrice inductible par la tétracycline telle que celle commercialisée par la Société CLONTECH.
- une séquence régulatrice inductible par la tétracycline telle que celle commercialisée par la Société CLONTECH.
- une séquence de promoteur inductible par un pathogène ou par un métabolite produit par un pathogène.
Promoteurs spécifiques de tissus
La séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour le polypeptide AKIN11 peut aussi diriger la synthèse de ce polypeptide spécifiquement dans certains tissus, comme la graine, la feuille ou la racine. Il peut s'agir notamment des séquences régulatrices suivantes : - un promoteur tissu spécifique comme le promoteur HMWG de blé ou d'orge, ou encore le promoteur pCRU du gène de la cruciférine de radis, qui permettent tous trois une expression de la protéine d'intérêt dans les graines (ROBERTS et al. (1989) ; ANDERSON O. D. et al. (1989) ; DEPIGNY-THIS et al. (1992) ; - les promoteurs pGEA1 et pGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEA1 et
GEA6 respectivement d'Arabidopsis thaliana (GAUBIER et al., (1993) et permettant une expression spécifique dans les graines ; - le promoteur du gène de zéine de maïs (pzéine) contenu dans le plasmide p63, et permettant l'expression dans l'albumen des semences de maïs (REINA et al., 1990) ; -des promoteurs spécifiques de régions ou de tissus particuliers des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines (DATLA, R. et al., 1997), notamment les promoteurs de la napine
(EP 255 378), de la phaseoline, de la glutenine, de l'héliantinine (WO 92/17580), de l'albumine (WO 98/45460), de l'oélosine (WO 98/45461), de l'ATS1 ou de l'ATS3 (PCT/US 98/06978, déposée le 20 Octobre 1998 ; - promoteurs spécifiques des tissus foliaires ou des racines.
La séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour le polypeptide AKIN11 peut aussi diriger la synthèse de ce polypeptide spécifiquement dans certains tissus, comme la graine, la feuille ou la racine. Il peut s'agir notamment des séquences régulatrices suivantes : - un promoteur tissu spécifique comme le promoteur HMWG de blé ou d'orge, ou encore le promoteur pCRU du gène de la cruciférine de radis, qui permettent tous trois une expression de la protéine d'intérêt dans les graines (ROBERTS et al. (1989) ; ANDERSON O. D. et al. (1989) ; DEPIGNY-THIS et al. (1992) ; - les promoteurs pGEA1 et pGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEA1 et
GEA6 respectivement d'Arabidopsis thaliana (GAUBIER et al., (1993) et permettant une expression spécifique dans les graines ; - le promoteur du gène de zéine de maïs (pzéine) contenu dans le plasmide p63, et permettant l'expression dans l'albumen des semences de maïs (REINA et al., 1990) ; -des promoteurs spécifiques de régions ou de tissus particuliers des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines (DATLA, R. et al., 1997), notamment les promoteurs de la napine
(EP 255 378), de la phaseoline, de la glutenine, de l'héliantinine (WO 92/17580), de l'albumine (WO 98/45460), de l'oélosine (WO 98/45461), de l'ATS1 ou de l'ATS3 (PCT/US 98/06978, déposée le 20 Octobre 1998 ; - promoteurs spécifiques des tissus foliaires ou des racines.
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Avantageusement, l'homme du métier pourra utiliser le promoteur spécifique des tissus foliaires inductible par la lumière décrit par Terzaghi et al. (1995) ou encore le promoteur spécifique des racines décrit par Elmayan et al. (1995).
AUTRES SEQUENCES CONTENANT DES SIGNAUX REGULATEURS
De manière avantageuse, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 peut aussi contenir une ou plusieurs autres séquences contenant des signaux régulateurs de l'expression de la région codant AKIN11, ou alternativement être placé sous le contrôle de telles séquences régulatrices.
De manière avantageuse, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 peut aussi contenir une ou plusieurs autres séquences contenant des signaux régulateurs de l'expression de la région codant AKIN11, ou alternativement être placé sous le contrôle de telles séquences régulatrices.
Séquences"/eader"
Les autres séquences contenant des signaux régulateurs englobent des séquences 5'non traduites dites"leaders". De telles séquences peuvent augmenter la traduction de l'ARNm codant AKIN11. Parmi cellesci, on peut citer, à titre illustratif mais non limitatif : - le leader EMCV (EncephaloMyoCarditis VIRUS 5'non coding region) (ELROY-STEIN et ai., 1989) ; - le leader TEV (Tobacco Etch Virus) (CARRINGTON AND FREED, 1990) ; - le leader du gène BiP codant pour la protéine de liaison à la chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine (MACEJACK et al., 1991) ; - le leader AMV RNA 4 provenant de l'ARNm de la protéine du
virus de la mosaïque de la luzerne (JOBLING et al. 1987) ; - le leader du virus de la mosaïque du tabac (GALLIE et al., 1989).
Les autres séquences contenant des signaux régulateurs englobent des séquences 5'non traduites dites"leaders". De telles séquences peuvent augmenter la traduction de l'ARNm codant AKIN11. Parmi cellesci, on peut citer, à titre illustratif mais non limitatif : - le leader EMCV (EncephaloMyoCarditis VIRUS 5'non coding region) (ELROY-STEIN et ai., 1989) ; - le leader TEV (Tobacco Etch Virus) (CARRINGTON AND FREED, 1990) ; - le leader du gène BiP codant pour la protéine de liaison à la chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine (MACEJACK et al., 1991) ; - le leader AMV RNA 4 provenant de l'ARNm de la protéine du
virus de la mosaïque de la luzerne (JOBLING et al. 1987) ; - le leader du virus de la mosaïque du tabac (GALLIE et al., 1989).
Séquences"terminateur"
L'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11, ou le vecteur dans lequel est inséré cet acide nucléique peut aussi comprendre des séquences dites"terminateurs".
L'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11, ou le vecteur dans lequel est inséré cet acide nucléique peut aussi comprendre des séquences dites"terminateurs".
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Parmi les terminateurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut citer, à titre illustratif mais non limitatif : - le polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de FRANCK et al. (1980) ; - le terminateur nos correspondant à la région 3'non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens (DEPICKER et al., 1992).
- le terminateur du gène histone (EP 0 633 317).
Séquences codant un peptide signal
L'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11, ou le vecteur dans lequel est inséré cet acide nucléique peut aussi comprendre des séquences de type peptide signal vacuolaire ou apoplastique lorsqu'elles ne sont pas déjà présentes dans la séquence du gène d'intérêt, pour amener la protéine codée par le gène hétérologue dans des compartiments particuliers des cellules de plante.
L'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11, ou le vecteur dans lequel est inséré cet acide nucléique peut aussi comprendre des séquences de type peptide signal vacuolaire ou apoplastique lorsqu'elles ne sont pas déjà présentes dans la séquence du gène d'intérêt, pour amener la protéine codée par le gène hétérologue dans des compartiments particuliers des cellules de plante.
De préférence, le peptide signal permet la localisation du polypeptide AKIN11 dans les parois de la plante, dans la paroi cellulaire, dans les tissus conducteurs comme le phloème, dans le reticulum endoplasmique, dans les chloroplases ou dans les mitochondries. Pour l'addition de séquences codant pour de tels peptides signal, l'homme du métier pourra avantageusement se référer aux documents suivants : Keegstra et alo. (1995), Zoubenko et al. (1994), Jones et al. (1993), Nhakamura et al. (1993), Hemon et al. (1990), Yang et al. (14990), Thoma et al. (1994) ou la demande PCT publiée sous le n WO 88/02402.
Séquences contenant un ou plusieurs introns hétérologues.
Lorsqu'on voudra exprimer la séquence codant pour le polypeptide AKIN11 dans une plante d'une autre espèce que les Brassica, on utilisera en outre une séquence nucléotidique dérivée d'un intron d'un gène de l'espèce dans laquelle l'expression de akin11 est recherchée.
De préférence, la séquence nucléotidique intronique hétérologue sera placée du côté 5'de la séquence codante.
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Selon un autre mode de réalisation, on remplacera une ou plusieurs des séquences naturelles des introns du gène amin11 par une telle séquence intronique hétérologue spécifique d'espèce ou spécifique d'une dicotylédone ou d'une monocotylédone.
A titre illustratif, mais non limitatif, on utilisera la séquence intronique du gène de l'Adh (Alcool déhydrogénase) du maïs.
Un acide nucléique comprenant une région codante pour le polypeptide AKIN11 et un ou plusieurs des signaux de régulation tels que définis ci-dessus constitue une cassette d'expression , une telle cassette d'expression constituant un objet de la présente invention. Un mode de réalisation particulier d'une cassette d'expression selon l'invention est une cassette comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide de fusion constitué du polypeptide AKIN11 fusionné avec un peptide signal.
L'invention concerne encore un polypeptide de fusion constitué du polypeptide AKIN11 fusionné avec un peptide signal permettant sa localisation ciblée dans un compartiment déterminé de la cellule végétale.
VECTEURS D'EXPRESSION PREFERES SELON L'INVENTION
Comme indiqué précédemment, un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 peut être inséré dans un vecteur approprié.
Comme indiqué précédemment, un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 peut être inséré dans un vecteur approprié.
Par"vecteur"au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme simple brin ou double brin.
Un vecteur recombinant selon l'invention est de préférence un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration.
Il peut s'agir notamment d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale.
Dans tous les cas, l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 est placé sous le contrôle d'une ou plusieurs séquences contenant des signaux de régulation de son expression dans la plante considérée, afin d'induire ou d'augmenter la résistance de cette
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plante à l'agression par un pathogène,. soit que les signaux de régulation soient tous contenus dans l'acide nucléique codant AKIN11, soit que l'un, plusieurs d'entre eux, ou encore tous les signaux de régulation soient contenus dans le vecteur récipient dans lequel l'acide nucléique codant AKIN11 a été inséré.
Un vecteur recombinant selon l'invention comprend avantageusement des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention peuvent inclure une ou plusieurs origines de réplication fonctionnelle chez les plantes dans lesquelles leur expression est recherchée, ainsi que, le cas échéant, des séquences nucléotidiques marqueurs de sélection.
Les vecteurs recombinants selon l'invention peuvent aussi inclure un ou plusieurs des signaux de régulation de l'expression tels que définis ci-dessus dans la description.
Selon un aspect avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention est un vecteur intégratif permettant l'insertion de multiples copies fonctionnelles de l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 dans le génome d'une plante, dont l'induction ou l'augmentation de la résistance à l'agression par un pathogène est recherchée.
Préférentiellement, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquence d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants : - vecteur pBIN19 (BEVAN et al.), commercialisé par la Société CLONTECH (Palo Alto, Californie, USA) ; - vecteur pBI 101 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ; - vecteur pBI121 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ; - vecteur pEGFP ; Yang et al. (1996), commercialisé par la Société
CLONTECH ; - vecteur pCAMBIA 1302 (HAJDUKIIEWICZ et al., 1994)
CLONTECH ; - vecteur pCAMBIA 1302 (HAJDUKIIEWICZ et al., 1994)
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PLANTES TRANSFORMEES PAR UN ACIDE NUCLEIQUE PERMETTANT LA SYNTHESE DU POLYPEPTIDE AKIN11 ET PROCEDES POUR LEUR OBTENTION
L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées par un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 tel que défini dans la présente description ou encore par un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique.
L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées par un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 tel que défini dans la présente description ou encore par un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique.
L'invention a encore pour objet une plante transformée comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11, tel que défini dans la présente description.
Un autre objet de l'invention consiste en une plante résistante à un pathogène, caractérisée en ce qu'elle a été transformée avec un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN1 chez cette plante, ou par un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique.
Parmi les plantes susceptibles d'être transformées selon l'invention, on peut citer à titre d'exemples des cellules de plantes de grandes cultures (maïs, blé, colza, tournesol, pois, soja, orge) ou des plantes potagères des fleurs ou des arbres fruitiers ou encore la vigne.
Parmi les plantes potagères, on peut citer, à titre non limitatif, les
cucurbitacées, les solanacées, les crucifères, les légumineuses et notamment la tomate, le melon, le poivron, la courgette, le potiron, le concombre, l'aubergine, la pomme de terre, le piment, la carotte ou la laitue.
cucurbitacées, les solanacées, les crucifères, les légumineuses et notamment la tomate, le melon, le poivron, la courgette, le potiron, le concombre, l'aubergine, la pomme de terre, le piment, la carotte ou la laitue.
Parmi les arbres fruitiers, on peut citer, à titre non limitatif, le pommier et l'abricotier.
Préférentiellement, une plante transformée selon l'invention est une céréale et de manière tout à fait préférée un maïs, un blé, une orge, un sorgho ou un millet.
En particulier, on peut choisir des plantes connues pour contenir d'importantes réserves (protéiques, glucidiques et lipidiques), notamment les plantes céréalières ou les plantes oléagineuses.
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Les plantes hybrides obtenues par le croisement de plantes selon l'invention, font aussi partie de l'invention.
L'invention a encore pour objet une semence ou un grain de plante d'une plante transformée telle que définie ci-dessus. Typiquement, une telle semence transformée ou un tel grain transformé comprend une ou plusieurs cellules comprenant dans leur génome une ou plusieurs copies d'un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11.
Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi une semence d'une plante transformée telle que définie ci-dessus, ou encore un fruit d'une telle plante transformée.
L'invention est également relative à un procédé d'obtention d'une plante transgénique telle que définie dans la présente section, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transfecter un cellule hôte végétale avec un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 chez une plante, ou avec un vecteur recombinant dans lequel a été introduit un tel acide nucléique ; b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré un acide nucléique tel que défini dans la présente description.
L'invention a encore pour objet un procédé d'obtention d'une plante transgénique ayant une résistance induite ou augmentée à l'agression par un pathogène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule hôte recombinante d'Agrobacterium tumefaciens transformée avec un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11, ou avec un vecteur recombinant dans lequel a été introduit un tel acide nucléique ; b) transformation d'une plante d'intérêt par infection avec la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; c) sélection des plantes ayant intégré dans leur génome ledit acide nucléique.
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Dans un premier mode de réalisation particulier, l'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transformée décrits ci-dessus peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes : d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape c) ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène.
Dans un second mode de réalisation particulier, l'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transformée décrit ci-dessus peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes : f) croisement d'une plante transformée obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; g) sélection des plantes issues du croisement de l'étape f) ayant conservé le transgène.
Dans un troisième mode de réalisation, l'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transformée décrit ci-dessus peut en outre comporter les étapes suivantes : h) croisement d'une plante transformée obtenue à l'étape c) avec une plante d'une lignée à valeur agronomique de la même espèce ; i) sélection des plantes issues du croisement de l'étape h) ayant conservé le transgène ; j) rétrocroisement d'une plante transformée obtenue à l'étape i) avec la plante d'une lignée à valeur agronomique de la même espèce ; k) répéter l'étape j) au moins deux fois ; 1) sélection des plantes issues des rétrocroisements de l'étape k) qui ont conservé le transgène et possèdent un fond génétique proche ou identique au fond génétique de la plante d'une lignée à valeur agronomique de la même espèce.
De préférence, l'étape j) est répétée de deux à vingt fois, et de' manière tout à fait préférée de trois à dix fois.
Un autre objet de l'invention consiste en une plante transgénique, telle qu'obtenue selon l'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transformée définie ci-avant, qui présente un phénotype de résistance induit ou augmenté à l'agression par un pathogène.
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La transformation de cellules végétales peut être réalisée par les techniques connues de l'homme du métier.
On peut citer notamment les méthodes de transfert direct de gènes telles que la microinjection directe dans des embryoïdes de plante (NEUHAUS et al., 1987), 1'infiltration sous vide (BECHTOLD et al., 1993) ou l'électroporation (CHUPEAU et al., 1989) ou encore la précipitation directe au moyen de PEG (SCHOCHER et al., 1986) ou le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt (FROMM M. et al. 1990).
On peut également infecter la plante par une souche bactérienne notamment d'Agrobacterium. Selon un mode de réalisation du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transformées par un vecteur selon
l'invention, ledit hôte cellulaire étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences nucléotidiques d'intérêt initialement contenues dans l'ADN du vecteur susmentionné. Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article d'AN et al., (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de GUERCHE et al., (1987) ou encore dans la demande PCT N WO 00 22.148.
l'invention, ledit hôte cellulaire étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences nucléotidiques d'intérêt initialement contenues dans l'ADN du vecteur susmentionné. Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article d'AN et al., (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de GUERCHE et al., (1987) ou encore dans la demande PCT N WO 00 22.148.
Par exemple, la transformation des cellules végétales peut être réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al. 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans l'un de ces vecteurs, la région T a été éliminée par délétion, à l'exception des bordures droite et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus de région T mais contient
toujours les gènes de virulence vir, nécessaires à la transformation de la cellule végétale.
toujours les gènes de virulence vir, nécessaires à la transformation de la cellule végétale.
Selon un mode préféré, on peut utiliser la méthode décrite par ISHIDA et al. (1996) pour la transformation des Monocotylédones.
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Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par FINER et al. (1992) utilisant le canon à particules de tungstène ou d'or.
L'homme du métier est capable de mettre en oeuvre de nombreux procédés de l'état de la technique afin d'obtenir des plantes transformées par un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11.
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à la technique décrite par BECHTOLD et al. (1993) afin de transformer une plante à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Des techniques utilisant d'autres types de vecteurs peuvent également être utilisées, telles que les techniques décrites par BOUCHEZ et al. (1993) ou encore par HORSCH et al. (1994).
A titre illustratif, une plante transgénique selon l'invention peut être obtenue par des techniques de biolistique telles que celles décrites par FINER et al. (1992) ou encore celles décrites par VAIN et al. (1993).
D'autres techniques préférées de transformation d'une plante
conformément à l'invention par Agrobacterium tumefaciens sont celles décrites par ISHIDA et al. (1996) ou encore dans la demande PCT publiée sous le n WO 95/06 722 au nom de JAPAN TOBACCO.
conformément à l'invention par Agrobacterium tumefaciens sont celles décrites par ISHIDA et al. (1996) ou encore dans la demande PCT publiée sous le n WO 95/06 722 au nom de JAPAN TOBACCO.
L'invention a encore pour objet une semence de plante dont les cellules constitutives comprennent un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 qui a été artificiellement inséré dans leur génome.
L'invention a encore pour objet une semence d'une plante transformée telle que définie ci-avant ou encore un fruit d'une telle plante transgénique.
L'invention a encore pour objet toute partie d'une plante transformée telle que définie ci-dessus, et à titre non limitatif les feuilles, les racines ou les tiges.
L'invention concerne aussi un procédé pour induire ou augmenter la résistance d'une plante à l'agression par un pathogène, caractérisé en ce qu'il comprend une étape selon laquelle on met en contact ladite plante avec le polypeptide AKIN11, ou une composition comprenant, à titre de composé actif, le polypeptide AKIN 11.
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L'invention a aussi pour objet une composition pour induire ou augmenter la résistance d'une plante à un pathogène, ladite composition comprenant une quantité efficace du polypeptide AKIN11 à titre de principe actif.
SONDES ET AMORCES SELON L'INVENTION
L'invention est également relative à l'utilisation de sondes et d'amorces hybridant avec l'ADN génomique ou l'ADNc du gène akin11 pour détecter un caractère de résistance à l'agression par un pathogène chez une plante. En d'autres termes, l'invention vise aussi l'utilisation d'un acide nucléique de akin11 comme marqueur moléculaire d'un phénotype de résistance à un pathogène chez une plante.
L'invention est également relative à l'utilisation de sondes et d'amorces hybridant avec l'ADN génomique ou l'ADNc du gène akin11 pour détecter un caractère de résistance à l'agression par un pathogène chez une plante. En d'autres termes, l'invention vise aussi l'utilisation d'un acide nucléique de akin11 comme marqueur moléculaire d'un phénotype de résistance à un pathogène chez une plante.
Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les séquences nucléotidiques SEQ ID NO1, 2,4 et 5, leurs fragments d'au moins 12 nucléotides, ainsi que les acides nucléiques de séquence
complémentaire, sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène amin11 ou encore d'un fragment ou d'un variant allélique de cette dernière dans un échantillon.
complémentaire, sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène amin11 ou encore d'un fragment ou d'un variant allélique de cette dernière dans un échantillon.
Fait également partie de l'invention l'utilisation de sondes et amorces nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID NO1, 2,4 et 5.
Des sondes ou amorces réalisées à partir des séquences SEQ ID N 1 ou 2 sont utiles pour détecter la présence d'un caractère de résistance à un pathogène.
Des sondes ou amorces réalisées à partir des séquences SEQ ID ? 4 ou 5 sont utiles pour détecter la présence d'un caractère de sensibilité à un pathogène.
Par conditions d'hybridation de forte stringence, au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes :
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Préhybridation : mêmes conditions que pour l'hybridation durée : 1 nuit.
Hybridation :
5 x SSPE (0.9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA)
5 x Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB) 100 ug/ml ADN de sperme de saumon
0.1% SDS durée : 1 nuit.
5 x SSPE (0.9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA)
5 x Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB) 100 ug/ml ADN de sperme de saumon
0.1% SDS durée : 1 nuit.
Lavages :
2 x SSC, 0. 1% SDS 10 min 65 C
1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65 C
0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65 C
0.1 x SSC, 0. 1% SDS 10 min 65 C.
2 x SSC, 0. 1% SDS 10 min 65 C
1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65 C
0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65 C
0.1 x SSC, 0. 1% SDS 10 min 65 C.
Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est définie par la relation :
Tm= 81,5 + 0,41 (% G+C) +16,6 Log (concentration en cations)- 0,63 (% formamide)- (600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.54-9. 62).
Tm= 81,5 + 0,41 (% G+C) +16,6 Log (concentration en cations)- 0,63 (% formamide)- (600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.54-9. 62).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4 (G+C) + 2 (A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation
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est approximativement de 5 à 30 C, de préférence de 5 à 10 C en-dessous de Tm.
Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989).
Les sondes ou les amorces nucléotidiques mises en oeuvre selon l'invention comprennent au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquences SEQ ID Nol, 2,4 et 5 ou de sa séquence complémentaire ou encore d'un acide nucléique hybridant dans des conditions d'hybridation de forte stringence avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID Nol, 2,4 et 5.
De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon
l'invention auront une longueur d'au moins 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200,300, 400, 500, 1000,2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
l'invention auront une longueur d'au moins 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200,300, 400, 500, 1000,2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de
12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.
Une sonde d'intérêt selon l'invention consiste en une sonde laquelle, dans ces conditions d'hybridation données, est capable de discriminer les séquences SEQ ID D ? 1 ou 2 des séquences SEQ ID ? 4 ou
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5. De préférence, une telle sonde hybridera avec un acide nucléique dans une séquence comprenant la base C en position 1972 de la séquence SEQ ID ? 2 ou en position 1003 de la séquence SEQ ID N 1 et n'hybridera pas avec un acide nucléique comprenant la base T en position 1972 de la séquence SEQ ID ? 2 ou en position 1003 de la séquence SEQ ID N'l.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen n EP 0 707 592. Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant une molécule détectable, c'est-à-dire un marqueur détectable, par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32p 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5'ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n FR 78 10 975 ou encore dans les articles de URDEA et al. (1988) ou SANCHEZ PESCADOR et al. (1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une
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amplification du signal, telles que les sondes décrites par URDEA et al ; (1991) ou encore dans le brevet européen n EP 0 225 807 (Chiron).
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique du gène amin11 ou encore dans des hybridations à l'ARN messager de ce gène lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de micro-titration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
En conséquence, l'invention a encore pour objet l'utilisation d'un acide nucléique d'une sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique de séquence nucléotidique SEQ ID Nol, 2,4 ou 5.
L'invention est également relative à l'utilisation d'un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il consiste en un polynucléotide d'au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique de séquence choisie parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N'l, 2,4 ou 5.
Comme décrit ci-dessus, un tel acide nucléique peut en outre être caractérisé en ce qu'il est marqué par une molécule détectable.
La présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique du gène akin11 marqueur de
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résistance à un pathogène dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de :
1) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
1) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.
Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites cidessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui vont être utilisées pour détecter des séquences
cibles d'intérêt du gène amin11 ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes du gène akin 11 plus particulièrement des acides nucléiques de séquence SEQ ID ? 1, 2, 4 et 5 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
cibles d'intérêt du gène amin11 ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes du gène akin 11 plus particulièrement des acides nucléiques de séquence SEQ ID ? 1, 2, 4 et 5 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
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On entend par séquence cible au sens de l'invention, une séquence nucléotique comprise dans un acide nucléique, ladite séquence nucléotidique hybridant, dans les conditions d'hybridation spécifiées dans la description, avec une sonde ou une amorce nucléotique de l'invention.
Une séquence cible préférée consiste en une séquence comprise dans la séquence SEQ ID N 1 ou SEQ ID D ? 2 et comprenant la base C en position 1972 de la séquence SEQ ID ? 2 ou en position 1003 de la séquence SEQ ID n'l.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier un fragment nucléotidique quelconque (ADNg, ADNc, ARNm) du gène amin11, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID Nol, 2,4 ou 5, ou encore un fragment ou un variant de ces séquences.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement d'un acide nucléique de séquence SEQ ID ? 1, 2,4 ou 5 ou un fragment ou un variant allélique de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3'de la région de l'acide nucléique cible du gène akin11 dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini cidessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-après.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus
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particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N'l, 2, 4 ou 5, ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conforme à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du
côté 3'de l'acide nucléique cible du gène akin11 dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telle que décrite ci-dessus.
UTILISATION D'OLIGONUCLEOTIDES ANTISENS CIBLES SUR LE GENE AKIN11 POUR MODULER LA RESISTANCE D'UNE PLANTE A L'AGRESSION PAR UN PATHOGENE.
La résistance d'une plante à l'agression par un pathogène peut être modulée en agissant sur le niveau d'expression et/ou de traduction du gène akin11, par exemple en utilisant des oligonucléotides antisens.
De préférence, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend une séquence complémentaire d'une séquence localisée dans la région de l'extrémité 5'de l'ADN du gène akinll, et de manière tout à fait préférée la proximité du codon d'initiation de la traduction (ATG) du gène
afin 11.
afin 11.
Selon un second mode de réalisation préférentiel, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend une séquence complémentaire à l'une des séquences localisées au niveau des jonctions exon/intron du gène akin 11 et de manière préférée des séquences correspondant à un site d'épissage.
Un polynucléotide antisens préféré selon l'invention comprend au moins 15 nucléotides consécutifs de l'ADNc du gène akin11 ayant la séquence nucléotidique SEQ ID N 1 ou de l'ADN génomique du gène amin11 de séquence SEQ ID N 2.
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Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant complémentaire d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée.
Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
De manière générale, un polynucléotide antisens selon l'invention possède au moins 20,25, 30,35, 40,50, 75,100, 150,200, 300,400, 500, 1000 ou 2000 nucléotides consécutifs de l'adnc dee ESM-1 de séquence SEQ DN 1 ouSEQ) DN 2.
A titre illustratif, un polynucléotide antisens préféré selon l'invention consiste en l'acide nucléique de l'ADNc de ESM-1 de séquence
SEQ DN 1.
SEQ DN 1.
Un polynucléotide antisens du gène akin 11 selon l'invention peut être préparé par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzyme de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen n EP-0 707 592.
De manière générale, les polynucléotides antisens doivent avoir une longueur et une température de fusion suffisante pour permettre la formation d'un hybride duplex intracellulaire ayant une stabilité suffisante pour inhiber l'expression de l'ARNm de akin-11. Des stratégies pour construire les polynucléotides antisens sont notamment décrites par GREEN et al. (1986) et IZANT et WEINTRAUB (1984).
Des méthodes de construction de polynucléotides antisens sont également décrites par ROSSI et al (1991) ainsi que dans les demandes PCT N WO 947/23.026, WO 95/04141, WO 92/L18. 522 et dans la demande de brevet européen n EP 0 572 287.
D'autres méthodes de mise en oeuvre de polynucléotides antisens sont par exemple celles décrites par SCZAKIEL et al. (1995) ou encore celles décrites dans la demande PCT N WO 95/24.223.
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D'autres techniques d'utilisation de polynucléotides antisens utilisables par l'homme du métier sont celles de SALE et al. (1995) ainsi que celle de GAO et al. (1996).
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un poloynucléotide antisens hybridant avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID ? 2 pour moduler la résistance d'une plante à l'agression par un pathogène, et en particulier inhiber la résistance d'une plante à l'agression par un pathogène.
La résistance d'une plante à l'agression par un pathogène peut être modulée en agissant sur l'expression du gène amin11, par exemple en utilisant des oligonucléotides antisens.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, aux figures et exemples suivants.
DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 illustre Isolement des extrémités de BAC de la banque TA & MU.
La figure 1 illustre Isolement des extrémités de BAC de la banque TA & MU.
Les inserts d'ADN nucléaire sont clonés dans le vecteur pBeloBAC11 qui comporte, dans sa séquence, les sites uniques Sphl, BamHI, Smal, Sacl, et EcoRI. La digestion du clone par une de ces enzymes de restriction permet de générer des fragments comportant une portion du vecteur et une portion d'insert de taille variable. Après religation de ces fragments sur eux-mêmes, l'extrémité droite peut être amplifiée par PCR inverse. Le fragment d'insert correspondant à l'extrémité gauche associée au vecteur constitue un plasmide fonctionnel comportant l'origine de réplication et le marqueur de résistance au chloramphénicol. L'extrémité gauche peut ainsi être clonée par plasmid rescue .
Cmr, résistance au chloramphénicol ; Ori, origine de réplication.
La figure 2 illustre la recherche d'ORFs dans la région délimitée par les marqueurs mi413 et MXE2RE.
(A). La portion séquencée du clone T7119 (correspondant à la portion couverte par le clone MXE2) est représentée sur ce clone. Les barres verticales noires indiquent la position des sites EcoRI.
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(B) Les cosmides C7119-66 et C7119-49 couvrant la région de 18 kb comprise entre les marqueurs atpox et mi413 sont représentés en gris.
(C) La présence de deux ORFs a été détectée par le programme Genscan dans l'intervalle délimité par les marqueurs atpox et mi413. L'une correspond à la séquence codante du gène Akin11 qui code pour une protéine kinase de type SNFI ; l'autre pour une protéine de 171 acides aminés ne présentant pas d'homologies avec les séquences présentes dans les bases de données. Les carrés pleins représentent la séquence codante des deux gènes identifiés. Le premier exon comportant le codon d'initiation de la traduction est représenté.
La figure 3 illustre la structure génomique du gène Akin11 d'Arabidopsis et position de la mutation hxc-2 : Le gène Akin 11 comporte 11 exons, représentés par des rectangles gris, dont la taille est indiquée en kb.
L'exon contenant le codon d'initiation de la traduction est représenté. La position des bases limitrophes de chaque exon est indiquée sur le clone MXE2. Les fragments B, C, D, E, F, G et H amplifiés par PCR et clonés en vue du séquençage de l'allèle hxc-2 sont représentés par des traits. La mutation hxc-2, qui résulte d'une inversion C- T en position 77578 du
clone MXE2, dans l'exon 8 du gène Akin11 est indiquée.
clone MXE2, dans l'exon 8 du gène Akin11 est indiquée.
La figure 4 illustre la complémentation de la mutation hxc-2.
En haut : Cosmides utilisés pour transformer les plantes mutantes.
Les cosmides C7119-29, C7119-32, C7119-66 et C7119-49 ont été utilisés pour transformer, via Agrobacterium, des plantes mutantes.
En bas : Phénotype observé, en réponse à l'inoculation par la souche 147, chez un transformant primaire, T66, obtenu avec le clone C7119-66, comparé au mutant hxc-2,5 jours après inoculation.
La figure 5 illustre la construction d'un vecteur d'expression recombinant contenant une séquence de l'ADNc ou de l'ADN génomique codant pour le polypeptide AKIN11, ou la séquence anti-sens correspondante.
35S Pro : Promoteur 35 S du CaMV ; NOS Ter : Terminateur du gène Nopaline synthase de A. Tumefaciens ; EF : extrémités franches. NPIII :
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gène de résistance à la kanamycine. AKINF : SEQ ID N 13 ; AKINR : SEQ ID N 14.
La figure 6 illustre la construction d'un vecteur d'expression recombinant contenant une séquence de l'ADNC codant pour le polypeptide AKIN11 ; ou la séquence anti-sens correspondante.
35S Pro : Promoteur 35 S du CaMV ; NOS Ter : Terminateur du gène Nopaline synthase de A. Tumefaciens ; EF : extrémités franches,.
AKIN68 : SEQ ID ? 15. AK) N1648 ; SEQ ID ? 16.
EXEMPLES EXEMPLE 1 : CLONAGE POSITIONNEL DU GENE CAUSAL DU PHENOTYPE DE SENSIBILITE DANS LA PLANTE MUTANTE HXC2 : CARTOGRAPHIE GLOBALE SUR DIFFERENT CHROMOSOMES D'ARABIDOPSIS THALIANA.
Suite à la caractérisation phénotypique du mutant hxc-2, la cartographie du locus avait été entreprise par l'analyse du phénotype de 132 plantes F2 issues du croisement entre une plante Col-gl-1-hxc-2 et l'écotype sauvage polymorphe, Ws-0. Un premier crible phénotypique avait été réalisé sur cette population en réponse à l'inoculation par la souche 147 de Xanthomonas campestris pv. campestris et 78 individus, incluant 28 plantes de phénotype mutant, avaient été sélectionnés et autofécondés.
L'analyse de la ségrégation du caractère hxc-2 dans chaque sous-famille
F3 résultant de l'autofécondation avait permis de déterminer, de manière codominante, le génotype des individus F2 au locus HXC2. L'intégration, dans une carte génétique préalablement réalisée sur la même population, du génotype des plantes F2 au locus HXC2 a permis de positionner le locus en position centromérique, sur le chromosome III, entre les marqueurs RFLP mm413 et atpox (Tableau 1).
F3 résultant de l'autofécondation avait permis de déterminer, de manière codominante, le génotype des individus F2 au locus HXC2. L'intégration, dans une carte génétique préalablement réalisée sur la même population, du génotype des plantes F2 au locus HXC2 a permis de positionner le locus en position centromérique, sur le chromosome III, entre les marqueurs RFLP mm413 et atpox (Tableau 1).
Cet intervalle, défini par la présence d'un événement de recombinaison à droite du marqueur télomérique mi413 et d'un événement de recombinaison à gauche du marqueur centromérique, atpox, représente
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une distance physique d'environ 1, 2 Mb, évaluée sur la base des données de cartographie physique offertes par l'agencement de clones YACs ("Yeast Artificial Chromosomes") de la banque de Versailles dans la région. Ces données sont disponibles sur le site Web TAIR (WWW. arabidopsis. org). L'absence d'événements de recombinaison supplémentaires dans cet intervalle ne permettait pas d'envisager d'isoler le gène par une approche de clonage positionnel. La poursuite de la marche chromosomique a donc consisté, dans un premier temps, à isoler des recombinants dans l'intervalle défini par les marqueurs flanquants (mm413 et atpox), et dans un deuxième temps, à augmenter le nombre et donc la résolution des marqueurs moléculaires dans cet intervalle.
Tableau 1 :
Fréquence de recombinaison qénétique entre le locus hxc2 et des marqueurs moléculaires du génome d'Arabidopsis.
Fréquence de recombinaison qénétique entre le locus hxc2 et des marqueurs moléculaires du génome d'Arabidopsis.
<tb>
<tb>
<tb>
Chromosome <SEP> Marqueur <SEP> Chromosome <SEP> Nombre <SEP> total <SEP> de <SEP> Fréquence <SEP> de
<tb> recombinants <SEP> chromosomes <SEP> recombinaison
<tb> (%)
<tb> Il <SEP> GAPC <SEP> 52 <SEP> 148 <SEP> 35
<tb> nga162 <SEP> 36 <SEP> 144 <SEP> 25
<tb> GAPA <SEP> 12 <SEP> 142 <SEP> 8
<tb> GLI <SEP> 6 <SEP> 148 <SEP> 4
<tb> mi413 <SEP> 1 <SEP> 146 <SEP> 1
<tb> atpox <SEP> 2 <SEP> 146 <SEP> 1
<tb> t04109 <SEP> 3 <SEP> 146 <SEP> 2
<tb> m249 <SEP> 21 <SEP> 144 <SEP> 15
<tb> m457 <SEP> 33 <SEP> 144 <SEP> 23
<tb> PUR5 <SEP> 35 <SEP> 146 <SEP> 25
<tb> BGL1 <SEP> 58 <SEP> 146 <SEP> 40
<tb> 1 <SEP> nga63 <SEP> 59 <SEP> 148 <SEP> 40
<tb> nga128 <SEP> 56 <SEP> 148 <SEP> 38
<tb> m315 <SEP> 56 <SEP> 146 <SEP> 38
<tb> 11 <SEP> m246 <SEP> 57 <SEP> 140 <SEP> 41
<tb> GPA1 <SEP> 49 <SEP> 128 <SEP> 38
<tb> IV <SEP> m518 <SEP> 58 <SEP> 142 <SEP> 41
<tb> g4539 <SEP> 59 <SEP> 144 <SEP> 41
<tb> DHS1 <SEP> 50 <SEP> 136 <SEP> 37
<tb> V <SEP> ASA1 <SEP> 53 <SEP> 142 <SEP> 37
<tb> nga106 <SEP> 61 <SEP> 148 <SEP> 41
<tb> CRA-1 <SEP> 63 <SEP> 144 <SEP> 41
<tb>
<tb> recombinants <SEP> chromosomes <SEP> recombinaison
<tb> (%)
<tb> Il <SEP> GAPC <SEP> 52 <SEP> 148 <SEP> 35
<tb> nga162 <SEP> 36 <SEP> 144 <SEP> 25
<tb> GAPA <SEP> 12 <SEP> 142 <SEP> 8
<tb> GLI <SEP> 6 <SEP> 148 <SEP> 4
<tb> mi413 <SEP> 1 <SEP> 146 <SEP> 1
<tb> atpox <SEP> 2 <SEP> 146 <SEP> 1
<tb> t04109 <SEP> 3 <SEP> 146 <SEP> 2
<tb> m249 <SEP> 21 <SEP> 144 <SEP> 15
<tb> m457 <SEP> 33 <SEP> 144 <SEP> 23
<tb> PUR5 <SEP> 35 <SEP> 146 <SEP> 25
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<tb> 1 <SEP> nga63 <SEP> 59 <SEP> 148 <SEP> 40
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<tb> m315 <SEP> 56 <SEP> 146 <SEP> 38
<tb> 11 <SEP> m246 <SEP> 57 <SEP> 140 <SEP> 41
<tb> GPA1 <SEP> 49 <SEP> 128 <SEP> 38
<tb> IV <SEP> m518 <SEP> 58 <SEP> 142 <SEP> 41
<tb> g4539 <SEP> 59 <SEP> 144 <SEP> 41
<tb> DHS1 <SEP> 50 <SEP> 136 <SEP> 37
<tb> V <SEP> ASA1 <SEP> 53 <SEP> 142 <SEP> 37
<tb> nga106 <SEP> 61 <SEP> 148 <SEP> 41
<tb> CRA-1 <SEP> 63 <SEP> 144 <SEP> 41
<tb>
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EXEMPLE 2 : CLONAGE POSITIONNEL DU GENE CAUSAL DU PHENOTYPE DE SENSIBILITE DANS LA PLANTE MUTANTE HXC2 : RESTRICTION DE INTERVALL DEFINI PAR LES MARQUEURS mi413 et atpox.
1. Isolement de recombinants entre les marqueurs mi413 et atpox :
Le positionnement d'un locus muté par une approche de clonage positionnel n'est défini que par l'existence d'événements de recombinaison génétique entre le génotype des individus F2 au locus considéré, accessible par l'analyse de la ségrégation du caractère mutant dans les lignées F3, et le génotype de ces mêmes individus pour des marqueurs moléculaires liés à la mutation. La restriction de l'intervalle physique définissant la position d'une mutation implique donc l'identification d'événements de recombinaison suffisamment proches du locus muté.
Le positionnement d'un locus muté par une approche de clonage positionnel n'est défini que par l'existence d'événements de recombinaison génétique entre le génotype des individus F2 au locus considéré, accessible par l'analyse de la ségrégation du caractère mutant dans les lignées F3, et le génotype de ces mêmes individus pour des marqueurs moléculaires liés à la mutation. La restriction de l'intervalle physique définissant la position d'une mutation implique donc l'identification d'événements de recombinaison suffisamment proches du locus muté.
L'isolement de ces recombinants aléatoires ne peut se faire qu'en augmentant la taille de la population en ségrégation.
La cartographie du locus hxc2 avait été réalisée sur une population de taille réduite (78 individus) ; par conséquent, la nécessité d'isoler de nouveaux recombinants pour le clonage positionnel du gène a été envisagée bien avant sa localisation entre les marqueurs mi413 et atpox. L'isolement de recombinants aléatoires a donc été abordé par une approche de génétique inverse, après avoir localisé le locus HXC2 dans une fenêtre de 13 cM, entre les marqueurs GL-1 et m249.
Le mutant hxc-2 a été isolé dans un fond génétique Col-gl-1. La mutation récessive, gl-1, localisée en position centromérique sur le chromosome III est responsable de l'absence de différentiation de cellules épidermiques en trichomes et confère le phénotype glabre. Ce marqueur phénotypique, hérité du parent mutant dans la population, coségrège avec la mutation hxc-2 et constitue l'une des limites supérieure du locus. La présence de ce marqueur phénotypique a été mise à profit pour l'isolement de recombinants entre les marqueurs gl-1 et m249. Au sein d'une population F2 résultant du croisement entre une plante mutante Col-gl-1- hxc-2 et une plante sauvage Ws-0, 367 individus de phénotype glabre
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(ayant hérité ce caractère du parent mutant) ont été sélectionnés. L'ADN de ces individus, présentant un génotype homozygote Col-0 au locus GL-1, a été isolé, digéré par EcoRI et soumis à une analyse RFLP par le marqueur m249 qui constituait la limite inférieure du locus HXC2. 61 individus présentant un profil homozygote Ws-0 ou hétérozygote pour ce marqueur, résultant respectivement d'un double et d'un simple événement de recombinaison entre les marqueurs gl-1 et m249 ont été sélectionnés, autofécondés et soumis à un second crible par les marqueurs mi413 et atpox. Seuls 8 individus recombinants entre ces deux derniers marqueurs ont été conservés et le phénotype des lignées F3 correspondantes a été testé en réponse à l'inoculation par la souche 147. Ce crible phénotypique a permis de déterminer le génotype de chaque individu recombinant, au locus HXC2, de manière codominante. Les événements de recombinaison de ces 8 individus, R80, R139, R148, R269, R273, R284, R287 et R313 ajoutés à ceux des lignées H25 et Wh72, issues de la population de cartographie initiale, ont été utilisés pour préciser la position du locus HXC2.
Il. Production de marqueurs moléculaires dans l'intervalle défini par les marqueurs mi 413 et atpox.
Au delà de l'identification de recombinants dans l'intervalle défini par les deux marqueurs flanquant le locus d'intérêt, le positionnement précis du locus par rapport à ces événements de recombinaison demande par ailleurs d'augmenter le nombre et donc, la résolution des marqueurs moléculaires dans cet intervalle.
Plusieurs sources de marqueurs moléculaires sont disponibles chez Arabidopsis. Tout d'abord, la génération de lignées recombinantes entre les écotypes Col-0 et La-er a permis de rassembler l'ensemble des marqueurs préexistants (gènes clonés, fragments d'ADN génomique, ESTs, marqueurs microsatellites...) en une carte génétique unique (Lister et Dean, 1993), qui précise actuellement la position relative de plus de 300 d'entre eux sur les 5 groupes de liaison du génome d'Arabidopsis.
Cependant, malgré son caractère exhaustif, cette carte n'a pas permis de fournir de nouveaux marqueurs permettant de restreindre l'intervalle défini par mi413 et atpox.
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Par ailleurs, la production de marqueurs résolutifs peut être assurée par la réalisation d'une carte physique précise couvrant le locus considéré. Plusieurs banques génomiques produites par le clonage de digestions partielles d'ADN nucléaire dans des vecteurs de type BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ou résultant de l'encapsidation d'inserts de taille définie dans des particules phagiques (clones P1 (Liu et a/., 1995)) ont été produites chez Arabidopsis. L'agencement de ces clones en contigus constitue l'étape préliminaire des programmes de séquençage. Il offre l'avantage de définir des zones de chevauchement entre ces clones et permet ainsi de réduire considérablement le nombre de clones BAC à séquencer pour assurer la couverture totale d'une région chromosomique. Contrairement aux chromosomes l, Il, IV, et V pour lesquels des cartes physiques très précises étaient exploitables en de nombreux points du
génome, pour la région centromérique du chromosome III, au début de cette étude, seule une carte physique approximative et discontinue, assortie de quelques données de séquences était disponible. Bien qu'incomplète, cette carte résultant du criblage de clones P1 (Liu et a/., 1995) et BAC par des extrémités d'inserts de clones YACs (Yeast Artificial Chromosomes) (Creusot et al., 1995) a servi de support au clonage positionnel du gène HXC2 : les données de séquence des clones P1 MOD1, MXO21 et MTO24 positionnés dans la région (Tableau 2), ont été utilisées pour amplifier par PCR des fragments génomiques, qui ont servis de marqueurs RFLP.
génome, pour la région centromérique du chromosome III, au début de cette étude, seule une carte physique approximative et discontinue, assortie de quelques données de séquences était disponible. Bien qu'incomplète, cette carte résultant du criblage de clones P1 (Liu et a/., 1995) et BAC par des extrémités d'inserts de clones YACs (Yeast Artificial Chromosomes) (Creusot et al., 1995) a servi de support au clonage positionnel du gène HXC2 : les données de séquence des clones P1 MOD1, MXO21 et MTO24 positionnés dans la région (Tableau 2), ont été utilisées pour amplifier par PCR des fragments génomiques, qui ont servis de marqueurs RFLP.
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Tableau 2 :
Séquence des oligonucléotides utilisés pour la génération de nouveaux marqueurs de type RFLP
Séquence des oligonucléotides utilisés pour la génération de nouveaux marqueurs de type RFLP
<tb>
<tb> Marqueur <SEP> de
<tb> P1 <SEP> oligonucléotiques <SEP> amplifié <SEP> restriction
<tb> e
<tb> MOD1 <SEP> MOD1 <SEP> ab026618 <SEP> 5'-gtcttgttttctgcagttcgag-832 <SEP> pb <SEP> EcoRV
<tb> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 7)
<tb> 5'-gggacacgtcgagtatagagg-3'
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO8)
<tb> MT024 <SEP> MT024 <SEP> ab026657 <SEP> 5'-ggaacttggaggagctcccac-3'1131 <SEP> pb <SEP> Ndel
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> N 9)
<tb> 5'-cattattctccatcggttgg-
<tb> 3'(SEQ <SEP> ID <SEP> N 10)
<tb> MXO21-LE <SEP> MXO21 <SEP> ap00606 <SEP> 5'-taccggttcgcgggtgttcg-3' <SEP> 1159 <SEP> pb <SEP> Spel
<tb> (SEQ <SEP> DN 11)
<tb> 5'-acttccatctcggcgtccgtc-3'
<tb> (SEQtDN 12)
<tb>
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<tb> e
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<tb>
Génération de marqueurs RFLP à partir de séquences de clones BAC et P1 positionnés dans l'intervalle défini parles marqueurs mm413 et atpox.
La production d'un marqueur RFLP à partir d'une séquence donnée nécessite l'identification préalable d'un polymorphisme de restriction entre les parents du croisement dont sont issus les individus en ségrégation. Toutes les sondes RFLP utilisées dans cette étude ont donc été hybridées à une membrane parentale résultant de la digestion d'ADN génomique des deux écotypes parentaux (Col-gl-1-hxc-2 et Ws-0) par 19 enzymes de restriction. L'identification de 3 couples enzyme/sonde (MOD1/EcoRV, MT024/Ndel MXO21LE/Spel) montrant un profil d'hybridation polymorphe entre les parents, et permettant de détecter des individus hétérozygotes sans ambiguïté, a permis de définir 3 marqueurs utilisables pour la marche chromosomique (Tableau 2 ci-dessus). Leur utilisation pour la cartographie du locus muté a nécessité la digestion de l'ADN de l'ensemble des
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individus F2 (ou de pools d'ADN F3 résultant de ces individus F2) par l'enzyme spécifique, et l'hybridation de ces digestions à leur sonde respective.
111. Restriction de l'intervalle par les marqueurs MOD1, MTO24 et MXO21-LE.
Les clones MOD1, MTO24 et MXO21, ancrés sur la carte physique par leur hybridation respective aux marqueurs CIC8D2RE, CIC10A4LE et CIC10A8RE (correspondant à des extrémités de clones YAC localisées dans la région (Creusot et al., 1995)) ont été totalement séquencés dans le cadre du programme de séquençage du chromosome III. L'utilisation des fragments amplifiés à partir de ces clones comme marqueurs RFLP a permis de réduire l'intervalle défini par les marqueurs mi413 et atpox. Les événements de recombinaison correspondant aux lignées R313, R287 et R139, phénotypées mutantes au locus hxc2 et homozygotes mutantes pour le marqueur MOD1, ont été éliminés par l'utilisation de ce marqueur. L'intervalle a ainsi été réduit aux 400 kb séparant MOD1 de min413. Enfin, l'utilisation des marqueurs MT024 et MXO21 a permis de réduire à 2, le nombre de recombinants de part et d'autre du locus, désormais limité à gauche, par le marqueur mm413 et à droite, par le marqueur MX021LE. L'absence de chevauchement entre les clones MXE2 et MXO21 ne permettant pas d'évaluer précisément la distance physique séparant les nouveaux marqueurs flanquants, mi413 et MX021LE, elle a été évaluée par la construction d'une carte physique précise autour du locus HXC2.
EXEMPLE 3 : CLONAGE POSITIONNEL DU GENE CAUSAL DU PHENOTYPE DE SENSIBILITE DANS LA PLANTE MUTANTE HXC2 : CONSTRUCTION D'UNE CARTE PHYSIQUE PRECISE DU LOCUS HXC2.
La construction d'un contig de BACs couvrant le locus HXC2 a nécessité le criblage de la banque TA & MU,
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(http ://http. tamu. edu : 8000/-creel/TOC. html) disponible sur filtre haute densité, à l'aide des marqueurs limitrophes du locus.
1.-Criblage de la banque BAC TA & MU (Texas A & M University).
Le filtre haute densité, généré à partir de la banque BAC TA & MU est une membrane de 21 sur 14 cm sur laquelle environ quatre équivalents du génome haploïde ont été fixés. Le filtre comportant les 12288 clones de la banque, est divisé en 4 champs renfermant chacun 384 carrés. Chaque carré comporte 16 points correspondant au repiquage de 8 clones en duplicata. La position des signaux d'hybridation qui apparaissent en double dans le carré d'un champ donné renseigne donc, sans ambiguïté, sur l'origine du clone allumé par l'hybridation.
Le criblage de ce filtre, à l'aide du marqueur correspondant à une extrémité de clone YAC, CIC12D2RE qui constituait la première limite télomérique du locus HXC2 utilisée pour la cartographie physique, a permis
l'identification des clones T16014, T25B14 et T8B20. Un second criblage, réalisé à l'aide du marqueur mm413 a permis d'isoler les clones T7119 et T24F18. Par ailleurs, l'alignement de la séquence du marqueur mi413 sur l'ensemble des séquences nucléaires disponibles chez Arabidopsis a permis d'identifier un clone P1, MXE2 provenant d'une autre banque génomique et séquencé à Kazuza, au Japon, dans le cadre du programme de séquençage du bras court du chromosome III. Le marqueur mi413 a ainsi pu être ancré entre les bases du clone MXE2. Afin d'assurer la jonction entre les clones T8B20, T25B14, T16014, isolés à l'aide du marqueur CIC12D2RE, et le clone MXE2, identifié à l'aide du marqueur min413, un troisième criblage de la banque, réalisé à l'aide d'un fragment de 1, 5 kb correspondant à l'extrémité gauche du clone MXE2, a permis l'isolement des clones T2H8 et T3N15.
l'identification des clones T16014, T25B14 et T8B20. Un second criblage, réalisé à l'aide du marqueur mm413 a permis d'isoler les clones T7119 et T24F18. Par ailleurs, l'alignement de la séquence du marqueur mi413 sur l'ensemble des séquences nucléaires disponibles chez Arabidopsis a permis d'identifier un clone P1, MXE2 provenant d'une autre banque génomique et séquencé à Kazuza, au Japon, dans le cadre du programme de séquençage du bras court du chromosome III. Le marqueur mi413 a ainsi pu être ancré entre les bases du clone MXE2. Afin d'assurer la jonction entre les clones T8B20, T25B14, T16014, isolés à l'aide du marqueur CIC12D2RE, et le clone MXE2, identifié à l'aide du marqueur min413, un troisième criblage de la banque, réalisé à l'aide d'un fragment de 1, 5 kb correspondant à l'extrémité gauche du clone MXE2, a permis l'isolement des clones T2H8 et T3N15.
II. Construction d'un contigue de clones BACs entre les marqueurs mi413 et MX021-LE.
L'organisation en contig des clones BACs identifiés par criblage de la banque TA & MU a été permise par la structure du vecteur
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pBeloBAC11 dans lequel les fragments d'ADN nucléaire, d'une taille moyenne de 100 kb, ont été clonés (Figure 1).
Le vecteur facilite l'isolement et le clonage des extrémités des inserts qui peuvent, par la suite, être hybridées aux autres BACs. Ces hybridations permettent de préciser d'une part, les zones de chevauchement inter-BACs et, d'autre part, l'orientation des clones les uns par rapport aux autres, étapes nécessaires à l'élaboration du contigue.
L'isolement des extrémités droite et gauche de ces inserts, définies par les bras du vecteur, peut être réalisée respectivement par PCR inverse et"plasmid rescue" : les sites uniques Sphl, BamHI, Smal, Sacl et EcoRI présents dans la séquence de pBeloBAC 11 permettent, via la digestion d'un clone par l'une de ces enzymes et la religation des fragments générés sur eux mêmes, l'amplification par PCR inverse de l'extrémité droite. Les produits de religation génèrent, par ailleurs, un plasmide comportant l'origine de réplication du vecteur, le marqueur de résistance au chloramphénicol, et un fragment de taille variable correspondant à l'extrémité gauche de l'insert (Figure 1).
L'hybridation de l'ensemble des clones isolés au terme des trois criblages successifs par un fragment de 3,7 kb correspondant à une digestion Hindlll/BamHl de l'extrémité gauche du clone T8B20 (T8B20LE) a permis de détecter un signal d'hybridation correspondant au clone T16014. Par ailleurs, l'alignement de 129 pb de la séquence de cette extrémité sur l'ensemble des séquences d'Arabidopsis disponibles a permis d'ancrer ce fragment entre les bases 11191 et 11319 du clone P1 MXE2.
Le chevauchement entre les clones T8B20 et MXE2 isolés respectivement à l'aide des marqueurs CIC12D2RE et min413 montre que la distance physique qui sépare ces deux marqueurs est suffisamment faible pour s'affranchir du clone T2H8, identifié initialement à l'aide du marqueur MXE2LE pour assurer la jonction entre ces deux clones.
La digestion EcoRI du clone T8B20 a permis, après religation des fragments sur eux-mêmes et PCR inverse, l'isolement de 700 pb correspondant à son extrémité droite (T8B20RE). Le marquage de cette séquence a révélé un signal d'hybridation correspondant au clone T25B14.
Ce signal d'hybridation, absent du clone T16014, identifié à l'aide du
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même marqueur CIC12D2RE, montre que T25B14 s'étend plus loin à gauche du locus HXC2 que les clones T8B20 et T16014. Par ailleurs, le signal détecté sur 4 des 5 clones isolés par les marqueurs CIC12D2RE et MXE2LE après marquage de l'extrémité droite de T16014 a permis de confirmer leur présence dans la région. Par contre, l'absence de signaux correspondant au clone T3N15 pour l'ensemble des sondes testées dans la région ainsi que ses profils de digestion EcoRI, KPNI et BamHI distincts des autres clones présents dans la région ont conduit à le considérer comme un artéfact de criblage.
Le"gap"présent entre les clones P1 séquencés, MXE2 et MX021, a été comblé par le clone T7119, isolé à l'aide du marqueur mi413 (Figure, 1). La séquence des extrémités droite et gauche de ce clone disponible dans Genbank avec les numéros d'accession also91267 et also91268, a permis d'ancrer T7119 entre la base 52265 du clone MXE2 et la base 34747 du clone MXO21. Le marqueur MX021 LE qui constitue la limite centromérique du locus HXC2 a été amplifié entre les bases 351 et 1510 du clone MX021 ; ce marqueur est donc présent dans la séquence du clone T7119 qui chevauche le clone MX021 jusqu'à la base 34747.
L'hybridation du clone T7119 avec les deux marqueurs limitrophes du locus HXC2 apporte la preuve que le gène HXC2 est présent dans le clone T7119. L'isolement de ce clone, dont la taille a été évaluée par digestion EcoRI et migration sur gel d'agarose à 80 kb offrait donc d'une part, la possibilité d'évaluer la distance physique séparant les deux marqueurs flanquants (45 kb) et d'autre part, la possibilité de construire une carte de haute résolution autour du locus de manière à produire des fragments de taille plus réduite pour la complémentation de la mutation.
III. Construction d'une carte de haute résolution couvrant le locus HXC2.
Les banques BAC produites chez Arabidopsis ont été réalisées à
partir de l'écotype sauvage Col-0. Les clones BACs isolés par criblage de la banque TA & MU fournissaient donc les éléments nécessaires à la complémentation de la mutation hxc-2, isolée dans un fond génétique Colgl-1. Toutefois, ces clones n'ont pas été générés dans des vecteurs binaires permettant la transformation d'Arabidopsis. La complémentation
partir de l'écotype sauvage Col-0. Les clones BACs isolés par criblage de la banque TA & MU fournissaient donc les éléments nécessaires à la complémentation de la mutation hxc-2, isolée dans un fond génétique Colgl-1. Toutefois, ces clones n'ont pas été générés dans des vecteurs binaires permettant la transformation d'Arabidopsis. La complémentation
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de la mutation nécessitait donc la production de fragments de taille plus réduite, dans un vecteur binaire permettant la transformation stable de plantes mutantes. Une carte de haute résolution du locus HXC2 a donc été élaborée par digestion partielle EcoRI du clone T7119 couvrant le locus, et par clonage de ces fragments dans un vecteur cosmidique de type binaire (pSLJ75515) permettant d'intégrer des fragments d'une taille moyenne de 20 kb.
L'analyse d'environ 160 cosmides de cette banque a permis de sélectionner 10 d'entre eux, assurant une couverture totale du clone T7119.
L'agencement de ces clones en contig a été facilité par la connaissance de la séquence, et donc de la carte de restriction des 30kb télomériques communs au clone, MXE2 et des 34 kb centromériques correspondant au clone MXO21.
L'intervalle d'environ 15 kb non séquencés du clone T7119, déduit de la longueur totale du BAC, pouvait contenir le gène hxc2. Afin de tester cette hypothèse, un marqueur RFLP correspondant à l'extrémité droite du clone MXE2 a été généré par amplification d'un fragment de 675 pb entre les bases 86114 et 86789 de ce clone. Le produit amplifié a permis de détecter un polymorphisme EcoRV entre les parents du croisement. L'utilisation de ce marqueur sur la population des recombinants isolés entre les marqueurs atpox et mi413 a permis d'éliminer l'événement de recombinaison correspondant à l'individu R284. Le maintien d'un recombinant unique, R269, entre le marqueur MXE2RE et le locus a permis de restreindre l'intervalle aux quelques 20kb séquencés correspondant à l'extrémité droite du clone MXE2, comprise entre les marqueurs mi413 et MXE2RE. Afin d'identifier les gènes candidats présents dans cette région, une analyse de prédiction des"ORFs"a été réalisée dans la région.
EXEMPLE 4 : CLONAGE POSITIONNEL DU GENE CAUSAL DU PHENOTYPE DE SENSIBILITE DANS LA PLANTE MUTANTE HXC2 : IDENTIFICATION DU GENE CAUSAL.
* L'utilisation du programme Genscan (http : //CCR- 081. mit. edu/GENSCAN. html) sur le séquence du clone MXE2 a permis d'identifier deux ORFs dans l'intervalle défini par les marqueurs mi413 et
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MXE2LE : une protéine de 171 acides aminés ne présentant pas d'homologies avec les séquences présentes dans les bases de données et une sérine thréonine kinase de type SNF1, homologue de la protéine SNF1 de levure (Figure 2). La séquence codante prédite de la protéine kinase est à 100% identique à celle de l'ADNc du gène Akin11 d'Arabidopsis (N? d'accession X99279), isolé initialement par criblage hétérologue d'une banque d'ADNc à l'aide du gène SENF1 de levure et interagissant avec PRL1, un régulateur pléiotropique de gènes induits en réponse à des signaux hormonaux ou"sucre-dépendants" (Németh et a/., 1998, Bhalerao et a/., 1999). L'identité stricte révélée par l'alignement de la séquence prédite avec celle de la protéine Akin11, caractérisée dans cette expérience a été confirmée par la cartographie de l'ADNc Akin11, sur la population de lignées recombinantes Col-0/La-er, en position centromérique du marqueur mi413 (Bhalerao et al., 1999).
Séquençage du gène Akin11 dans le fond génétique Col-gl-1-hxc-2
La stratégie retenue pour le séquençage du gène Akin11 dans le mutant hxc-2 a donc consisté à amplifier des fragments chevauchants de la région génomique contenant ce gène, et à cloner ces fragments dans un vecteur de type pGEM-T (PROMEGA). Le séquençage de plusieurs clones indépendants, issus de chacun des fragments amplifiés (Figure 3) a permis d'identifier la mutation hxc-2. Cette méthode, qui utilise la PCR, est génératrice de délétions ponctuelles ou de mésappariement de bases. Ces
erreurs apparaissent avec une fréquence, évaluée dans cette étude à 10-5, qui porte à 10-25 la probabilité d'apparition d'une erreur sur la même base dans deux clones indépendants. La détection d'une inversion C/T au niveau de la base 77578 du fragment E dans 8 clones résultant de 2
amplifications indépendantes est donc, très probablement, le résultat de la présence effective de cette mutation dans la séquence du gène et non pas d'un artefact dû à une erreur d'amplification. Cette mutation ponctuelle est responsable du changement de l'arginine 335 de la protéine prédite en tryptophane.
La stratégie retenue pour le séquençage du gène Akin11 dans le mutant hxc-2 a donc consisté à amplifier des fragments chevauchants de la région génomique contenant ce gène, et à cloner ces fragments dans un vecteur de type pGEM-T (PROMEGA). Le séquençage de plusieurs clones indépendants, issus de chacun des fragments amplifiés (Figure 3) a permis d'identifier la mutation hxc-2. Cette méthode, qui utilise la PCR, est génératrice de délétions ponctuelles ou de mésappariement de bases. Ces
erreurs apparaissent avec une fréquence, évaluée dans cette étude à 10-5, qui porte à 10-25 la probabilité d'apparition d'une erreur sur la même base dans deux clones indépendants. La détection d'une inversion C/T au niveau de la base 77578 du fragment E dans 8 clones résultant de 2
amplifications indépendantes est donc, très probablement, le résultat de la présence effective de cette mutation dans la séquence du gène et non pas d'un artefact dû à une erreur d'amplification. Cette mutation ponctuelle est responsable du changement de l'arginine 335 de la protéine prédite en tryptophane.
La séquence nucléotidique génomique du gène akin11 muté est la séquence SEQ ID ? 4 du listage de séquences.
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La séquence nucléotidique de l'ADNc du gène akin11 muté est la séquence SEQ ID ? 5 du listage de séquences.
Par rapport à la séquence sauvage, la séquence nucléotidique mutée du gène amin11 comporte le remplacement d'une base C initiale par une base T, qui constitue le nucléotide en position 1972 de la séquence SEQ ID N 4 et le nucléotide en position 1003 de la séquence SEQ ID ? 5.
La séquence d'acides aminés déduite correspondant au polypeptide AKIN11 muté est la séquence SEQ ID ? 6 du listage de séquences.
Par rapport à la séquence du polypeptide sauvage AKIN11, le polypeptide muté de séquence SEQ ID D ? 6 possède la substitution du résidu arginine initial en position 335 par un résidu tryptophane sur le peptide muté.
EXEMPLE 5 : UTILISATION D'UN ACIDE NUCLEIQUE PERMETTANT LA SYNTHESE DU POLYPEPTIDE AKIN11 POUR INDUIRE UNE RESISTANCE A L'AGRESSION PAR UN PATHOGENE
Afin d'induire un phénotype de résistance à un pathogène chez le mutant sensible hxc2 de Arabidopsis thaliana, des expériences de complémentation ont été réalisées, à l'aide des cosmides obtenus par digestion partielle du clone T7119, clonés préalablement dans un vecteur binaire, le vecteur pSLJ5515 dérivé du vecteur pRK290. Les plantes mutantes ont donc été transformées avec les cosmides C7119-66 et C7119- 49 qui couvrent le gène Akin 11. A l'issue de deux événements de transformation indépendants 12 et 5 transformants primaires ont été obtenus, respectivement, pour les cosmides C7119-49 et C7119-66. Des
transformations témoins ont également été réalisées à l'aide des cosmides C7119-29 et C7119-32 et le vecteur binaire lui-même (Figure 4, haut).
Afin d'induire un phénotype de résistance à un pathogène chez le mutant sensible hxc2 de Arabidopsis thaliana, des expériences de complémentation ont été réalisées, à l'aide des cosmides obtenus par digestion partielle du clone T7119, clonés préalablement dans un vecteur binaire, le vecteur pSLJ5515 dérivé du vecteur pRK290. Les plantes mutantes ont donc été transformées avec les cosmides C7119-66 et C7119- 49 qui couvrent le gène Akin 11. A l'issue de deux événements de transformation indépendants 12 et 5 transformants primaires ont été obtenus, respectivement, pour les cosmides C7119-49 et C7119-66. Des
transformations témoins ont également été réalisées à l'aide des cosmides C7119-29 et C7119-32 et le vecteur binaire lui-même (Figure 4, haut).
L'inoculation des transformants correspondant aux clones C7119- 49 et C7119-66 par la souche 147 de Xanthomonas montre que la transformation par les clones 66 et 49 a permis de restaurer le phénotype sauvage (Figure 4, bas).
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EXEMPLE 6 : CONSTRUCTION D'UN VECTEUR D'EXPRESSION RECOMBINANT CONTENANT UN ACIDE NUCLEIQUE PERMETTANT LA SYNTHESE DU POLYPEPTIDE AKIN11 CHEZ UNE PLANTE.
1. Construction d'un vecteur d'expression recombinant contenant
l'ADN cténomique du nène Akinll, ou une séquence antisens correspondante.
l'ADN cténomique du nène Akinll, ou une séquence antisens correspondante.
Le plasmide pRK290 (transfert John Innes Centre) contenant l'ADN génomique du gène Akin11 est préparé par minipréparation et utilisé comme matrice pour une expérience de PCR avec les oligonucléotides AKINF (SEQ ID NO13) et AKINR (SEQ ID NO 14).. L'utilisation de ce couple d'amorces permet d'insérer par mutagénèse ponctuelle un site de restriction Nael aux deux extrémités du fragment amplifié de 2684 pb. Ce fragment est purifié et cloné dans le vecteur pGE) v) @-T (Promega). L'insertion est vérifiée par digestion Nael/Drdl. La séquence du fragment est entièrement déterminée sur plusieurs clones pour tester la présence de mutations induites par la PCR. La digestion Nael/Drdl du plasmide permet de purifier sur gel d'agarose un fragment de 2674 pb : ORF Akin11 du clone retenu (sans mutation).
Le schéma de la méthode de construction est représenté sur la gauche de la figure 5.
Le plasmide pBI121 (Clontech) est soumis à une double digestion Sacl/Smal. L'extrémité digérée par Sacl est rendue franche par l'action du fragment Kleenow de l'enzyme ADN polymérase 1. Les extrémités du fragment sont déphosphorylées.
Le fragment ORF Akin11 est ligué dans le vecteur pBI121 déphosphorylé.
Le schéma de la méthode de construction est représenté sur la droite de la figure 5.
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2. Construction d'un vecteur recombinant contenant l'ADNc du gène Akin11, ou une séquence antisens correspondante.
Le plasmide pBlueScript SK-contenant l'ADNc du gène Akin11 est préparé par minipréparation et utilisé comme matrice pour une expérience de PCR avec les oligonucléotides AKIN68 (SEQ ID NO15) et AKIN1648 (SEQ ID N016). L'utilisation de ce couple d'amorces permet d'insérer par mutagénèse ponctuelle un site de restriction Nael aux deux extrémités de l'amplifiat de 1602 pb. Ce fragment est purifié et cloné dans le vecteur pGEM@-T (Promega). L'insertion est vérifiée par digestion Nael.
La séquence du fragment est entièrement déterminée pour plusieurs clones pour tester la présence de mutations induites par la PCR. La digestion Nael du plasmide permet de purifier sur gel d'agarose un fragment de 1578 pb : cDNA Akin.
Le schéma de construction est représenté sur la gauche de la figure 6.
Le plasmide pBI121 (Clontech) est soumis à une double digestion Sacl/Smal. L'extrémité digérée par Sacl est rendue franche par l'action du fragment Kleenow de l'enzyme ADN polymérase 1. Les extrémités du fragment sont déphosphorylées.
Le fragment cDNA Akin11 est ligué dans le vecteur pBI121 déphosphorylé.
Le schéma de construction est représenté sur la droite de la figure 6.
EXEMPLE 7 : OBTENTION DE PLANTES TRANSGENIQUES TRANSFORMEES PAR UN ACIDE NUCLEIQUE PERMETTANT LA SYNTHESE DU POLYPEPTIDE AKIN11 CHEZ CETTE PLANTE
La transformation d'une plante dans le but d'obtenir une expression stable du polynucléotide d'intérêt dans la plante transformée est nécessaire pour assurer une modification durable du phénotype de résistance aux pathogènes dans cette plante. Des essais sont réalisés avec une construction de vecteur décrite à l'exemple 6 ci-dessus.
La transformation d'une plante dans le but d'obtenir une expression stable du polynucléotide d'intérêt dans la plante transformée est nécessaire pour assurer une modification durable du phénotype de résistance aux pathogènes dans cette plante. Des essais sont réalisés avec une construction de vecteur décrite à l'exemple 6 ci-dessus.
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1. CANON A PARTICULES
La méthode utilisée repose sur l'utilisation d'un canon à particules identique à celui décrit par FINER (1992).
La méthode utilisée repose sur l'utilisation d'un canon à particules identique à celui décrit par FINER (1992).
Les cellules cibles sont des cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières.
Ce type de cellules compose le cal embryogène (dit de type 11) de maïs.
Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hill selon la méthode et sur les milieux décrits par ARMSTRONG (1994). Des fragments de tels cals d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boîte au centre d'une boîte de Pétri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides décrits dans les exemples précédents et portant les gènes à introduire, sont purifiés sur colonne QiagenRen suivant les instructions du fabricant. Ils sont
ensuite précipités sur des particules de tungstène (M10) en suivant le protocole décrit par KLEIN (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. FINER (1992). Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de ScellofraiSR puis cultivées à l'obscurité à 27 C.
ensuite précipités sur des particules de tungstène (M10) en suivant le protocole décrit par KLEIN (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. FINER (1992). Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de ScellofraiSR puis cultivées à l'obscurité à 27 C.
Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent sélectif, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boîte bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, multipliés puis cultivés de façon à régénérer des plantules, en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par VAIN et al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées pour l'obtention d'hybrides ou autofécondées.
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II. TRANSFORMATION PAR AGROBACTERIUM
Une autre technique de transformation utilisable dans le cadre de l'invention utilise Agrobacterium tumefaciens, selon le protocole décrit par ISHIDA et al. (1996), notamment à partir d'embryons immatures de 10 jours après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont référencés dans la référence citée. La transformation débute avec une phase de co-culture où les embryons immatures des plantes de maïs sont mis en contact pendant au moins 5 min avec Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 contenant les vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résultat d'une recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADN- T contenant le gène d'intérêt et/ou le marqueur de sélection dérivé des plasmides décrits dans les exemples précédents, et le vecteur pSB1 de Japan Tobacco (EP 672 752) qui contient : les gènes virB et virG du plasmide pTiBo542 présent dans la souche supervirulente A281 d'Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région homologue retrouvée dans le vecteur intermédiaire permettant cette recombinaison homologue. Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25 C. Une première sélection est effectuée sur les cals transformés : les cals embryogènes sont transférés sur milieu LSD5 contenant de la phosphinotricine à 5 mg/1 et de la céfotaxime à 250 mag/1 (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium tumefaciens). Cette étape est menée 2 semaines à l'obscurité et à 25 C.
La deuxième étape de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSD5, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mag/1) en présence de céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals de type 1 qui restent blancs (fragments de 1 à 2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à 25 C sur milieu LSD 10 en présence de céfotaxime.
La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals de type 1 qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à 5 mg/1 et de céfotaxime pendant 2 semaines à 22 C et sous lumière continue.
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Les plantes ayant régénéré sont transférées sur milieu RM + G2 contenant 100 mag/1 d'Augmentin pendant 2 semaines à 22 C et sous illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.
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Claims (30)
1. Utilisation d'un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 chez une plante pour induire ou augmenter, chez cette plante, une résistance à l'agression par un pathogène.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide AKIN11 choisi parmi les
séquences SEQ ID ? 1 et 2 et leurs séquences homologues résultant de la dégénérescence du code génétique.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 comprend un polynucléotide régulant l'expression du polynucléotide codant
pour le polypeptide AKIN11 chez la plante.
4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 code pour un polypeptide de fusion constitué du polypeptide AKIN11 fusionné avec un peptide signal permettant sa localisation dans un compartiment cellulaire donné ou sa sécrétion dans la paroi cellulaire.
5. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que le polynucléotide régulant l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide AKIN11 chez la plante est un promoteur constitutif.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le promoteur constitutif est choisi parmi le promoteur 35S du CaMV, le promoteur de l'actine du riz ou le promoteur pUbi1 du gène de l'ubiquitine 1 du maïs.
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7. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que le polynucléotide régulant l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide AKIN11 chez la plante est un promoteur inductible.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que le promoteur inductible est choisi parmi un promoteur inductible par des glucocorticoïdes ou un promoteur inductible par l'éthanol.
9. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que le polynucléotide régulant l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide AKIN11 chez la plante est un promoteur spécifique de tissus.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que le promoteur spécifique de tissus est choisi parmi le promoteur HMWG de blé ou d'orge, le promoteur pCRU du gène de la cruciférine de radis, le
promoteur PGEA1, le promoteur PGEA6, le promoteur du gène de la zéine de maïs, le promoteur de la napine, le promoteur de la phaseoline, le promoteur de la glutenine, le promoteur de l'heliantinine, le promoteur de l'albumine, le promoteur de l'oleosine, le promoteur de l'ATS1, le promoteur de l'ATS3.
11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 chez une plante comprend une séquence"leader"non traduite permettant d'augmenter la traduction de ce polypeptide chez la plante.
12 Utilisation selon la revendication 11 caractérisée en ce que la séquence"leader"est choisie parmi le leader EMCV, le leader TEV, le leader BiP, le leader AMV RNA 4 et le leader de la mosaïque du virus du tabac.
13 Utilisation selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce que l'acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 chez une plante est inséré dans un vecteur d'expression.
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14 Utilisation selon la revendication 13 caractérisée en ce que le vecteur d'expression est choisi parmi le vecteurs pBIN19, pBI101, pB1121, pEGFP et pCAMBIA 1302.
en ce que la plante est choisie parmi les plantes de grande culture, les plantes potagères et les fleurs.
15 Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisée
16 Utilisation selon l'une des revendications 1 à 15 caractérisée en ce que le pathogène est une bactérie, un virus, un champignon ou un nématode.
17. Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que le pathogène est un pathogène nécrotrophe.
18. Procédé d'obtention d'une plante transformée possédant une résistance à un pathogène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transfecter une cellule hôte végétale avec un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 chez une plante, ou avec un vecteur recombinant dans lequel a été introduit un tel acide nucléique ; b) Régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; c) Sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré ledit acide nucléique.
19. Procédé d'obtention d'une plante transformée possédant une résistance à un pathogène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule hôte d'Agrobacterium tumefaciens transformée avec un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN1 chez une plante ; ou avec un vecteur recombinant dans lequel a été introduit un tel acide nucléique ; b) Transformation d'une plante d'intérêt par infection avec la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ;
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c) Sélection des plantes ayant intégré dans leur génome ledit acide nucléique.
20. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une quelconque des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes additionnelles suivantes : d) croisement entre elles de deux plantes transgéniques telles qu'obtenues à l'étape c) ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène.
21. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une quelconque des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes additionnelles suivantes : f) croisement d'une plante transgénique obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; g) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé le transgène.
22. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une quelconque des revendications 18 ou 19 caractérisé en ce qu'il comporte les étapes additionnelles suivantes : h) croisement d'une plante transformée obtenue à l'étape c) avec une plante d'une lignée à valeur agronomique de la même espèce ; i) sélection des plantes issues du croisement de l'étape h) ayant conservé le transgène ; j) rétrocroisement d'une plante transformée obtenue à l'étape i) avec la plante d'une lignée à valeur agronomique de la même espèce ; k) répéter l'étape j) au moins deux fois ; 1) sélection des plantes issues des rétrocroisements de l'étape k) qui ont conservé le transgène et possèdent un fond génétique proche ou identique au fond génétique de la plante d'une lignée à valeur agronomique de la même espèce.
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23. Plante transformée selon le procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 22.
24. Plante résistante à un pathogène de végétal, caractérisée en ce qu'elle a été transformée avec un acide nucléique permettant la synthèse du polypeptide AKIN11 chez cette plante..
25. Partie d'une plante transformée selon l'une des revendications 23 ou 24.
26. Utilisation d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique hybridant avec la séquence SEQ ID N 1 ou 2 pour détecter la présence d'un caractère de résistance à un pathogène chez une plante.
27. Utilisation d'un polynucléotide antisens hybridant avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID ? 2 pour moduler la résistance d'une plante à l'agression par un agent pathogène.
28. Procédé pour induire ou augmenter la résistance d'une plante à un pathogène caractérisé en ce qu'il comporte une étape selon laquelle on met en contact ladite plante avec le polypeptide AKIN11.
29. Composition pour induire ou augmenter la résistance d'une plante à un pathogène, caractérisée en ce qu'elle comprend le polypeptide AKIN11 à titre de composé actif.
30. Polypeptide de fusion constitué du polypeptide AKIN11 fusionné avec un peptide signal permettant sa localisation ciblée dans un compartiment déterminé de la cellule végétale.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2002223779A1 (en) | 2002-05-21 |
| WO2002038780A2 (fr) | 2002-05-16 |
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